Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ионизирующего излучения с различной ЛПЭ на состояние хроматина в клетках млекопитающих и его взаимосвязь с индукцией и репарацией хромосомных повреждений

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние ионизирующего излучения с различной ЛПЭ на состояние хроматина в клетках млекопитающих и его взаимосвязь с индукцией и репарацией хромосомных повреждений"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ РЕНГТЕНО-РАДИШОГИадсКИЙ ИНСТИТУТ МИНЗДРАВА РОССИИ

На правах рукописи УДК 577. 391:570.315:42/45:576.315

АДНАН ЮЯ'ИАР

ВЛИЯНИЕ И0НИЗИРУКЩГ0 ИЗЛУЧЕНИЯ С РАЗЛИЧНОЙ ЛПЭ НА СОСТОЯНИЕ ХРОМАТИНА В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ЕГО ВЗАИМОСВЯЗЬ С ИНДУКЦИЕЙ И РЕПАРАЦИЕЙ ХРОМОСОМНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ

03 00 01 - Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1 13 9 3

решгеяо-радгвлога^.КиЛ зпгтитут !»3 СССР

Работа выполнена в Отделе молекулярной и радиационной биофизики Санкт-Петербургского института ядерной физики РАН км.5.П.Константинова.

Научные руководители : доктор биологических наук

О.В.Малиновский, кандидат биологических наук Н.Я.Гильяно.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

А.С.Ягунов. доктор биологических наук М.В.Архипов.

Ведущее учреждение - Институт физической химии РАН .

Защита диссертации состоится "2В " аттгеля_1993 г. в

чаооь на заседании специализированного совета Д 074.25.01 при Центральном научно-исследовательском рентгено-радиологическом Институте МЗ России по адресу: 188646.С-Петербург,Песочный - 2, ул.Ленинградская, д.70/4. С диссертацией можно ознакомиться•в библиотеке института.

Автореферат разослан. " 27 " Марта _1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета.

доктор медицинских наук

Л.И Корытова

- 3 -

Общая характеристика работы Актуальность теш: Изучение апологического действия ионизирующего излучения становится все более необходимым б связи с расаи-ряквдмся применением атомной энергии и радиоактивных изотопов. В основе лучевых реакций клетки лежат нарушения функций ядрч. Особое место принадлежит молекулярным повреждениям генетического аппарата ¡тетки, в частности ДНК в составе хроматина. Внход отдельных ради-ационно-химических повреждений и характер превращений нукле/новых кисдог,возникающих в результате зтих повреждений, во многом зависят от состояния нуклеиновых кислот. Под состоянием нуклеиновой кислоты понимают компактность ее упаковки в хроматине, взаимодействие с ядерными белками и другими веществами. Формирование хроматина происходит благодаря упорядоченной сборке ДНК и белков. В этой сборке определяюиуо роль играют белок-белковые и нуклеии-бел-ковые взаимодействия, приводящие к формированию структуры хроматина. В основе оборки хроматина лежит молекулярное узнавание, которое определяет такте взаимодействие промотора с РНК-подимеразой, операторов с репрессорами, управление транскрипцией.репликацией и другими процессами, которые и выражают функцию этого надмолекулярного комплекса. Перечисленные процессы настолько важны для клетки, что самое слабое их искажение отражается на судьбе клетки. По-видимому, клеточный ответ на повреждение ДНК координируется на уровне структуры хроматина. Все типы первичных повреждений ЛИС могут быть трансформированы л фиксированные мутации. Какой тип первичных повреждений приводит к тем или иным видам мутаций, по,ка сказать трудно,' поскольку повреждающие агенты, как правило, индуцируют целый спектр первичных повреждений. Ответ на этот вопрос помогут получить: 1) исследования с использованием воздействий, индуцирующих строго определенный тип повреждений; 2) сравнительный анализ эффективности излучений разного .качества, индуцирухж;« один и тот спектр первичных повреждений, но в различных соотношениях; 3) оценка зависимости трансформации первичных повреждений ЛЖ в Фиксированное мутации при модификации метаболической активности ¡слеток; 4) модификация радиационного поражении меток условиями пострадиационной кнкусзции. Усиление или оелайлеяие радиационного эффекта теми или иными модификатор««: рэд'ацгонкоги лощения позволит лучае понять не только природу перзичнщс чорре.ч'.онии, не таете и проследить >п гразс^лдию в фиксиро&зннне попре/^^нил,

приводящие ъ конечном счете к инактивации клетки.

Цель и задачи исследования: В связи с вшеизлтаенным, целью настоящей работы является .«'¿следование взаимосвязи конформационных изменений хроматина о индукцией и репарацией хромосомных повреждений после действия ионизирующих излучений разного качества.

Для выяснения этой взаимосвязи следовало решить следующие задачи-

1.Исследовать изменения конформации хроматина в клетках в процессе' клеточкой пролиферации и после воздействия различных доз УФ,рентгеновых лучей и нейтронов деления.

2.Оценить зависимость индуцированной ионизирующим излучениек декондексации хроматина от стадии клеточного цикла и возраста облучаемого животного.

3.Оценить влияние ингибиторов топоизомеразы II с разным механизмом действия на состояние хроматина в клетках и на индукцию I репарацию хромосомных повреждений в клетках, облученных УФ, рентгеновскими лучами и нейтронами.

4.Исследовать влияние полиаминов, в частности спермидина, » состояние хроматина в клетках и на индукцию и репарацию хромосом кку аберраций после облучения клеток УФ,рентгеновыми лучами нейтронами деления.

