Влияние полихроматического видимого и инфракрасного излучения на рост опухолей

Князев, Николай Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние полихроматического видимого и инфракрасного излучения на рост опухолей
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Влияние полихроматического видимого и инфракрасного излучения на рост опухолей"

На правах рукописи

Николай Александрович

ВЛИЯНИЕ ПОЛИХРОМАТИЧЕСКОГО видимого и ИНФРАКРАСНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА РОСТ ОПУХОЛЕЙ

03.03.04 —Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 8 НОЯ 2013

Санкт-Петербург 2013 г.

005540526

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Самойлова Кира Александровна

кандидат биологических наук Филатова Наталия Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Корнилова Елена Сергеевна Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор медицинских наук, профессор Назаров Петр Григорьевич

Научно-исследовательский институт экспериментальной

медицины СЗО РАМН,

Санкт-Петербург

Ведущая организация: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита состоится 20 2013 г. в 1Ъ_часов на заседании

диссертационного совета Д002.230.01 на базе Федерального государственного бюджетного

учреждения науки Институт цитологии Российской академии наук по адресу: 194064, Санкт-

Петербург, Тихорецкий пр., 4.

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru

Электронный адрес: ceIIbio@mail.cytspb.rssi.ru

Факс: 8(812)297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан « /о » ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.В. Камнпская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

После обоснования в 70-80-х годах прошлого века возможности иммуносупрессивного и проканцерогенного действия ультрафиолетового (УФ) излучения его применение в лечебно-оздоровительных целях резко сократилось, и основное место в светолечении заняли лазерные и, позднее, светодиодные технологии, использующие низкоинтенсивиое монохроматическое или узкополосное излучение видимого (ВИД) и инфракрасного (ИК) диапазона (Kripke, 1990; Aubin, 2003). Доказана высокая эффективность излучения этой части спектра для стимуляции физиологических процессов у нефотосинтезирующих организмов и накоплен значительный опыт его использования в медицине (Karu, Kolyakov, 2005). Фототерапевтические аппараты, используемые в медицине, характеризуются более высокой мощностью генерируемого излучения с высокой степенью его поляризации, в отличие от обычного дневного света. В настоящее время физиотерапевтические аппараты, генерирующие ВИД и ИК излучение, успешно используются для стимуляции иммунной системы, ускорения заживления ран и улучшения микроциркуляции крови (Samoilova et al., 1998; Posten et al., 2005). Отношение к применению полихроматического и монохроматического излучения в медицинской практике остается сдержанным из-за опасений индукции и (или) стимуляции неонластических процессов. Подобные опасения основаны на известном биостимулирующем действии ВИД и ИК излучения (Karu et al., 1982).

Вопрос о характере влияния излучений оптического диапазона на пролиферацию опухолевых клеток в условиях in vitro и рост злокачественных новообразований у лабораторных животных in vivo далек от разрешения. Показано, что низкоинтенсивное лазерное излучение различных длин волн может как стимулировать пролиферацию трансформированных клеток (Gao et al., 2006), так и не оказывать на нее влияния (Pinheiro et al., 2002; Renno et al., 2007) и даже угнетать ее (Liu et al., 2004). Торможение скорости роста опухолей и степень их прививаемости в условиях in vivo могут быть также связаны с изменением их чувствительности к лизису естественными киллерными клетками (NK-клетками), являющимися эффекторами системы естественного противоопухолевого иммунитета (Lanier, 2005; Kovalenko et al., 2012). К настоящему времени получены данные о том, что монохроматическое и полихроматическое излучение обладает стимулирующим действием на иммунитет человека (Жеваго и др., 2005) и животных (Novoselova et al., 2006), однако, механизмы этого явления изучены недостаточно. Не исключено, что распознавание

опухолевых клеток клетками иммунной системы может быть связано с фенотипическими изменениями облученных трансформированных клеток, что, однако, остается недоказанным.

Таким образом, учитывая актуальность исследования проблем онкологической безопасности применения фототерапии, в медицине необходимы исследования, направленные на изучение механизмов действия ВИД и ИК излучения на опухолевые клетки, и анализ их туморогенности в модельных экспериментах на лабораторных животных.

Цель исследования.

Цель настоящей работы заключалась в определении влияния полихроматического видимого излучения, сочетанного с инфракрасным (480-3400 нм), на рост опухолей МГ-22а у мышей линии СЗНА и выяснении возможных механизмов, вовлеченных в этот процесс. Задачи исследования.

1. Определить влияет ли ВИД и ВИД-ИК излучения на рост опухоли МГ-22а у мышей-опухоленосителей.

2. Оценить влияние облучения клеток МГ-22а ВИД-ИК светом в условиях in vitro на их прививаемость, скорость роста и выживаемость животных с опухолью.

3. Определить влияние ВИД-ИК света на жизнеспособность и пролиферативную активность клеток МГ-22а.

4. Установить возможные механизмы изменения туморогенности клеток МГ-22а, облученных ВИД-ИК светом в связи с изменением их фенотипа.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. ВИД и ВИД-ИК излучение тормозит рост опухоли гепатомы МГ-22а у мышей-опухоленосителей и увеличивает выживаемость животных. Облучение ВИД-ИК светом клеток МГ-22а в условиях in vitro снижает степень их прививаемости и скорость роста опухоли после перевивки мышам СЗНА.

2. ВИД-ИК излучение не влияет на жизнеспособность клеток МГ-22а и не приводит к изменению их пролиферативной активности. Не изменяются синтез и транслокация «рессорного белка теплового шока Hsp70 на поверхность клеток.

3. Облучение клеток МГ-22а ВИД-ИК светом приводит к увеличению их чувствительности к лизису NK-клетками интактных мышей СЗНА в условиях in vitro. ВИД-ИК излучение вызывает структурные изменеиия поверхности облученных клеток МГ-22а: снижается содержание гликопротеинов и кислых мукополисахаридов и увеличивается экспрессия ламинина-1 на поверхности клеток.

Научная новизна работы. Впервые обнаружено противоопухолевое действие двух видов полихроматического излучения - видимого и видимого, сочетанного с инфракрасным. В модельных экспериментах на мышах СЗНА с подкожно трансплантированной сингенной гепатомой МГ-22а показано торможение роста опухолей как после 5-кратного облучения мышей-опухоленосителей, так и после облучения клеток гепатомы МГ-22а in vitro перед их трансплантацией интактным животным.

Впервые продемонстрирован возможный механизм противоопухолевого действия ВИД и ИК света. Показано, что торможение роста опухолей не связано с повреждением клеток и изменением их пролиферативной активности, а обусловлено повышением чувствительности этих клеток к литической активности NK-клеток, являющихся эффекторами противоопухолевой резистентности. Как оказалось, повышение чувствительности трансформированных клеток к NK-лизису является следствием структурных изменений их поверхности — снижением содержания надмембранных гликопротеинов и кислых мукополисахаридов и увеличением синтеза ламинина, распознаваемого NK-клетками мышей.

Показано, что облучение полихроматическим светом в использованных дозах не является стрессорным фактором для клеток МГ-22а, поскольку не способствует повышению содержания белка теплового шока (Hsp-70) и его транслокации на поверхность опухолевых клеток.

Личиый вклад автора. Все экспериментальные процедуры и обработка результатов выполнены автором лично. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научными руководителями.

Теоретическое и практическое значение работы. Выявленное нами торможение роста опухолей у мышеи СЗНА под действием ВИД-ИК излучения и продемонстрированные нами механизмы этого воздействия являются научным обоснованием онкологической безопасности ВИД и ИК излучения. Полученные нами данные позволяют применять в медицинской практике фототерапевтические аппараты Bioptron и Q-light, генерирующие излучение различных длин волн оптического диапазона для стимуляции иммунитета, улучшения кровотока в макро- и микрососудах, а также для ускорения ранозаживления без опасения индукции неопластического процесса. Апробация работы.

Основные положения работы доложены и обсуждены на международной конференции 22th International Congress Laser Medicine with Pre-Conference Courses (Италия, 2008); на международной конференции The World Association of Laser Therapy 2008

Conference (ЮАР, 2008); на международной конференции 24th International Congress Laser Medicine & IALMS (Италия, 2010); на международной конференции I5ih International Congress of European Medical Laser Association (Финляндия, 2010); на международной конференции Laser Europe 2010 (Испания, 2010); на Российской конференция по фундаментальной онкологии «Фундаментальная онкология — Петровские чтения» (Россия, 2010); на III Съезде Общества клеточной биологии, Санкт-Петербург (2012); на международной конференции «Laser Helsinki 2012 International Congress» (Финляндия, 2012); на XXXVI и ХХХХ научно-практических конференциях «Лазеры в медицине и биологии» (Ялта 2009, 2013). По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 3 в рецензируемых научных журналах из перечня изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Структура и объём диссертации.

Диссертационная работа изложена на 100 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, методы, результаты, обсуждение и выводы. Материал иллюстрирован I? рисунками и О таблицами. Библиографический указатель содержит источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Источники излучения. Источником сочетанного ВИД-ИК, близкого но спектральному диапазону к солнечному свету без его ультрафиолетовой компоненты (480—3400 нм, 40 мВт/см2, 95 % поляризации), служил фототерапевтический аппарат Bioptron-2 (BioptronAG, Швейцария). Дня облучения были использованы дозы 4.8 и 9.6 Дж/см2. Экспозиция в 2 мин облучения соответствует дозе 4.8 Дж/см2.

Полный спектр ВИД (380-750 нм, 40 мВт/см2, 95 % поляризации) получали от фототерапевтического аппарата Q—light (Р&В AG, Швейцария). Для облучения были использованы дозы 9.6, и 38.4 Дж/см2. Одинаковые характеристики мощности излучений, генерируемых этими источниками, позволяла использовать их при одинаковых экспозициях в разных дозах (9.6 - 38.4 Дж/см2).

Обоснование выбора доз облучения. При выборе доз облучения ВИД и ВИД-ИК светом в первую очередь руководствовались величиной максимальной терапевтической дозы, применяемой в медицине при облучении поверхности тела пациентов. Эта доза не должна превышать значения 10 Дж/см2 (AIGhamdi et al., 2012). Нами были выбраны дозы 4.8 Дж/см2 и 9,6 Дж/см2. При облучении ВИД светом в дозах 4.8 и 9.6 Дж/см2 влияние на скорость роста

опухолей у мышей обнаружено не было, в связи с этим в экспериментах применяли дозы, превышающие терапевтическую, до 38.4 Дж/см2, что соответствовало экспозиции 16 мин. Естественная радиация Солнца. Эксперименты проводили при минимальных значениях инсоляции естественной солнечной радиации. Эти показатели имеют наиболее низкие значения с октября по март и составляют от 0.1 до 0.6 Дж/см2 для Санкт-Петербурга (Atmospheric science data center, NASA). Эти значения в 4-24 раз ниже доз облучения, использованных в нашей работе. Использованное нами излучение в отличие от естественного поляризовано и не включает в себя ультрафиолетовую компоненту. С учетом этих данных можно предположить, что естественное излучение не может оказывать значительного влияния на экспериментальных животных и культуру клеток. Экспериментальные животные. В экспериментах использовали мышей линии СЗНА обоих полов весом 18-20 г (питомник "Рапполово", РАМН).

Клетки гепатомы мыши. Линейноспецифичная гепатома МГ-22а - это субштамм гепатомы 22а, индуцированной ортоаминоазотолуолом у мышей СЗНА в 1951 г. (Гельштейн, 1954). Клетки МГ-22а были получены из Банка клеточных культур ИНЦ РАН. Клетки культивировали в среде ДМЕМ (Биолот, Россия) с добавлением 10 % телячьей эмбриональной сыворотки (Биолот, Россия) и 40 мкг/мл гентамицина (Sigma, США). Прививка клеток гепатомы МГ-22а. Клетки гепатомы МГ-22а прививали интактным мышам СЗНА в количестве 5><104 - 2><105 клеток на 1 мышь. Время появления опухолей, их размер и сроки гибели мышей с опухолями регистрировали 1 раз в 5 суток в течение 10-45 сут после трансплантации опухолевых клеток. Объем опухолей рассчитывали по формуле (Хавинсон и др., 2001):

где L - максимальный диаметр опухоли, D - минимальный диаметр (мм). Размер опухолей оценивали до начала гибели животных-опухоленосителей (до 25-х суток). Всего было использовано 150 мышей, разделенных на соответствующие группы. Было проведено 3 серии опытов.

Облучение мышей. Мышей СЗНА через 10 сут после прививки клеток МГ-22а, когда у 100% мышей образовались опухоли, разделили на 5 групп. Группы 1 и 2 подвергали 5-дневному курсу облучения ВИД-ИК излучением в дозе 4.8 и 9.6 Дж/см2, соответственно, группы 3 и 4 подвергали 5-дневному курсу облучения ВИД излучением в дозах 9.6 и 38.4 Дж/см2, соответственно. Пятая (контрольная) группа животных облучению не подвергалась. Облучение клеток гепатомы МГ-22а in vitro. Клетки гепатомы МГ-22а облучали только ВИД-ИК светом. Для облучения клетки МГ-22а рассевали в чашки Петри по 2><105 клеток на

чашку для достижения логарифмической фазы роста. Перед облучением культуральную среду заменяли на фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). После облучения PBS заменяли на среду культивирования. Через 24 ч после облучения клетки перевивали интактным мышам СЗНА. Параллельно проводили оценку клеток по критериям жизнеспособности, пролиферативной активности, чувствительности к лизису NK-клетками и параметрам изменения их клеточной поверхности.

Оценка пролиферативной активности и жизнеспособности клеток МГ22а. Оценку жизнеспособности и пролиферативной активности клеток проводили с помощью проточного цитометра EPICS XL (Вескшап Coulter, США). Контролем служили необлученные клетки. Для подсчета количества мертвых клеток к клеточной суспензии добавляли йодид пропидия (Invitrogen, США) в концентрации 0.05 мг/мл. После инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре пробы анализировали на проточном цитометре. Оценивали долю клеток, окрашенных йодистым пропидием, по отношению к общему числу клеток, в процентах.

Для анализа клеточного цикла к каждой пробе добавляли сапонин (Fluka, США) в концентрации 0.2 мг/мл, РНКазу (Sigma, США) в концентрации 0.25 мг/мл и йодид пропидия (Invitrogen, США) в концентрации 0.05 мг/мл. После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре пробы анализировали на проточном цитометре. Обработку данных проводили с помощью программы ModFit LT (Verity Software House, Topsham). Окраска гликопротеинов и кислых мукополисахаридов на поверхности клеток МГ22а альциановым синим (АС). Через 24 ч после облучения ВИД-ИК излучением клетки гепатомы 22а отмывали PBS три раза. Клетки снимали скребком. Проводили подсчет клеток в камере Горяева. К 1 мл суспензии, содержащей 1 млн. клеток, добавляли 2 мл АС до конечной концентрации 0.01 %. Смесь инкубировали 30 мин, затем осаждали клетки центрифугированием (200 g, 15 мин). Экстинкцию надосадочной жидкости измеряли на спектрофотометре СФ-46 при 617 нм. Полученные данные сравнивали с результатами спектрофотометрирования исходного 0.01 %-ного раствора АС.

Мерой сорбции красителя клетками служил коэффициент распределения красителя между гликокаликсом и средой - Q, который рассчитывали по формуле:

где С1 — концентрация исходного раствора АС (до окрашивания клеток), единицы оптической плотности; С2 — концентрация того же раствора после окрашивания клеток и удаления их центрифугированием, единицы оптической плотности.

Получение антнламнннновон иммупосывороткн. Поликлональную сыворотку против ламинина1 получали путем двукратной иммунизации кроликов препаратом ламинина1 в концентрации 1 мг/мл. Ламинин1 вводили подкожно в область спины в 10 различных точек в присутствии полного адыованта Фрейндта. Через 2 нед иммунизацию повторяли. Кровь забирали через 4 нед после иммунизации. Первичную очистку антител проводили методом ионообменной хроматографии. Дальнейшую очистку проводили при помощи колонки с иммобилизованным белком G для выделения фракции IgG.

Выявление внутриклеточного и мембранного Hsp 70 на клетках МГ-22а. Клетки рассевали на покровные стекла в чашках Петри так, чтобы в день опыта клетки занимали 75 % стекла. Чашки Петри помещали на лед, удаляли среду и промывали PBS 3 раза. Инкубацию с антителами против Hsp70 (ЗС5) проводили в течение 4 ч. Далее промывали холодным PBS 3 раза. Клетки фиксировали 4 %-ным формальдегидом в течение 40 мин. Для выявления цитоплазматического Hsp70 препараты обрабатывали Triton Х-100 (Рапгеас, Испания). Для выявления Hsp70 на мембране Тритон не использовали. Далее проводили отмывку PBS. Препараты обрабатывали вторыми меченными FITC антителами (GamFitc Sigma antimouse IgG F-0257 Lot 10 k 9245) и четырехкратно отмывку PBS. Препараты заключали в среду Fluoroshield (Sigma), содержащую DAPI. Препараты оценивали с помощью конфокального микроскопа AxioObserver (Zeiss). При анализе изображений использовали программу AxioVision 4,8 (Zeiss).

Электрофорез в полиакрнламидном геле. Дня выявления ламинина проводили разделение белков в 8 %-ном полиакрнламидном геле в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия с учетом рекомендаций Protein electrophoresis technical manual (Amersham, Швеция). Для проявления реакции использовали диаминобензидин. Цитотоксичсекнй тест. Клетки-эффекторы — NK-клетки — получали из селезенки интактных мышей СЗНА (Филатова и др., 2008). Клетками-мишенями служили культивируемые клетки гепатомы мыши линии МГ22а. Для определения NK-активности спленоцитов использовали Н3-уридиновый цитотоксический тест (Hashimoto, Sudo, 1971) в нашей модификации (Филатова и др., 2008). Каждый вариант эксперимента выполняли в 6 повторностях в пластиковых 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических реакций. Соотношение эффекторов и мишеней составляло 5:1—50:1. В контрольные пробы вместо спленоцитов вносили среду культивирования. Инкубацию проб проводили в течение 18 ч при 37 С в атмосфере с 5 % СОг. Радиоактивность измеряли в сцинтилляционном счетчике LS8100 (Beckman, США). Уровень NK-активности оценивали с помощью цитотоксического индекса (ЦИ), отражающего долю погибших клеток в процентах.

Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Вилкоксона для сравнения независимых выборок. В случае оценки статистической достоверности данных по выживаемости мышей и прививаемости клеток использовали критерий Фишера. Статистическую обработку результатов проводили при помощи программы Statistica 6.0. Достоверными считали различия между группами, если р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние полихроматического видимого (ВИД) и видимого сочетаниого с инфракрасным (ВИД-ИК) излучения на скорость роста опухолей у мышей со сформировавшимися опухолями. Для оценки действия ВИД и ВИД-ИК излучения на опухолевый рост in vivo проводили облучение мышей с уже сформировавшимися опухолями.

Выяснилось, что облучение мышей-опухоленосителей ВИД-ИК светом в дозе 4.8 Дж/см2 приводило к торможению скорости роста опухолей в 1.5^1 раза в зависимости от сроков после прививки клеток гепатомы. Облучение тем же светом в дозе 9.6 Дж/см2 на этот показатель не влияло. Облучение мышей ВИД светом в дозе 38.4 Дж/см2 достоверно тормозило рост опухолей только на 25-е сутки после прививки клеток МГ-22а, тогда как меньшая доза облучения (9.6 Дж/см2) не влияла на скорость роста опухолей (рис 1 А).

При облучении ВИД и ВИД-ИК светом во всех использованных нами дозах наблюдали увеличение выживаемости животных. Контрольные необлученные мыши начинали гибнуть раньше облученных (на 25-е сутки в контроле против 30-х суток после облучения) (рис. 1Б). Для обоих исследованных видов излучения количество выживших мышей было в 2 и 1.5 раза больше на 30 и 35-е сутки, соответственно.

Как следует из полученных нами данных, ВИД излучение в дозе 38.4 Дж/см2 достоверно тормозит рост опухолей только в поздние сроки после прививки. Поскольку в случаях применения ВИД-ИК света эффективная доза была значительно ниже (4.8 Дж/см2), а торможение роста опухолей было более выражено, чем при использовании ВИД света, дальнейшие эксперименты проводили с использованием только этого вида излучения.

вид-ик

ВИД

Время, сут

— -О— • контроль » 4.8 Дж/см2 —*— 9.6Дж/см2

Б "О 1 100 ■

'S 80 -з

i 60 -X

I 40 " I 20 ■

1 011 10 15 20 25 30 35 40 Время, сут

— -О— - контроль -■-4.8 Дж/см2 -*-9.6 Дж/см2

А 600

500 -

=1 400 -

¡.300 -

1 200 -р

из ° 100

о -

10 15 20 25 30 35 40 Время, сут

контроль-Ш-9.6 Дж/см2 -л-38.4 Дж/см2

контроль

15 20

Время, сут

—О—9.6Дж/см2 -л—

38.4 Дж/см2

Рисунок I. Динамика роста опухолей (А) и выживаемость мышей (Б) после облучения мышей-опухолсносителей ВИД-ИК светом в дозах 4.8 Дж/см2 и 9.6 Дж/см2 и ВИД светом в дозах 9.6 Дж/см2 и 38.4 Дж/см2. ♦отличие от контроля достоверно, р<0.05.

Из литературы известно, что излучение с длинами волн 400-650 им способно проникать только через эпидермис и дерму (Kolari et al., 1993). На рис. 2 видно, что излучение с длинами волн от 650 до 1350 нм проникает в ткани гораздо глубже, до нескольких мм. (Brown et al., 2004), что может объяснить большую эффективность ВИД света в сочетании с ИК.

Длина волны Л [нм]

Дерма

Гиподерма

Эпидермис

УФ Видимый свет

Глубина у

проникновения, мм

ИК

Рисунок 2. Глубина подкожного проникновения излучения различных длин волн (по: Begic-Rahic et al., 2010).

Действие ВИД-ИК излучения на опухолевые клетки in vitro с последующей их прививкой интактным мышам. Оценка прививаемости облученных клеток, скорости роста опухолей и выживаемости животных. Причины торможения роста опухолей у облученных мышей могут быть различными. С одной стороны, возможно прямое воздействие ВИД-ИК излучения на опухолевые клетки, с другой - стимулирующее действие этого излучения на иммунитет животных. Прямое действие ВИД-ИК излучения на опухолевые клетки при транскутанном облучении опухолевого узла может приводить к их повреждению, замедлению их пролиферации, либо к улучшению их распознавания клетками иммунной системы в связи с изменением их примембранных компонентов. В связи с этим, в следующих опытах моделировали действие ВИД излучения в сочетании с ИК на опухолевые клетки в условиях in vitro.

120

«* 100 ■-ш-

3 з 80

5 60 3

1 40

¡8 20

§ 0

ч 0 10 15 20 25 30 Время, сут 35 40

в — -е— контроль -•-4,8 Дж/см2 -*- — 9,6Дж/см2

Рисунок 3. Динамика роста опухолей (А), прививаемость клеток МГ-22а (Б) и выживаемость животных (В) после инъекции мышам интактных (контроль) клеток и клеток, облученных ВИД-ИК светом в дозах 4.8 Дж/см2 и 9.6 Дж/см2. *отличие от контроля достоверно, р<0.05.

Клетки МГ-22а за 24 ч до трансплантации мышам облучали ВИД-ИК светом в дозах 4.8 и 9.6 Дж/см2. При имплантации мышам клеток, облученных в дозе 4.8 Дж/см2, наблюдали торможение роста опухоли в течение первых 25 сут в 2.5-3 раза по сравнению с контролем (рис. ЗА). Облучение перед имплантацией клеток в дозе 9.6 Дж/см2 не влияло на скорость роста опухолей.

Прививаемость оценивали по количеству животных с опухолями. При облучении прививаемых клеток в дозе 4.8 Дж/см2 количество мышей с опухолями на 15-20-е сут составило 30 % и было в 1.5-2 раза ниже, чем в контроле, в то время как при облучении в дозе 9.6 Дж/см2 количество мышей с опухолями составило 60 % уже на 10-е сут. Несмотря на

различия в прививаемости в ранние сроки, к двадцать пятым суткам различий в прививаемости облученных и необлученных клеток не наблюдали (рис. ЗБ). Облучение ВИД-ИК светом клеток МГ-22а не влияло на выживаемость животных.

Влияние ВИД-ИК излучения на жизнеспособность и пролиферацию клеток гепатомы мыши МГ-22а. Одной из возможных причин снижения туморогенности клеток МГ-22а после их облучении ВИД-ИК светом может быть замедление пролиферации клеток. Для проверки этого предположения в экспериментах in vitro исследовали распределение клеток по фазам клеточного цикла в двух вариантах эксперимента и в контроле, через 24 ч после облучения в дозах 4.8 и 9.6 Дж/см2. Оказалось, что доля клеток в каждой фазе цикла остается в одних и тех же пределах (рис. 4). Облучение клеток гепатомы ВИД-ИК светом достоверно не влияет на гибель клеток МГ-22а в течение 24—72 ч после облучения.

Эти данные свидетельствуют о том, что облучение ВИД-ИК светом в исследованных дозах не обладает цитостатическим цитотоксическим действием в отношении клеток МГ-22а.

СУМ: 26.07% С*М24.04% Ог/М:25.25?4

Риунок 4. Влияние ВИД-ИК излучения на прохождение фаз клеточного цикла клетками МГ-22а через 24 ч после их облучения ВИД-ИК светом в дозах 4.8 Дж/см2 и 9.6 Дж/см2.

Влияние ВИД-ИК на чувствительность клеток гепатомы мыши МГ-22а к лизису !ЧК-клетками. Повышение чувствительности клеток МГ-22а к лизису клетками иммунной системы также может быть связано со снижением их туморогенности. В этой связи исследовали, как ВИД-ИК излучение в дозах 4.8 и 9.6 Дж/см2 влияет на чувствительность клеток гепатомы МГ-22а к их лизису ЫК-клстками, являющимися эффекторами естественного противоопухолевого иммунитета.

Количество эффекторов на одну мишень

Рисунок 5. 1ЧК-активность спленоцитов мышей в отношении клеток МГ-22а, необлученных (контроль) и облученных ВИД-ИК светом в дозах 4.8 Дж/см2 и 9.6 Дж/см2. "отличие от контроля достоверно, р<0.05.

Облучение клеток ВИД-ИК светом в дозе 4.8 Дж/см2 приводило к достоверному увеличению лизиса МГ-22а при всех соотношениях эффекторов и мишеней в диапазоне 5:1-50:1. Облучение в дозе 9.6 Дж/см2 не сопровождалось увеличением чувствительности клеток к лизису ИК-клетками (рис. 5). Изменение чувствительности клеток МГ-22а к ЬГК-лизису согласуется со снижением их туморогенности после облучения клеток в дозе 4.8 Дж/см2. Влияние ВИД-ИК излучения на сорбцию альцнанового синего (АС) клетками гспатомы МГ-22а. Изменение примембранных компонентов клеток (гликокаликса) гепатомы МГ-22а может быть причиной изменения их чувствительности к лизису 1ЧК-клетками. В современной литературе существует множество данных, указывающих на значительную роль гликозидов, представленных на клеточной поверхности, в распознавании опухолевых клеток ЫК-клетками. Показано как позитивное, так и негативное влияние различных гликозидов на опосредованную КК-клетками цитотоксичность. Известно, что при формировании опухолевого узла происходят изменения в структуре углеводов на поверхности клеток. Однако до сих пор не ясно, углеводные составляющие каких гликопротеинов или гликолипидов приводят к изменению чувствительности опухолевых клеток к ЫК-личису (Коваленко и др., 2004).

0,84

0,62

0,8

о. 0,/В

X 0,76

=г

о 0,74

с:

0,72

<1>

0,7

■н-

0 6В

0,66

Контроль

4.8 Дж/см2

9.6 Дж/см2

Дозы облучения

Рисунок 6. Сорбция красителя альцианового синего (АС) клетками МГ-22а интактными (контроль) и облученными ВИД-ИК светом в дозах 4.8 Дж/см2 и 9.6 Дж/см2. "отличие от контроля достоверно, р<0.05.

Степень выраженности гликокаликса оценивали по количеству сорбированного клеточной поверхностью АС. Этот краситель не проникает ни в живые, ни в мертвые клетки и окрашивает только внешние примембранные компоненты клетки пропорционально содержанию в них гликопротеинов и кислых мукополисахаридов (Крыленков и др., 1977). Оказалось, что облучение клеток гепатомы МГ-22а ВИД-ИК светом в дозе 4.8 Дж/см2 приводило к достоверному уменьшению поглощения АС гликокаликсом клеточной поверхности, а значит, и существенному уменьшению объема гликокаликса. При облучении опухолевых клеток в дозе 9.6 Дж/см2 отличий от контроля не наблюдалось (рис. 6). Полученные данные хорошо согласуются с тем, что именно при облучении в дозе 4.8 Дж/см2 наблюдалось как торможение роста опухоли, с одной стороны, так и увеличение чувствительности клеток гепатомы к литическому действию ЫК-клеток — с другой. Оценка экспрессии ламинина в клетках гепатомы МГ-22а после облучения ВИД-ИК светом. Одной из молекул, ассоциированных с мембраной и участвующих в процессах распознавания ЫК-клетками клеток-мишеней, является ламинин. Наличие ламинина на поверхности клеток гепатомы, в отличие от нормальных гепатоцитов подтверждено ранее (Тюряева и др., 2005, Филатова и др., 2008). В нашей работе показано, что при облучении клеток гепатомы мыши ВИД-ИК излучением в дозе 4.8 Дж/см2 происходит повышение экспрессии ламинина в клетках гепатомы МГ-22а. Облучение в дозе 9.6 Дж/см2 не влияло на синтез ламинина (рис. 7). Продемонстрированное в нашей работе увеличение синтеза

ламинина в клетках МГ-22а сопровождалось улучшением их распознавания NK-клетками, снижением сорбции АС гликокаликсом этих клеток и снижением их туморогенности.

По-видимому, снижение сорбционной способности гликокаликса может быть связано с тем, что рецепторы к ламинину на поверхности опухолевых клеток становятся более "доступны", что и способствует распознаванию клеток-мишеней NK-клетками (Филатова и др., 2008). Из литературы известно, что на поверхности NK-клеток присутствуют рецепторы к ламинину — VLA-6 и VLA-3. Увеличение экспрессии ламинииа-1 на поверхности опухолевых клеток также может быть причиной лучшего распознавания клеток-мишеней NK-клетками. (Rabinowich, 1993). С другой стороны, уменьшение объема гликокаликса также может служить причиной лучшего распознавания NK-клетками клеток гепатомы. Кроме того уменьшение объема гликокаликса позволяет предположить, что происходит "демаскирование" ламинина. Полученные нами данные подтверждают участие ламинина-1 во взаимодействии киллер-мишень.

Известно также, что присутствие ламинина на поверхности опухолевых клеток может приводить к снижению их туморогенности (Sprenger et al., 2008), что подтверждается результатами нашей работы.

200 кДа ; , .

4,8 9,6

К вид-ик

Рисунок 7. Определение содержания ламинина методом иммуноблоттинга в клетках МГ-22а через 24 ч после их облучения ВИД-ИК светом в дозах 4.8 Дж/см , 9.6 Дж/см2 и без облучения (К).

Оценка экспрессии IIsp70 в клетках гепатомы 22а после облучении ВИД-ИК излучением. Повышенная чувствительность клеток МГ-22а к цитотоксическому действию NK-клеток может быть связана с транслокацией Hsp70 на поверхность этих клеток. Можно предположить, что полихроматический свет является стрессовым фактором для клеток МГ-22а, приводящим к повышению экспрессии Hsp70 в цитоплазме клеток и их экспорту на поверхность, что, согласно имеющимся данным, может увеличить их распознавание NK-клетками (Kovalenko et al., 2012). Для проверки этого предположения, мы провели выявление Hsp70 в цитоплазме и на поверхности клеток МГ-22а. Удалось обнаружить, что через 24 ч после облучения клеток во всех используемых в предыдущих опытах дозах (4.8 и 9.6 Дж/см2) экспрессия Hsp 70 в цитоплазме клеток не изменялась по сравнению с контролем (клетки без

облучения) (рис. 8). На поверхности необлученных и облученных клеток НБр70 не обнаруживался (рис. 9). Полученные данные свидетельствуют о том, что снижение туморогенности опухолевых клеток МГ-22а и улучшение их распознавания ИК-клетками не связано со стрессорным воздействием ВИД-ИК излучения.

Тепловой шок Дозы облучения |

Без облучения 4.8 Дж/см2 9.6 Дж/см2

» - -

1 1 I

Рисунок 8. Выявление содержания Нвр70 в цитоплазме клеток МГ-22а через 24 ч после их облучения ВИД-ИК светом.

Рисунок 9. Выявление содержания Нэр70 на поверхности клеток МГ-22а через 24 ч после их

облучения ВИД-ИК светом.

ВЫВОДЫ

1. Видимое излучение и видимое излучение в сочетании с инфракрасным тормозит рост опухоли гепатомы МГ-22а у мышей-опухоленосителей.

2. Облучение клеток МГ-22а видимым светом в сочетании с инфракрасным с последующей прививкой их мышам, приводит к снижению прививаемости клеток, торможению роста опухолей и к увеличению выживаемости животных.

3. Снижение туморогенности клеток гепатомы МГ-22а, облученных видимым светом в сочетании с инфракрасным, не обусловлено изменением жизнеспособности и пролиферативной активности клеток МГ-22а.

4. Снижение туморогенности клеток МГ-22а, облученных видимым светом в сочетании с инфракрасным, коррелирует с увеличением их чувствительности к лизису ЫК-клетками.

5. Изменение туморогенности клеток МГ-22а, облученных видимым светом в сочетании с инфракрасным, и их чувствительность к NK-лизису обусловлены изменением состояния гликокаликса клеток гепатомы и связаны с увеличением синтеза ламинина-1.

6. Увеличение чувствительности клеток МГ-22а к NK-лизису, обуславливающее снижение их туморогенности, ire связано с увеличением экспрессии стрессорного белка Hsp70 и его транслокацией на поверхность клеток.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Knyazev N.A., Samoilova К.А., Filatova N.A., Galactionova A.A. Low power visible and near IR light in experimental oncology. South Africa, Johannesburg, The World Association of Laser Therapy Conference programme and abstract. 2008, p. 163.

2. Knyazev N.A., Samoilova K.A., Filatova N.A., Galactionova A.A. Low power visible and near IR light in experimental oncology. Laser in medical sciences. 2008, vol. 23, p. 33.

3. Зимин A.A., Князев H.A., Жеваго H.A., Филатова Н.А., Самойлова К.А. Экспериментальное и клиническое обоснование применения низкоинтенсивного видимого и ближнего инфракрасного света в онкологии. Нелекарственная медицина. 2009, № 2, с. 33-34.

4. Filatova N.A., Knyazev N.A., Samoilova К.А. Exposure to visible and near ir light of tumor cells in vitro enhances their sensitivity to cytolytic activity of natural killers. Laser therapy. 2009, vol 18, № 4, p. 289.

5. Filatova N.A., Knyazev N.A., Samoilova K.A. Low power polychromatic (visible + near IR) light elevates sensitivity of tumor cells to cytolytic activity of natural killers. Laser in medical sciences. 2009, vol. 24, S27-S28.

6. Knyazev N.A., , Samoilova K.A., Filatova N.A. Low power visible and polychromatic (visible + near ir) light enchances sensitivity of tumor cells to cytolytic activity of natural killers. Abstracts of Laser Helsinki 2010 Congress. 2010, S25-S26.

7. Knyazev N.A., Samoilova K.A., Filatova N.A. Antitumor efficacy and oncological safety of low power visible and near IR light in laboratory animals with transplanted tumors. Laser Europe 2010 pr. Final. Res. 2010, p. 42.

8. Филатова H.A., Князев И.А., Самойлова K.A. Низкоинтенсивное полихроматическое видимое и ближнее инфракрасное излучение повышают чувствительность опухолевых клеток к цитотоксической активности спленоцитов мышей. Вопросы онкологии. 2010. Приложение. 2010, с. 50.

9. Kosheverova V.V., Knyazev N.A., Filatova N.A., Samoilova К. A. Deceleration of tumor growth after irradiation of tumor-bearing mice and transplanted tumor cells with

polychromatic visible and infrared light Abstracts of Laser Helsinki 2012 International Congress. 2012, S5.

10. Князев H.A., Кошеверова B.B., Самойлова K.A., Филатова H.A. Влияние полихроматического видимого и инфракрасного света на пролиферацию и туморогенность клеток мышиной гепатомы 22А. III Съезд общества клеточной биологии. Санкт-Петербург. Цитология. 2012, Т. 54, № 9, с. 685.

П.Филатова H.A., Князев H.A., Кладиев А. А, Иванов В. А. Экспериментальная проверка противоопухолевой активности проспидина в модельных экспериментах на мышах. Ш Съезд общества клеточной биологии. Санкт-Петербург. 2012 Цитология. Т. 54, №9, с. 712.

12. Knyazev N.A., Samoilova К.A., Filatova N.A., Galactionova A.A. Effect of polychromatic visible light on proliferation of tumor cells under conditions in vitro and in vivo - after implantation to experimental animals. American Institute of physics. Proc. 2009, vol. 1142, p. 79-86.

13. Самойлова K.A., Князев H.A., Зимин A.A., Филатова H.A., Галактионова A.A. Влияние низкоинтенсивного видимого и ближнего инфракрасного излучения на имплантированные опухоли у лабораторных животных. Фотобюлопя та фотомедицина. 2009, № 4 с. 6-18.

14. Князев H.A., Самойлова К.А., Зимин A.A. Лазерное излучение видимого и ближнего инфракрасного диапазона при опухолевой патологии (анализ экспериментальных исследований) Физиотерапия, бальнеология и реабилитация 2010, № 6. с. 50-56.

15. Князев H.A., Самойлова К.А., Филатова H.A. Пролиферация и туморогенность клеток гепатомы мыши, облученных полихроматическим видимым и инфракрасным светом. Цитология. 2012, Т. 54, № 10, с. 767-773.

16. Филатова Н.А, Князев Н. А., Кошеверова В. В., Шатрова А. Н. Самойлова К.А. Влияние облучения полихроматическим видимым и инфракрасным светом на туморогенность клеток мышиной гепатомы 22а и их чувствительность к лизису естественными киллерами. Цитология. 2013, Т. 55, № 7, с. 501-506.

17. Самойлова К. А., Филатова Н. А., Князев H.A. Полихроматический видимый и инфракрасный свет, близкий к солнечному (480-3400 нм), тормозит рост злокачественных опухолей у мышей: эффекты и некоторые механизмы. Материалы ХХХХ международной научно-практической конференции "Применение лазеров в медицине и биологии". 2013, с. 156-157.

18. Зимин A.A., Князев H.A., Жеваго H.A., Филатова H.A., Самойлова К.А. Экспериментальное и клиническое обоснование применения низкоинтенсивного

видимого и ближнего инфракрасного излучения в онкологии. Материалы XXXTV международной научно-практической конференции "Применение лазеров в медицине и биологии". 2009, с. 23-24.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. AlGhamdi K.M., Kumar A., Moussa N.A. 2012. Lasers Med. Sei. 27(l):237-49. 2. Aubin F., 2003. Eur. J. Dermatol. 13(6):515-23. 3. Begic-Rahic J., Vranic S. 2010. European Dermatology 5:57-60. 4. Gao X., Chen Т., Xing D„ Wang F., Pei Y„ Wei X. 2006. J. Cell Physiol. 206:441-448 5. Hashimoto Y., Sudo H. 1971. Gann. 62:139-143. 6. Karu T.I., Kalendo G.S., Letokhov V.S., Lobko V.V. 1982. Novo Cimento, Vol. 3D(2):319-324. 7. Karu T.I., Kolyakov S.F. 2005. Photomed and laser surgery 23:355-361. 8. Kolari P. J., Airaksinen О. 1993. Acupunct. Electrother. Res. 18:17. 9. Kovalenko E., Kanevskiy L., Klinkova A., Kuchukova A., Streltsova M., Telford W., Sapozhnikov A. 2012. Cell Interaction, Dr. Sivakumar Gowder (Ed.) 322.10. Kripke M.L., 1990. J. Natl. Cancer Inst. 82(17): 1392-6. 11. Lanier L.L. 2005. Annu. Rev. Immunol. 23:255-274. 12. Liu Y.H., Cheng С .С., Но С.С., Pei R.J., Lee K.Y., Yeh K.T., Chan Y., Lai Y.S. 2004. Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. 115:185-201. 13. Novoselova E G., Glushkova O.V., Cherenkov D.A., Chudnovsky V.M., Fesenko E.E. 2006. Photodermatol. photoimmunol. photomed. 22:33-38. 14. Pinheiro A.L.B., Nascimento S.C., Vieira A.L.B., Rolim A.B., Silva P.S., Brugnera A. 2002. Braz. Dent. J. 13:109-112. 15. Posten W„ Wrone D.A., Dover J.S., Arndt K.A., Silapunt S„ Alam M. 2005. Dermatol. Surg. Mar. 31(3):334-40. 16. Rabinowich H., Sedlmayr P., Herberman R.B., Whiteside Т. 1993. J. of immun. 150(11):4844-4855. 17. Renno A.C., McDonnell P.A., Parizotto N.A., Laakso E.L. 2007. Photomed. Laser Surg. 25:275-280. 18. Samoilova K.A., Zhevago N.A., Menshutina M.A., Grigorieva N.B. 2008. Photomed. and laser surgery. 26(5):433-442.19. Sprenger C.C.T., Drivdahl R. H., Woodke L.B., Eyman D., Reed M.J., Carter W.G., Plymate S.R. 2008. Neoplasia. 10(12):1350-1361. 20. Гельштейн В.И. 1954 Вопр. Онкологии 7(1):172-180. 21. Жеваго H.A., Самойлова K.A., Оболенская К.Д., Соколов Д.И. 2005. Цитология. 47(5):450-460. 22. Коваленко Е. И, Хирова Е. В., Молотковская И. М., Овчинникова Т. В., Саблина М. А., Сапожников А. М., Хайдуков С. В., Бовин И. В. 2004. М. 30(3):281-292. 23. Крыленков В. А., Левин B.C., Самойлова К.А. 1979. Цитология. 21(2):157-163 24. Тюряева И.И., Миргородская O.A., Черепанова O.A., Подольская Е.П., Серебрякова М.В., Иванов В.А. 2005. Цитология. 47( 12): 1039-1047. 25. Филатова Н. А., Тюряева И. И., Иванов В. А. 2008. Цитология. 50 (1):72-78. 26. Хавинсон В.Х., Южаков В.В., Кветной И.М., Малинин В.В. 2001. Вопросы онкологии. 47(3):461-466.

Подписано в печать 12.11.2013 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ 564

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Князев, Николай Александрович, Санкт-Петербург

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук

04201454010

Князев

Николай Александрович

На правах рукописи

ВЛИЯНИЕ ПОЛИХРОМАТИЧЕСКОГО ВИДИМОГО И ИНФРАКРАСНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА РОСТ ОПУХОЛЕЙ

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор К.А. Самойлова кандидат биологических наук H.A. Филатова

Санкт-Петербург 2013 г.

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................8

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................12

1.1 Характеристики низкоинтенсивного лазерного излучения, применяемого в медицине............................................................................12

1.2 Естественная радиация Солнца..............................................................16

1.3 Механизм действия на клетку низкоинтенсивного излучения видимого и ближнего инфракрасного диапазонов.....................................16

1.4 Действие низкоинтенсивного лазерного излучения на организм человека..........................................................................................................21

1.5 Низкоинтенсивное лазерное излучение при опухолевом росте.........26

1.5.1 Действие низкоинтенсивного видимого и ближнего инфракрасного излучения на перевиваемые опухоли у животных......26

1.5.2. Действие лазерного излучения видимой части спектра (380-750 нм)................................................................................................................26

1.5.3. Действие лазероного излучения ближней инфракрасной части спектра (750-3400 нм)................................................................................34

1.5.4. Возможные причины изменения туморогенности опухолевых клеток...........................................................................................................36

1.6 Действие низкоинтенсивного видимого и инфракрасного излучения на пролиферативную активность нормальных и опухолевых клеток.....37

1.6.1 Действие низкоинтенсивного видимого и инфракрасного излучения на пролиферацию нормальных клеток..................................38

1.6.2 Действие низкоинтенсивного видимого и ИК излучения на пролиферацию опухолевых клеток..........................................................40

1.7 Распознавание опухолевых клеток клетками врожденного иммуннитета...................................................................................................46

1.7.1 Взаимодействие NK-клеток с опухолевыми клетками.................46

1.7.2 Влияние видимого и ближнего инфракрасного излучения на распознавание клеток опухоли NK-клетками.........................................52

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..........................................................55

2.1 Источники излучения..............................................................................55

2.2 Обоснование выбора доз облучения......................................................55

2.3 Экспериментальные животные..............................................................55

2.4. Клетки гепатомы мыши.........................................................................55

2.5 Прививка клеток гепатомы МГ-22а.......................................................56

2.6 Облучение мышей с опухолями.............................................................56

2.7 Облучение клеток гепатомы МГ-22а in vitro........................................57

2.8 Оценка пролиферативной активности и жизнеспособности клеток МГ-22а............................................................................................................57

2.8.1 Проточная цитометрия.....................................................................57

2.8.2 МТТ.....................................................................................................58

2.9 Окраска гликопротеинов и кислых мукополисахаридов на поверхности клеток МГ-22а альциановым синим (АС)............................58

2.10 Окраска актиновых микрофиламентов...............................................59

2.11 Получение антиламининовой иммуносыворотки..............................59

2.12 Выявление цитоплазматического и мембранного Hsp70 клеток МГ-22а....................................................................................................................60

2.13 Выделение клеточных мембран...........................................................61

2.14 Электрофорез в полиакриламидном геле............................................61

2.14.1 Подготовка проб..............................................................................61

2.14.2 Электрофорез...................................................................................62

2.14.3 Перенос белков на мембрану.........................................................62

2.15 Вестерн блот...........................................................................................62

2.16 Цитотоксический тест...........................................................................63

2.17 Статистическая обработка....................................................................64

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................66

3.1 Влияние полихроматического видимого (ВИД) и видимого сочетанного с инфракрасным (ВИД-ИК) излучения на скорость роста опухолей у мышей со сформировавшимися опухолями...........................66

3.2 Действие ВИД-ИК излучения на опухолевые клетки in vitro с последующей их прививкой интактным мышам. Оценка прививаемости облученных клеток, скорости роста опухолей и выживаемости

животных........................................................................................................70

3.3. Влияние ВИД-ИК излучения на жизнеспособность и пролиферацию клеток гепатомы мыши МГ-22а...................................................................75

3.4 Влияние ВИД-ИК излучения на актиновый цитоскелет клеток МГ-22а....................................................................................................................80

3.5 Влияние ВИД-ИК излучения на чувствительность клеток гепатомы мыши МГ-22а к лизису NK-клетками.........................................................84

3.6 Влияние ВИД-ИК излучения на сорбцию альцианового синего клетками гепатомы МГ-22а..........................................................................86

3.7 Оценка экспрессии ламинина в клетках гепатомы МГ-22а после их облучения ВИД-ИК светом..........................................................................89

3.8 Оценка экспрессии Hsp70 в клетках МГ-22а после облучения ВИДИК светом.......................................................................................................91

Работы опубликованные по теме диссертации............................................101

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

Cu-лазер - лазер на парах меди

DAPI - 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид)

DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (модифицированный по способу Дульбекко фосфатно-солевой буфер)

EDRF - Endothelium Derived Relaxing Factor эндотелиальный фактор расслабления сосудов

Ga-Al-As-лазер - лазер на основе галлия, алюминия и мышьяка

Ga-Al-лазер - галлий алюминиевый лазер

Ga-As-лазер - галлий-мышьяковый лазер

He-Cd-лазер - helium-cadmium (гелий-кадмиевый лазер)

Не-Ые-лазер - helium-neon (гелий-неоновый лазер)

HEPES - 4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazineethanesulfonic acid (4-(2-гидроксиэтил)- 1-пиперазинэтансульфоновая кислота)

Hsp - белок (белки) теплового шока

Hsp70 - heat shock protein 70 kDa, белок теплового шока 70 кДа 1С AM - intercellular adhesion molecule (молекула межклеточной адгезии) IFNy - Interferon, интерферон у IL - Interleukin, интерлейкин

KIR - killer cell Ig-like receptors (иммуноглобулинподобные рецепторы кил-лерных клеток)

NK - natural killers, естественные киллеры

PBS - Phosphate buffered saline, фосфатно-солевой буферный раствор

TNFa - Tumor necrosis factor, фактор некроза опухоли a

VLA - very late antigen

АФК - активные формы кислорода

БМ - базальная мембрана

ВИД - видимое излучение (375 - 750 нм)

ВИД-ИК - видимое излучение, сочетанное с ближним инфракрасным (480 - 3400 нм)

BJIOK - внутривенное лазерное облучение крови ИК - инфракрасное

ИК (блИК) свет - инфракрасный (ближний инфракрасный) свет

КМ - клетки-мишени

МГ-22а - гепатома мыши 22а

НИЛИ - низкоинтенсивное лазерное излучение

ОНЦ - Онкологический научный центр

ПКР - плоскоклеточный рак

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ТХУ - трихлоруксусная кислота

УФ - ультрафиолетовое (излучение)

ФГА - фитогемагглютинин ЦИ - цитотоксический индекс ЦФ - циклофосфан

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы.

После обоснования в 70-80-х годах прошлого века возможности им-муносупрессивного и проканцерогенного действия ультрафиолетового (УФ) излучения его применение в лечебно-оздоровительных целях резко сократилось, и основное место в светолечении заняли лазерные и, позднее, светодиодные технологии, использующие низкоинтенсивное монохроматическое или узкополосное излучение видимого (ВИД) и инфракрасного (ИК) диапазона (Kripke, 1990; Aubin, 2003). Доказана высокая эффективность излучения этой части спектра для стимуляции физиологических процессов у нефотосинтезирующих организмов и накоплен значительный опыт его использования в медицине (Tuner, Hode, 2004; Karu, Kolyakov, 2005). Фототерапевтические аппараты, используемые в медицине, характеризуются более высокой мощностью генерируемого излучения с высокой степенью его поляризации, в отличие от обычного дневного света. В настоящее время физиотерапевтические аппараты, генерирующие ВИД и ИК излучение, успешно используются для стимуляции иммунной системы, ускорения заживления ран и улучшения микроциркуляции крови (Samoilova et al., 1998; Posten et al., 2005). Отношение к применению полихроматического и монохроматического излучения высокой мощности в медицинской практике остается сдержанным из-за опасений индукции и (или) стимуляции неопластических процессов. Подобные опасения основаны на известном общем биостимулирующем действии ВИД и ИК излучения (Karu et al., 1982).

2002; Renno et al., 2007) и даже угнетать (Liu et al., 2004). Торможение скорости роста опухолей и степень их прививаемости в условиях in vivo могут быть также связаны с изменением их чувствительности к лизису естественными киллерными клетками (NK - natural killer cells), являющимися эффекторами системы естественного противоопухолевого иммунитета (Lanier, 2005; Kovalenko et al., 2012). К настоящему времени получены данные о том, что монохроматическое и полихроматическое излучение обладает стимулирующим действием на иммунитет человека (Жеваго и др., 2005) и животных (Novoselova et al., 2006), однако, механизмы этого явления изучены недостаточно. Не исключено, что распознавание опухолевых клеток клетками иммунной системы может быть связано с фенотипиче-скими изменениями облученных трансформированных клеток, что, однако, остается недоказанным.

Цель исследования.

Цель настоящей работы заключалась в определении влияния полихроматического видимого излучения, сочетанного с инфракрасным (4803400 нм), на рост клеток МГ-22а у мышей линии СЗНА и выяснении возможных механизмов, вовлеченных в этот процесс. Задачи исследования.

1. Определить влияет ли ВИД и ВИД-ИК излучения на рост опухоли МГ-22а у мышей-опухоленосителей.

3. Определить влияние ВИД-ИК света на жизнеспособность и про-лиферативную активность клеток МГ-22а.

Научная новизна работы.

Впервые обнаружено противоопухолевое действие двух видов полихроматического излучения - видимого (ВИД) и видимого, сочетанного с инфракрасным (ВИД-ИК). В модельных экспериментах на мышах линии СЗНА с подкожно трансплантированной сингенной гепатомой МГ-22а показано торможение роста опухолей как после 5-кратного облучения ВИД и ВИД-РЖ мышей-опухоленосителей, так и после облучения клеток МГ-22а in vitro перед их трансплантацией интактным животным.

тивности, а обусловлено повышением чувствительности этих клеток к ли-тической активности NK-клеток, являющихся эффекторами противоопухолевой резистентности. Как оказалось, повышение чувствительности трансформированных клеток к NK-лизису является следствием структурных изменений их поверхности - снижением содержания надмембранных гликопротеинов и кислых мукополисахаридов и увеличением синтеза ла-минина, распознаваемого NK-клетками мышей.

Показано, что облучение полихроматическим светом (ВИД-ПК) в использованных дозах не является стрессорным фактором для клеток МГ-22а, поскольку не способствует повышению содержания стрессорного белка теплового шока (Hsp70) и его транслокации на поверхность опухолевых клеток.

Научно-практическое значение

Выявленное нами торможение роста опухолей МГ-22а у мышей линии СЗНА под действием ВИД-РЖ излучения и продемонстрированные нами механизмы этого воздействия являются научным обоснованием онкологической безопасности ВИД и ИК излучения. Полученные данные позволяют применять в медицинской практике фототерапевтические аппараты Bioptron и Q-light, генерирующие излучение различных длин волн оптического диапазона для стимуляции иммунитета, улучшения кровотока в макро- и микрососудах, а также для ускорения ранозаживления без опасения индукции неопластического процесса. Основные положения, выносимые на защиту.

1. ВИД и ВИД-ИК излучения тормозят рост опухоли гепатомы МГ-22а у мышей-опухоленосителей и увеличивают выживаемость животных. Облучение ВИД-ИК светом клеток МГ-22а в условиях in vitro снижает степень их прививаемости и скорость роста опухоли после перевивки мышам линии СЗНА.

2. ВИД-ИК излучение не влияет на жизнеспособность клеток МГ-22а и не приводит к изменению их пролиферативной активности. Не изменяются синтез и транслокация стрессорного белка теплового шока Hsp70 на поверхность клеток.

3. Облучение клеток МГ-22а ВИД-ИК светом приводит к увеличению их чувствительности к лизису NK-клетками интактных мышей СЗНА в условиях in vitro. Оно вызывает структурные изменения поверхности облученных клеток МГ-22а: снижается содержание гликопротеинов и кислых мукополисахаридов и увеличивается экспрессия ламинина-1 на поверхности клеток. Это увеличивает сродство клеток опухоли к NK-клеткам.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Характеристики низкоинтенсивного лазерного излучения, применяемого в медицине.

Лазерное излучение широко применяется в медицинской практике. Большинство лазеров, используемых в медицине, имеют высокую мощность излучения и обладают свойствами поляризации и когерентности. Лазеры этого типа используются, как правило, в хирургии. В низкоинтенсивной лазерной терапии, в физиотерапевтических целях, напротив, применяют некогерентные лазеры с очень низкой мощностью, что и обеспечивает безопасность их использования. К лазерам, используемым в качестве источников НИЛИ, можно отнести газовые лазеры, в первую очередь гелий-неоновый (Не-Ме-лазер), как наиболее распространенный, а также диодные лазеры, например галлий-алюминиевый (Ga-Al-лазер).

НИЛИ обладает способностью проникать через эпителий кожи. Глубина его проникновения зависит от длины волны света. Чем больше его длина волны, тем глубже лазерное излучение проникает через эпителий (Brahmavar, 2001).

В нашей работе мы приводим характеристики наиболее часто применяемых длин волн, используемых в фототерапии. Излучение гелий-неонового лазера красной видимой части спектра с длиной волны 632 нм имеет незначительную глубину проникновения через эпителий кожи. При мощности излучения в 3.5 мВт, наибольшая глубина его проникновения составляет 6-8 мм, в зависимости от типа облучаемой ткани. Фотоакцепторами для этого лазера служат митохондриальные цитохромы. He-Ne лазер применяется, как правило, при заживлении ран. Лазер на основе галлия, алюминия и мышьяка (Ga-Al-As-лазер) генерирующий излучение с длиной волны 780-890 нм имеет значительно большую глубину проникновения в ткани (до 35 мм) по сравнению с He-Ne-лазером и применяется как при заживлении ран, так и для местного обезболивания. Наибольшую глубину проникновения в ткани имеет галлий-мышьяковый лазер (Ga-As-лазер), применяемый при обезболивании (Brahmavar, 2001).

На основании литературных данных можно заключить, что лазерное излучение с длинами волн 400-650 нм способно проникать только через эпидермис и дерму (Kolari et al., 1993). Излучение с длинами волн от 650 до 1350 нм проникает в ткани значительно глубже (рис. 1). Глубина проникновения ИК излучения может достигать нескольких миллиметров (Brown et al., 2004; Esnouf et al., 2007).

Высокая биологическая активность лазерного излучения обусловлена, прежде всего, его поляризацией. Накопленные в литературе данные позволили предложить и научно обосновать новый, более щадящий вид светотерапии основанный на использовании поляризованного света, представляющего собой полихроматическое (разные длины волн, генерируемые одним источником) некогерентное излучение низкой интенсивности. Этими характеристиками в полной мере обладает аппарат Bioptron, генерирующий ВИД и ИК части спектра солнечного света (от 480 до 3400 �

Информация о работе

Князев, Николай Александрович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2013
ВАК 03.03.04

Диссертация

Влияние полихроматического видимого и инфракрасного излучения на рост опухолей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы