Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование модификации множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование модификации множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток"

На правах рукописи

Ермаков« Наталья Владимировна

Исследование модификации множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток

03.00.04 биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино- 2005

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Корыстов Юрий Николаевич.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Новоселова Елена Григорьевна,

кандидат биологических наук Безлепкин Владимир Георгиевич.

Ведущая организация:

Защита состоится _

Филиал института биоорганической химии РАН

&0$г 4 10

¿>о

на

заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при Институте фундаментальных проблем биологии РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 2, ИФПБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фундаментальных проблем биологии РАН.

Авторефера! разослан «_ 25 » 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.Н. Назарова.

/, Ш405

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Работа посвящена исследованию множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток и возможности ее модификации с помощью ингибиторов транспортных белков и повышения оксигенации опухоли.

Онкологические заболевания стоят на втором месте по причине смертности во всем мире. Химиотерапия онкологических заболеваний часто сталкивается с проблемой множественной лекарственной устойчивости опухолей, при которой опухоль приобретает устойчивость к широкому ряду лекарственных препаратов различной структуры и механизма действия. Одной из причин развития устойчивости служит сверхэкспрессия в опухолевых клетках специфических АТФ- зависимых транспортных белков, откачивающих лекарственные препараты из клетки. Эффективным способом подавления МЛУ является использование ингибиторов транспортных белков; другой способ - подавление экспрессии генов, кодирующих эти белки.

Используемые на данный момент в клинике ингибиторы токсичны по отношению к нормальным клеткам и малоэффективны. Поиск селективных и эффективных ингибиторов транспортных белков является задачей первоочередной важности для химиотерапии.

Вопрос регуляции экспрессии генов транспортных белков слабо освещен в литературе. Есть данные о возможном подавлении множественной лекарственной устойчивости активными формами кислорода, однако эти данные противоречивы. Дель работы: Целью настоящей работы явилось исследование подавления и регуляции множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток с помощью ингибиторов транспортных белков и путем изменения уровня активных форм кислорода в опухолевых клетках.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние авермектинов на множественную лекарственную устойчивость клеток лимфолейкоза Р388 и штамма Р388ВР, устойчивого к винкристину.

2. Изучить влияние авермектинов на множественную лекарственную устойчивость клеток рака гортани человека НЕр-2 и штамма НЕр-2ТР, устойчивого к тахсолу.

3. Оценить противоопухолевые эффекты авермектинов in vivo.

4. Исследовать возможность усиления противоопухолевых эффектов винкристина авермектинами in vivo.

5. Изучить зависимость множественной лекарственной устойчивости клеток Р388ВР от срока роста опухоли.

6. Оценить изменение уровня активных форм кислорода по мере роста опухолей

7. Определить влияние увеличения оксигенации опухолей Р388ВР с помощью гипероксии и перфторана на множественную лекарственную устойчивость

Р388ВР.

опухолевых клеток.

Научная новизна работы. Данные об активности природных макролактонов - авермектинов в отношении множественной лекарственной устойчивости в литературе отсутствуют. Впервые показано, что авермектины подавляют множественную лекарственную устойчивость клеток лимфолейкоза Р388 и штамма Р388ВР, устойчивого к винкристину, и опухолевых клеток НЕр-2 и штамма НЕр-2ТР, устойчивого к таксолу. Также впервые исследовано действие авермектинов на рост опухолей in vivo и на противоопухолевый эффект винкристина in vivo. Показано, что авермектины существенно замедляют рост опухолей и усиливают противоопухолевый эффект винкристина в малых концентрациях.

Впервые показано, что множественная лекарственная устойчивость асцитной опухоли лимфолейкоза Р388ВР, устойчивой к винкристину, увеличивается по мере роста опухоли вследствие уменьшения в ней активных форм кислорода. Введение перфторана увеличивает концентрацию активных форм кислорода в опухоли, замедляет ей рост и снижает множественную лекарственную устойчивость.

Практическая значимость работы. Полученные данные могут послужить основой для повышения эффективности химиотерапии злокачественных заболеваний. Адробапия работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на УП, УШ и IX международных конференциях молодых ученых «Биология- наука XXI века» (г. Пущино, 2003, 2004 и 2005 гг); на Международном Биофизическом Конгрессе (15th IUPAB, 5th EBSA International Biophysics Congress, Montpellier, France, 2005).

По материалам работы опубликовано 9 печатных работ в рецензируемых журналах, из них 7 статей в отечественных журналах и 2 статьи в зарубежных журналах. Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список цитированной литературы состоит из 184 источников. Диссертация содержит 25 рисунков и 4 таблицы.

Обзор литературы. Обзор литературы состоит из 2 разделов. Первый раздел посвящен механизмам множественной лекарственной устойчивости, описаны клеточные и неклеточные механизмы, рассмотрена роль транспортных белков. Рассмотрены известные литературные данные об ингибиторах транспортных белков. Во втором разделе описывается регуляция множественной лекарственной устойчивости. Уделяется внимание противоречивости данных о роли сигнальных систем клетки и активных форм кислорода в регуляции устойчивости.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Объекты исследования. Объектом исследования являлись клетки лимфолейкоза Р388, клетки карциномы Эрлиха и клетки рака гортани человека НЕр-2. Был получен устойчивый к

винкристину штамм клеток Р388ВР, также был получен устойчивый к таксолу штамм клеток Нер-2ТР.

2. Определение экспрессии П-гликопротеина. Экспрессию П-гликопротеина в клетках Р388ВР проверяли с помощью полимеразной цепной реакции (Schneider et al., 2001 ; Takara et al., 2003; Baran et al., 2005). Тотальную мРНК выделяли с помощью гуанидин тиоционат содержащего раствора и последующей фенол-хлороформной экстракции. Обратную транскрипцию проводили, используя олиго- dT ("Fermentas", США), ПЦР проводили с помощью набора PCR Master Mix ("Fermentas", США), амплифицировали на амплификаторе "Терцик" ("ДНК-технология", Россия).

3. Определение чувствительности опухолевых клеток к различным агентам по критериям выживаемости клеток и повреждению ядер в опытах in vitro. Авермектины были получены, очищены и предоставлены фирмой "Фармбиомед", Москва. Использовали препараты авермекгинов Al, А2, В1, В2 и комплекс авермектинов аверсектин С и аверсект 3. В экспериментах также использовали: циклоспорин A ("Sigma", США), цисплатину (цис-платииа(11) диамин дигидрохлорид, "Sigma", США); перекись водорода (Россия). Винкристин ("Gedeon Richter", Венгрия) разводили в физиологическом растворе с добавлением 0.9% бензинового спирта. Перед инкубацией in vitro к клеткам добавляли исследуемые агенты. Гибель клеток Р388 и Р388ВР определяли по уменьшению их количества (лизис) и прокраске 0.04%- ным раствором трипанового синего ("Serva", Германия). Повреждение ядер оценивали по конденсации (пикноз) и фрагментации (апоптоз) хроматина. Гибель клеток НЕр-2 и НЕр-2ТР регистрировали по уменьшению их количества, определяемого окрашиванием 0.02% фиолетовым кристаллическим ("Sigma", США) и измерению оптической плотности на спектрофотометре Multiscan Plus.

4. Определение чувствительности опухолей к различным агентам in vivo. Влияние агентов на рост опухолей определяли по изменению их размеров (для солидных опухолей) и количества клеток (для асцитных опухолей) по сравнению с контролем. Объём солидных опухолей определяли по формуле: V=(axb2)/2, где а- максимальный, Ь- минимальный размеры опухоли. По соотношению средних объёмов опухолей в контрольных и опьггных группах определяли торможение роста: TPO=(VK-V0)A'l( х100%, где V, и V, - средние объёмы опухолей в контрольных и опытных группах соответственно.

5 Определение МЛУ в клетках лимАолейкоза Р388 и Р388ВР. МЛУ клеток Р388 и Р388ВР определяли по изменению скорости образования кальцеина в клетках из ацетоксиметилового эфира кальцеина при действии известного ингибитора МЛУ - циклоспорина А. За основу была взята методика Homolya (Homolya et al., 1993), отработанная нами для клеток Р388 (Ермакова и др., 2004). Клетки выделяли, отмывали, помещали в кювету и определяли базовый уровень флуоресценции. Затем в кювету помещали 2 мкМ Со2* (Essodaigui et al., 1998). Кинетику образования кальцеина в клетках регистрировали после добавления к клеткам 100 нМ кальцеина-АМ ("Molecular Probes", США) при постоянном перемешивании

3

на спектрофлуориметре Perkin-Elmer MF44, длины волн возбуждения и эмиссии 493 и 515 нм, соответственно. Для определения скорости образования кальцеина при иягибировании активного транспорта кальцеина-АМ из клеток в кювету добавляли 1 мкг/мл циклоспорина А ("Sigma", США).

МЛУ также определяли по накоплению в клетках кальцеина за определённый срок инкубации в среде. Клетки выделяли, отмывали, инкубировали с добавлением агентов, затем добавляли кальцеин-АМ. Через 10 мин клетки собирали, осаждали, осадок суспендировали в среде без фенолового красного с пониженным содержанием кальция ("Sigma", США). Количество кальцеина в клетках определяли по интенсивности его флуоресценции на спектрофлуориметре Perkin-Elmer MF44, длины волн возбуждения и эмиссии 493 и 515 нм, соответственно.

6 Определение МЛУ в клетках рака гортани человека НЕр-2. МЛУ клеток рака гортани человека НЕр-2 определяли по скорости выхода из клеток родамина 123 (R123) ("ICN", США) (Wielinga et.al., 2ООО). Клетки НЕр-2 высевали на стеклянные пластинки, инкубировали в СОг инкубаторе. Через сутки инкубации клетки отмывали и нагружали их R123 в присутствии циклоспорина А. Пластинку с клетками ставили в кювету в раствор Хэнкса с 0.5% сыворотки, 37°С, и определяли увеличение количества R123 в среде при постоянном перемешивании. Через 4 мин добавляли ингибиторы в необходимой концентрации. Количество всего R123 в клетках определяли добавлением в кювету 0,02% дигитонина ("Sigma", США). Относительное количество R123 в клетках (N) определяли по формуле: N=l-{(IrI)r/flmn-k)}, где /<, f„ - флуоресценция RI 23 в среде в моменты времени t, 0 и максимальная, после добавления дигитонина, соответственно. Затем определяется отношение скоростей выхода родамина 123 в контроле и после добавления ингибитора, R-1 Это соотношение минус единица характеризует МЛУ.

7 Определение активных форм кислорода в клетках лимфопейкоза Р388 и Р388ВР Относительную концентрацию активных форм кислорода (АФК) в клетках опухоли определяли по интенсивности флуоресценции 2',7'-дихлорфлуоресцеина (ДХФ) по методу (Bass et al., 1983; Tan et al., 1998). За 30 мин до забоя всем мышам внутрибрюшинно вводили 2',7'-дихлорфлуоресцеин диацетат (ДХФ-ДА), 0.36 мг/мьппь. После забоя мышей опухолевые клетки извлекали, помещали 1 млн. клеток в раствор Хэнкса с 0.5% сыворотки, 37°С, и измеряли интенсивность флуоресценции при постоянном перемешивании на спектрофлуориметре Perkin-Elmer MF44 при длинах волн возбуждения и эмиссии 475 и 525 нм, соответственно.

8. Введение перфторана и создание условий гипероксии. Для увеличения концентрации кислорода в клетках опухоли мышей помещали па 1.5 час в камеру, содержащую 95% Ог и 5% COj — гипероксия или за 1.5 час до забоя внутрибрюшинно вводили 0.5 мл перфторана (аптечный препарат).

9. Статистическая обработка результатов. Для опытов, выполненных в трех и более повторностях, определяли средние арифметические значения и стандартные отклонения. Различия между группами считали достоверными при р < 0.05 при расчете с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Часть 1. Авермектины — новый класс ингибиторов множественной лекарственной устойчивости

Один из способов подавления множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) -подбор эффективных ингибиторов транспортных белков. Существующие на данные момент ингибиторы не снимают МЛУ полностью при клинически достижимых концентрациях (Fisher, Sikis, 1995). Авермектины - соединения макролидной природы, продукты жизнедеятельности Streptomyces aveimitilis, применяются в ветеринарии и клинике человека как противопаразитарные препараты. Есть единичные данные об ингибировании П-гликопротеина синтетическим аналогом авермектина В1 - ивермектином. В настоящей работе впервые изучено влияние отдельных природных авермектинов и их комплексов на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток. 1.1. Влияние авермектинов на МЛУ клеток лимфолейкоза Р388 и Р388ВР. 1.1.1. Оценка МЛУ штамма клеток лимфолейкоза Р388ВР, устойчивого к винкристину.

Известно, «по обработка популяции клеток противоопухолевыми препаратами приводит к отбору устойчивых клеток, выживающих при больших дозах агентов. Нами был получен штамм клеток лимфолейкоза Р388ВР, устойчивый к винкристину. Для клеток дикого типа концентрация винкристина, вызывающая гибель 50% клеток, IC50, составляет 14 нМ. После введения витфистина устойчивость клеток возрастает с каждым пассажем: IC50 для клеток после второго, четвертого и шестого введения винкристина составляет 160, 350 и 1624 нМ, соответственно. Также было показано, что штамм после шестого введения винкристина более устойчив к агенту, чем дикий тип, по критерию повреждения ядер (Korystov et al., 2004). Штамм после шестого введения винкристина был обозначен как Р388ВР.

Штамм Р388ВР также обладал устойчивостью к рубомицину: IC50 клеток Р388 составляет 347 нМ, а клеток Р388ВР 3540 нМ.

Мы исследовали влияние цисплатины и перекиси водорода, не являющихся субстратами транспортных белков, на устойчивые клетки лимфолейкоза Р388ВР. Было показано, что чувствительность штамма Р388ВР к этим агентам такая же, как у родительской линии Р388. Это позволяет сделать вывод, что устойчивость нашего штамма клеток лимфолейкоза к винкристину обусловлена повышением экспрессии транспортных белков.

Экспрессию П-гликопротеина в клетках Р388ВР проверяли с помощью полимеразной цепной реакции (Schneider et al., 2001; Takara et al., 2003; Baran et al., 2005). Показано, что уровень экспрессии гена mdr\ в клетках Р388 дикого типа меньше, чем в клетках Р388ВР (рис.1).

"1 2 3 4 Рис.1. Электрофореграмма результатов ПЦР-анализа

экспрессии гена mdrl в клетках Р388 и Р388ВР. 1- mdrl в клетках Р388, 2- mdrl в клетках Р388ВР, 3- ß-акпш в в Ш клетках Р388,4 ß-акпш в клетках Р388ВР.

1.1.2. Модификация противоопухолевого эффекта вткристина на клетках Р388 и Р388ВР авермектинами.

Авермектины А1, А2, В1 и В2 не влияли на выживаемость клеток до концентрации 1000 нМ включительно. При исследовании влияния авермектинов на транспорт и чувствительность клеток к другим агентам их использовали в нетоксичных концентрациях.

Показано, что авермектин В1 в концентрации 300 нМ снижает 1С50 винхристина для клеток Р388 с 14 нМ до И нМ (в 1.3 раза), для клеток Р388ВР с 1624 нМ до 32 нМ (в 51 раз) (рис. 2а и 2Ь).

Рис. 2. Влияние винкристина (1) и винкристина в сочетании с авермектином В1, 300 нМ (2) на выживаемость клеток Р388 (в) и Р388ВР (А).

Было изучено влияние различных природных авермектинов на выживаемость клеток Р388ВР, обработанных нетоксичной для устойчивых клеток концентрацией винкристина, 100 иМ. Из рис. 3 видно, что модифицирующие концентрации авермектинов, увеличивающие чувствительность к винкристину на 50% (МС50), составляют 15,59,74,209, 460 и107 нМ для авермектинов А1, А2, В2, В1, ивермектина и циклоспорина А,

соответственно. Наиболее эффективным для клеток Р388ВР оказался авермектин А1, он в 7 раз активнее циклоспорина А, а наименее активным - ивермектин.

100 90

80

*70

г" во

а

»50-

а

I «оз

« 30 20 100-

Рис. 3. Влияние ивермектана (1), циклоспорина А (2), авермектинов В1 (3), В2 (4), А2 (5), А1 (6) на выживаемость клеток Р388ВР в присутствии винкристина, 100 нМ.

0.1

1 ю

Концентрация, нМ

100

1000

Также исследовали влияние авермектинов на чувствительность клеток Р388 и Р388ВР к платидиаму. Показано, что авермектин В1 не влияет на действие платидиама. Это подтверждает, что модифицирующий эффект авермектинов связан с интибированием транспортных белков МЛУ.

11.3. Действие авермектинов на активность транспортных белков МЛУ.

С помощью кальцеина-АМ мы исследовали способность природных авермектинов подавлять активность белков МЛУ. Были определены зависимости увеличения кальцеина в клетках Р388ВР от концентрации ингибиторов для всех авермектинов. В таблице 1 представлены концентрации агентов, увеличивающие количество кальцеина в клетках вдвое.

Таблица 1. Концентрации ингибиторов, увеличивающие флуоресценцию кальцеина в клетках Р388ВР в 2 раза (С2).

Агент Цик.А Авер-н А1 Авер-н А2 Авер-н В1 Авер-н В2 Аверсектин С Ивермек-н

С2,нМ 108 210 240 385 104 144 270

Как видно из таблицы, активность авермектинов по подавлению транспорта кальцеина-АМ сопоставима с активностью циклоспорина А, максимальный эффект достигался при обработке клеток авермектином В2.

Таким образом, впервые исследовано действие природных авермектинов па множественную лекарственную устойчивость клеток лимфолейкоза мышей Р388 и

резистентного к вннкристину штамма Р388ВР. Обнаружено, что авермектины в нетоксичных концентрациях повышают чувствительность клеток Р388 и Р388ВР к винкристину. Самым эффективным оказались авермектины AI и А2. Также показано, что авермектины подавляют транспорт флуоресцирующего субстрата транспортных белков кальцеина-АМ. 1.2. Влияние авермектинов на МЛУ клеток рака гортани человека НЕр-2 и НЕр-2ТР. 1.2 1 Оценка МЛУ штамма клеток НЕр-2ТР, устойчивого к таксону

Был получен штамм клеток рака гортани человека НЕр-2, устойчивый к таксолу. IC50 таксола равна 1.66 нМ для штамма НЕр-2ТР и 0.03 нМ для клеток НЕр-2 (рис. 4). Штамм НЕр-2ТР также обладал устойчивостью к винкристину. IC50 винкристина для этого штамма на порядок выше, чем для чувствительных клеток: IC50 для НЕр-2ТР равно 151 нМ, а для НЕр-2 15.7 нМ (рис. 5).

Таксол, как и винкристин, является субстратом Пгп (Mistry, Stewart, 2001), а приобретенная множественная устойчивость клеток НЕр-2ТР, по-видимому, обусловлена сверхэспрессией транспортных белков МЛУ.

Рис. 4. Влияние таксола на выживаемость клеток НЕр-2 (2), НЕр-2ТР (2), и таксола в сочетании с авермектином В1, 300 нМ, на выживаемость клеток НЕр-2 (3) и НЕр-2ТР (<)■

1Е-4 1Е-3 0.01 0.1 1 10

Таксол, нМ

12 2 Модификация эффекта противоопухолевых препаратов на клетки НЕр-2 и НЕр-2ТР авермектинами.

Авермектины Al, А2, В1 и В2 не влияли на выживаемость клеток до концентрации 1000 нМ включительно. При исследовании влияния авермектинов на транспорт и чувствительность клеток к другим агентам их использовали в нетоксичных концентрациях.

Было показано, что авермектин В1 в концентрации 300 нМ снижает IC50 таксола для клеток НЕр-2 с 0.03 нМ до 0.002 нМ (в 15 раз), а для НЕр-2ТР с 1.66 нМ до 0.0014 нМ (в 1185 раз) (рис. 4). Клетки дикого типа НЕр-2 также обладают некоторой устойчивостью, которая снимается добавлением авермектинов. Авермектин В1 повышал чувствительность клеток НЕр-2ТР и НЕр-2 также к винкристину. Авермектин В1 300 нМ снижает IC50 винкристина для клеток HEp-2'ГР с 151 нМ до 13 нМ (в 12 раз), а для клеток НЕр-2 с 15.7 нМ до 4.3 нМ (в 3.6 раза) (рис. 5).

Рис. 5. Влияние винкристина (1) и винкристина в сочетании с авермектином В1, 300 нМ, (2)на выживаемость клеток НЕр-2 (в) и НЕр-2ТР (Л).

Сравнивали действие разных авермектинов на модификацию выживаемости клеток НЕр-2, подвергнутых воздействию таксола, 0.005 нМ, выживаемость при згой концентрации была принята за 100%. Как следует из рис. 6 концентрации агентов, модифицирующих выживаемость на 50% (МС50), составляют 35, 59, 107 и 200 нМ для А2, А1, В2, В1, соответственно. Следовательно, авермекгины группы А более эффективны в подавлении устойчивости клеток НЕр-2ТР к противоопухолевым препаратам.

1.2.3. Действие авермектинов на активность транспортных белков клеток НЕр-2.

Действие авермектинов на транспортные системы клеток, обеспечивающие МЛУ, было проведено методом определения скорости выхода из клеток родамина 123. Определяли отношение скоростей выхода родамина 123 из клеток НЕр-2 в контроле и при добавлении ингибитора (11-1). Действие авермектина А1 сравнивали с эффектом известного ингибитора МЛУ циклоспорина А. На рис. 7 показана зависимость Л-1 от концентраций авермектина А1 и циклоспорина А. Величина максимума зависимости Я-1 от концентрации ингибиторов, определяемая отношением скоростей выхода родамина 123 без ингибиторов и при полном подавлении активного транспорта служит характеристикой МЛУ клеток. Ингибирующую

эффективность агентов отражает их концентрация, при которой Я-1 равно половине максимальной величины. Обнаружили, что авермектин А1 в 2 раза эффективнее циклоспорина А. Снижение величины Я-1 с увеличением концентрации ингибиторов больше концентрации, при которой Я-1 максимально, по-видимому, обусловлено увеличением пассивной проницаемости мембраны под воздействием ингибиторов, являющихся гидрофобными агентами. Токсичность авермектинов и циклоспорина А для клеток при концентрациях больше 1 ООО нМ также обусловлена действием на мембрану.

Рис.7. Зависимость (R-1) для циклоспорина А (/) и авермектина Al (2) на клетках НЕр-2

100 1000 10000

Концешрадия, нМ

Таким образом, впервые исследовано действие природных авермектинов на множественную лекарственную устойчивость клеток НЕр-2. Показано, что авермектины в нетоксичных концентрациях повышают чувствительность клеток дикого типа и устойчивого к таксолу штамма к винкристину и таксолу и ингибируют откачку из клеток субстратов транспортных белков. Обнаружены индивидуальные различия авермектинов: наиболее активны авермектины группы А. Сравнение с циклоспорином А показало, что авермектин А1 в 2 раза эффективнее подавляет активность транспортных белков, обуславливающих МЛУ.

1.3. Противоопухолевые эффекты авермектинов.

В литературе информация о действии авермектинов на опухолевые клетки in vivo отсутствует. Нашей задачей было изучить действие природных авермектинов и их комплексов на рост асцитных и солидных перевиваемых опухолей животных ín vivo.

1.3.1. Действие аверсектина С на асцитную опухоль лимфолейкоз Р388.

Исследовали влияние аверсектина С на рост асцитной опухоли лимфолейкоз мышей Р388. Мышам внутрибрюшинно вводили препарат в исследуемых концентрациях, а через 7 суток мышей забивали и подсчитывали количество опухолевых клеток в брюшной полости.

10

При введении аверсектина С 1 мкг/г через двое суток после прививки одно, дву-, трех- и четырехкратно с интервалом в 1 сутки количество клеток в опухоли уменьшается линейно с ростом суммарной дозы аверсектина С и при суммарной дозе 4 мкг/г снижается до 8% от контроля (рис. 8).

Рис.8. Влияние аверсектина С, 1 мкг/г, на рост асцитной опухоли Р388 в брюшной полости мышей ОВА2. 1 -Аверсектин С вводился однократно через 2 суток после прививки опухоли, 2- двукратно с интервалом в 1 сутки, 3-трехкратно с интервалом в 1 сутки, 4-четырехкратно с интервалом в 1 сутки.

Аверсектин С, мкг/г

10

1.3.2. Действие аверсектина С на солидную карциному Эрлиха.

Исследовали влияние введения аверсектина С на рост солидной карциномы Эрлиха. Препарат вводили через сутки после прививки в дозе 3 мкг/г. Изучали эффективность аверсектина С при различных способах введения, показали, что при введении препарата внутрибрюшинно эффект максимален. Внутрибрюшинно вводили разные дозы аверсектина С и измеряли объем опухоли на различных сроках роста. Показано, что аверсектин С подавляет рост солидной карциномы Эрлиха, и эффект возрастает с увеличением дозы вплоть до 9 мкг/г.

1.3 3. Влияние авермектина В1 на рост солидной карциномы Эрлиха.

Изучали влияние авермектина В1 на рост солидной карциномы Эрлиха. При введении его in vivo, активность авермектина В1 сопоставима с активностью аверсектина С. При однократном введении 1 мкг/г авермектина В1 мышам с солидной карциномой Эрлиха через 5 суток после прививки торможение роста опухоли (ТРО) равно ТРО аверсектина С и составляет 57%. Однако ТРО аверсектина С снижается во времени гораздо медленнее, чем ТРО авермектина В1. Т.е., нарастание опухоли после введения комплекса авермектинов происходит медленнее, чем при введении чистого авермектина В1 Возможно, это обусловлено сочетанным действием комплекса авермектинов на организм, или же авермектины группы А, присутствующие в комплексе, также более активны в условиях in vivo, как и in vitro.

Таким образом, при введении in vivo авермектины способны тормозить рост опухолей. Наибольший эффект достигается при суммарной дозе больше 4 мкг/г.

1.4. Усиление противоопухолевых эффектов винкристина авермектинами in vivo.

Показано, что авермектины подавляют множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток in vitro. Интересным представляется исследовать влияние авермектинов на противоопухолевое действие лекарственных препаратов in vivo.

141. Действие винкристина в сочетании с авермектинами на солидную карциному Эрлиха.

Показано, что авермектин Bl, 1 мкг/г, и аверсектин С, I мкг/г, увеличивают торможение роста солидной карциномы Эрлиха винкристином.

1.4 2 Действие винкристина в сочетании с авермектинами на лимфолейкоз Р388.

Сочетанное действие вишфистина с авермектинами исследовали как на рост опухолей лимфолейкоз Р388, так и на среднюю продолжительность жизни (СПЖ) мышей с опухолями. Авермектин В1 не влиял на рост опухоли Р388 in vivo в концентрации до 1 мкг/г: выживаемость составляет 90±12%. На рис. 9 показано действие авермектина В1 на рост опухоли Р388, обработанной винкристином, 180 нг/г. Количество клеток в опухолях при данной концентрации винкристина принято за 100%. Показано, что авермектин В1 удваивает эффект винкристина в концентрации 55 нг/г.

Рис.9. Влияние авермектина В1 на рост опухоли Р388 в сочетании с винкристином, 180 нг/г, in vivo.

га...................i..........

10 100 1000 Авермектин Bl, шУг

Было изучено влияние авермектина В1 на СПЖ мышей. Все исследованные концентрации авермектина В1 (от 0,3 до 9 мкг/г) самостоятельно не влияли на продолжительность жизни животных. Однако совместное введение винкристина, 0.2 мкг/г, и авермектина В1, 1.5 мкг/г, увеличивало СПЖ: при введении одного винкристина она составляла 13±0.2 суток (на 30% больше контрольной), а при добавлении авермектина В1 -15±0.5 суток (на 50% больше контрольной).

1.4.3 Противоопухолевое действие винкристина в сочетании с авермектинами на резистентный штамм Р388ВР.

Исследовали также сочетанное действие винкристина с авермектинами на лимфолейкоз Р388ВР, резистентный к винкристину. СПЖ мышей контрольной труппы

составляла 11+ 0.5 суток. Аверсект 3- природный комплекс авермектинов с преобладающим содержанием авермектинов группы А. Введение винкристина, 0.2 мкг/г, увеличивало СПЖ мышей до 14.7±0.2 суток (на 33% больше контроля), а сочетанное действие винкристина с аверсектом 3, 0.3 мкг/г, — 16.7±0.3 суток (на 52% больше контроля).

Таким образом, в данной работе впервые показано, что авермектины усиливают противоопухолевое действие винкристина in vivo. Также совместное введение авермектинов с винкристином повышает СПЖ мышей как с лимфолейкозом дикого типа, так и с устойчивым штаммом. СПЖ возрастает на 50%. Впервые показано различие в индивидуальных особенностях авермектинов в подавлении МЛУ.

Часть П. Регуляция МЛУ опухолей уровнем их оксигенации.

В нескольких работах (Wartenberg et al., 2000; Comerford et al.,2002) было показано, что гипоксические условия индуцируют экспрессию mdr\ в сфероидах опухолевых клеток простаты DU-145 и повышают их устойчивость к противоопухолевым препаратам. Мы исследовали влияние изменения уровня оксигенации клеток асцитной опухоли Р388ВР на МЛУ.

2.1. Зависимость МЛУ клеток Р388ВР от срока роста опухоли.

Исследовали изменение множественной лекарственной устойчивости по мере роста опухоли лимфолейкоза мышей Р388 и Р388ВР. Впервые было показано, что скорость образования кальцеина в клетках Р388ВР зависит от срока роста опухоли (таблица 2).

МЛУ минимальна в клетках дикого типа. В клетках Р388ВР МЛУ возрастает от 2х суточной опухоли к семисуточной. Для клеток Р388 дикого типа зависимости МЛУ от срока роста опухоли не было обнаружено.

Таблица 2. Скорость образования кальцеина в присутствии циклоспорина А (У2) и без него (VI) в клетках лимфолейкоза Р388 и Р388ВР.

Р388 дикий тип Р388ВР, 2 сут Р388ВР, 3 сут Р388ВР, 4 сут Р388ВР, 7 сут

VI, пмоль/106*мин 5.7±1.0 2.9±0.5 2.2±0.2 1.6+0.1 1.210.2

V2, пмоль/106*мин 9.1+1 9.8+0.3 8.7±0.7 8±0.9 8.2±0.7

К, V2/V1 1.600±0.14 3.380+0.8 3.950±0.7 5.000±0.3 6.833±0.6

Увеличение МЛУ по мере роста асцитной опухоли Р388ВР подтверждается также данными по чувствительности клеток к винкристину. 1С50 винкристина равна 14,101 и 1624

нМ для клеток Р388 дикого типа, клеток Р388ВР Зсуточных и клеток Р388ВР 7 суточных, соответственно. Т.е. по мере роста опухоли возрастает транспорт из клеток субстратов транспортных белков кальцеина-АМ и винкристина.

Таким образом, впервые показано, что рост опухоли Р388ВР сопровождается увеличением транспорта кальцеина-АМ, т.е. множественная лекарственная устойчивость клеток Р388ВР увеличивается по мере нарастания опухоли. При этом также увеличивается устойчивость опухоли к винкристину. В то же время уровень устойчивости опухоли дикого типа остается неизменным. Такая закономерность впервые обнаружена при росте асцитной опухоли.

2.2. Изменение активных форм кислорода по мере роста опухолей Р388ВР.

МЛУ асцитной опухоли Р388ВР возрастает по мере её роста. Можно предположить, что увеличение числа клеток запускает некие процессы, ведущие к активации механизмов устойчивости, и данные процессы не являются специфическими для определенного типа опухоли. Мы предположили, что, как и в других типах опухолей (Сотегйэгс1 ег а]., 2002; Wartenberg е1 а1., 2002), причиной изменения МЛУ опухоли Р388ВР является изменение уровня ее оксигенации. Уровень АФК измеряли спектрофлуориметрически с помощью 2',7' -дихлорофлуоресцеин диацетата (ДХФ-ДА). Результаты представлены в таблице 3.

Измерение уровня АФК показало, что максимальный уровень флуоресценции ДХФ наблюдается в двухсуточной опухоли Р388ВР, он составляет 18.9±1.0. Затем флуоресценция ДХФ снижается до 12±0.4 в четырехсуточной опухоли и до 3.6±0.3 в семисуточной.

Таблица 3. Изменение уровня активных форм кислорода в клетках лимфолейкоза Р388 и Р388ВР.

Р388, дикий тип, 7 сут Р388ВР, 2 сут Р388ВР, 4 сут Р388ВР, 7 сут

АФК, отн. ед. 4.210.5 18.9+1.0 12±0.4 3.6+0.3

Как видно из таблицы, уровень флуоресценции ДХФ, и, соответственно, уровень АФК в клетках дикого типа на седьмой день роста близок к содержанию АФК в резистентном штамме. Как было показано выше, МЛУ клеток дикого типа на седьмой день не отличается от МЛУ на более ранних сроках. Таким образом, снижение уровня АФК не ведет само по себе к развитию устойчивости, но увеличивает её лишь у устойчивого штамма.

Возможны несколько причин изменения содержания АФК в брюшной полости мышей при росте опухоли. При перевивке лимфолейкоза Р388ВР количество клеток, попадающих в брюшную полость мыши, составляет 1-2*106. К седьмому дню количество клеток увеличивается до 4-6*108 и возросшее количество клеток является причиной гипоксии в

14

брюшной полости. С другой стороны, дополнительной причиной окислительного стресса на ранних сроках роста опухоли может быть миграция в опухоль лейкоцитов, которые известны как эффективные продуценты активных форм кислорода. В 2-3 суточной опухоли количество лейкоцитов (нейтрофилы, эозинофилы) составляет 2-5% от числа опухолевых клеток, а к 6-7 дню это соотношение падает до 0.4-0.6%.

Показано, что рост асцитной опухоли лимфолейкоза сопровождается уменьшением уровня активных форм кислорода в брюшной полости. Это связано с увеличением числа опухолевых клеток (гипоксия) и снижением числа лейкоцитов.

2.3. Влияние увеличения оксигенации опухолей Р388ВР с помощью гипероксии и перфторана на МЛУ опухолевых клеток.

Снижение МЛУ при повышении оксигенации опухоли позволяет предположить, что искусственное увеличение оксигенации опухоли приведет к повышению чувствительности клеток к противоопухолевым препаратам. Насыщая кислородом кровь, мы можем увеличить содержание кислорода и в опухоли, т.к. опухолевые клетки в брюшной полости контактируют с капиллярами. К этому приводит помещение животных в условия гипероксии или введение в кровь веществ, увеличивающих скорость обмена кислорода между клетками и сосудами. Одним из таких веществ является перфторан (Маеувку е1 а1., 2005), мелкодисперсная эмульсия, увеличивающая площадь поверхности взаимодействия клеток с капиллярами брюшной полости.

Показано, что гипероксия и перфторан одинаково, в 2 раза, увеличивают содержание АФК в клетках Р388ВР (табл. 4).

Таблица 4. Влияние гипероксии и перфторана на образование АФК в клеток Р388ВР.

Условия контроль Перфторан Гипероксия Перфторан + Гипероксия

АФК, отн. ед. 3.6+0.2 7.0±0.5 7.3±0.5 7.7±0.3

Двукратное введение перфторана через 3 и 5 суток после прививки опухолей приводило к снижению количества опухолевых клеток в 2 раза. По-видимому, перфторан в брюшной полости создает окислительный стресс, а в работе Шапошниковой В.В с соавт. показано, что лейкозные клетки чувствительны к окислительному стрессу (Шапошникова и др., 2002). Также было обнаружено снижение МЛУ в 1.7 раза (табл.5).

Таблица 5. Количество клеток и МЛУ в 7 суточных опухолях Р388ВР в контроле и после двукратного введения перфторана.

Условия Количество клеток, *108 МЛУ

Контроль 3.3±0.3 6.8±0.3

Перфторан 1.7±0.4 3.8±0.5

Полученные результаты показывают, что введение перфторана в асцитные опухоли может быть использовано для снижения их МЛУ перед химиотерапией.

Таким образом, в работе впервые показано, что по мере роста асцитной опухоли лимфолейкоза Р388ВР, уменьшается концентрация АФК в опухолевых клетках и возрастает их МЛУ. Концентрацию АФК в опухолевых клетках можно увеличить, выдерживая животных в условиях гипероксии или введением перфторана в опухоль. Двукратное введение перфторана уменьшает количество клеток в опухолях и снижает МЛУ опухолевых клеток.

ВЫВОДЫ:

1. Авермектины подавляют множественную лекарственную устойчивость клеток лимфолейкоза Р388ВР, устойчивого к винкристину, клеток рака гортани человека НЕр-2ТР, устойчивого к таксолу, и их диких типов.

2. Относительная эффективность различных авермектинов в ингибировании множественной лекарственной устойчивости зависит от типа клеток и транспортируемого субстрата.

3. Внутрибрюшинное введение авермектинов в нетоксичных концентрациях подавляет рост опухолей in vivo.

4. При внутрибрюгаинном введении авермектины усиливают противоопухолевый эффект винкристина in vivo.

5. Множественная лекарственная устойчивость клеток лимфолейкоза Р388ВР увеличивается с ростом опухоли.

6. Уровень активных форм кислорода снижается по мере роста опухоли Р388ВР, а выдерживание животных в условиях гипероксии или введение перфторана увеличивает концентрацию активных форм кислорода в опухолевых клетках.

7. Внутрибрюшинное введение перфторана в опухоль Р388ВР снижает количество опухолевых клеток и уменьшает их множественную лекарственную устойчивость.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Сергеев П.В., Семейкнн A.B., Федотова Т.А , Самойликов Р.В., Камерницкий А.В , Левина И.С., Ржезников В.М, Гриненко Г.С., Корыстов Ю.Н., Ермакова Н.В., Шапошникова В.В., Шимановский H.JI. Исследование комбинированного действия доксорубицина и гестагенов на чувствительные и резистентные к доксорубицину клетки MCF-7. Бюлл.Эксп.Биол.иМед.,2003, т.136, №11, с.519-522.

2. Ермакова Н.В., Шапошникова В.В., Левитман MX., Ким Ю.А., Корыстов Ю.Н. Изменение множественной лекарственной устойчивости клеток лимфолейкоза Р388, устойчивых к винкристину, при росте асцитной опухоли. Биологические мембраны, 2004, Т. 21, №2, С. 102-106.

3. Корыстов Ю.Н., Шапошникова В.В., Ермакова Н.В., Кублик Л.Н., Новик Т.С., Мосин В.А., Кругляк Е.Б., Стерлина ТС., Дриняев В.А. Модификация авермектинами чувствительности клеток НЕр-2 к таксолу и винкристину. Биологические мембраны, 2004, Т. 21, №3, С. 220-224.

4. Корыстов Ю.Н., Ермакова Н.В, Шапошникова В.В., Левитман М.Х., Новик Т.С., Мосин В.А., Кругляк Е.Б., Стерлина Т.С., Дриняев В.А. Авермекпшы увеличивают чувствительность клеток лимфолейкоза Р388 к випкристину. Биологические мембраны, 2004, Т. 21, № 3, С.214-219.

5. Дриняев В.А., Мосин В.А., Кругляк Е.Б., Стерлина Т.С., Новик Т.С., Ермакова Н.В., Кублик Л.Н., Левитмап MX., Шапошникова В.В., Корыстов Ю.Н. Противоопухолевое действие природных авермектипов. Антибиотики и химиотерапия, 2004, Т. 49, №5, С. 8-10.

6. Дриняев В. А., Мосин В. А., Кругляк Е. Б., Стерлина Т. С., Новик Т С., Ермакова Н.В., Кублик Л.Н., Левитман М.Х, Шапошникова В.В., Корыстов Ю.Н.. Модификация противоопухолевого эффекта винкристина природными авермектинами. Антибиотики и химиотерапия, 2004, Т. 49, №6, С. 3-5.

7. Yuri N. Korystov, Natalia V. Ermakova, Ludmila N. Kublik, Maria Kh. Levitman, Vera V. Shaposhnikova, Vladimir A. Mosin, Viktor A. Drinyaev, Elena B. Kruglyak, Tamara S. Novik and Tatiana S. Sterlina. Avermectins Inhibit Multidrug Resistance of Tumor Cells. EurJ.Pharmacol., 2004, V.493, P.57-64.

8. Victor A. Drinyaev, Vladimir A. Mosin, Elena В Kruglyak, Tamara S. Novik, Tatiana S. Sterlina, Natalia V. Ermakova, Ludmila N. Kublik, Maria Kh. levitman, Vera V. Shaposhnikova, and Yuri N. Korystov. Antitumor Effect of Avermectins. Eur.J.Pharmacol., 2004, V.501, P.19-23.

9. Корыстов Ю.Н., Ермакова H.B., Шапошникова B.B., Левитман М.Х., Ким Ю.А, Пушкин С.Ю. Введение перфторана в асцитную опухоль мышиного лимфолейкоза снижает количество клеток и уменьшает их множественную лекарственную устойчивость. // Биологические мембраны, 2006, Т.23, №1, С.22-26..

17

10. Ермакова Н.В., Федотчева Т.А. Исследование ингибиторов множественной лекарственной устойчивости клеток по кинетике выхода родамина 123. Тезисы VII Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология- наука XXI века», г. Пущино, 14-18 апреля 2003 г.

П.Ермакова Н.В. Изучение множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток на разных стадиях роста. Тезисы VIII Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология- наука XXI века», г. Пущино, 17-21 мая 2004 г.

12. Ермакова Н.В. Изучение новых ингибиторов множественной лекарственной устойчивости опухолей. Тезисы IX Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология- наука XXI века», г.Пущино, 18-22 апреля 2005 г.

13. Ermakova N.V., V.V. Shaposhnikova, Y.N. Korystov. Multidrug resistance of tumor cell line P388 resistant to vincristine changes with tumor progression. 15th IUPAB and 5th EBSA International Biophysics Congress, Montpellier, France, August 27ft-September 1" 2005.

Принято к исполнению 22/11/2005 Исполнено 23/11/2005

Заказ №1350 Тираж- 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИИН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

Р? 5-0

РПБ Русский фонд

2006-4 28977

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ермакова, Наталья Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

• ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I. Множественная лекарственная устойчивость.

1.1 Неклеточные механизмы устойчивости.

1. 2 Клеточные механизмы устойчивости.

1.2.1 Лекарственная устойчивость, обусловленная инактивацией препарата в клетке.

1.2.2 Устойчивость, связанная с изменением мишеней лекарственных препаратов.

1.2.3 Роль ключевых генов, контролирующих апоптоз, в развитии лекарственной устойчивости.

1.2.3.1 Ген р53.

1.2.3.2 Антионкоген PTEN и лекарственная устойчивость опухолевых клеток.

1.2.3.3 Влияние онкогена Вс1-2 и других генов семейства Вс1-2 на лекарственную устойчивость опухолевых клеток.

1.2.3.4 Система CD95-L/CD95 (FasL/Fas ) и лекарственная устойчивость.

1.2.4 Транспортные белки во множественной лекарственной устойчивости.

1.2.4.1 Стуктура П-гликопротеина.

1.2.4.2.Конформационные изменения структуры Пгп.

1.2.4.3. Ген mdrl, кодирующий П-гликопротеин, генетические механизмы Пгп-МЛУ. ш 1.2.4.4. Субстратная специфичность Пгп.

1.2.4.5. Экспрессия Пгп в нормальных тканях и клетках.

1.2.4.6. Роль МЛУ, опосредованной Пгп (Пгп-МЛУ), в злокачественных новообразованиях.

1.2.4.7 MRP, белок, ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью.

1.3. Ингибиторы транспортных белков МЛУ.

1.3.1 Ингибиторы П-гликопротеина.

1.3.1.1 Ингибиторы 1 поколения.

1.3.1.2 Ингибиторы 2 поколения.

1.3.1.3 Ингибиторы 3 поколения.

1.3.2 Ингибиторы MRP.

Резюме:.

ГЛАВА II. Регуляция множественной лекарственной устойчивости.

2.1 Роль сигнальных систем клетки в МЛУ.

2.1.1. Влияние цитокинов на МЛУ.

2.1.2. Роль фосфолипазы С и протеинкиназы С в регуляции МЛУ.

2.1.3. Роль МАПК каскада в МЛУ.

2.1.4. Факторы транскрипции, регулирующие МЛУ.

2.2 Активные формы кислорода и МЛУ.

Резюме:.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Объект исследования.

1.1 Культуры клеток.

1.2 Получение резистентного штамма клеток Р388ВР.

1.2.1. Определение экспрессии П-гликопротеина.

1.3 Получение резистентного штамма клеток НЕр-2.

2. Определение чувствительности опухолевых клеток к различным агентам по критериям выживаемости клеток и повреждению ядер в опытах in vitro.

2.1. Используемые агенты.

2.2. Определение чувствительности клеток лимфолейкоза Р388 и Р388ВР.

2.3. Определение чувствительности клеток рака гортани человека НЕр-2 и Нер-2ТР.

3. Определение роста опухолей и эффекта противоопухолевых препаратов на их рост.

4. Определение МЛУ в клетках лимфолейкоза Р388 и Р388ВР.

5. Определение МЛУ в клетках рака гортани человека НЕр-2.

6. Определение активных форм кислорода в клетках лимфолейкоза Р388 и Р388ВР.

7. Введение перфторана и создание условий гипероксии.

8. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Часть I. Авермектины - новый класс ингибиторов множественной лекарственной устойчивости.

1.1. Влияние авермектинов на МЛУ клеток лимфолейкоза Р388.

1.1.1. Оценка МЛУ штамма клеток лимфолейкоза Р388, устойчивого к винкристину.

1.1.2. Действие авермектинов на выживаемость клеток Р388 и Р388ВР.

1.1.3. Модификация противоопухолевого эффекта винкристина на клетках Р388 и Р388ВР авермектинами.

1.1.4. Действие авермектинов на активность транспортных белков МЛУ.

Резюме:.

1.2. Влияние авермектинов на МЛУ клеток НЕр-2.

1.2.1. Оценка МЛУ штамма клеток НЕр-2ТР, устойчивого к таксолу.

1.2.2. Действие авермектинов на выживаемость. клеток НЕр-2 и НЕр-2ТР.

1.2.3. Модификация эффекта противоопухолевых препаратов на клетки НЕр-2 и НЕр-2ТР авермектинами.

1.2.4. Действие авермектинов на активность транспортных белков клеток НЕр-2.75 Резюме:.

1.3. Противоопухолевые эффекты авермектинов.

1.3.1. Действие аверсектина С на асцитную опухоль лимфолейкоз Р388.

1.3.2. Действие аверсектина С на солидную карциному Эрлиха.

1.3.2.1 Влияние аверсектина С на рост солидной карциномы Эрлиха.

1.3.2.2. Влияние аверсектина С на большие опухоли карциномы Эрлиха.

1.3.3. Влияние авермектина В1 на рост солидной карциномы Эрлиха.

Резюме:.

1.4. Усиление противоопухолевых эффектов винкристина авермектинами.

1.4.1. Действие винкристина в сочетании с авермектинами на солидную карциному Эрлиха.

1.4.2. Противоопухолевое действие винкристина в сочетании с авермектинами на лимфолейкоз Р388.

1.4.3. Противоопухолевое действие винкристина в сочетании с авермектинами на резистентный штамм Р388ВР.

Резюме:.

Часть 2. Регуляция МЛУ опухолей уровнем их оксигенации.

2.1. Зависимость МЛУ клеток Р388ВР от срока роста опухоли.

Резюме:.

2.2. Изменение активных форм кислорода по мере роста опухолей Р388ВР.

Резюме:.

2.3. Влияние увеличения оксигенации опухолей Р3888ВР с помощью гипероксии и перфторана на МЛУ опухолевых клеток.

Резюме:.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование модификации множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток"

По данным Всемирной Организации Здравоохранения онкологические заболевания являются одной из самых распространенных причин смерти на Земле. Несмотря на многолетние изучения проблемы рака, терапия онкологических заболеваний сталкивается с рядом трудностей, одной из которых является множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток к различным противоопухолевым препаратам.

Устойчивость к лекарственным препаратам может развиваться вследствие блока в опухолевых клетках апоптоза, вследствие особенностей роста опухолей, при которых уменьшается кровоснабжение опухоли и, следовательно, доставка препаратов с кровью. МЛУ также может быть результатом инактивации препарата в клетке, снижения его поступления в клетку и повышения вывода препарата из нее. В последние десятилетия все больше внимания уделяется проблеме повышенного транспорта лекарственных препаратов из опухолевых клеток, в результате которого внутриклеточная концентрация лекарственных средств снижается ниже летального уровня. Откачивают лекарственные препараты из клетки специфические транспортные белки семейства ABC (ATP- binding cassette).

Эти белки, локализованные в цитоплазматической мембране, осуществляют транспорт из клеток широкого ряда биологически важных веществ за счет энергии гидролиза АТФ. К транспортным белкам семейства ABC, ответственным за развитие устойчивости, относят П-гликопротеин, белок MRP1 (multidrug resistance-associated protein 1) и недавно обнаруженный белок MXR (mitoxantrone resistance protein). Эти белки в норме обеспечивают транспорт из клеток в кровь и каналы, образованные эпителием, метаболитов, продуктов распада и ксенобиотиков. Они создают гематоэнцефалический барьер, осуществляют процессы выделения в кишечнике, печени и почках и транспорт из клеток медиаторов, регулирующих иммунитет. Кроме того, сверхэкспрессия генов этих белков была обнаружена во многих опухолевых клетках, причем уровень транспортных белков существенно возрастал после терапии противоопухолевыми препаратами. Особенно важно учитывать роль транспортных белков в лечении острой миелоидной лейкемии, раках молочной железы и прямой кишки, т.к. именно эти заболевания чаще других сопровождаются развитием устойчивости опухолей.

Субстратами транспортных белков МЛУ являются такие противоопухолевые препараты, как алколоиды бравинка (винкристин, винбластин), антрациклины (даунорубицин, доксорубицин), эпиподофиллотоксины (этопозид), таксол. Более того, показано, что П-гликопротеин транспортирует ингибиторы протеазы Н1У-1, препараты, используемые в лечении вируса иммунодефицита человека.

Очевидно, что подавление множественной лекарственной устойчивости и предотвращение ее развития является задачей первоочередной важности для терапии опухолевых заболеваний.

Одним из способов подавления МЛУ является применение ингибиторов транспортных белков, блокирующих транспорт веществ из клеток и повышающих их внутриклеточную концентрацию. Эффективные ингибиторы должны избирательно действовать на опухолевые клетки в малых концентрациях и не быть токсичными для нормальных клеток. Применяемые в настоящее время в клинике ингибиторы имеют существенные недостатки: они малоэффективны, часто обладают побочными эффектами и не снимают МЛУ полностью при клинически достижимых концентрациях. Таким образом, задача подбора высокоспецифичных ингибиторов множественной лекарственной устойчивости до сих пор не решена.

В литературе есть данные об ингибиторной активности в отношении П-гликопротеина препарата ивермектина, синтетического аналога авермектина В 1а. Авермектины - соединения макролидной природы, продукты жизнедеятельности микроорганизмов 81:гер1:отусез ауегтШНБ, широко применяются в клинике благодаря своим антипаразитарным свойствам. Данные об ингибиторной активности природных авермектинов в отношении транспортных белков МЛУ отсутствуют.

Другим способом борьбы с МЛУ опухолей могло бы быть подавление экспрессии генов, кодирующих транспортные белки, и снижение их активности воздействием на клеточные сигнальные системы. Однако в настоящее время еще имеется мало информации о регуляции генов МЛУ и роли сигнализации в регуляции активности этих белков. Исследования в этом направлении только начинаются. В литературе существуют данные о зависимости экспрессии генов

МЛУ от концентрации активных форм кислорода, однако, эти данные противоречивы.

Целью настоящей работы явилось исследование подавления и регуляции множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток с помощью ингибиторов транспортных белков и путем изменения уровня активных форм кислорода в опухолевых клетках.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние авермектинов на множественную лекарственную устойчивость клеток лимфолейкоза Р388 и штамма Р388ВР, устойчивого к винкристину.

2. Изучить влияние авермектинов на множественную лекарственную устойчивость клеток рака гортани человека НЕр-2 и штамма НЕр-2, устойчивого к таксолу.

3. Оценить противоопухолевые эффекты авермектинов in vivo.

4. Исследовать возможность усиления противоопухолевых эффектов винкристина авермектинами in vivo.

5. Изучить зависимость множественной лекарственной устойчивости клеток Р388ВР от срока роста опухоли.

6. Оценить изменение уровня активных форм кислорода по мере роста опухолей Р388ВР.

7. Определить влияние увеличения оксигенации опухолей Р3888ВР с помощью гипероксии и перфторана на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ермакова, Наталья Владимировна

выводы

1. Авермектины подавляют множественную лекарственную устойчивость клеток лимфолейкоза Р388ВР, устойчивого к винкристину, клеток рака гортани человека НЕр-2ТР, устойчивого к таксолу, и их диких типов.

2. Относительная эффективность различных авермектинов в ингибировании множественной лекарственной устойчивости зависит от типа клеток и транспортируемого субстрата.

3. Внутрибрюшинное введение авермектинов в нетоксичных концентрациях подавляют рост опухолей in vivo.

4. При внутрибрюшинном введении авермектины усиливают противоопухолевый эффект винкристина in vivo.

5. Множественная лекарственная устойчивость клеток лимфолейкоза Р388ВР увеличивается с ростом опухоли.

6. Уровень активных форм кислорода снижается по мере роста опухоли Р388ВР, а выдерживание животных в условиях гипероксии или введение перфторана увеличивает концентрацию активных форм кислорода в опухолевых клетках.

7. Внутрибрюшинное введение перфторана в опухоль Р388ВР снижает количество клеток и уменьшает их множественную лекарственную устойчивость.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Определение ключевых событий, ведущих к множественной лекарственной устойчивости опухолей, и способов ее подавления является важнейшей задачей терапии онкологических заболеваний. Решение проблемы МЛУ опухолей важно также и в фундаментальном аспекте, так как связано с механизмами регуляции экспрессии генов сигнальными системами клеток и с их транспортными системами.

Несмотря на десятилетия исследований в данной области множество тайн остается неразгаданным. Нет единого мнения в вопросе о роли сигнальных систем клетки и ключевых посредников в регуляции МЛУ. Не найден эффективный и избирательный ингибитор МЛУ, который можно было бы использовать в клинике. Но нам известны основные факторы, приводящие к МЛУ: наиболее часто это увеличение экспрессии и активности специфических транспортных белков, откачивающих лекарственные препараты из клетки против градиента концентрации. Подавление МЛУ может идти как по пути использования ингибиторов активности транспортных белков, так и по пути изменения экспрессии генов, кодирующих белки МЛУ.

В данной работе впервые исследовали влияние природных макролактонов авермектинов на МЛУ опухолевых клеток. Полученные результаты свидетельствуют о том, что авермектины подавляют множественную лекарственную устойчивость клеток лимфолейкоза Р388 и штамма Р388ВР, устойчивого к винкристину. Единичные встречающиеся в литературе данные по синтетическому аналогу авермектинов ивермектину указывают, что ивермектин может являться ингибитором транспортных белков МЛУ. Показано, что устойчивость штамма Р388ВР обусловлена повышением активности транспортных белков. Обнаружено, что авермектины в нетоксичных концентрациях повышают чувствительность клеток Р388 и Р388ВР к винкристину. Самыми эффективными оказались авермектины группы А. Также показано, что авермектины подавляют транспорт флуоресцирующего субстрата транспортных белков кальцеина-АМ. Сравнение с классическим ингибитором циклоспорином А показало, что авермектин В2 по своей активности близок к нему, а авермектины группы А менее эффективны.

Авермектины также подавляют множественную лекарственную устойчивость клеток рака гортани человека НЕр-2 и штамма НЕр-2ТР, устойчивого к таксолу. Показано, что авермектины в нетоксичных концентрациях повышают чувствительность клеток дикого типа и устойчивого к таксолу штамма к противоопухолевым агентам винкристину и таксолу.

Обнаружены индивидуальные различия авермектинов. По действию на выживаемость клеток НЕр-2 наиболее активны авермектины группы А. Сравнение с классическим ингибитором циклоспорином А показало, что авермектин Al в 2 раза эффективнее подавляет активность транспортных белков, обуславливающих МЛУ.

Обнаруженная активность авермектинов в отношении транспортных белков МЛУ открывает новые возможности применения авермектинов в клинике. Информации о действии авермектинов на опухолевые клетки in vivo практически нет, а существующие работы ограничиваются экспериментами in vitro.

Показано, что введение авермектинов in vivo тормозит рост опухолей. Максимальный эффект наблюдается при внутрибрюшинном введении препарата. Авермектины влияют в широком диапазоне концентраций. Наибольший эффект достигается при суммарной дозе больше 4 мкг/г. Учитывая, что в концентрациях до 1 мкг/мл в экспериментах in vitro авермектины не вызывают гибели опухолевых клеток, можно предположить, что противоопухолевое действие идет через системы организма. Обнаружено, что комплекс авермектинов аверсектин С более активен в подавлении роста опухолей.

Также исследовали влияние авермектинов- на противоопухолевое действие винкристина in vivo. Авермектины удваивают эффект винкристина в чрезвычайно малых концентрациях. Также совместное введение с винкристином повышает среднюю продолжительность жизни мышей как с лимфолейкозом дикого типа, так и с устойчивым штаммом. Впервые показано различие в индивидуальных особенностях авермектинов в подавлении МЛУ.

Мы также исследовали возможность подавления МЛУ путем влияния на регуляцию транспортных белков МЛУ. Из литературы известно, что активные формы кислорода подавляют экспрессию белков МЛУ. Уровень АФК меняется по мере роста асцитной опухоли. Это связано с увеличением числа опухолевых клеток и снижением числа лейкоцитов, мигрирующих в опухоль, на разных стадиях- ее развития. • , . ■ ■

В нашей работе впервые показано, что рост опухоли Р388ВР сопровождается увеличением множественной лекарственной устойчивости. При этом также увеличивается устойчивость опухоли к винкристину. В то же время базальный уровень устойчивости опухоли дикого типа остается неизменным. Такая закономерность впервые обнаружена при росте асцитной опухоли.

Обнаружено, что рост асцитной опухоли лимфолейкоза Р388ВР сопровождается уменьшением уровня активных форм кислорода в брюшной полости. Наши результаты хорошо согласуются с литературными данными.

Модификация оксигенации опухолей позволяет влиять на их устойчивость. Мы увеличили концентрацию АФК в опухолевых клетках, выдерживая животных в условиях гипероксии или введением перфторана в опухоль. Двукратное введение перфторана уменьшало количество клеток в опухолях в 2 раза и МЛУ опухолевых клеток в 1.7 раза.

Полученные данные могут послужить основой для подавления и предотвращения МЛУ опухолей путем изменения их оксигенации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ермакова, Наталья Владимировна, Пущино

1. Барабой, В.А., Брехман, И.И., Голоткин, В.Г., Кудряшов, Ю.Б. Перекисное окисление и стресс.//Наука, 1992.

2. Владимиров, Ю.А., Азизова, O.A., Деев, А.И. Свободные радикалы в живых системах./ТИтоги науки и техники. Сер. Биофизика, 1991, 29, 1-249. Георгиев, Г. П. Как нормальная клетка превращается в раковую.// Соросовский образовательный журнал, 1999; 4, 17-22.

3. Дриняев, В.А., Кругляк, Е.Б., Мосин, В.А. Аверсектин С: физико-химические и биологические свойства.// Приклад. Биохим. Микробиол., 1999; 35(2), 206-212.

4. Ермакова, Н.В., Шапошникова, В.В., Левитман, М.Х., Ким,Ю.А., Корыстов, Ю.Н. Изменение множественной лекарственной устойчивости клеток лимфолекоза Р388, устойчивых к винкристину при росте асцитной опухоли. //Биологические мембраны, 2004; 21(2), 102-106.

5. Мосин, В.А., Кругляк, Е.Б., Стерлина, Т.С., Корыстов, Ю.Н., Шапошникова, В.В., Кублик, Л.Н., Левитман, М.Х., Дриняев, В.А. Действие авермектинов на клетки лимфолейкоза Р88 in vitro.// Антибиотики и химиотерапия, 1999, 44(6), 16-20.

6. Ярилин, А.А. Основы иммунологии.//Медицина, 1999.

7. Abolhoda, A., Wilson, А.Е., Ross, Н., Danenberg, P.V., Scotto, K.W., and Burt, M. Rapid activation of MDR1 gene expression in human metastatic sarcoma followintg in vivo exposure to doxorubicin.//Clin. Cancer Res. 1999; 5, 3352— 3356.

8. Adams, J.M., Cory, S. The Bcl-2 Protein Family: Arbiters of Cell Survival.// Science, 1998; 281(5381), 1322-1326.

9. Ahmad, S., Safa, A.R. and Glazer, R.I. Modulation of P-glycoprotein activity by protein kinase C-alpha in a baculovirus expression system. //Biochemistry, 1991, 33, 10313-10318.

10. Allen, J. D., Brinkhuis, R. F., van Deemter, L., Wijnholds, J., and Schinkel, A. H. Extensive contribution of the multidrug transporters P-glycoprotein and Mrpl to basal drug resistance.//Cancer Res., 2000; 60, 5761 -5766.

11. Baran, Y., Gunduz, U., Ural, A. Expression of multi drug resistance (MDR1) gene in human promyelocytic leukemia cell line selected with vincristine.// Turkish Journal of Cancer, 2005; 35(2), 88-92.

12. Bartsevich, V.V. and Juliano, R.L. Regulation of the MDR1 gene by transcriptional repressors selected using peptide combinatorial libraries. //Mol. Pharmacol. 2000; 58, 1-10.

13. Bass D.A., Parce J.W., Dechatelet L.R., Szeida P., Seeds M.C., Thomas M.// J. Immunol, 1983; 130(6),1910-1917.

14. Bates, S.E., Currier, S.J., Alvarez, M., and Fojo, A.T. Modulation of P-glycoprotein phosphorylation and drug transport by sodium butyrate. //Biochemistry 1992; 31, 6366-6372.

15. Bhushan, A., Abramson, R., Chiu, J.F., Tritton, T.R. Expression of c-fos in human and murine multidrug-resistant cells.//1991

16. Borst, P., Evers, R., Kool, M., Wijnholds, J. A family of drug transporters: the multidrug resistance-associated proteins.// J. Nat. Cancer Inst., 2000; 92(16), 1295-1302.

17. Burdon, R.H., Gill, V., Rice-Evans, C. Cell proliferaion and oxidative stress. //FreeRadic. Res. Commun., 1990; 11, 65-76.

18. Burg, R.W., Miller B.M., Baker, E.E. Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: producing organism and fermentation. Antimicrob Agents Chemother// 1979; 15,3:361-367.

19. Chaudhary, P.M., Roninson, I.B. Induction of multidrug resistance in human cells by transient exposure to different chemotherapeutic drugs.// J. Natl. Cancer Inst., 1993; 85, 632-639.

20. Chen, G., Jaffrezou, J.P., Fleming, W.H., Duran, G,E., Sikic, B.I. Prevalence of multidrug resistance related to activation of the mdrl gene in human sarcomamutants derived by single-step doxorubicin selection.//Cancer Res, 2000, 54, 4980-4987.

21. Clarke, A. R., Purdie, C. A., Harrison, D. J., Morris, R. G., Bird, C. C., Hooper, M. L. and Wyllie, A. H. Thymocyte apoptosis induced by p53 dependent and independent pathways.//Nature, 1993; 362, 849-852.

22. Cobb, M.H., Goldsmith, E.J. How MAP kinases are regulated.// J Biol Chem, 1995;270, 14843-14846.

23. Cole, S.P.C., Bhardwaj, G., Gerlach, J.H., Mackie, J.E., Grant, C.E., Almquist, k.C., Stewart, A.J., Kurz, E.U., Deeley, R.G. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line.// Science, 1992; 258, 16501654.

24. Essodaigui M., Broxterman H.J., Gamier-Suillerot A Kinetic analysis of calceinand calcein-acetoxymethyl ester efflux mediated by the multidrug resistanceprotein and P-glycoprotein.//Biochemistry, 1998; 37(8), 2243-2250.

25. Felix, R.A., Barrand, M.A. P-glycoprotein expression in rat brain endothelial cells:evidence for regulation by transient oxidative stress.// J. Neurochem., 2002; 80,64.72.

26. Feng, F., Xiang Y., Cui, Z., Liu, Z., Yang, Y. In vivo reversal of multidrug resistance by transduction of human tumor necrosis factor-alpha into drug resistant cell line of choriocarcinoma.// Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi, 2003; 38(5), 294297.

27. Filipits, M. MRP and MDR1 gene expression in primary breast carcinomas: M. Filipits.// Clin. Cancer Res., 1996; 2, 1239-1245.

28. Fine, R.L., Chambers, T.C., Sachs, C.W. P-glycoprotein, multidrug resistance and protein kinase C.II Stem Cells, 1996; 14, 47-55.

29. Fisher, G., Advani, R., Wakelee, H., Jacobs, C., Gladysheva, K., Fitzgerald, M., Sikic, B. A phase I trial of oblimersen and gemcitabine in refractory and advanced malignancies. //ASCO Meeting Abstracts, 2005; 23, 3174.

30. Ge Zhou, Tien Kuo, M. NF-B-mediated Induction of mdrlb Expression by Insulin in Rat Hepatoma Cells.//J.Biol.Chem., 1997; 272(24), 15174-15183.

31. Goa K, McTavish D, Clissold S, Ivermectin. A review of its antimicrofilarial activity, pharmacokinetic properties and clinical efficacy in onchocerciasis.//Drugs; 1991; 42, 640-658.

32. Goldsmith, M.E., Gudas, J.M., Schneider, E. Wild type p53 stimulates expression from the human multidrug resistance promoter in a p53-negative cell line.// J. Biol. Chem.,1995; 270, 1894-1898.

33. Goldstein, L.J., Fojo, A.T., Ueda, K., Crist, W., Green, A., Brodeur, G., Pastan, I., Gottesman, M.M. Expression of the multidrug resistance, MDR1, gene in neuroblastomas.//J. Clin. Oncology, 1997; 8, 128-136.

34. Gros P, Croop J, Roninson I, Varshavsky A, Housman DE. Isolation and characterization of DNA sequences amplified in multidrug-resistant hamster cells. //Proc Natl Acad Sci U S A., 1986;83(2), 337-341.

35. Hamada, H., Tsuruo, T. Characterization of the ATPase activity of the Mr 170,000 to 180,000 membrane glycoprotein associated with multidrug resistance in K562/ADM cells.//Cancer Res., 1988; 48, 4926-4932.

36. Hartmann, G., Kim, H., Piquette-Miller M. Regulation of the hepatic multidrug resistance gene expression by endotoxin and inflammatory cytokines in mice.// Int. Immunopharmacol2001; 1(2), 189-199.

37. Higgins, C.F. ABC transporters: From micro-organisms to man. // Annu. Rev. Cell. Biol., 1992; 8, 67-113.

38. Homolya H., Hollo Z., Germann U.A., Pastan I., Gottesman M.M., Sarkadi B. Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein.//J.Biol.Chem. 1993; 268(29), 21493-21496.

39. Hu, Z., Jin S.,and Scotto,K. Transcriptional activation of the MDR1 gene by UV irradiation.//J. Biol. Chem.2000; 275, 2979-2985.

40. Jones, P.M., George, A.M. Symmetry and structure in P-glycoprotein and ABC transporters .//Eur. J. Biochem., 2000; 267, 5298-5305.

41. Kolch, W., Heldecker, G., Rapp, U.R. Protein kinase C alpha activates RAF-1 by direct phosphorylation.//Nature, 1993; 364, 249-252.

42. Korystov, Y.N., Ermakova, N.V., Kublik, L.N., Levitman, M.K., Shaposhnikova, V.V., Mosin, V.A., Drinyaev, V.A., Kruglyak, E.B., Novik, T.S., Sterlina, T.S. Avermectins Inhibit Multidrug Resistance of Tumor Cells.// Eur.J.Pharmacol., 2004; 493, 57-64.

43. Cancer Res, 2001; 3,183-191.o Scotto, K., Egan, D. Transcriptional regulation of MDR1 genes.//Cytotechnol., 1998; 27,257-269.o Scotto, K., Johnson, R. Transcription of MDR1 a therapeutic target.// In Basic

44. Shapiro, A.B., Corder, A., Ling, V. P-glycoprotein-mediated Hoechst 33342 transport.//Eur J Biochem, 1997; 250, 115-121.

45. Sharom, F.J. The P-glycoprotein efflux pump: how does it transport drugs?// J. Membrane Biol, 1997; 160, 161-175.

46. Sinha, BK., Mimnaugh, E. G., Rajagopalan, S., Myers, C.E. Adriamycin activation and oxygen free radical formation in human breast tumor cells: protective role of glutathione peroxidase in adriamycin resistance //Cancer Res., 1989; 49, 3844-3848.

47. Smith, C. D., Li, Z., Lee, B. D., and Copper, J. E. Synthesis and evaluation of dihydropyrroloquinoline compounds that selectively inhibit P-glycoprotein.//Proc. Am. Assoc. Cancer Res. ,1993; 42, 953.

48. Smith, C. D., Li, Z., Lee, B. D., and Copper, J. E. Synthesis and evaluation of dihydropyrroloquinoline compounds that selectively inhibit P-glycoprotein.// Proc. Am. Assoc. Cancer Res. ,2001; 42, 953.

49. Sonveaux, N., Shapiro, A. B., Goormaghtigh, E., Ling, V., Ruysschaert, J.-M. Secondary and Tertiary Structure Changes of Reconstituted P-glycoprotein.//J. Biol. Chem., 1996; 271, 24617-24624

50. Stein, U., Walther, W., Shoemaker, R.H. Reversal of multidrug resistance by transduction of cytokine genes into human colon carcinoma cells.// J. Natl. Cancer Inst., 1996; 88(19), 83-92.

51. Sunderson, A., Jacobson, M.D. Reactive oxygen species and programmed cell death. //Trends Biochem Sci, 1995; 21, 83-86.

52. Tan S., Sagara Y., Liu Y., Maher P., Schubert D. The regulation of reactive oxygen species production during programmed cell death.//J. Cell Biol., 1998; 141(6), 1423-1432.

53. Tew, K.D., O'Brien, M., Kruh, G.D. The Influence of coordinate overexpression of glutathione phase II detoxification gene products on drug resistance.// J.Pharmacology Exp.Ther., 1994; 295(2), 480-487.

54. Treisman, R. Regulation of trancsription by MAP kinase cascades.//Curr. Opin. Cell. Biol., 1996; 8, 205-215.

55. Tsuruo, T., Iida, H., Tsulcagoshi, S., Sakurai, Y. Overcoming of vincristine resistance in P388 leucemia in vivo and in vitro through enhanced cytotoxity of vincristine and vinblastine by verapamil.//Cancer Res., 1981; 41, 1967-1972.

56. Wartenberg M., Ling F.C., Muschen M., Roe, J., Klein F. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor-1 and reactive oxygen species. //FASEB J. Express Article. 2003.

57. Wielinga, P.R., Haijn, M., Westerhoff, H.V., Lankelma, J. A method for studying plasma membrane transport with intact cells using computerized fluorometry.// Anal. Biochem., 2000; 263, 221-231.

58. Yamane, Y., Furuichi, M., Van Song, R.N.T., Mulcahy, R.T., Ishikawa, T., Kuo, M.T. Expression of multidrug resistance protein/GS-X pump and gamma-glutamylcysteine genes is regulated by oxydative stress.// J. Biol.Chem., 1998; 273, 31075-31085.

59. Yang, J.-M., Vassil, A., Hait, W. Activation of phospholipase C induces the expression of the multidrug resistance (mdrl) gene through the Raf-MAPK pathway.//Mol. Pharmacol., 2001; 60, 674-680.

60. Young, L. C., Campling, B. G., Voskoglou-Nomikos, T., Cole, S. P., Deeley, R. G., and Gerlach, J. H. Expression of multidrug resistance protein-related genes in lung cancer: correlation with drug response.//Clin. Cancer Res., 1999; 5, 673 -680.

61. Zamora, J.M., Pearce, H.L., Beck, W.T. Physical-chemical properties shared by compounds that modulate multidrug resistance in human leukemic cells.// Mol. Pharmacol., 1988; 33, 454-462.

62. Ziemann, C., Burkle, A., Kahl, G.F., Hirsch-Ernst, K.I. Reactive oxygen species participate in mdrlb mRNA and P-glycoprotein overexpression in primary rat hepatocyte cultures.// Carcinogenesis, 1999; 20, 407-414.