Изучение влияния окислительного стресса на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток

Емельянов, Максим Олегович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение влияния окислительного стресса на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение влияния окислительного стресса на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток"

На правах рукописи

48404ЦЗ

Емельянов Максим Олегович

Изучение влияния окислительного стресса на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток

03.01.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 2011 г.

4840403

Работа выполнена в лаборатории окислительного стресса Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Корыстов Юрий Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор ^и^е.-лдтьч. наук, профессор Акатов Владимир Семенович доктор биологических наук, профессор Новоселова Елена Григорьевна

Ведущая организация:

Филиал Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ФИБХ РАН)

Защита состоится 19 января 2011г. в _ на заседании

диссертационного совета Д 002.066.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Институте фундаментальных проблем биологии РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 2, ИФПБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фундаментальных проблем биологии РАН ! 1 " ■ . •

Автореферат разослан « /Т~» декабря 2010 г. ■

Ученый секретарь диссертационного совета

Общая характеристика работы. Актуальность проблемы.

По данным Всемирной Организации Здравоохранения онкологические заболевания являются одной из самых распространенных причин смерти на Земле. Несмотря на многолетние изучения проблемы рака, терапия онкологических заболеваний сталкивается с рядом трудностей, одной из которых является множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток к различным противоопухолевым препаратам. МЛУ опухолевых клеток, обусловленная откачкой из клеток противоопухолевых препаратов транспортными белками, является одним из главных факторов снижающих эффективность химиотерапии опухолей. Поэтому изучение регуляции экспрессии и активности транспортных белков в опухолевых клетках важно для химиотерапии опухолей.

В последние десятилетия возросло внимание ученых к изучению эффектов активных форм кислорода (АФК). В качестве мессенжеров они влияют на множество клеточных процессов, в том числе г МЛУ. В литературе существуют работы, посвященные эффекту АФК на синтез транспортных белков, ответственных за МЛУ. Однако результаты этих работ противоречивы. Показано, что АФК могут, как увеличивать (Karen I., 2000), так и снижать (Wartenberg М. et al., 2000; Wartenberg М. et al., 2003) экспрессию генов транспортных белков, ответственных за МЛУ. Противоречивость эффектов АФК на экспрессию транспортных белков обусловлена, по-видимому, спецификой опухолевых клеток, экспрессирующих разные типы транспортных белков, а также разным уровнем создаваемого окислительного стресса. Изменение экспрессии транспортных белков сказывается на МЛУ через 15-20 часов после воздействия окислительного стресса, и такие данные также существуют в литературе.

При большом количестве работ о влиянии АФК на синтез транспортных белков, ответственных за МЛУ, нами не было обнаружено работ о влиянии окислительного стресса, как на активность самих транспортных белков, так и о связанных с этим изменениях МЛУ. Эти изменения МЛУ должны быть быстрыми, в отличие от обусловленных изменением экспрессии генов.

Одним из основных условий выполнения поставленной задачи являлось количественное определение уровня АФК в клетках, поскольку при одинаковом воздействии, например перекиси водорода, уровень АФК в разных типах клеток может существенно отличаться. Кроме того, концентрация АФК в клетках зависит от состава сред, условий культивирования и т. д. Одним из наиболее чувствительных методов определения АФК в клетках является флуоресцентный: нефлуоресцирующее соединение превращается во флуоресцирующее после окисления АФК. Этот метод известен только в микроскопическом варианте, при котором результаты могут существенно искажаться за счёт фотоокисления исходного соединения. Поскольку уровень АФК в клетках значительно варьирует, а микроскопическим методом определяется АФК в отдельной клетке, то для получения среднего значения необходимо промерить достаточное количество клеток. За время этих измерений фотоокисление может существенно исказить (завысить) результат. Поэтому для определения среднего содержания АФК в клетках в различных

условиях необходимо было разработать не микроскопический флуоресцентный метод. Метод был основан на превращении нефлуоресцирующего 2',7'-дихлордигидрофлуресцеина (2',7'- дихлорфлуоресцина) во флуоресцирующий 2',7'- дихлорфлуоресцеин.

Подытоживая вышесказанное, целью данной работы было исследовать немедленный и отсроченный эффекты окислительного стресса на активность транспортных белков и МЛУ опухолевых клеток: мышиного лимфолейкоза P388VR и рака гортани человека НЕр-2. Параллельно с этим нужно было разработать метод определения АФК в клетках с помощью 2',7'-дихлорфлуоресцина диацетата и определить уровень АФК в норме и при различных воздействиях.

Задачи исследования:

1. Разработать метод определения АФК в клетках с использованием 2',7'-дихлорфлуоресцин диацетата и определить АФК в клетках в норме и при воздействиях, вызывающих окислительный стресс (радиация, перекись водорода).

2. Изучить влияние окислительного стресса на активность транспортных белков и лекарственную устойчивость клеток мышиного лимфолейкоза P388VR.

3. Изучить влияние ионизирующего излучения на активность транспортных белков и лекарственную устойчивость клеток рака гортани человека НЕр-2.

Практическая значимость. В работе было показано, что окислительный стресс сразу после воздействия может снижать МЛУ опухолевых клеток. Этот факт указывает на возможность увеличения эффективности химиотерапии опухолей с множественной лекарственной устойчивостью при сочетании противоопухолевых препаратов с окислительным стрессом, причём препараты должны применяться одновременно или сразу после окислительного стресса. При сочетании химиотерапии с радиотерапией следует иметь в виду, что после облучения может увеличиваться экспрессия генов транспортных белков, что приводит к увеличению МЛУ. Этот эффект развивается за время сопоставимое с длительностью клеточного цикла и применение противоопухолевых препаратов в это время после облучения менее эффективно, чем без облучения.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на конференциях: «V съезд по радиационным исследованиям», 2006 (Москва); «The 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Society», 2006 (Киев).

Публикации. По результатам работы опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка, 1 таблицу и список литературы из 158 ссылок.

Материалы и методы.

Клетки. В работе использовали линии мышиного лимфолейкоза Р388, P388VR и клетки рака гортани человека НЕр-2. Клетки лимфолейкоза выращивали в мышах DBA2, а клетки НЕр-2 в культуре. Устойчивый к винкристину штамм P388VR получали поэтапной обработкой опухолей in vivo винкристином. Ранее было показано, что клетки P388VR и НЕр-2 обладают множественной лекарственной устойчивостью, обусловленной активным транспортом из клеток противоопухолевых препаратов (Korystov Y.N. et al., 2004, Ермакова, 2005).

Выживаемость клеток Р388 и P388VR при действии перекиси водорода и винкристина определяли отношением живых клеток в опыте к контролю. Живыми считали клетки неокрашивающиеся 0.04% раствором трипанового синего. Выживаемость клеток НЕр-2 при действии облучения и винкристина определяли по отношению количества в клетках фиолетового кристаллического в опыте к контролю. Содержание в клетках красителя измеряли на спектрофотометре Multiscan Plus.

