Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический полиморфизм в клонах опухолевых линий гепатомы МГ-22А и саркомы J-774 мыши при разных условиях пролиферации и апоптозе

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Генетический полиморфизм в клонах опухолевых линий гепатомы МГ-22А и саркомы J-774 мыши при разных условиях пролиферации и апоптозе"

На правах рукописи

АЛЕКСАНДРОВА Светлана Алексеевна

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ В КЛОНАХ ОПУХОЛЕВЫХ ЛИНИЙ ГЕПАТОМЫ МГ-22А И САРКОМЫ ^774 МЫШИ ПРИ РАЗНЫХ УСЛОВИЯХ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗЕ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2005

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель:

доктор биологических наук Швембергер Ирина Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор Михельсон Виктор Михайлович

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор медицинских наук профессор Плисс Геннадий Борисович

Институт онкологии АМН, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Центральный научно-исследовательский

рентгенорад иологически й институт МЗ РФ, Санкт-Петербург

Защита состоится «28» октября 2005 года в 13 час на заседании диссертационного совета Д.002 230 01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

реферат разослан «2?» сентября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

, Каминская

Е.В.!

fuc ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Известно, что кодирующие последовательности ДНК занимают не более 10-15% всего генома (Li et ai, 2001). Эти последовательности наиболее консервативны в процессе эволюции, так как мутации в них подвержены давлению жесткого естественного отбора. Функции же остальной ДНК еще не ясны, известно, однако, что эта часть ДНК обладает высоким полиморфизмом (Алтухов, Салменкова, 2002). Наиболее хорошо изучены два варианта генетического полиморфизма: количественные изменения в области локализации мини- и микросателлитных последовательностей ДНК и качественные замены отдельных нуклеотидов (Salisbury et al., 2003; Никитина, Назаренко, 2004). Также большой вклад в геномную изменчивость как генеративных, так и соматических клеток вносят мобильные элементы (Smit, 1999). Изучение генетического полиморфизма показало важность и актуальность исследований этого явления в нормальной жизнедеятельности клеток и организмов, при патологии, в частности, при злокачественном росте, а также в процессе эволюции (Алтухов, Салменкова, 2002; Брага и др., 2004). Одним из наиболее перспективных методов изучения генетического полиморфизма являются разные варианты ПЦР-фингерпринта, в частности, RAPD-ПЦР (Caetano-Anolles, 1996; Гречко, 2002).

С появлением методов ПЦР-фингерпринта геномной ДНК расширились знания об опухолевом росте, так как с помощью этих методов были выявлены не только специфические изменения генома, связанные с функционированием генов, участвующих в канцерогенезе, но и неспецифические, являющиеся результатом дестабилизации генома вследствие множества мутаций в различных частях генома (lonov et al., 1993; Luo et al., 2003). Степень геномных изменений, выявляемых этими методами, коррелирует с генотипическими, фенотипическими и клиническими признаками при профессии опухолей и может быть полезна для прогностических оценок (Arribas et al., 1997; Papadopulus et al., 2002).

Одним из критериев злокачественности клеток является их способность к дифференцировке (Lotem, Sachs, 2002) Поэтому большое значение приобретает изучение зависимости способности опухолевых клеток к дифференцировке от степени генетической изменчивости, в частности, от перестроек генетического аппарата клетки, выявляемых методом RAPD-ПЦР.

Особое место в исследованиях взаимодзмавЖ-апухоль-организм занимает способность опухолей не только уходить от

Надзрра организма,

но и активно подавлять защитную иммунную реакцию, тем самым обеспечивая себе иммунологическую привилегированность (Weller et al, 1997; O'Connell et al, 1999) Иммунологическая привилегированность опухолей, образующаяся благодаря способности опухолевых клеток вызывать апоптотическую гибель лимфоцитов, показана в ряде работ (Rabinowich et al., 1998; Bennett et al., 1999; Pinkoski, Green, 2000). Представляет интерес изучение влияния генетической изменчивости опухолевых клеток на их способность вызывать апоптоз у клеток иммунной системы, а также на их чувствительность к индукции апоптоза лимфоцитами Изучение генетического полиморфизма в опухолевых клетках имеет важное значение для оценки степени злокачественности опухолей и прогнозировании течения заболевания.

Последнее десятилетие ознаменовалось бурным изучением молекулярных механизмов апоптоза как в физиологических условиях, так и при злокачественном росте. В результате этих исследований было выявлено большое значение в апоптозе системы Fas-рецепторэ и Fas-лиганда (Fas/FasL) (Барышников, Шишкин, 2002). Имеются данные, что именно от экспрессии FasL в опухолевых клетках зависит сопротивление опухолей иммунной системе организма и, следовательно, само развитие и течение заболевания (Houston et al., 2003). Однако до настоящего времени нет данных о гетерогенности популяции опухолевых клеток по экспрессии Fas и FasL. Поэтому важное значение имеет проведенное в работе выявление гетерогенности опухолей и по экспрессии Fas, и по экспрессии FasL с помощью клонального анализа для исследования злокачественных опухолей и прогнозирования их взаимоотношений с иммунной системой организма

Цели и задачи исследования

Цель настоящей работы заключалась в изучении динамики генетического полиморфизма, выявляемого методом RAPD-ПЦР, в гепатоме МГ-22а и гистиоцитарной саркоме J-774 мыши и в их клоновых линиях при их пассировании in vitro и in vivo.

В работе были поставлены следующие задачи:

1 Изучить генетическую структуру гепатомы МГ-22а мыши методом RAPD-ПЦР in vitro

2 Изучить зависимость жизнеспособности клеток клонов гепатомы МГ-22а мыши in vitro от числа выявленных методом RAPD-ПЦР генетических изменений

3. Изучить зависимость между генетическим полиморфизмом в клоновых линиях гепатомы МГ-22а мыши при их трансплантации в подкожную соединительную ткань (ПСТ) и переднюю камеру глаза (ПКГ) и уровнем дифференцировки.

4. Выявить влияние генетической вариабельности на способность к индукции апоптоза у опухолевых клеток гепатомы МГ-22а мыши и сингенных спленоцитов при их совместном культивировании in vitro.

5. Выявить зависимость индукции апоптоза у опухолевых клеток гепатомы МГ-22а и гистиоцитарной саркомы J-774 мыши с разным уровнем генетического полиморфизма и сингенных спленоцитов от экспрессии Fas и FasL.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В генетической структуре популяции клеток гепатомы МГ-22а мыши, основанной на числе перестроек на фингерпринтах клонов, полученных методом RAPD-ПЦР, выделены стволовая, вариабельная и аберрантная части популяции Наибольшей жизнеспособностью обладают клоны с наименьшей генетической изменчивостью.

2. Клетки клонов гепатомы МГ-22а мыши сохраняют способность к дифференцировке при пролиферации в передней камере глаза, несмотря на высокие значения индекса генетической вариабельности

3 Клоновые линии гепатомы МГ-22а мыши с высоким уровнем генетической вариабельности устойчивы к апоптозу, вызываемому спленоцитами, и обладают способностью индуцировать алолтоз спленоцитов.

4 Опухолевые клетки гепатомы МГ-22а и гистиоцитарной саркомы J-774 мыши с разным уровнем генетического полиморфизма могут влиять на экспрессию FasL в спленоцитах при их совместном культивировании, что приводит к разной интенсивности индуцированного спленоцитами апоптоза у опухолевых клеток.

Научная новизна полученных результатов

Впервые был изучен генетический полиморфизм в клеточной популяции и клоновых линиях гепатомы МГ-22а мыши методом RAPD-ПЦР и показана широкая вариабельность клоновых линий по этому признаку. Показана зависимость жизнеспособности клонов МГ-22а от числа выявленных генетических перестроек. Было выявлено, что способность опухолевых клеток к дифференцировке при их пролиферации в ПКГ может сохраняться при достаточно высокой частоте генетических перестроек. На клоновых линиях МГ-22а и J-774 с

разным уровнем генетического полиморфизма впервые была изучена способность опухолевых клеток индуцировать апоптоз спленоцитов, а также подвергаться апоптозу, индуцированному спленоцитами, при их совместном культивировании Показано, что устойчивость к апоптозу у опухолевых клеток, вызываемому спленоцитами, наблюдается у клоновых линий с высокой генетической вариабельностью. В то же время, такие клоновые линии обладают способностью индуцировать апоптоз спленоцитов Впервые был проведен клональный анализ популяции опухолевых клеток по экспрессии генов апоптоза Fas и FasL, для чего был использован метод обратно-транскриптазной ПЦР (ОТ-ПЦР), с помощью которого была показана широкая вариабельность их экспрессии В опытах по совместному культивированию опухолевых клеток с сингенными спленоцитами в спленоцитах после культивирования обнаружено значительное повышение вариабельности экспрессии FasL Таким образом показано, что опухолевые клетки с разным уровнем генетического полиморфизма могут оказывать воздействие на контактирующие с ними лимфоциты, влияя на экспрессию FasL и определяя таким образом интенсивность апоптоза опухолевых клеток

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные данные показывают, что в возникновении и нарастании генетического полиморфизма в процессе пролиферации опухолей in vitro и in vivo участвуют перестройки, выявляемые методом RAPD-ПЦР Вариабельность числа перестроек такого типа может дать представление о жизнеспособности опухолевых клоновых линий Важное теоретическое значение имеет показанная э работе возможность повышения уровня дифференцировки в клоновых линиях даже при высоких значениях индекса генетической вариабельности.

Практическое значение работы заключается в том, что показана целесообразность использования для изучения взаимодействия опухолевых клеток с иммунной системой модели совместного культивирования опухолевых клонов с сингенными спленоцитами Такая модель может быть использована не только в экспериментальной онкологии, но также и для изучения опухолей человека с целью определения их взаимоотношения с лимфоцитами носителя опухоли При этом показана целесообразность выявления генетической вариабельности в опухолях методом RAPD-ПЦР для определения степени их злокачественности и способности индуцировать апоптоз лимфоцитов, а также претерпевать индукцию апоптоза

лимфоцитами В работе показана целесообразность использования метода ОТ-ПЦР для выявления экспрессии Fas и FasL в опухолевых клетках и спленоцитах.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 6 работ в отечественных и зарубежных изданиях.. Основные положения доложены и обсуждены на Всероссийском Совещании «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000), на Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2001 г), 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Билогия - наука XXI века» (Пущино, 2003), на Ш-ей Международной Научно-практической конференции «Проблемы онкогенетики: научные и прикладные аспекты» (Киев, Украина, 2002), на Международной конференции для молодых ученых по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2003), на Международной конференции по сложным системам (Бостон, США, 2004), на Европейских конференциях по генетике человека (Мюнхен, Германия, 2004; Прага, Чехия, 2005), на 30-ом Конгрессе Европейского Биохомического общества (Будапешт, Венгрия, 2005), на научных семинарах Лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов' введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащегоД.52_источников- Работа изложена на страницах машинописного текста и иллюстрирована рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Опухолевые клеточные линии. Клеточные линии гепатомы мыши МГ-22а и гистиоцитарной саркомы J-774 были получены из Музея клеточных культур Института цитологии РАН. Клетки культивировали в среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 мМ L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина, при 37 °С в увлажненной атмосфере с 5% СОг. Для получения клоновых линий клетки рассевали по 200 клеток на пластиковые чашки Петри (35 мм) Клоны размером 3 мм в диаметре изолировали переносили в отдельные чашки Петри и продолжали культивирование при тех же условиях.

Линейные мыши. В работе были использованы линейные мыши, взрослые особи 3-6-месячного возраста линий СЗНА и Ва1Ь/с ("Рапполово" РАМН)

Выделение высокомолекулярной ДНК. Выделение высокомолекулярной ДНК из органов и тканей мыши и культивируемых клеток проводилось по стандартному методу с использованием фенольно-хлороформной экстракции, описанному Хоган (Нодапе1а1., 1986)

йАРй-ПЦР. В качестве праймеров для ЯАРО-ПЦР были использованы декануклеотиды: 447 (5'-ААСССТСАСС-3'), 452 (5*-СС03СТАСС0-3') и 453 (5'-АССТСССббС-З'), применявшиеся в работе с клоновыми линиями ВА1_В/с-ЗТЗ мыши (КеэЬауа е! а1, 1999) Клеточная ДНК (0.05 мкг) была амллифицирована отдельно с каждым из праймеров (50 пМ), Тад-полимеразой (1 25 ед.), смесью дезоксирибонуклеотидов (100 мкМ) и МдС12 (2.5 мкМ) в 50 мкл реакционного буфера в течение 40 циклов. Режим амплификации: денатурация 30 с при 94 °С, отжиг 1 мин при 40 °С и элонгация 1 мин при 72 "С Время денатурации в первом цикле составляло 5 мин, время элонгации в последнем цикле - 5 мин Продукты КАРР-ПЦР разделяли электрофоретически в 2%-ном агарозном геле на Трис-боратном буфере с последующим окрашиванием фрагментов ДНК бромистым этидием. В качестве контроля проводили ПЦР с праймерами без ДНК-матрицы.

Индукция дифференцировки опухолевых клеток и морфологическое исследование опухолей. Для выявления способности опухолевых гепатоцитов МГ-22а и опухолевых гистиоцитов 3-774 и их клоновых линий к дифференцировке, их клетки трансплантировали в подкожную соединительную ткань (ПСТ) и в переднюю камеру глаза (ПКГ) При подкожном росте после инъекции 1 млн клеток опухоли диаметром 1 см обнаруживались, как правило, через 2-3 недели. Трансплантация опухолевых клеток в ПКГ проводилась с использованием нембуталового наркоза (концентрация 8 мг/мл, 100 мкл на мышь). Глаза промывали раствором пенициллина, а затем закапывали 1 каплю 1%-ного раствора атропина и 1 каплю 0 25%-ного раствора дикаина. Через несколько минут после расширения зрачка суспензию опухолевых клеток (25 тыс.) инъецировали в ПКГ с помощью 1 мл шприца Рост трансплантатов выявляли через 15-20 дней после трансплантации. Опухоли фиксировали в 10%-ном формалине, проводили через спирты возрастающей крепости и заливали в парафин Среды толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином и по Массону.

Взаимоиндукция апоптоза между опухолевыми клетками и лимфоцитами. Селезенки измельчали с помощью ножниц, добавляли среду Игла

и смесь суспендировали с помощью пипетки. Полученную суспензию фильтровали через один слой капрона и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 3 мин. Индукцию апоптоза опухолевых клеток и спленоцитов проводили в среде ДМЕМ, для чего спленоциты и опухолевые гепатоциты или гистиоциты смешивали в соотношении 50:1 и культивировали в течение 18 ч. В качестве контроля использовали спленоциты и опухолевые клетки, культивировавшиеся по отдельности в то же время.

Выявление апоптоза опухолевых клеток и спленоцитов. Наличие апоптотических опухолевых клеток в культуре выявляли с помощью метода клоногенной выживаемости и электрофореза низкомолекулярной фракции ДНК по модифицированному методу Хирта (Vikhanskaya, 1994). Наличие апоптотических спленоцитов выявляли только методом электрофореза низкомолекулярной фракции ДНК Для выявления апоптоза методом клоногенной выживаемости опухолевые клетки до и после индукции апоптоза рассевали по 200-750 штук на пластиковые чашки Петри (35 мм) и культивировали в среде ДМЕМ с 10% ЭТС. Клоногенная выживаемость определялась процентом выживших клеток (выросших клонов) от числа посеянных клеток в контроле и опыте.

Выделение тотальной РНК. Культивируемые клетки снимали с чашек Петри или флаконов Кареля с помощью трипсина, помещали в пробирки на 1.5 мл и центрифугировали при 2000 об/мин. Среду, в которой находились клетки, сливали, а клеточный осадок заливали буфером для выделения РНК и гомогенизировали. Небольшие кусочки нормальных или опухолевых тканей мыши (4-6 мм) помещали в пробирки на 1.5 мл и сразу замораживали в жидком азоте. После замораживания ткани или хранили в холодильнике на -70 °С, или их сразу гомогенизировали и заливали буфером для выделения РНК. Тотальную РНК выделяли из культивируемых клеток или тканей мыши по стандартному методу с использованием гуанидин тиоцианата (Chromczynsky, Sacchi, 1987).

Обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция. Обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) состояла из двух этапов -синтеза ДНК на РНК-матрице и полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами к генам Fas-рецепторэ и Fas-лиганда. Для проведения синтеза кДНК использовали инструкции и соответствующий набор реактивов фирмы «Fermentas» (Латвия). Праймеры к Fas-рецептору, Fas-лиганду и Р-актину (использованному в качестве контроля) для ПЦР были синтезированы («Синтол», Москва) согласно структуре, описанной авторами (Lee et al, 1999). Нукпеотидные последовательности

праймеров, использованные в ПЦР: FasR1 - 5*-GAGAATTGCTGAAG-ACATGA-СААТСС-3'; FasR2 - 5'-GTAGTTTTCACTCCAGACATTGTCC-3'; FasL1 - 5-ACTC(A/T)C-GGAGTTCTGCCAG(C/T)TCCTT-3'; FasL2 - 5'-ATGCAGCAGCCC(A/T/G)T(C/G)AATTA-CCCAT-3'; Ac1 - 5'-AGGCATCCTGACCCTGAAGTAC-3'; Ac2 - 5*-TCTTCATGAGGTA-GTCTGTCAG-3' ПЦР проводилась в стандартных условиях. В качестве контроля вместо водного раствора ДНК использовали деионизованную воду (негативный контроль). Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле, приготовленном на Трис-боратном буфере. Полученные ПЦР-фрагменты фотофафировали зеркальным фотоаппаратом «Зенит-E» на пленку Микрат-300, получали позитивы и переводили их в цифровую форму сканером Mustek для дальнейшего анализа. Для количественной оценки наработанного продукта использовали профамму Scion Image 4.0.2. Об экспрессии генов Fas и FasL судили по относительному количеству мРНК, которое в разных образцах вычисляли по отношению оптической плотности ПЦР-продукта генов Fas и FasL к оптической плотности ПЦР-продуюа гена Р-актина. Средние величины значений (х), ошибку среднего (ах), стандартное отклонение (с) и коэффициент вариации (CV) получали методом бутстреп (Efron, Tibshirani, 1993) с помощью профаммы для анализа малых выборок, разработанной С.М. Микулинской (Гинкул и др., 1998).

Секвенирование ПЦР-фрагментов. Секвенирование было проведено НПФ «Хеликс» (Санкт-Петербург) по модифицированному методу Сенджера с использованием одновременно четырех типов нуклеотидов-терминаторов в одной реакции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Полиморфизм АФ ДНК в клетках клонов гепатомы мыши МГ-22а, выявленный методом RAPD-ПЦР. Известно, что потомства отдельных раковых клеток в пределах одной и той же опухоли различаются между собой по очень многим признакам. Выявлено также, что в основе межклональных различий зачастую лежат генетические изменения, происходящие в опухолевых клетках с очень высокими частотами, поэтому наиболее адекватным подходом для изучения гетерогенности популяций опухолевых клеток является клональный анализ, широко применяемый с этой целью как in vito, так и in vivo Генетическая гетерогенность клеточной популяции гепатомы мыши МГ-22а была изучена методом RAPD-ПЦР на 34 клонах с помощью трех праймеров Фингерпринты амплифицированных фрагментов (АФ) ДНК, полученных с каждым из праймеров, различались по

диапазону молекулярных длин фрагментов. В результате с помощью каждого праймера были получены фрагменты ДНК в определенном диапазоне' с праймером 447 - от 300 до 3000 п.н , с праймером 452 - от 900 до 3000 п н., а с праймером 453 - от 450 до 1300 п н. Каждый фингерлринт состоял из 14-17 амплифицированных фрагментов ДНК. Согласно данным, полученным с помощью всех трех праймеров, наиболее вариабельными были фрагменты ДНК, содержащие 500, 750, 900 и 1400 п.н. Наибольшее число перестроек было выявлено с помощью праймера 447. Сравнение фингерпринтов АФ-ДНК клонов с фингерпринтами АФ-ДНК в основной популяции гепатомы МГ-22а позволило зарегистрировать следующие изменения' появление новых амплифицированных фрагментов, исчезновение фрагментов, свойственных основной популяции, а также изменения интенсивности их свечения в ультрафиолете (рис 1) Результаты проведенного исследования показали, что вся

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

IS ■ я

JfS

Рис. 1. Фингерлринты гепатомы МГ-22а и ее клонов, полученные методом RAPD-ПЦР с праймером 447. 1 -популяция гепатомы МГ-22а, 2-14 - клоны; М - DNA Ladder 100 bp (Fermentas).

!

популяция может быть условно разделена на 3 группы (рис 2) стволовую, которая

составляет 56% клонов и определяет основные признаки популяции гепатоцитов МГ-

22а (в которой 21% клонов

имеют фингерпринты, схожие с

фингерпринтами основной

популяции гепатоцитов, и 35%

имеют небольшую изменчивость

Рис. 2. Распределение клонов гепатомы мыши МГ-22а по числу генетических изменений, выявленных методом 1ЗДРО-ПЦР с тремя праймерами.

5 6 7 Число изменений

(1-3 перестроек)), вариабельную (32% клонов содержащих от 4 до 7 перестроек в геноме, и аберрантную (12%), в которую вошли клоны с числом изменений 8 и более Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что клоны с

разной степенью ДНК-полиморфизма должны выполнять в популяции разные функции - стабильные или мало изменчивые клоны должны обеспечивать наследование основных признаков популяции, вариабельные клоны, благодаря повышенной изменчивости могут быть предметом отбора и таким образом влиять на признаки популяции в целом Единичные клоны с наибольшей частотой изменений обладают наиболее низкой жизнеспособностью В то же время, именно в этой группе клонов можно ожидать появления единичных клонов с резко атипичными свойствами В настоящее время изучение ДНК-полиморфизма с помощью различных вариантов метода ПЦР находит применение при исследовании опухолей человека в клинической онкологии с целью изучения их биологических свойств, в частности, злокачественности Прогностическое значение геномных повреждений было изучено методом ПЦР с произвольными праймерами в 65 случаях немелкоклеточной карциномы легких (Juan de et al, 1998) Было показано, что пациенты с большим количеством генетических перестроек имели худший прогноз, чем пациенты с малым или средним количеством геномных повреждений. Сходные результаты были получены при изучении с помощью ПЦР 55 случаев ненаследуемой колоректальной карциномы (Arribas et al, 1997) Авторы пришли к заключению, что степень генетических повреждений коррелирует с генотипическими, фенотипическими и клиническими признаками опухолей и может быть использована при прогнозировании течения колоректальных раков.

Параллельно с изучением генетической вариабельности на той же популяции клонов гепатомы МГ-22а было проведено изучение их жизнеспособности. Для количественной оценки генетической изменчивости использовали индекс генетической вариабельности (ИГВ), вычисляемый методом бутстреп, для получения которого в каждой исследуемой группе общее число изменений на

фингерпринтах,

Табл. 1. Генетическая вариабельность в клонах МГ-22а /л vitro, различавшихся по жизнеспособности

Группа клонов Число ИГВ Р

клонов

1 Клоны, погибшие вскоре после пересева

2 Клоны, прекратившие рост после нескольких пассажей

3 Клоны, давшие начало клоновым линиям

5 20

5.08 3 51

0.4 0 1

2.85 0.23

полученных с помощью КАРО-ПЦР, делили на число исследуемых образцов, Индекс генетической ва-

риабельности в этих группах приведен в табл 1.

По данным, приведенным в таблице, наибольшую генетическую вариабельность имели клоны, погибшие вскоре после пересева. В то же время, клоны, давшие начало клоновым линиям, имели наименьшую генетическую вариабельность. Промежуточное значение ИГВ оказалось у клонов, пересевавшихся всего несколько раз На основании этих данных можно считать, что жизнеспособность клоновых линий МГ-22а находится в зависимости от уровня генетической вариабельности

Полиморфизм АФ ДНК в клетках клонов гепатомы мыши МГ-22а, выявленный методом RAPD-ПЦР, при разных условиях культивирования In vivo. Представляет существенный интерес, насколько способность опухолевых клеток к дифференцировке и утрате злокачественности зависит от генетической изменчивости, которая происходит при злокачественной трансформации и дальнейшей прогрессии опухоли. Ранее было показано, что опухоли мышей и крыс разного гистогенеза, пролиферирующие в передней камере глаза (ПКГ), обнаруживают более высокий уровень дифференцировки, чем при пролиферации в подкожной соединительной ткани (ПСТ) (Швембергер, 1987). Клетки популяции и 10 клонов гепатомы МГ-22а были трансплантированы в ПСТ и в ПКГ сингенный мышей. Выросшие опухоли были исследованы морфологически, а также с помощью RAPD-ПЦР Опухоли, выросшие в ПКГ, по морфологическим признакам были разделены на 2 группы - недифференцированные опухоли и опухоли с элементами дифференцировки. ДНК из опухолей, выросших в ПСТ и ПКГ была исследована методом RAPD-ПЦР Сравнение фингерпринтов АФ ДНК клонов, полученных in vivo, с фингерпринтами АФ ДНК соответствующих клонов гепатомы МГ-22а in vitro, позволило зарегистрировать изменения по 23 АФ ДНК Изменения были выявлены у 80% опухолей в основном с одним из трех праймеров - 447; наиболее вариабельными были фрагменты ДНК длиной 850, 900 и 950 п.н. При анализе генетической структуры популяции гепатоцитов МГ-22а in vivo были определены доли опухолей с низкой, средней и высокой генетической вариабельностью. Оказалось, что большая часть опухолей независимо от места пролиферации и уровня дифференцировки состоит преимущественно из клеток с низкой генетической вариабельностью Приблизительно 1/5-1/3 часть опухолей имела среднее число генетических изменений, и только единичные клоны имели высокую генетическую изменчивость ИГВ был просчитан таким же способом, как и для популяции in vitro, для каждой группы опухолей in vivo при разных условиях пролиферации и с разной степенью дифференцированности.

Табл. 2. Генетическая вариабельность в клонах гепатомы мыши МГ-22а при разных условиях пролиферации /л vivo

Место Чис- Уровень

транс- ло дифференцировки ИГВ Р

план- кло-

тации нов

ПСТ в Недифференци- 1 5 0 25

рованные опухоли

ПКГ 15 Недифференци- 2 60 0 14

рованные опухоли

17 Опухоли с 2 53 0 12

Как показано в табл. 2, недифференцированные опухоли, пролиферировавшие в ПСТ, отличались наиболее низким индексом генетической вариабельности Опухоли, пролиферировавшие в ПКГ, различавшиеся по степени дифференцированное™, характеризовались

элементами более высокими ИГВ, причем

дифференцировки

недифференцированные опухоли имели практически такой же ИГВ, что и опухоли с элементами морфологической дифференцировки. Как показало сравнение данных клонов гепатомы МГ-22а, полученных in vitro и in vivo, ИГВ в клоновых линиях, пролиферирующих in vivo, близки по своим значениям к ИГВ, характеризующему жизнеспособные клоновые линии in vitro, а также то, что можно говорить только о тенденции к снижению ИГВ высокодифференцированных опухолей

Изучение генетической вариабельности в процессе пассирования одного и того же клона (внутриклональную генетическую вариабельность) при разных условиях пролиферации in vitro и in vivo и степени дифференцированности трансплантатов изучали на 8 клоновых линиях в сравнении с генетической вариабельностью общей популяции гепатомы МГ-22а. Было выявлено, что низкодифференцированная опухоль, выросшая в ПСТ из клеток общей популяции гепатомы, по генетической вариабельности не отличалась от вариабельности in vitro Все клоны, пролиферировавшие в ПКГ, имели признаки цито- или гистотипической дифференцировки, но при этом различались по числу генетических изменений от О до 5. В клоновых линиях с низкой генетической вариабельностью in vitro при трансплантации in vivo были выявлены значительные различия по количеству генетических изменений на фингерпринтах АФ ДНК. В этих клонах наблюдался как низкий уровень числа генетических изменений (22/5, 22/8), так и высокий уровень (22/6, 544), причем как низкий, так и высокий уровень генетической изменчивости мог наблюдаться в трансплантатах клонов с признаками и без признаков дифференцировки. Такая же внутриклональная вариабельность наблюдалась и в клонах со средним уровнем вариабельности in vitro Данное исследование показало, что способность к дифференцировке может наблюдаться как в клонах с низкой изменчивостью, так и при максимально выявляемых значениях изменчивости, регистрируемой нашим методом. Различными авторами была обнаружена

способность опухолей дифференцироваться и терять признаки злокачественности В частности, Лотем и Сакс (Lotem, Sachs, 2002) показали, что клетки миелоидной лейкемии in vitro могут быть индуцированы к дифференцировке в неделящиеся зрелые гранулоциты или макрофаги добавлением различных цитокинов. На основании этих данных авторами был сделан вывод о том, что существуют различные пути генной экспрессии, приводящие к дифференцировке, и если генетические изменения супрессируют индукцию дифференцировки клетки по одному пути, то существуют альтернативные пути, по которым клетка может прийти к дифференцировке.

Определение нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента ДНК гепатомы мыши МГ-22 а. Определение нуклеотидной последовательности проводили у амплифицированного фрагмента ДНК длиной 850 п.н , одного из наиболее вариабельных АФ ДНК МГ-22а Различия по амплификации у этого фрагмента наблюдались у 31% опухолей - 2/3 изменений представляли собой усиление интенсивности свечения, 1/3 - отсутствие фрагмента на фингерпринтах. Выявленная последовательность была сравнена с известными последовательностями в GenBank с помощью программы BLAST. Анализ показал, что исследуемый фрагмент ДНК имеет высокую (99%) гомологию с участком гена мыши Rad 52, принимающего участие в репарации двуцепочечных разрывов ДНК. Как известно, двуцепочечные разрывы относятся к числу наиболее серьезных повреждений ДНК, которые препятствуют транскрипции и репликации. Белок RAD52 может образовывать кольцевые гептамеры, которые специфично связывают концы одноцепочечных или двуцепочечных ДНК Таким образом он маркирует разрывы и служит инициатором последующей репарации с участием других белков (Rad 51 и др.) (Kuzminov, 2001).

Апоптоз в клоповых линиях гепатомы МГ-22а. Известно, что при появлении опухолевых клеток в организме, происходит их взаимодействие с иммунной системой, в результате которого может произойти гибель или дальнейшая прогрессия опухолевых клеток (Weller et al, 1997: O'Connell et al., 1999) В настоящее время в литературе отсутствуют работы, в которых бы сообщалось о клональном анализе апоптоза опухолевых клеток Однако исследователи, занимающиеся изучением апоптоза при злокачественном росте, подчеркивают необходимость проведения клонального анализа с целью выявления гетерогенности популяции опухолевых клеток по способности подвергаться апоптозу (Koudrine, 1998).

Индукция апоптоза спленоцитами была проведена в общей популяции гепатомы МГ-22а и 10 ее клоновых линиях. В популяции гепатоцитов, а также в большинстве клоновых линий после воздействия спленоцитами выявлялась фракция олигонуклеосомной ДНК, однако интенсивность ее варьировала, в нескольких клоновых линиях фракции олигонуклеосомной ДНК выявлено не было (22/6, 22/7, 22/16). При воздействии гепатоцитов основной популяции и разных клоновых линий на спленоциты во всех опытах, за исключением опыта с клоном 22/5, были выявлены олигонуклеосомные фракции ДНК спленоцитов, интенсивность их также варьировала. С целью изучения влияния разной степени ДНК-полиморфизма опухолевых гепатоцитов на их способнось индуцировать апоптоз спленоцитов при совместном культивировании, а также на устойчивость к апоптозу, вызываемому спленоцитами, было проведено комплексное исследование этих признаков на 5 клоновых линиях (Табл. 3).

Табл. 3. Генетическая гетерогенность и взаимоиндукция апоптоза опухолевых гепатоцитов МГ-22а и спленоцитов мышей СЗНА.

Культура клеток гепатомы МГ-22а Число отклонений в спектрах амплифициро-ванных фрагментов ДНК Наличие ниэкомолеку-лярных фракций ДНК на электрофореграммах Клоногенная выживаемость гепатоцитов после взаимодействия со спленоцитами (%)

т vitro in vivo гепатоциты спленоциты опыт контроль

ПСТ ПКГ

Популяция - 3 2 + + 1.5 4.4

Клон 22/4 в 1 0 - + 98 7 36.3

Клон 22/5 0 0 0 + + 1 6 12 8

Клон 22/6 0 3 55 - + 99 3 46 4

Клон 22П 1 нд 05 - + 31 28.7

Клон 22/8 4 1 1 2 + + нд 67

Примечание. ПСТ - опухоли, культивировавшиеся в подкожной соединительной ткани, ПКГ -опухоли, культивировавшиеся в передней камере глаза мыши. Для популяции и каждого клона было получено по одной ПСТ мыши и от одной до 8 ПКГ (в среднем - 4) Цифры обозначают отношение общего количества выявленных отклонений в спектрах АФ ДНК к числу выросших ПКГ

Сопоставляя результаты по генетической вариабельности и взаимоиндукции апоптоза, изучаемый материал можно разделить на три группы. Клоны 22 4 и 22 6 характеризуются наиболее высокой генетической вариабельностью in vitro или in vivo, высокой клоногенной выживаемостью после взаимодействия с лимфоцитами и устойчивостью к индукции апоптоза спленоцитами. Вторая группа - популяция, клоны 22.7 и 22.8 имеют средний уровень генетической вариабельности in vitro и in vivo В этой группе популяция и клон 22 8 обладали выраженной способностью к взаимоиндукции апоптоза со спленоцитами, тогда как у клона 22.7 эта способность отсутствовала. И отдельно должен быть выделен клон 22.5 у которого не была выявлена генетическая вариабельность in vitro и in vivo, но он подвергался апоптозу

и индуцировал его Результаты данного исследования показывают, что высокая генетическая гетерогенность может способствовать агрессивности опухолевых клеток, которая проявляется в их способности избегать апоптоза при взаимодействии с клетками иммунной системы и, одновременно, высокой выживаемости и даже пролиферации после этого взаимодействия

Экспрессия Fas и FasL в опухолевых гепатоцитах МГ-22а, гистиоцитах J-774 и сингенных спленоцитах при их совместном культивировании In vitro, а также in vivo. Особое значение для развития устойчивости опухолей к иммунной защите организма и создания для нее иммунологической привилегированности имеет экспрессия опухолевыми клетками FasL, как это было показано на примере раков кожи (Byrne and Holliday, 2003) и раков толстой кишки (Houston et а!, 2003) Однако не все имеющиеся данные о роли экспрессии Fas и FasL в опухолях однозначны Судя по литературным данным, в большинстве тканей присутсвует Fas и в меньшем числе тканей - FasL В то же время, именно от их соотношения часто зависит судьба клетки, в частности появление у нее признаков злокачественности и потенции к опухолевому росту.

Изучение экспрессии Fas и FasL в популяциях и клонах клеточных линий МГ-22а и J-774 мыши in vitro показало широкую вариабельность экспрессии Fas и FasL в популяциях и клоновых линиях обеих опухолевых культур, однако наибольшую вариабельность, судя по CV, показывала экспрессия FasL (Табл 4)

Табл. 4. Средние показатели экспрессии Fas и FasL в популяциях и клонах клеточных линий МГ-22а и J-774 in vitro, выявленные методом ОТ-ПЦР

Fas FasL

Материал п Х±Ох I - CV, % х±стх I ° CV, %

Гепатома МГ-22а 10 1.57±0.20 0.63 40.22 1.50±0.30 0.95 63.26

Популяция МГ-22а 3 1.49±0.55 0.95 36.91 1 20±0 32 0.56 26.74

Клоны МГ-22а 7 1.60±0.20 0 54 34 00 1 62+0.40 1.08 66 00

Саркома J-774 16 1.56±0.36 1 44 23 08 2 05±0.98 3.9 47.89 Популяция J-774 2 2 08±0.03 0.04 1 45 0.83±0.32 0.45 38.55 Клоны J-774 14 1 12±0 20 0 72 64.29 0 84±0.10 0.34 40.48

Специально проведенные опыты с пассированием гепатомы МГ-22а и гистиоцитомы J-744 в ПСТ имели целью сопоставить темпы роста опухолей и реакцию на них иммунной системы организма В результате в ряде пассажей гепатомы МГ-22а была изучена экспрессия Fas и FasL в подкожно растущих опухолях и в спленоцитах из селезенок мышей-носителей опухолей Было показано, что на протяжении 9 пассажей в опухолевых гепатоцитах нарастала экспрессия FasL, что коррелировало с увеличением темпов роста опухоли, т.е. с их

злокачественностью. При пассировании in vivo гистиоцитомы J-744 в IV, V и VI пассажах наблюдались метастазы в печени; на V и VI пассажах в метастазах экспрессия FasL нарастала Полученные данные совпадают с литературными, в которых увеличение темпов роста опухоли и приобретении ею иммунологической привилегированности было связано авторами с увеличением в опухолевых клетках экспрессии FasL и не только с уменьшением, но и почти полным исчезновением Fas (Abrahams et al., 2003).

Экспрессия Fas и FasL была также исследована в клоновых линиях гепатомы МГ-22а и гистиоцитарной саркомы J-774 мыши в экспериментах по их совместному культивированию с сингенными спленоцитами in vitro (Табл. 5, 6)

Таблица 5. Средние показатели экспрессии Fas и FasL в опухолевых гепатоцитах МГ-22а и сингенных спленоцитах СЗНА при их совместном культивировании in vitro, выявленные методом ОТ-ПЦР

Материал

Fas FasL

п Х±ах | a |CV, % х±а* | а |CV, %

Гепатома МГ-22а 5 1.63±0.33 0.74 45 45 2.04±0 45 1 00 49 07 (до опыта)

Гепатома МГ-22а 5 2 41±0.45 1 02 42 20 1 94±0 43 0 96 49.67 (после опыта)

Спленоциты СЗНА 3 3.03±0 77 1 33 43 78 1 53±0 22 0 37 24 53 (до опыта)

Спленоциты СЗНА 3 1 80±0 28 0 48 26 58 3 03±1 70 2 95 97.36 (после опыта)

Табл. 6. Средние показатели экспрессии Fas и FasL в опухолевых гистиоцитах J-774 и сингенных спленоцитах Balb/c при их совместном культивировании in vitro, выявленная методом ОТ-ПЦР

Fas FasL

Материал п х±пх I ^ CV, % Х±Ох I О CV, %

Саркома ^774 6 1 79±0 29 0 71 39.37 0 79±0 88 0.20 24.89

(до опыта) Саркома Л-774 5 1.83±0 25 0.57 30.96 1.19+0.30 0.67 56 54

(после опыта)

Спленоциты Ва1Ь/с 5 1.12±0.20 0.72 64.29 0.84±0.10 0 34 40.48

(до опыта)

Спленоциты Balb/c 6 185±0.46 1 12 60 61 1.02±0 31 0 76 74 51 (после опыта)

При культивировании опухолевых гепатоцитов со спленоцитами экспрессия Fas во всех исследованных опытах увеличивалась, в среднем, в 1,5 раза Экспрессия FasL оставалась без изменений или же наблюдались незначительные изменения в сторону как повышения, так и снижения В спленоцитах СЗНА после

культивирования с опухолевыми гепатоцитами экспрессия Fas или незначительно уменьшалась, или оставалась без изменений, в то же время вариабельность экспрессии FasL сильно различалась до и после опыта (Табл 5) Можно видеть, что после опыта коэффициент вариации (CV) увеличивался примерно в 4 раза, при этом наблюдалось как уменьшение (в 1.2 раза), так и резкое увеличение (в 3.7 раз) экспрессии FasL. В исследованных двух образцах популяции J-774 и четырех клонах можно было наблюдать большую вариабельность в экспрессии Fas и FasL, чем в соответствующих экспериментах с опухолевыми гепатоцитами МГ-22а (Табл. 6) Экспрессия Fas в опухолевых гистиоцитах после опыта могла оставаться на том же уровне, незначительно уменьшаться или увеличиваться Гораздо более широко, чем экспрессия Fas, варьировала экспрессия FasL Характер экспрессии Fas и FasL в спленоцитах Balb/c также имел вариабельный характер, однако наибольшая вариабельность наблюдалась у спленоцитов Balb/c по экспрессии FasL после культивирования их с опухолевыми гистиоцитами. Полученные результаты показали, что существует большое количество различных вариантов взаимодействия опухолевых клеток и лимфоцитов, которые могут проявляться в изменении экспрессии систем генов, отвечающих за запуск программ апоптоза или пролиферации

Апоптоз и экспрессия Fas и FasL в опухолевых гепатоцитах МГ-22а, гистиоцитах J-774 и сингенных спленоцитах после их совместного культивирования In vitro. В экспериментах по индукции апоптоза в опухолевых клетках и спленоцитах при их совместном культивировании in vitro представляло интерес выявить, существует ли зависимость между индукцией апоптоза в опухолевых клетках и спленоцитах и функционированием системы Fas/FasL в этих клетках Проведенные эксперименты позволили разделить их на три группы в зависимости от изменения экспрессии FasL у спленоцитов - увеличения или уменьшения В первую группу вошли три опыта один с популяцией гепатомы МГ-22а (1) и два с популяцией (2) и клоном 5 саркомы J-774. Существенно, что во всех трех опытах индукция апоптоза была выявлена и в опухолевых клетках, и в спленоцитах, при чем, если в опухолях интенсивность индукции апоптоза взрьировала от 27 до 100%, в спленоцитах она во всех случаях находилась на максимально определяемом уровне При этом следует отметить, что во всех случаях экспрессия FasL в спленоцитах уменьшалась, тогда как колебания Fas были незначительны По-видимому, низкий уровень FasL в спленоцитах способствовал агрессивности опухолевых клеток, в которых изменение экспрессии Fas и FasL происходили

незначительно как в ту, так и в другую сторону. Вторая группа состоит из трех экспериментов по индукции апоптоза с клоном 16(2) МГ-22а и клонами 1 и 4 саркомы J-774. В этих опытах при наблюдавшемся росте FasL у спленоцитов после взаимной их инкубации с опухолевыми клетками был выявлен высокий процент апоптоза у опухолевых клеток (до 100%) и незначительный уровень или даже полное отсутствие апоптоза у спленоцитов. По-видимому, увеличение экспрессии FasL в спленоцитах подавляет рост и агрессивность опухолевых клеток, вызывая у них Fas-опосредованный апоптоз. В третьей группе экспериментов не наблюдалось четких корреляций между экспрессией FasL у спленоцитов и апогтгозом у опухолевых клеток и спленоцитов.

ВЫВОДЫ

1. Генетическая структура популяции опухолевых гепатоцитов МГ-22а, в основу которой положено число перестроек на финлерпринтах клонов, полученных методом RAPD-ПЦР, состоит из 56% клонов гепатоцитов, имеющих от 0 до 3 изменений (стволовая часть), 32% кпонов с 4-7 изменениями на фингерпринтах (вариабельная часть) и 12% клонов, которые имеют от 8 до 12 изменений (аберрантная часть).

2. Наибольшей выживаемостью обладали клоны гепатомы мыши МГ-22а с нулевой или минимальной генетической изменчивостью, наименьшей - клоны с максимальной генетической изменчивостью.

3. Способность опухолевых гепатоцитов МГ-22а при их росте в ПКГ к дифференцировке не зависит от генетической вариабельности, выявляемой методом RAPD-ПЦР, в клоновых линиях и даже может осуществляться при высоких значениях индекса генетической вариабельности.

4. Один из наиболее вариабельных фрагментов ДНК опухолевых гепатоцитов длиной 850 п.н. имеет высокую (99%) гомологию с участком гена мыши Rad 52, принимающего участие в репарации двуцепочечных разрывов ДНК.

5. При совместном культивировании клеток клоновых линий гепатомы МГ-22а с сингенными спленоцитами клоновые линии МГ-22а с высоким уровнем генетической

вариабельности и высокой клоногенной выживаемостью устойчивы к индукции апоптоза, вызываемой спленоцитами, и способны индуцировать апоптоз спленоцитов, а клоновые линии с низким уровнем генетической вариабельности и низкой клоногенной выживаемостью чувствительны к индукции апоптоза спленоцитами и вызывают апоптоз у сингенных спленоцитов

6. Экспрессия Fas и FasL в клоновых линиях и гепатомы МГ-22а и гистиоцитарной саркомы J-774 мыши широко варьирует при их культивировании /л vitro.

7 Интенсивность экспрессии FasL у опухолевых клеток МГ-22а и J-774 возрастает в процессе их пассирования in vivo в ПСТ, что коррелирует с увеличением темпов роста опухолей, т е. с их прогрессией

8. Интенсивность экспрессии FasL у спленоцитов влияет на способность к взаимоиндукции апоптоза между опухолевыми клетками МГ-22а и J-774 и спленоцитами при их совместном культивировании При резком снижении экспрессии FasL в спленоцитах происходит массовый апоптоз спленоцитов при слабо выраженном апоптозе в опухолевых клетках. Увеличение экспрессии FasL в спленоцитах приводит к тотальному апоптозу опухолевых клеток и уменьшению апоптоза в спленоцитах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1) Shvemberger IN., Alexandrova S.A. PCR-Detected Genome polymorphism in malignant cell growth Intern. Rev Cytol. Vol. 199. P. 117-159(2000).

2) Alexandrova S.A., Ginkul L.B and Shvemberger I.N. The influence of genetic variability of tumor cell population of mouse hepatoma MH-22a on interinduction of apoptosis between tumor hepatocytes and splenocytes. Exp Oncology V. 24. № 3. P. 208-212 (2002).

3) Александрова C.A. и Швембергер И.Н. Анализ генетической структуры популяции опухолевых гепатоцитов МГ-22а методом RAPD-ПЦР. Вопр онкол. Т 49. № 3. Р. 347350 (2003).

4) Alexandrova С.А., Shvemberger I N Genetic variability of tumor hepatocytes MH-22, revealed by RAPD PCR at different conditions of proliferation in vivo. Exp Oncol. Vol. 27 N2. P. 114-119(2005)

5) Александрова C.A., Гинкул Л.Б, Швембергер И.Н. Экспрессия Fas и FasL, выявленная методом ОТ-ПЦР, при взаимоиндукции апоптоза в клоновых линиях гепатомы МГ-22а и гистиоцитарной саркомы J-774 мыши при их совместном культивировании in vitro с сингенными спленоцитами. Вопр. онкол. (в печати, 2005)

Тезисы конференций

1.Гинкул Л Б., Александрова С.А., Швембергер И.Н Апоптоз и генетическая вариабельность в клеточной популяции гепатомы МГ-22а мыши. Тез. Всерос. Совещания «Клеточная биология на пороге XXI века», Санкт-Петербург, 17-19 акт 2000 Цитология. Т. 42 С. 112 (2000).

2. Гинкул Л.Б., Александрова С.А., Швембергер И Н. Взаимная индукция апоптоза клеток гепатомы МГ-22а и спленоцитов и генетическая гетерогенность гепатоцитов. Клональный анализ. Тезисы докл. и сообщ., предст. на Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 16-18 октября 2001 г), Цитология т 43 № 9, с. 849 (2001).

3 Александрова С.А., Гинкул Л Б., Швембергер И Н ДНК-полиморфизм, выявляемый RAPD-ПЦР, при злокачественном росте. Ill Научно-практическая конференция «Проблемы онкогенетики' научные и прикладные аспекты» (23-24 мая 2002), Киев, Украина.

4. Александрова С.А. Применение RAPD-ПЦР для анализа генетической

вариабельности клонов клеточной линии гепатомы МГ-22а мыши, различающихся по цито - и гистотипической дифференцировке при их пролиферации in vivo Биология -наука XXI века 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино 14-18 апреля 2003 г.): Сборник тезисов, с 6 (2003).

5 Alexandrova S.A. Genetic variability revealing by RAPD-PCR in clonal lines of mouse hepatoma MH-22a varied by the ability to differentiation. Abstract book. Conference for young scientists, phD student of molecular bioilogy and genetics. Sept. 25-27, Kyiv, Ukrain, p. 235. (2003).

6 Alexandrova S.A , Shvemberger I N Genetic variability between clonal lines of tumor hepatocytes with various differentiation under different conditions of cultivation revealed by RAPD-PCR Abstract in European Conference of Human Genetics 2004, June 12-15, 2004, ICM, Munich, (Germany), Control No. 04-A-446-ESHG.

7 Ginkul L B., Alexandrova S.A, Shvemberger I N. Interaction of Tumor Cells and Immune System- Interinduction of Apoptosis between Tumor Hepatocytes and Splenocytes Abstract in International Conference on Complex Systems (ICCS2004), May 16-21, 2004, Boston (USA) (#330) (2004).

8. Alexandrova S.A., Ginkul L.B., Shvemberger I.N. Dependance of Fas and FasL expression on genetic rearrangements in tumor cells Abstract in European Conference of Human Genetics 2005, Prague 7-10th May 2005, ICM, Prague, (Czech Republic), Control No. 2005-A-467-ESHG.

9 Alexandrova S.A , Ginkul L B., Shvemberger I N. Expression of Fas and FasL in tumor cells and splenocytes at their simultaneous cultivation. Abstracts of the 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference The Protein World, Budapest (Hungary) 2-7 July p. 26 2005

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Алтухов ЮП, Салменкова ЕА Полиморфизм в популяционной генетике. Генетика. 2002. 38:1173-1195.

Барышников А.Ю. и Шишкин Ю В. Иммунологические проблемы апоптоза. М.: «Эдиториал УРСС». 2002. 318 с.

Брага ЕА и др. От идентификации геномного полиморфизма к диагностике и созданию прогностических маркеров для эпителиальных опухолей человека. Мол. Биол. 2004. 38 179-190.

Гинкул Л.Б., Микулинская СМ. и др. Фенотипическая вариабельность у трансгенных мышей gag-myc Вопр. Онкол 1998.44.556-561.

Гоечко В В. Использование молекулярных ДНК-маркеров в филогении и систематике. Генетика. 2002. 38:1013-1033

Никитина Т.В., Назарвнко С.А. Микросателлитные последовательности ДНК человека' мутационный процесс и эволюция Генетика 2004 401301-1318

Швембергер И.Н. Нормализация опухолевых клеток. Л., Наука, 1987. 144 с.

Abrahams V.M. et al. Epithelial ovarian cancer cells secrete functional Fas ligand Cancer Res. 2003. 63:5573-81.

Arribas R. et al Assessment of genomic damage in colorectal cancer by DNA fingerprinting prognostic applications. J. Clin. Oncol. 1997 15 3230-40.

Bennett M.W et al The Fas counterattack in vivo - apoptotic depletion of tumor-infiltrating lymphocytes associated with Fas ligand expression by human esophageal carcinoma J. Immunol. 1998. 160 5669-5675.

Caetano-Anolles G Scanning of nucleic acids by in vitro amplification new developments and applications Nat Biotechnol. 1996. 14 1668-1674.

Chromczynsky P., Sacchi N. Single-step DNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction Anal Biochem 1987 162 156-159.

de Juan С et al. Prognostic value of genomic damage in поп small cell lung cancer. Br. J Cancer. 1998. 77 1971-7

EfronB, TibshiraniRJ An introduction to the bootstrep New York 1993 436 p.

Hogan B. et al. Manipulating the mouse embryo. New York- Cold Spring Harbor Lab, 1966.332 p.

Houston A. et al. Fas ligand expressed in colon cancer is not associated with increased apoptosis of tumor cells in vivo: Int. J. Cancer. 2003.107 209-14

lonov J. et al. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature. 1993 363:558-561.

Keshava C. et al. Genomic instability in silica- and cadmium chloride-transformed BALB/C-3T3 and tumor cell lines by random amplified polymorphic DNA analysis. Mutat. Res. 1999.425:117-23.

Koudrine A.V. Trace elements and apoptosis - review Journal of Trace Elements in Medicine & Biology. 1998.12:65-76.

Kuzminov A. DNA replication meets genetic exchange: chromosomal damage and its repair by homologous recombination Proc Natl Acad Sci USA. 2001 98 8461-8.

Lee J. et al. The Fas system, a regulator of testicular germ cell apoptosis, is differentially up-regulated in Sertoli cell versus germ cell injury of the testis. Endocrinology 1999.140:852-858.

Li W.-H., et al. Evolutionary analyses of the human genome. Nature. 2001 409:847849.

Lotem J., Sachs L. Epigenetics wins over genetics: induction of differentiation in tumor cells. Seminars Cancer Biol. 2002.12:339-46.

Luo L. et al. DNA alterations in human aberrant crypt foci and colon cancers by random primed polymerase chain reaction Cancer Res 2003 63:6166-6169.

O'Connell J. et al. The Fas counterattack: cancer as a site of immune privilege. Immunology Today. 1999. 20:46-52.

Papadopoulos S. et al Assessment of genomic instability in breast cancer and uveal melanoma by random amplified polymorphic DNA analysis. Int. J. Cancer. 2002. 99:193200.

Pinkoski M J, Green D R Cloak and dagger in the avoidance of immune surveillance Curr. Opin. Gen. & Dev. 2000.10:114-119.

Rabinowich H. et al. Lymphocyte apoptosis induced by Fas ligand-expressing ovarian carcinoma cells - implications for altered expression of T-cell receptor in tumor-associated lymphocytes. J.CIin.lnvest. 1998.101: 2579-2588.

Salisbury B.A. et al. SNP and haplotype variation in the human genome. Mutat. Res. 2003. 526:53-61.

Shimizu M. et al Induction of antitumor immunity with Fas/APO-1 ligand (CD95L)-transfected neuroblastoma neuro-2a cells. J. Immunol. 1999.162:7350-7.

Smit A F Interspersed repeats and other mementos of transposable elements in mammalian genomes. Curr. Opin. Genet. Dev. 1999. 9: 657-663.

Vikhanskaya F. Introduction of wild-type p53 in a human ovarian cancer cell line not expressing endogenous p53. Nucl. Acids Res 1994. 22 1012-7

Weller M. et al. CD95-dependent T-cell killing by glioma cells expressing CD95 ligand -more on tumor immune escape, the CD95 counterattack, and the immune privilege of the brain Cellular Physiology & Biochemistry. 1997 7-282-288.

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать 22.09.2005. Формат 60x84/16. Печать офсетная. Уч. печ. л. 1,25. Тираж 100. Заказ 444.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая, 29.

У-

¡(117977

РНБ Русский фонд

2006-4 16706

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Александрова, Светлана Алексеевна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Генетические перестройки в онтогенезе эукариот

2.1.1. Особенности структуры генома и его изменчивость

2.1.2. Роль мобильных генетических элементов в изменчивости генома

2.1.3. Изменения генома в генеративных и соматических клетках, необходимые для нормального онтогенеза

2.1.4. Генетические перестройки, имеющие значение в адаптации и видообразовании

2.1.5. Изменения в генетическом аппарате клетки при наследственных и спорадических заболеваниях

2.2. ПЦР-фингерпринт как метод для изучения геномного полиморфизма. Варианты метода

2.2.1. ПЦР

2.2.2. АР-ПЦР

2.2.3. РМРО-ПЦР

2.3. Особенности канцерогенеза, изучаемые с помощью ПЦР-фингерпринта

2.3.1. Молекулярно-генетические маркеры злокачественного роста

2.3.2. Прогрессия опухолей и прижизненный анализ

2.3.3. Выявление активности онкогенов

2.3.4.Гэнные и хромосомные перестройки

2.3.5.Выявление потери гетерозиготности генов-супрессоров опухолевого роста

2.3.6. Идентификация генов

2.3.7. Неспецифические геномные перестройки. Микросателлитная нестабильность

2.4. Сохранение способности опухолевых клеток к дифференцировке при разных условиях их пролиферации

2.5. Роль апоптоза при злокачественной трансформации клетки и прогрессии опухолей

2.5.1. Апоптоз при нормальном развитии организма

2.5.2. Апоптоз при злокачественном росте и генетическая вариабельность опухолевых клеток

2.5.3. Фунционирование системы Раэ-рецетор/Раэ-лиганд при взаимодействии опухолевых клеток с иммунной системой

3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

3.1.Материал

3.1.1. Опухолевые клеточные линии

3.1.2. Линейные мыши

3.2. Методы

3.2.1. Выделение высокомолекулярной ДНК

3.2.2. НАРО-ПЦР

3.2.3. Индукция дифференцировки опухолевых клеток и морфологическое исследование опухолей

3.2.4. Взаимоиндукция апоптоза опухолевыми клетками и лимфоцитами

3.2.5. Выявление апоптоза опухолевых клеток и спленоцитов

3.2.6. Выделение тотальной РНК

3.2.7. Обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция

3.2.8. Секвенирование ПЦР-фрагментов

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Полиморфизм амплифицированных фрагментов ДНК в клетках клонов гепатомы мыши МГ-22а, выявленный методом RAPD-ПЦР

4.2. Характеристика генетической структуры популяции опухолевых гепатоцитов МГ-22а

4.3. Жизнеспособность клонов гепатомы M Г■22а с разной степенью генетической изменчивости

1* 4.4. Морфологические характеристики опухолей, выросших в ПСТ и ПКГ

4.5. Полиморфизм амплифицированных фрагментов ДНК в клетках клонов гепатомы мыши МГ-22а, выявленный методом RAPD-ПЦР, при разных условиях культивирования in vivo

4.6. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента ДНК

4.7. Взаимоиндукция апоптоза в клоновыхлиниях гепатомы МГ■22а и саркомы J-774 мыши и сингенными спленоцитами

4.8. Генетическая гетерогенность и взаимоиндукция апоптоза опухолевых гепатоцитов МГ-22а и спленоцитов

4.9. Экспрессия Fas и FasL в популяциях и клонах клеточных линий МГ-22а и J-774 мыши in vitro

4.10. Экспрессия Fas и FasL в опухолевых гепатоцитах МГ-22а, гистиоцитах J-774 и сингенных спленоцитах при их пассировании in vivo

4.11. Экспрессия Fas и FasL в опухолевых гепатоцитах МГ-22а, гистиоцитах J-774 и сингенных спленоцитах при их совместном культивировании in vitro

4.12. Способность к апопотозу и экспрессия Fas и FasL в опухолевых клетках МГ-22а и J-774 и сингенных спленоцитах при их совместном культивировании in vitro

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетический полиморфизм в клонах опухолевых линий гепатомы МГ-22А и саркомы J-774 мыши при разных условиях пролиферации и апоптозе"

Актуальность проблемы

Известно, что кодирующие последовательности ДНК занимают не более 10-15% всего генома (Li et al., 2001). Эти последовательности наиболее консервативны в процессе эволюции, так как мутации в них подвержены давлению жесткого естественного отбора. Функции же остальной ДНК еще не ясны, известно, однако, что эта часть ДНК обладает высоким полиморфизмом (Алтухов, Салменкова, 2002). Наиболее хорошо изучены два варианта генетического полиморфизма: количественные изменения в области локализации мини- и микросателлитных последовательностей ДНК и качественные замены отдельных нуклеотидов (Salisbury et al., 2003; Никитина, Назаренко, 2004). Также большой вклад в геномную изменчивость как генеративных, так и соматических клеток вносят мобильные элементы (Smit, 1999). Изучение генетического полиморфизма показало важность и актуальность исследований этого явления в нормальной жизнедеятельности клеток и организмов, при патологии, в частности, при злокачественном росте, а также в процессе эволюции (Алтухов, Салменкова, 2002; Брага и др., 2004). Одним из наиболее перспективных методов изучения генетического полиморфизма являются разные варианты ПЦР-фингерпринта, в частности, RAPD-ПЦР (Caetano-Anolles, 1996; Гречко, 2002).

С появлением методов ПЦР-фингерпринта геномной ДНК расширились знания об опухолевом росте, так как с помощью этих методов были выявлены не только специфические изменения генома, связанные с функционированием генов, участвующих в канцерогенезе, но и неспецифические, являющиеся результатом дестабилизации генома вследствие множества мутаций в различных частях генома (lonov et al., 1993; Luo et al., 2003). Степень геномных изменений, выявляемых этими методами, коррелирует с генотипическими, фенотипическими и клиническими признаками при прогрессии опухолей и может быть полезна для прогностических оценок (Arribas et al., 1997; Papadopulus et al., 2002).

Одним из критериев злокачественности клеток является их способность к дифференцировке (Lotem, Sachs, 2002). Поэтому большое значение приобретает изучение зависимости способности опухолевых клеток к if* дифференцировке от степени генетической изменчивости, в частности, от перестроек генетического аппарата клетки, выявляемых методом RAPD-ПЦР.

Особое место в исследованиях взаимодействия опухоль-организм занимает способность опухолей не только уходить от иммунологического надзора организма, но и активно подавлять защитную иммунную реакцию, тем самым обеспечивая себе иммунологическую привилегированность (Weller et al., 1997; O'Connell et al., 1999). Иммунологическая привилегированность опухолей, образующаяся благодаря способности опухолевых клеток вызывать апоптотическую гибель лимфоцитов, показана в ряде работ (Rabinowich et al., 1998; Bennett et al., 1999; Pinkoski, Green, 2000). Представляет интерес изучение влияния генетической изменчивости опухолевых клеток на их способность вызывать апоптоз у клеток иммунной системы, а также на их чувствительность к индукции апоптоза лимфоцитами, (^г Изучение генетического полиморфизма в опухолевых клетках имеет важное значение для оценки степени злокачественности опухолей и прогнозировании течения заболевания.

Последнее десятилетие ознаменовалось бурным изучением молекулярных механизмов апоптоза как в физиологических условиях, так и при злокачественном росте. В результате этих исследований было выявлено большое значение в апоптозе системы Fas-рецепторэ и Fas-лиганда (Fas/FasL) (Барышников, Шишкин, 2002). Имеются данные, что именно от экспрессии FasL в опухолевых клетках зависит сопротивление опухолей иммунной системе организма и, следовательно, само развитие и течение заболевания (Houston et al., 2003). Однако до настоящего времени нет данных о гетерогенности популяции опухолевых клеток по экспрессии Fas и FasL. Поэтому важное значение имеет проведенное в работе выявление гетерогенности опухолей и по экспрессии Fas, и по экспрессии FasL с помощью клонального анализа для исследования злокачественных опухолей и прогнозирования их взаимоотношений с иммунной системой организма.

Цели и задачи исследования

Цель настоящей работы заключалась в изучении динамики генетического полиморфизма, выявляемого методом RAPD-ПЦР, в гепатоме МГ-22а и гистиоцитарной саркоме J-774 мыши и в их (слоновых линиях при их & пассировании in vitro и in vivo.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить генетическую структуру гепатомы Мг-22а мыши методом RAPD-ПЦР in vitro.

2. Изучить зависимость жизнеспособности клеток клонов гепатомы МГ-22а мыши in vitro от числа выявленных методом RAPD-ПЦР генетических изменений.

3. Изучить зависимость между генетическим полиморфизмом в клоновых линиях гепатомы МГ-22а мыши при их трансплантации в подкожную соединительную ткань (ПСТ) и переднюю камеру глаза (ПКГ) и уровнем дифференцировки.

4. Выявить влияние генетической вариабельности на способность к индукции апоптоза у опухолевых клеток гепатомы МГ-22а мыши и сингенных у. спленоцитов при их совместном культивировании in vitro.

5. Выявить зависимость индукции апоптоза у опухолевых клеток гепатомы МГ-22а и гистиоцитарной саркомы J-774 мыши с разным уровнем генетического полиморфизма и сингенных спленоцитов от экспрессии Fas и FasL.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В генетической структуре популяции клеток гепатомы МГ-22а мыши, основанной на числе перестроек на фингерпринтах клонов, полученных методом RAPD-ПЦР, выделены стволовая, вариабельная и аберрантная части популяции. Наибольшей жизнеспособностью обладают клоны с наименьшей генетической изменчивостью.

2. Клетки клонов гепатомы МГ-22а мыши сохраняют способность к дифференцировке при пролиферации в передней камере глаза, несмотря на высокие значения индекса генетической вариабельности.

3. Клоновые линии гепатомы МГ-22а мыши с высоким уровнем генетической вариабельности устойчивы к апоптозу, вызываемому спленоцитами, и обладают способностью индуцировать апоптоз спленоцитов. у 4. Опухолевые клетки гепатомы МГ-22а и гистиоцитарной саркомы J-774 мыши с разным уровнем генетического полиморфизма могут влиять на экспрессию FasL в спленоцитах при их совместном культивировании, что приводит к разной интенсивности индуцированного спленоцитами апоптоза у опухолевых клеток.

Научная новизна полученных результатов

Впервые был изучен генетический полиморфизм в клеточной популяции и клоновых линиях гепатомы МГ-22а мыши методом RAPD-ПЦР и показана широкая вариабельность клоновых линий по этому признаку. Показана зависимость жизнеспособности клонов МГ-22а от числа выявленных генетических перестроек. Было выявлено, что способность опухолевых клеток к дифференцировке при их пролиферации в ПКГ может сохраняться при достаточно высокой частоте генетических перестроек. На клоновых линиях МГ-22а и J-774 с разным уровнем генетического полиморфизма впервые была изучена способность опухолевых клеток индуцировать апоптоз спленоцитов, а также подвергаться апоптозу, индуцированному спленоцитами, при их совместном культивировании. Показано, что устойчивость к апоптозу у опухолевых клеток, вызываемому спленоцитами, наблюдается у клоновых линий с высокой генетической вариабельностью. В то же время, такие клоновые линии обладают способностью индуцировать апоптоз спленоцитов. Впервые был проведен клональный анализ популяции опухолевых клеток по экспрессии генов апоптоза Fas и FasL, для чего был использован метод ОТ-ПЦР, с помощью которого была показана широкая вариабельность их экспрессии. В опытах по совместному культивированию опухолевых клеток с сингенными спленоцитами в спленоцитах после культивирования обнаружено значительное повышение вариабельности экспрессии FasL. Таким образом показано, что опухолевые клетки с разным уровнем генетического полиморфизма могут оказывать воздействие на контактирующие с ними лимфоциты, влияя на экспрессию FasL и определяя таким образом интенсивность апоптоза опухолевых клеток.

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные данные показывают, что в возникновении и нарастании генетического полиморфизма в процессе пролиферации опухолей in vitro и in vivo участвуют перестройки, выявляемые методом RAPD-ПЦР. Вариабельность числа перестроек такого типа может дать представление о жизнеспособности опухолевых клоновых линий. Важное теоретическое значение имеет показанная в работе возможность повышения уровня дифференцировки в клоновых линиях даже при высоких значениях индекса генетической вариабельности.

Практическое значение работы заключается в том, что показана целесообразность использования для изучения взаимодействия опухолевых клеток с иммунной системой модели совместного культивирования опухолевых клонов с сингенными спленоцитами. Такая модель может быть использована не только в экспериментальной онкологии, но также и для изучения опухолей человека с целью определения их взаимоотношения с лимфоцитами носителя опухоли. При этом показана целесообразность выявления генетической вариабельности в опухолях методом RAPD-ПЦР для определения степени их злокачественности и способности индуцировать апоптоз лимфоцитов, а также претерпевать индукцию апоптоза лимфоцитами. В работе показана целесообразность использования метода ОТ-ПЦР для выявления экспрессии Fas и FasL в опухолевых клетках и спленоцитах.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР