Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антимикробные и токсические свойства макроциклических и ациклических ониевых производных урацила

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антимикробные и токсические свойства макроциклических и ациклических ониевых производных урацила"

На правах рукописи

Волошина Александра Дмитриевна

!

Антимикробные и токсические свойства макроциклических и ациклических ониевых производных урацила

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

7 ОКТ 2015

005562957

Казань-2015 г.

005562957

Работа выполнена в лаборатории химико-биологических исследований Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра Российской академии наук»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Зобов Владимир Васильевич Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор,

заведующий кафедрой эпизоотологии и инфекционных болезней с ветеринарной санитарией факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Равилов Рустам Хаметович

доктор медицинских наук, профессор, кафедры микробиологии ГБОУ ВПО «Казанский медицинский университет» Мусина Линара Табрисовна

Ведущая организация: ФГАОУ ВО «Южный федеральный

университет»

Защита диссертации состоится «29» октября 2015г. в 13:00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420055, г. Казань, ул. Карла Маркса, д. 74, в зале заседания ученого совета (аудитория 205).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н. И. Лобачевского при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: г. Казань, ул. Кремлевская, д. 35.

Автореферат разослан » сеуУТ^Лб'/гЛ. 2015г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

З.И. Абрамова

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности. В

настоящее время описано более 20 тысяч природных веществ и синтезированы согни тысяч индивидуальных химических соединений с антимикробными свойствами, воздействующих на патогенных возбудителей различной природы. Однако широкое применение этих лекарственных средств, приводит к ряду явлений, осложняющих возможность их рационального использования. К ним относятся: возникновение аллергических реакций, наличие серьезного токсического действия на организм, а также развитие лекарственной резистентности патогенных микроорганизмов к используемым антимикробным препаратам.

В связи с этим приобретают особую актуальность и значимость исследования, посвященные целенаправленному поиску высокоэффективных малотоксичных препаратов с широким спектром действия в рядах новых перспективных антимикробных агентов.

Пиримидиновые производные, вследствие значительного разнообразия присущих им полезных свойств, давно привлекают к себе пристальное внимание, как химиков синтетиков, так и специалистов смежных областей. Целый ряд лекарственных средств на основе пиримидиновых производных в настоящее время широко применяется в медицинской практике. Их используют как фармацевтические препараты, обладающие антимикробными, противовоспалительными, противораковыми, регенерирующими и антималярийными свойствами (Машковский, 2012; Hugo et al., 1987).

Соединения, содержащие ониевую группу, давно вызывают большой интерес исследователей в области химиотерапии. В настоящее время они имеют широкую область применения: терапевтическая антисептика местных гнойно-воспалительных процессов, профилактическая антисептика неповрежденной кожи перед операциями, антисептика слизистых оболочек; консервирование глазных капель, инъекционных растворов, зубных паст, косметических средств и др. Типичные представители ониевых производных - бензалкония хлорид, бензалкония пропионат, мецетрония метилсульфат. Бензалкония хлорид обладает широким спектром антимикробного действия в отношении целого ряда патогенных микроорганизмов и входит в состав многих известных лекарственных средств: фарматекс, бенатекс, септолете (Опарин, 2003; РЛС Энциклопедия лекарств, 2012).

Антимикробная активность ониевых соединений является предметом многочисленных публикаций (Корочкина и др., 2010; Корочкина и др., 2011; Кудрявцев и др., 2011; Миргородская и др., 2011; Zhiltsova et al., 2012; Mirgorodskaya et al., 2014; Pashirova et al., 2015; Kenawy, 2007). Однако практически отсутствуют работы, посвященные изучению антимикробной активности макроциклических и ациклических ониевых производных урацила.

В связи с этим поиск новых оригинальных препаратов с широким спектром антимикробной активности и низкой токсичностью по отношению к млекопитающим

з

в рядах макроциклических и ациклических ониевых производных урацила является актуальным.

В соответствии с вышеизложенным, целью работы явилось исследование антимикробных и токсических свойств новых макроциклических и ациклических ониевых производных урацила.

Основные задачи исследования:

1. Охарактеризовать антимикробную активность макроциклических и ациклических ониевых производных урацила.

2. Проанализировать связь «структура-активность» в рядах исследуемых соединений.

3. Исследовать влияние ониевых производных урацила на активность ферментов дегидрогеназ и липаз, а также на биосинтез биомаркерных рибосомных белков Escherichia coli F 50.

4. Оценить острую токсичность на лабораторных млекопитающих (мыши внутрибрюшинно).

5. Исследовать генотоксические и гемолитические свойства макроциклических и ациклических ониевых производных урацила.

6. Дать сравнительную оценку потенциала практического применения макроциклических и ациклических ониевых производных урацила в качестве антимикробных средств.

Научная новизна. Впервые изучена антимикробная активность новых химических соединений; выявлены особенности молекулярной структуры, обеспечивающие низкие значения МИК (минимальной ингибирующей концентрации) на уровне известных лекарственных препаратов (ципрофлоксацина, офлоксацина, клотримазола, амфотерицина В, кетоконазола) и умеренные значения токсичности на лабораторных мышах. Исследованные соединения не являются гемолитическими агентами. В тесте Эймса показано отсутствие их генотоксичности. Макроциклические и ациклические ониевые производные урацила впервые предложены к разработке как антимикробные препараты.

Практическая значимость работы. Основным практическим достижением настоящей работы является выявление в рядах макроциклических и ациклических производных урацила соединений с высокой антимикробной активностью на уровне известных эталонов. Макроциклические ониевые производные урацила демонстрируют селективные свойства в отношении грамположительных бактерий. Ациклические ониевые производные оказались менее специфичными и проявили высокую антимикробную активность как в отношение грамположительных и грамотрицательных бактерий, так и в отношении грибов. Установленные результаты в совокупности с данными, свидетельствующими об отсутствии, у исследованных соединений, мутагенных и гемолитических свойств, а также о проявлении умеренно токсических свойств по отношению к лабораторным мышам, открывают перспективу

их использования для лечения бактериальных и грибковых инфекций человека и животных.

Положения, выносимые на защиту.

1. Среди 37 исследованных соединений оптимальное сочетание целевых антимикробных и побочных токсических свойств (острая токсичность, гемолитическая активность, генотоксичность) проявляется в ряду ациклических производных аллоксазина.

2. В отношении грамположительных бактерий макроциклические и ациклические производные урацила демонстрируют антимикробную активность на уровне ципрофлоксацина и офлоксацина (МИК = 0,2-3,9 мг/л); в отношении грамотрицательных бактерий наиболее активны ациклические производные хиназолин-2,4-диона и аллоксазина (МИК=3,1-31,3 мг/л); в отношении грибов наиболее активны ациклические производные аллоксазина и урацила (МИК= 0,39 -3,9 мг/л).

3. Ациклические производные аллоксазина вызывают угнетение активности дегидрогеназ и липаз S. aureus 209-Р и С. albicans 885-653 на (38-82%); все исследованные соединения оказывают воздействие на биосинтез белка в клетках Е. coliF 50.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена в лаборатории химико-биологических исследований ИОФХ им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН, является частью исследований в соответствии с научным направлением Института по государственным бюджетным темам «Синтез и изучение структуры, химических и биологических свойств макроциклических соединений, содержащих в своем составе пиримидиновые и триазиновые фрагменты» (№ госрегистрации 0120.0005796); «Функционализация клешневидных и макроциклических соединений, содержащих N-гетероароматические и карбоциклические фрагменты, с целью придания им практически полезных свойств (№ госрегистрации 0120.0503489). Работа поддержана программами ОХНМ РАН «Химия и физикохимия супрамолекулярных систем и атомных кластеров», «Биомолекулярная и медицинская химия», «Медицинская химия», программой Президиума РАН «Разработка методов получения химических веществ и создание новых материалов», Федеральными целевыми программами «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (г/к № 02.513.12.0018), «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (соглашение № 8432) и грантами РФФИ: № 07-03-00392-а «Амфифильные макроциклические соединения, содержащие пиримидиновые фрагменты: синтез, катализ, самоорганизация», № 10-03-00365-а «Синтез и свойства криптандоподобных и наноразмерных пиримидинофанов».

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены в сборнике «Новые лекарственные средства: успехи и перспективы» (Уфа: Гилем, 2005); сборнике «Химия и биологическая активность синтетических и природных соединений, Азотсодержащие гетероциклы» (Москва, 2006); на International symposium «Advances in synthetic and medicinal chemistry» (St. Petersburg, 2007); научной конференции «Органическая химия для медицины» (Орхимед — 2008) (Москва, 2008); научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Крым, Украина, 2009); научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Крым, Украина, 2011); 47thInternational Conferenceon Medicinal Chemistry "Drugdiscovery and selection" (Lyon, France, 2011); International Congresson Organic Chemistry (Kazan, Russian Federation, 2011); 17thEuropean Symposiumon Organic Chemistry "ESOC2011" (Hersonissos, Crete, Greece, 2011); первой Российской конференции по медицинской химии (MedChem Russia - 2013), (Москва, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 3 статьи в международных журналах и три статьи в российских журналах, удовлетворяющих требованиям ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из стандартных разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследования, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 107 страницах, содержит 12 таблиц и 27 рисунков. Библиография содержит 116 наименований российских и зарубежных авторов.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю д.б.н., профессору В.В. Зобову за поддержку и внимательное отношение к работе; своему первому научному руководителю к.б.н. Ж.В. Молодых за привитый интерес к исследуемой проблеме; коллективу лаборатории химико-биологических исследований ИОФХ им. А.Е. Арбузова за помощь в проведении микробиологических и токсикологических исследований; д.х.н., профессору B.C. Резнику, д.х.н. В.Э. Семенову и коллективу лаборатории химии нуклеотидных оснований ИОФХ им. А.Е. Арбузова за предоставленные для исследований соединения, научные консультации, всестороннюю помощь и поддержку; выражает глубокую признательность заведующему кафедрой микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии д.б.н., профессору О.Н. Ильинской за огромную помощь в написании диссертации; доценту кафедры микробиологии к.б.н., А.Б. Маргулис за помощь в проведении испытаний на генотоксичность. Благодарность выражается зав. лаборатории физико-химического анализа ИОФХ им. А.Е. Арбузова, к.х.н. И.Х. Ризванову и асперантке КФУ A.C. Стробыкиной за

помощь в проведении исследований на MALDI-TOF масс-спектрометре Autoflex («Bruker Daltonics», Германия).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы

1.1. Соединения и тест-объекты использованные в экспериментах В качестве эталонов были использованы препараты коммерческого происхождения (субстанции антибиотиков ципрфлоксацина, офлоксацина, стрептомицина, грамицидина С и противогрибковых средств клотримазола, кетоконазола, амфотерицина В) (Sigma). Триэтилдециламмония бромид (простой аналог исследуемых соединений, исследованный во всех тест-системах в качестве модельного соединения, содержащего те же специфические фармакофоры (децильный радикал и ониевую группу), 22 представителя макроциклических ониевых производных урацила, 8 ациклических ониевых производных урацила, 4 представителя ациклических ониевых производных хиназолин-2,4-диона и 3 представителя ациклических ониевых роизводных аллоксазина были синтезированы в лаборатории химии нуклеотидных оснований ИОФХ им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН.

Биологические объекты

Штаммы тест-микроорганизмов, использованные в работе, перечислены в таблице 1.

Таблица 1.

№ Штаммы бактерий Штаммы микроскопических грибов

1 Staphylococcus aureus АТСС 209р Aspergillus niger BKMF-1119

2 Bacillus cereus АТСС 8035 Trichophyton mentagrophytes var. gypseum 1773

3 Escherichia coli CDC F-50 Candida albicans ВКПГу-401/NCTC 885-653

4 Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027

5 Enterococcus faecalis ATCC 8043

6 Salmonella typhimurium ТА 100

Бактерии были получены из Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов ГНИСКЛС им. Л.А. Тарасевича г. Москва, грибы из Всероссийской коллекции патогенных грибов (ВКПГ) г. Санкт-Петербург.

Для культивирования тест-микроорганизмов использовали стандартные питательные среды: Бульон Хоттингера для бактерий и среду Сабуро для грибов.

1.2. Определение антимикробного действия макроциклических и ациклических ониевых производных урацила

Антибактериальную и противогрибковую активность определяли методом серийных разведений в жидких питательных средах, выявляя концентрацию

исследуемого соединения, при которой наблюдалось полное ингибирование роста тест-микроорганизма. Эту концентрацию (мг/л) обозначали как МИК (NCCLS, 2000; NCCLS, 1998).

1.3. Воздействие макроциклических и ациклических ониевых производных урацила на биохимические процессы микроорганизмов

1.3.1. Дегидрогеназную активность S. aureus 209р и С. albicans 885-653 определяли в анаэробных условиях по времени обесцвечивания метиленовой сини методом Тунберга (Rajvaidya, 2006).

1.3.2. Липазную активность S. aureus 209р и С. albicans 885-653 исследовали методом, основанном на титрометрическом определении свободных жирных кислот, образовавшихся в результате гидролиза липидов. (Модифицированный метод Ота, Ямада) (Kashmiri, 2006; Macedo, 1997). В экспериментах использовали суспензии культур S. aureus 209р и С. albicans 885-653 содержащие 1 х 109 кл/мл.

1.3.3. Спектры биомаркерных рибосомных белков Escherichia coli F-50 детектировали MALDI-TOF масс-спектрометром Autoflex («Bruker Daltonics»,Германия). В качестве контрольного образца, а также внешнего калибратора использовался стандартный набор белков фирмы «Bruker Daltonics» (Германия). Для получения каждого масс-спектра использовали от 1400 до 2000 импульсов лазера с мощностью излучения, установленной на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции - ионизации образца. Параметры масс-спектрометра оптимизировали для диапазона m/z от 3000 до 100000Да. Для каждого образца записывали спектр, полученный в результате суммирования 10 одиночных спектров (1400-2000 импульсов лазера). Для записи использовали программное обеспечение FlexControl 2.4 (Build 38), а для обработки и анализа масс-спектров FlexAnalysis 2.4 (Build 11) фирмы «Bruker Daltonics» (Германия).

Суспензию клеток E.coli F-50 (1*109 кл/мл) инкубировали в течение суток с раствором исследуемых соединений в действующих концентрациях. Затем получали масс-спектры рибосомных белков данной культуры. Результаты оценивали по уменьшению или полному исчезновению спектральных пиков.

В качестве позитивного контроля использовали пробы, содержащие стандартный ингибитор белкового синтеза - антибиотик стрептомицин.

1.4. Оценка острой токсичности соединений

Тест по оценке острой токсичности проводился на лабораторных млекопитающих: белых беспородных мышах обоего пола массой 19,0+2,0 г. Животные содержались на стандартном рационе питания в условиях природного режима освещения помещения при температуре 20±2°С (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005).

Первичную токсикологическую оценку соединений (в рамках поточного скрининга) при внутрибрюшинном способе (в/б) введения в виде водных растворов

(или с добавлением 0,2 % твина-80) проводили в острых опытах на мышах обоего пола массой 19,0+2,0 г. Затем в течение последующих 72 часов проводилось наблюдение за состоянием мышей, регистрировались симптомы интоксикации. Критерием токсичности служил расчетный показатель ЛД50 - доза (в мкМ), при которой у 50% животных наблюдались смертельные исходы. Для установления ЛД50, каждое соединение вводили 4 группам мышей (по 6 особей на каждую дозу; п=24). Пересчет доз с мкМ на мг/кг производился по формуле:

[мг/кг] = (мкМ х молекулярная масса) / 1000

Все изученные соединения ранжировались согласно классификации острой токсичности веществ при введении в брюшную полость животного (Измеров и др., 1977).

1.5. Оценка гемолитического действия макроциклических и ациклических ониевых производных урацила

Оценку гемолитического действия исследуемых соединений проводили по ГОСТ Р ИСО 10993.4-99. Метод основан на сравнении оптической плотности раствора исследуемого вещества с кровью с оптической плотностью крови при 100 % гемолизе. Для исследований использовали 10% взвесь эритроцитов человека (I«+») и барана.

1.6. Определение генотоксичности макроциклических и ациклических ониевых производных урацила

Способность препаратов индуцировать генные мутации в клетках бактерий определяли в тесте Эймса без метаболической активации по реверсии тест-штамма Salmonella typhimurium ТА 100 ауксотрофного по гистидину к прототрофности (Ames et al., 1973; Marón, Ames, 1983).

1.7. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программ Microsoft Office Excel 2007. Достоверность различий средних значений оценивали с использованием коэффициента Стъюдента (Р<0,05). Взаимосвязь ряда данных устанавливали с помощью коэффициента корреляции. Табличные и графические данные содержат средние значения и стандартную ошибку.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Определение антимикробного действия исследуемых соединений

2.1.1. Антимикробная активность макроциклических ониевых производных

урацила 10 £у_сн3 2В©

Q- 3 -<СН2)Д_(СН2)№ -Р

Ьгйчс!

Н3С (СН2>Г снз

/*±>-СНз

сюЧг1

Рис. 1. Общая формула макроциклических ониевых производных урацила

Таблица 2. Антимикробная активность макроциклических ониевых производных урацила

Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) (мг/л)

Гр+ Гр- Грибы

№ п R S. aureus В. cereus Е. faecalis Е. coli Р. аеги ginosa А. niger Т. menta его phytes С. albi cans

(4) 5 Н 0.97 ±0,09 1.95 ±0.19 500 ±49 62.5 ±5.8 500 ±49 250 ±25 125 ±12 125 ±12

(5) 6 Н 0.97 ±0.09 1.95 ±0.18 156.0 ±16 62.5 ±6.2 500 ±49 250 ±24 125 ±12 125 ±12

(6) 5 All 0.24 ±0.02 3.9 ±0.4 390 ±39 15.6 ±1.5 250 ±25 250 ±24 6.25 ±0.62 1.9 ±0.2

Триэтилдецил аммония бромид 2,5 ±0,2 50 ±4,5 — 156 ±12 — — 500 ±41 62,5 ±4,9

Ципрофлоксацин 0.25 ±0.02 0.25 ±0.02 3.9 ±0.4 0.50 ±0.05 0.50 ±0.05

Офлоксацин 0.97 ±0.09 1.5 ±0.1 15.6 ±1.5 0.50 ±0.05 3.1 ±0.3

Кетоконазол 3.9 ±0.4 3.9 ±0.4

(— ) МИК >500 мг/л, All-радикал аллил (СН2=СН-СН2)

Антимикробную активность макроциклических ониевых производных урацила наблюдали в пределах (0.24 - 500) мг/л. В таблице 2 представлены значения МИК самых активных макроциклических производных урацила. Соединение 6, содержащее в 5 положении урацилового фрагмента радикал аллил, проявило антибактериальную активность против S. aureus 209 Р на уровне ципрофлоксацина (МИК-0,24 мг/л). Противогрибковая активность данного соединения в отношении С. albicans 885-653 в 2 раза превышает значение активности противогрибкового препарата кетоконазола. Соединения 4 и 5, с незамещенным 5 положением в урациловом фрагменте оказались узко специфичны в отношении грамположительных бактерий (S. aureus 209 Р и В. cereus 8035), антимикробная активность проявлялась на уровне антибиотика офлоксацина (МИК-0,97 мг/л). В отношении Е. faecalis 8043 и грамотрицательных бактерий высоких значений активности выявлено не было (МИК 156-500 мг/л).

2.1.2. Антимикробная активность ациклических ониевых производных урацила

Я 2Вг°

Т L ^

сн3

С10Н21 -сн.

(CH2)5f^-—(

>—с

Рис. 2. Общая формула ациклических ониевых производных урацила

Таблица 3. Антимикробная активность ациклических ониевых производных урацила

№ Ri R2 Минимальная ингибирукяцая концентрация (МИК) (мг/л)

Гр+ Г р- Грибы

S. aureus В. cereus Е. faecalis Е. coli Р. аеги ginosa А. niger Т. enta-gro phyles С. albi cans

(7) no2 н 0.97 ±0.09 15.6 ±1.5 125 ±12 15.6 ±1.6 — — 31.3 ±3.0 0.97 ±0.09

(8) CHj н 0.97 ±0.09 6.3 ±0.6 125 ±12 15.6 ±1.5 500 ±49 125 ±12 12.5 ±12 0.97 ±0.09

(9) С10Н21 СН3 0.97 ±0.09 0.50 ±0.05 125 ±12 62.5 ±6.2 250 ±25 500 ±50 62.5 ±6.0 0.97 ±0.09

Триэтиддецил аммония бромид 2,5 ±0,2 50 ±4,5 — 156 ±12 — — 500 ±41 62,5 ±4,9

Офлоксацин 0.97 ±0.09 1.5 ±0.1 15.6 ±1.5 0.50 ±0.05 3.1 ±0.3

Амфотерицин В 20.0 ±1.9 3.1 ±3.0 0.97 ±0.09

(— ) МИК >500 мг/л

Антимикробная активность ациклических ониевых производных урацила наблюдалась в диапазоне концентраций (0,5-500) мг/л. Соединения 7, 8 и 9 проявляют антибактериальную активность в отношении S. aureus 209 Р и В. cereus 8035 на уровне офлоксацина, а противогрибковую активность в отношении С. albicans 885653 на уровне препарата амфотерицина В (МИК-0,97 мг/л). Наиболее активным оказалось соединение 9, содержащее в 5 положении урацилового фрагмента радикал децил (CioH2i). Значение активностей в отношении Е. faecalis 8043 и грамотрицательных бактерий, как и в случае макроциклических производных значительно ниже (Таблица 3).

2.1.3. В ряду ациклических ониевых производных хиназолин-2,4-диона получено соединение 12, обладающее высокой антибактериальной активностью в отношении всех грамположительных бактерий, включая Е. faecalis. Значения МИК проявляются на уровне ципрофлоксацина.

Против грамотрицательных бактерий соединение 12 менее активно, но в отношении P. aeruginosa 9027 наблюдалась самая высокая антибактериальная активность (МИК - 31.3 мг/л) по сравнению с макроциклическими и ациклическими ониевыми производными урацила. Однако по противогрибковым свойствам производные хиназолин-2,4-диона значительно уступают вышеописанным соединениям (Таблица 4).

_ ä 2вг° ох?

(CHJJi—R

сн3

Рис.3. Общая формула ациклических ониевых производных хиназолин-2,4-диона

Таблица 4. Антимикробная активность ациклических ониевых производных хиназолин-2,4-диона

№ R Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) (мг/л)

Гр+ Г р- Грибы

S. aureus В. cereus Е. faecalis Е. coli Р. aeruginosa А. niger Т. menta-gro phytes С. albi cans

(10) С,бнзз 250 ±25 500 ±49 — — — — — —

(И) С5Н„ 31.3 ±3.0 125 ±12 500 ±49 — — — 62.5 ±6.1 62.5 ±6.2

(12) С.А. 0.20 ±0.02 1.95 ±0.19 3.9 ±0.4 15.6 ±1.5 31.3 ±3.0 250 ±25 31.3 ±3.0 31.3 ±3.1

Триэтилдецил аммония бромид 2,5 ±0,2 50 ±4,5 — 156 ±12 — — 500 ±41 62,5 ±4,9

Ципро флоксацин 0.25 ±0.02 0.50 ±0.05 3.9 ±0.4 0.50 ±0.04 0.50 ±0.05 - - -

Кетоконазол - - - - - - 3.9 ±0.4 3.9 ±0.4

(— )МИК>500мг/л

2.1.4. Ациклические ониевые производные аллоксазина, как и ациклические ониевые производные урацила показали высокую антимикробную активность в отношении грамположительных бактерий и грибов (Таблица 5). Антибактериальная активность соединений 14 и 15 в отношении S. aureus 209 Р и В. cereus 8035 проявлялась на уровне ципрофлоксацина и офлоксацина. Соединение 14 показало самую высокую противогрибковую активность из всех исследованных соединений. В отношении С. albicans 885-653 активность этого соединения проявлялась на уровне клотримазола, а в отношении Т. mentagrophytes 1773 в 8 раз превышала значение МИК известного противогрибкового средства.