Для определения АФК был разработан метод, основанный на определении экстрагированного из клеток флуорохрома - DCF, который образуется в клетках из DCFH2 при действии АФК. Клетки инкубировали с 20 мкМ DCFH2-DA 10-30 мин при 37°С, затем отмывали остатки красителя и воздействовали различными агентами. По окончании воздействия DCF экстрагировали из клеток обработкой цитратного буфера с дигитонином при рН=4. Флуоресценцию DCF определяли при рН=7 на флуориметре MF44 Perkin Elmer при длинах волн возбуждения и эмиссии 475 и 525 соответственно. При исследовании воздействия (перекись водорода, ионизирующее облучение) перед инкубацией с DCFH2-DA, клетки обрабатывали перекисью водорода или облучали.

Активность транспортных белков определяли по скорости активного транспорта из клеток их субстратов: эфира кальцеина (клетки мышиного лимфолейкоза Р388 и P388VR) и родамина 123 (клетки рака гортани человека НЕр-2). Для количественной характеристики активной откачки этих соединений использовались коэффициенты, получаемые отношением констант скоростей выхода эфира кальцеина (К) или родамина 123 (R) из клеток к константам скоростей их пассивного выхода, получаемого при ингибировании активного транспорта циклоспорином А - ингибитором транспортных белков.

Результаты и их обсуждения.

1. Разработка нового метода определения АФК по количеству образовавшегося в клетках DCF.

Данный краситель часто используют при микроскопических методах определения АФК. Однако у этих методик есть свои минусы: во-первых - это фотодинамический эффект (быстрое окисление DCFH2 кислородом при действии света), и, во-вторых - гетерогенность клеток, от чего результаты сильно варьируют. Данная методика обладает малой специфичностью относительно, какой либо АФК в отдельности и адекватна при изучении общего окислительного стресса в клетке, что и было нашей задачей. Для нагрузки клеток DCFH2 используется 2',7'-дихлорфлуоресцин диацетат (DCFH2-DA), который, будучи незаряженной молекулой, хорошо проникает в клетки и там при действии эстераз превращается в DCFH2, запертый в клетке благодаря заряду.

Поскольку микроскопическое определение АФК в клетках по образованию в них DCF осложняется указанными выше артефактами, необходимо было разработать методику, при которой образование DCF определялось бы не в отдельных, а во всех клетках и не искажалось бы освещением. Избежать этих недостатков можно, инкубируя клетки с DCFH2-DA в темноте с последующей экстракцией, образовавшегося DCF и его определением в экстракте. Однако при такой методике возникает проблема сохранения уровня, образовавшегося в клетках DCF неизменным до измерения. Дело в том, что при экстракции из клеток выходит не только DCF, но и не окисленный DCFH2, который в экстракте способен спонтанно окислиться и определяемый уровень АФК будет завышен. Поэтому, для устранения искажения определяемого уровня АФК по этой методике необходимо было подобрать условия, минимизирующие спонтанное окисление DCFH2, что и было сделано. Мы исследовали сыворотку, температуру и рН среды, как основные факторы, которые могут влиять на этот процесс. Был проведен подробный анализ действия каждого из них, подобраны условия, при которых уровень DCF, образовавшийся в клетках не меняется до измерения.

На рисунке 1. представлена временная зависимость образования DCF из DCFH2. Как видно, в среде без сыворотки скорость образования DCF из DCFH2 низкая и возрастает с увеличением концентрации сыворотки до 3%. При содержании сыворотки 10% образование DCF не возрастает, а может быть даже ниже, чем при 3% (см. 45 и 65 мин). Это может быть обусловлено вмешательством антиоксидантов сыворотки.

т-'-1---1-'-1-'-1-'-1-'-----1

О 10 20 30 40 50 60 70

время, мин

Рис. 1. Образование ЭСР из БСРНг при 20°С в растворе Хэнкса, рН=7.3 (1) и с добавлением 1 (2), 3 (3) и 10% (4) сыворотки.

5 120-

100 -

20 40 60 80 100 120 Время, мин

Рис. 2. а) Образование ОСР из БСРЦ. в растворе Хэнкса с 3% сыворотки при 20°С, рН=7.3(1), рН=7.0 (2) и 4.0 (3). Ь) Относительное (к 15 мин) образование ОСР при рН=7.0 (1) и 4.0 (2).

Другим фактором, который влияет на процессы спонтанного окисления красителя - это кислотность среды.

На рис. 2 представлены данные по зависимости окисления ОСРНз от рН в присутствии 3% сыворотки. Видно, что понижение рН среды от 7.3 до 4.0 приводит к резкому уменьшению скорости образования ОСР (примерно в 10 раз). Таким образом, при рН=4 образование ОСР очень мало даже в присутствии сыворотки.

Основываясь на этих данных при определении АФК в клетках, мы снижали рН раствора дигитонина до 4, используемого для экстракции ОСР из клеток.

Еще один фактор, который был исследован - это температура. На рис. 3. показана зависимость количества ОСР, определяемое в экстрактах клеток от времени их хранения при разных температурах. Видно, что флуоресценция растворов не зависит от температуры хранения, но существенно (более чем в 10 раз) выше при экстракции красителя дигитонином в растворе Хэнкса (рН=7.4), чем цитратным буфером (рН=4) с дигитонином. Повышенное содержание ОСР в растворе Хэнкса - артефакт, обусловленный тем, что из клеток вместе с ОСР выходит и ОСРН2, который полностью окисляется до ОСР за время экстракции при рН=7.4 к моменту первого измерения и при дальнейшем хранении его концентрация не меняется. При экстракции красителя в цитратном буфере (рН=4) ОСРН2 не окисляется ни при экстракции, ни при хранении.

ю-

-Д 5

время, мин

Рис. 3. Временная зависимость количества ОСИ в экстрактах клеток в различных средах и температурах: 1,2- экстрагирование и хранение в растворе Хэнкса с дигитонином, рН 7.4; 1 - хранение при 2°С; 2 - хранение при комнатной температуре; 3, 4 - экстракция и хранение в цитратном буфере при рН 4 с дигитонином; 3 - хранение при 2°С; 4 - хранение при комнатной температуре; 5 - экстрагирование и хранение контрольных клеток без ОСРП2-ОА в цитратном буфере при рН 4 с дигитонином (п = 9).

Таким образом, эти данные показывают, что экстракцию DCF из клеток и хранение растворов необходимо проводить при низком значении рН=4.0 без сыворотки, а температура хранения не влияет. Цитратный буфер использовался потому, что его буферная ёмкость максимальна при рН около 4, в отличие от раствора Хэнкса, буферная ёмкость которого максимальна при нейтральном значении рН.

Поскольку рН экстрактов красителя были 4.0, а максимум флуоресценции DCF около 7.0, то для увеличения чувствительности метода, рН экстракта увеличивали до 7.0 добавлением щёлочи в кювете флуориметра.

Из полученных результатов можно сделать следующие выводы. Для устранения артефактов при определении АФК с помощью DCFH2-DA по разработанной методике нужно: во-первых, удалить сыворотку из экстрагирующего раствора, так как она способна образовывать новые АФК за счет металлов переменной валентности и повышать уровень флуоресценции за счет собственного фонового свечения; во вторых, понизить рН среды до 4.0 во время экстракции и хранения проб непосредственно до измерения во избежание спонтанного окисления DCFH2.

2. Определение АФК в клетках в различных условиях.

2.1. Влияние на АФК в клетках in vitro состава среды, концентрации клеток, перекиси водорода.

клнцентрация клеток, Ю'/мл На02,11м

Рис. 6. (а) Зависимость уровня АФК клеток Р388УЯ от их концентрации; (Ь) зависимость уровня АФК клеток Р388УЯ от концентрации перекиси водорода. Среда -ЯРМ1-1640 с добавлением 10% сыворотки в случаях (а) и (Ь). Концентрация клеток - 1.2 млн/мл (п = 3-4 для (а) и (Ь) случаев).

Была исследована зависимость АФК внутри клеток от состава среды, концентрации клеток и концентрации перекиси водорода, добавленной в среду. Количество АФК в клетках уменьшается с увеличением концентрации клеток и увеличивается пропорционально концентрации перекиси водорода (рис. 6.).

На рисунке 7. представлена диаграмма зависимости количества АФК от состава среды и количества АФК при воздействия 10 цМ перекиси тоже от состава среды. Как из него видно наименьшая величина АФК в ЯРМ1-1б40 с сывороткой. В 11РМ1-1640 без сыворотки и растворе Хэнкса величина АФК возрастает в 2,6 раз. Эффект перекиси водорода на АФК также зависит от состава среды. Увеличение образования АФК в ответ на перекись водорода минимален в среде ИРМЫ 640, содержащей 10% сыворотки и максимален в растворе Хэнкса. Снижение АФК в среде с сывороткой обусловлено тем, что среда содержит антиоксиданты, а сыворотка каталазу, разлагающую перекись водорода, образуемую клетками.

Рис. 7. Образование АФК клетками Р388УИ в растворе 11РМ1-1640, содержащей сыворотку 10% (1), в ЯРМ1-1640 и растворе Хэнкса (3); эффект 10 цМ перекиси водорода в растворе 11РМ1-1640, содержащим 10% сыворотки (2), в КРМ1-1640 (4), и растворе Хэнкса (5). Концентрация клеток 1,2 млн/мл. (п = 4). *, Р < 0.05 по отношению к (1); **, Р < 0.05 по отношению к (2).

2.2 Влияние на АФК в клетках ионизирующей радиации.

При определении АФК в облучённых клетках с помощью флуоресцентных индикаторов существуют две проблемы, приводящие к искажению результатов. 1 — увеличение проницаемости плазматической мембраны после облучения, которое приводит к ускоренному выходу индикатора из клеток по сравнению с контрольными клетками, что занижает определяемый уровень АФК.

На рис. 8. представлены данные по зависимости количества БСР в клетках, определённого с помощью проточной цитометрии (1) и в экстракте из клеток (2) от дозы облучения. Искажение результатов определения АФК в клетках после облучения за счёт увеличения выхода ОСР из клеток показывает сравнение кривых 1 и 2 на рис. 8. Видно, что при определении БСР только в

клетках (кривая 1), количество АФК линейно возрастает до дозы 3 Гр, а с дальнейшим увеличением дозы прирост АФК в клетках уменьшается и при 9 -12 Гр количество АФК одинаково.

Загиб дозовой зависимости I при дозах больше 3 Гр можно объяснить увеличением проницаемости клеточной мембраны. Так как по методике клетки отмываются перед измерением, то логично предположить, что при больших дозах облучения мембрана стала более проницаема. При неоднократном центрифугировании часть БСР выходит из клеток и остаётся в среде, а так как при проточной цитометрии измеряется то, что находится в клетках, то мы не получаем увеличения количества АФК.

Доза, Гр

Рис. 8. Зависимость относительного (к контролю) увеличения количества АФК в клетках Р388 (1) и в суспензии клеток, обработанных дигитонином(2) от дозы облучения. Клетки облучали в растворе Хэнкса с 1% сыворотки.

Для устранения артефакта, обусловленного более быстрым выходом БСР из облучённых клеток, необходимо определять весь БСР: оставшийся в клетках и вышедший из них. Для этого клетки сразу после облучения обрабатывали 20 мин при 37°С 0.02% раствором дигитонина в цитратном буфере рН=4, чтобы из клеток вышел весь ЭСР (дигитонин) и чтобы содержащийся в клетках ОСРН2 не окислился при экстракции (рН=4). Затем клетки удаляли центрифугированием и в супернатанте определяли БСР. Такая методика действительно даёт линейное увеличение количества ЭСТ во всём интервале исследованных доз (рис.8.(2)).

Второй проблемой при определении АФК в клетках после облучения является образование АФК в среде и их поступление в клетки. При нагрузке клеток БСРН^-БА и последующих отмывках, БСРНг остаётся только в клетках и, следовательно, в клетках и регистрирует АФК. Однако АФК,

регистрируемые по образованию БСР в клетках, могут образоваться как в клетках, так и проникнуть в них снаружи, в форме долгоживущей и хорошо проходящей мембраны перекиси водорода. Для подтверждения этого вывода была исследована зависимость образования БСБ в клетках от содержания сыворотки в среде. Сыворотка снижает образование АФК в среде за счёт перехвата продуктов радиолиза воды белками, а также разлагает перекись водорода, благодаря содержащейся в ней каталазной активности.

На рис. 9. приведено влияние сыворотки на количество АФК в контрольных и облучённых клетках НЕр-2 (рис. 9. (а)) и Р388 (рис. 9. (Ь)). При определении зависимости количества АФК от концентрации сыворотки из полученных данных вычитали завышение флуоресценции, обусловленное самой сывороткой и разрушенными клетками (данные не представлены).

38-,

36-

34-

32-

30-

28-

Ч)

Е 26-

о 24-

тс £ 22-

:т

I 20-

:т о 18-

а. 16-

>. с; 14-

в 12-

10-

8 -6 -

45-, 40 353025 20 1510 5 0-

0 2 4 в 8 10 Концентрация сыворотки, %

О 2 4 6 8 10

Концентрация сыворотки, %

Рис.9. Зависимость уменьшения АФК в контрольных (7) и облучённых 9 Гр (2) клетках НЕр-2 (а) и Р388 (б) от концентрации сыворотки. АФК измерялись в экстрактах клеток после обработки дигитонином.

В обоих типах клеток увеличение концентрации сыворотки снижает образование АФК в контрольном и облучённом вариантах. В контрольном варианте клеток Р388 сыворотка гораздо более эффективна в снижении АФК, чем в клетках НЕр-2.

Это, по-видимому, обусловлено тем, что клетки Р388 моноцитарного происхождения и большая часть АФК в них образуется на экспорт ЫАВРН-зависимой оксидазой плазматической мембраны. В клетках же НЕр-2 АФК образуются преимущественно внутри клеток (вероятно, митохондриями) и поэтому не доступны для сыворотки. Для интерпретации данных, полученных в облучённых вариантах, рассмотрим подробнее процессы, происходящие во время и после облучения. При инкубации клеток с ОСРН2-ВА, он проникает в

клетки, эстеразы отщепляют ацетатные группы, чем ССРН2 запирается в клетках. В контрольных и облучённых клетках БСРН2 в клетках окисляется как АФК, образующимися в клетках, так и в среде, которые в форме перекиси водорода проникает в клетки. Присутствие сыворотки во время облучения снижает образование перекиси водорода только в среде, поскольку белки сыворотки не проникают в клетки. Этот эффект обусловлен как перехватом образующихся при облучении радикалов сывороткой, так и разложением перекиси водорода каталазой, присутствующей в сыворотке. Как видно на рис. 9 в обоих типах клеток при увеличении концентрации сыворотки в среде эффект облучения на образование АФК резко снижается и при концентрации сыворотки 10% почти отсутствует.

до за. Гр

Рис. 10. Зависимость относительного (к контролю) увеличения количества АФК в суспензии клеток НЕр-2 после смены облучённой среды (/) и без замены облучённой среды (2) от дозы облучения. Результаты 1 и 2 получены после обработки суспензии клеток дигитонином. Клетки облучали в растворе Хэнкса без сыворотки.

Для того, чтобы более наглядно показать, что основная часть АФК образуется именно снаружи, а не внутри клетки, сразу после облучения была сменена среда. Приведенные на рис 10. данные (кривая 1 в сопоставлении с кривой 2) показывают, что большая часть определяемых в клетках АФК образуется в среде, поскольку при удалении облучённой среды сразу после облучения, образование АФК в клетках при облучении резко уменьшается.

Таким образом, большая часть АФК в клетках облучённых в средах без сыворотки и регистрируемая в присутствии облучённой среды, образуется в среде и проникает в клетки в виде перекиси водорода. Оставшееся небольшое увеличение количества АФК (около 1 % на 1 Гр - клетки НЕр-2 и менее 1 % -клетки Р388) может быть обусловлено радиолизом внутриклеточной воды.

Количество это мало, поскольку в клетке высока концентрация перехватчиков радикалов и ферментов, элиминирующих АФК. Несмотря на то,

что количество АФК, генерируемое ионизирующей радиацией в клетках мало по сравнению с метаболически образующимися АФК, ионизирующее облучение вызывает в клетках окислительный стресс. Это обусловлено тем, что большая часть метаболических АФК возникают в цитоплазме, органеллах и плазматической мембране, а в ядре клетки в норме АФК практически нет. При облучении АФК возникают во всех участках клетки с одинаковой вероятностью и, если для периферии клетки этот радиационный уровень АФК мал, по сравнению с нормой, то для ядра клетки он существенен. Таким образом, специфичность радиации заключается в том, что она создаёт локальный окислительный стресс там, где находиться генетический материал - ДНК.

3. Влияние окислительного стресса на МЛУ клеток лимфолейкоза P388VR.

МЛУ в данной работе оценивалась по функциональной активности белков и устойчивости клеток к противоопухолевому препарату - винкристину. Активность транспортных белков определялась по скорости транспорту из клеток эфира кальцеина и родамина 123.

Изменение МЛУ при росте клеток in vivo. Ранее в нашей лаборатории было показано (Ermakova, N.V. et al., 2004), что МЛУ клеток P388VR увеличивается со временем роста опухоли в мышах и это увеличение обусловлено развитием гипоксии и снижением АФК в опухоли (Корыстов Ю.Н. и др., 2006).

10-1

3-1-.-.-.—. . . . |-,-,-,-,—.....

100 1000

количество клеток в опухоли (1 0°) Рис. 11. Зависимость К (МЛУ) Р388УЯ от количества клеток в опухоли.

Поскольку скорость роста опухолей в разных мышах варьирует, то более точно влияние величины опухоли на МЛУ клеток будет отражать зависимость МЛУ от количества клеток в опухоли. На рис. 11. приведены данные по зависимости МЛУ клеток Р388УЯ от количества клеток в опухолях.

Как видно на рис. 11. МЛУ увеличивается с ростом количества клеток в опухоли. Клетки для опытов брали через 7 суток после прививки, когда их количество в опухоли было 4-5x108, а коэффициент активного транспорта эфира кальцеина (К) был 8-9.

3.2. Влияние перекиси водорода на МЛУ.

Было исследовано воздействие перекиси на транспорт из клеток эфира кальцеина, как на один из показателей МЛУ.

В присутствие 300 цМ перекиси водорода МЛУ клеток уменьшается экспоненциально со временем и полностью подавляется через 1 час (рис. 12.). Эффект перекиси водорода увеличивается с ростом её концентрации и зависит от концентрации клеток: при повышении концентрации клеток, эффект перекиси водорода уменьшается. 1С50 перекиси водорода при концентрации клеток 1.2x106 при 1 часовом воздействии равно 60 мкМ.

время, мин Н202, цМ

Рис. 12. (а) Временная зависимость уменьшения активного транспорта эфира кальцеина из клеток Р388УЯ (К) в присутствие 300 цМ перекиси водорода; (Ь) зависимость активного транспорта эфира кальцеина из клеток Р388УЯ (К) от концентрации перекиси водорода при концентрации клеток 1.2 млн/мл (/) и 3 млн/мл (2). Для случая Ь, У = К - \/Ко -1, где Ко - это К в контроле (без перекиси водорода). (п = 3-4 для случаев (а) и (Ь)).

Р388УР!

Р388

О 10 20 30 40 50 60

0 10 20 30 40 50 60

Н202, цМ

н202, рМ

Рис. 13. (а) зависимость выживаемости клеток Р388УК от концентрации перекиси водорода (/) и концентрации перекиси водорода в присутствие 10 цМ винкристина (2); 3, подсчитанная (теоретическая) кривая аддитивного эффекта пероксида водорода и винкристина на выживаемость; (Ь) зависимость выживаемости клеток Р388 от концентрации перекиси водорода (1) и концентрации перекиси водорода в присутствие 0.3 цМ винкристина (2). (п = 4 для опытов (а) и (Ь))

Далее было исследовано влияние перекиси водорода на МЛУ клеток по критерию их чувствительности к винкристину. На рисунке 13. показана зависимость выживаемости клеток Р388УЯ и дикого штамма от концентрации перекиси водорода в присутствие винкристина и без него. Взяты концентрации винкристина снижающие выживаемость клеток на 20%: 10 мкМ для Р388УЛ и 0.3 мкМ для Р388.

Для дикого штамма клеток Р388 эффект совместного действия веществ аддитивен. На графике для устойчивого к винкристину штамма Р388УЯ представлена подсчитанная теоретическая кривая аддитивного действия винкристина и перекиси водорода (рис. 13. (а,3)), фактически же действиеЮ цМ винкристина на клетки Р388УЯ увеличивается с ростом концентрации перекиси водорода. При концентрации перекиси 60 мкМ чувствительность клеток Р388ВР к винкристину становиться такой же, как и клеток дикого типа (рис. 14.).

Увеличение токсичности винкристина для клеток Р388УЯ перекисью водорода является следствием ингибирования откачки из клеток винкристина перекисью водорода.

концентрация винкристина.цМ

Рис. 14. Зависимость выживаемости клеток Р388 (!) и клеток P388VR (2) от концентрации винкристина (л = 4).

Известно, что полупериод распада транспортного белка Pgp, представленного в клетках P388VR, составляет 18.3-19.1 ч в различных клетках (Zhou J. et al., 2006) Так как, промежуток времени между обработкой клеток перекисью водорода и измерением МЛУ этих клеток слишком мал (десять минут) для элиминации (распада) существующих в клетке транспортных белков, то обнаруженный эффект перекиси водорода обусловлен её влиянием непосредственно на активность самих транспортных белков, ответственных за МЛУ. Скорее всего, механизм данного воздействия затрагивает окисление SH-групп в активных центрах транспортных белков, что нарушает их нормальное функционирование.

4. Влияние ионизирующей радиации на МЛУ клеток НЕр-2.

4.1. Влияние радиации на МЛУ. Зависимость от дозы, концентрации клеток и времени после облучення.

Мы изучали влияние ионизирующего облучения на множественную лекарственную устойчивость клеток НЕр-2 в зависимости от дозы и времени после облучения.

I ' I ' I ' I ■ I ' I ' I ' I ' I ' I ' I ' I ' ......I '

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Время, МИН

Рис. 15. Выход родамина 123 из клеток НЕр-2 в контроле (1,2) и через 16 часов после облучения дозой 1 Гр. 1,3-без и 2,4-с добавлением циклоспорина А (1цг/мл).

На рис. 15 показана кинетика выхода родамина 123 из контрольных и облучённых клеток. Выход родамина 123 в облученных клетках увеличивается в отсутствие ингибитора транспортных белков и уменьшается в его присутствии относительно контроля. Увеличение скорости выхода родамина 123 из облучённых клеток в отсутствие ингибитора показывает, что облучение увеличивает активный выход родамина 123, то есть увеличивает активность белков транспортирующих родамин 123.

Доза облучения 1 Гр увеличивает величину Я от 8 до 16 часов с максимальным наблюдаемым эффектом при 16 часах после облучения (табл. 1.). При 24 часах эффект снижается до контрольного уровня.

Время после облучения, ч 8 16 24

Я(1Гр) 3,2±0,3 4,3±0,1 2,5±0,1

И(контроль) 2,5±0,1 2,4±0,1 2,5±0,1

Таблица 1. Изменение активного транспорта из клеток НЕр-2 родамина 123 (Д) в зависимости от времени после облучения дозой 1 Гр (плотность клеток на пластинках 80 тысяч/см2, концентрация циклоспорина А - 1 мкг/мл. Ы= 4 и более).

доза, Гр

Рис. 15. Эффект облучения на активный транспорт из клеток НЕр-2 родамина 123 (Л). Средняя концентрация клеток в чашке 70000/см (с!= 40). N=4.

Зависимость эффекта облучения на МЛУ от дозы облучения и клеточной плотности мы изучали при 16 часах после облучения, когда эффект был максимальным. На рисунке 15. показана зависимость коэффициента ингибирования выхода родамина 123 из клеток (циклоспорином А, 1мг/мл) от дозы облучения. Как видно, Я увеличивается с увеличением дозы до 1 Гр, затем увеличение дозы ведет к уменьшению Я. При дозе облучения 4 Гр, величина Я уже не отличается от контрольной. Таким образом, максимальный эффект наблюдается при дозе 1 Гр, где величина Я увеличивается в 1,6 раза.

Эффект воздействия ионизирующего облучения на МЛУ зависит от плотности клеток. Максимальный эффект достигается при концентрации 80000 - 100000 кл/см2. Как видно на рисунке (рис. 16.) величина II в контрольных клетках не зависит от плотности клеток.

----1->-1-'-1-'-1

О 50 100 150 200

Плотность клеток (тыс./смг)

Рис. 16. Изменение активного транспорта из клеток НЕр-2 родамина 123 (Л) в зависимости от плотности клеток на пластинках в контроле (7) и после облучения дозой 1 Гр (2). N = 4.

Таким образом, при 16 часах после облучения дозой меньше 4 Гр величина Я оказывается выше, чем в контроле. Максимальный эффект наблюдался при дозе 1 Гр и плотности клеток в чашке Петри 80000 - 100000 кл/см2.

10 100 1000 винкристин, пМ

Рис. 17. Влияние винкристина на выживаемость клеток (1) НЕр-2 и клеток (2) Нер-2, облученных дозой 1 Гр за 16 часов до обработки; продолжительность обработки веществом 30 мин. IC50 составило 150 нМ (/) и 720 нМ (2).

Рисунок 17. показывает эффект кратковременной обработки клеток винкристином (30 мин) на выживаемость клеток как контрольных, так и облученных дозой 1 Гр.

Клетки обрабатывали веществом спустя 16 часов после облучения. Плотность клеток соответствовала 70000 кл/см2. Величина 1С50 для винкристина при этих условиях составила 190 нМ в контрольных клетках и 800 нМ для клеток, которых обрабатывали винкристином спустя 16 часов после облучения дозой 1 Гр. Таким образом при дозе 1 Гр облучение дозой 1 Гр не только ускоряет выход родамина 123 из клеток, но также увеличивает резистентность клеток к винкристину в 4,2 раза.

Известно, что около 90% эффекта редкоионизиругощей радиации (гамма и рентгеновское излучение) на клетки обусловлено продуктами радиолиза внутриклеточной воды, то есть АФК генерируемыми излучением (КогузШУ Уи-И., 1992). В то же время было показано выше (см. З.2.2.), что образование АФК при облучении в цитоплазме мало, по сравнению с АФК, возникающими при метаболизме в аэробных условиях. Эффект увеличения МЛУ при облучении можно объяснить радиационным образованием АФК в ядре клетки, где они действуют непосредственно на ядерные регуляторные механизмы транскрипции генов, например, факторы транскрипции. В пользу того, что наблюдаемый эффект обусловлен увеличением транскрипции генов транспортных белков свидетельствует также длительное время (16 ч) его реализации. Таким образом, можно заключить, что ионизирующее облучение посредством окислительного стресса определённой интенсивности (доза 1 Гр) в ядре клетки вызывает стрессовый ответ, следствием которого является увеличение синтеза транспортных белков, ответственных за МЛУ.

Заключение.

1. Разработка нового метода определения АФК по количеству образовавшегося в клетках ОСР.

Одним из результатов данной работы является адаптация использования 2',7'-дихлорофлуоресцина для определения количества активных форм кислорода при окислительном стрессе (избыточная концентрация эндогенно-добавленной перекиси водорода, ионизирующее облучение). Был рассмотрен ряд параметров, влияющих на спонтанный гидролиз ОСРН2-ОА и окисление ОСРНг. Из полученных результатов стоит выделить несколько моментов. Во-первых, при обработке клеток дигитонином и до определения флуоресценции рН экстракта, должен быть кислым; для этого мы экстрагировали ОСР цитратным буфером (рН=4) с дигитонином. Такое значение рН находится на границе буферной емкости для раствора Хэнкса, в то время как цитратный буфер способен удерживать это значение рН. Перед самим измерением рН необходимо повысить, так как максимум флуоресценции ОСР наблюдается при нейтральном значении рН (рН=7). Во-вторых, экстрагирующий раствор не должен содержать сыворотку крови, которая вызывает спонтанное окисление ОСРН2.

2. Влияние на АФК ионизирующей радиации.

При измерении окислительного стресса в клетках при действии ионизирующей радиации были выявлены артефакты (рис. 3.8.). При дозах свыше 3 Гр клеточная мембрана по-видимому становится более проницаемой (скорее всего происходит окисление липидов, составляющих саму мембрану, в результате чего появляются бреши) и DCF выходит из клеток . Вследствие выхода DCF, определяемый уровень DCF в клетках занижается; этот эффект возрастает с увеличением дозы облучения и дозовая зависимость искажается. При обработке клеток дигитонином, мы получили экстракт DCF, который был образован АФК, возникшими как в клетках, так и в среде и проникшими в клетки при инкубации клеток с DCFH2-DA. В этом случае зависимость количества АФК от дозы имела линейный характер.

Было выяснено, что основной вклад в образование АФК в клетках при ионизирующем облучении вносит радиолиз внеклеточной воды. Образовавшаяся при радиолизе воды перекись водорода проникает в клетки и окисляет внутриклеточный DCFI12. В подтверждение этому были проведены эксперименты по влиянию на радиационное образование АФК в клетках сыворотки и смены среды сразу после облучения (рисунки 9., 10.). Внутри самих клеток радиационное образование АФК мало по сравнению с метаболическим, но в зонах (ядро клетки), где метаболические АФК практически отсутствуют, именно радиационные АФК вызывают генотоксические и геномодулирующие эффекты.

3. Роль АФК в изменении МЛУ опухолевых клеток.

Для рассмотрения этого вопроса мы взяли 2 типа опухолевых клеток: это мышиный лимфолейкоз - P388VR и клетки рака гортани человека - НЕр-2. В нашу задачу не входило сравнение этих клеточных культур. Но так как результаты о влиянии окислительного стресса на эти клетки противоположны, то имеет смысл уделить внимание различиям в самих этих клеточных культурах, так и в постановках экспериментов относительно каждого типа.

Клеточные культуры P388VR (мышиная) и НЕр-2 (человеческая) принадлежат разным организмам и происходят из разных тканей: P388VR из крови, НЕр-2 из эпителия. По этой причине, транспортные белки, отвечающие за множественную лекарственную устойчивость клеток различны: у мышиного лимфолейкоза - это P-gp (Nagayama J. Et al., 2001) и скорее всего MRP у клеток рака гортани человека. Кроме того, эксперименты были поставлены специально так, чтобы исследовать разные эффекты окислительного стресса на МЛУ: на клетках НЕр-2 через длительное время после облучения, когда проявляется изменение количества белков, обусловленное влиянием на экспрессию генов, а на клетках P388VR сразу после воздействия окислительного стресса, когда может проявиться только изменение активности существующих белков.

Как уже было упомянуто, при ионизирующем облучении уровень АФК существенно повышается в ядре, а не в цитоплазме и эти АФК воздействуют на ДНК клетки. Нами было показано, что определённые дозы ионизирующего излучения (максимум при 1 Гр) увеличивают активность транспортных белков и МЛУ через длительное время после облучения. Максимальный эффект

наблюдался при 16 часах после облучения (табл. 1.). К 24 часам уровень МЛУ и активность транспортных белков возвращались к контрольному значению. Такое изменение экспрессии транспортных белков, ответственных за МЛУ сходно с изменением экспрессии стрессорных белков и может быть одним из компонентов ответа клетки на стрессорное воздействия, каковым является и ионизирующее излучение.

Р388УЯ явился удобным объектом, чтобы исследовать эффект окислительного стресса не на синтез, а на активность уже функционирующих транспортных белков, ответственных за МЛУ. Окислительный стресс был вызван добавлением перекиси водорода и её эффект на МЛУ и транспортную активность исследовали сразу после воздействия. В отличие от ионизирующей радиации перекись водорода вызывает окислительный стресс в цитоплазматической мембране и цитоплазме и, следовательно, её действие было направлено непосредственно на транспортные белки, ответственные за МЛУ. Увеличение чувствительности клеток Р388У11 к винкристину (рис. 13.) и уменьшение скорости транспорта кальцеина (рис. 12.) говорит о понижении уровня лекарственной устойчивости при обработке клеток перекисью водорода. Таким образом, мы вправе утверждать, что окислительный стресс подавляет МЛУ на уровне активности транспортных белков клеток Р388УЯ. Скорее это связно с окислением БН-групп в СуБ431 белка Р-ёР, как это было показано при воздействии Ы-метиламида в работе ЗЬагош (БЬагот ГЛ., 1997).

4. Значение полученных результатов для терапии опухолей.

В работе было показано, что окислительный стресс сразу после воздействия может снижать МЛУ опухолевых клеток. Этот факт указывает на возможность увеличения эффективности химиотерапии опухолей с множественной лекарственной устойчивостью при сочетании противоопухолевых препаратов с окислительным стрессом, причём препараты должны применяться одновременно или сразу после окислительного стресса. При сочетании химиотерапии с радиотерапией следует иметь в виду, что после облучения может увеличиваться экспрессия генов транспортных белков, что приводит к увеличению МЛУ. Этот эффект развивается за время сопоставимое с длительностью клеточного цикла и применение противоопухолевых препаратов в это время после облучения менее эффективно, чем без облучения.

Выводы:

1. Разработан новый метод определения окислительного стресса в клетках с помощью ОСРНг-ЭЛ, свободный от артефактов, присущих микроскопическому варианту метода. Этим методом измерено количество АФК в клетках в норме и при воздействии перекиси водорода и радиации.

2. Показано, что немедленным эффектом окислительного стресса является подавление активности транспортных белков и повышение чувствительность клеток к противоопухолевым препаратам.

3. Показано, что отсроченным эффектом ионизирующей радиации может быть увеличение активности транспортных белков и устойчивости клеток к противоопухолевым препаратам.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Шапошникова В.В., Ермакова Н.В, Сирота Н.П., Кузнецова Е.А., Емельянов М.О., Кудрявцев А.А., Левитман М.Х., Корыстов Ю.Н. Влияние ионизирующей радиации на клетки Р388 дикого типа и устойчивые к винкристину. Биологические мембраны 2006. Т.23. №4. С.316-320.

2.Корыстов Ю.Н., Шапошникова В.В., Ермакова Н.В., Емельянов М.О., Корыстова А.Ф., Кублик JI.H. Влияние радиации и окислительного стресса на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток. V съезд по радиационным исследованиям. Москва, 10-14 апреля 2006 г. Тезисы докладов, Т.2, с.62.

3. Korystov Y.N., Shaposhnikova V.V., Korystova A.F., Emelianov M.O., Kublik L.N. Detection of oxidative stress induced by radiation in cells with diclorofluorescein assay. The 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Society. 22nd to 25th August 2006. P.79. Kyiv, Ukraine.

4. В. В. Шапошникова, А. Ф. Корыстова, M. О. Емельянов, Jl. H. Кублик, А. А. Кудрявцев, M. X. Левитман, Ю. А. Ким, Ю. Н. Корыстов. Влияние ионизирующей радиации на множественную лекарственную устойчивость клеток рака гортани человека НЕр-2. Биологические мембраны 2007. Т. 24, № 5. С. 413-420.

5. Korystov Y.N., Shaposhnikova V.V., Korystova A.F., Emel'yanov M.О. Detection of Reactive Oxygen Species Induced by Radiation in Cells Using the Dichlorofluorescein Assay. Radiat. Res. 2007. V. 168. n. 2. P.226-232.

6. Korystov Y.N., Shaposhnikova V.V., Korystova A.F., Emel'yanov M.O., Kublik L.N. Modification of Multidrug Resistance of Tumor Cells by Ionizing Radiation. Cancer Chemother. Pharmacol. 2008. V. 61. n. 1. P. 15-21.

7. Korystov Y.N., Emel'yanov M.O., Korystova A.F., Levitman M.Kh., Shaposhnikova V.V.. Determination of Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Rat Aorta Using the Dichlorofluorescein Assay. Free Radical Research. 2009; 43(2): 14955

Подписано в печать:

15.12.2010

Заказ № 4710 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autorcfcrat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Емельянов, Максим Олегович

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Окислительный стресс.

1.1.1. Понятие окислительного стресса.

1.1.2. Активные формы кислорода.

1.1.2.1. Общее понятие активных форм кислорода.

1.1.2.2. Супероксидный анион-радикал.

1.1.2.3. Пергидроксильный радикал.

1.1.2.4. Перекись водорода.

1.1.2.5. Гидроксильный радикал.

1.1.2.6. Синглетный кислород.

1.1.2.7. Гипохлорид.

1.1.2.8. Оксид азота.

1.1.2.9. Пероксинитрит.

1.1.3. Источники активных форм кислорода.

1.1.3.1 Метаболические пути образования АФК.

1.1.3.2. Образования АФК митохондриями во время гипоксии и гипероксии.

1.1.3.3. Образования АФК при действии ионизирующего облучения

1.1.4. Роль АФК.

1.1.4.1. Клеточная сигнализация.

1.1.4.2. Экспрессия генов.

1.1.4.3. Регуляция клеточной гибели.

1.1.4.4. Регуляция клеточного роста.

1.2.Методы определения окислительного стресса в клетках.

1.2.1. Определение супероксидного аниона-радикала.

1.2.2. Детекция перекиси водорода.

1.2.3. Детекция пероксинитрита.

1.2.4. Использование флуоресцентного красителя 2',7'-дихлорофлуоресцеина.

1.3. Множественная лекарственная устойчивость.

1.3.1. Неклеточные механизмы устойчивости.

1.3.2. Клеточные формы устойчивости.

1.3.3. Природная устойчивость.

1.3.4. Приобретенная устойчивость.

1.3.4.1. Роль ключевых генов, контролирующих апоптоз, в развитии лекарственной устойчивости.

1.3.4.2. Транспортные белки, ответственные за множественную лекарственную устойчивость.

1.3.4.2.1. Структура Р-гликопротеина.

1.3.4.2.2. Конформационные изменения структуры Р

§р.

1.3.4.2.3. Субстратная специфичность Р

§р.

1.3.4.2.4. Ген ггкМ, кодирующий Р-гликопротеин, генетические механизмы Р-^р-МЛУ.

1.3.4.2.5. Экспрессия шс!г1 в нормальных тканях и клетках.

1.3.4.2.6. Роль МЛУ, опосредованной Р-^р, в злокачественных новообразованиях.

1.3.4.2.7. МЯР, белок, ассоциированный с множественной лекарственной устойчивости.

1.3.4.2.8. Ингибиторы транспортных белков МЛУ.

1.3.5. Регуляция МЛУ.

1.3.5.1. Влияние цитокинов на МЛУ.

1.3.5.2. Роль фосфолипазы С и протеинкиназы С в регуляции МЛУ.

1.3.5.3. Роль МАРК каскада в МЛУ.

1.3.5.4. Факторы транскрипции, регулирующие МЛУ.

1.3.5.5. Влияние окислительного стресса на экспрессию генов и синтез белков, ответственных за МЛУ

2. Материалы и методы.

2.1. Реактивы и среды.

2.2 Определение количества клеток в опухоли.

2.3. Облучение клеток.

2.4. Культуры клеток. Определение выживаемости клеток.

2.4.1. Клетки Р388 и P388VR. Определение влияния винкристина и перекиси водорода на выживаемость клеток.

2.4.2. Клетки НЕр-2. Определение влияния винкристина и облучения на выживаемость клеток.

2.5. Определение АФК.

2.5.1. Определение АФК в клетках Р388 и P388VR.

2.5.2. Определение АФК в клетках НЕр-2.

2.6. Определение активности транспортных белков.

2.6.1. В клетках НЕр-2.

2.6.2. В клетках P388VR.

2.7. Статистический анализ.

3. Результаты.

3.1. Разработка нового метода определения АФК по количеству образовавшегося в клетках DCF.

3.2. Определение АФК в клетках в различных условиях.

3.2.1. Влияние на АФК в клетках in vitro состава среды, концентрации клеток, перекиси водорода.

3.2.2 Влияние ионизирующей радиации на АФК в клетках.

3.3. Влияние окислительного стресса на МЛУ клеток лимфолейкоза P388VR.

3.3.1. Изменение МЛУ при росте клеток in vivo.

3.3.2. Влияние перекиси водорода на МЛУ.

3.4. Влияние ионизирующей радиации на МЛУ клеток НЕр-2.

3.4.1. Влияние радиации на МЛУ. Зависимость от дозы, концентрации клеток и времени после облучения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение влияния окислительного стресса на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток"

Устойчивость к лекарственным препаратам может развиваться вследствие блока в опухолевых клетках апоптоза, вследствие особенности роста опухоли, при которых уменьшается кровоснабжение опухоли, и следовательно, доставка препаратов с кровью. МЛУ также может быть результатом инактивации препарата в клетке, снижения его поступления в клетку и повышения вывода препарата из нее. В последнее время показано, что множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток, обусловленная откачкой из клеток противоопухолевых препаратов транспортными белками, является одним из главных факторов снижающих эффективность химиотерапии опухолей. Поэтому изучение регуляции экспрессии и активности транспортных белков в опухолевых клетках важно для химиотерапии опухолей.

В последние десятилетия возросло внимание ученых к изучению эффектов активных форм кислорода. В качестве месенжеров они влияют на такие клеточные процессы как клеточная гибель, старение, пролиферация, экспрессия генов, множественная лекарственная устойчивость. Относительно последнего имеется большой ряд работ, посвященных эффекту активных форм кислорода на синтез транспортных белков, ответственных за множественную лекарственную устойчивость. Причем этот эффект носит довольно противоречивый характер: в одних случаях окислительный стресс стимулирует МЛУ за счет синтеза новых белков, в других - подавляет, а в третьих - не оказывает влияния вовсе. Скорее всего, противоречивость эффектов связана с различиями в типах клеток, генах, которые экспрессируют разные белки, в концентрациях АФК. Все это в совокупности дает разные результаты в экспериментах о влиянии АФК на МЛУ. Одной из наших задач было посмотреть влияние ионизирующего облучения как модулятора АФК на множественную лекарственную устойчивость на уровне синтеза транспортных белков, отвечающих за МЛУ.

При большом количестве работ о влиянии АФК на синтез транспортных белков, ответственных за МЛУ, нами не было обнаружено статей о влиянии окислительного стресса на активность самих транспортных белков. Поэтому одной из задач данного исследования было оценить влияние окислительного стресса на активность белка P-gp, обеспечивающего множественную лекарственную устойчивость клеток мышиного лимфолейкоза P388VR мышей.

Параллельно с увеличением внимания к изучению эффектов АФК появилось большое количество методов количественного определения АФК как в клетке, так и в растворе. Довольно часто используется флуоресцентный краситель, который начинает светиться после взаимодействия с окислителем (АФК). Одним из таких красителей является 2',7'-дихлорфлуоресцин. В методах определения АФК пользуются его предшественником 2',7'-дихлорофлуоресцин диацетатом, который, после попадания в клетку, посредством внутриклеточных эстераз теряет две ацетатные группы, приобретает заряд и таким образом "запирается" в клетке. Появившийся в клетке 2',7'-дихлорфлуоресцин в реакции с АФК становиться 2',7'-дихлорфлуоресцеином, который флуоресцирует и определяется спектрофлуориметрически или микроскопически. Главная проблема использования этого детектора - его неустойчивость, что сказывается на точности результатов. 2',7'-дихлорофлуоресцин диацетат при нейтральном рН способен спонтанно гидролизоваться, а 2',7'-дихлорфлуоресцин спонтанно окисляться. По этому еще одной задачей настоящей работы явилась адаптация использования DCF для измерения окислительного стресса в клетках.

Задачи исследования:

1. Разработать метод определения АФК в клетках с использованием 2',7'-дихлорофлуоресцин диацетата и определить АФК в клетках в норме и при действии окислительного стресса различной природы (радиация, перекись водорода).

2. Изучить влияние ионизирующего облучения на МЛУ клеток рака гортани человека НЕр-2.

3. Изучить влияние окислительного стресса на активность белка Р-§р и МЛУ клеток Р388УЯ мышиного лимфолейкоза.

1. Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Емельянов, Максим Олегович

4. Заключение.

4.1. Разработка нового метода определения АФК по количеству образовавшегося в клетках БСГ.

Одним из результатов данной работы является адаптация использования 2',7'-дихлорофлуоресцина для определения количества активных форм кислорода при окислительном стрессе (избыточная концентрация эндогенно-добавленной перекиси водорода, ионизирующее облучение). Был рассмотрен ряд параметров, влияющих па спонтанный гидролиз БСРНл-ОА и окисление ВСРН2. Из полученных результатов стоит выделить несколько моментов. Во-первых, при обработке клеток дигитонином и до определения флуоресценции рН экстракта, должен быть кислым; для этого мы экстрагировали БСР цитратным буфером (рН=4) с дигитонином. Такое значение рН находится на границе буферной емкости для раствора Хэнкса, в то время как цитратный буфер способен удерживать это значение рН. Перед самим измерением рН необходимо повысить, так как максимум флуоресценции БСР наблюдается при нейтральном значении рН (рН=7). Во-вторых, экстрагирующий раствор не должен содержать сыворотку крови, которая вызывает спонтанное окисление ВСРН2.

4.2. Влияние на АФК ионизирующей радиации.

При измерении окислительного стресса в клетках при действии ионизирующей радиации были выявлены артефакты (рис. З.8.). При дозах свыше 3 Гр клеточная мембрана по-видимому становится более проницаемой (скорее всего происходит окисление липидов, составляющих саму мембрану, в результате чего появляются бреши) и ВСБ выходит из клеток . Вследствие выхода БСР, определяемый уровень БСБ в клетках занижается; этот эффект возрастает с увеличением дозы облучения и дозовая зависимость искажается. При обработке клеток дигитонином, мы получили экстракт БОБ, который был образован АФК, возникшими как в клетках, так и в среде и проникшими в клетки при инкубации клеток с ВСРН2-ОА. В этом случае зависимость количества АФК от дозы имела линейный характер.

Было выяснено, что основной вклад в образование АФК в клетках при ионизирующем облучении вносит радиолиз внеклеточной воды. Образовавшаяся при радиолизе воды перекись водорода проникает в клетки и окисляет внутриклеточный DCFH2. В подтверждение этому были проведены эксперименты по влиянию на радиационное образование АФК в клетках сыворотки и смены среды сразу после облучения (рисунки 3.9., 3.10.). Внутри самих клеток радиационное образование АФК мало по сравнению с метаболическим, но в зонах (ядро клетки), где метаболические АФК практически отсутствуют, именно радиационные АФК вызывают генотоксические и геномодулирующие эффекты.

4.3. Роль АФК в изменении МЛУ опухолевых клеток.

Как уже было упомянуто (см. 3.2.2.) при ионизирующем облучении уровень АФК существенно повышается в ядре, а не в цитоплазме и эти АФК воздействуют на ДНК клетки. Нами было показано, что определённые дозы ионизирующего излучения (максимум при 1 Гр) увеличивают активность транспортных белков и МЛУ через длительное время после облучения. Максимальный эффект наблюдался при 16 часах после облучения (табл. 3.1.). К 24 часам уровень МЛУ и активность транспортных белков возвращались к контрольному значению. Такое изменение экспрессии транспортных белков, ответственных за МЛУ сходно с изменением экспрессии стрессорных белков и может быть одним из компонентов ответа клетки на стрессорное воздействия, каковым является и ионизирующее излучение.

P388VR явился удобным объектом, чтобы исследовать эффект окислительного стресса не на синтез, а на активность уже функционирующих транспортных белков, ответственных за МЛУ. Окислительный стресс был вызван добавлением перекиси водорода и её эффект на МЛУ и транспортную активность исследовали сразу после воздействия. В отличие от ионизирующей радиации перекись водорода вызывает окислительный стресс в цитоплазматической мембране и цитоплазме и, следовательно, её действие было направлено непосредственно на транспортные белки, ответственные за МЛУ. Увеличение чувствительности клеток P388VR к винкристину (рис. 3.13.) и уменьшение скорости транспорта кальцеина (рис. 3.12.) говорит о понижении уровня лекарственной устойчивости при обработке клеток перекисью водорода. Таким образом, мы вправе утверждать, что окислительный стресс подавляет МЛУ на уровне активности транспортных белков клеток P388VR. Скорее это связно с окислением SH-групп в Cys431 белка P-gp, как это было показано при воздействии N-метиламида в работе Sharom (Sharom F.J., 1997).

4.4. Значение полученных результатов для терапии опухолей.

Информация о работе

Емельянов, Максим Олегович
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Изучение влияния окислительного стресса на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы