Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез производных колхцина, структура и биологическая активность

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Синтез производных колхцина, структура и биологическая активность"

РГ6 од

национальная академия наук республики казахстан

1 1\ ¡¡ЮН 1Щ?титут молекулярной биологии и биохимии

им. м.а.аитхошна

На правах рукописи

УДК 581,19; 581.192: 581.143.6

ТОЙБАЕВА КАРЛЫГАШ АМИРОВНА

синтез производных колхицина, структура и биологическая должность

03.00.04 - Бнохданя

Автореферат

дкссвртацаи па соискание учено*! степега Ю»ДЕ1Яа?а- СГ*0ЛС1ГГГ<5СКт НЗуЯ

Алшггн. 1903

Работа выполнена в лаборатории растительного генома Института молекулярной биологии й биохимии им. М.А.Айтхокина Национальной Академии Наук Республики Казахстан

Научный руководитель: Доктор биологических наук Н.А.Айтхонина

Официальные оппоненты:

Доктор химически наук, профессор

К.Д. Пралиев

Доктор биологических наук, профессор 8.С. Сеитов

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии РАН

в час. на заседании Специализированного совета К 008.22.01 По ващитй диссертаций на соискание ученой степайи кандидата биологических наук при Институте молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхокивв HAH PK по йдресу: 430012, г. Амати, ул. Мичурина, 86.

О диссертацией. Можно ознакомиться б библиотеке HAH PK (г, Алматы, ул.Шевченко, 28).

Защита состоится »

Автореферат

Автореферат разослан _1993

¡88.. . _ В---^ Н.С.

Н.С.ПОЛИМБЕТОВА

Актуальность проблею. Ряд соединений избирательно или, но крайней, мере, преимущественно подавляют то или иное звено метаболизма макромолекул в клетке, в результате которого можно остановить процесс и изучить отдельные компоненты во взаимодействии с другими. К этим соединениям относятся антибиотики, токсины, гетероциклические соединения различной природы, среди которых алкалоиды представляют значительный интерес как биологически активные вещества с высокой сг тективност^л действия на метаболизм у высших.

Научение молекулярных мэхениамов да ¿ta теня алкалоидов выявило ¡a как ингибиторы отдельных стадий синтеза белка и нуклеиновых кислот (нарциклазин, нарцеин, гомохаррингтонин, эметин и др.). Алкалоида из семейства Amaryl 11<1лсеае (нарциклззин, линорин, гемантамин) пнгибяруют образование пептидной связи [Yazques D., 19Т"; KuWiano-7а et al..1984]. Особое внимание было удалено группе алкалоидов, являющихся антимитотическими агентами. К им относятся винкрястт и винбластин из Vinca, колхицин и его природные аналоги из Colchicum autumnale. В присутствии колхицина нэ образуется веретено деления и поэтому S-хромосош делящихся клеток не расходятся. Хромосомы, однако, продолжают конденсироваться, мэтафазныо d-xpo-мосош после обработки колхицином бывают короче и толще нормальна!, lia срезах v jkoo расположение хромосом напоминает фигуру митоза и получило название колхзщиновой метафазы или К-метафазы [Албертс и др.,1987; Cosa,1974; Salœon et al.,1984]. В растениеводстве этот эффект испо^зуется в получении полиплоидных клеток (Hasheral et al.,1989; Hassawl et al.,1991]. Механизм такого действия связан с ингиСиров8нием процесса образования микротрубочек в результате связывания алкалоида с суоъедишщэми белка тубулина и нарушением полимеризации микротубул [Албертс и др.1987; Olnsted et al.. 1973; Zweiß et al.,1973; Dustiri, 1984, Fernando, 1991]. В этом заключается молекулярный механизм действия колхицина, а следствие - нару-иение пролиферации клеток и антимитотичоскоо действие - лекит в основе химиотерапии опухолей. Колхицин и ого производные могут быть использованы в ингибиторлом анализе для изучения состояния хроматина при делении клеток, амплификации генов синтеза белков активного обратного транспорта алкалоида и возникновения лекарственной устойчивости, митотических хромосом, в медицинской генетике и клинической диагностике хромосомных аномалий. Однако, использова нлэ колхадина для этих целой ограничено ого высокой токсичностью.

Для решения этой, проблемы ранее рядом исследователей были получены различные химические модифицированные производные колхицина, главным образом при замене метоксигрупп А кольца и C-IQ мэтоксигрупп С кольца. К сожалении, в большинстве случаев изменение химической структуры соединения приводило к снижению оиологической активности, а в некоторых случаи. - к полной потере tcapraro et al. J984]. Крайне ограничены данные о биологических свойствах производных. Повтому получение новых производных колхицина, изучение их свойств являются актуальными и составляют вахный этап для решения научно-практических задач.

Цель работы. Целью настоящей работы является направленная кодификация колхицина для снижения токсичности с сохранением биоло гической активности и молекулярных механизмов действия, изучение взаимосвязи структуры и функции для последующего использования их в ингиоиторном анализе, регуляции експрессии еукариотического. генома а решении практических, задач химиотерапии опухоли.

Научная новизна . в настоящей работе разработаны ноше спо-сооы модификации колхицина путем введения в структуру С-10 мет-оксигрупш с кольца алкалоида остатков различных аминокислот и пептидов (химическая модификация) и увеличения аффинности к рецепторам опухолевых клеток за счет сшивки с белком трансферрином (способ получения конъюгатов). Впервые синтезированы аминокислотные и дипептидаые производные колхицина, методами УФ- и ПМР-спек-тров и электрофореза установлена их химическая структура. Показа-что в ходе реакции не нарушается исходная структура алкалои-. да. Сохраняются все боковые функциональные группы, которые имеют Важное значение для проявления биологических свойств. Приоритетным результатом работы является проведение широкого анализа биоло гической активности в системе In vitro и In vivo обоих типов соединений, выявление некоторых закономерностей - структура : активность.

Определение биологической активности синтезированных соединений выявило ряд производных с высокой биологической активностью при значительном снижении токсичности. Изучение молекулярных основ их действия показало высокую тубулинсвязыващую активность. Показана зависимость биологической активности производных от природа и длины аминокислотного остатка, способа сшивки, от степени чувствительности - резистентности опухолевых клеток к действию

препаратов.

Установлена возможность повышения избирательности действия колхицина иа опухолевые клетки в результата синтеза белкового конъюгата.

Практическая зиочтаость работы заключается в получении ряда новых химических производных колхицина с высокой биологической активностью, низкой токсичностью, которые рекомендованы для использования в качестве ингибиторов с цзлью решиния широкого круга вопросов, связанных с делением клетсш, состояния хроматипа при митозе, мембранной рецепции лекарственных препаратов и молоку лярных механизмов лекарственной устойчивости.

Белковые конъюпатн, полученные активацией Н-ацетильного производного алкалоида , по токсичности In vivo на два порядка таги исходного колхицина, с высоким процентом подавления некоторых видов экспериментально перевиваемой опухоли рекомендованы как эффективные противоопухолевые препараты пролонгированного действия.

Разработанные в настоящей работе подходы и згсслеримептальшэ приемы могут быть использованы в исследованиях с друпми биолога-чески активными гетероциклическими соединениями.

Апробация работа. Представленные в диссертации результаты докладавал-jb на IX. советско-индийском «шпозиуме по химии природных соединений (Рига, 198У); на международной конференции по химии и биотехнологии биологически активных соединений ( Варна, 1989); на коррекции "Прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1992г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем работа. Диссертация изложена на страт цах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и выводов. Работа содержит 7 таблиц, 21 рисунок и список цитируемой литературы, включающий 200 наименований.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований были клетки мышшой миолога/. Hela и СНО из 1Ш0 "Вектор". г.Кольцово, Новосибирск.

В работе использовали [^Hl-колхицин (5 Кю/ммоль, АшегзЬаш), [^Ш-тимидин (64 Кю/ммоль, СССР), колхицин (Merck), трис, фосфат натрия» ЭДТА. MgCL,, трзнс^еррян и NaHC03 колхамин (деацетилиро-вашюе производное колхицина), набор аминокислот из фирмы Si^ma.

Колххщидклглицин получали конденсацией колхкшгаа с глицином в

этанола в присутствии 10 U раствора КаОН при нагревании в те чеша 5 часов. Продукт реакции экстрагировали хлороформом.

Офиры С-Ю кмоицидалтднодлашнокислот. Этиловые и метиловые афиры аминокислот получали соответственно в абсолютном этаноло и метаноле в присутствии тионилхлорида [Гривштейн и др.1965]

а) выделение тубулина из ыозга крупного рогатого скота. Тубулин выделяли по модифицированному методу Вайзенберга и Шелан-ского. описанному в Ш111атз R.C. аи1 lee J.C. 1982] из мозга крупного рогатого скота. Гомогенизацию проводили в 10 мМ На-фэсфат пом буфере рН. 7.8. содержащем 0,24 М сахарозу и 0,5 гсМ HgCl3. Тубу лин алшровали с ДЗАЭ целлюлозы промыванием двумя объемами фосфат-лого буфера, содержащем 0,8 М КС1.

гомогенность тубулина проверялась SDS-электрофореаом по Laemll 119701. Концентрацию белка определяли по Брэдфорду [19761.

б) связывание колхнцяаа и ого аналогов с тубулинсодаряащши Свлкаьа. Связывание колхицина и его аналогов с тубулином и тубулинсодерисащими белками определяли по методике tZ^elg et al, 19731. Результата опытов приведены в процентах связывания колхицина с туоулином (контроль), для аналогов - в процентах относительно контроля.

Определение цитотокскчкости производных колхицина проводили по уровню включения СаЦ]-тимидина в ДНК в культура краток САдамс, 19831. Результаты приведены в виде % ингибирования включения [*%] ' тимидина. за 100% принимали включение метки в ДНК в Культуре клеток без добавления испытуемых соединений,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ .

Известно, что C-IO метоксигруппа алкалоида наиболее реакционно способный участок молекулы алкалоида, что создает дополнитель пне возможности для получения новых производных колхицина. Согласно данным twildman,1960; Повпег at al..1980; Capraro,l984j Dumont et al., 1987] C-IQ нвтоксигруппз легко вменяется ña аммиак, ытя амины, диалкиламини и элкйлмеркаптаны, удаление или замена остаяь-пых боковых функциональных груш! приводит к снижению или к полной потере способности связывания й тубулином.

Для химической реакций колхицина с аминокислотными остатками и белками предварительно синтезировали рЯД химических модифациро-ваййых производив ixyTefe ИуКЛэофильноГо зймещеПия его С-Ю метокси

б

1Н0 (СНо ЬСОО

ннсосн

яке осн.

"й(СН2)пСООН

ннсссн,

:=/ о

о

сск

3 II - колхицидилглицин (п=1) II а) - колхицидил-^-аланин (я=2) б) - колхицидил-2-вцинокапро-ыовая кислота (п=4)

ЯКН^СОНЩНС ^ 0Й

ш н

н -

1. -С1уОЕ1; 5. ЧаиОЕ*

2. -ЬеиОМе 6. -УаЮЕг

3. -TyгOEt -ТгрОЫе

4. -1ЬеиОЕг 8. -РЬеОШе

дипептидше производные колхиаян»

ШСОСН-,

НИИ

а

(Р)АеШСНСОО'

IV.н -н Аминоколхицид V. к -сг^с^ш^ - Ашшоэтил-

-ннсссн..

—/ ^ о

аминоколхицид

С?)АсКН|НС0ННСН2СН2

VI. .ч- Ацилашгаокислотннв ппоиззодныз колхзщнкз

Рис. I Схаиа синтеза производных колхицина

(?)АсААСО

1.Р-С1уСО-

2.?-ЬеиСО-3-?-ТгзСО-Д.Р-ЕЬеСО-

б.?-МегРЬеСО-7„Ас-С1уСО-8»Ао-ТгрСО-9.Ас-Р1аеСО-10.Ас-А1вСО-11 .Ас-^аХСО-

группа на аминогруппу глицина и атилендаамина (рис, I, соединения II и V). С целью ышсцьшя влияния природы аминокислотных остатков, связанных с колхицином, и способа их связывания били синтезированы два класса соединений: I. дипептидные производные колхицина -путем конденсации колхицидилглицина со свободной аминогруппой метиловых или этиловых эфиров глицина а др. (рис. £, соединение типа III); 2. N-замещенше аминокислотные производные - путем образования амидной связи мевду аминогруппой N.р-амшоэтиламиноколхяцида и кар боксильной группой N-ацилировашшх глицина и др. (рис. I, соединение типа VI). :

1. СИНТЕЗ ПРОИЗВОДНЫХ КОЛХИЦИНА

I. I. Comea С-Ю ашнопрокаводных колхицина.

C-I0 аминопроиаводные колхицина получали путем нуклеофильво-го замещения С-Ю матоксигруцш на аммиак, аминогруппы глицина, р-алаяина, £-аминокапроповой кислоты, втилендиамина по приведенной схеме (рис.1). Были получены следукщие соединения: II - колггцкдял глицин, а) -колхицидил-р-аланин, 0) -колхицидал-е-аминокапроновая кислота, ГУ -аминоколхицид, V -N,Р-аминовтиламиноколхицид.

Реакцию нуклеофшьиого замещения проводили в втаноле с IQ-крат ним, относительно колхицина, избытком яуклэофильного компонента, в присутствии Ю-1фатного избытка гидроокиси натрия в смеси.

Колхицидилглицин и колхицидал-0-аланш очищали кзбирательной экстракцией хлороформом из водной фазы при нейтральном аначении рЯ после предварительного удаления колхицина при рН 7.0. После выпаривания растворителя и растирания сухим вффом полученные вещества имели светло-желтую «фаску, аморфную консистенцию, были хроматографически чистыми и отличались от исходных компонентов реакционной смеси по значению ni в двух системах рзстшрителей. Очистку колхицидил-е-оминокапроновой кислоты проводили ионообменной хроматографией на колонке с Dowex 1x4 (Н$. Избыток колхицина удаляли 10 %-ннм водным раствором етанола. Продукт реакции елшровали 0,2 М раствором бикарбоната аммония в БОТ-ном водном раствора этанола. ílocuie удаления растворителя получили аморфное вещество светло-желтой окраска. Получешше аминоколхицид и к,р-ами ноэтилашшоколхкцид очищали адсорбционной хроматографией на окиси алшйнйя и силикагеле, соогвеФсгввЙйо. В обоих случаях колхицин влшройалй Зслороформом, продукт!! реакции - в ступенчатом градиенте коИЦептраЦйй в^айола 1-30% в хлороформе. Структуру полученных

соединений подтверждали данными тонкослойной хроматографии, олзк-трофореза, УФ- и ПМР-спектров. Соединения, содержащие свободную карбоксильную группу (бЬколхицидил-е-аминокапроновая кислота), на хроматограмме в системе растворителей "В"(хлороформ:уксус.к-та:во-да) имели низкие значения ILf. около 0,01. Высокие значения Ri сох-храпяли в системе растворителей "Л" (Б.УБ-4:1:1 ) колищидил-е-емгаю-капроновая 1сислота-0,80, колхицидол-р-алашш-0,68 и Н.р-аминоэтпл аминоколхицид-0,43. Г^лхицин им с л высокие значения ïli в обоих системах растворителей - 0.66 и 0,8.

В УФ-области спектра для колхицина характерно поглощение с двумя максимумами при 248 и 352 нм, замена C-IQ мэтоксигруппы на амино- или алкиламиногруппу проявляется смещением максимума поглощения при 352 ш в сторону длигашх волн и появлением плеча при 370 нм и нового максимума при 408 нм (рис.2). УФ-спектрм всех полученных аминопроизводпих колхицина одинаковы и не зависят от природа алкильяого радикала у атома азота. Зги спектры соответствуют спектрам некоторых ранее полученных аминопроизводных колхицина.

44 40 36 32 28 ^ 1000 х си

Рис. 2. УФ-спектры колхищша (.1.). амино--и ашюгаслотного .производного колхицина (2),д1шептидаого производного колхицина (3)

Отличие УФ-спектроп амгаюпроизводошх -колхицина от спектров самого алкалоида. по-видимому, связано с заменой С-10 метоксигруп-пы на аминогруппу. Это лфодполоаеше .подтверждается также чувствительностью спектров гмгаопроиоводпых -колхицина к .рН исследуемого ¡раствора, что связано с иошшм состоянием аминогруппы -у С-Ю тро-•полонового кольцо гинсалоуда., 'которые обусловлена 'оснотюй II тидро-

7. л л Д1 к!!! Цэтр я::

И ШР-спвктрах для колхицина особо характерны пять синглетных сигналов при 2,12-2,16; 3,71-3,75| 4,02; 4,044 и 4,12 ы.д., которые относятся к ацетильной и четырем мвтоксигруппам алкалоида. У колхицидоглицина отсутствует сигнал при 4,12 м.д., обусловленный С-10 метоксигруппой алкалоида. Дополнительно к этим сигналам^ спектрах колхицидоглицина наблюдается синглетный сигнал при 4,18 м.д., обусловленный, по-видимому, метиленовой группой остатка глицина, связанного с колхицином (рис. За). Проявление втого сигнала при 4,18 м.д., возможно связано с тем, что метиленовая груша расположена меиду двумя влоктронакцепторными группами - карбоксильной и аминогруппой, сопряженной с С-Кольцом алкалоида. В ПМР-спектрах

м.д.

а)

б)

>-'------<—i-

6 4 3 2 6 «-Д-

Рис. 3. ПМР-спектры колхяцидилглщина (а) и Н, р--аминовтил-анилоколхицида (б)

Н.р-аминоэтиламиноколхицида отсутствует сигнал 4,18 м.д. Углеводородный радикал остатка втилецциамина проявляется в области 3,13.4 м.д. в виде мультиплотяого сигнала. ПМР-спектры остальных аминопроизводных колхицина незначительно отличались от спектров Н.р-аминоэтиламиноколхицида (рис. 3 6)

Таким образом, соединения, получопные в результате взаимодействия алкалоида с глицином. (З-алашшом, е-аиипокапроновой кислотой, этиле иди амином, являются соответствующий аминопроизводпнми колхицина, которые образуются при нуклеофильном замещении С-10 мат зксигруппы алкалоида. При этом остальные участки молекулы колхицина не подвергаются изменениям и основное ядро алкалоида не нарушается. Соединения II. На и Пб (рис. I) имеют в структуре свободную карбоксильную группу, а в соединении IV и 7 содержится свободная аминогруппа. Установлено, что С-10 аминогруппа у этих производим: обладает слабоосновными свойствами к в кислой среда переходит м ионную форму и не вступает а химическую реакций как пуклеофдлъниЛ агент

I. 2. Синтез дипептидных производных колхицина.

Целью дальнейших эксперименте? было получение дипептидных производных колхицина на основе синтезированных нами производных колхицина, содержащих в своей структуре свободную карбоксильную группу. Дипептлдаые производапдз колхицина й основном синтезировали конденсацией колхицидалглиципа с зфирами различных аминокислот.Для изучения ели.-шя природа аминокислотного остатка па биологические свойства алкалоида били выбраны эфиры следующих аминокислот: этиловые эфиры глицина, лейцина, изолейципа, валина, тироз1ша, триптофана. метиловые эфиры лейцина, фешцаланкна. триптофана, а танго дивтиловый эфир глутаминовой кислоты (рис. I).

Конденсации карбоксильной группы аминопроизводных колхицина с аминогруппой эфира аминокислоты проводили методом смотанных ангидридов с использоваткм изобутилхлорформиата для активирования карбоксильной группы. Из-за плохой растворю,гости офиров амипокпс-лот в хлороформе необходимо было подобрать подходящий растворитель для проведения реакции. Нами установлено, что наиболплиЯ выход иоб людаотся при проведении реакции в смеси хлороформа с тетрагидрофу-раном. Ход реакции контролировали тонкослойной хроматографией, а продукты реакции разделяли подкостной хроматографией па колонке с окисью плгмннип. Но пступиилий в решению КОЛХИЦИН УДПЛЛЛИ из колен

хси хлороформом, а продукты реакции елшровали в ступенчатом градиенте концентрации втанола в хлороформе в соотношении хлорофоры-эта нол от 9:1 до 7:3.

Идентификация дидептидных производных колхицина, проведенная в тонком слое силикагеля, показала, что полученные соединения отличаются от исходных компонентов реакционной смеси большее хрома тографической подвижностью в двух системах растворителей. Так ЙГ в системе "А" и "В" соответственно для Со1С1уС1уОЕг - 0,68 и 0,33; Со1С1у7а10Ые - 0,72 и 0,40; Со1С1у1Ьеи0Е1; - 0,68 и 0,37; Со1С1уТуг 0Е1; - 0,71 и 0,34; СоШуРИеОМе - 0,73 и 0,43; СоШуТгрОНе.- 0,69 и 0,43; СоШуИиОИ - 0.Т4 и 0,57.

УФ-спекгры дипептидаых производных, так ко как УФ-спектры колхицидилглицина и других аминопроизводшх колхицина, имеют три максимума поглощения при 264, 354 и 408 нм (рис. 2). Отсутствие заметного изменения в спектрах колхицидилглицина после конденсации с аОДами аминокислот свидетельствует о сохранении основного ядра алкалоида й структуре синтезированных соединений. В УФ-спектрах вфиров колхшдадилглицилтриптофана мокно заметить вклад остатка триптофана, который проявляется появлением плеча при 280 нм.

В ШР-спектрах дапептидннх производных колхицина присутствуют все основные сигналы, характерные для колхицидилглицина .Три мето-ксигрупш, а такке ацетильная группа остатка колхицина в ШР-спектрах втох соединений проявляются в виде синглетных сигналов при 3,71, 3,99 , 4,03 и 2,11 м.д., соответственно (табл. I), так

Таблица I

НИР-СПЕКТР (ы.Д.) КОЛХИЦИНА И ЕГО ДШТЕПТЩШЫХ ПРОИЗВОДНЫХ.

К при с10 СОМе ОМе ОЫе ОМе ароматам. СН3СЕ,0- СН3СН20 ОМе

сбсьз С-1 С-2 С-3 протоны слокноэфирные группы

колхицин 2,16с 3,'ГЬо 4.02С 4,04с 6,50- - -

2.16с 3,710 4.02С 4,04с -7,58 - -

-С1у0Е1; 2.09с 3,75с 4,02С 4.04Й 6,50-7,58

-С1у01у0Е1 2,16с 3,756 4.02С 4.03С 6,50-7,58 1,36т 4,22К

-Ь-ЬеиОМе 2.10С 3,75с 4.02С 4.03С 6,48-7,56 3,61

-Ь-ТугОЕг 2,09с 3,72с 4,00о 4.04С 6,49-7,65 1,42т 4.21к

-Ь-ТгрОЫа 2,11с 3,76с 3,99с 4,03с 6,50-7,58 3,40

Т2

ED. как и в спектрах колхицвдилглицина и другая аминопроиз-водпнх колхицина. Дополнительно к а тем сигналам.в спектрах метиловых вфиров дипептидных производных нолхицина наблюдается синг-летный сигнал эфирной матоксигрушш при 3,61 и 3,81 м.д.

Таким образом, данные тонкослойной хроматографии, УФ- и ШР-спектров полученных соединений позволяют подтвердить, что эти соединения действительно являются эфирами дипептидных производных колхицина. В ходе реакции не нарушается исходная структура алкалоида, сохраняются все боковые функциональные группы,которые имеет важное значение для полного проявления биологических свойств.

2. Взаимодействие колхицина а его производных с тубулином.

Известно, что в основе молекулярного механизма действия кол ■хицина лежит аффинное связывание его с тубулином, что приводит к нарушению полимеризации тубулина в микратрубочки и деления клеток. Поэтому определение аффинной специфичности к тубулину производных колхицина является необходимым этапом в исследовании биологических свойств этих соединений. Для этой цели т использовали тубулин, выделенный из мозга крупного рогатого скота и тубулинсодеркащие белки из клеток Hela и СНО. выделенные по модифицированному методу Вайзенберга л Шеланского. Препарат соответствовал по данннын SDS-алектрофореза белку с с молекулярной массой 69 Кд, характерному молекулярной массе тубулина. Важное значение при изучения связывания колхицина с тубулином представляет сохранение димерной структуры последнего. Выделенный препарат сохранял способность к полимеризации в микротубулы, о чем свидетельствует слабая опалесценция раствора при инкубации при 37° в присутствии 0.06 м ГТФ. Функциональную активность тубулина проверяли по С^П-колхицинсвязывавдей способности. Аффинную специфичность нолхицииа и его производных изучали по связыванию с тубулином По методу [Zv?elg,1973].

Как следует из приведенных в таблице 2 результатов, препарат проявляет достаточную активность для изучения аффинной специфичное •ти производных колхицина - 91%. Видно также, что увеличение длины углеводородной Цепй у С-Ю заместителя снижает степень связывания аминокислотных производных колхицина с тубулином на 15-203. Наблюдаемая дифференциация по аффинной специфичности является, по-видимому, следствием природной особенности аминокислотного остатка. Дипептияныо производные колхицина обладалают примерно одинаковой

Таблица 2

Цах'отоьсичиоогь и ту^улинсвязывашая активность С-10 производных колхищдш на клетках мышиной миеломы

Соединешгв 1 R » 1 1 H%J ! 1 ! ! Связывание с ! тубулином, %

I. Колхицин ОСНд 1,8 XI0~B 91%

о Аминоколхицид Шо 0,9 хЮ~т 85%

3„ КсшЕцадш^глирш HHGHgCoca 0,6 ж10~7 аг%

4. Колхицидил-р-аланин NlíCEjCHgCOOH 0,58x10 74%

5. Колхицидал-е-амино

капроновая кислота Щ(Сйо)^С00Н 2,3 xI0~5 61%

6. Н,0-аШШОЭТЕЛ8Ш£ВО- SHO^CHgNHg г,г xiб 68%

кодшщдд.

аффинной специфичностью и их уровень связывания доходит до 50% относительно колхицина, и также зависит от природы аминокислотного остатка. Такие близкие значения показывают, что природа аминокислотного остатка не оказывает существенного влияния на механизм дей ствия производных, однако понижает степень связывания с тубулином Незначительный разброс, по-видимому, связан с пространственными особенностями аминокислот. Такое предположение подтверждается тем, что уровень связывания этиловых зефиров колхицидилглицилглицина и колхицидилглицилвалина были наибольшими, так как глицин и валин имеют меньше радикалы. Несмотря на значительное увеличение длины и объема радикалов у тршгтофановых производных колхицина их связывание с тубулином по сравнению с фешлаланиновыми производными на IOS выше. Значительное снижение тубулинсвязывающей активности наблюдалось у производных колхицина, модифицированных аминокислотами с полярными иди зарякэнныш к группами (тирозиновые и глутаминовые производные).

Данные по взаимодействию производных колхицина по колхицин-связывапцему центру белка были получены в опытах по конкурентноспособности аминокислотных и дипептидних производных колхицина связываться с тубулином в присутствии в инкубационной среде £3Ш-колхицша. Связывание [^Ш-колхицина с тубулином проводили при про должительной инкубзщш его вместо с производными,, а такта после

1Л

предварительной инкубации производных с тубулином. Проявление зткми соединениями хотя бы слабой конкурентноспособности свидетель ствовало бы о сохранении в структура синтезированных соединений основного ядра алкалоида для связывания -зо специфическими участками на тубу лине. Из рис.4 видно, что присутствие в .чнкубационной среде аналогов колхицина снижает уровень связывания (%]-колхицина с тубулином и равновесие устанавливается в течение 15„э часов. Присут ствие соМХуШуст в инкубационной смеси о самого начала реакции снихает уровень связывания [3Ш-колхицша с тубулином на 35-50$- и равновесие устанавливается в течение 3-3,6 часов (рис.- 4 кривая 2). Дальнейшая инкубация не приводит к увеличению уровня связывания [3Ш-колхицина, добавление намеченного колхицина в инкубационную смесь не приводит к диссоциации комплекса, что свидетельствует о необратимости связывания аналогов колхицина с тубулином. Более того при предварительной инкубация.тубулина о Со101у01у0й в течение часа снижается уровень связывания (^Ш-колхицина на 43-60 %, увеличение времени предварительной инкубации приводит к уменьшению равновесного значения связанного.Л]-колхицина о тубулином. (рис.4 кривая 3). На основании этих данных мокно предположить. Что конкуренция за место связывания лигвндов с тубуйшом Действительно имее'р место и в основном происходит на начальной стадии ёзаимодей-стшя до образования стабильного комплекса.

I 2 3 4 чао. 7

Рис.4. Связывание С3Н1-колхиЦина с тубулином в присуто-в инкубационной смеси колхицина (I), СоШуСПуОЕГ (2), ь также посла прэдвзрительной инкубации СоЮ1у01у0Ег в течет»/» I час (3), ?. час (4). 3 час (5).

ГЗ

Однако, более шзкап степень связывания производных колхицина, по-видимому, связана с что длина и объем 0-Ю заместителя действа только замедляют процесс первичного связывания алкалоида с активным центром из-за пространственных затруднений. Синтезированные наш производше сохраняют исходный механизм действия и могут быть использованы для тех же целей, что и колхищш.

В литературе имеются данные о разной чувствительности к действию алкалоидов (колхицин, колхамин пинбластш. шнкристин) клеток Hela и ОНО. Последние отлетаются высокой резистентностью, что что МОГ.ЭТ быть связано с избирательностью действия на уровне молекулярного взаимодействия с тубулином. Наш показано, что удель нов связывание колищдна и его производных с тубулинсодержаднми белками в обоих типах клеток находится на одам уровне. По всей вероятности, резистентность клеток ОТО не зависит от степени связываний с тубулином.

3. Биологическая активность ашнокксяотшх к дипептвдшх производных колхицина.

Изучение связывания производных колхицина с тубулином не дает полного сведения об их биологической активности, так как последняя может быть результатом не только молекулярного взаимодействия и ингибирования деления клеток, но и действия других факторов. Биологическую активность производных колхицина определяли на культуре клеток мышиной миеломы. Hela и СНО в среде DMEM (Signa) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка по их способности-ивгпбнровать включение [%]-тимидина в ДНК (Вилсон и др. 1989]. Концентрацию соединений при которых происходило ингибирование пключения Аьтимидина в ДНК по общепринятой методике принимали за показатель цитотокскчности И050. Токсичность препаратов определяли 1л vivo (IiDgg). Из всех синтезированных производных наибольшей цитотоксичностью обладали аминоколхицид, колхвдидалглицин, колхицидил-р-аланин, Hflgg которых составляло 0,9 xlО-7, 0,6 хЮ-7, 0,58 хЮ"6 соответственно, резкое снижение цитотоксичности наблюдалось у К.р-амшоэтшимшюколтада и колхихицидил-е-аминокапро-повой кислоты (табл. 2). Из таблицы видно, что существует обратная зависимость мекду цитотоксичностью, длиной С-Ю заместителя к тубулинсвязываицей активностью. Результаты, приведенные на рис. Ь, свидетельствуют о том, что дипептидано производные колхицин?) с

к

Рис. 5. Цитотоксичвость колхицина (1) и его дипептидных производимх кшшщидалгжцина (2), ColGlvTrpOM» (3), ColGlvLeuOMe (4). ColGlyGlyOEt (5) И ColGlvPheOkfe (6) На культуре клеток Щ-шноа míe ломы Х53Л8-653 (a). Hela (б) и СТО (в).

. .л^аовой активностью шгябировали синтез ДИК в клетках мшшной шеломы и Hela, Однако для клеток CHQ для такого не эффекта потребовалось в 10-Ш раз более высокая концентрация этих соединений. Цитотоксичность дипептидных и й-ацилированных аминокислотных производных зависела от природы аминокислотного остатка, спиртовой компоненты, образующей слозкноэффную грушу с пептидным остатком, и от способа связывания алкалоида с аминокислотой. Наибольшей активностью обладали метиловые вфкры колхицидилглицилтриптофана (Й%0-0,8 х Ю"7М) и колЕвдидалглициллейцина 0,26 х 10""%). йзопропиловый вфир колхЕВДИлглицялтрит-офапа (ИДео- 0,8 х Ю"5М) оказался на порядок менее активным, чем мзтиловый и этиловый вфяры того ке соединения (ИД^-О.Э х ГО-7 и 1,1 х 10-7М, соответственно. Н-ацилированные аминокислотные производные колхицина s кзсмоа-ря на достаточную аффинность (25-40«) етюс соединений, оказались менее активными, чем вфиры дапептидных производных колхицина. Значение И®50 для этих соединений были выше I х Ю~6М. Ранее для других производных колхицина были получены данные о прямой зависимости цитотоксичности и аффинного связывания химических производных ж его природаых аналогов (Brossi et al., 1S83; Dumont et al,19861. Для дапептидных производных колхицина такой зависимости не наблюдалось. Несмотря на большую аффинную специфичность ColGlyGlyOEt и ColGlyValOEt по сравнению с другими производными значения ИД50 этих соединений были на порядок выше ColGlyTrpOMe и ColGlyLeuOtóe. Природа слокновфирной спиртовой группы не влияет на их аффинное связывание (28,32 и 30%, соответственно), хотя по цитотоксичности метиловые и этиловый вфиры были на порядок более активными, чем изопрошловый эфир.По-видимому, такая разница е цитотоксическом действии связана с какими-то дополнительными факторами, обусловленными структурной особенностью последних. Важно отметить, что эти препараты характеризуются токсичностью ln rlvo на 1,5 порядка ниже основного соединения.

Таким образом, разработанные нами способы модификации колхици на и изучение физико-химических и биологических свойств его аминокислотных г дапептидных производных показали, что введение остатков различных аминокислот и пептидов в структуру алкалоида лозволя ет значительно снизить его токсичность. Это позволяет использовать колхицидалглицин, колхицидал-р-аланин и колхицидил-глицилтриптофан в научных целях. На их основе были синтезированы

коиъвгаты, обеспечивающие направлений транспорт колхицина в опухолевые ¡слетки.

4. Синтез белковых кокьигатов производных кояхаэдшмп

биологические свойства.

Использование белков, обладающих способностью специфического взаимодействия о определенными нвдами опухолевых клеток, позволяет целенаправленно доставлять лекарственные препараты в эти клетки, что приводит к повышению избирательности их действия. Таким белком является трансфэррин, количество рецепторов к которому в аекоторнх видах опухолевых клеток в I04 рааа выше, чем в нормальных -ISuthrland, 1981; Schindelisan et al.,1981].

Для конъюгации производных колхицина о трансферршом исполь-.зовэли соединения, содеркадаэ свободную карбоксильную группу: нол-хицидалглнщш, колхицидил-р-вланин, колхицидил-е-аминокапроновая кислота и двацетилированшй аналог алкалоида по С-? полоаешш Й кольца. Одним из лучших лигандов для связывания колхицина с белком явился колхшщцил-р-аланин и деацетильное производное по С-? участку. УФ-спектр ксньюгатов после гель-фыьтрации на колонке с Toyopearl выявил идентачяость с 0-1Q аминопроизводаыми в интервале от 300 до 450 вы, что указывает на" отсутствие нарушений в основном ядра алкалоида и максимум поглощения ири 230 ш свидвтелЬсгует ö койблентном связывании алкалоида d öejiKdM. Действие коаьюгата изу-

Рис, 6 Транспорт колхицина а Нонгюгата колхицидйл-р-алашшп

о траысферршюМ в клегкй На1й, обрпйотаншэ (я) и па обработанные to) трансферрином. г

далось на клетках fíela, не обработанных и предварительно обработанных 'фансфэррянс-л. Последние приняты как "нормальные клет на",т.к. рецепторы в них заранее блокировались белком и содержание их уменьшалось до уровня нормальных клеток. Из рас. 6 видно, что транспорт конъюгата колхицидал-р-аланкна с трансферркном в "нормальные клетки" значительно уменьшается (кривая а - конъюгат) по сравнению с клетками, но обработанным!! трансфэрршю:.: (кривая б -конъюгат), указывая на транспорт производного колхицша в клетки через рецепторы трансферрша. Такой механизм транспорта конъюгата придает ему избирательность действия на опухолевые клетки с шсо-кт содержанием рецепторов транс^арриаа в клетках и тем саьшм повышает вффектианасть действия данного соединения. Наиболее активным был конъюгат на основе деацэтшшрованного производного по с-7 полосеншо В кольца.. Нйзкая цктстоксйчность данного препарата (G,u3üsJO~w) дала возможность использовать его для определения процента тордакення роста опухоли асцитной карциномы яичников крыс.

Полученные наш данные показали, что белковые конъюгата в суммарных дозах 160 и 900 мг/кг не вызывают гибели иивотных. В то ко время доза двацеишсолхидана 16 мг/кг при трехкратном введении приводила к табели всех ¡штатных на 4-Б день, что подтверждает

Таблица 3

Торможение роста опухоли яичника крыс при воздействии производных колхицина

доза" суммарная размера торм-ие продоНЧ'Ь Соединение шУкг доза опухоли роста Д шзш'

мг/кг млн.клет. сутки

контроль колхицин 0,3 1.8 17G9 52 97,1 9.4 6,8

конъюгат колхицина 1,5 9,0 485 73, 11,6

де аце тшпсолхицин I 6 569 67.8 8,4

15 45 гибель кивотных 4,7

ко1Гьюгатдв8цотал колхицина I 6 257 96,7 —

___п___ 1Б 90 17,7- 98,9 21,6

низкую (в несколько десятков раз) токсичность белковых, конъвгатов. Преимущество конъюгата в том, что при дозе почти в 4 раза меньшей подавление роста опухоли составляло 88,95.

Показателем эффективности препарата является продолжительность кизни и латентный период у крыс о опухолью при использовании соответствующих доз вещества. В таблице 3 показано значительное повышение продолжительности дазни в опытных грушах гивотных, чем в контроле. Видно, что чистый деацатилколхицин в используемых дозах вызывает уменьшение продолаительпости зизни на II и 50%, что подтверждает его высокую токсичпость для организма» . Конъюгация алкалоида со специфическими белками, повыиакщими рецепцию к клеткам. увеличивает эффективность действия целевого соединения.

Результаты проведенных экспериментов показали перспективность • полученных препаратов для использования их в научно-исследовательской и клинической практике в системах In vitro и In vivo.

ВЫВОДЫ

1. Впервые синтезированы C-IO N-аминокислотные и дипептидные производные колхицина. Разработаны способы очистки н установлена структура на основе УФ-, ПНР-спектров а данных электрофореза. Показа но, что в ходе реакции не нарушается исходная структура алкалоида, сохраняются все боковые функциональные группы, важные для проявления биологической активности.

2. Изучена субстратная специйгшость к тубулину производных колхицина и показана ев обратная зависимость от длины и объема С-10 заместителя

3. Показано, что синтезированные соединения сохраняют высокую биологическую активность, их цитотовсичность зависит от природа аминокислотного остатка, спиртовой компоненты, образующей сложно-эфирную группу с пептидным остатком, и от способа связывания алкалоида с аминокислотой.

4. Разработан способ получения конъюгата колхицина для направленного транспорта в опухолевые клетки и усиления цитотокси ЧесКого действия

5. Показана высокая противоопухолевая активность синтезирова иного конъюгата в опытах in vivo на перевиваемой опухоли яичника крыс.

Сшсок работ. огц/блакавашшх по теме диссертации:

1. Есболачв Е.О., ТоЁ^асва к.А., Айтхошна H.A. Цитотоксичес-кая активность дипептидннх производных колхицина. Известия All КазССР, сер.биологическая. 1989, N.5, стр.83-36.

2. Ecbolajev E.On, lo^bajeva К.А., AjtMioshlna N.A. Structure and cytotoxicity of dlpeptlde derivatives of colchicine. In: Chemistry and biotechnology oi biologlcaly active natural products. Varna,Bulgaria. 1889, P.18-23,

3. Esbolajev E.O., Alexandrova L., Tojba^eva К.А. The structure and biochemical activity of colchicine derivatives. Republ.Scl. Conference on Modern Problems of Phyeico-Chemlcal Biology and Biotechnology, 1989, Alma-Ata. P.95. .

4. Есболаев Е.О.Тойбаева К.А.,Мтхогина H.A.. Способ получения кснькгата трансфзррика- с колхещшом, обладавшего противоопухолевой активностью Авторское свидезельство Ii. f639003, 1990.

Б. Тойбаева H.A.. Есболаев Е.О., Айтхошна H.A. Синтез и цито-токсичность аминокислотных производных колхицина и колхашна. Сборник тезисов II Всесоюзного симпозиума Теоретические и пршслад пне проблемы молекулярной биологии". СамаркандЛ991. С.192

6. Тойбаева К.А., Есболаев Е.О., Александрова Л.А., Айтхошна H.A. С-Ю АЦЕЛигшокислохные производные колхицина. Химия природных соединенна, 1992, стр. 372-375.