Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование количественных закономерностей распределения эндогенносвязанных биогенных микроэлементов в хроматине и его компонентах

ВАК РФ 03.00.17, Цитология

Автореферат диссертации по теме "Исследование количественных закономерностей распределения эндогенносвязанных биогенных микроэлементов в хроматине и его компонентах"



ИНСТИТУТ ФИЗИКИ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ГРУЗИЯ

На правах рукописи

ГЕЛАШЫ1ЛИ МКДЕЯ Л1ГГИМ030ВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЗНДОГЕННОСВЯЗАННЫХ БИОГЕННЫХ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ В ХРОМАТИНЕ И ЕГО КОМПОНЕНТАХ

03.00.17.- Биофизика

А в т о р е ф е р а т Диссерпиши па соискание ученой степени кандидата фцоико - математических паук

Т01Ш1С11-1995

г

Работа выполнена в институте физики АН Республики Грузия

Научные руководители:

доктор физико-математических паук Л. М. Мосулиштиш кандидат биологических наук А. И. Белокобыльский

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Дж. Р. Монаселмдзе кандидат биологических наук М. К. Абуладзе

Защита диссертации состоится в

ч. на заседании научно-аттесташюнного совета ръм 01.02 с т-з института физики АН Республики Грузия, г. Тбилиси, 380077, ул. Тамарашвили 6.

С диссертацией можно ознакомить« в библиотеке института физики АН Республики Грузия.

Автореферат разослан и^гу^Си 1995г.

Ученый секретарь специализированного совета ф

доктор фпз.-мат. наук ^-/¡у Г.И. Сурамлишвили

1 в

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность теми. Подавляющее большинство исследований, проводимых ршюё; посвященных изучению метаболизма микроэлементов в норме и при опухолевых заболеваниях в эксперименте и клинике били выполнены на органном, тканевом, клеточном и органолытом (ядра, ядрышка, митохондрии, цитоплазма, мембраны) уровнях. В этих работах били обнаружены, как, и следовало ожидать, значительные различия в метаболизме как макро- так и микроэлементов на всех уровнях. Значительно меньше исследований посвящено изучению роли некоторых из микроэлементов в нормальных клетках и еще меньше при неоплазме на молекулярном и субмолекулярном уровнях. Актуальность настоящей работ» состоит в том, что наши исследования посвящены сравнительному изучению широкого спектра микроэлементов при нормальном и злокачественном росте на молекулярном и субмолекулярном уровнях. В частности наш было изучено распределение гп, ге, сг, эе, со, нь в хроматине, гистонах, негистоношх белках (нме, ьив, кислые белки), ДНК, полученных из карциносаркомы я-256, асцитной гепатомы 22а и селбзенки различных линий мышей, инфицированных лейкозом Раушора, а также из адекватных нормальных тканей в динамики роста опухолей. Проведение этих исследований стало возможным благодаря использованию высокочувствительного метода инструментального

нейтронно-актинашгоррого анализа, позволяющего определять названные и другие элементы в миллиграммовых навесках исследуемых биообразцов.

Для более углубленного понимания механизма участия в частности гп и ке, которые проявляют наиболее яркие изменения нами были проведены исследования влияния этих элементов на хроматин методом кругового дихроизма.

1 Г)

Цель работы. Целью настоящей работы являлось получение аналитических препаратов Д1Ж, хроматина, гистонов, различных фракций негистоновых белков и изучение содержания микроэлементов на органном (тканевом), еубмолекулярном молекулярном уровнях в динамике роста ряда экспериментальных опухолей. Основными задачами были: - Изучение содержания ге, 2п, сг, Бе, со, № в тканях (кровь, селезенка, печень, мышцы, кость) мышей линии вахь/с в динамике развития лейкоза Раушера; - Изучение содержания перечисленных элементов в аналогичных органах и тканях здоровых мышей той же линии в качестве контроля; - Сравнительное изучение содержания элементов ге, т, сг, эе, со, кь в хроматине, выделенном из селезенки и печени нормальных и пораженных вирусом лейкоза Раушера мышей линии ва1ь/с; - Изучение микроэлементного состава хроматина и его оежових. компонентов (ДНК, гистопы, нмв-Оелки, ьив-Оежн, кислые белки), выделенных из злокачественных клеток при асцитной гепатоме 22а и в динамике роста карциносаркомы и-256 по сравнению с нормой; - Изучение влияния 2п и ге на спектры кругового дихроизма реконструированного хроматина, компоненты которого били выделены из клеток асцитной гепатомы 22а и нормальной печени мышей линии СЗНА.

Научная новизна и практическая значимость работы. Настоящая" "^забота является комплексным исследованием по установлению поведения ряда микроэлементов в живом организме в норме и патологии. В результате проведенной экспериментальной работы определено содержание гп, ге, сг, Бе, со и иь в органах, тканях, субмолекулярних и молекулярных структурах как в норме, так и при экспериментальных злокачественных опухолях таких как карщшосаркома н-256, асцитная гепатома 22а, лейкоз Раушера. В частности впервые было показано, что нарушение микроэлементного обмена происходит у жпвотных-опухоленоеителей на всех уровнях не только в самих опухолях по сравнению с адекватной нормой, но и в отдаленных органах больных животных.

го

Впервые изучена кинетика изменения содержания zn, Fe, сг и se в хроматине и негистоновых белках хроматина печени и опухолевой ткани белых беспородных крыс в процессе роста кар-циносаркомы w-256 и хроматшкз селезенки зараженных вирусом лейкоза Раушера лилейных мышей Ва1ь/с.

Исследопаны спектры кругового дихроизма реконструированного хроматина из нормальной почини мышей линии C3ÎÎA и клеток асцитной генатомы 22а. Показана разница в положительной элиптичности этих спектров, а также обнаружено увеличение положительной элиптичности спектров кругового дихроизма при добавлении ионов пинка.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на: Научных конференциях молодых ученых (Тбилиси 1986), Пятом Всесоюзном

совещании но активашюнному анализу и другим радиоаналитическим методам (Ташкент, 1987), Первом Всесоюзном совещании "Биофизика рака" (Черноголовка, 1987), Научной сессии, посвященной 70-летию Октябрьской социалистической революции (Тбилиси, 1987), Всесоюзной школе по активационному анализу и другим радиоаналитичееким методам (Юрмала, 1989), Всесоюзном симпозиуме "Химия белков" (Тбилиси, 1990), одинадцатой Всесоюзной конференции "Микроалемонты в биологии п их применение в сельском хозяйство и медицине (Самарканд, 1000)

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения^ трёх глав, заключении и выводов, содержит 96 страниц, в том числе Й4 рисунка и 9 таблиц, а также список литературы из 154 наименований.

краткой СОД1'Л%\ПИ1;: РАБОТЫ.

Первая глава посвящена обзору современного состояния проблемы металл-хроматин, метолл-хроматиновые белки. Приведены работы, в которых в целом анализируется роль

м

микроэлементов в биологических процессах, стимулировании и нормализации обмена веществ, активировании и угнетении ферментативных процессов в организме, функционировании гормонов, витаминов и т.д. Однако до сих пор остается открытым вопрос: что именно происходит в клетке при попадании в нее иона металла, с чем конкретно связывается тот или иной ион с ДНК или с белками, и каким образом это влияет киноведение клетки в целом. Наиболее интересным в этом плане становится исследование комплексов ДНК-металл-белок, как наиболее близкую к природной структуру. В обзоре описаны также наиболее яркие работы, посвященные структуре и функции хроматина, приведены принятые на сегодняшний день ступени иерархии организации и упаковки хроматина, показана роль ионов металлов в этом процессе. Затем дан обзор работ, посвященных негистоновнм белкам хроматина - наиболее качественно и количественно гетерогенной фракции. Входящие в эту фракцию белки являются наиболее реальными претендентами на роль специфических регуляторов экспрессии генома. Более подробно описана группа белков с высокой подвижностью -нью-белков. В последней части обзора литературы приведены работы, где исследовалась роль металлов в процессе канцерогенеза.

Во второй главе приводятся перечень используемых в работе экспериментальных животных и описание экспериментальных опухолей. Даются биохимические методики выделения хроматина, ДНК, гистонов и негистоновых белков, а также фракционирование последных на группу нмс-белков, ьмс-белков и кислых белков. Это разделение схематически изображено на рис.I.

Затем приведены физические методы анализа применяемые для определения микроэлементного состава полученных образцов. В эксперименте использовался в основном нейтронно-активашонный анализ для определения содержания ке, хп, эе, сг, со, иь. Параллельно использовался атомно-абсорбционный метод для определения Си, Ыа, Мд, Са, к.

ЕЕ

Оба метода требуют особую обработку и подготовку образцов для измерения, полностью исключающую загрязнения или потерю исследуемых элементов. Эти процедуры также приведены во второй главе. Далее в ней коротко описан метод кругового дихроизма, который используется для анализа комплексов реконструированного хроматина.

В третьей главе представлены экспериментальные результаты исследования микроэлементного состава тканей (печень, селезенка, кровь, кость, мышечная ткань) мышей линии ва1ь/с в норме и в динамике развития эритробластоза Раушера. На фоне изменения микроэлементного состава организма в целом и в различных его тканях, изучено изменение микроэлементного состава в ДНК и хроматине, выделенном из печени больных животных и ¡IX селезенки, резкое увеличение которой является показателем прогрессирующего развития лейкоза.

Как известно, если для мышей линии ва!ь/с лейкоз Раушера развивается у 100% животных и приводит к летальному исходу, то мыши линии С57в1ас полностью резистентны к вирусу, тогда как мыши линии сва заболевают лейкозом, но через определенное время у них наступает спонтанная регрессия. В связи с этим был сделан анализ изменения содержания zn и cu в сыворотке крови в прцессе лейкоза для всех трех линий. Для линий сва и Baib/с был сделан сравнительный анализ изменения са, мд, си и zn в хроматине селезенки.

Следующим объектом исследований сила асиитная гепатома 22а мышей линии езнл, имеющая хороший контроль в виде печени здоровых животных . Пил сделан сравнительный мнкроэлементннй анализ хроматина, кислых белков, hmg и lmg белков, гистонов и ДНК. Определено содержание Fe, zn, cr, Rb, со и se. Гистограмма на рис. 2 показывает разницу содержания zn и Fe в норме и патологии, а также распределение этих элементов по составляющим компонентам хроматина. Показано, что этими элементами наиболее обогащена фракция кислых белков. Наличие большого количества дикарбоновых и серусодержащих аминокислот, очевидно, является одной изпричин того, что

аз

большая часть zn и Fe приходится на эту белковую компоненту хроматина.

Еще одним объектом исследования служила карцоноеаркома w-256, контролем для которой условно была выбрана печень здоровых животных. Изучено изменение содержания Fe, zn, сг и se для составляющих компонентов хроматина. Показано, что резкое увеличение концентрации zn в хроматине и фракции кислых белков приходится на 15-19 день после перевивки опухоли, т.е. на период наиболее быстрого ее развития, что частично, возможно связанно с увеличением активности ДНК- и РНК-полимераз, которые являются zn-содержащими ферментами.

Как показал нейтронно-активационный анализ, самый высокий уровень содержания в хроматине у Fe, затем идет zn. В попытке изучить роль этих элементов в хроматине был использован метод кругового дихроизма, который является очено чувствительным методом для регистрации изменения конформации биологических молекул. Исследовались спектры КД реконструированного хроматина, компоненты которого были выделены из асцитных клеток гепатомы 22а и печени здоровых мышей линии СЗНА (рис.3,4).

При сравнении спектров КД положительная элиптичность в районе 275 нм асцитных комплексов была выше элиптичности нормальных. По всей вероятности, это говорит о том, что структура этих комплексов более рыхлая, в ней больше участков свободной ДНК, что, возможно, связано с более высокой транскрипционной и репликативной активностью. При добавлении ионов zn и Fe в процессе реконструкции хроматина в соотношении I ион на 1000 и на 100 оснований ДНК заметное увеличение положительной элиптичночти происходило при добавлении I иона zn на 100 оснований. По всей вероятности, ионы Zn конкурируют с белками за места связывания с ДНК, в результате чего сравнительно большая часть ДНК осталась свободной от взаимодействия с белками.

ЕЧ

Рис. 1 С X К М А РАЗДЕЛЕНИЯ ХРОМАТИНА НА СОСТАВ II И Е КОМПОНЕНТЫ

800

80

§

Я60'

о. ч>

о

<о X

с40

N

С *

£

20'

а норма а асиит

3

г о ь и

г

ас 2

.гИ, гА.

Рис.2 Содержание ге и т в хроматине и его компонентах, выделенных из печени здоровых мышей линии сзна и клеток асцитной гепатомы 22а.

6.0

о *

сп О) "V

-2.0

рис. 3 Спектр КД комплекса, реконструированного из ДНК, гистонов I негистоновых белков, выделенных из нориальных клеток печени •---реконструирован <5сэ металлов

о---в присутствии ¿п а концентрации 1 иои иа 100 оснований

о---в присутствии 7п в концентрации 1 ион па 1000 оснований

0---а присутствии Ге в концентрации 1 ион на 100 оснований

а---в присутствии и концентрации 1 иои на 1000 оснований

ае

6.0

о

Б

"и *

Е

0

к-

№

<и О

п

1

О <

4.0 ■ ,

2.0 -

-2.0

.1

0.0 -] ! I I ||/| III | ! I I I I II I I I П I I I II I I I I 1 П I 1

245 II 260 275 290 35

Н

Х(пт)

рис. 4 Спектр КД комплекса, реконструированного из ДНК, гистонов и негистоковых белков, выделенных иа асцитных клеток

* -

о -а -

0 — & —

реконструирован без иетадлон

в присутствии ¿п в концентрации 1 ион иа 100 оснований

в присутствии ¿п и концентрации I ион на 1000 оснований

- в присутствии Ке в концентрации 1 ион на 100 оснований

в присутствии гс в концентрации 1 ион на 1000 оснований

Заключение.

Т.о., данная работа была посвящена определению эндогенных, биотических концентраций макро- и микроэлементов на различных уровнях организации организма in vivo. Изучены их количественные закономерности распределения в хроматине и его компонентах в динамике нормального и злокачественного роста на фоне изменения содержания на органном и организменном уровнях, позволяющие утверждать, что злокачественный рост приводит к значительным нарушениям элементного обмена на всех уровнях организации во всем организме животных-опухоленосителей. Сделана попытка об§яснить механизм их участия в процессах организации хроматина с помощью метода КД.

Результаты этих исследований могут оказаться полезными при дальнейшем изучении молекулярных механизмов участия ионов металлов в процессах нормального и злокачественного роста, а также в разработке диагностических тестов злокачественных новообразований и состояния организма в ходе лечения.

Выводы.

1. Изучено содержание Fe, zn, se и сг в хроматине, HMG-белках, LMG-Селках, кислых белках в печени здоровых крыс, а также в опухолевой ткани и печени крыс-опухоленосителей в динамике роста карциносаркош w-256.

2. Изучено распределение Fe, zn, cr, ль, со и se в хроматине и его компонентах в печени споровых мышей СЗНЛ и клетках аецитной гепатомы 22а. Уровни содержания перечисленных элементов по порядку совпадают с концентрациями соответствующих элементов в препаратах, полученных в случае карциносаркомы w-256, и аналогично, фракции, выделенные из опухолевых клеток гепатомы 22а значительно обогащены zn по сравнению с контролем.

3. Установлено, что уровень концентрации различных микроэлементов в хроматине и его компонентах значительно различается. Самый высокий уровень содержания характерен для

еэ

• •

ге, концентрация которого изменяется от десятков до сотен микрограммов. Концентрация гп колеблется в пределах десятков микрограммов, концентрация иь, яе и сг - в пределах нескольких микрограммов, а остальных - в пределах десятых и сотых долей микрограмма. Больше всего те и хп обнаруживается во фракции кислых белков, значительно меньше их содержится в остальных белковых фракциях и ДНК. При этом во фракциях, выделенных из опухолевой ткани содержание 2п значительно выше по сравнению с нормой.

4. Показано, что у различных линий мышей (вагь/с, сва, С57в1ас) характеризующихся различной чувствительностью к вирусу лейкоза Раушира происходит изменение мшсрозлементного обмена и динамике злокачечтнешюго роста на органном, тканевом, субмолекулярном и молекулярном уровнях. При этом наблюдаются изменения обмена микроэлементов не только в органах непосредственно пораженных злокачественным ростом, но и в так называемых отдаленных органах больных животных. Микроэлементные сдвиги, вызванные злокачественным ростом, обнаруживаются также в хроматине выделенном из опухолевой ткани.

5. Исследованы спектры КД реконструированного хроматина, фракции которого были выделены из клеток асцитной гепатомн 22а и печени здоровых мышей езнл. Показано, что положительная элиптичность спектра КД реконструированного асцитного хроматина выше но сравнению с нормой. По-видимому, это свидетельствует о том, что комплекс, реконструированный из компонентов асцитных клеток образует менее жесткую структуру. При реконструировании хроматина в присутствию! ионов гп в соотношении I ион металла на 100 оснований происходит увеличение положительной элиптичкости, что возможно, говорит об увеличении числа участков ДНК, свободных от взаимодействия с белками.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 работ. Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

ЬЭ.Л.Андроникашвили, А.И.Белокобыльский, Л.М. Мосу-лишвили Н.И.Шония, М.А.Гелашвили. Железо, цинк, хром и селен в

аз

хроматине и некоторых фракциях негистоноьыл белков в норме и при злокачественном росте. - ДАН СССР, 1987, т.295, к 6, с. 1484-1486.

2. Шония Н.И., Белокобыльский А.И., Мосулишвили Л.М., Гелашвили М.А., Харабадзе Н.Е. Содержание селена в органах и хроматине здоровых и опухолевых крае. - Тезисы докладов v Всесоюзного совещания по активацнонному анализу и другим радаоаналитическим методам Ташкент, 1987, с.354.

3. Шония Н.И., Мосулишвили Л.М., Белокобыльский А.И., Гинтури Э.Н., Гелашвили М.А. - Нейтрошю-активационное определение селена в органах и хроматине линейных мышей Baib/c в норме и динамике развития эритробластоза Раушера. -Тезисы докладов v Всесоюзного совещания по активационному анализу и другим радиоаналитичееким методам, Ташкент, 1987, с.355.

4 Гелашвили М.А., Мосулишвили Л.М., Белокобыльский А.И Шония Н.И., Харабадзе Н.Е. Определение содержания цинка, железа хрома и селена в негистоновых белках хроматина М11АА. -Тезисы докладов v Всесоюзного совещания по активационному анализу и другим радиоаналитическим методам, Ташкент, 1987, с. 358.

5. Н.И.Шония, М.А.Гелашвили, А.И.Белокобыльский, Л.М.Мосулишвили. Разработка и примените инструментального нейтронно-активационного анализа определения злементного состава негистоновых белков хроматина здоровых и опухолевых тканей. Материалы i Всесоюзного рабочего совещания "Биофизика рака", Черноголовка, 1987.

6. Л.М.Мосулишвили, А.И.Белокобыльский, М.А.Гелашвили, Н.И.Шония, Э.И.Гинтури, . А.Н.Рчеулишвшш. Микро- и макроэлементы при лейкозе Раушера. Материалы i Всесоюзного рабочего совещания "Биофизика рака", Черноголовка, 1987.

7. E.l.Andronikashvili, L.M.Mosulishvili, N.I.Shonia, M. A. Gelashvili. Fe, ZN, Rb, Se, Co and Hg in chromatin and nonyistone proteins in the norm and at the malignant growth. Proceedings 3-rd International Conference of Bioinorganic Chemistry, Noordwijkerhowt, Motherland, 1987.

8. Мосулишвили Jl.M., Гелашвили M.A., Белокобыльский А. И. Шония Н.И. Закономерности распределения эндогенно

за

связанных Fe, zn, se, со, Rb и Hg в белках хроматина и ДНК. Материалы Всесоюзного симпозиума "Химия белков", Тбилиси 1990.

9. А.И.Белокобыльский, Л. М. Мосулишвшш, Н.И.Шония, М.Л.Гелашвили. Микроэлементы в хроматине и его компонентах в норме и при экспериментальных опухолях. Тезисы xi Всесоюзной конференции "Микроэлементы в биологии и их применение в сельском хозяйстве и медицине", Самарканд, 1990.

10. A.I.Belokobilsky, N.I.Shonia, М.A.Gelashvili. Microelements in chromatin and its components in norm and in cells of ascitic hepatoma 22a. International symposium on applied bioinorganic chemistry, Wuhan, China, 1990.

•jg-ibo

30j30mJ 65 . 6"<-Ч-1л 50 _ moj>.ibo 8 . 30x40 1/4

19/У1-1995 F-

i).)J.ir^fnoQtx-ib ЭдуБо^Лдй^т^ goSojob

;iH0077. onioqobo, оплЗл*>о'Эзл(у>Ь J. 6