Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Естественная киллерная активность спленоцитов мышей линии СЗНА в ранние сроки после трансплантации клеток гепатомы 22А

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Естественная киллерная активность спленоцитов мышей линии СЗНА в ранние сроки после трансплантации клеток гепатомы 22А"

й У V : У

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ АКАДЕМИИ НАУК СССР

На прапах рукописи

ФИЛАТОВА Наталия Алексеевна

УДК 612.112.94.017.1:616—006

ЕСТЕСТВЕННАЯ КИЛЛЕРНАЯ АКТИВНОСТЬ СПЛЕНОЦИТОВ МЫШЕЙ ЛИНИИ СЗНА В РАННИЕ СРОКИ ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК ГЕПАТОМЫ 22А

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт- Петербург 19Э1

Работа выполнена в лаборатории цитологии опухолевого роста Института цитологии АН СССР.

Научные руководители: доктор биологических наук, прпфрггпр| В. Я. Фель: [кандидат биологических наук, старший научный сотрудник А. М. Малыгин.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. М. Михельсои, доктор медицинских наук П. Г. Назаров.

Ведущее учреждение: НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова МЗ СССР.

Защита состоится « » 1992 года в ¿Г час. на

заседании Специализированного совета Д.002.73.01 Института цитологии АН СССР по адресу: 194064, С.-Петербург, Тихорецкий проспект, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии АН СССР.

Автореферат разослан «

/О,

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Л. Н. Писарева

© — Институт цитологии АН СССР

- - _ _ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Одной из важнейших проблем современной иммунологии опухолей является взаимодействие организма и опухоли, растущей вопреки наличию противоопухолевой реакции. Представление о существовании шляпного надзора по отношению к опухолевым клоттсрм било сТор^лулировано Бернетом (1971), когда иммунология опухолей опиралась на утверждение о налички у всех или большинства опухолеЗ спе-цкфичесшгх, иммунологически чужеродных антигенов, вызывающих иммунный ответ организма. Поэтому особое внимание уделялось изучению специфического иммунного ответа, основными эффекторами которого признавались Т-лимфоциты. Эти взгляды претерпели в последнее время существенные изменения.■Господствующим стало представление о том, что большинство спонтанных опухолей человека и животных тлеет очень слабую иммуно-генность или она отсутствует вовсе (К1ауЗпп,1Э&Э). Исследования последних лет указывают на то, что возникновение "без-антпгенных" опухолей находится, по-видимому, под контролем системы естественной резистентности (ЕР) (Дейчмаа,1984; Фель,1287). При этом остаются неизвестными механизмы подавления опухолью системы ЕР и ее взаимодействие о системой специфического иммунитета. Для системы ЕР организма, в отличие от специфического противоопухолевого иммунитета, характерно кммунологическ'и неспецифическое распознавание опухолевых клеток, немедленная реакция против них, не требующая предварительной имгяунизации, отсутствие иммунологической памяти и способность к неспецифической активации. Эффекторами системы ЕР являются естественные киллеры (ЕК), мононуклеар-ные фагоциты и К-клетки. Среди эффекторов системы ЕР особое место занимают ЕК. ЕК - это большие гранулярные лимфоциты, обладаю'дие спонтанно проявляемой цитотоксичностыо против широкого спектра клеток-мишеней, не ограниченной по главному ; комплексу гистосовместимости. Клетками-мишенями для ЕК являются трансформированные и некоторые нормальные клетки син-генного, аллогенного и ксеногенного происхождения. Наиболь-

шую активность ЕК проявл/шт по-отношению к опухолевым клеткам. Есть'веские основания полагает., что именно ЕК осуществляют "первую линии" защити организма против различных чу- . I жеродних агентов и трансформировании* клеток. Учитывая чувствительность к действию ЕК не только шлпгннзироьаниих,' но и нормальных клеток, следует иметь ввиду возможность <Тунк-ционирования в организме элективных механизмов контроля ЕК активности (ЕКА) (НегЬеггаап, БагПол!,1584; Ломакин и др., 1935). Особый интерес представляет изучение функций ЕК на ранних этапах опухолевого роста, когда происходит столкновение ЕК с популяцией опухолевых клеток и решается вопрос о том, будут ли оти клетки уничтожены или дадут начало опухолевому узлу. Этот аспект проблемы на клшшчсском материале изучен недостаточно. Выяснению указанного вопроса могут на каш взгляд способствовать исследования особенностей функционирования и регуляции ЕК при развитии перевившие опухолей у животных.

Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, целью работы было изучение особенностей функционирования и регуляции ЕК, а также юлмуномодуляция их активности в ранние сроки после трансплантации клеток сингенной гепатомы 22а у мышей СЗНА. В соответствии с зтш задачами работы стало:

1. Изучение динамики ЕКА спленоцитов мышей СЗНА в ранние сроки после трансплантации клеток гепатог.щ 22а при использовании аллогешшх и ксеногешшх клеток-*шшвней;

2. Исследование влияния макрофагов на ЕКА спленоцитов. мышей СЗНА в ранние сроки после трансплантации клеток гепа-томы 22а;

3. Выяснение влияния различных сублопуляций Т-лимфоци-тов на ЕКА спленоцитов мышей СЗНА в ранние сроки после трансплантации клеток гепитомы 22а; . ,

4. Определение иммуиомодулирущего влияния двуспираль-ной НШ (дсРНК), тимогена и циклофос^аывда на ЕКА спленоцитов мышей СЗНА в условиях роста гепатомы 22а.

о

На;г^ноя_ новизна работы. Впррвич детально лослеиогопл дпнпмкка ПСА спленоцптов мше(1 С,ЗИЛ в течение .10 сут поело трансплантации им клеток сингешюй геиатогш при использовании гччество мишеней клеток К-562 и УАС-1. При ртом установлено, что происходят г.олнообраэш/о колебания ЕКА спленоцптов. Доказано, что ЕКА спленоцитов, оцениваемая в цитотоксической реакции кооперативный г^Тскт, в котором толитичеекпе потенции ЕК проявляются во взаимодействия с макрофагами и различными субпопуллциями Т-лвмфоцптов. Установлено, что по мере пролиферации опухолевых клеток в организме характер взаимодействия ЕК о макройагемп и Т-лш.'(£оци-таш постоянно меняется, что находит свое ичражение в характере динамики ЕКА спленоцитов милей. Впервые показано, что под влиянием введения мышам СЗНА тимогена происходит торможение роста перевивной гепатомц 22а, коррелирующее с увели-■ чением ЕКА спленоцитов.

Научно-практическое значение. Полученные' в настоящей работе данные о характере динамики ЕКА в ответ на транс- ' плантлруемыа опухолевые клетки открывают перспективы ее модуляции в необходимом направлении. Обнаруженные особенности влияния макрофагов и Т-лимфоцитов на ЕКА сплепоцитов следует учитывать при проведении противоопухолевой йдмунотерапии. Значение для практической иммунологии имеет также обоснование механизма действия тимогена, как препарата, оказывающего тормозящее действие на рост опухоли и лтивирумцее - на ЕКА спленоцитов.

Публикации и апробация результатов. Основные результата настоящей работы'изложены в 11 публикациях. Материалы диссертации были доложены на научных семинарах лаборатории цитологии опухолевого роста и Всесоюзном совещании "Клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза и антиканцерогенеза" (1988).

Апробация диссертации состоялась на совместном заседании научного семинара Лаборатории цитологии опухолевого роста и Лаборатории генетических механизмов малигниэацни и

диТференцировки клегок Института цитологии АН СССР (по месту работы) 25 июня 1991 г.

Объем работы..Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Общий объем диссертационной работы/У«? стр., включая /¿Г рисунков и 6 таблиц. Список .цитированной литературы включает публикаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опиты проводили на мышах-самцах линии СЗНА массой 18-20 г разводки питомника "Рапполово" АШ СССР.

Сингенную гепатому 22а трансплантировали животным под кожу спины ия расчета.2-10^ жизнеспособных клеток в 0.2 мл сгедц Игла на мыть. Контрольным мышам вводили среду Игла в, том не объеме.

Ежесуточно или через 2 сут в течение 10 сут после соответствующих инъекций забивали по 3-4 мтш в опыте и контроле, извлекали селезенки и готовили суспензию спленоцитов в среде Игла для каждого срока исследования в 2-4 сериях опытов. Суспензию спленоцитов, освобожденную от эритроцитов с помощью гипотонического шока, рассматривали как нефракцио-нированные спленоциты (Малыгин, Алреликова, 1982).

Спленоциты фракционировали инкубацией на пластиковых чашках Петри в течение 2 ч при 3?°С в атмосфере с Ъ% С0£. После инкубации полученные фракции прилипающих и неприлипа-ющих спленоцитов исследовали по реакции окрашивания на неспецифические встеразы, являющиеся маркерами макрофагов (ЫопеЬап ег а1., 19811 Гамалей И др., 1980).

Иммуносыворотку против гомогената головного мозга мышей СЗНА (АМС) получали по методу Голуба (Оо1иЬ, 1971). ". . Аналогичным образом получали иммуносыворотку против тимоци-тов мышей линии СЗНА (АТС). Полученные сыворотки истощали гомогенатами сингенпой печени, клетками сингениих вритроци-тов и костного мозга. Часть АМС дополнительно истощали син-генными тимоцитами. Полноту истощения проверяли в компле- '

ментзависимом цитотоксическом тесте. В работе также била использована моноспедафнческая иммуносыворотка против антигена Т-супрессоров мышей, предоставленная нам Н.А.Краскнной (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского).

Удаление Т-лимфоцитов с помощью иммуносцвороток проводили в комплементзависимом цитотоксическом тесте в среде Игла с 10 мГЛ HEPES и 0.1% бычьего сывороточного альбумина. Оценку цитотоксической реакции (количество убитых клеток) проводили при помощи окраски 0.2$ трипановым синим.

В работе были использованы культивируемые in vitro клеточные линии К-562 (эритробластоз человека) и УАС-1 (лимфома мышей A/Sn индуцированная вкусом лейкемии Моло-ни).

Для определения ЕКА спленоцитов использовали %-урцди-новый цитотоксический тест Хашимото и Судо (Hashimoto, Su-■ do, 1971) в модификации Рыковой и соавт. (1981). Клетки-мишени К-562 и УАС-1 метили %-уридином. При постановке цито-токсичес'кого теста использовали среду RPMI-1640 о 10$ эмбриональной телячьей сыворотки (Бел..НИШ,.Минск), 20 мМ HEPES, pH 7.3 (Signa, США), 80 мкг/мл гентамицина (Pharma-chira, НРБ), 5 мкг/мл РНКазы (Reanal, ВНР). Иммунологическую реакцию проводили в пластиковых 96-луночных крутлодонных планшетах. В каждую лунку вносили.по 0.1 мл суспензии спленоцитов. (0.2-10® или 1.0-10® клеток) и.0.1 мл суспензии меченых клеток К-562 или УАС-1 (10^. клеток), т.е. соотношение эффекторов и мишеней (Э:М) составляло 20:1 и 100:1. В контрольные пробы вносили спленоциты и 0.1 мл среды. Инкубацию проводили 18 ч при 37°С в атмосфере с 5% C0g. После инкубации содержимое лунок переносили на бумажные фильтры и промывали последовательно физиологическим раствором, 5% ТХУ; 96° этанолом и высушивали. Радиоактивность измеряли в сцин-тилляционном счетчике bS-8100 (Beckman, США). Уровень естественной киллерной активности оценивали с помощью цитоток- j сического индекса (1Ш), отражающего долю погибших клеток в 1 процентах:

lilt - m число ¡imriyjif coii_xi_ormto_ч , л./w

ци и число"iuinySbcoB в контроле' "

Процедура постановки теста конкурентного ингибироьания била аналогична процедуре постановки цитотсжоического теста, однако при атом к меченым ^Н-уредином клеткам-мишеням добавляли немеченые клетки-конкуренты в соотношениях 1:1, '¿•Л, 6:1 и 12:1.

Для определенна влиянии иммукоыодуляторов на ЕКА опле-ноцитод мышей подразделяли на 4 групп и. 1-ой гр. шшей им-' муномодулирущие агенты вводили внутрибрюшинно в 0.2 мл . среды Игла: дсРНК - по 50 мкг, тимоген - по 20 мкг и цикло-фосфамид - по Ь миг. Шшам 2-ой гр. вводили внутрибршгинно по 0.2 мл среды Игла (кот-роль 1). Мытам 8-й гр. через 1 сут после введения ишуномодуляторов трансплантировали под fiouy спины по 2-10° жизнеспособных клеток сингенной гепато-мн 22а в' 0.2 шг среды Игла. Мытам 4-й гр. через 1 сут после введения соответствующих иммуномодуляторов вместо гепатом-ных клеток вводили подкожно по 0.2 мл среды Игла (контроль 2). Еивотные перечисленных'групп были исследованы в 2-4 сериях опытов.

Статистическую значимость отличий вариационных радов оценивали с помощью t-критерия Стыадента. Статистический анализ был проведен на ЭВМ "Элыстроника-бО" и "CM-G" по программе "Диана". ДостоЕернцмц считали различия при Р<-0.05.

РЕЗУЛЬТАТ.!! .ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

. Проведенные наш исследования показали, что трансплан-г тация мышам СЗНА 2-10® клеток сингенной гепатомы 22а приводила в 100$ случаев к опухолевому росту. Опухолевый узел : обычно появлялся на 10 сут после введения гепатомных клеток.

При изучении динамики ЕКА нефракционированных сплено-цитов (ШЗ) мышей (рис. l.a.rt) удалось' показать, что ЕК не остаются безучастными к трансплантации опухоли. Независимо от условий постановки цитотоксического теста - применения аллогенных или ксеногешшх клеток-мишеней (КМ), а также от

K1Z545G789Í0 . К i Z i 5 6 7 8 3 JO

Fhc.I. Влияние трансплантации клеток гentro.™ 22а на ЕКА сгшеноцитов мышей СЗНЛ по отношению к клетсссм-шшеням К-562 (а) и УЛС-1 (б) при соотношении оффекторов и мшяеней 20:1 (1) и 100:1 (2); по оси ординат - по оси абсцисс

- время после прививки гепатомц 22а (сут), К - контроль. -

соотношения эффекторов и мишеней (Э:М), ЕКА спленоцитов мышей колебалась в первые 10 сут после трансплантации клеток гепатсмы. Общее в отих колебаниях - волнообразный характер • с достоверным падением ЕКА в 1-не сут после трансплантации опухолевых клеток. Возможно, ото падение было связало с прямым ипгибируюэдм аффектом большого инокулята опухолевых клеток на ЕК (Carzotti et al.,1987; lUieknla et nl.,19Üö). Sütc'.v следовало достоверно о повышение ЕКА на 2-ыэ сут в случае применения KM IÍ-C62, а при использовании КМ УЛС-1 несколько позднее .- на 5 сут (Э:!,Ь20:1) и 3-5 сут (3:М= 100:1). Эти налги данные хорошо согласуются с результатами других исследователей, получениям при развитии перевивных опухолей. ЕКА спленоцитов мышей увеличивалась на 3 сут после введения кшам клеток карциномы легкого Льюис (Budzyn-oki,1984), меланомы BIS (Ковальчук и др.,1986) л опухоли галочной железы СЕ14о0 (Pollaok,1909). На 2-ые сут после

а

инокуляции мышам л/J клеток нейробластомы С-1300 отмечалось 4-5 кратное увеличение ЕКА их спленоцитов (beclurcq et al., 1957). Бог.мо-.но, что наблюдаемое увеличение ЕКА било связа-. но с интер'Хсрон-зависимоЙ стимуляцией ЕК с учетом возможной ролг. (Те-нотипячески измененных клеток кок индукторов синтеза интерферона (Славина,1004). При птом следует иметь ввиду, что интерферон является "двоИстлэннш" модулятором в системе естественной резистентности. С одной стороны он активирует ЕК, а с другой, - монет оказывать протектквный эффект' на опухолевые клетки, которые являются потенциальными шае-нямл SIC (Vielull et al.,1981). По даннш других авторов ин-' тег/гГеооп при длительном контактировании с Ж способен угнетать iuc активность (Vose,Bonnard,1903I Хаитов, Маджвдои, 1934). Вслед за подъемом ЖА наблюдалось ее падение ¡гаже контрольного уровня, которое бало зарегистрировано при ио-пол-ьзоипнт K.I IC-5S2 на 4-5 сут. (Э:М-20:1) и на 5 сут (Э:М =100:1). При тестировании ЕКА против КМ УЛС-1 падет* е ее уровня било отмечено лишь на 6 сут при Э:М=20:1. Падение Й(Л, отмечаемое до появления опухолевых узлов, некоторые автор:.: предположительно относили за счет активности клеток- • сулросооров (Parhar, Ьа1а,19б5). Б дальнейшем уровень ЕКА пр:: использовании К.! К-552 не отличался от контроля.. При тестировании про'иш КГ.1 УЛС-1 ЕКА или не отличалась (Э:М~ 20:1), или превышала .контрольный уровень на 8 сут с последующим падением до контрольного уровня на 9-10.сут (Э:М~ 100:1). По даннш Ковальчука' и др. (1986) угнетение ЕКА и появление пальпируемой опухоли совпадало по времени. По даннш других авторов супрессия ЕКА наступала позднее.'под влиянием прогрессирующего роста опухоли (Leoiercq et al., 1S87; pollack et ai.,1909). Угнетение ЕКА некоторые авто- ' pa связывали о накоплением в селезенке опухоленооителя оу-преосорных клеток (Jonea et al., 1984).

Результаты опытов с конкурентным ингибированием при использовании в качестве мишеней и конкурентов клеток К. -562 и УАС-1 свидетельствует о наличии на них общих структур, характерных для малигнизированных клеток и являтацихся

с;

no мнению ряда авторов мишенями для ПК (Шпарнтс,БялшскпЯ, 1391). Одной из .причин разной чувствительности клеток К--562 и УАС-1 к действию ЕК может бить различны,"; уровень экспрессии укапанных структур на этих клзтках. Что г.аслот-ся эжекторов, участвующих в лизисо клеток-мшепел, то он может осуществляться как одной, так и различными субпопуляциями ек.

Центральное место в изучении особенностей функционирования ЕК при опухолевом росте зашила от проблема регуляции их активности на клеточном уровне. Известно, что при олухо-' левом росте способностью модулировать ЕКА обладают ярезде всего моноциты и макрофага, а такко Т-лшфоцитк, особенно Т-супрессоры (Elgert, Parrar, 1970; Porhar, bala, 1905; Johnson, Popo, 1986{ Younf; ot al., 19BG). Однако о том, как эти клетки влияют на ЕКА в ранние сроки после привязки опухоли, известно очень мало.

Влияние макрофагов на ЕКА спленоцптов мцуей в первые 10 сут после прививки опухоли было изучено с использованием 1С.! К-562 и УАС-1 при Э:М=20:1 и 100:1 (рте. 2,а,б). Удаление макрофагов или не влияло на ЕКА сплеяоцнтоз милей сразу после прививки опухоли при Э:М=20:1 (на 1-6 сут в случае применения Ш К-552 и 1-5 сут при использований КМ УАС-1), или приводило даже к снижению ЕКА при 3:1.1=100:1 (ка 1 сут, когда КМ были К-562 и на 1-5 сут при использовании 1С! УАС--1). Наблюдаемая супрессия возможно связана с отсутствие!.! синтезируемого макрофагами интерферона, который необходим на этом зтапе для активации ЕК (Славина, 1984). Эффект угнетения ЕКА после удаления макрофагов наблюдался лишь при Э:№=100:1, поскольку показано, что тип формируемых конъгага-тов эффектор-мишень зависит от их соотношения в цятотокси-ческой реакции. При низких Э:М - один эффектор взаимодействует с одной мишенью, а при высоких с несколькими, т.е. тлеет место явление рециклинга эффекторов, а этот процесс, как известно, активируется JKH (Henkart et al., 1985). Указанное влияние 'зависит от чистоты наделенной популяции

о

50

ко I ъо ' ¿0 ю

а

(1 I I > ■ I ■ ■ I

.. I. ,1 .. I_I_I I .1

К 56 789 ¿0 К I г 5 4 Я 6 7 8 9 ю

Рис.2. Влияние макрофагов на ЕКА спленоцитов мшей СЗНА по отношению к клеткам-мишеням К-562 (I а,б) и УАС-1 (П а,б).при соотношении вффекторов и мишеней 20:1 (а) и

100:1 (б), (-) - ЕКА нефракционировашшх спленоцитов;'

(----) _ ЕКА спленоцитов поело удаления макрофагов; по

оси ординат - ЦИ, по оси абсцисс - время после трансплантации гепатомы 22а (сут), К - контроль.

ЕК и чем чище популяция, тем эта зависимость внрааеннее (аагс1а-РвпаггиЪ1а, 1909). На 7-9 сут (КМ К-562) И 5-е, 9-е 4 (Ш УАС-1) удаление макрофагов приводило к повышению ЕКА снлеиэцитов, что являлось косвенным доказательством их су-пресспрующего влияния в период, предшествующий появлению опухолевых: узлов. Прямые доказательства сулрессирующого влияния макрофагов на ЕКА спленоцитов били получены в опытах по "восстановлению" состава оуспензии спленоцитов добавлением макрофагов к неприлипаю,цн.м спленоцитам, в составе которые содержатся ЕК. Опыт}/ были проведены прй использовании Ш.1 К-562 при 3:1.1=20:1. Результаты опытов показали, что макрофага обладали супрессорной активностью в отношении ЕКА ' спленоцитов мшей ¡¡а 8 сут после прививки опухоли. Полуленные нами данные подтверждаются данными других авторов об участии макрофагов в регуляции ЕКА спленоцитов мышей при развитии перевивных опухолей (Шпагс/Па et а1., 1ЭЮ). По нашим дашгш способность ЕК лизировагь опухолевые клетку подавляется макрофагами в сроки, предшествующие появлению .пальпируемой опухоли.

Из литературы известно, что кроме макрофагов иммуно-модулирующео действие на ЕК в процессе опухолевого роста оказывают Т-ЛГШЛфх)циты (ао1иЬ, 1901-; Lotгov¿, Зауагу,198б). • Влияние удаления различных субпопуляций Т-лимфоцитов на ЕКА ■ спленоцитов мышей было изучено в первые 10 сут после трано-плантацш! опухолевых клеток с интервалом в двое суток, используя КМ К-562 при Э:М-20:1 (табл.1). Т-лимфоциты удаляли. ' из суспензии спленоцитов, используя.для обработки одну из 3-х типов' иммуносывороток - антимозговую сыворотку (А'.К), ' антитго.юцитарную сыворотку (АТС) и антисупрессорную'сыворотку (АСС). Особенность результатов опытов с мышами-носителями гепатомных клеток состояла в неоднозначности действия . испытуемых анти-Т иммуносывороток на ЕКА спленоцитов, взятых для исследования в разные сроки после трансплантации опухолевых клеток. Эти данные убездают презде всего в том, ' что разнонаправленность действия анти-Т иммуносывороток на ЕКА спленоцитов, ровно как и их индифферентность, есть

Таблица I

Влияние на ЕКА фракционирование спленоцитоз мышей СЗНА анти-Т-имыуносывороткани

Срок после -трансплан- ЕКА спленоцитов а

тации гепа-томы 22а,- сут нейракциониро- Фоакционированных с помощью сызоооток

ванных АТС -АСС ' АЫС

0 (контроль) 25.4*1.4 (42) ' 35.4*2.8^(16) 32.2±2.3б(32) 26.5*1.7(30)

2 38.8-3.0В(16) II.I-5.0^'s(8) 19.9±3.7б,в(15) 31.5-3.7В(8)

4 I5.8-I.7B(I6) 25.6-2.9^,3(8)' 24.9±1.6б'в(12) 42.8±4.6°'В(8)

' 6 26.8-1.8(18) 4.5-2.2б'в(8)'. 5.0±2.5б,в(8) 8.9-2.8^'в(8)

8 22.6*2.2(29) 38.8*4.8^(12) 24.9-2.7в(14) 25.1-3.4(8)

10 18.4-2.9(14) 12.1^4.8В(8) 13.6-2.5В(8) . II.0±3.IB(8)

Примечание: а - в скобках указано количество животных; б - достоверно отличается от

ЕКА нефракционирозашшх спленоцитов для того ае срока исследования (р-=0.05); в - достоверно отличается от значения в контроле (р-^0.05).

следствие количественных или качественных изменений в селезенке состава субпопуллций Т-лимфоцитов, возникающих по ме-"ра пролиферации в чувствительном организме трансплантированных опухолевых клеток. Обращает на себя внимание очень большое сходство в действии АТС и АСС, свидетельствующее, очевидно, о том, что с их помощь» в цитотоксическом комплемент зависимом тесте из суспензии снленоцитов элиминируются по преимуществу Т-супрессоры, что отмечено и другими исследователями (Fujimoto et al., 1978> Краскина и др., 1987). Наличие последних- и их анти-ЕК эффективность выявлены с большим постоянством у контрольных мышей и у нишей на 4-е и 3-е сут после инокуляции опухолевых клеток (на 8-е сут лишь при использовании АТС). Указанные Т-супрессоры по всей вероятности'' не взаимодействуют непосредственно с ЕК. Такое допущение кажется нам правомерным в связи с результатами опытов, в которых фракционирование снленоцитов с помощью АСС и АТС приво- . дило не к подъему уровня ЕКА, а к его резкому падению, что имело место на 2-е и 6-е сут. Такие результаты могут быть ,связаны как мы полагаем с тем, что действие Т-супрессоров на ЕКА опосредовано действием на другие им ^некомпетентные клетки, к числу которых некоторые авторы относят естественные супрессорные клетки (Ilaokett et al*., 1986} Maier et al., ' 1986). AIJC отличается от АСС и АТС в своем действии на ЕКА •снленоцитов у контрольных животных и у мышей о привитыми опухолевыми клетками,, и ото отражает различия в ассортименте антител соответствующих антисывороток к антигенным маркерам, тех или иных субполуляций Т-лимфоцитов. Например, АМС способна выявлять антиген asialo-GMl, присущий ЕК мышей (Young et al.,' 1986; Кпза1, Okiunura, .1982). Этот антиген, однако, был выявлен и на некоторых Т-клетках (Parker et al.,1980). Обработка снленоцитов мышей в комллементзависиыом цитотокои-ческом тесте с помощью еще Одной полученной нами имцуносыво-ротки - АМС, истощенной сингенными тимоцитами (АДОнТ) приводила на 2-е оут после трансплантации клеток гепатомы к уменьшению ЕКА спленоцитов мышей в 5.5 раза, а на 4-е оут -

к ее повышению в 1.5 раза. По-видимому, возможны различил в уровне экспрессии антигенов (в том числе aninlo-G.'H) спле-ноцитами мышей в разные сроки после прививки опухоли. При изучении регуляции ЕКА спленоцитов в ранние cpotcn после прививки опухоли мы смогли показать, что ЕКА спленоцитов, оцениваемая в цитотоксической реакции in vitro, это кооперативный эффект, в котором цитотоксические потенции ЕК проявляются во взаимодействии с макрофагами и Т-клетками.

С учетом этих данных несомненный интерес вызывает анализ действия на ЕКА разного рода веществ, модулирующих им-мунореактивность и влияющих вместе с тем на рост у животных перевивных опухолей. В данной работе в качестве иммуномоду-ляторов были использованы индуктор интерферона - двуспираль-ная РНК (дсРНК) (Разворотнев, Сысоева, 1989; Полуэктова и др., 1989), которая подобно ее широко применяемому синтетическому аналогу поли И:Ц усиливает ЕКА (Haeoiry, Miller, 1987; Skinner et al., 19B7),■ циклофосфамид (ЦФ) - противоопухолевый препарат из группы алкилиругощих соединений, обладающий цитостатическим аффектом (Mantovani et al., 1978; Вя-дро и др., 1989) и иммуномодулирующий синтетический дипептид тимоген (Ш) - аналог тималина, антиканцерогенное действие которого проверено при развитии некоторых опухолей, индуцируемых у крыс (Беспалов и др., 1989).

Из результатов, представленных в таблице 2, видно, что трансплантация гепатомных клеток контрольны:.! мышам, которым за 1 сут до этого внутрибрюшинно вводили среду Игла, а также мышам, получившим'в указанный срок инъекцию дсРНК или Ш, приводила в 100% случаев к опухолевое росту, хотя у мышей, которым были введены иммуномодуляторы, его темпы оказались -существенно замедленными.-Так, введение дсРНК и Ш приводило на 10-е и 15-е сут к достоверному торможения опухолевого . роста на 63.6 и 45.1$ и на 77.7 и Ю.% соответственно. У мышей, получивших предварительно ЦФ, на 10-е сут после трансплантации гепатомных клеток опухолевых узлов не было . •обнаружено, а на 15-е сут они были зафиксированы только у ■2-х мышей из 5.

Таблица 2

Влияние дсРНК, тимогена и циклов оо^амща на рост гепатош 22а у мышей СЗНА

Вариант опыта Масса опухоли (мг) в разные сроки (оут)

пооле трансплантации*1

10 1э •

Среда Игла "ТЙГГ 24!з шТГб 123 .'а

(контроль I) (13/13) (5/5)

до РНК

Тимоген

111я;ло:{оо|)а1гид 0 - !;0.0 20. Ь^

(0/13) (2/5)

.Примечание: а - в скосках во всех алучинл указано общее ко личество животннх, который трансплантировали опухолевые клетки (знаменатель) и число животных, у которых развились опухопи (числитель), б - достоверно отлетаются от значения в контроле (р 0.05).

Дня определения вклада в вти изменения ЕК сначала рассматривали влияние используемых иммуномодуляторов на ЕКА спленоиптов у мышей в отсутствии опухолевого роста. Введение иммуномодуляторои влияло на величину массы селезенки и содержание в ней ядросодержащих клеток. Чтобы сдать о реальном вкладе селезенки как органа иммунной системы в обеспечении естественной противоопухолевой резистентности организма, значения ЕКА были соотнесены о количеством сплеиоци-тов в каждый срок исследования. Полученные величины была обозначены в качества литическпх единиц (ЛЕ). Было установлено, что инъекция мцшам ЦФ приводила к резкому падению ЕКА

57.5 17.6е (23/13)

35.2 10ЛЙ (3 2/12)

378.0 31.0'1 ('1/4) _

21,0.8 45.8°' (5/5)

ЕКА спленоцитов. По оси абсцисс - сроки введения ишуномодулятороз или среды Игла, сут, К-контролъ; по'оси ординат - ЕКА спленоцитов,- ЛЕ; а - введение иммуномодулято-ров;' б - введение иммуномодуляторов и трансплантация кдет.ок гепатомы. I -инъекция среды Игла (контроль I); 2 - инъекция среды-Игла и трансплантация клеток гепатомы (контроль 2); 3 -дсРНК(А) или дсРНК+гепатома (б); 4 - тииоген (а) или тимоген+гепа-тома (б); 5 - .циклофосфамид (а) или'циклофосфамид+гепатома (б).

через 1 сут и восстановление исходного уровня наблюдалось через 10 сут. Введение Ш приводило к резкому подъему ЕКА Ччерез 2 сут. Уровень ЕКА был выше контрольного на 11 сут после инъекции доРНК и Ш. На этой фоне происходил рост ге~ патомы,'который и eau по себе влиял на ЕКА спленоцитов, что было подробно описано выше. Динамика ЕКА спленоцитов под влиянием иммуномодуляторов и в их отсутствие оказалась по ходу роста гепатомы довольно сходной: сначала снижение уровня ЕКА, особенно выраженное при инъекции мышам Цф, а затем неуклонный подъем. При этом повышение ЕКА через' 7 сут.посла введения иммуномодуляторов было более интенсивным при использовании дсРНК и ТМ и менее интенсивным при использовании ЦФ по сравнению с мышами, которым лишь прививали опухоль. Однако через 11 сут ЕКА у кивотных-опухоленосителей разных групп практически сблизилась (132.4-140.5 ЛЕ),не отличаясь от ЕКА мышей, которш только прививали опухоль и вместе с тем значительно превышая ЕКА у безопухолевнх животных (103.5 ЛЕ) (рис.3).

ВЫВОДЫ

1. В ранние срони после трансплантации мышам линии -СЗНА клеток сингенпой гепатомы 22а; происходят волнообразные колебания естественной киллерной активности (ЕКА).их спленоцитов. А тленно: ЕКА в отношение ЕК-чувствительных клеток-мишеней К-562 и УАС-1 падает вслед за инокуляцией гепатомы, затем резко повышается, снова падает и к моменту • появления опухолевого узла как анатомического образования на 10-е сут практически не отличается от таковой у контрольных' мышей.

2. Удаление макрофагов ив суспензии спленоцитов мышей СЗНА приводило к изменению динамики ЕКА после трансплантации клеток гепатомы 22а. На'1-6 сут после введения опухолевых клеток макрофаги либо не влияют, либо усиливают ЕКА ' спленоцитов. На 7-9 сут макрофаги выступают как супрессорц ЕКА спленоцитов.

3. о1дш,шнан,:<л Т-суиреосоров с помощью анти-супрессор-noil и гжти-тшлоцитарной иммуносывороток приводила к увели-'ммни*) ЕКА спленоцитов на 4 и 8 сут и к уменьшению на 2 и 6 сут поело трансплантации нишам C3IIA клеток гепатомн 22а.

4. V иомощш ннти-аюзговой иммуносьпюротнп, отличач-щоКол по ассортименту антител от анти-супрессорной и анти--тимоцпторной иммуносывороток, из суспензии спленоцитов мышей СЗНА элиминируются супрессорн, активность которых особенно велика на 4-е сут«после прививки опухоли.

С. Обработка спленоцитов мышей СЗНА о помощью анти--мозгсвой иммуно'оыворотки, дополнительно истощенной синген-шии тимоцитами,'приводила на 2-е сут после трансплантации клеток гепатомы 22а п. уменьшении ETiA в 5.5 раза, а на 4-е сут к ее повышению в 1.5¡раза.

6. Е1СЛ спленоцитов мышей СЗНА. после трансплантации ■ клеток гепатомы 22а - кооперативный аффект, в котором цито-. токсические нотенцш ЕК проявляются в их взаимодействии с различными субпопуляциями Т-лимфоцитов, а такие с макрофагами. По ходу опухолевого роста характер таких взаимодействий постоянно меняется, что находит свое выражение в характере динамики ЕКА.

7. Введение дсГНК или тимогена за 1.сут до трансплантации мнгаам СЗНА клеток гепатомы 22а приводило к торможению опухолевого роста с одной стороны и к повышению ЕКА спленоцитов втих животных: с другой стороны. Введение циклофосфа-меда аналогичным образом, и также приводящее к тормокекию . роста гепатомы 22а, вызывало падение ЕКА спленоцитов. Полученные результаты указывают на различные механизмы контроля вя ростом опухоли в случае использования дсРНК и тимогена о одной стороны и циклофосфашда, с другой. '

Список работ, опубликованных' по теме диссертации:

1. Филатова H.A.; Малыгин A.M., Плескач В.А., Фель В.Я. Естественная киллерная активность спленоцитов мышей линии СЗНА в ранние сроки после трансплантации клеток гепатомы 22а // Экспер.онкология. 1987. T.9, Jü6. С.52-55.

2. Филатова H.A., Малыгин A.M., Плескач Б.А., Фель Б.Я. Регуляция естественной киллерной активности спленоцитов ш-

4 шей линии СЗНА в ранние сроки после трансплантации гепатомы 22а // Эксперкм.онкология. 1989. Т.11, J3 2. С.42-45.

3.-Филатова H.A., Мэлнгин A.M., Горшова Л.Б., 5-ель

B.Я. Влияние анти-Т-сывороток на естественную киллерну® активность спленоцитов мышей СЗНА в ранние сроки после трансплантации клеток гепатомы 22а // Цитология. 1989. Т. 31, Í310,

C.1221-1225.. .

4. Снлатова H.A., Малыгин A.M.', Горюнова 1Г.Б., £>зль

B.Я., Ханинсон В.Х. Иглмуномодуляция естественной киллерной активности спленоцитов мышей СЗНА в условиях роста гепатомы

' 22а"// Цитология. 1990. Т.32, №6. C.652-G58.

5. Малыгин A.M., Погодина О.Н., Рецысо A.A., Филатова H.A., Шалвхова О.В., Кутушев Ф.Х., Телъ В.Я. Динамика НК-ак--тнвности при различных физиологических состояниях и опухолевом росте // Тез. докл. 1У Всесоюз. съезца онкологов. JT., 1986. С.533.

6. Малыгин A.M., Погодина О.Н., Филатова H.A., Шалахова О.В., ¡Еель В.Я. Естественные киллеры и проблема иммунологической резистентности // Тез. докл. П Респ. конф. "Экологическая биофизика". Тбилиси, 1986. С.87.

7. Филатова H.A. Влияние макрофагов на активность естественных киллеров у мышей СЗНА на ранних стадиях после трансплантации гепатомы 22а // Тез. докл. конф. "Биология клетки". Тбилиси, 1987. С.552-554.

- 8. Фель В.Я., Малыгин A.M., Редъко A.A., Филатова H.A. ЕК-активность при опухолевом росте //Тез, докл. конф. "Актуальные проблемы иммукотерапир опухолей". Юрмала, 1988. .

C.115-116.

9. Погодина О.Н., Филатова H.A., Горюнова Л.Б., Малыгин A.M., <5ель В.Я. Естественная киллерная активность спленоцитов мышей СЗНА на ранних сроках химического канцерогенеза и после трансплантации опухолевых клеток // Тез. докл. Всесовзн. совет. 'ЧСлеточныо и молекз^лярные механизмы канцерогенеза и антиканцерогенеза". Л., 1988. С.1141.

10. Фель В.Я., Погодина О.Н., Филатова H.A. Взаимодействие иммунокомпетентпых клеток в осудествлении спленоцита-ми мышей СЗНА естественной киллерной активности п процессе опухолевого роста // Тез. докл. I Всесоюзн. съезда иммунологов. Сочи, 1989. С.133.

11. Филатова H.A. Регуляция естественной киллерной ак- ■ тивности спленоцитов мышей СЗНА в процессе опухолевого роста // Тез. докл. Всесоюзн. школа "Колекулярно-клеточные ме-. ханизмы иммунной регуляции гомеостцза и проблемы математического моделирования". Красноярск, 1990. С.30-32.

I

I

Подписало к чечита 17.12.Э1, РТП. Тип. ВИР. Зак.- 904 '. Тир. 100. Формат бумаги 60x84 I/I6. _Бесплатно.