Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение динамической организации хроматина в клетках млекопитающих методом проточной цитометрии

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение динамической организации хроматина в клетках млекопитающих методом проточной цитометрии"

Па правах рукопна! УДК 576.315.42:57.086.12

^—.

Г}

ВАРФОЛОМЕЕВА Елена Юрьевна

ИЗУЧЕНИЕ ДИ11АЛ111ЧЕСКОП ОРГАИИЗАЦИИ ХРОМАТИНА В КЛЕПлАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ.

_ 03.00.25 - 1Слеточнал биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата бнологнмеекпх паук

Санкт-Петербург 1С97

Работа выполнена в Отделении молекулярной н радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики РАН. Санкт-Петербург, Гатчина

Научный руководитель: кандидат биологических наук

М.В. Филатов.

Петербургский институт ядерной физики РАН, Санкт-Петербург, Гатчина.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.Ф. Смирнов,

Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных жнвотных РАСХ11, Санкт-Петербург, Пушкин.

кандидат биологических нау к А.Е. Виноградов, Пмсгигутиитрлогип РАН, Сан кт-Петербур г,

Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии РАН, Москва.

,&о

Защита состоится " }■+ " 01С / Л ¿ЖМ 1997 г. в АО часоп

О&ТЯе^Л 1997 г. в 13'

на заседании специализированно!о совета Д 002.73.01 Института цитологии РАИ

по адресу: 194064. С.-Петербург. Тихорецкий пр., дом 4, С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке И нет «гута цитологии РА11 Авторсфсраг разослан " / Ь " СЛНХЯЗ^А 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических на\к . '' , , л г п л . . Л.М. Писарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Большинство современных подходов к изучению таких сложных многокомпонентных систем, каким является организованный в хроматин генетический материал клетки, наряду с общеизвестными достоинствами имеет ряд недостатков. В результате важная информация о структуре и функционировании хроматина может сыпадать из поля зрения.

Во-первых, больщинство.экспериментальных методов требует нарушения целостности клетки и фракционирования биологического материала. Это может вызывать изменения в поведении макромолекул и их комплексов. Поэтому развитие методов, позволяющих максимально приблизить исследование к ситуации в целой или даже живой клетке, может дать важную дополнительную информацию.

Во-вторых, большинство современных молекулярных и биохимических методов, имея дело с массой клеток, неизбежно усредняют и фактически нивелируют особенности индивидуальных клеток и клеточных субпопуляций. С другой стороны, аналитические возможности современных цитогенетических и гистохимических методов ограничены из-за их трудоемкости и малой производительности. Поэтому полезно развивать высокопроизводительные методы количественного анализа различных параметров организации и функционирования индивидуальных клеток.

В-третъпх, основная часть современных методов изучения сложных

клеточных структур и систем статична, то есть не дает информации о

у

динамике клеточных процессов и о постоянно идущих перестройках клеточных структур. Очевидно, что функционирование сложно-организованных клеточных структур возможно только при минимальном их разрушении в процессе анализа. Следовательно развитие подходов изучения таких структур п максимально иитактных клетках может датн ранее недоступные сведения о динамическом аспекте их организации.

Все эти недостатки, по нашему мнению, может позволить частично преодолеть активно развивающаяся техника проточной цитометрин, которая позволяет с высокой производительностью и чувствительностью

количественно регистрировать различные структурные и функциональные характеристики индивидуальных клеток при минимальном их разрушении либо прижизненно. Однако эффективное применение проточной цитометрии для изучения сложных многокомпонентных клеточных структур требует изобретения п развития специальных методических подходов.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в разработке новых подходов, позволяющих с помощью проточной цитометрии регистрировать изменения в высших порядках организации хроматина и применении этих методов для изучения функционирования и динамической организации хроматина в клетках млекопитающих.

В работе решались следующие задачи:

1.Изучить возможность применения методов проточной цитофлуорометрии для регистрации различий в структуре хроматина' в клетках млекопитающих.

2. Разработать методы фиксации клеток, позволяющие измерять степень экраиированностн ДНК белками хроматина.

3. Описать явление изменения структуры хроматина при взаимодействии с однонитевой ДНК.

4. Изучить необычное поведение красителя Хест 33342, связанное с

4

удалением его из ДНК живых клеток, и охарактеризовать его зависимость от клеточного метаболизма, разрывов ДНК и активности топоизомераз.

Научная новизна.

В результате проведенной работы были предложены новые методы регистрации изменений в высших порядках упаковки хроматина.

Нами разработана процедура фиксации клеток, усиливающая экранирование ДНК белками хроматина от связывания с флуоресцентными красителями.

Впервые был предложен метод заключения отдельных клеток в полиакриламиднйе частицы клеточного размера, позволяющий удалягь '"ольшую часть клеточного белка, оставляя нативную заключенной в

дискретные частицы клеточиого размера. Применение данного метода и

техники проточной цитофлуорометрни • позволяет измерять степень экранированное™ ДНК белками хроматина.

Считается, что необходимым условием для функционирования генома является способность "раскрывать" в нужный момент те или иные его участки. Нами показано, что обработка клеточных ядер однонитевой ДНК, но не близкими по физико-химическим' свойствам двунитепой ДНК или РНК, приводит к значительному увеличению доступности ядерной ДНК. Высказано предположение, что появление участков' однонитевой ДНК может служить сигналом к локальному раскрытию хроматина.

Полученные результаты позволили высказать предположение, что в процессе активного удаления из клетки нековалентно связанных с ДНК агентов, наряду со специальными транспортными системами существует явление активной энергозависимой диссоциации из клеточной ДНК веществ, нековалентно связывающихся по малой бороздке. Показано, что процесс удаления красителя Хест 33342 из ДНК зависит от топологии ДНК. и активности топонзомеразы2. Получеш-ые результаты могут дополнить представление о механизмах явления множественной лекарственной устойчивости.

Таким образом в работе были расширены возможности использования проточной цитофлуорометрни для изучения динамической организации генетического материала клетки.

Теоретическая и практическая ценность работы.

Почучены факты, указывающие на некоторые новые аспекты функционирования генетического материала клеток млекопитающих, такие как изменение структуры хроматина под воздействием однонитевой ДНК- и явление активного энергозависимого удаления из ДНК клеток нековалентно связывающихся веществ что может быть важно для понимания механизмов функционирования генетическогсГматериала млекопитающих.

Предложен простой метод заключения отдельных клеток в полиакриламидиые частицы клеточного размера, позволяющий использовать таким образом фиксированные клетки для решения широкого спектра биологических задач.

Предложенный метод фиксации клеток-глутаровым альдегидом может быть использован в качестве экспресс-метода оценки соотношения форменных элементов крови (нейтрофилов и лимфоцитов) для диагностических целей.

Апробация работы.

Материалы работы представлялись па XVII Конгрессе Международного общества аналитической цитологии (Лейк-Плэсид, США, 1994), были доложены на Всероссийских научных конференциях и научных семинарах Отдела молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики РАН. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из

введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего публикаций. Диссертация иллюстрирована рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Проточные питометры.

В работе использовались цитофлуорнметры, сконструированные в ПИЯФ РАН. В качестве источника света были использованы ртутная лампа НВО 100 и аргоновый лазер. Данные были получены и обработаны с помощью программы накопления и обработки результатов, написанной в ПИЯФ РАН.

2.2 Клеточные культуры.

В качестве объекта исследования использованы: клетки перевиваемой линии фибробластов китайского хомячка V-79, ядерные клетки периферической крови человека, перевиваемая линия карциномы шейки матки человека Hela, крысиные селезеночные лимфоциты, лимфоциты периферической крови человека.

Клетки перевиваемых линий HeLa и V-79 выращивались во флаконах Корреля на среде Игла с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого t гота, снимались стандартным раствором Версеиа в течение 5-10 мин. при

37°С. В зависимости от дальнейшего использования переводились г> соответствующий буферный раствор.

Крысиные селезеночные лимфоциты выделились диспергированием и? сслозснкн крыс. Затем отмывались и переводились в соответствующий буфер.

Лейкоциты периферической кропи человека получали после лизиса эритроцитов 0.87% раствором Гч'ШО при последующем центрифугировании и дальнейшем переводе в стандартный раствор Вгрссна. Лимфоциты периферической кро:.л человека получали после центрифугирования крови на фмколле-яерогрпфини с плотностью 1.077. Послс отмывки клетки переводились либо и стандартный раствор Версеиа, либо в среду Игла с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота в зависимости от дальнейшего использования.

2.Ti Фиксация клеток глутаровым альдегидом.

Клетк.ч в изотопическом растворе обрабатывались 0.2% ней иным детергентом Тритон Х-100, что приводило к лизису цитоплмматпчсскоп мембраны и освобождению ядер, стабильных и эти:; условиях и легко проницаемых для макромолекул. Затем ядра фиксировались глутаровым альдегидом в конечной концентрации 0.5%. Таким образом приготовленные образцы могут храниться длительное время. Окрашивание образцов флюоресцентными красителями проводили в течение 30 миг. непосредственно перед проточио-цнтомстрнчсскнм анализом.

2.4 Обработка клеток- одпошпепон ДНК, РНК и двушггепой ДН!С и приготовление смеси ¡слеток, обработанных различным образом до фиксации глутаровым альдегидом.

Ядра крысиных лимфоцитов, полученные обработкой 0.2%-ным Тритоном Х-100 в изотоническом солевом растворе Хенч-са (без бикарбоната натрия), либо в стандартном буфере PBS с добавлением 0.2 мг/мл MgCh, инкубировались с добавлением гкзогеннои однонктсвон ДНК, PIIK или двунитевой ДНК. Использовалась коммерческая ДНК тимуса теленка, спермы лосося или ДНК, полученная фенольнон экстракцией из клеток Hela. В качестве препаратов PHIC использовалась тРНК E.coli и суммарная РНК дрожжей, выделенные в пашей лаборатории. РНК добавлялась из водного

растпора с концентрацией 2 мг/мл. Двунитевая ДНК добавлялась из раствора двунитевой ДНК с концентрацией 2 мг/мл. Однонитевую ДНК получали кипячением в воде с последующим быстрым охлаждением. После инкубации в присутствии разных концентраций ДНК или РНК ядра фиксировали 0.5% глутаровым альдегидом.

Для анализа на проточном цитометре приготавливали смесь ранее фиксированных глутаровым альдегидом ядер, обработанных до фиксации различным образом. Смесь необработанных и обработанных различны^ образом фиксированных ядер окрашивали ЭБ пли Хехст 3325S и анализировали на проточном цитометре.

2.5 Приготовление полиакриламидиых частиц клеточного размера.

Клетки помещались в приготовленный на стандартной среде Игла 50%

раствор акриламида с добавлением 10% бисакриламида и 2 % ТЕМЕДа на > час. Так как и акриламид и бисакрнламнд являются низкомолекулярнымн соединениями, они достаточно свободно проникали в клетку. Затем проводилась индукция полимеризации акриламида внутри клеток путем переведения их в среду, содержащую персульфат натр.гч (1%) и ТЕМЕД (1%). Полученные полиакрилам.идные частицы после центрифугирования переводились в стандартный буфер PBS.

2.6 Окрашивание живых клеток прижизненным красителем Хсст 33342 li их о.мыианнс от красителя.

Клетки окрашивались Хест 33342 в среде Игла с добавлением 10% сыЕоротки крупного рогатого скота и инкубировались в течение 1.5 часов в термостате при 37°С. Для отмывки красителя проводилось 3 ополаскивания средой Игла для клеток, выращенных во флаконах Корреля либо 3 центрифугирования с удалением супернзтанта для клеток в суспензии. Затем клетки инкубировались в среде Игла с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота без красителя в течение 2 часов при 37°С. '

Перед проведением проточноцитофлуорометрического анализа клетки снимались стандартным раствором Версена в течение 5-!0 минут при 37°С.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ "И ОПСУ^ОДЕНИЕ.

В работе решались несколько относительно независимых подзадач, имеющих дело с характеризацией различных сторон организации и функционирования генетического материала.

3,1. Изучение экраиировашгостп ДНК бе.,ками хроматина в ядрах клеток млекопитающих.

Известно, что глутаровын альдегид вызывает сшивки белков по аминогруппам (Кот е1 а1,1972, Сгс^т й а1,1984). Используя это его свойство при обработке клеточных • ядер, можно ожидать, что будет зафиксирована имеющаяся в данный момент упамзвка хроматина в клетках и такая фиксация приведет к ограничению доступа внешних агентов к ДНК клеток.

Мы предложили метод количественной регистрации экранировки ДНК белками хроматина при связывании флуоресцентных красителей, применяя фиксацию клеточных ядер глутаровым альдегидом (Филатов. М.В., Варфоломеева Е.Ю., Цитология, 1990). Было продемонстрировано существование нескольких способов экранирования ДНК белками хроматина, значительно снижающих количество связанного с ДНК красителя, что позволяет получать информацию об упаковке ДНК в клетках. Было обнаружено, что фиксация выделенных ядер глутаровым альдегидом приводит к тому, что интенсивность окрашивания их разными флуоресцентными красителями снижается в два и более раз по сравнению с нефиксированными ядрами. Этот эффект не зависит от присутствия глутарового альдегида в момент окрашиваний предварительно фиксированных образцов. (глутаровын альдегид может быть убран центрифугированием) и наблюдается для таких различных красителей, как бромистый этиднй (ЭБ), ОАР1 (ДАФИ-диаминофеКилиндол), Хест 33258 (Ное1т 33258). Было показано, что при использовании насыщающих концентраций красителей (50 мкг/мл ЭБ 2 мкг/мл Хеста 33258, 2 мкг/мл ДАФИ) значительного увеличения интенсивности флуоресценции не наблюдается ни с увеличением времени окрашивания (более 30 мин.), ни с ростом концентрации красителей. Если же ядра сначала окрашивали ЭБ, а затем фиксировали глутаровым альдегидом, то их интенсивность

Рис.! Гистограммы распределения по интенсивности флуоресценции ядер крысиных лимфоцитов, окрашенных этндием бромидом (ЭБ).

По оси збсцисс-интснсивность флуоресценции, усл.ед. (каналы анализатора), по оси ордннат-количестьо событий X 1С3.

а-ядра, окрашенные 20 мкг/млЭБ без фиксации, С-охрашенные 20 мкг/мл ЭБ после фиксации 0.5% тлутароЕым альдегидом; в-д-смссь ядер, обработанные соответственного, 10 и 2 мкг/мл ЭБ перед фиксацией глутаропым альдегидом с ядрами, фиксированными глутаровьш альдегидом без предварительной обработки ЭБ (левый ипк па гистограммах).

После смспшг.ання концентрацию ЭГ» дгхюдили до 50 мкг/ма.

У»с.2 Гистограммы распределения по интенсивности флуоресценции ядер клеток периферической крохи чслопска, фиксированных

0.5% глутаровым альдегидом и окрашенных специфичным к ДНК флуоресцентным красителе:.! Хсст 3325Й (2 мкг/мл).

По осям -то ;ке,что и на рис.!. я- спектр ядер цельно": крови; пик» слева чапрацо соответствуют блзофшим, лимфоцитам н нсГггрофппзм, 6,8 - клетки кроен после фракционирования и3 фнколлс с плотностью 1,077 г/мл. б-иизкняя фракция, видно резкое уменьшение пшеа лимфоцитов, в -Еерх!1яя фракция, единственный пик соответствует лимфоцитам.

флуоресценции была значительно больше,.чем у ядер, окрашенных после фиксации. Можно сделать вывод, что ЭБ при взаимодействии с хроматином изменяет его структуру, раскрывая некий уровень экранирования ДИК белками. Фиксация глутаровым альдегидом, сшивающим белки, делает невозможными такого рода изменения, п и этих условиях краситель связывается только с неэкранировапными участками ДНК. Данные рис.1 демонстрируют сопоставление интенсивности флуоресценции клеток, обработанных разными концентрациями ЭБ перед фиксацией глутаровым альдегидом, а также нефиксированных клеточных ядер (1а). Нами было показано, что степень экранирования ДНК белками, выявляемая с помощью фиксации глутаровым альдегидом, неодинакова для клеток разной днфферепцировки. Так, при окрашивании нефиксированных ядер клеток периферической крови человека на гистограмме наблюдается один пик, что не удивительно, если принять во внимание равенство содержания ДНК в клетках. В то же время после фиксации глутаровым альдегидом мы можем видеть другую картину, представленную на рнс.2. При окрашивании ЭБ ни гистограмме наблюдаются два больших, отдельно стоящих пика, а при окрашивании Хехст 33258 или ДАФИ, кроме них, еще небольшой пик с меньшей интенсивностью флуоресценции (2а). Фракционирование ядерных элементов крови с помощью фиколла-верографина позволила идентифицировать большой пик с меньшей интенсивностью флуоресценции как лнмфоциты(2в), а второй большой пик как нейтрофилы(2б).

Рис.З Гистограммы распределения по интенсивности флуоресценции ядер клеток китайского хомячка У-79, фиксированных 0.5% глутаровым альдегидом и окрашенных Хест 33258 (2 мкг/мл). Пс осям -то же,-¡го и на рис.1. »- популяция клеток без митозов; б-популяцня клеток, обогащенная шгтозами путем блока колхицином (0.1 мкг/мл) в течение 7 ч.

При применении данного подхода для сопоставления хроматина митотичсских клеток и клеток в С2-псриоде получилось, что после фиксации глутаровым альдегидом интенсивность окрашивания Хехст 33258 митотичсских клеток была выше, что указывает на большую доступность ДНК митотичсского хроматина внешним агентам (рнс.З). Полученный эффект перекликается с данными, полученными рапсе (Larson et al, I9S6). Нужно сказать, что различия в упаковке хроматина в клетках, находящихся с G2 фазе клеточного цикла и митотичсских клеток наблюдали и раньше, применяя проточную цнтомстршо и такие красители как акридиновый оранжевый. В то же время интересно отмстить, что при применении метода фиксации глутаровым альдегидом к клеткам, находящимся в фазах GO и GI клеточного цикла не удается получить сколько-нибудь заметных различий, как это наблюдается при некоторых других способах обработки (Cubbies, 1990). Вероятно, различные проце-дуры фиксации и окраски .подчеркивают различные аспекты организации хроматина, что отмечалось и другими авторамп (Зеленин, 19S7).

Глутаровый альдегид, вызывая сшивки белков, фиксирует, то есть деласг статичной, относительно динамичную упаковку хроматина. В результате ограничивается доступность ДНК к внешним агентам,, в частности, к красителям. При этом обнаруживается, что фиксируемая глутаровым альдегидом упаковка хроматина различна в клетках разной дифференцнровки и на разных стадиях клеточного цикла. Метод позволяет зафиксировать различные изменения структуры хроматина и зарегистрировать их с помощью прсточной цитомстрии по изменению связывания с ДНК специфичных флуоресцентных красителей. Таким образом имеется удобный метод изучения копформацнн хроматина.

3.2. Влияние одноннтсвой ДИК на упаковку хроматина.

Известно, что процессы, сопровождающиеся раскрытием плотно упакованной структуры хроматина, такие как транскрипция, репарация, рекомбинация, репликация одновременно сопровождаются появлением локальных участков однопитевой ДНК или ДНК с измененной структурой {Conclin and Groudinc, 19S4). Можно полагать, что появление однонитевых участков ДНК провоцирует изменение упаковки хроматина.

Мы обнаружили, что обработал ядер лимфоцитов одиоиитевой ДНК, но не двупмтевон ДНК или РНК, приводит к раскрытию хроматина. Это регистрируется по увеличению связывания ДНК-тропиых красителей. Препараты ДНК и РНК из разных источников давали сходные результаты. Данные представлены на рис.4г (левый пик соответствует необработанным одиоиитевой ДНК ядрам). Обычная инкубация в солевом растворе не приводила к изменению в окрашиваемое™ ядер. Если же ядра инкубировали в присутствии одиоиитевой ДНК, то интенсивность флуоресценции существенно возрастала. Инкубация с неденатурнрованннон ДНК не оказывала такого действия (рис.'Зв). Инкубация с РНК также была неэффективна (рис.4б). Предварительная фрагментация ДНК ультразвуком до средней мол. массы 300 пар нуклеотидов существенно не меняла эффекта, указывая на то, что проницаемость ядра для ДНК не является критической для описываемого явления. Эффект зависел от Бремени инкубации и концентрации ДНК. Для того, чтоы исключить возможность артефакта, связанного с неспсцифнческнми реакциями, мы провели дополнительные исследования.

Рис.4 Гистограммы распределения по интенсивности флуоресценции ядер крысиных лимфоцитов, фиксированных глутаровым альдегидом после обработки РНК, двунитсвой ДНК, одиоиитевой ДНК с добавкой ингибиторов протгаз или без нее.

По осям то же, что и на рис.1, »-необработанные фиксированные глутаровым альдегидом ядра лимфоцитов, б-д- смесь ядер, обработанных и необработанных различным образом перед фиксаи ей глутаровым алъдепшом: 6- РПК в концентрации 200 мкг/мл, в- двутгтевол ДНК в концентрации 200 мкг/мл, гл-одношгтег.ой ДИК в концентрации 200 мкг/мл в oTcyicTRim(r) и я прнсутствии(д) 5 м.М ФМСФ при обработке одноннтевоП ДИК.

Окапалось, что удаление ДНК центрифугированием ядер перед фиксацией не изменяло эффекта. Добавление ДНК после фиксации глутаровым альдегидом было не в состоянии вызвать увеличение прокрашивания. Все это, по нашему мнению, исключает возможность того, что наблюдаемый эффект обусловлен артефактами, связанными с сорбцией ДНК па клетках или снятием с хроматина мажорной фракции белков, сорбирующихся на экзогенной ДНК. Элсктрофорстпчсскис данные убеждают, что после обработки клеток однопнтсвой ДНК не наблюдается разницы в содержании таких мажорных фракций белков, как гнетопы. Оказалось, что процесс может быть частично заторможен некоторыми ингибиторами ссрннопых протсаз, такими как ФМСФ (рнс.4д). Возможно, некие протеазпые активности принимают участие в регулировании упаковки хроматина. Подобные активируемые однопнтсвой ДНК хроматиновыс протеазы были вписаны ранее в лизатах ядер клеток млекопитающих Газнсвым и Куцым (1988). В то же время не исключена возможность конкурентного снятия относительно минорных белковых компонентой хроматина, специфически связывающихся с одпоиитсвои ДНК клеток.

Таким образом обработка ядер лимфоцитов однопнтсвой ДНК, но не близкими по физико-химическим свойствам двуннтсвой ДНК или РНК, приводит к раскрытию хроматина и увеличению связывания флуоресцентных красителей. Наблюдаемое явление может быть связано с изменением структуры хроматина в местах расплетсння ДНК.

Суммируя сказанное, можно заключить, что предложенный подход позволяет получать новую информацию об организации хроматина и ее изменениях в клетках.

3.3. Заключение клеток в полиакрнламндные частицы клеточного размера.

Еще одним разработанным нами методом оценки упаковки клеточного хроматина с помощью проточной цитометрии является оригинальный способ иммобилизации индивидуальных клеток в полиакриламндные частицы клеточного размера (Филатов М.В. и др.,Цитология, 1991, Filatov М., /arfolomeeva Е., Va^folomcev D., Cytometry, 1994). N

Изучение комплексных макромслекулярпых структур клетки, в частности, генетического материала, сталкивается с существенными трудностями, связанными с манипулированием огромными по молекулярным масштабам и крайне нестабильными к механическим воздействиям молекулами и комплексами молекул. Для преодоления этих трудностей были предложены методические подход!,:, связанные с заключением клеток в агарозный гель с последующим лизисом и фракционированием (Eisenberg, 1984, Jackson, Cook, 1986). Но попытки получить таким образом агарозные частицы, пригодные по размерам для анализа на проточном цнтомстре, показали, что даже шарики из 10% згарозы (большей плотности не удается достичь из-за преждевременного гелеобразования) не в состоянии удержать ДНК клетки после лизиса. Следовательно, требовалось заключать клетки в более плотный гель. Такими являются полученные нами полиакрнламндные частицы.

Главной идеей предложенного метода является полимеризация акрпламида внутри клеток- при отсутствии реакции в окружающей среде. При этом формируются полиакриламидные частицы клеточного размера, удерживающие полностью содержимое индивидуальных клеток и позволяющие и дальнейшем проводить выборочное удаление клеточных компонентов. Для того чтобы получить такие частицы, нами были применены различные методы индукции полимеризации внутри клеток. Так как и акриламидн бисакриламнд являются иизкомолскулярнымн соединениями, они достаточно свободно проникают в клетку. После удаления их из окружающей среды центрифугированием эти соединения не сразу удаляются из клетки, т.к. цитоплазматпческая мембрана • является препятствием для свободной диффузии. Если в этот момент па клеточную суспензию подействовать веществами, продуцирующими свободные радикалы ( такими как пчкульфат натрия, рибофлавнп+свет, гамма-радиация), то произойдет полимеризация полиакриламидного геля внутри клеток. Полученные частицы переводятся в стандартный буфер PBS.

Критерием целостности и стабильности полученных частиц является их способность удерживать клеточную ДНК после того, как клетки лнзируются и потеряют большую часть всех белков. После лизировання 2% раствором

лаурил саркозила и 0.5 М растворе ЭДТА, в течение 20 часов из клеток удаляется большинство содержащихся в них белков. Чтобы убедиться в этом, измерялась радиоактивность частиц, полученных из клеток, предварительно меченных в течение сугок смесыо аминокислот, содержащих радиоактивный изотоп углерода IJC, до и после лизиса этих частиц. Было видно, что гри такой обработке теряется 90-95% включенной радиоактивности. Между тем, флуоресцентно-микроскопический анализ выявляет наличие частиц правильной формы, интенсивно светящихся при окрашивании специфичными к ДНК красителями ЭБ и ДАФИ (рис.5). Анализ на проточном питометре показывает, что они имеют одинаковую интенсивность флуоресценции. Это говорит о том, что потери ДНК из клеток отсутствуют , т. к. содержание ДНК на клетку остается постоянным (рнс.бг). Еолее того, как видно из. тех же рисунков, флуоресценция частиц после лизиса становится даже больше, что связано, вероятно, с устранением препятствий да я связывания красителей с ДНК, обусловленных экранированием белками хроматина. Ранее было показано, что фиксация клеточных ядер глутаровым альдегидом, сшивающим белки хроматина, уменьшает доступность ДНК к связыванию флуоресцентных красителей по сравнению с интактными ядрами. Напротив, фиксация спиртом, денатурирующим белки, .увеличивает связывание. Литература указывает на то, что экранировка белками влияет на взаимодействие ДНК и ДНК-тронных агентов, заметно сказываясь lia проточноцнтометрнчсских результатах (Jackson, Cook, 1986, Larsen et al, 1986, Зеленин, 1987), однако, нельзя утверждать, насколько велик этот эффект. Прямые оценки такого рода имеются для растворов ДНК и хроматина (Miller et al,I979), что может, однако, не вполне отражать ситуацию в клетке. Рис.6 приводит результаты для обработанных различным образом клеток, окрашенных ДАФИ. Аналогичные результа'тыгпо-лучены для ЭБ. Нужно отметить, что само по себе заключение клеток в поли- ( акрнламидные шарики не сказывалось существенно на интенсивности флуоресценции клеток. Из приведенных результатов видно, что в ¡ппактных нефиксированных клетках существует значительная экранировка ДНК. которая не снимается полностью при спиртовой денатурации белков.

■ Г

р'

I ' Р -к I 5 ? '

; г

I Ь-?

(

У10.

1'пс.б. Сопоставление

интенсивности флуоресценции клеток, прешедших различную обработку и окрашенных ДЛФИ.

Но осям то -ас , что и на рис.). »-клетки, фиксированные

глутаролым альдегидом, б-нефпкенропанные ннтактные

клс1хи, в-клегкн, фиксированные пнловмм СИНр'ШМ, г-клеткн, заключенные в полнпкршгамцдпыс • шарики.

|'пс.5 Фоннрафип нолиакрил-амидпмх части: Л - ис (крашенные нолнлкрпламплные частим. В -полпакрнллмндпые частицы,

окрашенные -индием бромидом

Таким образом предложен оригинальный способ заключения клеток в полиакрнламидные частицы клеточного размера, проницаемые для белковых молекул. Это позволяет частично или полностью убирать из них клеточные компоненты вплоть до удаления 90 % всего белка, сохраняя их в виде дискретных частиц, удерживающих всю клеточную ДНК, которая доступна для экзогенных белков^таких как иммуноглобулин О и ДНКаза1, что было продемонстрировано п специальных экспериментах. Предлагаемый метод может быть использован, по нашему мнению, как основа для разнообразных молекулярных методик изучения индивидуальных клеток ш уцго.

3.4 Изучение процессов удалении бнсбснзпмндазолыюго красит ели Хссг 3j342 из клеток млекопитающих in vivo.

Широко известно явление множественной лекарственной устойчивости клеток млекопитающие, связанное с активным выводом внешних агентов, в частности, красителей, из клеток. Данное явление, как правило, связывают с функционированием специфических транспортных систем (Eiidicott, 19S9, Гамалей н др, 1995). Однако не вполне попятно, как плотно связанные с ДНК агенты могут быть удалены из клетки только за счет эффективных систем транспорта. Представляется, что механизмы, облегчающие диссоциацию этих агентов от ДНК, могли бы принимать участие в этом процессе.

Мы изучали удаление из ДНК плотно связанного по малой бороздке красителя Хест 33342 в метаболически активных клетках (Filatov and Varfolomeeva, Mutation research, 1995). Достаточно свободное проникновение Хест 33342 в живые клетки, специфическое связывание с ДНК и резкое усиление флуоресценции при таком связывании делаег этот агент удобным зондом в таких исследованиях. В качестве основной модели была взята перевиваемая линия карциномы шейки матки человека Hela. В общих чертах сходные результаты получались и па других клетках.

В нашей работе измерялась интенсивность флуоресценции связанного с клетками красителя с помощью лампового проточного цнтофлуориметра. Фиксированные спиртом клетки или ядра клеток, полученные обработкой 0,2% неполным детергентом тритон Х-100 интенсивно окрашиваются Хест 33342, причем окрашивание очень стабильно. Хест 33342 с большим трудом диссоциирует от ДНК при удалении его из окружающего раствора повторным центрифугированием (рис.7 (1,2)). Видно,что даже при длительной инкубации без краски идет лишь незначительное ее удаление из клеток. Интересно, что при окрашивании низкими концентрациями Хест33342 (0,1 мкг.мл) живые метаболнзнрующие клетки также практически не удаляют краситель из ДНК в течение длительного времени (рис.8). Напротив, при окрашивании живых клеток большими, но не убывающими клетки, концентрациями Хест 33342 большая часть красителя удаляется уже через час при инкубации в полной среде при 37°С, что демонстрирует ркс.9(1,2).

Рпс.7. Хест 33342 с большим трудом диссоциирует от ДНК ядер клеток при удалении его из окружающего раствори.

По осп абсцисс-пнтенспшюсть флуоресценции в усл. сд., по оси ординат- количество клеток.

1)Яяра клеток Hela, полученные обработкой 0.2% нснонпым детергентом T¡¡ton Х-100 и окрашенные 2 мкг/мл Хсст 33342, 2) ядра клеток líela, полученные как в I), по затем инкубированные п течение 4-х часов п среде без красителя.

Рнс.8. Клегкн, окрашенные низкой концентрацией красителя, не способны выбрасывать Хест 33342 и течение 4-х 'часов.

По ос;::.: то же, что па рпс.7.

1- ¡Слетки, окрашенные in vivo в течение 1.5 часов Хсст 33342 (С.2 мкг/н.ч) при 37°С, 2- клетки, обработанные как 1, но затем инкубированные в свободной от красителя среде Игла + 10 % КРС 4 часа при 31"С.

Рнс.9. Выбрасывание Хест 33342 из ДИК зависит от нормального энергетического метаболизма клеток. По осям то же, что на рис.7.

1)1Слстки, окрашенные ¡n vivo в течение 1.5 часов Хсст 33342 (2 мкг/мл) при 37°С, 2) клетки, обработанные как в 3), но затем инкубированные в свободной от красителя среде Игла + 10 % ICPC 1.5 часа при 37°С, 3) клетки, обработанные как в 4), по инкубация без красителя проводилась при 22°С, 4) клетки, обработанные как в 4), по инкубация проводилась в присутствии 2,4-динптрофспола (10 « М) при 37°С

Обычно явление удаления красителей из клеток сказывают с активностью транспортных систем, в частности, с наличием в клетках, трансмс.мбранного белка Р-глнкопротсина, кодируемого генами mdr. Однако такая система не может сама но себе ускорять процесса диссоциации красителя из ДНК, что наблюдается и пашем случае. Необходимым условием данного процесса является полноценное метаболическое функционирование нсповрсэденных жизнеспособных клеток. Нарушение этого условия приводит к тому, что клетки перестают удалять краситель из ДНК. Так, инкубация клеток ь пониженной температуре (ниже 30°С) игш с разобщителем окислительного

фосфорилирования 2,4-дшштрофенолом ведет к погере этого свойства (рис.9(3,4)). Процесс удаления Хест 33342 может быть существенно заторможен и в активнометаболизирующих клетках обработкой ингибиторами топонзомеразы2. Мы использовали ингибиторы: новобиоцин, эллиптицин, этопознд (УР16) и тонипозид (УМ26). Полученные результаты, сходные в общих чертах, приведены на рис.10.

РисЛО. Ингибиторы топопзомеразы 2 подавляют выбрасывание ХесТ 33342 из ДНК. По осям то же, что и на рис.7. Правая гистограмма на рисунках: а) клетки, окрашенные in vivo в течение 1.5 часов Хест 33342 (2 мкг/мл) при 37°С, Ь-с) клетки, обработанные как в а), затем инкубированные 1.5 часа при 37°С в среде без красителя в присутствии: Ь) 100 мкг/мл новобиоцшш, с) эллнгптщина (1 мкг/мл), d) VP-16 (этопознда)(5 мкг/мл), с) VM-26 (тонипозцда)(5 мкг/мл). Левая гистограмма на всех рисунках- клетки, обработанные как а), но затем ннхубированные в свободной от красителя среде Игла + 10 % КРС 2 часа прн 37°С.

Основываясь на этих результатах, можно независимым приемом проверить положение о том, что открашиванне клеток идет не только на уровне выхода красителя из клетки, но и На уровне диссоциации его нз ДНК. Дело в том, что при диссоциации из ДНК краситель какое-то время еще может находиться внутри клетки, т.к. диффузия его ограничена. При этом его флуоресценция слаба. Если мы теперь при отсутствии красителя во внешней среде подавим процесс диссоциации Хест 33342 нз ДНК ингибиторами топоизомеразы 2, то мы должны увидеть вновь усиление флуоресценции за счет связывания красителя с ДНК. Именно это и наблюдается, как показано на рис.11 (2,4,6). Таким образом,можно полагать, что в клетках существует активный процесс вывода Хест 33342 нз ДНК. зависимый от топонзомеразы2. Но функционирование топоизомераз трудно представить себе без наличия топологически замкнутых петель ДНК. Основываясь на этом, мы предприняли

попытку подавить процесс диссоциации Хест 33342, инициируя в ДНК разрывы гамма-лучами.

Рис.11. Удаление красителя Хест 33342 идет именно из ДНК клеток. По осям то же, что и на рие.7.1) Клетки, окрашенные ¡n vivo в течение 1.5 часов Хест 33342 (2 мкг/мл) при j7°C,2) клетки, обработанные как 1), но затем инкубированные в свободной от красителя среде Игла + 10 % КРС 2 часа при 37°С, 3).5) клетки, обработанные как в 2), но инкубация проводилась в присутствии ингибиторов 100 мкг/мл новобиоцина или эллипгнцина (1 мкг/мл), соответственно, 4),б) клетки, обработанные как в 2), но затем снова инкубированные 1.5 часа при 37°С в среде без красителя в присутствии новобиоцина(100 мкг/мл) или эллнптнцина (I мкг/мл), соответственно.

Дозы в десятки грей не в состоянии были повлиять на этот процесс (рис.12). Однако увеличение доз облучения до 1000-2000 грей давало эффект, сходный с действием ингибиторов топоизомеразы 2 (рис. 12). Использование высоких доз гамма-облучения в то же время может оказывать действие не только через разрывы в ДНК, что делает интерпретацию результатов неоднозначной.

U/L

А к

Рпс.12, y-oGri учение ннгибирует

выбрасывание Хест 33342 из ДНК.

По осям то же, что на рис.7.

1) Клетки, окрашенные in vivo Е течение 1.5 часов Хест 33342 (2 мкг/мл) при 37°С, 2) клеткн, обработанные как 1), но затем инкубированные в свободной от краыггеля среде Игла + 10 % КРС 2 часа при 37°С, 3) клетки, обработанные как 2), ко после воздействия у-облучением (100 Gy) перед инкубацией в среде без красителя, 4) клегки, обработанные как 3), но облученные 2000 Gy, 5) клетки, обработанные как 2), но затем облученные 2000 Gy и затем снова инкубированные I ча<.

Для того, чтобы исключить эту неоднозначность, мы сносили разрывы и ДНК другим способом. Известно, чтс ДИК с частичной ззпеиоГ; тимнднпа на бромдсзокеиурндпп становится краппа чувствительной к фотолизу длинноволновым ультрафиолетом при связываг.ни бпсбепзнмндазольных красителей (Х1-Сап£ с! а!, 1986). Мы использовали этот эффект лля подтверждения того, что именно разрывы в ДНК блокируют процесс удаления Хсст 33342. Клетки Не1а, предварительно выращенные в среде с бромдезокснурпдином (0,05 «иглимоля), окрашивались Хсст 33342 как обычно. Затем проводился фотолОз освещением длинноволновым ультрафиолетом в

К

Р'хЛЗ:;. Фотолиз содержащей БУДР ДНК ингчбирует выбрасывание Хсст 33342. По осям то же, что па рнс.7 1) Клетки Hela, содержащие БУДР г> Д№." и окрашенные ¡avivo в течение 1.5 часов Хест 33342 (2 мкг/мл) при 37°С, 2) клетки, обработанные как 1) по "згем инкубированные в свободной ог красителя среде Игла + 10 % КРС 2 часа при 37°С, 3) клетки, обработанные как 2), но облучнинс длинноволновым ультрофнолегом перед инкубацией в среде без крнс.ггеля,. 4) клеп;п, обработанные как 2), по облученные

длинноволновым ультрофиолстом после инкубации и затем снова инкубированные в среде без красителя 1 часпрн37°С

Рис,135. Фотолиз ДНК содержащей БУДР, инкорпорированный в меньшую сс часть не пнгпбирует выбрасывание Хсст 33342. По осям то же, что на рнс.7 1) Клетки Hela, содержащие БУДР в ДИК и окрашенные ¡n vivo в течение 1.5 час,ос Хсст 33342 (2 мкг/мл) при 37°С (БУДР добавлялся на 20 мни. каждые 4 часа в течение 24 часов), 2) клетки, обработанные как 1) по затем фотолизировапные и инкубированные в свободной от красителя сред,-Игла + 10 %' КРС 2 часа при 37°С, 3) клетки líela, содержащие БУДР в ДНК и окрашенные in vivo в течение 1.5 часов Хсст 33342 (2 мкг/мл) при 37°С (БУДР добавлялся на 24 часа, затем клетки культивировались в среде без БУДРа 4S часов), 4) клетки, обработанные как 3) но затем фотолизировапные и инкубированные в свободной от красителя среде Игла + 10 % КРС 2 часа при 37°С

дозе порядка 50 Дж/м либо сразу после удаления Хест 33342 из среды, либо через некоторое время, после частичного открашипания клеток.Полученные результаты, как это видно из рис.13, аналогичны данным, полученным при облучении гамма-раднацией или обработкой ингибиторами топоизомеразы2. Специальными экспериментами (седиментацией в щелочном градиенте сахарозы) продемонстрировано, что в ДНК при этом образуются многочисленные разрывы (FiIatov,Varfo!omeeva, 1995, Филатов, 19S4).

Полученные результаты позволяют предположить, что з клетках действует активный энсргозависнмый процесс, приводящий к эффективной диссоциации Хест33342 из ДНК. Возможно, некие белки движутся вдоль ДНК, удаляя краситель. Известным процессом такого рода, проходящим за 1 час значительную часть генома, является транскрипция. Однако ингибиторы транскрипции, такие как актиномицин Д (0,2мкг/мл) или альфа-аманнтнн(10 мкг/мл), не подавляли процесс удаления Хест 33342, даже п токсических концентрациях. Другим таким процессом могло бы быть функционирование хеликаз, но сегодня мы не имеем-каких либо экспериментальных данных, касающихся этого предположения.

Необходимо отметить, что интенсивность процесса диссоциации веществ из малой бороздки ДНК зависит от состояния клеток в культуре и происходит тем активнее, чем активнее пролнфернруют данные клетки. Наибольшая интенсивность процесса удаления красителя наблюдается для клеток в логарифмической фазе роста (рнс.14 (3,4)), панмеиьша,. - для клеток в монослое, голодающих по глютамину (рис.14 (1,2)).

Рпс.14. Промесс диссоциации Хест. 33342 зависит от состояния культуры клеток. По осям то же, что на рис.7.

1) Клетки в монослое и после 12 часов голодания по глутамину, окрашенные ¡n vivo и течение 1.5 часов Хест 33342 (2 мкг/мл) при 37°С, 2) клетки, обработанные как I), но затем инкубированные в свободной от красителя среде Игла + 10 % КРС 2 часа при 37°С, 3) клетки в логарифмической фазе роста, окрашенные ¡n vivo в течение 1.5 часов Хсст 33342 (2 мкг/мл) при 37°С, 4) клетки, обработанные как 2), но затем инкубированные в свободной от красителя среде Игла + 10 % КРС 2 часа пои 37"С

IU Jl'l

(1 ] 1 Ч - \ ' ч

4.ВЫВ0ДЫ.

1) Продемонстрировано, что предлагаемые методические подходы расширяют возможности проточной цитометрии и могут быть использованы для изучения динамической организации генетического материала в клетках млекопитающих.

2) Показано, что при определенных условиях фиксация глутаровым альдегидом позволяет регистрировать различия в структуре хроматина между клетками разной дифферснцировки и разных стадий клеточного цикла.

3) Обнаружено, что обработка ядер лимфоцитов однонитевой ДНК, но не близкими по физико-химическим свойствам двунитевой ДНК или РНК, приводит к раскрытию хроматина и увеличению связывания флуоресцентных красителей. Высказана гипотеза, что наблюдаемое явление может быть связано с изменением структуры хроматина в местах расплетения ДНК.

4) Предложен оригинальный способ заключения клеток в полиакриламидные частицы клеточного размера, проницаемые для белковых молекул. Это позволяет частично или полностью убирать из них клеточные компоненты, сохраняя их в виде дискретных .частиц, удерживающих всю. клеточную ДНК.

5) Исследование .процессов удаления из ДНК клетки нековалентио

связывающегося по малой бороздке красителя Хест 33342 позволило

л ■

предположить, что наряду с удалением красителя из клеток за счет < транспорта, существует метаболически' зависимый процесс , активной диссоциации Хест 33342 из ДНК.

. 6) Продемонстрировано, что процесс активной диссоциации Хест 33342 из ДНК зависит от топологии ДНК и может быть подавлен ингибиторами топоизомеразы 2 и разрывами в ДНК.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1) Филатов М.В., Варфоломеева Е.Ю. Изучение упаковки хроматина в ядрах клеток млекопитающих методом проточной цитометрии. Цитология, 1990, т.32, N4, стр.343-350.

2)Меерсон Ф.З., Малышев И.К)., Варфоломеева Е.Ю., Варфоломеев Д.Б., Ноекин Л.А. Адаптация организма к стрессовым воздействиям повышает устойчивость ядер сердечных клеток к повреждающему действию одноннтевой экзогенной ДНК. Бюллетень Эксп. Биологии и Медицины, 1991, N5,стр. 460-462.

3) Филатов М.В., Варфоломеева Е.Ю, Варфоломеев Д.Б.. Кот.юванова Л.В. Новые возможности изучения организации и функционирования генома клеток млекопитающих путем заключения клеток в полиакриламидные шарики клеточного размера. Бюллетень 2 Международной конференции "Геном человека", 1991, стр.28-29.

4) Носкнн Л.А., Варфоломеева Е.Ю. и др. Новые клинические и биологические аспекты использования метода проточной цитометрии. Конф.доклад на 2 Всесоюзном совещании "Люминесцентные методы в биологии и медицине", Москва, 16-22 февраля 1992 г.

5) Филатов М.В., Варфоломеева Е.Ю. Демонстрация конформацнонных изменений ДНК в клетках млекопитающих in vivo с помощью бисбензимидозольного красителя Хест 33342. Цитология, 1992, т.34, N 9, стр.112.

6) Filatov M.Vfrfolomeeva Е. Active dissociation of Hoechst 33342 from DNA in living mammalian cells. Mutation research, 1995, v.327, pp.209-215 .

7) Filatov M.,Varfolomeeva E. Flow cytometric characterization of chromatin dinamic organization. Cytometry., 1994 suppl.7 p. 30.

8) Varfolomeeva E., Filatov M., Ivanov E. Measurement of oxigen radical production in cells. Cytometry, 1994, suppl.7, p.29.

9) Filatov M.,Varfolomeeva E.,Varfolomeev D. Method of incorporation cells into polyacrilamide spheries. Cytometry, 1994, suppl.7.p.26,