Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеинкиназа С в клетках с множественной лекарственной устойчивостью

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Протеинкиназа С в клетках с множественной лекарственной устойчивостью"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ АКАДЕМИИ НАУК СССР

На правах рукописи УДК 576.535.085

НЕКРАСОВА Татьяна Павловна

ПРОТЕИНКИНАЗА С В КЛЕТКАХ С МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ

03.00.25—КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД — 1991

Работа выполнена в лаборатории генетических механизмов диффе-ренцировки и малигнизации клеток Института цитологии АН СССР.

Научные руководители: доктор биологических наук Т. Н. ИГНАТОВА кандидат биологических наук Л. Ш. ГАНЕЛИНА

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Б. Д. ЖИВОТОВСКИИ доктор биологических наук И. И. МАРАХОВА

Ведущее учреждение — НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова МЗ СССР.

Защита состоится « II » 0& 1991 года в часов

на заседании специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии АН СССР по адресу: 194064, Ленинград, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацисй можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии АН СССР.

Автореферат разослан « » 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

. Н. ПИСАРЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш исследования. Устойчивость клеток опухолей к различным аятинеопластическим препаратам существенно снижает эффективность современных курсов химиотерапевтического лечения. Линии клеток, устойчивые к противоопухолевым препаратам, получаемые и исследуемые in vitro, служат адекватной и удобной моделью для понимания механизма лекарственной резистентности клеток.

Особенности фенотипа клеток с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) во многих чертах охарактеризованы и главной является снижение накопления ими различных химиопрэпаратов finaba е.'а. ,1979? Skovagaard,IíiXaen,1982), обусловленное присутствием в устойчивых клетках трансмембранного белка, называемого Р-гликопротеином (Ling е.а.,1974), осуществляющего активное выведение ксенобиотиков. В связи с этим вопрос о регуляции функциональной активности Р-гликопротеина, наряду с вопросами о регуляции его экспрессии и механизмах самого транспортного процесса, становится одним из наиболее важных для углубленного понимания феномена МЯУ.

Существенными чертами фенотипа клеток, проявляющих ГШ", оказываются также изменения активности ферментов системы дето-ксикации (cowan е.а.,1986), внутриклеточного распределения хи-миопрепаратов (Supino е.а.,1986), а также изменение влияния противоопухолевых препаратов на свои мишени (Glisson е.а.,1986; Capranico е.а.,1986; Potmeail е.а.,1988). В ТО же время показана .принципиальная возможность реверсии устойчивости опухолевых клеток под влиянием различных агентов (Tsuruo е.а.,1983; Rsmu е.а.,1984). Принято считать, что они влияют на транспортную функцию Р-гликопротеина и задерживают выведение химиопре-ларатов. Большинство этих агентов влияет и на фосфолипвд-Са^+-зависимую дротеинкиназу С (Ж С), однако роль этого фермента в обеспечении ИЛУ окончательно не выяснена.

Известно, что обработка чувствительных и устойчивых вариантов клеток форболовда эфиром приводит к увеличению их резистентности (Ferguson е.а.,1987; Pine е.а.,1988),чго связано с усиленным фосфополированием Р-гликопротеина по остаткам серина,

возможно в результате активности ПК С (Hamada е.а.,1987). Исследование профилей фосфорилирования белков из устойчивых вариантов клеток выявило увеличенное фосфорилирование не только Р-гликопротеина (Marsh,Center,1935), но и увеличение степени фосфоршшрования многих других белков клеток (Pine е.а.,1985, 1936).

Изучение ПК С в клетках с ГМУ может внести значительный вклад в понимание механизмов регуляции такого феномена как 1Ш", а также многих других процессов, в которых участвует ПК G. В ходе дальнейших исследований в этом направлении должен расшириться перечень субстратов ПК С в сопоставлении с их функциональной характеристикой. К различным физиологическим функциям, регуляция которых осуществляется при участии ПК С, включающим экспрессию некоторых генов, секрецшз, экзоцитоз, модуляцию ионной проницаемости и взаимодействие разнообразных ли-гавдов со своими рецепторами, вероятно, будет относиться и обеспечение устойчивого фенотипа трансформированных клеток.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании роли ПК С в обеспечении МЛУ, а также в попытке идентификации возможных субстратов для этого фермента. Для достижения сформулированной цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ активности, свойств и субклеточного распределения ПК G в клетках с МЛУ и юс чувствительных аналогах.

2. Исследовать влияние селективного агента бромистого этидия на активность ПК С в устойчивых к нему сублиниях клеток.

3. Изучить участие ПК С в транспорте и накоплении селективного агента бромистого этидия и флуоресцентного красителя Хехст 33 342.

Научная новизна полученных результатов. Работа содержит новые данные, касающиеся возможной экспрессии дополнительных изозимов ПК С в клеткахсШГУ по сравнению с их чувствительными аналогами.

Комплексное применение методов ионообменной хроматография

и проточной цитофлуорииетрии позволило доказать, что феномен ' МНУ включает в себя изменение не только активности ПК С, но и изменение спектра изозимов фермента, что значительно расширяет современные представления о функционировании этого, одного из наиболее существенных для жизнедеятельности клетки фермента.

Впервые показана возможность существования дополнительной компоненты, помимо ускоренного выведения токсических веществ, в механизме МЛУ, которая касается изменения доступности хроматина для ДНК-тропннх препаратов, модулируемой фосфорилировани-ем.

Практическое значение работы. Изучение ПК С-зависимого фо сформирования в клетках с МЛУ представляет,не только большой научный интерес для исследования новых аспектов данной проблемы, но и имеет непосредственное отношение к проблеме химиотерапии опухолей в клинике. В опухолях пациентов, прошедших и непрошедших курс химиотерапии, часто встречаются варианты клеток с перекрестной устойчивостью к различным противоопухолевым препаратам. Выполненная работа создает новые возможности для поиска средств решения такой важной онкологической проблемы как МЯУ. Некоторые из препаратов, обладающих способностью повышать чувствительность устойчивых вариантов клеток к анти-неопластическим средствам, узе используются в клиниках. Однако они характеризуются высокой токсичностью (как, например, вера-папки), что препятствует их эффективному применения.

Повышенная чувствительность устойчивых вариантов клеток к ингибитора!.! ПК С, обнаруженная в данной работе, такае может привлечь внимание онкологое. Наибольший интерес могут представлять результаты, продемонстрировавшие усиление цитотоксиче-ского действия селективного агента для устойчивых вариантов клеток в присутствии ингибитора ПК С трифторперазпна - хжгао-терапевтяческого средства, относящегося к группе нейролептиков или "больших транквилизаторов", применяющегося в клинике с 50-х годов.

Выполненная работа позволяет считать механизм МЛУ комплексным, реализующимся на нескольких различных уровнях, каждый из которых может тлеть свои способы купирования.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в.культуре (Звенигород,1986), Всесоюзном совещании "Клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза и антиканцерогенеза" (Ленинград ,1988) , Конференции молодых ученых, посвященной 30-ле-тив ИНЦ (Ленинград,1989), а такае неоднократно на семинарах в Институте цитологии АН СССР.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем работы. Диссертация изложена на iSf стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего ¿55" публикаций отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 8 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали культуры клеток трансформированных фибробластов подкожной соединительной ткани мыши СЗН линии L (Earle,1943) и полученного на основе этой линии клона ЬеЪгб25, устойчивого к бромистому этвдию (БЭ) в концентрации 25 мкг/мл (Игнатова и др. ,I9?4J.

Такгэ были использованы клетки трансформированных фибробластов яичника китайского хомячка линии CH0-KI (Kao.Puok, 1968) и полученных на ее основе клонов, устойчивых к БЭ в концентрации 1 мкг/мл - СеЪг (Игнатова и др.,1981), СЕ 3/1 и СЕ 6/1. Путем многоступенчатой селекции из клонов СЕ 3/1 и СЕ 6/1 были получены варианты СЕ 3/10 и СЕ 6/10, устойчивые к БЭ в концентрации 10 мкг/мл.

Клетки линии X. и клока ЬеЬг^,- пассировали в смчси сред Игла и 199 (1:1) с 10$ сыворотки крови крупного рогатого скота (СКРС) во флаконах Карреля площадью 20-25 см^ и пересевали, используя смесь коммерческих растворов 0.25%~то трипсина и 0,02%-го Версена (1:1), каждые 2-3 дня.

Клетки линии CH0-KI и устойчивых вариантов, полученных на ее основе, культивировали в смеси сред Игла и 199 (1:1), либо в среде Р12 (Plow) с 10% СКРС и пересевали с помощью коммерче-

ского раствора 0.02%-то Версена каждые 2-3 дня.

Скорость размножения и величину насыщающей плотности популяций клеток определяли по кривым роста. 1.10й клеток внее-вали на чашки Петри диаметром 50 мм (АпшпЪга) и культивировали в атмосфере с COg, меняя среду на свежую в 1, 3 и 5 сут. 0 скорости размножения судили по среднесуточному увеличению числа клеток. За величину насыщающей плотности принимали максимальную плотность популяции, приходящуюся на единицу площади.

Селекцию устойчивых вариантов осуществляли стандартным методом при посеве 2-10й клеток линии CH0-KI на 120 мм чашки Петри (Anumbra) с 20 мл среды Р12, содержащей 10% СКРС и БЭ в концентрации 1 мкг/мл. Через 14 дней образовавшиеся колонии клеток изолировали.

Эффективность клонирования линий и клонов определяли, подсчитывая число колоний клеток, образовавшихся через 1&-15 дней после посева 200 клеток в 3 мл среды Р12 с 10$ СКРС в пластиковые чашки диаметром 25 мм (iíuncion). Клетки инкубировали без смены среды в атмосфере с Ъ% СО2 при 37°С.

Устойчивость клеток к различным препаратам определяли по Ж50 - концентрации препарата, вызывающей 50% уменьшение кло-нообразования (Puck,1956). Для определения перекрестной устойчивости использовали адриамицин (Pharmitalia), колхицин, акти-НОМИЦШ Д И БЭ (Serva).

Получение препаратов ПК С осуществляли по методу Киккава с соавт. (Kikkawa е.а.,1982). Клетки выращивали в сосудах объемом 1 л и в логарифмической фазе роста снимали с поверхности сосуда механически. Гомогенизацию проводили в среде следующего состава: 20 м!1 Т£ис-НС1, pH 7.4 (Serva), 0.25 И сахароза (Serva), 2 мМ ЭДТА (Serva), 0.5 мМ ЗГТА (Signa), 1 Ш дитиотрейтол (Sigua) и 2 мМ фенилметилсульфонилфторад (Serva). После осаждения ядер гомогенат центрифугировали 45 мин при 100000g, су-пернатант использовали в качестве цитозольной фракции, а осадок солибилизировали в 0.5 мл буфера с 0.27$ Тритоном Х-100 (Меток) и 2.5 мМ ЭГТА. После центрифугирования в течение 45 мин при юоооо g супернатант использовали как фракцию мембран.

Все процедуры проводили при 4°С.

Хроматографическую очистку цитозольных и мембранных препаратов ПК С проводили на колонке с ДЕ-52 целлюлозой по методу Киккава с соавт. (Kikkawa е.а., 1982). Фермент с колонки алвировали в объеме 1 мл буфером, содержащим 0.08 М NaCl (Serva) .

Определение активности ПК С цроводили по методу Киккава с соавт. (RtMcawa е.а.,1982). Образцы частично очищенного фермента объемом 20 мкл, содержащие 1-5 мкг белка инкубировались в 50 мкл Трис-HCl буфера, рН 7.0, содержащем 5 мМ MgCl2 (Serva), 40 МКГ гистона HI, 0.1 ¡^ АТФ (Serva), 1-2-106 имп/ мин на образец /|-33рДТЗ (ЛИЯФ,Ленинград) в течение 5 мин при 30°С. В качестве активаторов ПК С в реакционную смесь вносили 1 мК СаС12 (Serva) ж 5 мкг фосфатадилсерина (Signa или Serve). Аликвоты наносили на фильтры и определяли их радиоактивность на СЦИНЦИЛЛНЦИОННОМ Счетчике Вескиan LS-8100.

Активность ПК С выражали в пмолях AT®, перенесенных ферментом на субстрат за 1 мин.

Определение содержания в клетках холестерина и фосфоли-падов цроводили после предварительной экстракции лшидов метанолом и хлороформом (Ковалева,Дильман, 1971) по методу Банковского И Светашева (Vaskovsky,Svetaschev,1972).

Определение концентрации белка проводили по методу Лоури (Lowry е.а.,1951) с бычьим альбумином в качестве стандарта.

Накопление флуоресцентного красителя Хехст 33 542 оценивали по интенсивности флуоресценции клеток после инкубации с красителем при 87°С. Проинкубированные клетки снимали с поверхности флаконов 0.25% раствором трипсина, суспендировали в холодном растворе Хенкса и анализировали суспензию с помощью проточного цитофлуориметра (Розанов,1988) в условиях описанию: в работе Моргана с соавт. (Morgan е.а.,1988).

Окрашивание клеток бромистым этвдгаем исследовали на клетках, выращенных на по!фовных стеклах (Neifakh е.а.,1988). Инкубацию с БЭ проводили в чашках Петри при 37°С и оценивали флуоресценцию 20 полей зрения, содержащих 15-20 клеток на микроскопе-фотометре ICíi-405 ("Ofiton") с объективом JUuar х40.

Снижение флуоресценции клеток изучали, помещая клетки, предварительно проинкубированные с БЭ в концентрации 25 мкг/ мл, в чашки Петри со средой без красителя на разные сроки при температуре 57°С.

При статистической обработке полученных данных вычисляли стандартную ошибку ш и доверительный интервал ]_ по формуле: 1р= т • -ь , где - критерий Стьвдента при р^ 0.05 (Кравцова и др.,198В).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение содержания холестерина и фосфолипвдов - основных компонентов плазматической мембраны, в чувствительных и устойчивых вариантах клеток линий Ь и СН0-К1. Поскольку ХЛ и ФЛ участвуют в регуляции микровязкости мембран, изменение их количества или соотношения в мембранах клеток может влиять на основные функции клеточных мембран: рецепторную, транспортную и ферментативную (см. обзор: СЬеп,1984). При сравнении содержании ХЛ выявляется снижение его количества, причем как общего (на 25.5$), так и свободного (на 29%) в устойчивом варианте ЬеЬгб25. Более выраженные различия в содержании общего (снижение на 55%) и свободного (снижение на 55%) получены для устойчивого варианта СеЬг при сравнении его с вариантом СНО--К1.

Содержание ФЛ при развитии устойчивости к БЗ снижается как в I, так и СН0-К1 клетках и изменение ФЛ, следовательно, вдет параллельно изменению ХЛ (табл.1). Таблица 1. Содержание холестерина и фосфолипвдов в клетках, чувствительных и устойчивых к бромистому этидию

Вариант Общий ХЛ, Свободный ЭФиры XI, фосфолиявдн, Отно-клеток мкг/мг ХЛ,мкг/мг %~от об- мкг/мг белка шение белка белка щего ХЛ ХД/ФЛ

моль/ /моль

Ъ 8"! 32+1.15^1791~19 ."о+йТгС 96?04+12.77 0.19

ЬеЬгб2С 6.57+0.53 5.09+0.81 22.50+1.49 В2.52+5.52 0.17 СН0-К1"' 26.55+6.69 17.74+4.96 24.70+4.01 15?. ,0+40.12 0.17 СеЪг 10.84+4.61 2.56+2.24 50.00+1.89 V. ..-¿19.27 0.15

Примечание: указаны средние значения из 5-7 о.' ^тов и дсвепи-тельные интервалы пру ^¿.О.ОЪ,

Во всех устойчивых вариантах клеток получено четкое снижение отношения общий 1Л/Ш. Оно падает от 0.19 в клетках 1> до 0.17 в клетках ЬеЪг625> и от 0.17 в клетках СН0-К1 до 0.15 в клетках СеЪг.

В работе с использованием лилосом для встраивания и удаления ХД и одновременным определением микровязкости было показано, что уменьшение отношения ХЛ/ФЛ характеризует увеличение жидкостности мембран (Иванова и др.,1984), следовательно, оба устойчивых варианта, как ЬеЬгб25, так и СеЬг отличаются по этому показателю от своих чувствительных аналогов.

Изучение протеинкиназы С в устойчивых и чувствительных вариантах клеток. Определение активности ПК С в препаратах цитозоля и мембран, полученных из чувствительных и устойчивых вариантов клеток, находящихся в логарифмической фазе роста, проводили во фракциях, полученных после хроматографии на колонке с ДЕ-52 целлюлозой. Сравнение активности фермента из препаратов чувствительного и устойчивого вариантов обнаруживает следующее: общая активность мембраносвязанной ПК С из устойчивого варианта ЬеЬгб25 незначительно меньше - на 15%, чем таковая для исходных клеток, цитозоль устойчивого варианта выраженных количественных изменений в активности фермента не имеет. Подобное, но более выраженное, снижение мембраносвязанной активности ПК С было обнаружено и в клетках СеЪг при сравнении их с устойчивым вариантом СН0-К1 (рис.1). В данном случае устойчивые клетки были почти лишены фермента на мембранах. Таким образом, для данных устойчивых вариантов клеток было обнаружено изменение в активности ПК С, характеризующееся уменьшением активности фермента в мембранных фракциях.

Существенное различие выявилось в профилях элюции мембранных препаратов из чувствительных и устойчивых вариантов клеток (рис.1,6). Максимальная активность ПК С обнаруживалась во фракциях, элюируемых 0.07 М НаС1 для мембранных препаратов обоих чувствительных вариантов - ь и СН0-К1. В устойчивом варианте ЬеЬгб25 наблюдалось смещение пика активности во фракцию, элюируемую 0.08 М КаС1, а у варианта СеЪг - исчезновение Г пика активности фермента.

В результате исследования пролифератнвных характеристик

о о

Рис.1.Активность протеинкиназы С в цитозольных /а/ и мембранных /б/ фракциях клеток Ъ (I), 1еЬг625 (2), СН0-К1 (3) и СеЬг (4х/.

Светлые столбики - активность фермента в присутствии фосфатидилсерина и Са^+, заштрихованные области - ба-зальная активность.

устойчивых и исходных вариантов клеток было обнаружено различие мевду ними. Оно касалось уменьшения времени удвоения популяций обоих устойчивых вариантов и увеличения величин насыщающей плотности. Такое различие в ростовых характеристиках, причем однонаправленное, затрудняло анализ роли ПК С в фенотипе ШУ. Известно, что этот фермент является регулятором многих важнейших клеточных функций, в том числе и пролиферации клеток (см. обзоры: Nishizuka,1986,1989).

В попытке вычленить изменения активности ПК С, обусловленные изменением их пролиферативных свойств, была проведена селекция ноеых устойчивых вариантов на основе линии CH0-KI ж вьделены клоны, устойчивые к 5Э в концентрации 1 жг/мл (СЕ 3/1 и СЕ 6/1), характеризующиеся как увеличением, так и уменьшением времени удвоения и величины насыщающей плотности популяции относительно исходной линии клеток. Данная линия клеток была выбрана вследствие простоты образования устойчивых вариантов с амдлифицированнши последовательностями ДНК, обеспечивающими экспрессию Р-глжопротекна (Riordari,ling, 1979; Gupta е.а.,1984; Ефимова,1988). Дальнейшая селекция высокоустойчивых вариантов (CS 3/10 и СЕ 6/10) на основе полученных клонов проводилась в массовой культуре без реклонщювания. Высокоустокчивке варианты проявляли перекрестную устойчивость к других исследованным цитотоксическим препаратам. Индекс устойчивости, представленный как отношение концентрации препарата, вызывающей 50$ ингибирование клокообразования у устойчивых вариантов клеток к таковому для клеток исходного варианта, составлял для БЭ - 31 и 31, адриашцина - 33 и 25, актшоми-цина Д - 69 и 56, колхицина - 9 и 13, соответственно для варианта СЕ 3/10 и СЕ 6/10.

Результаты сравнительной оценки активности ПК С из вариантов, устойчивых к БЭ в различных концентрациях, показали, что в клетках обоих исследованных устойчивых вариантов активность фермента выше, чем в клетках исходного варианта CH0-KI (табл.2). В клетках клонов первого шага селекции увеличение активности ПК С касалось только мембранной фракции. Обращает на себя внимание то, что клетки варианта СЕ 6 имели более высокую активность мембраносвязанной АПК С с самого первого этапа селекции. Увеличение уровня з7стойчивости обоих вариантов

Таблица 2. Активность протеинкиназы С в клетках линии CH0-KI и полученных на ее основе вариантов с разными уровнями устойчивости

Вариант клеток Активность ПК С Доля мембраносвязанной активности, $

Мембраны Цитозоль

CH0-KI 3.9+0.2 24.9+1.2 13

СЕ 3/1 6.9+0.3 23.0+1.1 23

СЕ 6/1 12.1+0.6 22.3+1.1 35

СЕ 3/10 13.4+0.7 71.3+4.0 16

СЕ 6/10 34.1+1.3 99.0+4.5 26

Примечание: приведены средние значения 2-х экспериментов, каждый из которых проведен в 2-х повторах. Активность Ж С выражена в пмолях АТФ, перенесенных на субстрат за минуту на 1 мг белка.

в 10 раз сопровождалось увеличением активности ПК С, однако по абсолютной величине активности варианты различались меяду собой. Помимо более высокой активности фермента как в мембранной, так и в цитозольной фракциях, вариант СЕ 6 имел и иное внутриклеточное распределение фермента: доля активности, приходящейся на мембранную фракцию, составляла для варианта СЙ 6/1 35$, для высокоустойчивого варианта СЕ 6/10 - 25$. Аналогичные значения длн варианта СЕ 3/1 - 23$, варианта СЕ 3/10 -16$.

Литературные данные свидетельствуют как об увеличении активности ПК С (Fine е.а.,1938; Aquino е.а.,1988; O'Brien е.а.,1989), Так И О ее снижении (Ido е.а.,19875 Schwarts е.а., 1991) в клетках с ЩУ. Общей чертой для устойчивых вариантов, характеризующихся увеличением активности ПК С была их селекция на адриамицине, тогда как они отличались по видовому происхождению, способу селекции и уровням устойчивости к селективным агентам. Однако наши результаты, из которых следует, что селекция на БЭ монет приводить к образованию вариантов как с увеличенной, так и с уменьшенной активностью ПК С противоречат выводу о том, что различия в активности данного фермента могут быть связаны с применением разных селективных агентов.

Обнаруженное нами в клетках ЬеЪгб25 и СеЬг снижение активности мембраносвязанной Ж С коррелировало с изменением их ростовых характеристик. Вариант СЕ 6/10, характеризующийся более продолжительным временем удвоения популяции в сравнении с вариантом СЕ 3/10, имел более высокую активность мембраносвя-занного фермента, тогда как имел одинаковый с нём уровень устойчивости к БЭ. Следовательно, различие в протеинкиназной активности может быть связано не только с обеспечением устойчивости, но и с одновременным участием Ж С в других физиологических функциях. Существует множество доказательств того, что ПК С играет основную роль в модуляции функций мембраны клетки, включая ионную проницаемость, секрещш и взаимодействие с разнообразными рецепторами (см. обзор: Hiehizuka,1986), Плейотро-пные изменения фенотипа, характерные для клеток с МЛУ, в таком случае могут вносить свою коррекцию в изменение активности Ж С (Игнатова и др.,1976,1981; Сальников и др.,1979; Плескач и др.,1980; Конобасова и др.,1980; Ганелина и др.,1982).

Обнаруженное в настоящей работе изменение соотношения ХЛ/ФЛ, определяющего состояние кидкостности мембран, в мембранах устойчивых вариантов ЬеЬгб2^ и СеЬг свидетельствовало о сниаенин их микровязкости. Вероятно, что это изменение монет быть частью процессов, регулирующих состояние фосфорилирования белковых компонентов мембран, приводя к их облегченному взаимодействию у устойчивых вариантов клеток.

Неоднозначность результатов, полученных при изучении активности Ж С в клетках с МЛУ не исключает возможности усиленного фосфорилирования Ж С отдельных клеточных белков, в том числе и мембранных, участвующих в транспортных процессах. Такая возмоеность вполне реальна, если учитывать разный изозим-ньй состав фермента в чувствительных и устойчивых вариантах клеток, что следует из собственных и литературных данных (Aquino е.а.,1990).

Влияние цитотоксического препарата БЭ на активность Ж С в устойчивых к нему вариантах клеток исследовалось при культивировании вариантов СЕ 3/10 и СЕ 6/10 в среде, содержащей БЭ в нетоксичной для данных вариантов концентрации (10 мкг/мл) и сравнении их с теш лее вариантами клеток, культивировавшимися в отсутствии цитотоксического препарата. После стандартной

процедуры получении и очистки фермента оценивали его активность в цитозольной и мембранной фракциях (табл.3).

Т&блица 3. Активность ПК С в клетках устойчивых вариантов, культивируемых в присутствии БЭ в концентрация 10 мкг/мл или без него

I эксперимент П эксперимент

Вариант клеток

СЕ 3/10 СЕ 3/10+БЭ

Мембраны

12.7+0.528.1+1.0

цетозоль

57.7+3.4 117.5+5.3

Мегх5раны

1.3+0.07 5.2+0.3

цитозоль

7.6+0.4 11.1+0.6

Ш эксперимент 1У эксперимент

Вариант клеток

СЕ 6/10 СЕ 6/10+БЭ

Мембраны

4.5+0.2 8.9+0.4

цитозоль

12.3+0.6 45.4+2.2

Мембраны

4.3+0.2 7.1+0.4

цитозоль

12.6+0.6 28.0+1.4

Примечание: активность фермента выражена в пмолях АТ$/мкн/мг белка.

Присутствие БЭ в среде для культивирования клеток значительно увеличивало активность Ж С в обеих сублиняях клеток. Это возрастание активности касалось как мембранной, так и ця~ тозолъной фракций клеток. Чем обусловлено обнаруженное увеличение активности Ж С определенно сказать нельзя, однако имеющиеся в литературе данные могут способствовать поникшею данного события. Исследования клинического материала показали, что существует возможность непосредственной активации гена таг химиотерапевтическими препаратами, поскольку из 41 исследованных образцов опухолей нейробластомы лишь 6% опухолей пациентов, не прошедших курс химиотерапии,имели повышенный уровень мРНК гена &ЗЛУ, тогда как у прошедших курс лечения увеличение экспрессии гена наблюдалось у 42% (ВоигМэ е.а., 1989). Подобно тому, как промотор гена таг 1 может прямо активироваться многими противоопухолевыми препаратами (КопЬо е.а.,1989), присутствие цитотоксического препарата БЗ может вызывать увеличение транскрипционной активности гена, ответственного за синтез Фермента, влияющего на функциональную активность Р-гли-

копротеина. Тем не менее, могут оказаться существенными и другие механизмы, участвующие в активации Ж С, такие как снижение скорости ее протеолиза, изменение конформации молекулы или продолжительности ее существования.

Накопление флуоресцентного красителя Хехст 33 342 клетками чувствительных и устойчивых вариантов. Исследование накопления различных препаратов (обычно меченых радиоактивными изотопами) чувствительными и устойчивыми вариантами клеток является широко используемым методом при изучении ШУ, поскольку позволяет количественно оценить различия между сублиниями клеток (Inaba е.а.,1979} Skovagaard е.а.,1976; Tsuruo е.а.,1933). Вариацией этого метода является применение флуоресцентных красителей, имеющих определенные внутриклеточные мишени (Laiande е.а.,1981; Morgan е.а.,1988; Ефимова,1988; Neifakh. е.а.,1989).

В работе использовали не интеркалирующий, АТ-специфичный■ гаситель Хехст 33 342, увеличивающий интенсивность флуоресценции более чем в 40 раз только при связывании с хроматином (Latt.wohlebb,1975)• Сравнение величин максимальной интенсивности флуоресценции после инкубации клеток в присутствии 10 мкЫ Хехста 33 342 дало следующие значения: CH0-KI - 226+14, вариант СЕ 3/10 - 35+2, СЕ 6/10 - 38+2.5. Различие в интенсивности флуоресценции мевду чувствительными и устойчивыми вариантами клеток составляло 6 раз.

