Окислительный стресс во взаимодействиях опухоли и организма

Шварцбурд, Полина Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Окислительный стресс во взаимодействиях опухоли и организма
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Окислительный стресс во взаимодействиях опухоли и организма"

ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ РАН ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ РАН

На правах рукописи

* и сл

ШВАРЦБУРД ? НПП Полина Михайловна

ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ ОПУХОЛИ И ОРГАНИЗМА

03.00.02 - Биофизика

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

ПУЩИНО 1997

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук, профессор Е.Б. Бурлакова,

Доктор биологических наук, профессор Г.С. Календо,

Доктор физико-математических наук, профессор

В.В. Смолянинов.

Ведущая организация - Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

у*) " ■> > -

Защита состоится Л-г. о-'/> д 1997 г. в /3 часов на заседании диссертационного совета (Д200.22.01) в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, Московская область, г.Пущино, ИТЭБ РАН.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Диссертация в виде научного доклада разослана

1997Г.

(дата)

Ученый секретарь '/

диссертационного совета ¡Нелипович П.А.

(фамилия)

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Среди фундаментальных проблем, общих для биофизики, клеточной биологии и медицины, важное место занимает проблема развития опухолевого процесса и изучение механизмов его регуляции. До настоящего времени проблема рака продолжает оставаться одной из наиболее актуальных и сложных в современной науке, что обусловлено стабильно высоким уровнем онкологической заболеваемости и часто неудовлетворительными результатами ее лечения. Механизмы взаимодействия опухоль - организм по праву считаются основополагающими в развитии опухолевого процесса, его системном влиянии, индуцирующим расстройство гомеостаза (прежде всего, как результат успешной. конкуренции опухоли с тканями организма за жизненно важные метаболиты, витамины, антиоксиданты). В результате такой конкуренции, формируется стабильный дисбаланс между развивающейся опухолью и организмом, при котором именно опухолевые клетки приобретают более благоприятные условия для своего роста и повышенную устойчивость к повреждениям. Действительно, для большинства опухолевых клеток и их мембранных фракций характерен более низкий уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в сравнении с нормальными клетками. Наиболее вероятным субстратом ПОЛ в организме являются полиненасыщенные жирные-, кислоты (ЖК). Известно, что многие опухолевые клетки содержат липопротеиновые гранулы с высоким уровнем содержания • полиненасыщенных ЖК, в частности линолевой и арахидоновой ЖК. Неясно какие механизмы при этом позволяют опухолевым клеткам поддерживать высокую устойчивость к образованию продуктов ПОЛ, особенно когда количество и объем таких гранул в клетках возрастает. В 1969 году Оогтапс!у Т.!_. выдвинул теоретическое предположение, что если полиненасыщенные ЖК (ПНЖК) преимущественно входят в состав мембранных структур, то в таких клетках следует ожидать снижение устойчивости к ПОЛ-индуцированным летальным повреждениям. Напротив, преимущественная аккумуляция связанных ПНЖК в составе внутриклеточных липид-содержащих гранул способна защитить клетки, так как такие гранулы могут работать как ловушки свободных радикалов (СР), снижая доступность

высокореаетивных окислителей к мембранным структурам (основных индукторов апоптоза и некроза). Таким образом, характер внутриклеточного распределения ПНЖК может существенно влиять на устойчивость клеток к окислительным повреждениям. Теоретическое предположение Dormandy T.L. ранее не проверялась, вероятно, из-за отсутствия прямого метода, который бы позволил непосредственно измерить устойчивость к окислительному стрессу в одиночных, живых клетках и их внутриклеточных компартментах (в частности, в кластерах из опухолевых липопротеиновых гранул и в участках цитоплазмы, не содержащих эти гранулы).

Проблема взаимодействия опухоль-организм является основополагающей в прогрессии опухолевого процесса, его опосредованном, негативном действии на организм хозяина. Такое действие опухоли индуцирует каскад неспецифических нарушений функций различных органов и систем, непосредственно не связанных с локализацией первичной опухоли. Одним из проявлений негативного действия опухоли на организм опухоленосителя является увеличение содержания продуктов ПОЛ, появление некоторых модифицированных белков с большей устойчивостью к деструкции (как например, фибрин). Не изучено, принимают ли такие модифицированные белки участие в развитии комплекса вторичных болезней опухоленосителя, мало-зависящих от локализации первичной опухоли и известных также под названием "Паранеопластический синдром". Проведение таких исследований представлялось важным, так как именно вторичные болезни часто являются непосредственной причиной смерти опухоленосителя. К числу таких болезней, прежде всего, следует отнести нарастающую эндотоксикацию опухоленосителя (эндоток-семия), которая развивается на фоне приобретенной гиперчувствительности организма к летальному действию эндотоксинов (в частности, к фактору некроза опухоли). Усиливаются также симптомы необратимой анемии и гиперферритинемии, сопровождающиеся массивными отложениями водонерастворимого ферритина в селезенке, хотя обычно ферритин является водорастворимым белком. В серии опытов in vitro O'Connel M.J. показал, что водорастворимый ферритин становится водонерастворимым

после модификации его структуры свободными радикалами (СР). Такой СР-модифицированный ферритин становится устойчивым к протеолизу и приобретает характерную желто-оранжевую флуоресценцию (сходную с флуоресцентцией гемосидерина и липофусцина, известных пигментов старения). К моменту начала данной работы не было известно является ли ферритин, накапливающийся в селезенке опухоленосителя СР-модифицированным, и если да, то кореллирует ли его появление с уменьшением порога устойчивости спленоцитов к окислительному стрессу, и на какой стадии взаимодействия опухоль-организм это происходит.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы явилось выяснение механизмов, способствующих сохранению высокой резистентности опухолевых клеток к окислительному стрессу и потере такой устойчивости в нормальных клетках опухоленосителя, а также исследованию данного дисбаланса как возможной патофизиологической основы для развития ряда вторичных болезней опухоленосителя (в частности, перекисной интоксикации, селезеночной гиперферритинемии, гипохромной анемии, обусловленной крайне низкой реутилизацией ионов железа из ферритинового депо).

Цель исследования обусловила постановку ряда

задач:

1. Выбор экспериментальных моделей развития опухолей, различающихся по уровню содержания внутриклеточных липопротеиновых (ЛП) гранул.

2. Поиск и разработка методов, позволяющих с максимальной контрастностью визуализировать ЛП-гранулы в нативных опухолевых клетках и количественно оценивать порог устойчивости к развитию перекисного стресса как в нативных тканях и отдельных живых клетках, так и различных внутриклеточных компартментах, содержащих и несодер-жащих ЛП-гранулы.

3. Изучение действия опухоли на организм, путем сравнения динамики порога устойчивости опухолевых и нормальных клеток к окислительному стрессу на разных стадиях развития опухолевого процесса.

4. Исследование возможности эндогенной генерации свободных радикалов самими опухолевыми клетками (прежде всего, на стадии быстрого поступления нормоксической плазмы к гипоксическим асцитным опухолевым клеткам, т.е. в состоянии имитирующем переход гипоксия-реперфузия in vivo). Изучить цитохимическим методом, в каких именно внутриклеточных компартментах могут генерироваться окси-данты и какие это может иметь последствия для выживания опухолевых клеток.

5. Изучение влияния опухоли на организм, по возникновению вторичной болезни накопления - селезеночной гиперферри-тинемии, развитие которой сопровождается накоплением водонерастворимого ферритина с высокой устойчивостью к деструкции и сравнение спектральных свойств этого селезеночного ферритина и ферритина, модифицированного свободными радикалами in vitro.

6. Оценка возможности использования перфторорганических соединений как сорбирующих агентов, способных удалять гидрофобные продукты окислительного стресса из организма опухоленосителя. Разработка метода, позволяющего наблюдать за поведением перфторорганических соединений в живых тканях.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Открыты пространственно-упорядоченные кластерные структуры из ЛП-гранул в живых клетках асцитной гепатомы Зайделя (АГЗ). Это стало возможным благодаря применению интерференционной микроскопии с полным расщепленным изображением, используемой с целью визуализации единичных липидсодержащих гранул с максимальным цветовым контрастом, что позволило впервые выявить треугольно-подобные кластеры из этих гранул в делящихся, одиночных клетках АГЗ, где они симметрично распределены относительно линии межклеточного раздела. Были выявлены также приповерхностные "кэпообразные" кластеры из ЛП-гранул в опухолевых клетках АГЗ и АОЭ.

Впервые получены прямые экспериментальные подтверждения гипотезы Dormandy T.L. о потенциальной способности внутриклеточных липопротеинов улавливать свободные радикалы. Показано особое значение этого механизма для защиты асцитных опухолевых клеток в период

развития "Паранеопластического синдрома" в организме опухоленосителя. Проведение таких прямых измерений стало возможным благодаря нашим разработкам в создании нового метода, позволяющего измерить устойчивость к окислительному стрессу непосредственно в одиночных опухолевых клетках или их липопротеиновых кластерах (или в участках цитоплазмы без липопротеинов). Выявлены также метаболические условия, при которых опухолевые внутриклеточные липопротеины приобретают способность работать ловушками свободных радикалов.

Впервые, и только в селезенке опухоленосителя с гиперферритинемией, зарегистрировано появление желто-оранжевой флуоресценции с высокой устойчивостью к процессам деструкции (подобные свойства приобретает ферритин после его модификации свободными радикалам in vitro. Накопление CP-модифицированного ферритина в селезенке опухоленосителя коррелировало с потерей потенциальной устойчивости спленоцитов к окислительному стрессу, возникновению эндогенных источников генерации оксидантов. Эти изменения непосредственно предшествовали развитию симптомов эндотоксического шока и анемии. Предложен механизм объясняющий взаимосвязь этих эффектов. Предполагается, возникновение нового "порочного" цикла, в котором из-за необратимой модификации ферритина, реутилизация ионов железа значительно снижена. В результате блокируется рост опухоли, на фоне прогрессии анемии и эндотоксемии организма-хозяина.

Впервые экспериментально установлено, что химически инертные перфторорганические (ПФО) соединения обладают биологической активностью, проявляющейся в сорбции белков, липидов, клеток с повышенной гидрофобностью. Визуализация этих сорбционных эффектов стала возможной благодаря нашим разработкам первого в мире прямого метода, позволившего однозначно идентифицировать ПФО-соединения в нативных цитологических препаратах. В последние годы ПФО-соединения успешно применяются в зарубежной онкологической практике (как газо-транспортирующие среды, усиливающие цитотоксич-ность противоопухолевых воздействий). На основании наших данных можно считать, что такая эффективность

основана не только на известных газо-транспортирующих свойствах ПФО-соединений, но и на их способности сорбировать токсичные, гидрофобные соединения, возникающие в результате развития окислительного стресса в организме опухоленосителя.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

1. Предложен механизм системного действия опухоли, способствующий развитию комплекса вторичных болезней, часто являющихся непосредственно причиной смерти опухоленосителя. Этот механизм базируется на способности злокачественных опухолей индуцировать развитие окислительного стресса в некоторых тканях опухоленосителя при сохранении самими опухолевыми клетками высокой резистентности к повреждающему действию свободных радикалов. Развитие такого дисбаланса индуцирует приобретение ряда обратимых и необратимых модификаций некоторыми жизненно важными белками, в частности ферритином. В итоге в селезенке развивается новая, вторичная болезнь накопления модифицированного ферритина (с низкой способностью к реутилизации ионов железа), что в свою очередь усиливает анемию опухоленосителя, делает ее стабильной и необратимой. Важным практическим следствием формирования этого нового "порочного цикла" является противопоказание к применению экзогенных препаратов железа для нормализации этого типа анемии. Предложенный механизм экспериментально обоснован и имеет большое научно-практическое значение, так как позволяет выработать стратегию возможных превентивных действий, лимитирующих негативное влияние опухоли на окислительную устойчивость организма.

2. Разработанный экспресс-метод определения порога устойчивости в тканевых препаратах (а также в одиночных, живых клетках и их внутриклеточных компартментах) к окислительному стрессу, впервые дает возможность оперативно оценить системное действие опухоли на организм хозяина. Этот метод имеет хорошую перспективу найти применение в самых различных областях экспериментальной биологии и клинической медицины.

3. Приведенные в работе данные о способности некоторых внутриклеточных липопротеинов работать ловушками

свободных радикалов и защищать опухолевые клетки от летальных повреждений, необходимо учитывать при оценке опухолевой резистентности и выборе противоопухолевой терапии (особенно на поздних стадиях развития опухолевого процесса).

4. Используемый в работе метод интерференционной микроскопии с полным расщепленным изображением в качестве способа визуализации одиночных внутриклеточных липо-протеинов и их структур может оказаться крайне полезным для решения различных задач липидологии живой клетки (в частности, для изучения механизмов формирования пространственно-упорядоченных структур из опухолевых ЛП-гранул). Этот редко используемый метод, оказался также незаменимым для прямой цитовизуализации перфтор-органических соединений и установления факта их сорбционной активности. Накопленный опыт применения этого метода может быть полезным для практического применения перфторорганических соединений в трансплантологии, локальной перфузии органов, создании новых оксигенирующих систем.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы были представлены на 5 Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию физиологически активных веществ, г.Рига, 1983; 2 Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение", г.Рига, 1985; 6 Конференции онкологов Прибалтийских республик, г.Рига, 1985; 4 Всесоюзном симпозиуме "Регуляция иммунного гомеостаза", г.Ленинград, 1986; 1 Всесоюзном рабочем совещании "Биофизика рака", Черноголовка, 1987; 5 Всесоюзный съезд геронтологов и гериатров, г.Тбилиси, 1988; 4 Всесоюзный съезд патофизиологов, г.Кишенев, 1989; International conference "Regulation of free radical reactions", ^/arna, Bulgaria 1989; 5 Всесоюзном симпозиуме "Взаимодействие нервной и иммунной системы", -.Ленинград, 1990; Всесоюзном симпозиуме "Биохимия эпухолевой клетки", г.Минск, 1990; 2-th Meeting the -ederation of Europ. Biochem. Soc., Hungary, 1990; 4-th nternational Symposium of Lipofuscin and Ceroid Pigments "'Biology of Aging-92"), Tampere, Finland, 1992; 25-th Annual

Meeting of the European Society for Radiation Biology, Stokholm, Sweeden, 1993; International Congress of "Cell Biology", Praque, Czechoslovakia, 1994; 5-th International Symposium of Lipofuschin, "Gerontology Week in Japan", Tokyo, Japan, 1995; Keystone Symposium "Oxidant Stress: From Molecuies to Man", USA, 1996; International Symposium "Anticancer Target and Stratégies for the Twenty-First Century", Castres, France, 1996; 1 Международный Симпозиум "Фундаментальные науки и альтернативная медицина", г.Пущино, 1997.

МЕТОДЫ

РАЗРАБОТКА И ОПТИМИЗАЦИЯ КОМПЛЕКСА МЕТОДОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ НАТИВНЫХ ТКАНЕЙ, А ТАКЖЕ ЕДИНИЧНЫХ, НАТИВНЫХ КЛЕТОК И ИХ ЛИПОПРОТЕИНОВ К ОКИСЛИТЕЛЬНОМУ СТРЕССУ Генерация прооксидантов, является обязательным атрибутом нормальной аэробной жизни. Постоянное образование прооксидантов в живых организмах уравновешенно той же скоростью их дезактивации антиоксидантами, что требует непрерывной регенерации антиоксидантного потенциала клетки. Развитие конституционного дисбаланса между оксидантами и антиоксидантами, прежде всего отражается на изменении порога устойчивости клеток к экзогенному окислительному стрессу. Резистентность клеток - интегральный показатель, в немалой степени зависящий от химического состава клеточных липидов, их структурной организации, а также от уровня экспресии ряда важных защитных белков (Bcl-2, хит-шоковских белков). Обычно для тестирования потенциальной клеточной устойчивости к окислительному стрессу используются свободные радикалы, генерируемые в модельных системах (в частности, ксантиноксидазной реакции) и непосредственно действующие на суспензию изучаемых клеток или препаративно выделенных субклеточных фракций. В итоге измеряется суммарный уровень образования конечных продуктов окисления (в частности, .малонового диальдегида) с помощью биохимических методов. Такие методы определения клеточной устойчивости давно и широко применяются, но они не позволяют производить прямые измерения резистентности в одиночных клетках, и тем более в их внутриклеточных компартментах.

Нам удалось разработать микроспектрофлуо-ресцентный экспресс-метод, который впервые позволяет оценить резистентность нативной ткани, а также индивидуальных клеток и их внутриклеточных органелл к окислительному стрессу. В этом методе УФ-свет (А.=365нм) использовался как экзогенный индуктор генерации радикалов, в изучаемых внутриклеточных компартментах, где затем измерялся уровень образовавшихся флуоресцентных продуктов (ФП) перекисного окисления липидов (ФП-ПОЛ) в спектральной полосе 430-470нм.

нарн

10(4

Т(мин)

0,7 1,4 2,1 2,8 3,5

Рис.1. Скорость уменьшения интенсивности (I) флуоресценции (УФ-фотодеструкция), тестируемая при 1=460нм для НАД(Ф)Н (а), линоленовой (□) и линолевой (А) жирных кислот, а также смеси полиненасыщенных жирных кислот (V) при непрерывном действии УФ-света (А); Реакция УФ-фотодеструкции линолевой кислоты (В) развивается как при действии УФ-света, /,=365нм (заштрихованные участки), так и в темновых условиях (не заштрихованные участки) после инициирующего действия УФ-света. Стрелки вниз - указывают на момент выключения УФ-света, стрелки вверх - на его включение (аналогичные обозначения и на Рис.2).

'460 и .уф . СВет

□ - темновые условия

ир 1-1.5 гтил

— 5 гит и более

Время(МИН)

Рис.2. Схема демонстрирует принцип спектрокинетической идентификации и разделения в условиях нативной клетки двух важных соединений, флуоресцирующих в одной, общей спектральной полосе (430-470нм). К ним относятся: 1) флуоресцирующие продукты перекисного окисления липидов (ФП-ПОЛ), характеризующиеся высокой скоростью УФ-фотодеструкции [эта реакция продолжается и в темновых условиях (точка 2 ниже точки 1)]; 2) НАД(Ф)Н, флуоресценция которых более устойчива к фотодеструктивному действию УФ-света (^=365нм), более того, живая клетка способна регенерировать интенсивность НАД(Ф)Н флуоресценции в темновых условиях (точка 4 выше точки 3, точка 6 выше точки 5). Применение набора микродиафрагм [с различным диаметром] позволяет использовать УФ-свет как экзогенный локальный индуктор свободных радикалов, с целью последующего определения [по уровню ФП-ПОЛ] порога устойчивости различных внутриклеточных компартментов или одиночных клеток к пероксидативному стрессу. Перечисленные выше спектро-кинетические различия между флуоресценцией НАД(Ф)Н и ФП-ПОЛ были нами использованы, чтобы в условиях одиночной живой клетки четко отличить их друг от друга, а затем оценить их вклад в общую интенсивность полосы флуоресценции с максимумом Х=460нм (условно принятого за 100%).

В этой же спектральной полосе одновременно флуоресцирует и НАД(Ф)Н, который однако отличаются от ФП-ПОЛ большей устойчивостью к УФ-фотодеструкции (Рис.1 А), а также тем, что в условиях нативной клетки интенсивность флуоресценции НАД(Ф)Н может быть частично восстановлена в темновых условиях (Рис.2). Напротив, ФП-ПОЛ характеризуются УФ-фотодеструкцией, которая способна продолжаться и при действии УФ-света, и в темновых условиях [это свойство ФП-ПОЛ наблюдается как в модельной системе (Рис.1 В), так и в условиях живой клетки (Рис.2)].

Для проверки гипотезы Оогтапс1у [о предполагаемой способности внутриклеточных ЛП-гранул работать ловушками свободных радикалов], необходимо было визуализировать ЛП-гранулы именно в нативных опухолевых клетках, а затем измерить в них устойчивость к окислению. С этой целью микроскопирование проводилось с применением метода интерференционного контраста с полным расщепленным изображением. Этот редко применяемый метод наиболее адекватен для изучения чисто фазовых объектов - не поглощающих свет, но вносящих изменения в фазу проходящего через него излучения (именно такими объектами являются опухолевые клетки и их липопротеины). В свою очередь эта разность фаз равна произведению показателя преломления света (п) на путь, пройденный светом -толщину. Разность между показателем преломления цитоплазмы (1,36) и показателем преломления опухолевых липопро-теинов (1,5), которые в основном состоят из жидких липидов, настолько существенна, что цвет гранул в интерференционном изображении резко отличается от цвета, окружающей их цитоплазмы (Рис. 3,4). Это позволяет более точно измерить диаметр этих гранул, изучить особенности их внутриклеточного распределения.

Этот метод также оказался незаменимым для прямой визуализации химически инертных ПФО-соединений, для которых характерен аномальный показатель преломления (ниже единицы), тогда как у всех биологических объектах этот показатель выше единицы. Это свойство послужило основанием для создания метода визуализации ПФО-соединения в любых нативных цитологических препаратах с целью проверки их сорбционной активности.

Рис.3. Визуализация липопротеиновых (ЛП) гранул в асцитных опухолевых клетках АГЗ [интерференционная микроскопия, метод "Интерфако" с полным расщепленным изображением ЛП-гранул].

A,Б - многоклеточные агрегаты из суспензии опухолевых клеток АГЗ на 2-ые (А) и 5-ые сутки (Б) развития опухолевого процесса in vivo.. По мере роста опухоли, с увеличением числа ЛП-гранул увеличивается из размер, а также возможность появления ЛП-гранул на периферии опухолевых клеток и за ее пределами (Б);

B,Г - топография распределения и пространственная упаковка ЛП-гранул в делящихся нативных АГЗ-клетках - [В -интерференционное микроскопировании; Г - та же клетка после фиксации и окраски акридиновым оранжевым (люминесцентное микроскопирование)]. На фотографии четко видна симметричность в распределении треугольных кластеров из ЛП-гранул относительно линии межклеточного раздела и линии, мысленно соединяющей два ядра (В). После фиксации кластеры из ЛП-гранул выявляются в виде непрокрашенных темных пятен, пространственная упаковка ЛП-гранул в кластеры не видна (Г).

Рис.4. Одиночные опухолевые клетки из нативной суспензии асцитной гепатомы Зайделя: А - "Кэпообразные" кластеры из ЛП-гранул, расположенные на периферии АГЗ-клетки, а возможно, и на ее поверхности; Б - явление сферуляции и клазматоза, в результате которых ЛП-гранулы образуют плотно-упакованные агрегаты в составе некоторых везикул, способных к последующему отрыву от клеточное поверхности и появлению во внеклеточное среде.

КОМПЛЕКС ЦИТОХИМИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СИСТЕМНОГО ДЕЙСТВИЯ ОПУХОЛИ НА ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ ГОМЕОСТАЗ ХОЗЯИНА

Для цитохимической визуализации внутриклеточных мест с супероксидной генерацией радикалов была использована способность этих радикалов восстанавливать витальный, водорастворимый краситель (пара-нитро-тетразолий фиолетовый) до нерастворимого формазана. В работе использовалось несколько режимов и условий окраски, что позволило отличить высокореакционный места окраски от неспецифических, низкореакционных.

В работе использовался потенциал-чувствительный витальный краситель родамин-123, по интенсивности флуоресценции которого можно было оценить энергетическое состояние митохондрий в опухолевых клетках.

Белок-синтетическая активность клеток тестировалась на фиксированных клеточных препаратах по их цитохимической окраске акридиновым оранжевым (Rigler R.,1966) и последующем цитофлуоресцентном микроскопировании.

Активность супероксидцисмутазы и глутатион перок-сидазы -в опухолевых клетках определяласть по методу Blaachmp е., Fredovich J (1971) & Paylia D.E. (1967). Уровень общих липидов и соотношение в них ненасыщенных жирных кислот к насыщенным определялось газово-хроматографи-чески (Gerson Т., 1966). Комплекс этих измерений был выполнен профессором В.З. Ланкиным, в рамках серии совместных исследований (23,24).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

РЕЗИСТЕНТНОСТЬ АСЦИТНЫХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК И ИХ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЛИПОПРОТЕИНОВ ПО ОТНОШЕНИЮ К ОКИСЛИТЕЛЬНОМУ СТРЕССУ.

Устойчивость клеток к действию свободных радикалов обычно тестируется по уровню конечных продуктов окисления [в частности, перекисного окисления липидов (ПОЛ)], содержащихся в популяции, изучаемых клеток или образовавшихся в клетках после действия свободных радикалов [источниками которых могут быть некоторые противоопухолевые препараты, гамма- и УФ-радиация]. Во многих экспериментальных и клинических исследованиях было обнаружено, что быстро развивающиеся опухоли, как правило, характеризуются низким уровнем образования 14

липидных пероксидов, в сравнении с соответствующими нормальными клетками. Этот эффект появляется уже на стадии формирования предопухолевых гиперпластических очагов и сохраняется в большинстве опухолевых клетках по мере развития опухолевого процесса in vivo. В последнем обзоре Dianzani M.U. (1993) представлен комплекс механизмов, объясняющих повышенную устойчивость опухолевых клеток к окислительному стрессу. Прежде всего, это: 1) способность опухоли мобилизовать природные антиоксиданты (в частности, альфа-токоферол) из тканей хозяина и аккумулировать их в опухолевых клетках; 2) увеличенная активность ряда антиоксидантных ферментов (СОД, ГПазы) на определенных стадиях развития опухолевого процесса; 3) сниженное содержание полиненасыщенных жирных кислот в плазматических мембранах и микросомах ряда опухолей; 4) низкое содержание цитохрома Р-450 в опухолевых микросомах [как возможных источников генерации свободных радикалов]; 5) снижение уровня НАД на определенных этапах развития опухолей in v¡vo\ 6) конституционная и индуцибильная экспрессия во многих опухолевых клетках группы стресс-б ел ков, а также защитных белков семейства Bcl-2.

Эти механизмы не могут объяснить, каким образом опухолевым клеткам удается поддерживать высокую свободно-радикальную устойчивость, тогда как подавляющее большинство асцитных опухолевых клеток (по данным Apffel С.А.) содержат внутриклеточные липопротеины, обогащенные полиненасыщенными жирнокислотными остатками (DiPaolo J.A., 1963), которые в свою очередь являются наиболее чувствительными мишенями для липидной пероксидации. Почему же опухолевые клетки при этом столь устойчивы к повреждающему действию свободных радикалов? Чтобы объяснить этот эффект была экспериментально проверено теоретическое предположение Dorrnandy T.L. о потенциальной способности внутриклеточных липидных гранул с высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) работать ловушками токсичных радикалов. В то время как клетки, где основной пул ПНЖК входит в состав жизненно-важных мембран (плазматических, ядерных, микросомальных) должны обладать % более низкой устойчивостью к CP-индуцируемой летальности.

Для проверки этой гипотезы была выбрана высокоагрессивная перевиваемая опухоль - асцитная гепатома Зайделя (АГЗ) с высоким содержанием ЛП-гранул; а также менее агрессивная опухоль Эрдиха (АОЭ), содержащая сравнительно меньше липопротеинов, В клетках АГЗ и АОЭ проводилось микроскопирование с применением метода интерференционного контраста с полным расщеплением изображения ЛП-гранул. Было установлено, что в начальных стадиях развития опухолевого процесса (АГЗ, АОЭ), диаметр ЛП-гранул был столь мал, что его можно было измерить только благодаря цветовому контрастному изображению ЛП-гранул (Рис.ЗА). Клетки АГЗ (без экзогенной стимуляции) обнаруживали также способность формировать кластерные структуры из плотно-упакованных ЛП-гранул (Рис.ЗВ, Рис.4А). Это позволяло выполнять измерения окислительной устойчивости непосредственно в таких кластерах. Сам факт формирования ЛП-кластеров в опухолевых клетках был описан еще в ранних работах Аррге! С.А.. Однако до наших исследований не было известно, что из ЛП-гранул в опухолевых клетках [особенно делящихся] могут формироваться квазисимметричные, пространственно-упорядоченные структуры, различающиеся по форме. 'Наиболее неожиданными оказались кластеры, где ЛП-гранулы были плотно-упакованы [наподобие "бильярдных шаров"] в треугольно-подобные структуры, располагающиеся симметрично по обе стороны от линии межклеточного раздела в делящихся, индивидуальных АГЗ клетках (Рис. З.В). Следует отметить, что после липидораство'римой фиксации эти разрозненные кластеры экстрагировались как единая структура (Рис.3.Г; черные неокрашиваемые участки). Ко второму наиболее распространенному типу ЛП-упаковки следует отнести "кэппообразные кластеры" из ЛП-гранул (Рис.4А). Чаще всего такие кластеры выявлялись в приповерхностных зонах опухолевых клеток (Рис.4А), откуда они могли попасть во внеклеточную среду в составе везикул, отделяемых от АГЗ клеток (Рис.4Б).Функциональное значение процесса формирования таких кластеров остается неизвестным, но их размеры (от 3 до 6 мк в поперечнике) позволяет непосредственно в них измерять устойчивость ЛП-гранул к пероксидативному стрессу и сравнивать ее с соответствующей резистентностью единичных опухолевых

клеток и ее участков цитоплазмы, где не обнаруживались видимые ЛП-гранулы. В результате проведения таких измерений было установлено, что только после перехода опухолей (АГЗ, АОЭ) в стационарную фазу своего развития, в опухолевых клетках наблюдалось увеличение доли флуоресцирующих продуктов окисления [в частности, ФП-ПОЛ (Рис.5А, 6Б)], тогда как в участках цитоплазмы, в которых не обнаруживались ЛП-гранулы, уровень образования ФП-ПОЛ, напротив, был низок (Рис.5Б, 6Б).

_Сутки

2 6 8 10

Развитие опухоли ,\ГЗ

Развитие опухали АГЗ

Рис.5. Динамика изменения диаметра ЛП-гранул и уровня образования флуоресцирующих продуктов (ФП) перекисного окисления липидов (ФП-ПОЛ), тестируемые в одиночных АГЗ-клетках (А), их кластерах из ЛП-гранул (Б) и участках цитоплазмы, где ЛП-гранулы не обнаруживались (Б) в процессе роста асцитной гепатомы Зайделя (АГЗ) in vivo. Рост опухоли оценивался по изменению объема асцитной опухоли и количеству опухолевых клеток в нем (А).

□

2 4 6 é 10 12 14 Сутки в

Развитие опухоли ДОЗ

2 4 6 8 10 12 14 Сутки Развитие опухоли АОЭ

Рис.6. Динамика изменения диаметра ЛП-гранул (Б) и уровня ФП-ПОЛ в одиночных клетках АОЭ (Б), а также участках АОЭ-цитоплазмы, где ЛП-гранулы не обнаруживались (Б) в процессе развития асцитной опухоли Эрлиха (АОЭ) in vivo. Рост асцитной опухоли оценивался по увеличению ее объема и приросту клеточной массы (А).

Проведение непосредственных измерений в АГЗ-кластерах из ЛП-гранул, позволяло установить, что именно в ЛП-гранулах сосредоточено подавляющее большинство флуоресцирующих продуктов окисления, которые образуются в опухолевых клетках в ответ на окислительный стресс, индуцированный УФ-светом. Аналогичная закономерность выявлялась in vitro, при оценки окислительной устойчивости стационарно-растущих АОЭ-клеток в модельной системе, при экзогенном действии аскорбат-индуцированного стресса (Рис.7). В этих условиях, АОЭ-клетки сохраняли высокую устойчивость к образованию малонового диальдегида (одного из конечных продуктов перекисного окисления липидов). В противоположность высокой устойчивости АОЭ-клеток, фракция липидов из этих же клеток обнаруживала крайне низкую устойчивость к прямому действию свободных радикалов, что выражалось в высоком уровне образования малонового диальдегида (Рис.7). Все эти данные в совокупности подтверждают гипотезу Dormandy о 18

потенциальной способности ЛП-гранул, в определенных метаболических ситуациях, работать ловушками токсичных радикалов и снижать уровень клеточной летальности в ответ на окислительный стресс.

Рис.7. Временная кривая развития аскорбат-индуци-рованного перекис-ного окисления липидов (ПОЛ) в целых опухолевых клетках [взятых на стационарной фазе роста АОЭ in vivo] и их липидной фракции. Среда инкубации содержала 0,5 мМ аскорбата и 12 мМ Fe2+ в 50 мМ К, Na-фосфэтного буфера, pH 6,0.

Важно отметить, что приобретение опухолевыми ЛП-гранулами защитного потенциала от внутриклеточных радикалов коррелировало с увеличением объема ЛП-гранул (Рис.55, 6Б) [прежде всего, за счет депонирования в них нейтральных липидов с высоким уровнем ненасыщенных жирнокислотных остатков (DiPaolo J.A.)] и снижением энергетического потенциала опухолевых митохондрий (Рис.8) [тестирование состояния митохондрий производилось с помощью потенциал-чувствительного витального красителя -родамина-123].

В таких митохондриях снижена способность к ß-окис-лению жирных кислот, и как следствие, уровень АТФ в таких стационарно-растущих опухолевых АОЭ-клетках был резко снижен (Schmidt Н, 1991). Известно, что синтез нейтральных липидов АТФ-независим [в противоположность синтезу фосфолипидов], поэтому не удивительно, что в опухолевых

1 ' 2 ' 5 (часы)

клетках с низким уровнем АТФ складываются благоприятные условия для преимущественного образования нейтральных липидов в форме ЛП-гранул. В частности, в период активной мобилизации липидов из тканей опухоленосителя и их последующей преимущественной аккумуляции в опухолевых клетка (для опухоли Эрлиха это происходило в период между 6 и 8 сутками роста АОЭ fn vivo (Рис.9)].

Рис.8. Уменьшение интенсивности митохондриальной флуоресценции родамина-123 при переходе in vivo от экспоненциальной (Б) в стационарную (Г) фазу роста клеток АОЭ коррелировало с увеличением размера внутриклеточных липопротеиновых (ЛП) гранул [переход от (А) к (В); ЛП-гранулы при этом можно было непосредственно наблюдать при фазово-контрастном микроскопировании (В)] .

Многие опухолевые клетки имеют ряд общих метаболических свойств с эмбриональными клетками. В частности, и эмбриональные, и опухолевые клетки проявляют высокую резистентность к токсичному действию кислорода (модель гипероксигенации). В лаборатории профессора

Плазма крови (1,11) II

пнжк/нжк

ацитная жидкость

дни

' S

¿ ' 6 10 14

развитие опухоли

Рис.9. Изменение некоторые параметров метаболизма глюкозы и липидов в процессе развития асцитной опухоли Эрлиха in vivo. А - содержание глюкозы (1) общих липидов (II) в плазме крови опухоленосителя; В - относительное содержание полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) к насыщенным жирным кислотам (НЖК) в динамике роста

Frank I. было установлено, что клетки легкого из эмбриона или новорожденного приобретают большую устойчивость к токсичному действию атмосферного кислорода, если животные в период беременности получали диету с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот. Такая повышенная устойчивость формировалась у эмбрионов [позднего срока развития] или новорожденных не за счет активации антиоксидантных защитных систем, а за счет образования внутриклеточных липид-содержащих гранул с высоким уровнем полиненасыщенных жирных кислот. Такие гранулы обнаруживали липидный состав (Sosenko I.R.) сходный с опухолевыми ЛП-гранулами (DiPaolo J.A.). Формирование в опухолевых и эмбриональных клетках липидного депо (ЛП-гранул) является, вероятно, проявлением одного из наиболее древних и примитивных механизмов клеточной защиты. В частности, в опухолевых клетках (АОЭ, АГЗ), развивающихся in vivo, такой защитный механизм потенциально способен эффективно функционировать только на поздних этапах взаимодействия опухоли и организма, когда в опухолевых клетках эффективность работы основных

АОЭ.

50/2 т----

25%

. А Ílílfl iiijft

• ж\ щ\ v сод

Л5Г-, i_ i, i -j—i-, ifiiii íüiii íiilll \

100$

50/6

3 6 9 12

в и НИИ

IIII1I 1 >

■v 'liiü lililí

: \ ifüfe Ъ ГП

i Ши Í'HHÍ ........

Рис. 10. Изменение активности НгСЪ-продуцирующего фермента [СОД: супероксиддисмутазы (А)] и Н202-удаляющего фермента [ГП: глютатион пероксидазы (В)] в клетках аецитной опухоли Эрлиха (АОЭ) в динамике опухолевого развития in vivo. Рост АОЭ характеризовался приростом доли АОЭ-клеток и накоплением аецитной опухолевой жидкости (С). Заштрихованная область выделяет период (6-9 сутки), при котором клетки АОЭ проявляют окислительный дисбаланс [между активностями СОД и ГП ферментов]: Развитие этого дисбаланса коррелировало с фазой быстрого увеличения

объема аецитной жидкости в опухоли (С; заштрихованная область).

9 12 сутки g Развитие опухоли (АОЭ)

антиоксидантных систем значительно снижена. В частности, существенно снижена активность супероксид-дисмутазы (Рис.10); резко уменьшен пул эндогенных НАД(Ф)Н, функционирующих как кофакторы глутатионзависимых антиоксидантных ферментов. По данным Е.А. Нейфаха в этот период также снижено содержание важного липофильного антиоксиданта - альфа-токоферола.

В последние года накопилось немало данных не только о высокой устойчивости различных опухолей к повреждающему действию свободных радикалов, но и о способности опухолевых клеток к генерации свободных радикалов [как при экзогенной стимуляции (Orr W.F.,1994), так и без таковой (Nathan С.F.,1991), когда опухолевые клетки в условиях in vitro продуцировали низкий, но постоянный уровень внеклеточных гидропероксидов]. В опытах Bozzi А. также была подтверждена способность опухолевых клеток продуцировать Н2О2 при переходе клеток от гипоксии к нормоксии in vitro. При этом в опухолевых клетках возникал временный дисбаланс между повышением активности Н202-продуцирующего фермента (супероксид-дисмутазы - СОД) и снижением активности Н202-удапяющего фермента (глутатион пероксидазы - ГП). Пободный окислительный дисбаланс обнаруживался также в опухолевых клетках АОЭ в период поступления нормоксической плазмы к гипоксическим асцитным АОЭ-клеткам, растущим в перитонеальной полости. Возникновение этого временного дисбаланса (между СОД и ГП-зой) коррелировало с фазой быстрого накопления асцитной жидкости в опухоли (Рис.10) и диссеминацией опухолевого процесса, что многими авторами (Orr W.F., Young S.D.) связывается со способностью опухолевых клеток, в определенных ситуациях, локально генерировать оксиданты, прежде всего Н2О2 (Orr W.F). До настоящего времени в опухолевых клетках не идентифицирована ферментативная система, способная продуцировать свободные радикалы без экзогенной стимуляции опухолевых клеток (Nathan С.F.), а также не выявлены места ее внутриклеточной локализации. Используя витальный цитохимический краситель - пара-нитро-тетразолий фиолетовый, удалось визуализировать [по локальному образованию окрашенного формазана] места эндогенной генерации супероксидных радикалов в клетках АОЭ. Действительно, было установлено, что формазан образовывался в части опухолевых клетках АОЭ только в период быстрой аккумуляции, поступающей нормоксической плазмы в перитонеапьную полость, к гипоксическим АОЭ-клеткам. Неожиданностью оказался тот факт, что формазановые гранулы располагались в тесном контакте с

Рис.11. Выявление мест внутриклеточной локализации формазана (малые темные гранулы), формирующиеся в результате свободно-радикального восстановления витального тетразолиевого цитокра-сителя (пара-нитро-тетразолия фиолетового) в клетках АОЭ и на их ЛП-гранулах. Установлен тесные контакт между формаза-новыми гранулами и ЛП-гранулами (и их соотношение 1:1).

ЛП-гранулами (Рис.11) и на каждой ЛП-грануле выявлялось не более одной формазановой гранулы. Неизвестно, что отражает факт такого тесного контакта, очевидно лишь одно, что при таком внутриклеточной расположении • мест, возможных источников генерации оксидантов, их действие не должно негативно повлиять на выживаемость опухолевых клеток и их интегральную резистентность.

СНИЖЕНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ТКАНЕЙ И КЛЕТОК ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЯ КАК ВАЖНЫЙ ФАКТОР, СПОСОБСТВУЮЩИЙ РАЗВИТИЮ КОМПЛЕКСА ВТОРИЧНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ХОЗЯИНА.

Хорошо известна высокая конкурентноспособность большинства злокачественных опухолей за основные метаболиты, кофакторы и незаменимые антиоксиданты опухоленосителя. В зависимости от скорости развития этих процессов, следует ожидать снижение потенциальной устойчивости жизненноважных органов и их клеток к

повреждающему действию оксидантов [как эндогенно, так и экзогенного генеза]. В опухолевых клетках АОЭ такое снижение отчетливо проявляется уже к 9 суткам развития АОЭ in vivo, когда уже не происходит прироста численности опухолевых клеток, а также объема асцитной жидкости в АОЭ (Рис.бА). Такому снижению устойчивости нормальных клеток опухоленосителя (Рис. 12) предшествует период (между 6 и 8 сутками) активной мобилизации липидов хозяина, обогащенных альфа- токоферолом (Нейфах Е.А.) (Рис.9) и их последующий транспорт в развивающиеся клетки АОЭ.

Рис.12. Снижение свободно-радикальной устойчивости участков цитоплазмы нормальных клеток опухоленосителя (спленоцитов, тимоцитов, клеток печени), развивающееся к 9 суткам опухолевого роста АОЭ in vivo (рост ФП-ПОЛ, незаштрихованные столбцы) и их сравнение с контрольными нормальными клетками (заштрихованные столбцы) и с участками цитоплазмы опухолевых клеток АОЭ, также сохраняющих высокую устойчивость на разных этапах опухолевого роста [в противоположность опухолевым ЛП-гранулам, которые в период (11-14 сутки) теряли соответствующую устойчивость (свободно-радикальная устойчивость тестировалась внутриклеточно по уровню образования ФП-ПОЛ].

Вероятно, что именно снижение содержания в тканях опухоленосителя ряда незаменимых витаминов-антиоксидантов [таких как: витамин Е (альфа-токоферол), витамины А и Д] является патологической основой для уменьшения окислительной устойчивости этих тканей к стресс-индуцированным повреждения. Это в свою очередь повышает вероятность преимущественного развития окислительного стресса в тех тканях опухоленосителя, где могут сформироваться локальные клеточные очаги, хронически продуцирующие оксиданты и/или эндотоксины [в частности, фактор некроза опухоли, цитотоксическое действие которого также происходит посредством индукции свободно-радикальных реакция в митохондриях клеток-мишеней]. Известно, что в условиях организма именно активированные фагоциты являются основными источниками, где эндогенно могут синтезироваться эндотоксины и генерироваться оксиданты. Поэтому, логично было предположить, что именно в органах опухоленосителя [с конституционно высоким содержанием ретикулоэндо-телиальных клеток (как в селезенке, печени, легком)] можно ожидать развитие окислительного стресса, индуцирующего появление СР-модифицированных белков и липидов. Именно появление последних я рассматриваю как возможную патологическую основы для развития ряда вторичных болезней опухоленосителя.

Рис. 13. Схема развития основных реакций клетки на окислительный стресс, при которых индуцируется образование ряда патофизиологических значимых флуоресцирующих соединений. Часть этих соединений можно идентифицировать по длине волны их флуоресценции, а также по их реакции на УФ-свет. В частности, по различиям в скорости УФ-фотодеструкции, которая максимальная для ФП-ПОЛ и практически отсутствует для СР-модифицированного ферритина, тогда как некоторые производные ретиналей демонстрируют рост интенсивности флуоресценции, но только в гипоксических условиях.

Как же тестировать развитие окислительного стресса и его патологические последствия в условиях нативной клетки? На Рис.13 представлена обощенная схема, где суммированы современные знания о последовательности развития каскада приспособительных клеточных реакций на

окислительный стресс и повышающих выживаемость клеток к повторных действиям стресса. Из этой схемы видно (Рис.13), то развитие адаптационных, клеточных реакций на окислительный стресс сопровождается появлением, а также исчезновением нескольких групп внутриклеточных флуо-рофоров, которые могут быть использованы как чувствительные маркеры, позволяющие оценивать участие того или иного типа клеточного ответа на стресс. В частности, высокая чувствительность ненасыщенных жирных кислот к окислению используется клеткой как триггерный механизм, запускающий экспрессию ряда защитных стресс-индуцированных белков [среди которых гем-оксигеназа, расщепляющая клеточные гем-содержащие белки в ответ на окислительный стресс]. Освобождающиеся при этом высокотоксичные ионы железа акуммулируются в форме ферритина. Такой ответ клетки на окислительный стресс обратим, и после прекращения действия стрессора, накопленное железо реутилизируется из ферритинового депо. O'Connel M.J. установил, что ферритин можно необратимо модифицировать свободными радикалами в условиях in vitro, при этом водорастворимый ферритин становится водонерастворимым, устойчивым к протеолизу и приобретает желтую флуоресценцию сходную по спектрокинетическим свойствам с флуоресценцией гемосидерина и липофусцина [известного пигмента старения]. Известно, что развитие злокачественного опухолевого процесса индуцирует развитие гиперферритинемии, прежде всего в селезенке опухоле-носителя. Это связывают, в первую очередь, с развитием стойкой тенденции к повышенному катаболизму в селезенке опухоленосителя эритроцитов с повышенной регидностью. Развитие селезеночной гиперферритинемии обычно рассматривается как прявление системного действия опухоли на организм хозяина. До начала проведения моих исследований не было известно является ли ферритин, накапливающийся в селезенке опухоленосителя необратимо модифицированным или нет.

С помощью прямых микроспектрофлуоресцентными измерений нативных тканей опухоленосителя было установлено (Рис.14) появление только в ткани селезенки желтой флуоресценции с высокой устойчивостью к УФ-фото-

деструкции [такая флуоресценция обычно обнаруживалась в селезенке не ранее 9 суток роста АОЭ]. Аналогичные спектрокинетические параметры (Рис.14) характерны также для ферритина, модифицированного свободными радикалами in vitro (O'Connel M.J.) и липофусцина. Эти данные указывают, что одним из результатов системного действия, развивающейся опухоли (АОЭ) на организм хозяина, является возникновения вторичной болезни накопления [селезеночной гиперферритинемии, где большая часть ферритина приобретала необратимую модификацию, вероятно, в результате локального действия эндогенно-генерируемых свободных радикалов]. Этому способствует,

Рис.14. Спектрокинетические изменения флуорес-ценции нативной ткани селезенки, [взятой из опухоленосителя на 9 сутки роста АОЭ] при действии УФ-света (/-=365нм). Стрелка показывает быстрое уменьшение интенсивности флуоресценции (в спектральной полосе 430-460нм, характерное для ФП-ПОЛ). Пунтрирные линии показывают желто-оранжевую флуоресценцию селезеночных пигментов (с высокой устойчивостью к УФ-фотодеструкции).

прежде всего уменьшение порога устойчивости спленоцитов к окислительному стрессу (Рис. 12), а также развитие спленомегалии с миелоидной гиперплазией [ведь именно тканевые миелоцигы, как активно фагоцитирующие клетки, являются основным источником, продуцирующим оксиданты и эндотоксины в селезенке опухоленосителя]. В условиях развития кратковременного окислительного стресса, повышается экспрессия индуцибильной формы ферритина, где временно акуммулируется железо и тем самым уменьшается вероятность развития свободно-радикальных реакций окисления [с помощью реакций Фентона]. Одновременно с этими процессами развивается и вторичная анемия, неспецифически ингибирующая различные пролиферативные процессы [так как железо необходимый активатор рибонуклеотид редуктазы - ключевого фермента синтеза ДНК]. После прекращения действия окислительного стресса, организм способен реутилизировать железо из ферритинового депо. Многие клиницисты и экспериментаторы отмечали, что развитие злокачественного опухолевого процесса часто сопровождается появлением загадочной необратимой анемии, преимущественно индуцированной низкой реутилизацией железа из ферритинового депо, хотя в организме опухоленосителя наблюдается гиперферритинемия и обнаруживаются массивные отложения железа в селезенке и печени. Наши экспериментальные находки позволяют предположить, что низкая реутилизация железа из ферритина вызвана его необратимой модификацией [возможно с образованием внутрипротеиновых "сшивок", затрудняющих процесс "изъятия" железа из ферритинового депо]. В результате в организме опухоленосителя формируется новый "порочный функциональный цикл" (Рис.15), когда анемия из временной, защитной реакции. организма на окислительный стресс, становится хронической и необратимой. Представленная схема (Рис.15) объясняет, почему этот тип анемии противопоказано лечить с помощью экзогенных препаратов железа. Это обусловлено тем, что введение железосодержащих препаратов, с одной стороны, ускоряет процессы опухолевой пролиферации; а с другой стороны, на фоне хронического окислительного стресса организма, экзогенно поступающее железо будет опять преимущест-

рост

опухоли

ингибирование пролиферации опухолевых

клеток из-за недостатка

ионов железа

необратимая анемия

обратимая анемия

¡5

тр

%_ А)

v Тионы х железа

_1Г\

неспецифи- 1

1еский стресс |

мобилизация и транспортировка лнтиоксидантов хозяина в опухолевые клетки

снижение устойчивости КЛЕТОК ХОЗЯИНА К окислительному стрессу

низкая реутилизация ионов железа из депо СРМФ

повышенная повреждаемость эритроцитов

временная гопоферримия крови из-за депонирования ионов железа в Форме ферритина ^ г

гиперферритинемия в селезенке

обильное накопление ср - модифицированного ферритина(срмф] 8 селезенке

УСИЛЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ эндотоксинов АКТИВИРОВАННЫМИ МАКРОФАГАМИ

генерация свободных радикалов (ср). индуцируемая ЭНДОТОКСИНОМ (фио)

усиление

интоксикации

1 »

летальный исход

Рис.15. Предполагаемая последовательность событий, индуцирующая формирование в организме опухоленоси-теля нового "порочного цикла" [средний круг, обозначенный сплошной линией], как патологической основы для дальнейшей прогрессии анемии, развивающейся на фоне нарастающей эндотоксикации опухоленосителя (при выживании части опухолевых клеток, но в отсутствии их пролиферации). Развитие этого "порочного", патологического цикла связано с системным действием опухоли и развитием вторичной болезни накопления [селезеночной гиперферритинемии, где ферритин после свободно-радикальной модификации утрачивает способность к эффективной реутилизации железа (возможно, он также может действовать как перманентный локальный раздражитель тканевого фагоцитов)]. Необходимость железа для процесса пролиферации, неспецифически ограничивает скорость клеточного деления нормальных клеток при

стресс-индуцированной временной анемии [внутренний малый цикл, короткая пунктирная линия], а также ингибирует пролиферацию опухолевых клеток при опухоль-индуцированной анемии [как обратимой, так и необратимой].

венно накапливаться в форме ферритине, а не использоваться для целей эритропоэза. В опытах на животных Manuel D.N. установил, что на поздних стадиях развития опухолевого процесса, именно селезенка становится основным источником эндотоксина (ФНО), увеличение концентрации которого, и является непосредственной причиной смерти опухолено-сителя от эндотоксического шока. Причины почему именно селезенка становится в этот период основным местом синтеза эндотоксинов неизвестны. Можно предположить, что внеклеточные отложения модифицированного ферритина [помимо индуктора необратимой анемии] могут также действовать по аналогии с "инертной занозой", которую безрезультатно пытаются катаболизировать многочисленные селезеночные фагоциты, продуцируя при этом провоспа-лительные эндотоксины и усиливая таким образом, развитие воспалительной реакции в селезенке опухоленосителя. Напротив, в зоне роста • опухоли, а также в нормальных тканях, непосредственно прилегающих к опухоли ("опухолевом поле"), стойко поддерживается противовоспалительная реакция, дополнительно защищающая опухолевые клетки [и без того с повышенной устойчивостью к окислительному стрессу] от повреждающего действия оксидантов и эндотоксинов. Формирование в одном организме опухоленосителя этих двух антагонистических тканевых центров [опухолевого и селезеночного, резко отличающихся по окислительной устойчивости], способствует выживанию части опухолевой популяции на фоне, нарастающей эндотоксикации хозяина (Рис.16). Представленные в данном разделе экспериментальный данные подтверждают гипотезу, что формирование стойкого дисбаланса, между повышенной окислительной устойчивостью опухоли и снижением защитного потенциала тканей опухоленосителя к свободно-радикальным повреждениям, является патологической основой для развития некоторых вторичных болезней опухоленосителя.

[опухолевый! рост

[опу:

мобилизация и транспорт жизненноважных МЕТАБОЛИТОВ хозяина в опухоль

ме1аболистическая депрессия клеток хозяина как ОСНОВА для роста клеточных повреждений

высокая устойчивость опухолевых клеток к окислительным повреждениям

кдьнинм |

i выживание некоторых! 1 опухолевых клеток > | при эндотоксикации 1

"Защитное, противовоспалительное

тканевое поле". формирующееся локально вокруг опухолевых клеток

формирование

локальных воспалительных

ЦЕНТРОВ (как в селезенке) р+1

мобилизация и

транспорт антиоксидантов

хозяина а Опухолевые клетки

приобретение опухоленосителем

низкой

устойчивости к

окислительным повреждениям

^ разрушающиеся клетки опухоленосителя как индукторы с пленом егалии и активаторы тканевых макрофагов

ьмьза! ^

\____

i эндотоксимия i ' хозяина '

смерть i i опухоленосителяj

Рис.16. Интегральная схема, объясняющая происхождение опухоль-индуцированной эндотоксикации и анемии хозяина как результат противостояния двух антагонистических тканевых центров: 1) защитного, противо-воспали-тельного "опухолевого поля", формирующегося из фено-типически нормальных клеток, непосредственно окружающих опухоль; 2) воспалительных, локальных очагов, формирующихся в селезенке, которая при этом становится основным источником генерации эндотоксинов в организме опухоленосителя. Это противостояние развивается на фоне высокой устойчивости опухолевых клеток к повреждающему действию окислительного стресса и при потери такой устойчивости у большинства нормальных-тканей и клеток опухоленосителя.

Рис. 17. Применение интерференционного микроскопи-рования с полным расщепленным изображением для выявления перфторуглеродов в нативных цитологических препаратах.

A. Кровь контрольного животного после 2-х часовой инкубации с перфтордекалином. В центре кадра - капля перфтордекалина (зеленое изображение справа) и шиловидный эритроцит (зеленое изображение слева). Благодаря тому, что коэффициент преломления перфтордекалина меньше, чем у воды (фон), тогда как коэффициент преломления клетки выше, чем у воды -изображение перфтордекалина и клетки при расщеплении оказываются смещенными в противоположные стороны, что и позволяет их идентифицировать.

Б. Сорбционное взаимодействие капель перфтордекалина (зеленое изображение сверху) и окисленных липосом (зеленое изображение снизу).

B. Сорбционное взаимодействие мелких капель перфтордекалина (зеленое изображение справа) и липосом (зеленое изображение слева). Слева, сбоку - крупная капля перфтордекалина.

Г. Кровь, оттекающая от солидной опухоли [саркома С-45], после инкубации in vitro с перфтордекалином. Видно, что капли перфтордекалина (зеленое изображение сверху) разного размера связаны между •. собой нитевидной, фибрино-подобной структурой биологической природы (зеленое изображение снизу).

Д. Результат инкубации крови, оттекающей от спонтанной опухоли крысы, с перфтордекалином. Видно, что капли перфтордекалина (голубое изображение сверху) сорбируют компоненты плазмы крови (голубое изображение снизу).

Е. Клетки асцитной гепатомы Зайделя (зеленое изображение снизу), окруженные более мелкими каплями перфтордекадина (зеленое изображение сверху).

Развитие окислительного стресса в организме эпухоленосителя сопровождается увеличением содержания эяда токсичных продуктов окисления, общим свойством соторых является их повышенная гидрофобность.

Эндотоксины также преимущественно концентрируются в гидрофобной части липопротеинов, которые после этого приобретают высокотоксические свойства. Поэтому удаление таких гидрофобных, токсичных продуктов из организма опухоленосителя может помочь уменьшить последствия окислительного стресса. Американское агенство по испытаниям противоопухолевых соединений недавно представило отчет - 5-летний итог клинических испытаний, сочетанного применения противоопухолевых курсов радиоци-онной терапии и эмульсионных сред, на основе перфторорганических соединений [как газотранспортирующих средств, в частности, применяемые для увеличения напряжения кислорода в зоне роста опухоли]. Установлено, что применение перфторорганических эмульсий [в неоперабельных стадиях развития опухолевого процесса] не только способствовало ингибированию опухолевого роста, но и уменьшало эндотоксикацию организма, подавляло дальнейшее распространение опухолевого процесса, и тем самым увеличивало показатели 5-летней выживаемости больных. Механизмы такого антитоксического действия химически инертные перфторорганических соединений неизвестны. Нам впервые удалось показать высокую сорбционную активность этих соединений, что стало возможным благодаря нашим методическим разработкам и созданию уникального метода (Яшин В. А., Шварцбурд П.М., Карнаухов В.Н., 1986), позволившего непосрественно наблюдать за поведением химически инертные перфторорганические соединений в любых нативных цитологических образцах (Рис.17).

выводы

1. Впервые обнаружены пространственно-упорядоченные кластерные структуры из липопротеиновых гранул (ЛП-гранул) в клетках асцитной гепатомы Зайделя (АГЗ), но не в клетках асцитной опухоли Эрлиха (АОЭ). Этот результат получен методом интерференционной микроскопии, с полным расщеплением изображения.

2. Разработан микроспектрапьный метод, позволивший впервые определять устойчивость нативных тканей, а также одиночных, живых клеток и внутриклеточных компартментов к развитию перекисного стресса. Предложенный спектрокинетический метод позволяет разделять сигналы флуоресценции продуктов перекисного окисления липидов и НАД(Ф)Н, которые не могли быть разделены по положению максимумов их флуоресценции.

3. Исследована сравнительная динамика порога устойчивости нормальных и опухолевых клеток различных тканей к окислительному стрессу. Установлена потенциальная способность внутриклеточных, опухолевых ЛП-гранул работать ловушками свободных радикалов, ограничивая таким образом летальные повреждения опухолевых клеток от цитотоксического действия высокореакционных радикалов. Определены метаболические условия, способствующие развитию защитного потенциала у опухолевых ЛП-гранул.

4. Установлено, что в стадии быстрого накопления асцитной опухолевой жидкости, в опухолевых клетках АОЭ возникает временный окислительный дисбаланс: между ферментами, генерирующими и удаляющими гидропероксиды, что указывало на потенциальную способность опухолевых клеток (в отсутствии экзогенной стимуляции) продуцировать оксиданты [аналогично модельной ситуации - "гипоксия-реоксигенация" опухолевых клеток in vitro]. Цитохимическим методом определено внутриклеточное расположение систем, потенциально способных к эндогенному образованию свободных радикалов внутри опухолевых клеток.

5. Установлена стадия, когда в большинстве нормальных тканей и клеток опухоленосителя снижается порог устойчивость к повреждающему действию окислительного стресса (при сохранении его опухолевыми клетками АОЭ). Возникновение этого дисбаланса между устойчивостью опухолевых и нормальных клеток коррелирует с развитием ряда вторичных болезней опухоленосителя [селезеночной гиперферритинемии, анемии, эндотоксемии], что позволяет рассматривать данный окислительный дисбаланс как патологическую основу развития "Паранеоплатического синдрома" в организме опухоленосителя.

6. Впервые в селезенке опухоленосителя обнаружена флуоресценция, характерная для необратимо модифицированного свободными радикалами ферритина. Установлено, что такая флуоресценция обнаруживается только на стадии развития селезеночной гиперферритинемии, предшествовавшей прогрессии анемии и эндотоксикации организма. На основании полученных данных, предложена последовательность событий, индуцирующих формирование в организме опухоленосителя "порочного цикла". Его функционирование, сдерживает рост опухолевых клеток, но усиливает анемию и эндотоксикацию организма.

7. Впервые экспериментально установлена сорбционная активность "химически инертных перфторорганических (ПФО) соединений. Выявлена способность ПФО-соединений эффективно сорбировать ряд окисленных компонентов крови, непосредственно оттекающих из опухоли, и тем самым уменьшать окислительный стресс в организме. Открытие этого явления стало возможным благодаря нашим разработкам уникального метода, позволившего непосредственно визуализировать химически инертные ПФО-соединения в любых нативных цитологических препаратах.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Шварцбурд П.М., Гаранина H.H. К вопросу о местном иммунорегуляторном действии злокачественных опухолей. Тезисы доклада, 5 Всесоюзный симпозиум по целенаправленному изысканию физиологически активных веществ, г.Рига, 1983, стр. 102-103.

2. Шварцбурд П.М. Цитолюминесцентные исследования субпопуляционного состава асцитной гепатомы Зайделя на разных стадиях ее развития. Тезисы доклада, 2 Всесоюзное совещание "Люминесцентный анализ в медицине и биологи и его аппаратурное обеспечение", г.Рига, 1985, стр 43.

3. Шварцбурд П.М., Гаранина H.H. О местном иммунорегуляторном действии злокачественных опухолей. "Экспериментальная, онкология", 1985, т.7, N25, 71-73.

4. Сухоруков Б.П.,Шварцбурд П.М. Влияние концентрации ионов водорода в среде на состояние хроматина в лимфоидных клетках, "Биофизика", 1985, т.30, №4, 637641.

5. Шварцбурд П.М. О некоторых возможностях использования флюорохрома акридинового оранжевого для изучения процессов дифференцировки в различных одиночных опухолевых клетках. Тезисы доклада. 6 Конференция онкологов Прибалтийских республик и 8 республиканская конференция онкологов Латв. ССР "Профилактика,- ранняя диагностика и лечении злокачественных новообразований", 1985, Рига, стр. 69-70.

6. Шварцбурд П.М. Эндогенные энергетические параметры лимфоцитов нативной крови как показатель их иммунологической реактивностию. Сборник докладов, 4 Всесоюзный симпозиум "Регуляция иммунного гомеоста-за", 1986, Ленинград, стр. 257-258.

7. Яшин В.А., Шварцбурд Л.М., Карнаухов В.Н. Применение микроскопа Перавап-интерфако для выявления перфтор-углеродов в тканях организма. "Йенское обозрение". 1986, №1, стр. 42-44.

8. Шварцбурд П.М. Кластерные структуры из липидсодер-жащих органелл в нативных клетках асцитной гепатомы

Зайделя. Топография распределения, структурные особенности. Препринт, ОНТИ НЦБН АНСССР, стр. 1-12.

9. Шварцбурд П.М., Асланиди К.Б. Спектральные характеристики липидсодержащих кластеров в нативных опухолевых клетках. Тезисы доклада, 1 Всесоюзное рабочее совещание "Биофизика рака", Черноголовка, 1987, стр.149.

10. Григоренко Е.В., Шварцбурд П.М. Особенности возрастного метаболизма высокораковой линии мышей AKR. Сборник докладов "Молекулярные основы биотехнологии", Пущино, 1987, стр.68-69.

11. Шварцбурд П.М., Асланиди К.Б., Карнаухов В.Н. О происхождении флуоресценции липофусциновых гранул, Тезисы доклада, 5 Всесоюзный съезд геронтологов и гериатров, г.Тбилиси, 1988, стр.104.

12. Шварцбурд П.М., Асланиди К.Б., Маевский Е.И., Григоренко Е.В. Кислородзависимый цитокиллинг и особенности липидного обмена опухолевых клеток.Тезисы доклада, 4 Всесоюзный съезд патофизиологов, г.Кишенев, 1989, стр.71.

13. Schwartsburd P.M., Aslanidi K.B. Estimation of the intensity of lipid peroxidation in refractive granuis of native ascitic tumor cells during cancer development, (Abstract) International conference "Regulation of free reaction", Varna, Bulgaria, 1989, p.166.

14. Шварцбурд П.М., Асланиди К.Б.,Карнаухов В.Н. К вопросу о происхождении эффекта "возгорания" флуоренции в липофусциновых гранулах. "Биофизика", 1989, т.ЗО, вып.4, стр. 593-597.

15. Шварцбурд П.М. Липопротеины очень низкой плотности и их окислительный метаболизм - важный патогенетический фактор, определяющий состояние нервной и иммунной систем в зоне роста опухолей. Тезисы докладов. 5 Всесоюзный симпозиум "Взамодействие нервной и иммунной систем", Ленинград-Ростов/Дону, 1990, 188189.

16. Григоренко Е.В., Шварцбурд П.М. Предопухолевые изменения метаболизма печени высокораковой линии мышей AKR. Тезисы доклада. Всесоюзный симпозиум "Биохимия опухолевой клетки", Минск, стр. 36-37.

17. Шварцбурд П.М. О причинах ингибирования роста и селективности цитотоксического действия ненасыщенных жирных кислот на опухолевые клетки. Тезисы доклада, Всесоюзной симпозиум "Биохимия опухолевой клетки", Минск, 1990, стр. 158-159.

18. Schwartsburd P.M., Maevsky E.I. Can reactions of "respiratory burst" occur in tumor cells? Abstracts 2-th Meeting the Federation of Europ. Biochem. Soc. (FEBS), Hungary, 1990, p.157.

19. Schwartsburd P.M., Aslanidi K.B. Resistance of single tumor cells and their intracellular compartments to lipid peroxidation. "Med. Oncol. & Tumor Pharmacother", 1991, 8, 57-61.

20. Schwartsburd P.M., Aslanidi K.B. Spectrokinetic characteristics of two types of fluorescence of refractive granules in native individual cells from ascitic tumors. "Biomedical Science", 1991, 2, pp.391-397.

21. Schwartsburd P.M., Aslanidi'K.B. Analysis of some metabolic conditions promoting selective sensitity of tumor cell to peroxidative stress. "Med. Oncol. & Tumor Pharmacother.", 1991, 2, 235-241.

22. Schwartsburd P.M. About the origin of fluorescent products formation in the native cells anf their granules upon chronic peroxidative stress. Abstract. Fourth International Symposium of Lipofuscin and ceroid pigments. "Biology of Aging-92", Tampere, Finland, pp,21.

23. Schwartsburd P.M. Lipoprotein granules in tumor cells as the effective traps and quenchers of free radicals, Abstract, 25th Annual Meeting of the European Society for Radiation Biology, Stockholm, Sweeden, 1993, P006.-09.

24. Schwartsburd P.M., Lankin V Z. Tumor lipoproteins as protectors of hypoxic tumor cells against oxidative stress. Abstract. Fourth European Congress of Cell Biology, Czechoslovakia, Praque, 1994, 18, p.567 (Th-117).

25. Schwartsburd P.M., Lankin V Z. Liproteins in hypoxic tumor cells as traps of free radicals. "Medical Oncology", 1994, 11, 3/4, 101-110.

26. Schwartsburd P.M. On the origin of heterogenety of lipofuscin fluorophores and their possible interrelations. "Gerontology", 1995, 41, Suppl. 2, 29-37.

27. Schwatsbood P.M., Lankin V.Z. Endogenous induction of transient oxidant imbalances in Ehrlich cells as possible

trigger to fast tumor fluid accumulation. Medical Oncology,

1995, 12, 203-207.

28. Schwartsburd P.M., Lankin V,Z. Oxidant-imbalance state in tumor ascitic cells as a possible trigger to fast fluid influx into peritoneal cavity. Abstract. Keystone Symposium "Oxidant Stress: From Molecules to Man", USA, 1996, A2 141.

29. Schwartsburd P.M. A new mechanism connecting high levels of tumor resistance with increased ability to metastasize. Abstract. International Symposium "Anticancer Targets and Strategias for the Twenty-First Century", Castres, Fr&nce,

1996, pp.109.

30. Schwartsburd P M. An integrated view on the genesis of irreversible anemia and endotoxemia in cancer-bearing host. "Frontier Perspectives", 1997, 7(1) (in publication).

31. Шварцбурд П.М. Почему опасно лечить анемию у опухоленосителей. Тезисы доклада. I Международный Симпозиум "Фундаментальные науки и альтернативная медицина", 1997, г.Пущино, стр. 45-46.

32. Schwartsburd P.M. Is cancer induced "Tumor field" to formation of new immunological privileged sites in tumor-bearing host? (in press).

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АТФ аденозинтрифосфат

ЛП-гранулы липопротеиновые гранулы

ПОЛ перекисное окисление липидов

ФП-ПОЛ флуоресцирующие продукты перекисно-

го окисления липидов НАДН восстановленный никотинамидаденин-

динуклеотид

НАД окисленный никотинамидаденин-

динуклеотид

НАДФН восстановленный никотинамидаденин-

динуклеотидфосфат

МДА малоновый диальдегид

СОД супероксиддисмутазы

ГП глутатионпероксиаза

АГЗ асцитная гепатома Зайделя

АОЭ асцитная опухоль Эрлиха

СР свободные радикалы

СРМФ свободно-радикально модифицирован-

ный ферритин ФНО фактор некроза опухоли

ПФО-соединения перфторорганические соединения

Работа частично поддержена Российским Фондом Фундаментальных Исследований (гранты № 96-04-50263: № 96-04-49053).

/Зьфалсаю щЗощю ¿миоуа^гноабь своим цчшпелям -М.а/гии Николаевне ¿¿ону^ашовой, Валерию Николаевичу Ка^нщховц и ¿езв(геменмй цшедшему 0Ип нас п^гофессо/гу 3 .М. 3)ильманх/, а /каюке всем, моим соав/по/гам и коллегам, ¿ез помощи и поууе/гласи койго/мх э/на /гадо/Яа ¿мла ¿м. невозможна. Особую ¿лагоуа/гноань вьф&жаю К."Б\^4сланис}и за /метение /с авМорц и помощь в¡га£о1не и йфо/глиении ¡гукояиси.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Шварцбурд, Полина Михайловна, Пущино

А / / /">

£..•/*»«. «Ц /

1 /. / / / ./ ■ V V у/ / - . 5

ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ РАН

_ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ РАН

На правах рукописи

ШВАРЦБУРД Полина Михайловна

ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ ОПУХОЛИ И ОРГАНИЗМА

03.00.02 - Биофизика

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук, профессор Е.Б. Бурлакова,

Доктор биологических наук, профессор Г.С. Кален до,

Доктор физико-математических наук, профессор

В.В. Смолянинов.

Ведущая организация - Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Защита состоится Няд^д» 1997 г. в часов на заседании диссертационного совета (Д200.22.01) в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, Московская область, г.Пущино, ИТЭБ РАН.

С диссертацией в виде научног; да можно

ознакомиться в библиотеке Института - теской и экспериментальной биофизики РАН.

Диссертация в виде научною , разослана

2.5 1997г.

• (дата)

Ученый секретарь диссертационного совета

Йелипович П.А.

(фамилия)

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Среди фундаментальных проблем, общих для биофизики, клеточной биологии и медицины, важное место занимает проблема развития опухолевого процесса и изучение механизмов его регуляции. До настоящего времени проблема рака продолжает оставаться одной из наиболее актуальных и сложных в современной науке, что обусловлено стабильно высоким уровнем онкологической заболеваемости и часто неудовлетворительными результатами ее лечения. Механизмы взаимодействия опухоль - организм по праву считаются основополагающими в развитии опухолевого процесса, его системном влиянии, индуцирующим расстройство гомеостаза (прежде всего, как результат успешной конкуренции опухоли с тканями организма за жизненно важные метаболиты, витамины, антиоксиданты). В результате такой конкуренции, формируется стабильный дисбаланс между развивающейся опухолью и организмом, при котором именно опухолевые клетки приобретают более благоприятные условия для своего роста и повышенную устойчивость к повреждениям. Действительно, для большинства опухолевых клеток и их мембранных фракций характерен более низкий уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в сравнении с нормальными клетками. Наиболее вероятным субстратом ПОЛ в организме являются полиненасыщенные жирные^ кислоты (ЖК). Известно, что многие опухолевые клетки содержат липопротеиновые гранулы с высоким уровнем содержания полиненасыщенных ЖК, в частности линолевой и арахидоновой ЖК. Неясно какие механизмы при этом позволяют опухолевым клеткам поддерживать высокую устойчивость к образованию продуктов ПОЛ, особенно когда количество и объем таких гранул в клетках возрастает. В *псг* году Оогтапйу Т.1_. выдвинул теоретическое ."•^положение, что если полиненасыщенные ЖК (ПНЖК) имущественно входят в состав мембранных структур, то в таких клетках следует ожидать снижение устойчивости к ;С|Л-индуцированным летальным повреждениям. Напротив, '•-.-'.мущественная аккумуляция связанных ПНЖК в составе 2 £ • ■'■¡•¿неточных липид-содержащих гранул способна г ;ч;чтить клетки, так как такие гранулы могут работать как — ушки свободных радикалов (СР), снижая доступность

высокореактивных окислителей к мембранным структурам (основных индукторов апоптоза и некроза). Таким образом, характер внутриклеточного распределения ЛНЖК может существенно влиять на устойчивость клеток к окислительным повреждениям. Теоретическое предположение Dormandy T.L. ранее не проверялась, вероятно, из-за отсутствия прямого метода, который бы позволил непосредственно измерить устойчивость к окислительному стрессу в одиночных, живых клетках и их внутриклеточных компартментах (в частности, в кластерах из опухолевых липопротеиновых гранул и в участках цитоплазмы, не содержащих эти гранулы).

Проблема взаимодействия опухоль-организм является основополагающей в прогрессии опухолевого процесса, его опосредованном, негативном действии на организм хозяина. Такое действие опухоли индуцирует каскад неспецифических нарушений функций различных органов и систем, непосредственно не связанных с локализацией первичной опухоли. Одним из проявлений негативного действия опухоли на организм опухоленосителя является увеличение содержания продуктов ПОЛ, появление некоторых модифицированных белков с большей устойчивостью к деструкции (как например, фибрин). Не изучено, принимают ли такие модифицированные белки участие в развитии комплекса вторичных болезней опухоленосителя, мало-зависящих от локализации первичной опухоли и известных также под названием "Паранеопластический синдром". Проведение таких исследований представлялось важным, так как именно вторичные болезни часто являются непосредственной причиной смерти опухоленосителя. К числу таких болезней, прежде всего, следует отнести нарастающую эндотоксикацию опухоленосителя (эндоток-семия), которая развивается на фоне приобретенной гиперчувствительности организма к летальному действию эндотоксинов (в частности, к фактору некроза опухоли). Усиливаются также симптомы необратимой анемии и гиперферритинемии, сопровождающиеся массивными отложениями водонерастворимого ферритина в селезенке, хотя обычно ферритин является водорастворимым белком. В серии опытов in vitro O'Connel M.J. показал, что водо^-растворимый ферритин становится водонерастворимым

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель исследования обусловила постановку ряда

задач:

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

развития "Паранеопластического синдрома" в организме опухоленосителя. Проведение таких прямых измерений стало возможным благодаря нашим разработкам в создании нового метода, позволяющего измерить устойчивость к окислительному стрессу непосредственно в одиночных опухолевых клетках или их липолротеиновых кластерах (или в участках цитоплазмы без липопротеинов). Выявлены также метаболические условия, при которых опухолевые внутриклеточные липопротеины приобретают способность работать ловушками свободных радикалов.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

3. Приведенные в работе данные о способности некоторых внутриклеточных липопротеинов работать ловушками

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы были представлены на 5 Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию физиологически активных веществ, г.Рига, 1983; 2 Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение", г.Рига, 1985; 6 Конференции онкологов Прибалтийских республик, г.Рига, 1985; 4 Всесоюзном симпозиуме "Регуляция иммунного гомеостаза", г.Ленинград, 1986; 1 Всесоюзном рабочем совещании "Биофизика рака", Черноголовка, 1987; 5 Всесоюзный съезд геронтологов и гериатров, г.Тбилиси, 1988; 4 Всесоюзный съезд патофизиологов, г.Кишенев, 1989; International conferance "Regulation of free radical reactions", Varna, Bulgaria 1989; 5 Всесоюзном симпозиуме "Взаимодействие нервной и иммунной системы", г.Ленинград, 1990; Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки", г.Минск, 1990; 2-th Meeting the Federation of Europ. Biochem. Soc., Hungary, 1990; 4-th International Symposium of Lipofuscin and Ceroid Pigments ("Biology of Aging-92"), Tampere, Finland, 1992; 25-th Annual

Meeting of the Européen Society for Radiation Biology, Stokholm, Sweeden, 1993; International Congress of "Cell Biology", Praque, Czechoslovakia, 1994; 5-th International Symposium of Lipofuschin, "Gerontology Week in Japan", Tokyo, Japan, 1995; Keystone Symposium "Oxidant Stress: From Molecules to Man", USA, 1996; International Symposium "Anticancer Target and Stratégies for the Twenty-First Century", Castres, France, 1996; 1 Международный Симпозиум "Фундаментальные науки и альтернативная медицина", г.ПуЩино, 1997.

МЕТОДЫ

Информация о работе

Шварцбурд, Полина Михайловна
доктора биологических наук
Пущино, 1997
ВАК 03.00.02

Диссертация

Окислительный стресс во взаимодействиях опухоли и организма - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Окислительный стресс во взаимодействиях опухоли и организма ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Окислительный стресс во взаимодействиях опухоли и организма"

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Шварцбурд, Полина Михайловна, Пущино

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Окислительный стресс во взаимодействиях опухоли и организма
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика