Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Определение характеристических параметров эритроцитов методами динамической проточной цитометрии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Определение характеристических параметров эритроцитов методами динамической проточной цитометрии"

На правах рукописи

Тарасов Петр Александрович

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ЭРИТРОЦИТОВ МП ОДАМИ ДИНАМИЧЕСКОЙ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ

03 00 02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

—■

Новосибирск - 2005

Рабии пьмюлнсма в Научио-исследовагс 1ьском Институте чимичилон мшмики и горения СО РАН

Научный руководитель

Научный консультант

Официальные оппоненты

доктор физико-математических наук Мальцев Валерий Павлович, кандидат физико математических наук Чернышев Андрей Витальевич доктор физико-математических наук старший научный сотрудник Белобров Па р Иванович

Ведущая организация

доктор физико математических паук старший научный сотрудник Парамонов Леонид Евгеньевич ГУ НИИ физиологии СО РАМН (г Новосибирск)

Защита состоится '' 1 с. "_мая 2005 г в К!'6 часов на заседании диссертационного

совета Д 003 007 01 при Институте Биофизики СО РАН по адресу 660036 Красноярск Академгородок д 50 стр 50

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Биофизики СО РАН

Авторефсрл! рлюслан " О ' стрспи_ 2005 г

капдйд.п фишко-маа'м.пнмсскич паук

II ( Ку фяшсна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальност ь проблемы

Эритроциты (красные кровяные тельца) являются основными клетками крови где выполняют преимущественно транспортную и буферную функции В цельной крови человека концентрация эритроцитов на порядок превышает концентрацию остальных клеток, и их корпускулярный объем составляет около 50%

Нормальные эритроциты человека имеют форму двояковогнутого диска В отличие от большинства других клеток эритроциты млекопитающих лишены ядра Кроме тою, в отличие от тромбоците, так же не имеющих ядра, эритроциты более устойчивы к внешним воздействиям, т к в их задачу входит не активация в ответ на изменение состава окружающей среды, а устойчивость к периодическим деформациям при циркуляции в кроют оке Уникальные свойства данной к тетки, такие как несферическая форма с большим «запасом» на увеличение объема и высокая эластичность мембраны, делают эритроцит довольно чувствительным осмометром Данное свойство легло в основу изучения кинетики трансмембранного переноса веществ методом коллоидно осмотического гемолиза

Эритроцит морфологически устроен относительно просто Нормальные клетки популяции имеют подобную форму и узкое распределение по концентрации гемоглобина Именно относительно высокая однородность эритроцитов и повторяемость значений характеристических параметров данных юге ток облегчает регистрацию чюбых изменений, вызванных патологией в организме in vivo, или постановкой эксперимента in vitro Поэтому даже простые эмпирические методы исследования ансамбля красных кровяных телец оказываются достаточно информативными

Персчисченные факторы послужите причиной того, что эритроциты являются одним из основных объектов в проведении клинического анализа крови Детальный ана ги * популяции эритроцитов показывает, что фитроциты одного ор1анизма не являются полностью подобными друг другу ни морфологически, ни биохимически даже в норме Время жизни зрелого эритроцита в кровяном русле составляет около 120 дней, в течение которого клетка «записывает» состояние организма за данный период, что отражается на изменении ее параметров Современные гематологические анализаторы позволяют измерять не только средние величины параметров популяции клеток, но и распределения по параметрам Для эритроцита типичными измеряемыми параметрами («индексами») являются объем (V) и показатель преломления, который практически полностью определяется концентрацией гемоглобина (НВС)

Постановка вопроса о происхождении и формировании распределения эритроцитов по индексам НВС и V в норме делалась неоднократно и самими разработчиками гематологических анализаторов В резулпате был сделан лишь качественный вывод что распределение складывается из увеличения ширины функции распределения в процессах рождения и созревания клеток природа и величины которых неизвестны до настоящего времени

Проточная цитометрия выгодно отличается от других методов измерения параметров эритроцитов, так как позволяет исследовать свойсгва одиночных клеток в режиме поштучною анализа в потоке до 1000 клеток в секунду и более С гидродинамической точки зрения большинство современных гематологических анализаторов представляют собой раз точные модификации проточных цитометров Недавно было предложено новое направление в проточной нитометрии обеспечивающее уникальные возможности для измерения угловой зависимости интенсивности свеюрассеяния от одиночных частиц, и каь следствие для морфологического анализа клеток - сканирующая проточная цитометрия Сканирующий проточный цитомегр (СПЦ) позволяет регистрировать дифференциальное сечение рассеяния - индикатрису в диапазоне углов от 5 до 120 градусов без принципиальных ограничении по угловому разрешению Для сравнения метод 2ALS (2 angular light scattering), который используется в последних моделях гематологических анализаторов, основан на регистрации светорассеяния от объектов всего в 2 фиксированных тенсых угла (два измеряемых параметра) Тем не Mtuec используя метод 2ALS удалось впервые измерить совместное распределение эритроцитов по индексам (V0 НВС)

Термич динамическая проточная цитометрия появился недавно и связано с проведением кинетических измерении на цитометрах По причине относительно сложной постановки эксперимента и необходимости разработки математических моделей для интерпретации изучаемых процессов, данное направление остается мало разработанным К настоящему времени существенный прогресс достигнут в разработке устройств автоматической подготовки пробы, которые позволят расширить диапазон характерных времен регистрирусмых процессов с минут до секунд

Диссертационная работа посвящена использованию подходе динамической проточной цигометрии к разработке новых способов анализа популяции эритроцитов Данные способы можно подразделить на прямое измерение параметров частиц и анализ их поведения в кинетическом процессе

Цель работ ы

Целью данной диссертационной работы является разработки новых методов характеризации популяции эригроцитов человека с помощью сканирующего проточного цигометра Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи

исследование ориентационнои динамики одиночного эритроцита в градиентном потоке с целью оптимизации гидрофокусирующеи системы сканирующего проточного цитометра для задания предопределенной ориентации несферической клетки,

разработка метода определения характеристических параметров нативных эритроците по светорассеянию на сканирующем проточном цитомере

- разработка методики идентификации эритроцитов сферической формы по светорассеянию,

адаптация методики сферизации эритроцитов с сохранением объема применяющейся на современных гематологических анализаторах для иепользования на сканирующем проточном цитометре

адаптация сканирующего проточного цитометра для измерения кинетики гемолиза эритроцитов в изотоническом растворе хлорида аммония

разработка математической модели кинетики гемолиза эритроцитов и экспериментальная проверка адекватности модели

Научная новизна Научная новизна работы определяется следующими наиболее значимыми результатами

Впервые продемонстрирован автоматический способ анализа популяции нативных эритроцитов человека по нескольким характеристическим параметрам

В работе на примере эритроцитов впервые продемонстрирован метод определения степени несферичности микрочастиц по индикатрисе светорассеяния Благодаря этому в процессе гемолиза эритроцитов в изотоническом растворе хлорида аммония в реальном времени впервые измерена динамика появления и лизиса сферизованных клеток

Впервые сканирующий проточный цитометр использовался для измерения кинетики процесса на минутных временах

В данной работе впервые для анализа результатов кинетического эксперимента построена и применена статистическая модель, описывающая динамику функции распределения эритроцитов по параметрам в процессах ко шоидно осмотического лизиса на минутных временах Используемая в работе модель лизиса в хлориде аммония развивает новое представление о статистическом механизме разрыва клеточной мембраны

Практическая ценность

Проведенная работа позволила развить потенциал технологии сканирующей проточной цитометрии для кинетических исследований в биологических дисперсных системах Предложенные методы характерюации эритроцитов буду! иеппль¡ованы при разработке новых методов анализа в гемагологии на базе сканирующею проточною питометра СферШсЩИЯ эритроциюв t сохранением объема является одним из приемов упрощения формы клеток, в результате которого повышается информативность их характеристик Предложенный в работе способ определения степени сферичности эритроцитов позволяет на сканирующем проточном цитометре отрабатывать методики в которых требуеуся получение объектов с формой близкой к сферической литературные о

формировании распределения эритроцитов по г

индексам) могут быть использованы для интерпретации измерений полученных на существующих а также в

моделировании процессов старения клеток динамики несферических части в потоке с

рафаооткс I идро шнамическои чаеж приборов, иыю 1ыуч>щих принцип 1 и фофокусировки

На защиту выносятся следующие положения:

1 Разработанная I идродинамичес кая система сканирующею проточного цитометра

в зону измерения в заданной ориентации при которой длинная ось клетки огк юняегся на утл, не превышающий 6 градусов относительно При этом за время измерения индикатрисы светорассеяния, дезориентация клетки в тестируемой зоне не превышает ~ 2 градусов

2 Эритроциты с индексом сферичное I и 0 93 и выше идентифицируются по Фурье обращу их индикатрисы светорассеяния При этом амплитуда основного пика Фурье образа нормированная на амптитуду нулевой частоты, равна или бо (ьше 0 25 Разработанный и

обоснованный подход индекс сферичности

фигроцитов широком 1иапачопе объемов (74 100 фл) и концентрации гемоглобина (31 36 г/дл)

(среднее значение и полуширина распределения по популяции) эритроцитов человека ь норме имеют следующие величины произведение эффективной проницаемости мембраны к осмолитам на площадь клетки (среднее -141 0 02 мкм7сек полуширина - 0 33 ±0 02 мкм'сек) параметры времени образования гемолитической поры в мембране напряжения

(104 з: 17 дин/см) в мембране

Апробация работы

Основные результаты диссертации представлены в 7 публикациях, включенных в прилагаемый перечень Содержание диссертации докладывалось на международном симпозиуме сБиомедицинская оптика» (BIOS, Сан-Хосе, США, 23-29 января 19991 , 22-27 января 2005 i) на IV международном совещательном семинаре «Фундаментальные науки в деятечьности Международною Научно-Технопогического Центра», Новосибирск, 23-27 апреля, 2001, на Европейской Конференции по Ьиомедицинской Оптике (Мюнхен, 1 ермания, 22-25 июня 2003 г), на XXII-OM Конгрессе Международного Общества Аналитической Цитологии (Монтпелье, Франция, 22-27 мая 2004 г), на IV-fí Международной школе молодых ученых и специалистов (Томск, 27 июня - 3 июля 2004г), а также на научных семинарах и конкурсах в Институте химической кинетики и горения СО РАН (Новосибирск, 1998-2004 г), в отделении Национального Агентства Италии по Изучению Новых Технологий, Источников Энергии и Окружающей среды (ENEA, г Фраскати, 2003 г) Результаты исследований вошли в курс лекций «Биокинетика» кафедры биомеди пинской физики Новосибирского госуниверситета Публикации

Основное содержание изложено в 4-х статьях в рецензируемых журналах, в тезисах докладов 2-х конференций, а также в одном 1ехни"еском отчете Структура диссертационной работы

Диссертация состоит из введения, четырех ыав, заключения и списка цигирусмой литературы, включающею 151 наименование Диссертация изложена на 110 страницах, включает 2 таблицы, 30 рисунков и список используемых обозначений

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, определены цель и задачи работы, сформулированы основные положения, выносимые на защиту, и дано краткое описание диссертации по главам

Первая глава является обзором научной литературы, связанной с темой данной работы как имеющей значение для биофизики клетки в целом, так и сфокусированной на изучении свойств эритроцита, разработке методов измерения его параметров

Первая часть посвящена изложению необходимых сведений о составе эритроцита Поскольку в работе используется метод коллоидно-осмотического гемолиза в растворе хлорида аммония, дано описание транспортного белка полосы 3 и механических свойств мембраны клетки Концентрации основных составляющих цитоплазмы эритроцита известны достаточно хорошо Блаюдаря своему относительно простому строению эритроцит был

выбран в качестве первого обьекта для создания полной схемы клеточного метаботизма ш sihco В настоящее время полная модель далека от завершения и многие вопросы, в том числе метод расчета буферных свойств клетки остаются открытыми

В конце первой части просуммированы сведения касающиеся формирования распределения клеток по свойствам т vno Описаны оиохимическис маркеры С1арения эритроцитов Рассмотрено изменение параметров на протяжении жизни клетки в русте крови

Во второй части рассмотрены жеперименталъные решения, позволяющие измерять характеристические параметры эритроцитов Преимущественно рассчофсны мего|ы, позволяющие измерять или оценивать основные морфологические параметры объем клетки концентрацию гемоглобина и площадь мембраны (V НВС V) Описаны методы опгическои микроскопии турбидиметрические методы и!мерения ансамбля клеток спсктрофотометрическии метод, традиционная проточная цитомефия контукюметрическии мешд чеюд дв>ху1 гового рассеяния меюд механического вшивания я микропинегку методы и приложения предваритепьпо! о разделения клеток а также ipyi не еще не нашедшие системашческот применения подходы (.вязанные с современным развитием экспериментальной техники

Наиболее про (ушивпыми в морфоло! ичес кой харакгеризации .»ритроцчюв остаются оптические методы исследования I (омимо оптической микроскопии основной након 1енный материа.1 об оптических cbohcibix )рифоцитов базируется на измерении светсрассеяния в диекоегныи набор умов Для харчк1ери<апии клеток по светорассеянию на проточном циюмегре сындаршои конфигурации обычно измеряются рассеяние в ша yi ювнх диапазона (от Ч 0 до 5 5 ipajvcoB и oí ~> 5 до 9 0 градусов полярного >гча) В своей ocjiobl метод двух/глового светорассеяния (2 angular light scattering 2 МЛ) еводи1ся к методу уз IOB прямой задачи рассеяния в двумерной плоскости Оси плоскости образовали значениями ишенснвностеи рассеяния и да? ie ¡есных угла Ceib 2ALS обрадавана V3iaMH причем интенсивности в утх рассчи1ываютея по етроюн теории Ми для сферических частиц К недостаткам мегощ 2AIS можно отнести с*»ществование обтасюи с множественными решениями обратной ¡адачи светорассеяния и необходимость калибровки

Существенно больше информации о характеристиках частицы можно изв 1ечь ит знания угловой зависимости ин1енсивности рассеянного света индикатрисы Нопьпки измереиия индикафисы светорассеяния на цитомсфах нре ¡принимались неоднократно Все они не нашли широкою применения либо из за большого ко шчества фотонриемникоз, либо ма тою углового разрешения, а также низкои чуветвитетьноети, ечожносги в настройке, калибровке

Основные недостатки приборов, и ¡меряющих угловую зависимость сигнала светорассеяния от одиночной частицы, были преодолены в оптической системе сканирующего проточного питометра который и был использован в данной работе

Далее рассмотрены методы анализа популяции эритроцитов, нашедшие свое применение в диагностике Таковыми являкнеятеи на резистентнойъ ею автоматшация на базе прибора «Фраджилиграф» Как автоматизированная альтернатива к тесту на резистентность на основе идеи Ponder И А Тереховым и ИИ I итсчьзоном (1957) был детально разработан метод дифференциации эритроцитов по кинетике изменения прозрачности взвеси клеток при разрушении в растворе гемолитика После сравнения нескольких лизирующих веществ ь качестве рабочею раствора был выбран водный раствор НС1 с концентрацией 0 004 М В последующие десятилетия была подтверждена информативность этого метода в диагностике Для характеризации деформационных свойств эритроцитов часто используются фильтрационные методики Наблюдение же деформации клеток в сдвиговом потоке легло в основу прототипа глиническот о прибора - эктацитометра

Достаточно полное представление о современном рынке анализаторов дают приборы всемирно известных компаний

Все анализаторы используют

принцип ироючной цитометрии Обьем цельной крови, забираемой для анализа, продиктован необходимостью набора по субпопуляциям лейкоцитов и составляет

от 100 до 200 микролитров Количественный анализ параметров отде гьных эритроцитов представ 1ен и<мерением объема кондуктометрическим методом и, в случае серии ADVTA (Bayer) решением обратной )ддачи светорассеяния методом 2ALS Вес анализаторы измеряют такие параметры как количество и суммарный объем эригроцшов Оемаюкрт) количество гемоглобина в единице обьема пробы Ни измерение какого-либо теста на резистентность клеток ни определение деформационных свойств эритроцитов в данных анализаторах не предусмотрено В современных гематологических приборах, как правило проба модифицируется для удобства измерений Например, проводится фиксирование клеюк или сферизация с сохранением объема в нрисугстгии детер1енга Эти процедуры ктетки далеко модификации

Как указывалось выше, только для данных, полученных на гематологических анализаторах, использующих принцип в 90-х годах делались первые попытки

применения математического аппарата для патологий по форме измеряемою

двумерною распределения Необходимо отметить, что существенная часть работ по биофизике эритроцитов в проводилась с участием исследователей

компании Bayer и ]акже с применением принципа 2ALS

Последующие главы представляют результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы

Во второй главе рассмотрены инструментальные аспекш данной работы В первом парафафе рассмотрен принцип и схема сканирующего проючною питометра {СПЦ) использованного в жеперимешах Угловая зависимоетъ индикатрисы, измеренной на данной конфигурации СГ1Ц, зависит 01 эдеменга 5ц матрицы рассеяния частицы, ичеющеи ось симметрии (каковым полагаеюя эритроцит)

/,(0)- Дзг,,се,Ф)1*Р (1)

о

В основе всех приборов, рабошощик на принципе проточной циточетрии, дежщ I идрофокусирующая система 1е основное преднашачепие сосгош в доставке микрочастиц пробы в зону измерения в ни (с юнкой струи диаметром на порядок меньше юпцины облегающей жидкое! и Известным побочным )ффектом плрофокусирующси сис1смы является преимущественная ориетация несфсрических чаоиц наиболее вьияну|ым размером «по направ 1снию движения поюка» на выходе I и 1,х фокусировки

Часю встречающаяся пробтема при анализе песферичсских час1иц омическими чеюдами влияние

поворота обьекта па и ¡меряемый сигнал и, как с 1едствие, иояв юние юнолнигс |ЬНои «параадпюи» с/епепи свободы п решении обратной .адачи светорассеяния Измсршьльная сис!ема СПЦ не ч>всгмпслы1а к поворот^ частицы вокруг оси потока, и обыкновенная 1 идрофокусировка с <<огкрыгой струей» спо< обна решшь проблему получения клеток в одинаковой ориентации Но по техническим соображениям СПЦ являема цитометром «с закрытой сфу^й» те в ноюке присутс!вую1 поперечные грациенгы скоростей, вызывающие вращение частиц и, как сюдивие их размешивание по ушам поворота после гидрофокусировки

Во втором параграфе произведен теорешческий расчы 1Идро (инамической сис!емы СПЦ, с целью ее оишмизации для получения возможности измерения несферических клеток при заданной одинаковой ориентации Все резулыаш в данной части приведены для типичных параметров СПЦ диамеф капипляра сканирующей кюветы 250 микрон средняя

Делите льнуи / 1 \

*/бис \ | У у реп а л <~ка> лру»ювпта

Обь „и.Г"?/ Ггчи 4 П»1жмап>Р

^ л ''

гфг _чл

'О

и ^

Магка — - - • ЛинМ г"

Рис 1 Ошичсскря схема сканирующею проточною питометра

скорость потока по сечению капилляра ~1 5 м/сек Радиус сферического зеркала сканирующей кюветы равен 3 5 мм Сканирование индикатрисы по углам от 70 до 10 1ра;[ус(1В приблизительно соответствует движению частицы в кювете в диапазоне от 1 34 до 2 2 мм, считая от входа в сканирующую кювету

Несферическая клетка на примере эритроцита моделируется сплюсну 1ЫМ сфероидом Основной интерес в данной работе представляет поведение несферической клетки, взвешенной в потоке вблизи его центра Считается, что движение складывается из

равной скорости потока в данной точке и обусловленной движением жидкости на масштабе частицы Скорость

движения частицы можно оценить как скорость невозмущенного потока (без частицы) в данной точке Для расчета вращательною движения применимо приближение Стокса, когда в уравнении можно пренебречь инерционными

членами по сравнению с вязкостными В приближении Стокса для расчета вращения

профиля скоростей

В рамках Стоксова приближения рассмотрено вращение сфероида в параболическом профиле скоростей Просфансшенный периот поворота в данном приближении не зависит от скорости потока и равен

отношение главных - радиус капилляра, - смещение

траектории объекта от центра потока

оценка преобразования углов при прохождении частицей сужаюшегося конуса гидрофокусирующей системы

относительно направления капилляра на входе и выходе I мдрофокусировки В рам ин.юто'ратйпся и ж е н и я

ориентированности сфероидов зависит от отношения диаметра входного выходного отверстий гидрофокусировки и слабо зависит от

гидрофокусировки На Рис 2 показано расчетное сфероидов

диаметрами входною отверстия Видно, что можно получать достаточно узкие распределения сфероидов по Остается

сохранить распределение по углам поворота на протяжении всей зоны сканирования

}то проще сделать при неустановившемся течении в кювете, ко1да еще малы градиенты скоростей, вызывающие вращение сфероида

10=я(*+-1) я /у, « пк Я7/у0

ь>

(2)

(3)

Задачу описания течения в переходной зоне между входом в трубу и установившимся течением обычно решают в приближении однородного распределения скоростей по профилю трубы на входе Данное предположение выполняется тем лучше, чем более резким являете я сужение в трубе Дальнейшее решение основывается на различных предположениях о характере пограничною слоя Для характеристик системы СПЦ, использовавшейся в работе, переходной процесс представлен на Рис 3 При этом использовалось решение Буссинеска

о 1 2 3 4 5 150 тоо 'Л 1 ¡0 то, 1.0

угол грчдусор

расстояние рг о( и ьзпиппйрт мкч

Рис 2 1'асчешос распределите сфероидов а 4 по Ри~ 3 Учетное усыновление профиля скоростей в >, мм штпр>м посте имрофокустрчкщ.и сис (смп гитротиначичскои сис 1счс СПЦ на промежутке от О СПЦ при р тичных входных диаметрах 2 мкшшчстров от входа а сканирующую кювету

Предварительные оценки показывают, тго система ц тя шмерения несферических часгии должна обладал с тс тующдми характеристиками

тиамеф в\о итого отверстия гндрофоку! ировки делжен на поря цж превышать диаметр выходит о (в 10 и ш бо ]ыне раз)

ичмерения леплены проводится в области неустановившегося течения в трубе, где малы градиенты скоростей на оси потока Иначе говоря, помимо естественною ограничения сверху на вепичин> скорости потока, {шатаемою /с товием ламинарноетт» течения, лт каждой величины диаметра ьапиллярц такл>е существует нижний тшро] скоростей

Речульташ приведенных вычис тении испо тыукнс,т ниже для по тучетшя оптимальных юометрических параметров тидрофокусиругошей сис.смы при аналше имеряемою распределения тритроцигов в потоке но углам поворота

1ретья пава чосвяшена математическому моделированию коллоидно осмотическою гемолим с учетом распределения эритроцитов по параметрам

В первом параграфе изложены представления о коллоидно осмотическом гемолше, представлена модель теста на резистетность С,чи1ае1СЯ что объем эритроцита равен сумме осмотически активной и неактивной частей

где У„ - приблизительно соответствует объему занимаемому водой V/, определяется объемом 1емо1лобипа В ходе сферизации клетки трансмембранныи перечад давления мал и им пренебрегаЮтощадь мембраны также считается постоянной при сферизации Тогда разница осмотических давлений внутри клетки и снаружи равна нулю

Здесь первая сумм) производится но концентрациям цитоплгзматичгских компопешов [(] с соответствующими осмотическими коэффициентами ф И$ нес вычитается аналогичная сумма по концентрациям внеклеточных компонентов Кончен грации компонентов (осмолигон) в уравнении (5) рассчитываются на осмотически активный объем Считается то при изменении обьема эритроцита и таком процессе количество внутриклеточного 1СМ01 юбина (основной сосмвляющеи осмотически неактивного обтема) сохраняется и следоватечыто значение полного осмотически неактивною объема кле[ки ке меняется Концентрационная ¡аиисимость осмотического коэффициента вводится юлько утя одного внутриклеточного компонента гемоглобина счедуюшим эмпирическим

где концентрация гемот юбина выражена в мМ'чигп Гелгг кле1ка сферизовадась, дальнейшим прирост объема иди с увеличением площади мембраны, что увеличивает внутриклеточное давление всдедствие упругою растяжения мембраны

*Т ¡Ъ. [с.^-Ь*, [сД„

И Д с 1

(Л

50 ,

Символами ?о и ^ обозначены исходная и во ¡росшая П'ЮЩади мембраны, г - радиус сферизованного <ри грощл а, К - модуль упругости мембраны При моделировании геста на резистентность считается, что ввиду дтитедытотти проведения теста (порядка часа с цен грифутированием и анализом) успевают лизировать все клетки с пену левым растяжением мембраны

Во втором параграфе рассмотрена феноменологическая модель растворе хлорида аммония, испо хьзуемая в данной работе

В первом приближении для отработки методики моделирования процесса и

поиска основных закономерностей было решено использовать «модель пассивной диффужи

13

осмотического эквива тента» N Согласно условиям эксперимента внеклеточная концентрация эквивалента [Л^оы равна изотонической, Г'ч'Н4+]ои1+[ГГ]ои1, а начальная внутриклеточная концентрация [/V] равна нулю

Соответствующая система уравнений включает дифференциальное уравнение на

в клетке и

обе стороны мембраны

(8)

Здесь обозначения / - время, [А/] - концентрация осмотического эквивалента в клетке в расчете на осмотически активный объем, [Л], ,„ его концентрация вне клетки, р эффективная проницаемость клеточной мембраны д Ы, я - начальная площадь мембраны, осмотически активный объем, количество внутри клетки из

начальных условий N-0 ¡'„-Кл при ¡-0). фт, фта - соо|вегсвующие осмотические коэффициенты, для ф, учитывается зависимое 1Ь (6) ог концентрации ] смоглобина

В условиях растяжения уравнения анатогичны (8), за исключением ненулевой разницы осмотических давлений внутри и снаружи к тетки за счет упругого растяжения мембраны

(9)

тде коэффициент задает изменение проницаемости клеточной мембраны при ее

растяжении

Согласно данным, полученным в последние образование поры в мембране можно

рассматривать как случайный процесс, от степени натяжения

мембраны, и распада клетки можно охарактеризовать постоянной времени

согласно уравнению

с/ , ч п(/)

п(1)--->-

си т

(Ю)

тде я количество клеток ( ненарушенной мембраной, при этом сама постоянная времени образования гемолитической поры натяжения мембраны

следующим образом

где ао И То - параметры, характеризующие популяцию клеток, а а - мембранное напряжение Напряжение в мембране увеличивается в ее растяжения, что приводит к

зависимости г от времени, и, подставляя уравнение (11) в уравнение (10), получаем време***""" -------------~ ™"нными параметрами

где нулевой момент времени соответствует началу растяжения мембраны эритроцита

Адекватность представленной модели кинетики гемолиза эритроцитов была jKCriepMvieHiajibiio проверена с помощью ОПЦ В хо ie исследования бьпо обнаружено, что рост объема клеток в стадии сферизации резко замедляется (фактор уменьшения проницаемости мембраны у) Учет чанного фактора в модели привел к согласию с литерагурными данными по величине параметров о и то а также уменипи i в шянис ре ¡кой зависимости времени лизиса от величины растяжения мембран11 на временной хо ( i емотша <рифоцитов PesyibTaibi эксперимента гьной проверки адекватное га моде те обсужд потея в •leíверши главе диссертации

В данной модели мы пренебрегли временем

гемолитическою пору Из сделанной в рабою оценки стелет "по размер гемо шшческой

поры должен быть не менее 300 нанометров, чтобы времена впхода 1емо1 юбина соиавляли секунд и менее чю согласуется с литературными ынными

В конце параграфа проводится обсуждение д<ма1ыюи схемы гемочта в NH4CI Типичный состав коммерческого i емо шчирующег о раствора на основе хторичл гммония N11,С! ( 15М) NdllCO-. (-10 шМ), двунатрисвая соль Г)ДТА (~1 mVU, рН-7 4 Как покачано

такой состав paciBopa не является сл>чайным Лизис чритроцигор и растворе солях аммония осуществляется благодаря каскаду реакции, ишестному как цикл Якобса-Стюарга В пренебрежении буферными свойствами клетками и зависимостью скорости работы транспортного белка почосы 3 от рН и других факторов сделана оценка времени сферюации эритроцита -40 секунд что согласуйся с экспериментом

В третьем параграфе рассмотрено формирование совместного распределения человека по морфологическим индексам в норме

основное изменение площади поверхности и объема клетки объясняется образованием ве шкул во второй части жизни эритроцита в предположении что на месте каждой везикулы образуется «аншген зре'юсж»

схемы формирования распредечения индексам сколь угодно точное гьмерение параметров клеток будет иметь офаниченное

практическое применение, ввиду эмпиричности методов аналим получаемых совместных распределений Накопленного в мировой литературе фактическою материала и современною уровня развития методов измерения одиночных клеюк достаточно для начала детальною изучения мотели формирования распределения эритроцитов но индексам и другим параметрам По-видимому, построение подобной модели дело ближайшего будущего Наводящими соображениями в таком построении могут еду жить изложенные в данном параграфе предположения о корреляциях параметров в распределении эритроцитов

В четвертой главе представчены методы и результаты экспериментальных исл ледований

В первом параграфе описаны а'норигмы измерения сферизованныч клеюк на СПЦ специализированного алгоритма характеризации сферизованных эрифоцигоь ч данной работе за основу быд взят подход, суть которою состоит в построении решения обратной задачи светорассеяния

индикатрисы

При этом не исходная угловая зависимость индикатрисы а ее

модификация произведением с пиковой функцией от углов

Положение пика основной частоты I'/ в Фурье образе модифицированной индикатрисы напрямую связано с размером сферической часгицы Нормированная амп 1И1Л"(а танкою чем уже резонанс в сигнале светорассеяния на частице и, в опре (елейных сдучаях но может служить критерием сферичности объекта Для построения решения обратной задачи в качестве параметров

в (ианаюнеот 10 до 100 тра 1У(.ов от индикатрис/умноженной на пиковую функцию

Для длины во ты рассеиваемого света равной 632 8 нм радиус измеряемой с ф егр^ы и

следующие зависимости от параметров индикатрисы

(13)

гче 0/ 10° и Oí, ~ 70°— максимальный и минимальный уг 1Ы измеряемой индикатрисы

100

(14)

10

НВС ос J т ¡P,, const »0 43

нвсв 31 2 г/дл V0=74mkm - НВС =33 7 r/дл v0 88 мкм3 -НВС 36 2 r/дл У-102 мкм

-4-

fc-=ir

06 07 08 09

Отношение осей сфероида f

Для оценки применимости параметра А/в распознавании сферических и нссфсрических эритроцитов было проведено моделирование светорассеяния для о 45 сфероидов по методу Г матриц о4о

Расчешос поведение 4/ при ¡ 035 сферизации с сохранением площади | озо

я

сфероидов показано на Рис 4 В g 025

н

качестве «начальных значении» для ? 020

с S

сфероидов был за^н одинаковый " 015 средчии индекс сферичности и ом значения остальных нарамсфов, хартктерные для нашвннх rvt 4 Зшисидаиь ау||ЛИ1уД1, Ш1ка основн„и ЧЖ,Г01Ы Af

тифонитв человека Показано что >«>г™р™анни.о """Р* модифицировав™ индимгриш от

они шения ni тных осей сфероида (

нпевышение парамефом /1/

■ раничнот значения равного 02") можеi служить кршериеч достижения >ри фонтом формы сфероида с о i ношением i пвных осей f 0 94 При сферизации с сохранением площади поверхности ло соответствует достижению обьема -0 93 oí сферическою чю было учтено при анализе рсзу1ьгаюв и мерения кинетики тизиса в хлориде аммония Ногрешноаь определения объемов получаем! ix еА^роидов е А/А) 25 соиавляе! менее 5%

К настоящему времени алгориш [)ешения обртшои задачи еветор 1еееяния применим к t тедующем) диапазону траметров

V сфсризовашго! о эритроцита от 30 до 250 фемю iii[ров НВС от 5 и до 50 i/ол

Далее на Ряс 5 приведены

&

рез> HTiTi.i измерения )питроциюв q

человека и мыши, сферизованных с сохранением объема еотласно методике, иепопьзуемой в современных i емаютог ических анализаторах Сферизация

m

45

!

40 I

í

35 30

!

25

мышь

20

40

_______________ I

60 80 10Г 120 140

V, мкм3

Рис 5 йшерсние на СПЦ распреде¡еннн двух 1емагого1И(сских осущеавдялась разбавлением в шшексов четдоч сферизации с сохранением обьема

гоигроциток чс ювека и чпши

Течение одной мину ты цельной

крови в охношении 1 50 в забуференном физио 101 ическом растворе, содержащем 0 003% додецилсульфата натрия (ДСП) с последующим рссуспендированием клеток в отношении

1/25 в фиксирующем забуференном физиологическом растворе, содержащем 0 1% глугарового альдешда и 0 001% ДСН показано, что часть клеток не является сферами Гем не менее, их форма близка к сферической с £>0 93 Значит, несмотря на то, что происходит неполная «сферияция», ошибка определения на СПЦ объема анализируемых, клеток состав тает менее 5%

Во втором пара1рафе приведены резулыанл анализа индикатрис нативных эритроцитов моделировании светорассеяния на данных клетках в квазиклассическом приближении (приближении ВКБ) и методом аппроксимации дискретными диполями (discrete dipole approximation - DD \)

несмотря на качественное согласие экспериментальных и рассчитанных индикатрис необходимо отметать существенные недостатки данного метода Многообразие жснеримешальмых индикатрис определяется в сущее геенной степени углом эритроцита направления падающею излучения, а не только

распределением kiciok но свийивам Из чею и возникла необходимость поиска путей усовершенствования системы с целью уменьшения разброса по углам

поворота измеряемых несферических частиц Индикатриса с наибольшим контрастом среди экспериментальных всегда имеет меньший контраст, чем у рассчитанных что находится в согласии с фактом, что приближение завышает контрасты индикатрисы

Метод DDA на практике не быть для прямой подгонки

данных Время для расчета картины светорассеяния от одного эритроцита в фиксированной ориентации составляло порядка 10 часов уже на современном суперкомпьютере Полому был произведен насчет индикатрис при различных значениях параметров и углов поворота относительно падающего излучения Затем перебором проведено сравнение измеренных индикатрис с рассчитанными в узловых точках и таким образом построено распределение по углам поворота и морфологи клеток Расчетная сетка из за больших вычислительных затрат на данном этапе была одним показателем

преломления, тремя углами поворота клетки и 23-мя узтами с рач шчной морфоло! иен На Рис 6 пре (ставлены распределения полученные в результат обработки индикатрис нативных эритроцитов по объему с данными измерений

методом с сохранением объема Приведены значения среднею (mean) и

стандартных откчонении (SD) соответствующих распределенД гаРис 6 (с) приведены параметры аппроксимации распределения

по упам поворота изложеннои в работе вращения клетки в

гидродинамической системе СПЦ, получены следующие параметры экснернмен i anbHoij установки смещение трека частицы относительно оси и

I I сферизоеанные

клетки П ___ - I ИйИВнагивные-)

Mean SD

' Mean SD 94? 13 0

? 8 £

d—() 60±0 07 мм - эффективный диаметр входною отверстия гидрофокусировки (истинныи геометрический диаметр составлял 0 5 мм)

Восс гаповленные значения

yдoвJIelвopиreльнo согласуются с данными независим),1х измерений, ли |ерагурными значениями и оценками вращения клетки в i идродинамическои системе Все перечисленное свидетельствует в пользу перспективности данною меюда для характеризации популяции нашвных )ритроциюв но морфологическим индексам

В третьем параграфе изложены рс^льтаты чо-периментальною

исследования коллоиню осмотического ючолша

Teci на резисшшность в данной paOoie выыунал в качестве тмсрсния дня получения параметров и?учаемои

ю 20 ад 1,11 /о 75 80 угол градусов диаметр мкм

Рис 6 (,U Распределения loofiiewiM (b) Всксммипенппе вспомогательного распределения ни орие1гациям и (с) iiidMurmi >ритрошпов

популяции фитроцитов Моделирование iecia на резне 1енгное]ь в предположении чю

распределение эритроцитов для данною процесса с хорошей точностью 0нисывас1ся прои¡ведением гауссовых распределения но объему, концентрации гемоглобина и индексу сферичноыи

ФВС) G(K0/KJ ,1б)

Параметры дтя задания распределении по объему и концентрации гемоглобина выбирались из резу ¡ьгаюв по сферизации с сохранением объема Иодюнкои онре1етапись значения параметров распределения по индексу сферичности

Кинетика гемолиза в NH4CI сильно зависяi от конненфации ионов НСОг, те растворенного СО> По>тому воду с лишрующим раствором хлорида аммония сначала «обез1 аживали» кипячепием я микроволновой печи в течение 5 минут, затем доводили до исходной массы анало1ичным образом «обе¡гаженным» дисшллятом, добавляй -1 мМ Ка(1ССЬ,и 8 чМ О 2М буфера IIFPIS (Sigma) Приготовленный раствор использовался в течение полутора часов

На Рис 7 показаны наблюдаемые на цитометре временные зависимости общей клеток в пробе и эрифоцитов, распознанных сферические При

кинетики лизиса предиолагалось что помимо распределения по параметрам испочьлванного в моде мроьании тес^а на резне тсшносгь (16), существует тауссово распределение по произведению параметров (эффективной проницаемости и мембраны нативной клетки) Параметры связанные с кинетикой образования гемолитической поры (сто и а также параметр полагались общими для всей клеток и

также участвовали

подгонке

даннпе и по понка мотелтю

Помимо кинетики участвовали распределения клеток

распознанных как сферические по объему и концентрации гемоглобина, полученные в промежуточных временах сферизации

суммирует значения используемых в подгонке

полуширины для описания тауесовым распределением каждой проекции Серым цветом выделены клетки таблицы содержащие параметры полученные подгонки экспериментальных данных по сферизации с

сохранением объема (параметры и НВС) и осмотического теста на резистентность

Значения параметров (динамические

получены по донкой кинетики рае воре хлорида 1ммоьи« моден ю пассивной диффузии о с м о т и ч агакватаТа к и м

существенно повысить уровень популяции эритроцитов человека, когда наряду е доступными современным анализаторам параметрами НВС появляется характеризовать эритроциты по

денамическим параметрам

Помимо наблюдение стадии сферизации эритроцитов

может простым критерием того вид лизиса по коллоидно

осмотическому механизму В проведенном в работе эксперименте по гемолизу в 0 004 М НО сферические клетки в ходе чизиса не наблюдаются По ВИДИМОМУ В данном случае целостность клеточной мембраны нарушается не в результате ее растяжения

В конце главы нричсден пример вывода, следующего из рассмотрения распределения клеток гго индексам При аппроксимации проекции распределения, используемого в моделировании коллоидно-

осмотическою лизиса на Телица 1 Птрачсфыраитредететшн ииш тыуемого и юдюнке

кинетики лизиса

п юскость параметров (5и, Ио) методом наименьших квадратов зависимостью сделана

оценка диаметра минимальною капилляра кровотока

Полу чешюс значение -3 9 мкм со! тасуется е литературными данными

В заключении

сформулированы основные результаты, подученные при создании методов определения параметров оригроциюв на базе сканирующею проточною цтпомсфа Данные методы являются либо уникальными (измерение площади мембраны) либо оршиналытой адаптацией существующих подходов к сканирующему проточному цигометру с существенным расширением качества получаемых данных

РЫУЛЬГАТЫ РАЬОГЬТ

1 Ратработана 1 идродинамическая иодсль поведения несферической кле1ки в градиентном потоке в сканирующей кювете проточною питометра Рассчитан ориенгационныи эффект в приближении сфероидальной формы эритроцита Предложена оптимальная копфшурация т идрофокусирутощей системы сканирующею проточного цигомстра дпя за тан их опреде теннои ориентации эритроцитов в зоне анализа

2 Предложен метод распознавания сферических эритроцитов па основе анализа их индикатрис светорассеяния Развит метод решения обратной задачи светорассеяния дчя определения следующих параметров сферических эригроцшов но индикатрисе светорассеяния объема кле|ки и концентрации темопобина

3 Применяя моод сферюации эритроцитов с сохранением обьема и метод сферимции эритроцитов е сохранением площади поверхности мембраны, измерены распределения эритроцитов по различным морфологическим параметрам площадь мембраны, обьем, индекс сферичности, концентрация гемотлобина

4 В процессе гемоли!а эритроцитов в шоюническом рааворе хлорида аммония в

Параметр X и-,

Ко, мкм 87 1 102

НВС, грамм/дл 33 4 2 11

0 577 ± 0 002 0 02810 002

/>5о, мкм3/сек 141Ю 02 0 33 Ю 02

v 0 025 ± 0 007

а„, дин/см 104+17 -

х„,сек 3 4/104 ± 1 3"10"

реальном времени измерена динамика появления сферизованных клеток Предложена математическая модель для описания данного процесса в приближении пассивной диффузии осмотического эквивалента через мембрану В результате обработки экспериментальных данных в рамках данной модели оценены основные параметры процесса произведение эффекшвной проницаемости мембраны к осмолигам на площадь клетки, паоаметры времени образования гемолитическои поры в мембране и критического напряжения Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1 Shvalov А N, Soini J Т, Chernyshev А V, 1 arasov Р А , Somi L and Maltsev V Р Light-scattering properties of individual erythrocytes // Applied Optics - 1999 - V 38 P 230-235

2 Semyanov К \ , Tarasov P A Soun J T, Petrov А К , Soini E and Maltsev V P Calibration-tree method to determine the size and hemoglobin concentration of individual red blood cells from light scattering h Applied Optics - 2000 - V 39 - P 5884-5888

3 Semyanov К A and Tarasov P A Measurement ot mammalian erythrocyte indices from light scattering with scanning flow cytometer // in Diagnostic Optical Spectroscopy in Biomedicine II, Georges A et al, eds Proceedings of SPIE -2003 - V 5141 - P 106-113

4 Scmianov К A , I arasov P A, Zharinov А Ь, Cheinyshev A V Hoekstra A G , and Valen P Maltsev Single particle si/ing from light scattering by spectra! decomposition H Applied Optics - 2004 -V 43(26) - P 5110-5115

5 Maltsev V P, Tarasov P Erythrocyte osmotic lysis measured with scanning flow c>tometer ' Cytometry-2004 PARTA59A(1) 144-144

6 Colao b , Fantoni R borani I , Palucci A and Tarasov P Scanning Flow Cytometry a Prospective System for Marine Particulate Classification // Technical Reports of the Italian Agency for New Technologies, Tnergy and the Environment Rome, Italy, - 2004 -RT'2004/60/I IS (ISSN 0393-3016)

7 Yurkm M A , Semyanov К A Tarasov P A, Chernyshev A V , Hoekstra A G, and Maltsev V P Experimental and Theoretical Study of I ight Scattering by Individual Mature Red Blood Cells with Scanning Flow Cytometry and Discrete Dipole Approximation // Applied Optics -2005 - V 44 - P 3240-3247

Подписало к печагн "6" аиредя 20051 Тираж 100 экз Заказ ЛЬ 1416 Отпечатано "Докучент-Ссрвис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, гел 356-600

S*> V i

r o

??

• -) pr

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Тарасов, Петр Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

§ 1.1 Биофизика эритроцита.

1.1.1 Мембрана клетки.

1.1.2 Цитоплазма, метаболизм.

1.1.3 Формирование распределения клеток по параметрам.

§ 1.2 Измерение параметров эритроцитов.

1.2.1 Существующие экспериментальные решения.

1.2.2 Методы, используемые в диагностике.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ УСТАНОВКА.

§ 2.1 Сканирующий проточный цитометр.

2.1.1 Оптическая система.

2.1.2 Гидродинамическая система.

§ 2.2 Анализ гидродинамических эффектов в проточном цитометре.

2.2.1 Вращение сфероида в параболическом профиле скоростей.

2.2.2 Ориентация сфероида при гидрофокусировке.

2.2.3 Установление потока после гидрофокусировки.

2.2.4 Выводы.

ГЛАВА 3. МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ГЕМОЛИЗА С УЧЕТОМ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ ПО ПАРАМЕТРАМ.

§ 3.1 Коллоидно-осмотический гемолиз.

3.1.1 Модель осмотического теста на резистентность.

§ 3.2 Модель лизиса в изотоническом растворе хлорида аммония.

3.2.1 Стадия сферизации.

3.2.2 Стадия растяжения мембраны.

3.2.3 Распад клетки.

3.2.4 Обсуждение детальной схемы гемолиза в ЫЩС!.

§ 3.3 Формирование распределения эритроцитов человека по морфологическим индексам

У,НВС,8) в норме.

3.3.1 Качественная схема старения эритроцитов взрослого человека в русле крови.

ГЛАВА 4. ИЗМЕРЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК ЭРИТРОЦИТОВ С ПОМОЩЬЮ СКАНИРУЮЩЕГО ПРОТОЧНОГО ЦИТОМЕТРА.

§ 4.1 Измерение сферизованных эритроцитов.

4.1.1 Коллоидно-осмотическое набухание клеток, регистрация сферической фазы.

4.1.2 Сферизация с сохранением объема.

§ 4.2 Измерение нативных эритроцитов.

4.2.1 Сравнение экспериментальных индикатрис светорассеяния эритроцитов с расчетами в квазиклассическом приближении.

4.2.2 Сравнение экспериментальных индикатрис светорассеяния эритроцитов с расчетами методом аппроксимации дискретными диполями.

4.2.3 Определение параметров распределения эритроцитов с использованием корреляционного метода

§ 4.3 Экспериментальное исследование коллоидно-осмотического гемолиза.

4.3.1 Осмотический тест на резистентность.

4.3.2 Лизис в изотоническом растворе ЫН4С1.

4.3.3 Дискриминация процессов, идущих не по коллоидно-осмотическому механизму на примере лизиса в соляной кислоте.

4.3.4 Оценка диаметра минимального капилляра кровотока.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Определение характеристических параметров эритроцитов методами динамической проточной цитометрии"

Эритроциты (красные кровяные тельца) являются основными клетками крови, где выполняют преимущественно транспортную и буферную функции. В цельной крови человека корпускулярный объем эритроцитов составляет около 50% (концентрация -4,15-4,9-Ю6 мкл-1), концентрация тромбоцитов на порядок ниже (1,3-4-105 мкл-1), а концентрация всех прочих клеток еще на два порядка ниже. Нормальные эритроциты человека имеют форму двояковогнутого диска. В отличие от большинства других клеток, эритроциты млекопитающих лишены ядра. Кроме того, в отличие от тромбоцитов, так же не имеющих ядра, эритроциты более устойчивы к внешним воздействиям [1], т.к. в их задачу входит не активация в ответ на изменение состава (ф окружающей среды, а устойчивость к периодическим деформациям при циркуляции.

Все это послужило причиной того, что эритроциты являются распространенным объектом исследования.

Число работ по биомеханике эритроцита человека намного превышает количество публикаций, связанных с какой либо другой клеткой [2]. Судя по работам последних десятилетий, научный интерес на таком уровне поддерживается благодаря нескольким факторам:

- очевидной связи между состоянием красных кровяных телец и реологией потока Фкрови в кровеносной системе;

- наметившимся в 80-х годах прошлого века предпосылкам для перехода диагностики в гематологии на качественно новый уровень.

Кроме того, эритроцит служил одним из основных экспериментальных объектов при построении бислойной модели клеточных мембран. Уникальные свойства данной клетки, такие как несферическая форма с большим «запасом» на увеличение объема и высокая эластичность мембраны, делают эритроцит довольно чувствительным осмометром. Данное свойство легло в основу изучения кинетики трансмембранного ф переноса веществ [3, 4, 5, 6] методом коллоидно-осмотического гемолиза.

Эритроцит морфологически устроен относительно просто. Нормальные клетки популяции имеют схожую форму и узкое распределение по концентрации гемоглобина. Относительно высокая однородность эритроцитов по многим параметрам (и схожие величины значений некоторых параметров иногда даже между эритроцитами различных видов животных [7]) облегчает регистрацию любых изменений в клетке, будь они вызваны патологией в организме ш-у/уо, или постановкой эксперимента шvitro. Поэтому даже простые эмпирические методы исследования популяции красных кровяных телец оказываются достаточно информативными.

Проточная цитометрия выгодно отличается от других методов измерения параметров эритроцитов тем, что позволяет исследовать свойства одиночных клеток. С гидродинамической точки зрения большинство современных гематологических анализаторов представляют собой различные модификации проточных цитометров. Недавно было предложено новое направление в проточной цитометрии - сканирующая проточная цитометрия [84], обеспечивающее уникальные возможности для измерения светорассеяния от одиночных частиц, и, как следствие, для морфологического анализа клеток.

Термин «динамическая проточная цитометрия» появился недавно и связан с проведением кинетических измерений на цитометрах. По причине относительно сложной постановки эксперимента и необходимости в разработке математических моделей для его интерпретации данное направление остается мало разработанным. К настоящему времени существенный прогресс достигнут в разработке устройств автоматической подготовки пробы [8], которые позволяют измерять существенно более короткие процессы, начиная с долей секунды, по сравнению со стандартными проточными цитометрами, где время смешивания реагентов «вручную» составляет от минуты и более.

Диссертационная работа посвящена применению сканирующей проточной цитометрии в разработке новых методов как статического, так и динамического анализа популяции эритроцитов. С точки зрения проведения кинетических измерений в сканирующей проточной цитометрии данная диссертационная работа также является пилотной.

В данной работе:

1. Разработана гидродинамическая модель поведения несферической клетки в градиентном потоке в сканирующей кювете проточного цитометра. Рассчитан ориентационный эффект в приближении сфероидальной формы эритроцита. Предложена оптимальная конфигурация гидрофокусирующей системы сканирующего проточного цитометра для задания определенной ориентации эритроцитов в зоне анализа.

2. Предложен метод распознавания сферических эритроцитов на основе анализа их индикатрис светорассеяния. Развит метод решения обратной задачи светорассеяния для определения следующих параметров сферических эритроцитов по индикатрисе светорассеяния: объема клетки и концентрации гемоглобина.

3. Применяя метод сферизации эритроцитов с сохранением объема и метод сферизации эритроцитов с сохранением площади поверхности мембраны, измерены распределения эритроцитов по: площади мембраны, объему, индексу сферичности, концентрации гемоглобина.

4. В процессе гемолиза эритроцитов в изотоническом растворе хлорида аммония в реальном времени измерена динамика появления сферизованных клеток. Предложена математическая модель данного процесса в приближении пассивной диффузии осмотического эквивалента через мембрану эритроцита.

Проведенная работа позволила развить потенциал технологии сканирующей проточной цитометрии для кинетических исследований в биологических дисперсных системах. Предложенные методы характеризации эритроцитов будут использованы при разработке новых методов анализа в гематологии на базе сканирующего проточного цитометра. Сферизация эритроцитов с сохранением объема является одним из приемов упрощения формы клеток, в результате которого повышается информативность их характеризации. Предложенный в работе способ определения степени сферичности эритроцитов позволяет на сканирующем проточном цитометре отрабатывать методики, в которых требуется получение объектов с формой, близкой к сферической. Проанализированные литературные данные о формировании распределения эритроцитов по характеристическим параметрам (гематологическим индексам) могут быть использованы для интерпретации результатов измерений, полученных на существующих гематологических анализаторах, а также в моделировании процессов старения клеток. Теоретические расчеты ориентационной динамики несферических частиц в потоке с градиентом скорости могут быть использованы в разработке гидродинамической части приборов, использующих принцип гидрофокусировки. Способ измерения ориентированных несферических частиц в закрытом потоке "предложен для патентования в прототипе прибора, разрабатываемом ЗАО «Эконова» (Институт Хроматографии СО РАН, Новосибирск).

Работа выполнена в Институте Химической Кинетики и Горения СО РАН совместно с Клиникой Иммунопатологии Института Клинической Иммунологии СО РАМН, Институтом Цитологии и Генетики, СО РАН и НИИ Молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «ВЕКТОР» МЗ РФ.

Диссертация состоит из литературного обзора, трех глав и заключения.

В первой главе описана гидродинамическая система сканирующего проточного цитометра. В приближении Стокса рассчитано поведение несферической клетки, моделируемой сфероидом при гидрофокусировке (сужающийся поток) и в измерительной кювете (течение в трубе).

Во второй главе изложены принципы математического моделирования гемолиза в различных системах (тест на осмотическую резистентность эритроцитов в гипотонических растворах, динамика коллоидно-осмотическиго гемолиза в хлориде аммония), использовавшиеся в данной работе.

В третьей главе рассмотрены подходы к определению параметров эритроцитов с помощью СПЦ, разработанные к моменту написания данной работы: измерение эритроцитов, сферизованных с сохранением объема, нативных клеток и анализ кинетики гемолиза.

В заключении кратко сформулированы основные результаты диссертационной работы.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Разработанная гидродинамическая система сканирующего проточного цитометра обеспечивает доставку нативных эритроцитов в зону измерения в заданной ориентации, при которой длинная ось клетки отклоняется на угол, не превышающий 6 градусов относительно направления потока. При этом, за время измерения индикатрисы светорассеяния, дезориентация клетки в тестируемой зоне не превышает ~ 2 градусов.

2. Эритроциты с индексом сферичности 0.93 и выше идентифицируются по Фурье-образу их индикатрисы светорассеяния. При этом амплитуда основного пика Фурье-образа, нормированная на амплитуду нулевой частоты, равна или больше 0.25. Разработанный и экспериментально обоснованный подход позволяет определять индекс сферичности эритроцитов в широком диапазоне объемов (70-180 фл) и концентраций гемоглобина (18-40 г/дл).

3. Характеристические параметры (среднее значение и полуширина распределения по популяции) эритроцитов человека в норме имеют следующие величины: произведение эффективной проницаемости мембраны к осмолитам на площадь клетки (среднее - 1.41 ±0.02 мкм3/сек; полуширина - 0.33 ±0.02 мкм3/сек), параметры времени образования гемолитической поры в мембране (3.7* 10"4 ± 1.3Х10"4 секунд) и критического напряжения (104 ± 17 дин/см) в мембране.

Основные результаты диссертации представлены в 7 публикациях, включенных в прилагаемый перечень. Содержание диссертации докладывалось на международном симпозиуме «Биомедицинская оптика» (BIOS, Сан-Хосе, США, 23-29 января 1999 г., 22-27 января 2005 г); на IV международном совещательном семинаре «Фундаментальные науки в деятельности Международного Научно-Технологического Центра», Новосибирск, 23-27 апреля, 2001; на Европейской Конференции по Биомедицинской Оптике (Мюнхен, Германия, 22-25 июня 2003 г.); на ХХИ-ом Конгрессе Международного Общества Аналитической Цитологии (Монтпелье, Франция, 22-27 мая 2004 г.), на IV-й Международной школе молодых ученых и специалистов (Томск, 27 июня - 3 июля 2004г.); а также на научных семинарах и конкурсах в Институте химической кинетики и горения СО РАН (Новосибирск, 19982004 г.); в отделении Национального Агентства Италии по Изучению Новых Технологий, Источников Энергии и Окружающей среды (ENEA, г. Фраскати, 2003 г.). Результаты исследований вошли в курс лекций «Биокинетика» кафедры биомедицинской физики Новосибирского госуниверситета.

4г Л

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Тарасов, Петр Александрович

Заключение

Главный результат работы заключается в разработке методов определения параметров эритроцитов на базе сканирующего проточного цитометра. Данные методы являются либо уникальными (измерение площади мембраны), либо оригинальной адаптацией существующих подходов к сканирующему проточному цитометру (СПЦ) с существенным расширением качества получаемых данных за счет регистрации непрерывной угловой зависимости светорассеяния от клетки. Полученные данные позволили поднять ряд малоизученных проблем биофизики эритроцита, таких, как описание поведения клетки на промежуточных временах порядка минут, например, в процессе коллоидно-осмотического гемолиза, построение схемы формирования распределения клеток по биофизическим параметрам в норме.

Суммируя, можно выделить следующие результаты данной работы:

1. Разработана гидродинамическая модель поведения несферической клетки в градиентном потоке в сканирующей кювете проточного цитометра. Рассчитан ориентационный эффект в приближении сфероидальной формы эритроцита. Предложена оптимальная конфигурация гидрофокусирующей системы сканирующего проточного цитометра для задания определенной ориентации эритроцитов в зоне анализа.

2. Предложен метод распознавания сферических эритроцитов на основе анализа их индикатрис светорассеяния. Развит метод решения обратной задачи светорассеяния для определения следующих параметров сферических эритроцитов по индикатрисе светорассеяния: объема клетки и концентрации гемоглобина.

3. Применяя метод сферизации эритроцитов с сохранением объема и метод сферизации эритроцитов с сохранением поверхности мембраны, измерены распределения эритроцитов по различным морфологическим параметрам (гематологическим индексам): площадь мембраны, объем, индекс сферичности, концентрация гемоглобина.

4. В процессе гемолиза эритроцитов в изотоническом растворе хлорида аммония в реальном времени измерена динамика появления сферизованных клеток. Предложена математическая модель для описания данного процесса в приближении пассивной диффузии осмотического эквивалента через мембрану.

В результате обработки экспериментальных данных в рамках данной модели оценены основные параметры процесса: произведение эффективной проницаемости мембраны к осмолитам на площадь клетки, параметры времени образования гемолитической поры в мембране и критического напряжения.