Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моделирование светорассеяния клетками крови с помощью метода дискретных диполей

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Моделирование светорассеяния клетками крови с помощью метода дискретных диполей"

На правах рукописи

Юркин Максим Александрович

МОДЕЛИРОВАНИЕ СВЕТОРАССЕЯНИЯ КЛЕТКАМИ КРОВИ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА ДИСКРЕТНЫХ ДИПОЛЕЙ

03 00 02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Новосибирск - 2008

003446941

Работа выполнена в Институте химической кинетики и горения СО РАН

Научный руководитель

доктор физико-математических наук профессор

Мальцев Валерий Павлович

Официальные оппоненты

доктор физико-математических наук профессор

Хлебопрос Рем Григорьевич

доктор физико-математических наук профессор

Парамонов Леонид Евгеньевич

Ведущая организация

Институт оптики атмосферы СО РАН (г Томск)

Защита состоится 2008 г в часов на заседании диссертационного

совета Д 003 007 01 при Институте Биофизики СО РАН по адресу 660036, Красноярск, Академгородок, д 50 стр 50

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Биофизики СО РАН Автореферат разослан " 2Я " 0% 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Л А Франк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Кровь является одной из самых важных систем человеческого организма, а ее функции в основном определяются клетками крови Многие заболевания проявляют себя гематологически, поэтому клинический анализ крови является основным компонентом любой медицинской диагностики Увеличение информативности и снижение стоимости такого анализа приведет к увеличению общей эффективности системы здравоохранения

Оптические методы широко используются для изучения и характеризации клеток крови, поскольку они неинвазивны и обладают высокой скоростью анализа Наиболее важными среди этих методов являются методы, основанные на измерении (упругого) светорассеяния и флуоресценции (либо автофлуоресценции, либо при использовании флуоресцентных меток) Для анализа крови оптические методы широко применяются в проточных цитометрах, которые позволяют одновременно измерять сигналы светорассеяния и флуоресценции от одиночных клеток со скоростью десяток тысяч частиц в секунду Светорассеяние определяется морфологией клеток, а именно распределением показателя преломления внутри клетки в масштабе порядка длины волны Флуоресцентные же метки используются для изучения химической структуры клетки в масштабе нанометров Они определяют наличие определенных макромолекул на поверхности или внутри клетки, тем самым разделяя клетки, которые экспрессируют или не экспрессируют эти макромолекулы Автофлуоресценция используется очень редко в связи с ее чувствительностью ко многим факторам, которые тяжело контролировать

Исторически методы, основанные на светорассеянии, быстро развивались в проточной цитометрии в 1980-х Но в начале 1990-х многоцветный флуоресцентный анализ перехватил инициативу и в дальнейшем определял развитие проточной цитометрии Флуоресцентные метки позволяют быстро и достоверно разделять и подсчитывать любые подтипы любых типов клеток крови известных специалистам В обычных проточных цитометрах светорассеяние только предоставляет неточную оценку объема клетки и используется для разделения основных типов клеток крови Измерение объема частично дополняется использованием ячейки Култера, измеряющей электрический импеданс клетки

Несмотря на свое триумфальное использование в проточной цитометрии, флуоресцентные метки имеют два основных ограничения Во-первых, они обычно не предоставляют никакой информации о морфологии клетки, те об ее размере и форме, ядре и других элементах внутренней структуры Во-вторых, флуоресцентные метки нельзя назвать полностью неинвазивными Мечение занимает некоторое время (обычно полчаса) и может слегка модифицировать живые клетки Это особенно важно для кинетических исследований, когда требуется отслеживать состояние системы в определенные моменты времени в течение биологического процесса Более того, флуоресцентные метки довольно дороги Их цена добавляется к себестоимости каждого анализа крови, в то время как методы, основанные на светорассеянии, требуют только определенного количества электричества и воды для каждого анализа Анализ, проведенный В П Мальцевым в российских больницах, показал, что себестоимость анализов является основным препятствием для массового применения проточных цитометров То же самое относится и к

применению проточной цитометрии для диагностики таких заболеваний, как малярия, в Африке

Поэтому светорассеяние является перспективным направлением для медицинских систем для массового анализа крови Особенно это актуально для развивающихся стран, где такие системы могут существенно улучшить качество здравоохранения Более того, светорассеяние потенциально может характеризовать морфологию клеток, в том числе и их внутреннюю структуру, расширяя тем самым информативность анализа крови Эта информация может быть немедленно применена для диагностики заболеваний, для которых, например, известна корреляция между морфологией и стадией заболевания, как при некоторых видах рака крови Однако в данном контексте существуют ограничения для методов, основанных на светорассеянии Во-первых, стандартные проточные цитометры предоставляют очень мало информации о светорассеянии, которая обычно сводится к интенсивности светорассеяния, интегрированной в нескольких угловых интервалах, обычно только в двух так называемые рассеяние вперед и вбок Некоторые цитометры также измеряют деполяризованное рассеяние вбок Во-вторых, проблематично точно моделировать светорассеяние клетками крови ввиду их большого размера и сложной внутренней структуры В-третьих, характеризация клеток крови по измеренным сигналам светорассеяния требует решения обратной задачи светорассеяния, что нетривиально

Первое ограничение снимается новыми экспериментальными методами, такими как сканирующий проточный цитометр и методы, основанные на эллипсоидальной полости, которые измеряют индикатрису светорассеяния, разрешенную по одному или двум углам соответственно

Целью данной диссертационной работы является развитие метода дискретных диполей и его применению для исследования клеток крови с помощью сканирующего проточного цитометра Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи

1 Провести строгий теоретический анализ сходимости метода дискретных диполей и разработать методику экстраполяции для улучшения точности и оценки погрешностей, а также разработать способ непосредственного разделения ошибок формы и дискретизации

2 Разработать компьютерную программу на основе метода дискретных диполей для моделирования светорассеяния произвольными частицами, в частности, клетками крови в жидкости, изучить её возможности для рассеивателей много больших длины волны и провести сравнение этой программы с аналогами на основе этого же и других методов

3 Разработать метод характеризации эритроцитов, основанный на прямом сравнении экспериментальных индикатрис с базой данных теоретических индикатрис, и экспериментально проверить его в сравнении с эталонными методами определения объема и концентрации гемоглобина Также, используя базу данных индикатрис, уточнить и проверить спектральный метод определения диаметра эритроцитов

4 На основании моделирования светорассеяния упрощенной моделью гранулоцита в виде зернистого шара объяснить наблюдаемое различие в интенсивности деполяризационного бокового рассеяния между двумя подтипами гранулоцитов,

и рассмотреть эту же задачу светорассеяния в рамках приближения Релея-Дебая-Ганса и его второго порядка 5 Измерить индикатрисы нейтрофилов с помощью сканирующего проточного цитометра и сравнить их с теоретическими индикатрисами модели зернистого шара с сегментированным ядром, а также исследовать зависимость модельных индикатрис от размера гранул

Научная новизна работы определяется следующими наиболее значимыми результатами

Впервые проведен строгий теоретический анализ сходимости метода дискретных диполей и показано, что ошибки ограничены суммой линейных и квадратичных по размеру диполя членов

Предложена методика независимой оценки погрешности метода дискретных диполей и способ непосредственного разделения ошибок формы и дискретизации, а также проведено систематическое сравнение этого метода с методом конечных разностей во временной области для рассеивателей много больше длины волны

Разработан метод характеризации эритроцитов, основанный на прямом сравнении экспериментальных индикатрис светорассеяния с базой данных из 40 ООО теоретических индикатрис

Объяснено наблюдаемое различие в интенсивности деполяризационного -бокового рассеяния между двумя подтипами гранулоцитов на основании численного моделирования светорассеяния моделью гранулоцита и измерены индикатрисы -светорассеяния нейтрофилов с помощью сканирующего проточного цитометра

Практическая ценность работы связана с применением метода дискретных диполей для исследования клеток крови Это позволяет сделать принципиальный шаг от эмпирического анализа индикатрис клеток сложной формы, измеренных сканирующим проточным цитометром, до непосредственного сравнения этих индикатрис с вычислениями на основе реалистичных моделей формы Тем самым данная работа расширяет потенциал сканирующего проточного цитометра для идентификации и характеризации клеток крови В частности, предложенный метод характеризации эритроцитов потенциально позволяет проводить клинический анализ эритроцитов быстрее и информативнее существующих методов Дальнейшее развитие подходов, предложенных для гранулоцитов, позволит определять такие клинически значимые параметры, как зернистость гранулоцитов, в автоматическом режиме

На защиту выносятся следующие положения

1 Предложенная в работе методика экстраполяции результатов метода дискретных диполей уменьшает максимальные ошибки угловой зависимости интенсивности рассеяния кубическими рассеивателями порядка длины волны более чем в 100 раз

2 Метод дискретных диполей позволяет моделировать светорассеяния частицами с параметрами размера вплоть до 160 и 40 при показателе преломления равном 1 05 и 2 соответственно, в частности, всеми клетками крови в жидкости (при использовании 64 процессоров с частотой 3 4 ГГц)

3 Среднее значение коэффициента пропорциональности между положением последнего пика в амплитудном спектре Фурье модифицированной индикатрисы

эритроцита и его диаметром составляет 28 643 мкм градус (при длине волны О 66 мкм и показателе преломления внешней среды 1 337) 4 Степень деполяризации бокового рассеяния ступенчато зависит от диаметра гранул для модели гранулоцита в виде зернистого шара Она практически постоянна при диаметре меньше 0 2 мкм и больше 0 5 мкм (при длине волны в среде равной 0 5 мкм)

Апробация работы Основные результаты диссертации представлены в 11 публикациях, включенных в прилагаемый перечень Содержание диссертации докладывалось на международных конференциях «Рассеяние света и электромагнитных волн» (Салобрена, Испания, 16-20 мая 2005 г, Санкт-Петербург, 5-9 июня 2006 г, Бодрум, Турция, 17-22 июня 2007 г), на международной конференции «Оптика биологических частиц» (Новосибирск, 3-6 октября 2005 г), на международном семинаре по методу дискретных диполей (Бремен, Германия, 23 марта 2007 г), на международной конференции «Применение лазеров в науках о жизни 2007» (Москва, 11-14 июня 2007 г), на УШ-ом международном симпозиуме «Оптическая характеризация частиц» (Граз, Австрия, 9-13 июля 2007 г), а также на научных семинарах в Институте химической кинетики и горения СО РАН и Университете Амстердама

Публикации Основное содержание изложено в 9-и статьях в рецензируемых журналах и 2-х главах книги, а также в тезисах международных симпозиумов и конференций

Личный вклад Все приведенные в работе результаты получены либо самим автором, либо при его непосредственном участии

Структура диссертационной работы Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка цитируемой литературы, включающего 282 наименования Диссертация изложена на 231 странице, включает 18 таблиц, 65 рисунков и четыре приложения

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, определены цель и задачи работы, сформулированы основные положения, выносимые на защиту, и дано краткое описание диссертации по главам

Первая глава представляет собой общий литературный обзор, в котором рассмотрены клетки крови, методы измерения и моделирования светорассеяния и существующие подходы к решению обратной задачи светорассеяния В первом разделе дана классификация клеток крови (эритроциты, лимфоциты, гранулоциты и тромбоциты), описаны их основные функции и морфология В частности, для видимого излучения размерный параметр клеток крови, определяемый как отношение длины окружности шара того же объема к длине волны, лежит в диапазоне 30 < х <150, а средний показатель преломления относительно жидкой внешней среды от ~ 1 05 При этом эритроциты практически однородны, но имеют форму двояковогнутого диска, а гранулоциты, напротив, практически сферические, но имеют сложную внутреннюю структуру

В разделе 1 2 описаны экспериментальные методы измерения светорассеяния одиночных микрочастиц, каковыми являются клетки крови Самым распространенным методом для этого является проточная цитометрия, в которой

система гидродинамической фокусировки доставляет частицы в зону измерения по одиночке со скоростью до 30 ООО частиц/с При этом для каждой частицы измеряется интенсивность светорассеяния в фиксированные телесные углы, например рассеяние вперед и вбок и флуоресценция в нескольких спектральных интервалах, возможно с использованием нескольких возбуждающих лазеров Существуют методы измерения разрешенного по углу светорассеяния, т е одно- и двумерных индикатрис рассеяния, с помощью либо оптического или электростатического пинцета, либо проточной системы с гидродинамической фокусировкой Установки, в которых частица зафиксирована и используется сканирующий детектор или множество детекторов для измерения индикатрисы, требуют относительно большого времени измерения

Примером проточной системы измерения индикатрисы является сканирующий проточный цитометр (СПЦ) В настоящее время, СПЦ может измерять индикатрисы одиночных частиц со скоростью до 500 частиц в секунду в диапазоне углов от 5° до 100° Более того, СПЦ позволяет одновременно с индикатрисой измерять несколько сигналов флуоресценции, используя для возбуждения либо тот же лазер, либо другой, перпендикулярный потоку В данной диссертации используется конфигурация СПЦ, которая измеряет следующую индикатрису

где 5ц и ^14 - это элементы матрицы Мюллера, а усреднение проводится по всему азимутальному углу рассеяния

Раздел 1 3 посвящен обзору существующих методов моделирования светорассеяния, которые можно разделить на строгие и приближенные К последним относятся приближения Релея, Релея-Дебая-Ганса (РДГ) и Вентцеля-Крамерса-Бриллюена (ВКБ), аномальная дифракция (АД) и геометрическая оптика Приближенные теории обладают быстротой и простотой, однако границы их применимости не определены четко, так как их точность сильно зависит от формы частицы и от того, какую именно величину требуется вычислить Клетки крови лишь частично попадают в область применимости РДГ, АД и ВКБ Строгие методы, в свою очередь, удобно разделить на аналитические, частично аналитические и численные К аналитическим методам относятся различные варианты метода разделения переменных (МРП), которые практически применимы только к шарам и сфероидам, возможно многослойным Частично аналитические методы базируются на разложении решения дифференциального уравнения для электрического поля в частотной области в ряд по собственным функциям этого уравнения К ним относятся обобщенный МРП, дискретизированный формализм Ми, метод согласования в конечном числе точек и метод расширенных граничных условий Более общими методами, применимыми также и к вогнутым частицам, являются метод дискретных источников (МДИ) и программа на основе нескольких мультиполей

Неоднородные частицы произвольной формы составляют область применения численных методов, которые напрямую дискретизируют дифференциальные или интегральные уравнения для электромагнитного поля К ним относятся метод конечных разностей во временной области (КРВО), метод конечных элементов,

(1)

метод моментов (ММ) и метод дискретных диполей (МДЦ) Ввиду их сложной морфологии строгое моделирование светорассеяния клетками крови требует именно численного метода В данной диссертации использовался МДЦ, который физически представляет рассеиватель в виде кубической решетки точечных диполей, поляризуемость каждого из которых определяется локальным показателем преломления Взаимодействие этих диполей друг с другом и с падающим электрическим полем определяет поляризацию каждого диполя Рассеянное поле вычисляется как суперпозиция полей, излученных точечными диполями с известными поляризациями

В разделе 1 4 описаны существующие подходы к решению обратной задачи светорассеяния Прямая подгонка экспериментальной индикатрисы путем решения прямой задачи для многих наборов параметров методически проста, однако ее применимость практически ограничена простыми формами частиц, вплоть до пятислойного шара Для анализа одиночных частиц в реальном времени наиболее предпочтительны эмпирические или приближенные методы, которые обычно основаны на сжатии информации, содержащейся в индикатрисе, до нескольких специально подобранных параметров, которые получаются либо напрямую из индикатрисы, либо из ее спектра Гегенбауэра или Фурье При этом многомерное отображение параметров частицы (размер, показатель преломления и т д) в параметры индикатрисы обращается приближенно Обобщением этого подхода является нейронная сеть, которая автоматически обращает многомерное отображение, - в настоящее время эта область быстро развивается, но для характеризации одиночных частиц нейронные сети применялись пока только для шаров В данной диссертации мы имеем дело со сложными частицами, и большим количеством параметров частиц, вплоть до шести Поэтому мы используем подходы, основанные на базе данных индикатрис для различных параметров, которая используется либо напрямую для характеризации, либо как учебный набор для развития другого метода

Во второй главе развивается МДЦ В первом разделе проведен подробный обзор предыдущих работ в рамках общей формулировки на основе интегрального уравнения для электрического поля Хотя основные алгоритмы МДЦ, которые используются в нескольких широко используемых компьютерных программах, мало изменились с 1994 г, было предложено много улучшений, которые еще не общеприняты Сначала обсуждается теория МДЦ, включая формулировки различных авторов, и его место среди похожих методов, таких как ММ Далее приведены литературные данные по точности МДЦ при численном моделировании для различных форм, размеров и показателей преломления рассеивателей Далее подробно обсуждаются вычислительные аспекты МДЦ, а именно прямые и итерационные методы решения линейных уравнений и использование быстрого преобразования Фурье для вычисления произведения матрицы на вектор В завершение, описаны существующие работы, в которых МДЦ сравнивается с другими методами

В разделе 2 2 представлен теоретический анализ сходимости МДЦ Исходя из интегрального уравнения для электрического поля, доказано, что ошибка любой измеряемой величины ф ограничена квадратичной функцией параметра дискретизации у = \m\kd (к - волновое число во внешней среде, с?- диаметр диполя)

\ьфу\< (с, - с2 In у)у2 + (с3 - С4 In у)у, (2) ~ [| . шар kD=3 [ * ' ' • 11 g об- — подгонка (9 точек)

где константы с,-с4 зависят от всех " ° шарш=ю

J - - подгонка (9 точек) 0

параметров задачи и конкретной 8. 04" . ШаР«о=зо

измеряемой величины, но не зависят от о5 02 - " подгонк^9т°ч//)1--'"~ □

у При выводе предполагается, что | °

kd< 2, а обратный интегральный опера- о 00 .

тор рассеяния имеет конечную L\ |-02 - •

норму Линейный член относительно § V ' ................"

мал для кубовидных рассеивателей о .......\ ,",.,.., .

(форма которых может быть точно 5 00 0 1 02 03 04Д5т06 07 08 09 1 0

описана набором кубических элемен- п , _ ,

г J Рис 1 Относительная ошибка эффективности

TOB), И его относительная важность ЭКСТИНКции (со знаком) в зависимости от у и убывает С ростом размера частицы подогнанные квадратичные функции по 9 лучшим Поэтому СХОДИМОСТЬ МДЦ для доста- точкам для трех шаров точно больших частиц квадратична при типичных значениях d

Было проведено моделирование для пяти тестовых частиц куб с kD = 8, три шара с kD = 3, 10 и 30 и частица, полученная дискретизацией шара с kD= 10, используя 16 диполей на D (всего 2176 диполей), D обозначает диаметр шара или длину стороны куба Все рассеиватели однородные с т-15 Результаты -моделирования подтверждают все теоретические выводы Более того, ошибки не только ограниченны квадратичной функцией, но и могут быть (с хорошей точностью) описаны квадратичной функцией (рис 1)

В разделе 2 3 на основании теоретического анализа предложена методика экстраполяции, основанная на предположении, что

фу=а0+а1у + а2у2 (3) -

где а0, CJ) и а2 - это коэффициенты, выбранные так, чтобы - ошибка приближения - была в некотором смысле минимальна Тогда а0 является оценкой точного значения измеряемой характеристики ф° Вычисление а0, по сути, является подгонкой квадратичной функции по нескольким точкам {у,фу}, полученным стандартным МДЦ моделированием (рис 1) Мы используем подгонку методом наименьших квадратов, параметрами которого являются количество и величины у (интервал [Утш>^шах])> относительный вес различных точек (ожидаемое поведение ошибок и оценка погрешности итогового результата (исходя из стандартного отклонения, СО, величины а0) Эти параметры выбираются эмпирически - нашей целью является показать применимость одного конкретного набора параметров, а их оптимизация является предметом дальнейшего исследования В итоге сформулирована следующая пошаговая методика экстраполяции, где используются сокращения (к) и (нк) для кубовидных и некубовидных рассеивателей соответственно

1 Выберите утт на основе имеющихся вычислительных ресурсов

2 Возьмите ушлх равное 2-м (к) или 4-м (нк) утт, но не больше чем 1

3 Выберите 5 (к) или 9 (нк) точек в интервале \утт,утйХ], примерно равномерно расположенных в логарифмическом масштабе

■ шар /сО=3 Ч- » « I ■ 1 ■ '—г ' --1 •

. — подгонка (9 точек]

□ шар кО-10

- - подгонка (9 точек; о .' '

• шар /сО=30

- - подгонка (9 точек)

о Q

Г X т^т'*'' °

•

\

■.......\ ■

y=kdm

• у = 0.094 ■ у = 0.047 - экстраполяция (оценка)

60 90 120 Угол рассеяния 0, градусы

',70 ГБ

(10,10"')

4. Проведите МДЦ моделирование для каждого значения у.

5. Подгоните квадратичную функцию [формула (3)] к точкам {у,фу}, используя у3 в качестве ошибок данных; тогда а0 будет оценкой значения ф°.

6. Умножьте СО а0 на 10 (к) или 2 (нк) чтобы оценить погрешность экстраполяции.

Моделирование для тех же тестовых частиц, ЧТО и в предыдущем разде- Рис.2. Ошибки S\\(6) в логарифмическом масштабе ле показало, ЧТО экстраполяция заметно Для экстраполяции с использованием 5 значений у в подавляет максимальные ошибки интервале [0.047,0.094] для куба с = 8.

S]](û), когда параметр наилучшей дискретизации jvmin <0.4 и 0.15 для кубовидных и некубовидных рассеива-телей соответственно. Качество экстраполяции улучшается с уменьшением >'Ш1П, достигая выдающихся результатов, особенно для кубовидных частиц, -уменьшение ошибки на два порядка при Утт ~ 0.05 (рис. 2, при этом время вычислений увеличивается менее чем в 2.7 раза). Предложенная оценка надёжно описывает реальную ошибку, хотя Рис 3 Текущие В03М0ЖН0СТИ АША для шаров с она требует дальнейшего улучшения, различными хит. Заштрихованная область чтобы не переоценивать ошибку В соответствует полной сходимости, а перекрёстно некоторых случаях. Этот подход заштрихованная - неполной. Пунктирные линии

отображают два уровня постоянного объёма памяти.

используется в данной диссертации для

оценки ошибки моделирования светорассеяния клетками крови. Поскольку эта оценка полностью внутренняя, она потенциально позволяет создать адаптивный МДЦ - программу, автоматически улучшающую дискретизацию до достижения заданной точности.

В разделе 2.4 представлена новая компьютерная программа на основе МДЦ, разработанная автором диссертации и названная ADDA. Основной отличительной чертой этой программы является возможность параллелизовать одиночное вычисление, разделяя его между многими процессорами, поэтому размер частиц не ограничен памятью одного процессора. Моделировалось светорассеяние шарами с разными размерами и показателями преломления, используя 32 узла Голландского вычислительного кластера LISA (на каждом два процессора Intel Xeon 3.4 ГГц и 4 ГБ памяти). Использовалась стандартная формулировка МДЦ и три разных итерационных метода: метод квазиминимальной невязки, би-сопряжённых градиентов (Би-СГ) и Би-СГ стабилизированный. Для всех трёх использовался критерий остановки по умолчанию - относительная норма невязки £jt = 10~5, однако в некоторых случаях ADDA останавливалась на более высоком значении. Текущие

60 80 100 120 Размерный параметр х

Время, с Память, МБ

Куб т„ SIRRI 45 54 1

1 ориен DDSCAT 51 22 5

ZDD 273 21 6

ADDA 18 15 3

SIRRI 19 54 1

DDSCAT 37 22 5

ZDD 85 21 б

ADDA 9 15 3

Сфероид SIRRI 137 74 8

80 ориен DDSCAT 13 32 3

ZDD a

ADDA li 21 6

И,с SIRRI 41 74 8

DDSCAT 10 32 3

ZDD 13

ADDA 5 21 6

' Эта величина не была измерена

ВОЗМОЖНОСТИ программы показаны на Таблица 1 Время вычислений (одной ориентации) и

рис 3 в координатах (х,т), в частности, память- "СП0ЛЬЗУшая ЧСТЫРЬМЯ программами МДЦ,

для двух тестовых задач

биологические частицы (т ~ 1 05) можно моделировать вплоть до х = 160, что покрывает весь диапазон клеток крови при использовании видимого излучения

Время вычисления резко увеличивается с ростом и х, и т - оно не превосходит 1 часа для т = 1 05, но достигает величин порядка недели для больших т Последнее связано с очень медленной сходимостью итерационного метода, ускорение которой, например, с помощью предобусловливания, является темой дальнейшего исследования Ошибки и интегральных, и разрешенных по углу измеряемых характеристик

в целом увеличиваются с т, но не имеют систематической зависимости от х

В разделе 2 5 ADDA сравнивается с тремя другими аналогичными программами (SIRRI, DDSCAT, ZDD) для нескольких тестовых задач Сравнение проводилось в терминах точности, быстродействия и удобства работы - каждая программа имеет свои преимущества и недостатки Использовались следующие пять тестовых частиц шар, сфероид, цилиндр и кластеры из 4 и 50 одинаковых шаров - для всех х = 5 1, и два разных показателя преломления mSi = 1 6 + 0 OOli (силикат) и т1С = 1 313 (лед) Размер диполя соответствовал kd= 0 3, и для всех частиц, кроме шара, проводилось усреднение по ориентации Для шара ADDA, DDSCAT и ZDD приводят к практически идентичным результатам, что подтверждает то, что они основаны на одинаковой формулировке МДД (на основе дисперсионного соотношения решетки, предложенного Дрейном) Ошибки SIRRI, основанной на выражении для поляризуемости диполей, предложенном Лахтакиа, немного больше

Однако схемы усреднения по ориентации различаются во всех программах В ADDA используется регулярная решетка по углам Эйлера и метод интегрирования Ромберга, который можно использовать в адаптивном режиме Но в некоторых случаях, особенно для осесимметричных частиц, эта схема приводит к плохой точности при использовании настроек по умолчанию Важно отметить, что при учете симметрий частицы в настройке данной схемы точность ADDA не хуже, чем для других программ С другой стороны, ADDA быстрее всех остальных программ во всех тестах, причем для некоторых частиц более чем в два раза (таблица 1), и она единственная применима к большим частицам, для которых не хватает памяти одного процессора

В разделе 2 6 проводится систематическое сравнение МДД с КРВО в широком диапазоне размеров и показателей преломления рассеивателей, используя современные параллельные реализации обоих методов и требуя, чтобы они достигли определенной точности, после чего сравнивалась их производительность Моделирование светорассеяния проводилось для шаров с размерным параметром

11

вплоть до 80 и вещественной части показателя преломления т' вплоть до 2 (мнимая часть т" равнялась 1 5x10"5) Времена вычисления на 16 узлах кластере Lemieux (каждый имеет 4 процессора Alpha EV6 8 1 ГГц и 4 ГБ памяти), требуемые для достижения точности 1% в Qext и среднеквадратичной относительной ошибки Su(0) не более 25%, приведены в таблице 2 Относительное быстродействие резко зависит от т - МДД более чем на порядок быстрее при т' < 1 2 и х > 30, в то время как при т'>\1, наоборот, КРВО быстрее в той же степени, а при т' = 1 4 методы сравнимы

Также рассмотрены два примера биологических клеток эритроцит и предшественник В-лимфоцита, для последнего использовалась реалистичная трехмерная модель, измеренная с помощью конфокального микроскопа При этом МДД в 80 и 60 раз быстрее соответственно, что согласуется с выводами для шаров Хотя выводы данного сравнения немного зависят от конкретной характеристики рассеяния и от степени оптимизации программ, принципиально они не изменятся, пока не произойдет большое улучшение эффективности одного из методов Тем не менее данное сравнение нельзя считать завершенным, поскольку мы не варьировали мнимую часть показателя преломления, которая существенно влияет на эффективность обоих методов Проведенные сравнения показывают, что МДД, в частности, компьютерная программа ADDA, является наиболее подходящим методом для моделирования светорассеяния клетками крови

Третья глава посвящена характеризации эритроцитов по индикатрисам светорассеяния В первом разделе проводится обзор литературы по морфологии эритроцитов и их исследованиям на основе светорассеяния Введены следующие параметры диаметр D, минимальная (Ь) и максимальная (И) толщина, объем V, площадь поверхности S, индекс сферичности (ИС) и концентрация гемоглобина НЬС, последняя линейно связана с показателем преломления эритроцита Приведены литературные данные по значениям этих параметром для нормальных человеческих эритроцитов, полученные различными экспериментальными методами Также описаны существующие параметрические модели двояковогнутой формы эритроцита, среди которых наиболее реалистичной является форма, предложенная Эвансом и Фангом на основе прямых экспериментальных измерений с помощью интерференционной голографии

z{p) = ±0 5л]\-(2р/D)2(со + C2(2p/Df + C4(2p/Z))4), (4)

где z и р это цилиндрические координаты, ось z совпадает с осью симметрии клетки Светорассеяние эритроцитами долгое время моделировалось путем приближения двояковогнутой формы шаром, сфероидом или эллипсоидом, что оправдано только при определенных экспериментальных условиях Впервые строгое

Таблица 2 Времена вычисления для шаров с разными хит"

Время, с

МДД КРВО

102 10 1 1 06

20 11 4 1

30 24 17

40 78 384

60 453 7026

80 691 (40580)

1 08 10 07 2 1

20 1 9 25

30 87 207

40 19 388

60 31 1196

80 129 12215

12 10 09 32

20 32 58

30 87 645

40 106 740

60 1832 35998

14 10 4 25

20 896 3203

30 7256 3791

40 10517 (47410)

17 10 185 5 5

20 22030 998

30 (185170) 47293

2 10 1261 32

20 (252370) 6416

а Скобки указывают неполную сходимость

о

р мкм

моделирование светорассеяния натив-ными эритроцитами было проведено с помощью метода граничных элементов, а далее с помощью МДИ, КРВО и МДЦ Однако строгое моделирование исполь- 1 зовалось только в фундаментальных целях, таких как проверка адекватности приближенных форм Практическая характеризация эритроцитов ограничивается методами, основанными на

сферизации эритроцитов с сохранением р"с 4 УсРед,,г:""ый ПР°ФГЬ эритроцита из работы 1. Фанга и др, подогнанный четырехпараметрическои

объема И последующим измерением моделью, показаны геометрические параметры размера и показателя преломления этих

шаров по сигналам светорассеяния, тем самым определяя V и НЬС Недавно был предложен новый метод для определения диаметра эритроцита по спектру Фурье его индикатрисы

В разделе 3 2 проведено моделирование светорассеяния эритроцитами с помощью МДД - индикатриса чувствительна к форме эритроцита, поэтому в общем случае требуется использовать метод, способный работать с реалистичной формой, для изучения влияния характеристик эритроцита на его индикатрису Предложен %2 метод характеризации эритроцитов, основанный на прямом сравнении экспериментальных индикатрис с теоретическими с использованием следующей меры близости

(5)

где /ехр(6() - это экспериментальная индикатриса, измеренная для п углов в, (вх = 10°, вп = 50°), 4(6!) - теоретическая индикатриса, вычисленная для тех же углов, а в) - следующая весовая функция

7Г-

(6)

что соответствует стандартному окну Хенинга, которое сильно уменьшает влияние разрывов в начале и конце измерительного диапазона СПЦ Мы считаем, что анализируемый эритроцит имеет те же характеристики, что и ближайшая модель (по X2 расстоянию) Данный идея была продемонстрирована на базе данных из 92 индикатрис для разных диаметров, объемов и ориентации эритроцита в капилляре СПЦ (угол $

В разделе 3 3 представлено дальнейшее развитие %2 метода Предложена четырехпараметрическая модель формы эритроцита, в которой все величины, полученные микроскопическими измерениями (Д Ъ, Ь и диаметр кольца максимальной толщины с), являются независимыми входными параметрами В частности, эта модель хорошо описывает экспериментальные результаты Фанга и др на основе формулы (4) - рис 4 Составлена база данных из 40 ООО индикатрис эритроцитов, при этом случайно выбирались шесть параметров четыре параметра формы, НЬС и р из интервалов, соответствующим литературным данным (/?

Таблица 3. Результаты х другими методами."

метода и сравнение с

Параметр СПЦ Coulter

эритроцита j2 метод Сферизация МАХМ

D, мкм 7.42 ± 1.48

А, мкм 2.61 ±0.68

Ъ, мкм 1.03 ± 1.15

с, мкм 4.74 ± 1.42

НЬС, г/дл 33.5 ± 7.5 33.4 ±4.2 31 оь

К, мкм3 91 ± 35 94 ±26 93 ±22

S, мкм2 118 ±36

ИС 0.712 ± 0.131

А градусы /2 86 ±5 (5.25 ± 3.40)х 10"'

" Показаны средние значения ± 2хСО. ь Coulter МАХ М не определяет СО для распределения по НЬС.

Теоретические индикатрисы -Линейная подгонка_

выбиралось из интервала [75°,90°] ввиду ориентирующих свойств СПЦ). В х2 методе умножение на весовую функцию было заменено логарифмическим преобразованием:

X1 =1EM^PW) + l)-log(/1„W) + l)]2, (7)

п ы

Кроме того используется немного другой диапазон 0: = 12° и в„ - 55°. Формула (7) измеряет среднюю относительную разницу между двумя функциями, за исключением небольшого интервала углов вблизи в„.

Результаты применения j2 метода к пробе крови здорового донора приведены в таблице 3. Значения для V и НЬС сравнены с методами на основе сферизации эритроцитов с сохранением объёма и коммерческого гематологического анализатора Coulter МАХ М (Beckman Coulter Corporation). Средние значения хорошо согласуются, однако стандартные отклонения для %г метода примерно в 1.5 раза больше, чем для эталонных методов. Это объясняется чувствительностью х1 метода к несовершенству оптической системы СПЦ, однако этот вопрос требует дальнейшего исследования. Результаты для всех параметров разумные, за исключением минимальной толщины, которая не может быть точно определена х1

методом, ввиду низкой чувствительности индикатрисы к этому параметру.

Мы также использовали базу данных вычисленных индикатрис для уточнения и проверки ранее предложенного эмпирического метода определения диаметра эритроцита D по положению последнего пика (ППП) в амплитудном спектре Фурье модифицированной индикатрисы, определённой как

A»d(0) = w(fl)[/(f?)wF(i?)- </wF>]/CO(/wF), (8)

где wF(0) = в25, и индикатриса рассматривается в интервале [5°,50°]. Мы вычислили ППП для каждой из 40 ООО теоретических индикатрис и отложили их как функцию от D на рис. 5. Процедура обращения основана на выраженной линейной корреляции между ППП и D:

£> = ПППх 28.643 мкм-градус, (9)

коэффициент которой (среднее значение) определён для длины волны Я = 660 нм и показателя преломления внешней среды тй= 1.337. Применимо к той же пробе

14

0.20

0.25 0.30

Положение последнего пика, градус"

0.35

Рис. 5, Положение последнего пика амплитудного спектра Фурье модифицированной индикатрисы и диаметр для 40 000 моделированных эритроцитов. Также показана линейная подгонка через все точки.

крови спектральный метод приводит к распределению по диаметру 7 00 ± 1 86, что шире, чем для х2 метода Следовательно требуется дальнейшее улучшение обоих методов, а для проверки их точности необходим эталонный метод, например, на основе микроскопических измерений Для дальнейшего развития как так и спектрального метода требуется дополнительная проверка для многих проб крови в сравнение с эталонными методами

В четвертой главе представлено исследование светорассеяния гранулоцитами Первый раздел посвящен обзору литературных данных по морфологии гранулоцитов, а также существующих методов их исследования с помощью светорассеяния, в частности, на проточных питометрах Гранулоциты это самый многочисленный тип лейкоцитов, состоящий из трех подтипов нейтрофилов, эозинофилов и базофилов Их количество относительно всех лейкоцитов в нормальных условиях лежит в диапазонах 46-73%, 0^ 4% и 0 2-12% соответственно В мазках крови гранулоциты имеют размер 10-15 мкм, однако во взвеси их размеры заметно меньше - 8 3, 8 и 5-7 мкм для нейтрофилов, эозинофилов и базофилов соответственно Их ядро состоит из нескольких долей, обычно двух или трех Гранулы в каждом из подтипов представлены несколькими классами в нейтрофилах размеры этих классов равны примерно 0 2 и 0 5 мкм, в эозинофилах - 0 1-0 5 и 0 5-1 3 мкм, а в базофилах - 0 1-0 5 и 0 2-1 0 мкм Суммарный объем гранул равен примерно 10% объема клетки

В проточных цитометрах гранулоциты можно отделить от других лейкоцитов по большим сигналам рассеяния вперед и вбок (кроме базофилов, которые попадают в область лимфоцитов) Дальнейшее разделение гранулоцитов на подтипы основано на измерении либо количества поверхностных антигенов, таких как CD45, CD16, CD49d, NTB-A и CD224, используя меченые моноклональные антитела, либо степени деполяризации бокового рассеяния (D$$) Последняя была предложена де Гротом и сотрудниками как отношение интенсивности деполяризованного бокового рассеяния (/±) к полной (/ss) - они экспериментально показали, что эозинофилы имеют примерно такое же Iss, как нейтрофилы, но большее 1± и Dss

В разделе 4 2 проводится теоретическое исследование светорассеяния моделью гранулоцита с помощью метода дискретных диполей путем вычисления /Ss и /i для разных размеров (Dc и dg) и показателей преломления (отс и mg) клетки и гранул соответственно, и разных объемных долей гранул/ В качестве модели гранулоцита мы используем зернистый шар, который не имеет ядра, а все его гранулы одинаковы и случайно расположены Использовались следующие параметры модели по умолчанию- Dc = 8 мкм, /= 0 1, mc=1015, ms- 12, Я= 0 4936 мкм (во внешней среде) Основная переменная величина - это de, который изменяется от 0 075 до 2 мкм Конкретный результат зависит от случайного положения гранул, поэтому мы повторяем каждое вычисление 10 раз и показываем среднее ± 2хСО для каждой характеристики рассеяния Сигналы бокового рассеяния моделировались в соответствии с исходной работой де Грота и др, используя квадратную апертуру, ограничивающую и полярный и азимутальный угол рассеяния интервалом 90° ±25° /ss и 1± получены усреднением по этой апертуре

Результаты моделирования приведены на рис 6, где каждая точка соответствует одному d% Мы также варьировали все параметры модели (кроме Л), но общий вид

50 100 150 200

Полное боковое рассеяние [

зависимостей 7ss и /j_ от d% не изменялся

- два сегмента высокой корреляции

между 7ss и 1± для малых и больших d& и

промежуточная область для узкого

диапазона dg. Эти области качественно

соответствуют нейтрофилам и эозино-

филам по данным де Грота и др. Как 7ss,

так и /j_ увеличиваются с ростом afg при

малых dg, достигают максимума при ds

порядка Я и после медленно спадают.

Dss ведёт себя ступенчато (рис. 7), при

этом литературное значение для

нейтрофилов примерно соответствует п , ..

г т ri- j рис 6 Интенсивности полного и деполяризованного

пределу малых б/g ДЛЯ/= 0.1, В ТО время бокового рассеяния для нескольких диаметров как Dss ДЛЯ эозинофилов лежит между гранул от О до 2 мкм. Показаны средние значения ± пределами малых и больших ds для той 2хСО. же / Последнее можно качественно объяснить наличием у эозинофилов больших (> 0.4 мкм), малых (< 0.25 мкм) и промежуточных гранул. Тем самым различие в IL и Dss между нейтро-филами и эозинофилами можно полностью объяснить разным размером гранул.

Аналитические выражения, полученные в рамках приближений Релея-Дебая-Ганса и второго борновского, качественно описывают все эти результаты. Более того, эти выражения численно согласуются со строгим МДЦ Рис' 7' Степень деполяризации бокового рассеяния в

, . зависимости от диаметра гранул для нескольких моделированием при малых ds и/, что объёмных долей Показаны средние значения ±

может быть ИСПОЛЬЗОВаНО ДЛЯ прибли- 2хСО. Также приведены литературные средние жённого решения обратной задачи све- значения для нейтрофилов и эозинофилов. торассеяния для гранулоцитов. В завершение приведены вычисленные зависимости Qext и параметра асимметрии от dg и/

В разделе 4.3 представлены первые экспериментальные измерения индикатрис светорассеяния нейтрофилов и их сравнение с моделированием на основе МДЦ. Для однозначной идентификации нейтрофилов использовались моноклональные антитела к CD16b, меченные флуоресцеина изотиоцианатом. Для сравнения с экспериментальными данными мы провели дополнительное моделирование с помощью МДД, немного изменив параметры модели. Во-первых, установив Dc = 9.6 мкм, тъ = 1.15 и тй = 1.015, мы вычислили шесть индикатрис для зернистых шаров с ûfg = 0.1, 0.15 и 0.2 мкм и /=0.1 и 0.2. Во-вторых, мы добавили в нашу модель ядро, составленное вручную из четырёх эллипсоидов разного размера, случайно расположенных и повёрнутых в цитоплазме, с суммарной объёмной долей равной 0.11. Рассматривались две ориентации модели относительного падающего

0.00

0.5 1.0 1.5

Диаметр гранул d , мкм

излучения, а гранулы случайно располагались в оставшейся цитоплазме с объёмной долей /=0.1 (суммарная объёмная доля нецитоплазматического материала во всей клетки 0.2). Мы использовали те же три размера гранул, что и выше, а показатель преломления ядра та такой же, что и для гранул 1 (1-15).

Усреднённые по пробе эксперимен-! тальные индикатрисы сравнены с

; модельными для d& = 0.15 МКМ на рис. 8. рис 8 Усреднённые по пробе экспериментальные j Общая величина модельных индикатрис индикатрисы нейтрофилов трёх доноров в ! хорошо согласуется С экспериментом логарифмическом масштабе, показанные вместе с

с „ индикатрисами моделей с ядром и без.

для разных проб, при этом различие v F

между моделями не превосходит

разницы между пробами. Наличие ядра значительно увеличивает 1(9) при 15° < (9< 40°, в то время как при больших углах 1(9) практически одинакова для всех моделей с одинаковой суммарной объёмной долей ядра и гранул. Важно отметить, что величина индикатрисы сильно зависит от показателей преломления ядра и гранул и от / Вероятно, вариация именно этих факторов приводит к различию экспериментальных индикатрис между пробами, так как ядро присутствует во всех зрелых нейтрофилах.

Также было измерено распределение по диаметрам нейтрофилов с помощью спектрального метода, средние значения составили от 9 до 10 мкм с различием менее 10% между пробами. Однако, эти результаты лишь приблизительные, так как применимость спектрального метода для зернистых частиц на данный момент недостаточно обоснована. Результаты моделирования позволяют приблизиться к задаче характеризации нейтрофилов, однако на данный момент не представляется возможным строго характеризовать отдельные нейтрофилы. Возможны несколько I упрощённых подходов: характеризовать отдельные нейтрофилы, используя приближённые теории светорассеяния, или определять средние по пробе морфологические параметры путём анализа усреднённых индикатрис. Но даже эти более простые задачи отнюдь не тривиальны и всё ещё ожидают своего решения.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.

1. Проведён строгий теоретический анализ сходимости метода дискретных диполей и показано, что ошибки ограничены суммой линейных и квадратичных по размеру диполя членов. Предложенная методика экстраполяции позволяет улучшить точность и оценивать погрешность вычислений; надёжность этой оценки доказана эмпирически. Также предложен способ непосредственного разделения ошибок формы и дискретизации.

2. Проведено систематическое сравнение метода дискретных диполей с методом конечных разностей во временной области, которое показало, что первый более чем на порядок быстрее при моделировании светорассеяния биологическими клетками. Разработанная компьютерная программа ADDA на основе метода

дискретных диполей позволяет моделировать светорассеяние произвольными частицами много больше длины волны, в частности, биологическими клетками в жидкости При этом ADDA превосходит аналогичные программы в вычислительной эффективности

3 Разработан метод характеризации эритроцитов, основанный на прямом сравнении экспериментальных индикатрис с базой данных из 40 ООО теоретических индикатрис, вычисленных с использованием четырехпараметрической модели формы Экспериментальная проверка показала согласие средних значений объема и концентрации гемоглобина с двумя эталонными методами Используя базу данных теоретических индикатрис, уточнен и проверен спектральный метод определения диаметра эритроцитов

4 Моделирование светорассеяния упрощенной моделью гранулоцита в виде зернистого шара с помощью метода дискретных диполей показало, что наблюдаемое различие в интенсивности деполяризационного бокового рассеяния между двумя подтипами гранулоцитов может быть объяснено разным размером их гранул Эта же задача светорассеяния рассмотрена в рамках приближения Релея-Дебая-Ганса и его второго порядка - полученные аналитические выражения качественно описывают результаты численного моделирования

5 Измерены индикатрисы нейтрофилов с помощью сканирующего проточного цитометра, они, в целом, согласуются с вычисленными индикатрисами модели зернистого шара с сегментированным ядром Рассмотрена зависимость модельных индикатрис от размера гранул, и показаны возможные подходы к решению обратной задачи светорассеяния для гранулоцитов

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах

1 Yurkin М А , Semyanov К А, Tarasov Р А , Chernyshev А V, Hoekstra A G , Maltsev VP Experimental and theoretical study of light scattering by individual mature red blood cells with scanning flow cytometry and discrete dipole approximation // Appl Opt -2005 -V44 -P 5249-5256

2 Yurkin M A, Maltsev V P, Hoekstra A G Convergence of the discrete dipole approximation I Theoretical analysis // J Opt Soc Am A - 2006 - V 23 - P 25782591

3 Yurkin M A, Maltsev V P, Hoekstra A G Convergence of the discrete dipole approximation II An extrapolation technique to mcrease the accuracy // J Opt Soc Am A - 2006 - V 23 - P 2592-2601

4 Tarasov P A, Yurkin M A, Avrorov P A, Semyanov К A, Hoekstra A G , Maltsev

V P Optics of erythrocytes // Optics of Biological Particles, Hoekstra A G, Maltsev

V P , Videen G , eds - London Sprmger, 2006 - P 231-246

5 Semyanov К A, Zharinov A E , Tarasov P A, Yurkin M A , Skribunov IG , van Bockstaele D R, Maltsev V P Optics of leucocytes // Optics of Biological Particles , Hoekstra A G , Maltsev V P , Videen G , eds - London Springer, 2006 - P 253-264

6 Penttila A, Zubko E , Lumme К , Mumonen К, Yurkin M A , Drarne В T , Rahola J , Hoekstra A G, Shkuratov Y Comparison between discrete dipole implementations and exact techniques //J Quant Spectrosc Radiat Transf-2007 -V106 -P417-436

7 Yurkin M A , Maltsev V P , Hoekstra A G The discrete dipole approximation for simulation of light scattering by particles much larger than the wavelength // J Quant Spectrosc Radiat Transf - 2007 - V 106 - P 546-557

8 Yurkin M A, Hoekstra A G The discrete dipole approximation an overview and recent developments //J Quant Spectrosc Radiat Transf-2007 -V106 -P558-589

9 Yurkin M A , Semyanov К A , Maltsev V P , Hoekstra A G Discrimination of granulocyte subtypes from light scattering theoretical analysis using a granulated sphere model //Opt Express-2007 -V15 - P.16561-16580

10 Yurkin M A , Hoekstra A G , Brock R S , Lu J Q Systematic comparison of the discrete dipole approximation and the finite difference time domain method for large dielectric scatterers //Opt Express-2007 -V15 -P 17902-17911

11 Орлова Д Ю , Юркин M A , Семьянов К А , Мальцев В П Оптические свойства гранулярных клеток крови нейтрофилы // Вестник НГУ Серия Физика - 2007 -Т2 -№4 -С 83-87

Подписано к печати 31 июля 2008г. Тираж 100 экз. Заказ № 735. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел 335-66-00

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Юркин, Максим Александрович

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Клетки крови.

1.2. Экспериментальные методы.

1.3. Моделирование светорассеяния. 1.4. Обратная задача светорассеяния.

Глава 2. Метод дискретных диполей

2.1. Обзор МДЦ «

2.1.1. Введение.

2.1.2. Общая формулировка.

2.1.3. Разновидности МДЦ.

2.1.3.1. Теоретические основы МДЦ.

2.1.3.2. Точность МДД вычислений.

2.1.3.3. МДЦ для кластеров шаров.

2.1.3.4. Модификации и расширения МДД.

2.1.4. Численные соображения.

2.1.4.1. Прямые и итерационные методы.

2.1.4.2. Разложение по порядкам рассеяния.

2.1.4.3. Блочно-топлицева структура.

2.1.4.4. Быстрое преобразование Фурье.

2.1.4.5. Быстрый метод мультиполей.

2.1.4.6. Усреднение по ориентации и повторные вычисления.

2.1.5. Сравнение МДЦ с другими методами.

2.1.6. Заключительные замечания.

2.2. Сходимость МДД

2.2.1. Введение.

2.2.2. Теоретический анализ.

2.2.2.1. Дополнительные определения.

2.2.2.2. Анализ ошибок.

2.2.2.3. Ошибки формы.

2.2.2.4. Различные формулировки МДД.

2.2.3. Численное моделирование.

2.2.4. Обсуждение.

2.2.5. Выводы.

2.3. Методика экстраполяции для улучшения точности МДД

2.3.1. Введение.

2.3.2. Экстраполяция.

2.3.3. Численное моделирование.

2.3.4. Обсуждение.

2.3.5. Выводы.

2.4. Текущие возможности МДД для очень больших частиц

2.4.1. Введение.

2.4.2. Компьютерная программа ADDA.

2.4.3. Численное моделирование.

2.4.3.1. Параметры моделирования.

2.4.3.2. Результаты.

2.4.4. Обсуждение.

2.4.5. Выводы.

2.5. Сравнение компьютерных программ на основе МДД 114 2.5.1. Введение.

2.5.2. Программы МДД.

2.5.2.1. SIRRI.

2.5.2.2. DDSCAT.

2.5.2.3. ZDD.

2.5.2.4. ADDA.

2.5.3. Сравнение программ.

2.5.3.1. Формы объектов и параметры.

2.5.3.2. Точные методы.

2.5.3.3. Точность.

2.5.3.4. Скорость.

2.5.4. Обсуждение.

2.6. Сравнение МДД с методом конечных разностей во временной области

2.6.1. Введение.

2.6.2. Параметры моделирования.

2.6.3. Результаты для шаров.

2.6.4. Пример применения к биологическим клеткам.

2.6.5. Выводы.

Глава 3. Эритроциты

3.1. Введение в эритроциты

3.1.1. Морфология.

3.1.2. Светорассеяние эритроцитами.

3.2. Решение обратной задачи светорассеяния для эритроцитов, используя простую форму и постоянный показатель преломления

3.2.1. Методология моделирования.

3.2.2. Экспериментальный метод и процедура обращения.

3.2.3. Эффект формы и ориентации.

3.2.4. Характеризация эритроцитов.

3.2.5. Приближённые формы.

3.2.6. Выводы.

3.3. Характеризация морфологии нативных эритроцитов с помощью сканирующего проточного цитометра

3.3.1. Расширенная модель формы эритроцита.

3.3.2. Методология моделирования.

3.3.3. Экспериментальный метод и процедура обращения.

3.3.4. Результаты и обсуждение.

3.3.5. Эмпирическая процедура определения диаметра эритроцитов.

3.3.6. Выводы.

Глава 4. Гранулоциты

4.1. Введение в гранулоциты

4.1.1. Нейтрофилы.

4.1.2. Эозинофилы.

4.1.3. Базофилы.

4.1.4. Оптическая характеризация гранулоцитов.

4.2. Теоретическое исследование светорассеяния простой моделью гранулоцита - зернистым шаром

4.2.1. Введение.

4.2.2. Простая модель гранулоцита.

4.2.3. Ортогональное светорассеяние.

4.2.4. Результаты и обсуждение.

4.2.5. Выводы.

4.3. Экспериментальное исследование нейтрофилов сканирующим проточным цитометром

4.3.1. Экспериментальная процедура.

4.3.2. Дополнительное МДЦ моделирование.

4.3.3. Результаты и обсуждение.

4.3.4. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Моделирование светорассеяния клетками крови с помощью метода дискретных диполей"

Кровь является одной из самых важных систем человеческого организма, в то время как её функции в основном определяются клетками крови. Многие заболевания проявляют себя гематологически, т.е. некоторые характеристики клеток кровн выходят за пределы физиологических интервалов [1]. Поэтому клинический анализ крови является основным компонентом любой медицинской диагностики. Увеличение информативности и снижение стоимости такого анализа немедленно приведёт к увеличению общей эффективности системы здравоохранения.

Оптические методы широко используются для изучения и характеризации клеток крови, поскольку они неинвазивны и обладают высокой скоростью анализа. Наиболее важными среди них являются методы, основанные на измерении (упругого) светорассеяния и флуоресценции (либо автофлуоресценции, либо при использовании флуоресцентных меток). Для анализа крови оптические методы широко применяются в проточных питометрах [2,3], которые позволяют одновременно измерять сигналы светорассеяния и флуоресценции от одиночных клеток со скоростью десяток тысяч частиц в секунду. Светорассеяние определяется морфологией клеток, а именно распределением показателя преломления внутри клетки в масштабе порядка длины волны. Флуоресцентные же метки используются для изучения химической структуры клетки в масштабе нанометров. Они определяют наличие определённых макромолекул на поверхности или внутри клетки, тем самым разделяя «положительные» и «отрицательные» клетки, т.е. клетки, которые экспрессируют или не экспрессируют эти макромолекулы. Автофлуоресценция используется очень редко в связи с её чувствительностью ко многим факторам, которые тяжело контролировать.

Исторически методы, основанные на светорассеянии, быстро развивались в проточной цитометрии в 1980-х [2,4,5]. Но в начале 1990-х многоцветный флуоресцентный анализ перехватил инициативу и в дальнейшем определял развитие проточной цитометрии [3]. Флуоресцентные метки позволяют быстро и достоверно разделять и подсчитывать любые подтипы любых типов клеток крови известных специалистам. В обычных проточных цитометрах светорассеяние только предоставляет неточную оценку объёма клетки и используется для разделения основных типов клеток крови. Измерение объёма частично дополняется использованием ячейки Култера, основанной на измерение электрического импеданса клетки [3].

Несмотря на своё триумфальное использование в проточной цитометрии, флуоресцентные метки имеют два основных ограничения. Во-первых, они обычно не предоставляют никакой информации о морфологии клетки, т.е. об её размере и форме, ядре и других элементах внутренней структуры. Во-вторых, флуоресцентные метки нельзя назвать полностью неинвазивными. Мечение занимает некоторое время (обычно полчаса [6]) и может слегка модифицировать живые клетки [7]. Это особенно важно для кинетических исследований, когда требуется отслеживать состояние системы в определённые моменты времени в течение биологического процесса. Более того, флуоресцентные метки довольно дороги. Их цена добавляется к себестоимости каждого анализа крови, в то время как методы, основанные на светорассеянии, требуют только определённого количества электричества и воды для каждого анализа. Анализ, проведённый В.П. Мальцевым в российских больницах, показал, что себестоимость анализов является основным препятствием для массового применения проточных цитометров. То же самое относится и к применению проточной цитометрии для диагностики таких заболеваний, как малярия, в Африке.*

Поэтому светорассеяние является перспективным направлением для медицинских систем для массового анализа крови. Особенно это актуально для развивающихся стран, где такие системы могут существенно улучшить качество здравоохранения. Более того, светорассеяние потенциально может характеризовать морфологию клеток, в том числе и их внутреннюю структуру, расширяя тем самым информативность анализа крови. Эта информация может быть немедленно применена для диагностики заболеваний, для которых известна корреляция между морфологией и стадией заболевания, как при некоторых видах рака крови (например, [8]). Однако в данном контексте существуют ограничения для методов, основанных на светорассеянии. Во-первых, стандартные проточные цитометры предоставляют очень мало информации о светорассеянии, которая обычно сводится к интенсивности светорассеяния, интегрированной в нескольких угловых интервалах, обычно только в двух: так называемые рассеяние вперёд и вбок [3]. Некоторые цитометры также измеряют деполяризованное рассеяние вбок [9]. Во-вторых, проблематично точно моделировать светорассеяние клетками крови ввиду их большого размера и сложной внутренней структуры. В-третьих, характеризация клеток крови по измеренным сигналам светорассеяния требует решения обратной задачи светорассеяния, что нетривиально.

Первое ограничение снимается новыми экспериментальными методами, такими как сканирующий проточный цитометр [10] и методы, основанные на эллипсоидальной В.П. Мальцев, частное сообщение (2003). т Дж. Нойкаммер (J. Ncukammer), частное сообщение (2004). полости [11], которые измеряют индикатрису светорассеяния, разрешённую по одному или двум углам соответственно.

Диссертационная работа посвящена развитию метода дискретных диполей и его применению для исследования клеток крови с помощью сканирующего проточного цитометра. При этом использовались как можно более реалистичные модели формы клеток, и проводилось моделирование светорассеяния для большого диапазона значений параметров модели. Этот подход применён для двух классов клеток крови: эритроцитов и гранулоцитов. Для первых разработан метод характеризации, а для последних подробно исследовано влияние гранул на сигналы светорассеяния.

Задачами данной работы является:

1. Провести строгий теоретический анализ сходимости метода дискретных диполей и разработать методику экстраполяции для улучшения точности и оценки погрешностей, а также разработать способ непосредственного разделения ошибок формы и дискретизации.

2. Разработать компьютерную программу па основе метода дискретных диполей для моделирования светорассеяния произвольными частицами, в частности, клетками крови в жидкости, изучить её возможности для рассеивателей много больших длины волны и провести сравнение этой программы с аналогами на основе этого же и других методов.

3. Разработать метод характеризации эритроцитов, основанный на прямом сравнении экспериментальных индикатрис с базой данных теоретических индикатрис, и экспериментально проверить его в сравнении с эталонными методами определения объёма и концентрации гемоглобина. Также, используя базу данных индикатрис, уточнить и проверить спектральный метод определения диаметра эритроцитов.

4. На основании моделирования светорассеяния упрощённой моделью гранулоцита в виде зернистого шара объяснить наблюдаемое различие в интенсивности деполяризационного бокового рассеяния между двумя подтипами гранулоцитов, и рассмотреть эту же задачу светорассеяния в рамках приближения Релея-Дебая-Гапса и его второго порядка.

5. Измерить индикатрисы нейтрофилов с помощью сканирующего проточного цитометра и сравнить их с теоретическими индикатрисами модели зернистого шара с сегментированным ядром, а также исследовать зависимость модельных индикатрис от размера гранул.

Теоретическая ценность работы заключается в развитии метода моделирования светорассеяния произвольными частицами и разработка компьютерной программы на его основе, что расширило границы его применимости до частиц много больше длины волны. Этот метод может использоваться при исследовании различных объектов: наночастиц, бактерий, клеток крови, атмосферных аэрозолей, комет, межзвёздной пыли и т.д. Рассмотрение светорассеяния зернистыми шарами на основе приближённых теорий объясняет внутренние механизмы этого процесса, что может быть обобщено на другие зернистые объекты, например, атмосферные аэрозоли.

Практическая ценность работы связана с применением метода дискретных диполей для исследования клеток крови. Это позволяет сделать принципиальный шаг от эмпирического анализа индикатрис клеток сложной формы, измеренных сканирующим проточным цитометром, до непосредственного сравнения этих индикатрис с вычислениями на основе реалистичных моделей формы. Тем самым данная работа расширяет потенциал сканирующего проточного цитометра для идентификации и характеризации клеток крови. В частности, предложенный метод характеризации эритроцитов потенциально позволяет проводить клинический анализ эритроцитов быстрее и информативнее существующих методов. Дальнейшее развитие подходов, предложенных для гранулоцитов, позволит определять такие клинически значимые параметры, как зернистость гранулоцитов, в автоматическом режиме.

Работа выполнена в Институте химической кинетики и горения СО РАН совместно с Университетом Амстердама.

Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заключения и списка цитируемой литературы, включающего 282 наименования. Диссертация изложена на 231 странице, включает 18 таблиц, 65 рисунков и четыре приложения.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Юркин, Максим Александрович

Основные результаты работы докладывались на

1. VIII-ой международной конференции «Рассеяние света и электромагнитных волн» (Салобрена, Испания, 16-20 мая 2005 г.);

2. Международной конференции «Оптика биологических частиц» (Новосибирск, 3-6 октября 2005 г.);

3. IX-ой международной конференции «Рассеяние света и электромагнитных волн» (Санкт-Петербург, 5-9 июня 2006 г.);

4. Международном семинаре по методу дискретных диполей (Бремен, Германия, 23 марта 2007 г.);

5. Международной конференции «Применение лазеров в науках о жизни 2007» (Москва, 11-14 июня 2007 г.);

6. Х-ой международной конференции «Рассеяние света и электромагнитных волн» (Бодрум, Турция, 17-22 июня 2007 г.);

7. VIII-om международном симпозиуме «Оптическая характеризация частиц» (Граз, Австрия, 9-13 июля 2007 г.);

8. Научных семинарах в Институте химической кинетики и горения СО РАН (Новосибирск, 2004-2007 гг.) и Университете Амстердама (Амстердам, Голландия, 2005-2007 гг.); и опубликованы в следующих работах:

1. Yurkin М.А., Semyanov К.A., Tarasov P.A., Chernyshev A.V., Hoekstra A.G., Maltsev V.P. Experimental and theoretical study of light scattering by individual mature red blood cells with scanning flow cytometry and discrete dipole approximation. // Appl. Opt. — 2005. - V.44. - P.5249-5256.

2. Yurkin M.A., Maltsev V.P., Hoekstra A.G. Convergence of the discrete dipole approximation. I. Theoretical analysis. // J. Opt. Soc. Am. A — 2006. — V.23. — P.2578-2591.

3. Yurkin M.A., Maltsev V.P., Hoekstra A.G. Convergence of the discrete dipole approximation. II. An extrapolation technique to increase the accuracy. // J. Opt. Soc. Am. A - 2006. - V.23. - P.2592-2601.

4. Tarasov P.A., Yurkin M.A., Avrorov P.A., Semyanov K.A., Hoekstra A.G., Maltsev V.P. Optics of erythrocytes. // Optics of Biological Particles., Hoekstra A.G., Maltsev V.P., Videen G., eds. - London: Springer , 2006 - P.231-246.

5. Semyanov K.A., Zharinov A.E., Tarasov P.A., Yurkin M.A., Skribunov I.G., van Bockstaele D.R., Maltsev V.P. Optics of leucocytes. // Optics of Biological Particles., Hoekstra A.G., Maltsev V.P., Videen G., eds. - London: Springer, 2006 - P.253-264.

6. Penttila A., Zubko E., Lumme K., Muinonen K., Yurkin M.A., Draine B.T., Rahola J., Hoekstra A.G., Shkuratov Y. Comparison between discrete dipole implementations and exact techniques. // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transf. - 2007. - V.106. - P.417-436.

7. Yurkin M.A., Maltsev V.P., Hoekstra A.G. The discrete dipole approximation for simulation of light scattering by particles much larger than the wavelength. // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transf. - 2007. - V.106. - P.546-557.

8. Yurkin M.A., Hoekstra A.G. The discrete dipole approximation: an overview and recent developments. // J. Quant. Spectrosc. Radiat. Transf. - 2007. - V.106. - P.558-589.

9. Yurkin M.A., Semyanov K.A., Maltsev V.P., Hoekstra A.G. Discrimination of granulocyte subtypes from light scattering: theoretical analysis using a granulated sphere model. // Opt. Express - 2007. - V.15. - P.16561-16580.

10. Yurkin M.A., Hoekstra A.G., Brock R.S., Lu J.Q. Systematic comparison of the discrete dipole approximation and the finite difference time domain method for large dielectric scatterers. // Opt. Express - 2007. - V.15. - P.l7902-17911.

П.Орлова Д.Ю., Юркин M.A., Семьянов К.А., Мальцев В.П. Оптические свойства гранулярных клеток крови: нейтрофилы. // Вестник НГУ. Серия: Физика — 2007. -Т.2. - №4. - С.83-87.

Заключение

В данной диссертации проведено улучшение метода дискретных диполей (МДД) как в скорости, так и в надёжности, что позволяет моделировать светорассеяние практическими любыми биологическими клетками. С помощью этого метода моделировались индикатрисы клеток крови, измеряемые сканирующим проточным цитометром (СПЦ). Был разработан метод характеризации нативных эритроцитов по измеренным индикатрисам. Была исследована модель гранулоцита в виде зернистого шара, которая объясняет известные экспериментальные данные. Было проведено экспериментальное исследование нейтрофилов с помощью СПЦ и обсуждены различные подходы к решению обратной задачи светорассеяния.

Развитие метода дискретных диполей

Мы провели строгий теоретический анализ сходимости МДД. В области применимости МДД (kd < 2) ошибки ограничены суммой членов линейных и квадратичных по параметру дискретизации у, при этом линейный член существенно меньше для кубовидных, чем для некубовидных, рассеивателей. Относительная важность линейного члена убывает с увеличением размера, поэтому сходимость МДД для достаточно больших частиц квадратична в типичном диапазоне у. Все эти выводы были подтверждены численным моделированием для большого диапазона значений параметров.

Более того моделирование показало, что ошибки не только ограниченны квадратичной функцией, но и могут быть (с хорошей точностью) описаны квадратичной функцией от у. На основании этого факта мы предложили методику экстраполяции для улучшения точности МДД. Эмпирическое изучение эффективности этой методики показало, что она заметно подавляет максимальные ошибки S\\(0), когда параметр наилучшей дискретизации < 0.4 и 0.15 для кубовидных и некубовидных рассеивателей соответственно (при показателе преломления т = 1.5). Качество экстраполяции улучшается с уменьшением ymin, достигая выдающихся результатов, особенно для кубовидных частиц, - уменьшение ошибки более чем на два порядка при Vmin ~ 0.05 для рассеивателей порядка длины волны с т = 1.5.

Мы предложили оценку погрешности экстраполяции и показали её надёжность. В дальнейшем мы использовали этот подход для оценки погрешности моделирования светорассеяния клетками крови, для которых не существует эталонных методов. Эта оценка полностью внутренняя, следовательно она потенциально позволяет создать адаптивный МДД - программу, автоматически улучшающую дискретизацию до достижения заданной точности. Также предложен прямой метод разделения ошибок формы и дискретизации. В частности, максимальные ошибки >Sn(<9) для шара с kD = 10 и т = 1.5, дискретизированного с 16 диполями на диаметр (параметр дискретизации у = 0.93), вызваны, в основном, ошибками формы. Этот метод можно использовать для изучения фундаментальных свойств этих двух ошибок и для непосредственной оценки эффективности различных способов подавления ошибок формы.

Мы разработали ADDA - компьютерную программу на основе МДД для моделирования светорассеяния произвольными частицами. ADDA может параллелизовать одиночное моделирование, поэтому она не ограничена памятью одного компьютера. Мы продемонстрировали её возможности для моделирования светорассеяния шарами с размерным параметрами х до 160 и показателями преломления т до 2. Максимальный достижимый х на кластере из 64 современных процессоров резко уменьшается с увеличением т\ он составляет 160 при т = 1.05 и только 20-40 (в зависимости от критерия сходимости) при т = 2, что связано с медленной сходимостью итерационного метода и следовательно неприемлемо большим временем вычисления.

Ошибки как интегральных, так и разрешённых по углу характеристик рассеяния не зависят систематически от х, но в целом увеличиваются с т. Ошибки эффективности экстинкции QCxt и параметра асимметрии <со$в> лежат в диапазоне от меньше чем 0.01 % до 6%, а максимальные и среднеквадратичные ошибки Su(0) — в диапазонах 0.2-18 и 0.04-1 соответственно. Оценка ошибки с помощью традиционного эмпирического правила Дрейна имеет очень ограниченное применение в этом диапазоне х и т - оно описывает верхнюю границу для ошибок 0Cxt и <cos#>, но даже для них не описывает влияние т.

Мы сравнили ADDA с тремя другими программами на основе МДД и показали, что она не только единственная способна параллелизовать одиночное моделирование, но и самая быстрая и требующая наименьший объём памяти при работе на одном процессоре. Единственным существенным недостатком ADDA по сравнению с другими программами является ограниченный набор заданных форм частиц и негибкая система выбора углов для усреднения по ориентации, которая может приводить к относительно большим ошибкам или временам вычисления.

Мы провели систематическое сравнение МДД и другого метода для моделирования светорассеяния произвольными частицами — метода конечных разностей во временной области (КРВО) - для шаров в диапазоне размерного

195 параметра х вплоть до 80 и т до 2, используя современные программные реализации обоих методов. Отличительной чертой этого сравнения является задание точности характеристик рассеяния, которую должны достичь оба метода. МДД более чем на порядок быстрее при т < 1.2 и х > 30, в то время как при т > 1.7 КРВО быстрее в той же степени, а при т = 1.4 методы сравнимы. Рассмотренные примеры биологических клеток согласуются с выводами для шаров.

Можно заключить, что МДД, и компьютерная программа ADDA в частности, является наиболее подходящим методом для моделирования светорассеяния клетками крови в жидкости, поэтому он и используется в данной диссертации. Методика экстраполяции и внутренняя ошибка погрешности делают МДД точным и надёжным, однако возможно дальнейшее улучшение МДД, особенно для больших показателей преломления. Они могут включать уменьшение ошибок формы, а также улучшение поляризуемости и члена взаимодействия для уменьшения ошибок дискретизации. Предобусловливание матрицы взаимодействия МДД должно быть исследовано для уменьшения времени моделирования и доступности больших х и т. Также требуется систематически исследовать эффективность МДД для комплексных т.

Характеризация эритроцитов с помощью сканирующего проточного цитометра

Было показано, что популярные приближения нативной формы эритроцита сплюснутыми сфероидами и шаровыми дисками в целом неудовлетворительны для точного моделирования индикатрис эритроцитов, кроме нескольких частных случаев. Поэтому мы использовали МДД для строгого моделирования светорассеяния нативными эритроцитами. Мы предложили расширенную четырёхпараметри ческую модель формы эритроцита, в которой все величины, полученные микроскопическими измерениями, являются независимыми входными параметрами. Мы вычислили 40 ООО индикатрис эритроцитов, случайно выбирая шесть параметров: четыре параметра формы, концентрацию гемоглобина НЬС и угол ориентации Д из интервалов, соответствующих литературным данным по здоровым человеческим эритроцитам. Для решения обратной задачи светорассеяния мы разработали % метод, основанный на прямом сравнении экспериментальных индикатрис с теоретическими из насчитанной базы данных. Мы проверили две модификации этого метода.

Мы использовали %2 метод для характеризации эритроцитов в пробе крови, полностью определяя их форму, НЬС и ориентацию в капилляре СПЦ. Результаты для объёма и НЬС были сравнены с другими методами - средние значения совпадают, но стандартные отклонения результатов у1 метода примерно в 1.5 раза больше чем для эталонных методов. Результаты для всех параметров разумные, за исключением минимальной толщины, которая не может быть точно определена х2 методом, ввиду низкой чувствительности индикатрисы к этому параметру. Мы показали, что ориентация эритроцитов в потоке СПЦ практически всегда попадает в интервал /?<= [80°,90°] (диаметр вдоль потока) в согласии с предыдущими оценками на основе гидродинамических вычислений и приближённого моделировании светорассеяния.

Мы также использовали базу данных вычисленных индикатрис для уточнения и проверки ранее предложенного эмпирического метода определения диаметра эритроцита D по положению последнего пика в амплитудном спектре Фурье модифицированной индикатрисы. Коэффициент пропорциональности, определённый линейной подгонкой для модельных данных, составляет 28.643 мкм-градус (при длине волны 0.66 мкм и показателе преломления внешней среды 1.337). Применительно к той же пробе крови спектральный метод приводит к более широкому распределению по диаметру, чем у2 метод, также существует систематическая разница примерно 0.5 мкм между этими методами. Следовательно требуется дальнейшее улучшение обоих методов, а для проверки их точности необходим эталонный метод, например, на основе микроскопических измерений.

Хотя мы и показали, что вышеописанный метод характеризации приводит к разумным результатам, и средние значения согласуются с надёжными эталонными методами, определённо требуется дальнейшая работа, прежде чем внедрять его в клиническую практику. Эта работа включает улучшение скорости и точности х2 метода, а также его надёжности и контроля экспериментальных ошибок. Можно использовать х2 метод совместно со спектральным методом для более точного определения диаметра эритроцита. В завершение, необходимо провести дополнительную проверку на многих пробах крови, сравнивая результаты с эталонными методами, в том числе и микроскопическими.

Поскольку метод характеризации одновременно определяет шесть параметров для каждого эритроцита, он очень чувствителен к ошибкам как моделирования, так и измерений. Поэтому дальнейшее развитие требует прогресса в трёх областях: моделировании светорассеяния, экспериментальном измерении индикатрисы и математике, связанной с процедурой обращения и задачей многопараметрической оптимизации. Всё это значительно усложняет задачу, но её решение позволит существенно повысить точность и информативность клинического анализа эритроцитов на проточном цитометре.

Теоретическое и экспериментальное исследование гранулоцитов

Мы предложили шар с одинаковыми сферическими гранулами в качестве морфологической модели гранулоцита и провели моделирование светорассеяния этой моделью с помощью МДД. Вначале мы рассмотрели интенсивности полного и деполяризованного бокового рассеяния (/ss и /j), которые были ранее предложены в литературе для разделения нейтрофилов и эозинофилов. Общий вид зависимостей /ss и 1± от диаметра гранул dg одинаковый для разных значений остальных параметров модели. Степень деполяризации Dss ведёт себя ступенчато — она почти постоянна при малых dg, потом резко увеличивается в узком диапазоне dg и при больших dg снова почти постоянна. Более того вычисленная Dss численно согласуются с литературными экспериментальными данными для нейтрофилов и эозинофилов.

Аналитические выражения, полученные в рамках приближений Релея-Дебая-Ганса (РДГ) и второго борновского, качественно описывают все эти результаты. Более того, эти выражения численно согласуются со строгим МДД моделированием при малых dg и объёмных долях гранул. Помимо предельной простоты вычисления приближённые теории дают дополнительное понимание феномена светорассеяния и могут быть использованы для создания приближённых методов обращения.

Мы измерили индикатрисы нейтрофилов трёх здоровых доноров с помощью сканирующего проточного цитометра (СПЦ). Величины индикатрис из разных проб отличаются вплоть до пяти раз, что можно объяснить только различием во внутренней структуре нейтрофилов. Мы добавили ядро, состоящее из четырёх эллипсоидов, в нашу модель и провели дополнительное моделирование с помощью МДД. Вычисленные индикатрисы моделей с ядром и без, в целом, согласуются с экспериментом, однако подгонка одиночных экспериментальных индикатрис модельными пока не представляется возможным из-за большого количества параметров задачи. Было определено распределение по диаметрам нейтрофилов с помощью спектрального метода, средние значения составляли от 9 до 10 мкм с различием менее 10% между пробами. Хотя этот метод перспективен для определения диаметра зернистых клеток, требуется его дальнейшая проверка и сравнение с другими методами, например, микроскопией.

Сравнение моделей с разными диаметрами гранул dg показывает, что интенсивность рассеяния 1(0) для каждого угла рассеяния в определяется, в основном, определённым dg. Другими словами, наблюдается качественное соответствие между d[; и 0 — большие dg соответствуют меньшим 0. Решение обратной задачи светорассеяния требует точных экспериментальных данных. Дальнейшая экспериментальная работа должна включать повторное измерение одних и тех же проб для оценки экспериментальных погрешностей, измерение индикатрис эозинофилов и базофилов для подхода к задаче классификации гранулоцитов и измерение поляризационной индикатрисы в качестве дополнительной информации для методов обращения.

Обратная задача светорассеяния для гранулоцитов намного сложнее, чем для эритроцитов из-за их сложной внутренней структуры. Результаты МДД моделирования позволяют приблизиться к этой задаче, однако на данный момент не представляется возможным строго характеризовать отдельные гранулоциты. Следовательно требуется упростить задачу: во-первых, использовать упрощённую модель формы, например, шар с несколькими популяциями гранул и ядром, адекватность которой следует проверять сравнением с точной трёхмерной моделью, полученной, например, с помощью конфокальной микроскопии. Во-вторых, можно использовать приближённые теории светорассеяния, например РДГ, для характеризации отдельных нейтрофилов или для определения средних по пробе морфологических параметров путём анализа усреднённых индикатрис.

Параметры гранулоцитов, определённые этими (приближёнными) методами, такие как зернистость или средний размер долей ядра, будут иметь немедленное клиническое применение. В этом случае сканирующий проточный цитометр сможет заменить трудоёмкие наблюдения под микроскопом, который используются на данный момент для определения этих свойств гранулоцитов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Юркин, Максим Александрович, Новосибирск

1. Williams Hematology, 6th ed., Beutler E., Lichtman M.A., Coller B.S., Kipps T.J., Selingsohn U„ eds. - New York: McGraw-Hill Co., 2000. - 1941..

2. Flow Cytometry and Sorting, 2nd ed., Melamed M.R., Lindmo Т., Mendelson M.L., eds. New York: Wiley-Liss, 1990. - 824P.

3. Givan A.L. // Flow Cytometiy: First Principles, 2nd ed. New York: Wiley-Liss, 2001. - 280P.

4. Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis., van Dilla M.A., Dean P.N., Laerum O.D., Melamed M.R., eds. New York: Academic Press, 1985. - 300P.

5. Flow Cytometry Protocols., Jaroszeski M.J., Heller R., eds. Totowa, USA: Humana Press, 1998. -274P.

6. Terstappen L.W.M.M., de Grooth B.G., Visscher K., van Kouterik F.A., Greve J. Four-parameter white blood cell differential counting based on light scattering measurements. // Cytometry 1988. - V.9. - P.39-43.

7. Maltsev V.P., Semyanov K.A. // Characterisation of Bio-Particles from Light Scattering. -Utrecht: VSP, 2004. I32P.

8. Kaye Р.П., Aptowicz K., Chang R.K., Foot V., Videen G. Angularly resolved elastic scattering from airborne particles. // Optics of Biological Particles., Hoekstra A.G., Maltsev V.P., Videen G., eds. London: Springer, 2006 - P.31 -61.

9. Wintrobe's Clinical Hematology, 11th ed., Greer J.P., Foerster J., Lukens J.N., eds. Baltimore, USA: Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 2003. - 2800P.

10. Bonetta L. Flow cytometry smaller and better. // Nature Methods 2005. - V.2. - P.785-795.

11. Бореи К., Хафмен Д. // Поглощение и рассеяние света малыми частицами. М.: Мир, 1986.-664Р.

12. Wheeless L.L. Slit scanning. // Flow Cytometry and Sorting, 2nd ed., Melamed M.R., Lindmo Т., Mendelson M.L., eds. New York: Wiley-Liss, 1990 - P.109-126.

13. Condrau M.A., Schwendener R.A., Niederer P., Anliker M. Time-resolved flow-cytometry for the measurement of lanthanide chelate fluorescence . I. Concept and theoretical evaluation. // Cytometry 1994. - V. 16. - P. 187-194.

14. Neukammer J., Gohlke C., Hope A., Wessel Т., Rinneberg H. Angular distribution of light scattered by single biological cells and oriented particle agglomerates. // Appl. Opt. 2003. -V.42. - P.6388-6397.

15. Doornbos R.M.P., Schaeffer M., Hoekstra A.G., Sloot P.M.A., Degrooth B.G., Greve J. Elastic light-scattering measurements of single biological cells in an optical trap. // Appl. Opt. 1996. -V.35. - P.729-734.

16. Salzman G.C., Singham S.B., Johnston R.G., Bohren C.F. Light scattering and cytometry. // Flow Cytometry and Sorting, 2nd ed., Melamed M.R., Lindmo Т., Mendelson M.L., eds. New York: Wiley-Liss, 1990 - P.81-107.

17. Maltsev V.P. Scanning flow cytometry for individual particle analysis. // Rev. Sci. Instrum. -2000. V.71. - P.243-255.23