Ь.йчучить зависимость индукции и репарации хромосомных аОерра цлй от исходного уровня конденсации.

6.Оценить зависимость индукции и репарации хромосомных аберра 1Ий при облучении клеток, предобработанных ингибиторами ацетшшро занпя, метилирования, ДЦФ-рибоэилнрования.

Научная новизна. Впервые с помощ>ю метода проточной цитомет ри показана дозе-зависимая деконденсация хроматина гепатоцитов п. облучении кркс рентгеновыми лучами и нейтронами деления в маль дозах.Обнаружена зависимость данной реакции клеток на облучение с ета".!:и меточного цикла, ЛПЭ излучения и возраста облучаемого аа нотного. Впервые показана зависимость процесса рэпарации хромссо* нкх поарехдекий от состояния хроматина в клетках в момент облуч< ния. Продемонстрирована возможность модификации репарационно: • процесса с лсмохул изменения степени конденсированаости или деко; дексировакноста хроматина.

г;

- о -

Научная к практическая ценность. Благодаря раэработг-ннсчу в лаборатории цигомегрическому методу оценки кокформации хромэтига з клетках была получена возможность изучения зияния малых дез ионизирующего излучения на деконденсацию хроматина .Процесс дскопзен-сащш хроматина сопровождает целый ряд клеточных процессов, )а:-:их как транскрипция,репликация,репаргдия. Изученная нка аачисимссть процесса репарации хромосомных повреждений от степени конденсированное ти хроматина в клетках подтверждает эту взаимосвязь. Результаты наших экспериментов позволили нам предположить, что процесс репарации хромосомных повреждений детерминирован доступностью поврежденных участков действию ферментов репарации. Декондэнсышя хроматина в клетках может быть предложена в качестве биологического дозиметра малых доз ионизирующего излучения.Автоматизация анализа и простота приготовления препаратов позволяют анализировать большое количество проб с достаточно большой статистической достоверностью. Возможность идентификации покоящихся и пролифэркруюЕНХ клеток по степени конденсированное™ хроматина, позволяет нам предложить этот метод для анализа популяции опухолей, для более успешного применения как химической, так и лучевой терапии.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 1-м Всесоюзном радиобиологическом съезде, Москва, 1689: на б-м Всесоюзном совещании по микредозиметрии, Канев..1989: на Всесоюзном совещании "Генетические последствия загрязнения окрузкатаой среды мутагенными факторами", Самарканд, 1990: на 24-м Ежегодном совещании Европейского общества радиационных биологов, Германия, Эрфурт, 1992.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б работ.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав и выеодов, содержит 11 таблиц, 19 рисунков. Список литературы включает 253 названия, из которых 23 на русском языке и "30 на английском языке.

Материал и метода исследования.

Работа выполнена на еанцзх белых крыс питомника "Тапполово". Материалом исследования служила печень крыс. Стимуляцию гепатоци-тпз к пролиферации проводили с помощью частичной гепьтэктомии.Клеточную суспензии гепатоцитов получали с помощью перфузии печени раствором цитрата натрий. Для штогеначического анализа готовили ыазки на предметных стеклах с последующей их фиксацией этанолом и окраской бромистым этидием для анализа на флуоресцентном микроскопе " 0F-TCN ".Экспериментальный материал получен при исследовании 2000 тавотных. . Эксперименты проводились и на клетках человеческой карцинош линия HeLa и фиробласты Китайского хомячка V-79 в культуре. В качестве питательной среды использовали среду Игла с 15% содержанием сыворотки крупного рогатого скот?.. Для цитогенетическо-го анализа клетки раееевали в пенициллиновые флаконы с покровными стеклами и всю обработку и облучение проводили на стеклах, затем стекла еынимзли из бутклечек с питательной средой, промывали в растворе Хенкса и фиксировали этанолом. Синхронизация клеток в культуре проводилась с помгацыо миготической селекции,основанной на различной адгезивности ингерфазных и митотичееких клеток.Для анализа кон$орыационного состояния хроматина клетки окрашивали бромистым этидием в низких, ненасидачицих концентрациях. Фиксированные этанолом клетки отмывали от фиксатора раствором 2 SSC(0,3M NaCl и Ü.03M цитрата Na). Затем клетки обрабатывали з течение часа в растворе ГНК-азы (.конц.ОДмг/мл предварительно прогретой до Р5°С) при 37 О.Затем отмывали от РНК-а&ч растзором'и помещали в раствор кр?.сигеля в конечной концентрации 10 М, столь низкая концентрация интернирующего красителя не вызывала конформационных изменений в еамей молекуле ДНК. Для адекватности определения изменений связывания красителя с молекулой ДНК во всех исследуемых пробах выдер-:ы:валао1 одинаковая концентрация клеток и красителя.Обработка клеточных культур ¡иглоиторами толонэомэраз.деацетшаз, метилирования к АГ^-ркбозклирозанля провздоаоъ га час до облучения в концентрациях: ;-:ово5::оц;:н(0,?.мг/мл), с-дриьмицин(0,001мг/мл;, спермидин (0,01 1-с'мл; .Сутир&т Na ( 0.55мг/мл),5-&зацитиди.чоо1мгЛ:д) ,3-акиноОенза-уил iS мМ/мл).Время инкуоьции клеток э питательна": среде с ингибиторами варьировало от 1 часа да А часов.Для большинства используе-уых ингибиторов не зарегистрировано существенного влияния времени инкуСадм, иск.-:очек::е состаьляе? адр^з^^цин. Для :;::тогекетическзго

анализа был выОран гнафазным метод учета хромосомных аберраций, причем учитывались асимметричные хромосомные переетгойгл -мосты и фрагменты,выход которых коррелирует с клеточной выживаемостью. Облучение проводили на рентгеновской установке "РУН-11" при напряжении 250 кВ.силе тока 15 мА,фокусном расстоянии .1С см, фильтрах 0.5 мм Си + 1 мм AI и модаости дозы 1,04 Гр/мин.Облучение нейтронами с энергией 0,85 МэВ проводили на реакторе ВВР-Ч П'/яг> РАН в специально оборудованном для радиобиологических экспериментов вертикальном канале. Дозиметрия в рабочем объеме биологической камеры осуществлялась с помощью двух ионизационных камер - полиэтиленовой и графитовой. Погрешность измерения мощности дозы приблизительно 15Z. Неравномерность нейтронного и гамма-поля в рабочем обьеме биокамеры не больше 10%. Облучение биообъектов проводили при тепловой мощности реактора 16+18 Мвт. Мощность дозы нейтронного облучения при этом была 0,3-0,33 Гр/мин.Облучение УФ проводили на лампе ЕУФ-ЗО,. при моодости 1 ДжУм в сек.Цитофдуорометрический анализ проводили на лазерном проточном цитометре .созданном в Отделе молекулярной и радиационной биофизики ЕМЯФ. Программная обработка цитометрических данных на ЭЗМ написана Л.К.Валеевым, она вычисляет общее число зарегистрированных клеток, количество клеток, принадлежащих клеткам разной плоидносли, вычисляет положение мод для клеток каждого уровня плокдности и коэффициент вариации для каадой группы клеток. За повтсрность принималось кэдое отдельное животное или отдельный эксперимент для клеток клекопитах-ддх в культуре. На каждую экспериментальную точку, приходилось от А до 8 животных, повторность экспериментов колебалось от 3 до 5 раз.

Результаты и обсуждение.

1.Исследование ¡информационных изменений хроматина в гепатоцитах крыс в процессе клеточной пролиферации.

Рассмотрим взаимосвязь конформационшх изменений хроматина с процессом клеточной пролиферации. Наиболее удобным объектом для этих исследований являются клеточные системы со стимулированной пролиферацией,в частности гепатоциты половозрелых крыс.На рис.1А представлены результаты наших экспериментов по исследования изменения конформации хроматина в гепатоцитах негепатэктомирозанкых крыс и гепатоцитах крыс, стимулированных к пролиферации частичной

100 (50 200 250

£0 1оо 15о

Рис.! Мэм&ненке интенсивности флуоресценции комплекса ДНК-бромис-гын этидий в клеточном процессе пролиферации генатоцитов (1) и 1 процессе естественного старения крыс (2).

1 а - гепатоцити негепатэктомированных крыс ( 6о ); б,в,г • гепатотти через 6 часов (61),20часов (Э ),24чгса (62) пос ле гепатзктомип .соответственно.

2 : а,б,в,т - гепатоциты 30-ти, 60-ти, 90 ч 120-тидневных

крыг, соответственно. По оси абещюс - номер канала флуоресценции. По оси ординат - колтество клеток (в отн.ед.).

генатэктомией. Из гистограмм видно, что интенсивность флуоресценции (или увеличение связывания бромистого этидя с ДНК) возрастает с увеличением времени от момента стимуляции ¡слеток к пролиферации. Наибольшее изменение интенсивная флуоресценции набладзлось для клеток, находящихся в ДйК синтетическом периоде клеточного цикла.

Бри сравнений гистограмм 1 с 2,3 отчетливо видны различия в связывании красителя непролиферирующими (йо)и пролчфераруюцимч ге-латоцитами(В1,5,б2).Идентификация с помоя^ю красителя покоящихся м гролиферирующих клеток имеет большое практическое значение, поскольку мзвестно.что в большинстве своем солидные опухоли состоят из Go клеток, более резистентных как кхимио-,так и к радиотерапии, способных к пролиферации, а значит, к росту опухоли.Кроме того, структурная .организация хроматина играет важную роль в злокачественной трансформации зукариотачес.чих клеток. Дозы канцерогенов, вызывающих опухоли для регенерирующих геиатоцктов, меньше. чем для неделящихся.Связывание канцерогенов и мутагенов чаще происходит в тех районах ДНК, козорно более деградирсваны экзогенными нуйлеазами.

2. Влияние ионизирующего излучения на конфирмационные изменения хроматина в гепатоцитах облученных крыс.

Радиация вызывает дезагрегацию ядерного хроматина в интерфазных ядрах.Результаты наших экспериментов по влиянию ионизирующего излучения на конформациокиые изменения хроматина проводились при облучении целого организма, а анализ Информационных изменений проводили не на клеточном лиэате.а на целых клетках, что позволяет исключить влияние условий лизиса на результаты экспериментов. На рис.2А представлена дозовая зависимость увеличения декондэнсации хроматина в гепатоцитау негепатэктомировакных крыс, облученных рентгеновыми лучами. Из гистограмм видно, что с увеличением дозы облучения интенсивность флуоресценции комплекса ДКК-бромистый эти-дий (оцененная по положению пина флуоресценции) увеличивается. Однако. это увеличение достигает некоторого плато, после которого дальнейшее увеличение доэк не приводит к увеличению связывания красителя с ДНК. По-видимому, в этом диапазоне доз в большей степени начинают проявляться повреждения молекулы ДНК, а не хроматина. и процессы доступности красителя и повреждения ДНК работают в противоположных направлениях: доступность увеличивается, количест-

- то -

Рис.2. Изменение интенсивности флуоресценции комплекса ДНЯ-бромистый етидиЯ з гепатоцитах кегепатэктомированных (А,В) и иерез б часов после гепатэктомии (Б,Г) облученных в различных в различные дозах Х-лучат (А,Б), и нейтронам:! деления 0,85 МэВ (В,Г). А: 1,2,3 - 30-тк, 60-ти и 90-дневные крысы, соответственно. Б: 1,2 - 40 и 65-ти-дневныэ крисы, соответственно. В.: I и 2 - 20-ти и 40-днев-шэ крысы, соответственно. В: I - 30- дневные крысы. По оси абс-дисс - доза облучения (о Гр). По оси ординат - Интенсивность флуоресценции относительно к не облученному контролю 'в отн.ед.).

- 1Г -

венность связиваяия уменьшается.

Индукция деконденсации хроматина в гепатоцетах крыс меняется на протяжении клеточного цикла. Для 61-периода существенной раэтшу в индуцированной излучением деконденсации хроматина по сранению с Со не наблюдается (рис. 26) .Положение плато прикерко з одном и том к> диапазоне дез 4--6Гр. Для клеток, находящихся з момент облучения п. Б- и в 62-периодах, индуцированной излучением деконденсаши хроматина зарегистрировано не было. По-видимому, уровень деконденсаци:? хроматина, сопровсодавдий пролкфератквный процесс з клетках, к 20-24 часам после стимуляции гепатоцитов к делению достаточно висок и на его фоне вклад деконденсации, индуцированной излучением, не регистрируется.Кроме того, при сопоставлении положения пиков флуоресценции гепатоцитов негепагэктомированных крыс .облученных ь дозе 4Гр, с положением пиков флуоресценции гепатоцитов гепатэкто-иированннх крыс через 20-24 часа после гепатзктошод р.идко, ч^о вролиферативвый процесс индуцирует примерно так?» же декокденсацгсэ •<ак и облучение в доев 4Гр. Исследование зйфэкглгности нейтронного здучэния на процесс деконденсацци хроматина проводили на негепа-гэктомировантге кивотаих, чтобы исключить вклад деконденсатм.нн--кодированный пролифэративным процессом.Результаты экспериментов тредставлепу на рис.2 в, лз которого видно, что при нейтронном обручении жявотиих. таге же, как и при облучении рентгеновыми лучами, 1а5лодается доеовая зависимость увеличения иктеркаляции красителя 1 ДНИ гопатоцктов облученных крнс.Однако,несмотря на. то, что дозы [ейтронного облучения были достаточно высокими, плато декоьденса-цш ' хроматина в диапазоне доз 4-6Гр,гсак при рентгеновской излучение не наблюдалось. Только при увеличении дозы до 10Гр не наблюдаюсь дальнейшего увеличения интенсивности флуоресценции. Это города о том, что в индукции деконденсацчи хроматина нейтронное яалу-ениэ менее эффективно, чем рентгеновское. Аналогичная обратная ависимость от ЛПЭ излучения характерна, например, для точковш утаций в отличие от хромосомных.По-видимому, величина локально ыделенной энергии, столь важная для индукции разрывов ДНК.хромо-омных аберраций и клеточной выживаемости, в данной реакции ¡слеток е является определяющей. Число событий ионизации,которое больше ри редкоионизирувдем излучении, в данном случае шеет большее качение.

- 12 -

3. Исследование конфоршщюяних изменений хроматина в гепатоштах крыс разного возраста.

Результаты экспериментов,выполненных на крысах разного возраста,представлены на рис.1 (В) . Иь гистограмм нетрудно заметить,, '.то с увеличением возраста тавотного увеличивается степень декон-денсации хроматина в клетках.Еторым возрастным показателем является увеличение уровня полиплоидизации гепатоцитов, что такта наглядно представлено на этих гистограммах.

В работах, выполненных на животных разного возраста.ш исследовали индукцию деконденеации хроматина в негепатэктомированных животных нейтронами деления со средней энергией 0,85 ГОВ и Х-лучей рис.2(А ,В). Эффект индуцированной излучением деконденеации был зарегистрирован только для относительно молодых крыс120-ти,60-та дневных), а для более старых(100-ти дневных) не наблюдался. Старение организма сопровождается нарушением стабильности генетических структур клетки: на молекулярном уровне - это накопление повреждений ДНК,а на клеточном -повышение спонтанного уровня хромосомных повреждений.В то же время не зарегистрировано существенных различий в эффективности репарации повреадений ДНК и активности репарационных ферментов в клетках молодых и старых особей(Тегпег еиа1. ,1982;Газиев и др,1982)

Для двух возрастных групп крыс нами был оценен уровень спонтанных хромосомных аберраций.Крыс подвергали частичной гепатзктомии у через 27 часов (пик митотической активности) фиксировали материал. У месячных крыс 10% анафаз были аберрантными, а у 4-месячных крыс 25Х анафаз были аберрантными.Корреляция степени деконденсиро-ьаннос-ти хроматина с уровнем хромосомных повреждений при условии отсутствия зависимости от возраста процесса репарации разрывов ДНИ и активности репарационных ферментов, позволяет предположить,чте конфоразщя хроматина играет существенную роль в аккумуляции повреждении наследственных структур клетки в процессе естественного старения.

4.Исследование кенформациокиих изменений хроматина в кдетка> млекопитающих в культуре после воздействия нониаирущего излучени;

Иссд£.дованме влияния ионизирующего излучения на конформацион-яые игменйкйл хроматина сыди пг-овелекы на клетках Ней. Глспериыен-

ту га клетка:; ияекоштадик л к/ттур<? представляют более корректную информации о слиянии ионизиру/щэго излучения на кокформацию хро/.еткна,поо1со.шсу исключают разброс между индивидом®«». При облучении клеток НэЬатак ао „как и при обгучояш крыс, оыло зарегистрировано зависимое от дозы увеличение ;,еконденсации хроматина. При облучении рентгеновыми лучами ечп зарегистрирован порог при облучении клеток в диапазона 4-6 Гр. Бз рис.З(Б) предстазлены гистограммы распределиут меток по содержанию дик при облучении их в стационарной фазе роста (61-перксч>.). Совладение диапазона доз, при котором эффект деконденсации дос?мгает"яасьщения"для гоиатоиитоз и для ¡слеток Н<з1л, проинициировал нас проверить ецз один тип клеток, а именно лимФоцити периферической крови человека. 6о-лимфоциты оказались очень чувствительной системой,они также продемонстрировали зависимую от дозы облучения декондексацмо хроматина, однако плато в этой клеточной реакции у них наступал при облучении в дозе 1Гр. Таким образом, деконденсация хроматина индуцируется дозозави-симым образом не только при облучении животных, но и при облучении клеток. И в том и в другом случаях регистрируется плато данного эффекта радиации. Дозц, при которых регистрируется плато,аазисят от типа клеток.Нейтронное излучение индуцировало тшоке зависимое от дозы увеличение ингеркаляции бромистого этидия в ДНК клеток НеЬа.Результаты экспериментов представлены на рис.3 (А). Плато насыщения эффекта наблюдалось в диапазоне ЮГр.Для клеток грызунов, облученных УФ,показано либо отсутствие,либо более медленное удалениз пкримидиновых диыеров в процессе фотореактивации.и,следовательно. меньшее количество одненитевых разрывов,по сравнению с клетками человека. Используя фибробласты Китайского хошчка линии У-79 с очень малой продолжительностью 61-пермода.и,следовательно, с малой эффективностью зкецизионяой репарации пиримядиновых дилеров, мы попытались выделить вклад. оОдусдовленный разрывами в цепи ДНК. в процесс изменения интенсивности флуоресценции комплекса Д1И-бромистый зтадий.На рис.3 (В), представлены гистограмму распределения клеток по содержанию ДНК после облучения в различных дозах УФ. Из гистограмм видно,что УФ так яз, как и рентгеновы лучи и нейтрону,индуцирует зависимое от дозы увеличение дековденсгцми хроматина.Однако,и в случае облучения клеток УФ.наблюдается плато, :оторое зарегистрировано нами при облучении исток з дозе 15?х/м .

10

-4-1-Г-

15 №A¡*

*[> 100 /so J 50

Рис.3.Изменения интенсивности флуоресценции комплекса ДНН-бромис-тый этад1й в клтках млекопитающих в культуре,индуцированное облучением в различных дозах УФ, Х-лучами и нейтронами деления.

i и 2 : клетки Hela, облученные нейтронами деления и Х-лучами. 3 : клерки Y-79, облученные УФ. По оси абсдасс - номер канала флуоресценции. По осп ординат - количество клеток (в отн.ед.).

- 15 -•

5.Оценка индукции .хромосомных аберраций в клетках с исходно различной степенью конденсированнссти хроматина.

Известно,что изменения в конформации хроматина во время прохождения клетками стадий клеточного цикла после облучения драматически влияют на выход хромосомных повреждений (Pantallas,1986). На одной и той же клеточной системе, клечках HeLa,синхронизированных в 31 и toóse, мы допытались выяснить взаимосвязь между радиочувствительность» клеток и степенью конденсации хроматина в момент Облучения. Значительных различий в радиочувствительности клеток, находящихся б этих периодах, не зарегистрировано. Возникшие, сразу же после облучения повреждения ДНК нестабильны и способны к взаимодействию: либо они реларируются с восстановлением исходной структуры, либо - два повреждения могут провзаимодействовать друг с другом. Время, в течение которого индуцированные ионизирующим излучением повреждения способны провзаимодействовать, обычно определяется с помощью фракционирования дозы облучения.При этом частота хромосомных аберраций измеряется как функция от времени между двумя облучениями. Для определения временного фактора в эффекте реализации первичных повреждений в хромосомные аберрации клетки HeLa облучали рентгеновыми лучами однократно в дозе 4 Гр и фракционировали эту дозу на две равные фракции с различным временным интервалом от 20 минут до 2-х часов.Оптимальное время, в течение которого протекают процессы репарации,которые мы регистрируем по уменьшению числа хромосомных аберраций , соответствует 60 минутам. В течение 60 минут культивирования клеток в нормальной питательной среде при температуре 37 С, одни и те хе клетки Hela,облученные в стационарной Фазе роста (Gl-периоде) и в митозе, по-разному репа-рировали повреждения от одной и той же дозы рентгеновского излучения (Рис.8). Клетки, находящиеся в этих двух периодах клеточного' цикла, различаются между собой по степени конденсироЕаннэсти хроматина. Отсутствие репарации первичных повреждений, индуцированных первой фракцией дозы в течение оптимального временного интервала, зарегистрированного для этих клеток, позволяет предположить, что вероятность взаимодействия первкчшгх повревдещй в конденсированном хроматине выше, чем в дисперсно«.Следовательно, в митотических клетках процессы фиксации повреждений превалируя? над процессами их репарации.

- Г6 -

6.Влияние спермидина на ¡информация хроматина, индукцию и репарацию хромосомных повреждений в клетках млекопитающих.

Клетки НеЬа в стационарной фазе роста перед облучением инкубировали в питательной среде со спермвдином в конечной концентрации 0,01 иг/ил.Используемая концентрация спермидина не ингибирова-ла роста клеток, что позволило нам оценить влияние спермидина на выход хромосомных аберраций в облученных клетках.После облучения клеток в различных дозах Х-лучами не варегистировано существенного увеличения в выходе хромосомных аберраций ( Рис.4 Б).Однако,эффективность фракционированного облучения существенно уменьшалась,по сравнению с необработанным контролем (Рис.8 ) изменяла степень конденскрованности хроматина в клетках (рис.7 Б), и тем,видимо, определялся выход хромосомных аберраций при фракционировании дозы облучения.

Индукция повреждений ионизирующим излучением разного качества , так же,, как и степень конденсации хроматина, позволяют проследить за ролью фактора пространственного распределения первичных повреждений.На рис.4 представлены кривые дозовой зависимости выхода хромосомных аберраций для клеток,обработанных спермвдином и затем облученных УФ, Х-лучами и нейтронами деления.Из рисунка видно, что спермздии практически не модифицирует повреждения, индуцированные нейтронами и Х-лучами, но статистически значимо увеличивает выход хромосомных аберраций в У0-облученных клетках Не1а.Пиримиди-новые димеры ,индуцированные УФ-лучами в клетках,представляют собой топологически зависимые первичные повременив,посколысу для их репарации необходимо т быть узнанными ферментами репарации. Увеличивая степень конденсированности хроматина, спермидин не только уменьшает вероятность диме^ов быть узнанными ферментами репарации, но и увеличивает вероятность неотрепарированных повреждений прсв-заиыодействовать.между собой. Меньшая эффективность спермидина в клетках облученных Х-дучами и нейтронами деления объясняется, по-видимому, тем,что эти виды излучения индуцируют разрывы в цепи ДНК,которые не способствуют конденсации хроматина. Кроме того, . первичные повреждения, индуцированные плотноиониэирущим излучением, являются слабо модифицируемыми повреждениями.

Ряс.4. Влияние спершдина (А) и новобиоцнна (Б) на пкход не-абарралтных анафаз клеток НвЬа , облученные в различных дозах УФ (1), Х-лувдми (2) и нейтронам делений 0,85 ИэВ (3). I - без обработки, 2 - после обработки либо епершдлном, либо новобиоцином. По оси абсцисс - доза облучения (для I -в Дж/м^, для 2 и 3 в Гр). По оси ординат - доля неаберрмгг-ных анафаз (в %).

- 18 -

7.Влияние ингибиторов топоизомеразы II на конформацию хроматина, индукцию и репараций хромосомных повреждений в клетках млекопитающих.

Ь эксперимента* по исследованию влияйй*-ингибиторов íGuí¡ i¡ на процесс индукции и репарация хромосомных повреждений ш использовали два ингибитора топо 12 - новобиоцин и адриамицин. Выбор этих ингибиторов был обусловлен тем, что во-первых, они были в наличии во-вторых, механизм их ингибирующего действия на топо 11 -разный. Большинство работ,посвященных исследованию зависимости процессов репарации с активностью топомзомераз,выполнены с использованием неспешфического ингибитора топо II - новобиоцина.Представлялось интересным не только проследить зависимость активности топоизомераз на индукцию и репарацию хромосомных аберраций, но и сраЕнить эффективность двух ингибитороз топо II. На рис.4 В представлены кривые дозовой зависимости для клеток HeLa обработанных новобиоцином и затеи облученных УФ, Х-лучами и нейтронами деления. Иа кривых видно, что больная модифицируемость повреждений наблюдается в УФ- облученных клетках.Это еще раз подтверждает большую топологическую зависимость репарации пиримидиновых дшеров, по сравнению с повреждениями, индуцированными ионизирующим излучени-ем.Наблюдается таете усиление повреждающего действия Х-лучей ново-биоцином .что, возможно, является результатом не только ингибирова-ния активности топо Б, но и результатом ингибирования полимеразной активности (Collins,1990).Отсутствие модифицирующего эффекта ново-биоцина при облучении газеток нейтронами»по-видимому, указывает на то, что топологические изменения не столь важны для репарации или Фиксации повреждений,индуцируемых плотноионизирукшдам излучением, посколоку в ■ этом случае велика вероятность.фиксации первичных повреждений.Лля адриамицина в предварительных экспериментах была зарегистрирована зависимость выхода хромосомных аберраций от времени инкубации клеток к среде с алриамицином.Обработка клеток перед облучением адриамицином . не увеличивала чувствительности клеток к действию рентгеновского излучения, а при одночасовой инкубации даже наблюдалось некоторое уменьшение радиочувствительности (Рис.6 А).Известно, что адриамицин'Стабилизирует комплекс ДНК-ги-разы за счет свивок разорванных фосфодиэфирных связей белками.Это затрудняет реализацию разрывов ДНК в хромосомные разрывы .предотвращая их взаимодействие друг с другом. Поскольку эффект адриамици-

на на топоизомеразы обратим, и фиксация разрывов ДЧК белками исчезает, то интересно проследить, во-первых,зависимость этого эффекта от времени после обработки; и, во-вторых, влияние этой модификации первичных повреждений на процесс репарации хромосомных повреждений при Фракционировании дозы облучения. На рно.8 Д,Е представлены диаграммы выхода хромосомных аберраций для клеток обработанных адри-змкцином в течение 1 и 4 часов перед облучением однократно в дозе 4 Гр или фракционирование 2Гр + бОмин.инкубации при 37 С + 2Гр. Из диаграмм видно, что в обеих случаях адриатщив снимал эффект фракционирования дозы облучения. При исследовании влияния адриамицина за конформацию хроматина в клетках, мы наблюдали четко регисгриру-эмую индуцированную вдриамицином конденсацию хроматина (Рис.7 Б).

Таким образом, используемые нами на модификации степени конденсации хроматина три агента: спермидин -прямо не влияющий ни на зепарационный процесс,ни на ферменты,меняющие топологию ДНК; ново-5И0ЦИН- влияющий и на репарационные ферменты и на ферменты,меняйте топологию ДНК; адриамицин -влияющий на ферменты,меняющие топо-югим ДНК;- подавляли репарации хромосомных повреждений при фрак-тонировании дозы облучения и увеличивали кояденсированность хоо-гатина в клетка;:. Все это позволяет предположить, что механизм реа-мэации первичных повреадений связан с конформационными изменениям хроматина, вне зависимости от того, каким агентом это изменение [ндуцировано.

8.Влияние ингибиторов клеточного метаболизма на конформашон-ные изменения хроматина, индукции и репарацию хромосомных повреждений в клетках млекопитающих.

Показано,что индуцированная радиацией летальность клеток мле-опитающих может быть результатом разбалансированности биохимичес-их и метаболических процессов(Nagasava and Lett,1980).Предлолага-тся, что выживаемость облученных клеток определяется компетенцией иохимических и метаболических процессов в строго определенный ременной срок в большей степени, чем специфичностью поврежде-ий,которые в конечном счете остаются нерепарлрованными или сан-очно репарировакными. Мы исследовали зависимость радкочувстзи-ельности .репарационную способность и конформацию хроматина в летках от трех наиболее важных посттраисляционных модификаций элков: ацетилирования, АДФ~рнбозилирсвания и метилирования.

- го -

Рис.5. Влияние бутирата На (А) и 5-агацитидика (Б) на выход нэвберрантных анафая клеток НеЬа , облучзнньк в различию: до-зет УФ (I), Х-лучаш (2) и нейтронами деления 0,85 МэЬ (3).

о - без обработай, а - посла обработки либо бутиратомНа, либо 5-азацитидином. По оси абсцисс - доза облучения (для I ■ ДжЛг, для 2 и 3 в Гр). По оси ординат - доля неаберрантных анафаз (в %).

В предварительных экспериментах была подобрана концентрация бутирата натрия и время обработки, в течение которого наблюдается наименьшая токсичность бутирата натрия. Мы наблюдали дозоэависиное увеличение радиочувствительности клеток (Рис.Б А). Модифицирующий эффект бутирата натрия нагляднее проявлялся при УФ-облучении клеток и почти полностью.отсутствовал при облучении клеток нейтронами деления (Рис.БА). Поскольку мы регистрировали только асимметротные хромосомные перестройки,которые , как известно, являются аберрациями обменного типа, то , вероятно, большая эффективность предобра-ботга клеток бутиратом при УФ облучении клеток можно объяснить механизмом образования аберраций этого типа. УФ задерживает репарацию повреждений ДНК и тем самым увеличивает вероятность взаимодействия хромосомных разрывов.Повреждения,возникаэдие при воздействии одного трека,слабо модифицируемые, в отличие от повреждений, индуцированных различными треками, что еще раз доказывается отсутствием модифицирующего эффекта бутирата натрия при облучении клеток нейтронами деления. Репарацию хромосомных' повреждений в клетках,обработанных бутиратом натрия, мы исследовали при фракционировании дозы облучения. Результаты экспериментов представлены на рис.8 Ж. Из диаграмм видно, что предобработка клеток бутиратом натрия, не изменяла репарацию хромосомных повреждений при фракционировании дозы рентгенозского облучения, в отличие от воздействия агентов, увеличивающих степень конденсированное™ хроматина в клетках.Использованная концентрация бутирата натрия и время обработки ст 90 мин. до 300 мин. увеличивали связывание интеркалирую-щего красителя (бромистого эткдия)с ДНК,это регистрировалось нами по интенсивности флуоресценции комплекса ДНК-бромисткй зтидий.Рис.7 .

Используя ингибитор поли (ДДФ-рибозилироваяия) 5-амино5енза-мид, мы попутались оценить роль этой модификации гистоноз в индукции и репарации хромосомных аберраций рентгеновыми лучами, з также измерить кокформационньге изменения в хроматине при ингибировзнии этого процесса. На рис.6 В представлены кривые дозовой зависимости для клеток HeLa предобработанных 3-амикобензамидом в не токсической концентрации (концентрации, не ингибкрувдей рост клеток). З-аминобензамид увеличивал выход клеток с хромосомными аберрациями. При фракционировании дозы облучения не наблюдалось уменьшения выхода аберрантных анафаз при разделении дозы на дзе фракции 60-минутнкм временным интервалом.Однако,нельзя забывать,что 3-амино-бензамид мокет ингибировать такте и синтез пуринов de novo и такхе

Рис.6 Влияние адриамкцина (А) и З-аминобензамида (Б) на выход неа Оеррантных анафаз клеток НеЬа,облученных в различных дозах Х-лучами. 1 - без обработки, 2 - после часовой обработки, 3 -после 4-чэсовой обработки.

По оси абсцисс - доза облучения ( в Гр ).

По оси ординат - доля нзаберрантных анафаз ( в % ).

тый этидий клеток НеЬа без обработки (А) и после обработки сперыи-дином (В), адриамицином (В).новобиоцинои (Г).бутиратом Ка (Д) и

5-азацитидином (Е).

По оси абсцисс - помер канала флуоресценции. По оси ординат - количество клеток (в отн. ед.).

АБВГДЕЛЗИ

Рис.8 Процент неаберрантных анафаз в облученных Х-лучами клетках НеЬа в (А).в митозе (В).предварительно обработанных новобиоци-ном (В), спермвдином (Г), адриамицином в течение 1 часа (Д) и в течение 4-х часов (Е), бутиратом На (Ж). 3-аминобензамидом (3) и 5-аэацитидином (И).

1 - однократное облучение в дозе 4 Гр.

2 - фракционирование этой дозы 2 Гр + 6С мин.+ 2 Гр.

воздействовать на метаболизм глюкозы и на синтез ДНК(С1еауаг.1985) Исследование радиационного ответа клеток с недометилированной ДНК позволит нам получить дополнительные доказательства в пользу взаимосвязи радиочувствительности с состоянием хроматина в клетках. 5-азацитидин был использован нами в качестве ингибитора процесса метилирования. Предобработка клеток в концентрации, не инги-бируюцей клеточный рост, приводила к доэо-зависимому увеличению индукции хромосомных аберраций ионизирующим излучением. Результаты экспериментов представлены на рис.5 Б, из которых видно, что инкубирование клеток с 5-азацитидином приводит к увеличению их чувствительности к последующему УФ и Х-облучению и не изменяет радио-, чувствительности клеток к облучению нейтронами деления. При исследовании влияния 5-азацитидина на кинетику репарации хромосомных аберраций при фракционировании дозы облучения мы не зарегистрировали существенного различия медду обработанными клетками и контрольными (Рис 8 И). Инкубация клеток НеЬа с 5-азацитидином приводила к изменению степени конденсации хроматина,которую мы регистрировали по увеличении интеркаляции бромистого этидия (Рис 7Е) Полученные данные подтверждают высказанные предположения о том. что педометилированная ДНК, являющаяся транскрипционно активной, имеет более деконденсированный хроматин. В дисперсном хроматине доступность репарационных ферментов к поврежденным сайтам не затруднена в отличае от конденсированного хроматина и процессы репарции протекают с нормальной скоростью.

ВЫВОДЫ

1.С помощью метода проточной цитометрии проведено дэтерминиро-'-вание клеточного цикла по состоянию хроматина в клетках.

2.Продемонстрировано изменение конфорнации хроматина в процессе естественного старения организма.

3.Показана индукция ионизирующим излучением деконденсации хроматина, которая носит догозависимый характер, с выходом на плато.

4.Положение плато на кривой дозовой зависимости определяется рядом факторов, в том числе: тип клеток,ЛПЭ излучения, возраст животного.

5.Деконденсация хроматина индуцируется УФ,рентгеновыми лучами и нейтронами деления, со средней энергией 0,85 МэВ. Эффективность излучения уменьшается с увеличением ЛПЭ излучения.

- 2S -

6.Обработка клеток ингибиторами топоизомеразы II так же, как и спермидмн, увеличивает конденсацию хроматина в клетках.

7.Обработка клеток ингибиторами ацетилирования и метилирования увеличивает деконденсацию хроматина в клетках.

8.Радиочувствительность клеток существенно не зависела от состояния хроматина в клетках в момент облучения.

9.Репарация хромосомных повреждений существенно уменьшалась или полностью подавлялась при увеличении степени конденсирован»ости хроматина в клетках до облучения.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1.Гил>яно Н.Я. .Малиновский О.В. Дайр М.Б. .Ихтиар А. Действи< излучений с разной ЛПЭ на состояние хроматина в гепатоцитах облученных крыс. Тезисы доклада VI Всесоюзного совещания по микродози-ыетрии.г.Канев.1989. стр.72.

2.Гидьяно Н.Я. .Малиновский О.В. Дайр М.Б. .Ихтиар А. Действ» излучения с разной ЛПЭ на состояние хроматина в клетках млекопитающих In vivo и in vitro. Тезисы докладов 1 Всесоюзного радиобиологического сьеэда. МоскваЛ989.том.1,стр.137.

3.Гильяно Н.Я..Ихтиар А. .Малиновский О.В. Влияние ионизирующеп излучения с разной ЛПЭ на наследственные структуры клетки.Материалы Всесоюзного совещания " Генетический мониторинг-генегическ» последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами Москва-Самарканд. 1990.стр.61-62.

4.Giliano N.Ya. .Malinovsky O.V. ,Khair M.B. .Ikhtiar A.M. The DN. content and chromatin conformation measure by flow cytometry ii mammalian cells after different LET radiation. Abstracts. 24-1: Meeting of the 'European Society for radiation biology. Erfurt Germany. 1992. p.242.

б.Гильяно Н.Я. .Ихтиар A.M. .Малиновский О.В. Влияние ингибиторо ДНК,-топоизомеразы П на радиочувствительность,репарацию и конформа ционныэ изменения хроматина в клетках млекопитающих.Радиобиоло ГИЯ.т.ЗЗ.ЕЫП.2,197-205, 1993.

б.Гильяно Н.Я..Малиновский О.В..Ихтиар A.M. Изменение конформа ции хроматина,индуцированное ионизирующим излучением с разной ДГ в покоящихся и пролиферирущих гепатоцитах крыс разного возрас та.Радиобиология,1993.т.33.,вып.2,с.1а9-196.