Для выяснения роли ПК С в обеспечении фенотипа }MJ исследовали изменение интенсивности флуоресценции клеток после достижения ими плато насыщения, добавляя в среду инкубации препараты, способные тем или иным способом модулировать активность ПК С. Эффективными для изменения интенсивности флуоресценции оказались в большей степени ингибиторы, чем активаторы ПК С. Так, блокатор каналов вёрапамил в концентрации 10 мкМ вызывал за 15 мин увеличение флуоресценции Хехста 33 342 на 22% у чувствительных и на 100$ у устойчивых вариантов клеток, а ингибитор ПК С и кальмодулина трифторперазин (ТФП) в той же концентрации - на 52% у чувствительных и 460$ у устойчивых вариантов (рис.2). Кратковременная обработка клеток фор-боловым эфиром (ТФА), вызывающая транслокацию Ж С на мембраны клеток, или ингибитором протеолиза фермента Е-64 не меняла интенсивности флуоресценции обоих типов клеток (рис.2,Б).

я я

300

со и о

ф СП

0,4 о га

Е1200

л а, е-> о о в о о

£КЮ0

о к си Ен К К

41

200-

к

э 15(

а> СГ о

си со

ач

о со

3 ® >9<И

Л Ск ь ш о Й , о о « К

Ш

о из

О) Ен К

к

Ю(

5С

СН0-К1 Л_

СЕ 6/10

да=кт

СЕ 3/10

Рис.2.Накопление ДНК-специфичного флуоресцентного красителя Хехст 33 342 клетками чувствительного и устойчивых вариантов. А и Б - два независимых эксперимента. Приведены средние значения интенсивности флуоресценции и их стандартные ошибки.

I - контроль; 2 4 - 15' Е-64; 5

15' ТФП; 3 - 15' верапамил; 15" ТФА; 6-48 час ТФА.

Однако ингибитор лротеолиза ПК С оказался эффективным дри совместной обработке клеток с Хехстом 33 342 (снижение интенсивности флуоресценции на 13 и 23$?), и особенно в том случае, когда в среде инкубации присутствовал ТФА. (снижение интенсивности флуоресценции на 49 и 47^, соответственно для чувствительных и устойчивых вариантов клеток (рис.3). Различая между вариантами СЕ 3/10 ж СЕ 6/10 по влиянию на накопление Хехста 33 342 как ингибиторов, так и активаторов ПК С обнаружено не было.

Исследование накопления Хехста 342 клетками, лишенными ПК С, проводили после 48 часовой обработки ТФА, приводящей к значительному снижению, вплоть до исчезновения фермента (Мс Са^еу е.а.,1984; РаЬЬго е.а.,1986). Сравнение величин интенсивности флуоресценции таких клеток с их аналогами, растущими в среде без ТФА, обнаружило, что происходит увеличение значения этой характеристики у клеток чувствительного варианта (на 2Ъ%) и не меняется у устойчивых вариантов клеток (рис.2). В работах последних лет показано, что подвиды ПК С по-разному реагируют на продолжительную обработку ТФА: наиболее чувствительным оказался ¿-изозим ПК С, тогда как р- и менее

СН0-К1

СЕ 6/10

240

I

о

Ф го о да ]£§ 160

л о<

Еч О О £ О О

м к

80

О 5! К К

80

ж <о

ая

Рис.3.

м +

§

В) **

ш

рЬ

■ч1 +

5$ О е-<

?

Накопление ДНК-специфичного красителя Хехст 33 342 клетками чувствительного /СН0-К1/ и устойчивого /СЕ 6/10/ вариантов в присутствии ингибитора про-теолиза Е-64 и форболового эфира.

чувствительны (Cooper е.а.,1989; Hooper е.а.,1990). Разная реакция на длительную обработку ТФА чувствительных и устойчивых вариантов клеток, вероятнее всего, результат изменения спектра изозимов ПК С в клетках с 5Ш".

Регистрируемая интенсивность флуоресценции клеток после обработки их Хехстом S3 342 отражает не только транспорт красителя через плазматическую мембрану (как в клетку, так и из нее), но и его связывание со своими мишенями, АТ-парами ДНК. Изменение скорости выведения многих химиопрепаратов показано для большинства устойчивых клеток (Dan¿ е.а.,1972} Розенблат И др.,1973; Skovsgaard е.а.,1978; Inaba е.а.,1979) и,.безусловно, является важнейшим механизмом, обеспечивающим МЛУ. Однако из литературы известно о возможности существования дополнительных механизмов, обеспечивающих устойчивость, в том числе - изменении внутриклеточных мишеней для противоопухолевых препаратов. Это подтверждает отсутствие корреляции между внутриклеточным содержанием препаратов и их цитотоксическим действием (Capranico е.а.,1987; Supino е.а.,1988), между уровнем устойчивости клеток и накоплением ими химиопрепаратов (Tsuruo е.а.,1986), а также неодинаковые уровни устойчивости к разным агентам у одних и тех же клонов (Tsuruo е.а.,1986).

С целью исключения транспортных процессов варианты клеток после предварительной обработки Хехстом 33 342 и отмывок в растворе lemca, обрабатывали вераламилом или ТФП в среде без красителя, фактически не меняясь за 3 часа в вариантах клеток, находящихся в чистой среде, интенсивность флуоресценции клеток, обработанных вераламилом или ТФП увеличилась: в среде с верапамилом на 20 и 33,«, с ТФП - на 53 и 440%, соответственно в исходном и устойчивых вариантах (рис.4).

Сравнение потенцирования флуоресценции в результате действия ТФП за счет внутриклеточного количества Хехста 33 342 с потенцированием флуоресценции в среде с 10 мкМ красителя, проведенное в отдельном эксперименте, обнаружило лишь незначительную разницу в значениях интенсивности флуоресценции, составляющую 8% для чувствительных и 18JS для устойчивых вариантов клеток.

Полученные результаты позволяют предположить существова-

Рис.4.Изменение Флуоресценции клеток, предварительно инкубированных с Хехстом 33 342 /10 мкМ/, после их обработки 10 мкМ ТФП СИ или 10 мкМ верапамила (2) в среде без красителя. о - о СН0-К1; • - • СЕ 6/10.

ние внутриклеточных механизмов, ограничивающих связывание флуоресцентного красителя Хехст 33 342 со своими мишенями, обусловленное ПК С-зависимым фосфорилщрованием неизвестных субстратов. Ими могут быть белки зфоматина или ферменты, присутствующие в ядре, которые являются хорошими субстратами для ПК С (Кио,1982;5аЬуош1 е.а.,1986), либо неспецифические белки-сорбенты цитоплазмы.

Окрашивание клеток интеркалятором ДНК БЭ осуществляли, измеряя интенсивность флуоресценции клеток, инкубированных с БЭ в концентрации 25 мкг/мл. После 30-минутной инкубации с БЗ клетки достигали максимальных значений интенсивности флуоресценции и различие меаду чувствительным и устойчивыми вариантами составляло при данной концентрации БЭ 3 раза. Таким образом, обнаруженная разница в накоплении БЭ не может полностью объяснить устойчивости данных вариантов, которая была з 31 раз вше, чем у клеток СН0-К1 (см. стр. ■/0 ). Совместная инкубация с БЭ и верапамилом (10 мкМ) или ТФП (10 мкМ) приводила к значительному увеличению интенсивности флуоресценции устойчивых вариантов клеток - в 3.5 раза при инкубации с верапамилом и в 12 раз при инкубации с ТФП. Поскольку из литературы известно, что присутствие ТФП не увеличивает количества адриамкцика в клетках (Ganapathi е.а.,1988), то обнаружен-

ное увеличение- интенсивности флуоресценции, вероятно, следует оценивать как результат модификации клеточных мишеней, делающей их более доступными для БЭ.

Использование БЭ дало возможность оценить транспортные процессы из клеток в окружающую их среду, поскольку после помещения прединкубщюванных с БЭ клеток в среду без красителя можно было регистрировать уменьшение значений интенсивности флуоресценции клеток (табл.4).

Таблица 4. Снижение флуоресценции клеток, предварительно проинкубированных с БЭ в концентрации 25 мкг/одг, после помещения их в среду без красителя

Время от начала эксперимента Вариант клеток

CH0-KI СГВ 6/10

0 128+6* (10QO 45+1.5 (100^5)

2 мин 121+4 (<ЗВ%)Ш 21+1.5 (47$)

10 щи 112+4.5 (87*) 14+0.5 (31%)

SO глин 60+3.5 (47%) 0

Примечание: представлены средние значения величины интенсивности флуоресценции 1 клетки и стандартные ошибки средних значений;

шэоцент от исходного значения величины интенсивности флуоресценции.

Из таблицы 4 видно, что интенсивность флуоресценция как чувствительных, так и устойчивых клеток быстро снижается, однако этот процесс вдет с разной скоростью. Помещение предикку-бироваяных с БЭ клеток в среду с верадамилом или Т5П препятствовало снижению интенсивности флуоресценция клеток. В случае вераладала это можно объяснить его конкуренцией за связывание с р-гликопротеином (Pastan,Got-fcesman,1988). ТФП также препятствовал падению интенсивности флуоресценции, но, помимо этого, через 2 шя происходило увеличение флуоресценции клеток, достигающее у устойчивых вариантов 188$. Через 10 мин после начала отмывки незначительно увеличивалась и флуоресценция клеток CH0-KI. Подобное увеличение Флуоресценции подтверждает возможность существования эффективных механизмов ззш.иты

хроматина от ДНК-тропных агентов в устойчивых клетках, регулируемых фосфорилированием неизвестных субстратов. Потенцирование флуоресценции в такой эксперименте противоречит мнению об усилении входа гасителей в устойчивые клетки или блокирования их выхсща в результате действия Т5Ю.

Чувствительность клеток исходного и устойчивых вариантов к верапамилу и трифторперазину оценивали по их способности к клонообразованию в присутствии этих препаратов. Результаты клонирования показали повышенную чувствительность высокоустойчивых вариантов к исследуемым веществам (рис.5). Клетки линии СН0-К1 клонировались в присутствии 10 мкМ верапамила с эффективностью 95%, тогда как эффективность клонообразования устойчивых вариантов составляла 60$. Подобное изменение чувствительности было обнаружено и для МП. В присутствии 10 мкМ ТФП эффективность клонирования клеток исходного варианта составляла 95$, клетки обоих устойчивых вариантов клонировались лишь с 40% эффективностью. По чувствительности к верапамилу и ТФП клетки устойчивых вариантов меаду собой не различались.

Присутствие т5п в среде для культивирования клеток резко усиливало токсичность БЭ для устойчивых вариантов клеток. Эффективность клонирования устойчивых вариантов при 5 мкг/мл БЭ составляла 95$, но в присутствии этой же концентрации БЭ и 3 мкМ ТВП удалось получить только 5$ клонов. Полученные результаты согласуются с литературными данными об усилении цитоток-

Рис.5. Клонирование клеток линии сн0-к1 и варианта сб 3/10 в присутствии верапамила /а/ и трифторперазина /б/ о-о сн0-к1; *-* се 3/10.

¡ЯГ

"40 мкМ 2 i б-В-10 мкМ

сичности химиопрепаратов в присутствии как верапамила, так s *Pffl (Tsuruo е.а. ,1982,1983; Ganapathi,GrabOT»Bki,1983; Kessel, Wilberding,1985).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании собственных и литературных данных можно считать существенной роль ПК С в обеспечении устойчивого фенотипа. Существует прецедент, позволяющий рассматривать ПК С-зависимое фосфорилирование как механизм регуляции транспортных процессов. Известно, что активация Ж С связана с усилением экзоцитоза серотонина и арахидоната в тромбоцитах и секреции амилазы и инсулина клетками поджелудочной железы, а также с высвобождением гистамина и ферментов лизосом в нейтрофилах. Как предполагаемые субстраты для Ж С рассматривают также мембранные белки, участвующие в транспорте Са^+, Ка+, к+ и глюкозы, причем показано, что их активность регулируется фосфорилированием (см. обзоры: Ilishizuka, 1986,1989).

Обнаруженное в настоящей работе изменение активности фермента как в сторону увеличения, так и снижения, тем не менее не исключает роли Ж С в фосфорилироваяии Р-гликопротеина и, таким образом, в поддержании устойчивости. Обнаруженное изменение соотношения ХЛ/ФЛ, ведущее к снижению микровязкости мембран, в тех вариантах, которые характеризуются уменьшением активности мембраносвязанной Ж С, может способствовать усилению Ж С-зависимого фосфорилированкя. Более существенным, чем увеличение активности фермента, может быть изменение его изозим-ного состава, что подтверждается изменением профилей элюцип мембранных препаратов устойчивых вариантов я измененной реакцией клеток с МЛУ на длительную обработку ТФА. Данные об изменении спектра изозимов в клетках с МЛУ известны из литературы

(Aquino е.а. ,1990).

Важными для оценки роли фермента является также результаты по влиянию цитотоксического препарата БЭ на активность Ш С, полученные при культивировании устойчивых вариантов клеток в среде с БЭ в нетоксичной для них концентрации.

Безусловно, что и результаты исследования накопления флуоресцентного красителя Хехст 33 342 в условиях увеличенной

или уменьшенной активности фермента сввдетельствуют в пользу его участия в ИДУ. Усиление резистентности клеток в результате обработки их TSA известно из литературы (Ferguson,1987j Fine е.а.,1988) и показано в настоящей работе.

Эксперименты по изменению флуоресценции клеток в отсутствие гасителя в окружающей их среде свидетельствуют о существовании в вариантах клеток с МЛУ дополнительных внутриклеточных механизмов устойчивости, обеспечиваемых ПК С-зависимым фосфорилированием неизвестных субстратов.

ВЫВОДЫ

1. Селекция сублиний клеток с МЯУ в присутствии бромистого этвдия может приводить к отбору вариантов как с уменьшенной, так и с увеличенной активностью ПК С. Г вариантов СЕ 3 и СЕ 6, характеризующихся повышенной активностью фермента, это увеличение обнаруживается на первом этапе селекции и усиливается при последующем увеличении устойчивости.

2. Варианты 1.еЪгб25 и СеЬг, в которых обнаружено уменьшение активности ПК С в мембранах, проявляют изменение в липвд-ном составе мембран. Снижение отношения холестерин/фосфолипи-ды, характерное для данных вариантов клеток, сввдетельствует об уменьшении микровязкости их мембран.

3. В устойчивых к БЭ вариантах клеток, вероятно, происходит изменение изозимного состава ПК С, что следует из результатов хроматографии в ступенчатом градиенте и из измененной реакции на форболовый эфир в устойчивых сублшшх.

4. Присутствие БЭ в среде для культивирования устойчивых вариантов клеток линии CH0-KI в нетоксичной для них концентрации приводит к активации ПК С, что может быть связано с непосредственным проявлением устойчивости.

5. Эксперименты по потенцированию связывания флуоресцентных красителей с ДНК устойчивых вариантов клеток в среде без красителей, за счет их внутриклеточного количества, сввдетельствуют о том, что в устойчивых вариантах клеток существует дополнительный, помимо системы ускоренного выведения ядов, механизм защиты хроматина от ДНЕС-тропных препаратов, связанный с усиленным фосфорилированием неизвестных субстратов.

6. Действие ингибиторов и активаторов ПК С приводит к изменению интенсивности флуоресценции клеток при использовании флуоресцентных: красителей Хехст 342 и БЭ как за счет изменения работы транспортной системы клеток, так и вследствие изменения фосфорилирования неизвестных субстратов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ганелина Л.Ш., Ковалева И.Г., Некрасова Т.П., Лошакова

Л.В., Пашинин Ю.В., Игнатова Т.Н. Содержание холестерина и фосфолшщцов в клетках, чувствительных и устойчивых к бромистому этидию, и его изменение в устойчивых клетках при действии метилтестостерона // Цитология. 1986. Т.28, $ 10. С.1085-1090.

2. Некрасова Т.П., Ганелина Л.Ш., Игнатова Т.Н. Са2+-активи-руемая, фосфолипидзависимая протеинкиназа в трансформированных клетках с генетически обусловленной устойчивость» к бромистому этидию // Материалы Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре. Звенигород. 1986. С.33.

3. Некрасова Т.П., Ганелина Л.Ш., Игнатова Т.Н. Корреляция мевду пролиферативной активностью и активностью протеннкя-назы С в клетках, чувствительных и устойчивых к бромистому этвдию ,// Цитология. 1988. Т.ЗО, В 6. С.710-717.

4. Некрасова Т.П., Ганелина Л.Ш. Различия свойств протеанки-назы С в устойчивых и чувствительных к цитостатикам клетках СЯ0-К1, связанные с различием темпа пролиферации клеток // Цитология. 1988. Т.ЗО, № 10. С.1139.

5. Ганелина Л.Ш., Некрасова Т.П. Цротеинкиназа С и ее роль в нормальных и трансформированных клетках /'/ Цитология.1989. Т. 31, }? 2. С. 131-147.

Заказ №•/£££.. Тираж 100. Формат бумаги 60x84- 1/16. I печ.лист. Ротапринт ПО № 3 Ленуприздата. 191104 Ленинград, Литейный пр., д.55. Бесплатно