Таблица 5. Антимикробная активность ациклических ониевых производных аллоксазина

№ п R Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) (мг/л)

Гр+ Гр- Грибы

S. aureus В. cereus Е. faecalis Е. coli Р. аеги ginosa А. niger Т. menta gro phytes с. clbi cans

(13) 5 с2н5

(14) 5 С10Н21 0.24 ±0.02 0.24 ±0.02 500 ±49 3.1 ±0.3 125 ±12 125 ±12 0.39 ±0.04 0.39 ±0.03

(15) 6 С10Н21 0.97 ±0.09 1.5 ±0.14 - 12.5 ±1.2 500 ±48 — 1.9 ±0.1 1.9 ±0.1

Триэтидцецил аммония бромид 2,5 ±0,2 50 ±4,5 — 156 ±12 — — 500 ±41 62,5 ±4,9

Ципрофлоксацин 0.25 ±0.02 0.25 ±0.02 3.9 ±0.4 0.50 ±0.05 0.50 ±0.05 - - -

Офлоксацин 0.97 ±0.09 1.5 ±0.1 15.6 ±1.5 0.50 ±0.05 3.1 ±0.3 - - -

Клотримазол - - - - - - 3.1 ±0.3 0.39 ±0.03

(— )МИК>500 мг/л

2.2. Оценка влияния макроциклических и ациклических ониевых производных урацила на биохимические процессы микроорганизмов

2.2.1. Влияние исследуемых соединений на дегидрогеназы и липазы S. aureus 209-Р и С. albicans 885-653.

В отличии от триэтилдециламмония бромида все исследованные соединения начинают ингибировать дегидрогеназную активность S. aureus 209-Р в диапазоне малых концентраций 0,05-5 мг/л (рис. 5а). Производные аллоксазина в концентрации 0,5 мг/л угнетают действие фермента на 47 %, а в концентрации 5 мг/л на 60%. Дегидрогеназную активность С. albicans 885-653 наиболее сильно ингибируют производные хиназолин-2,4-диона и аллоксазина (рис. 5 б). В концентрации 0,05 мг/л процент ингибирования составил 29% и 22%, в концентрации 0,5 мг/л - 48 % и 36 %, а в концентрации 5 мг/л - 55% и 70 % соответственно. Триэтилдециламмония бромид незначительно ингибирует дегидрогеназную активность С. albicans 885-653 тош.ко в высокой концентрации 500 мг/л. Липазную активность S. aureus 209-Р наиболее активно угнетают производные аллоксазина (в концентрации 0,5 мг/л на 72 %, 5 мг/л - 82 %) (рис. 5в). Остальные соединения менее активны в отношении этого фермента. На липазную активность С. albicans 885-653 самое сильное воздействие оказывают производных аллоксазина (в концентрации 5 мг/л - ингибирование 38 %) (рис. 5 г).

Ингабирование липазы 5. aureus 209p (в)

MC МЦ6 АЦ9 ХД12 АЛ 14

Ингибирование липазы С. albicans 885-653 (г)

МЦ 6

АЦ9

ХД12

Концентрации соединений: И 500 мг/л Е2 50 мг/лП 5 мг/л 0 0,5 мг/л КЗ 0,05 мг/л

Рис. 5. Влияние исследуемых соединений на дегидрогеназную и липазную активности S1. aureus 209-Р и С. albicans 885-653. MC - модельное соединение (триэтилдециламмония бромид); МЦ- макроциклическое ониевое производное урацила; АД- ациклическое ониевое производное урацила; ХД- ациклическое ониевое производное хиназолин-2,4-диона; AJI-ациклическое ониевое производное аллоксазина.

2.2.2. Влияние макроциклических и ациклических ониевых производных урацила на синтез биомаркерных рибосомных белков Escherichia coli F 50

При помощи метода масс-спектрометрии MALDI-TOF были получены масс-спектры рибосомных белков Е. coli F-50 с молекулярными массами 9064, 9229, 9533 и 9735 Да (рис. 6 А).

Анализ масс-спектров рибосомных белков E.coli F-50 после воздействия на них стрептомицина в МИК-25 мг/л показал, что первый пик, соответствующий белку S12 (масса 9064 Да), практически полностью исчезает (рис. 6 Б).

Далее было изучено влияние представителей каждого ряда исследованных соединений в МИК на биосинтез рибосомных белков E.coli F-50 (рис. 7). Триэтилдециламмония бромид (рис.7 Б) и ациклическое ониевое производное урацила (соединение 9) (рис. 7 В) как и стрептомицин оказывают сильное воздействие на спектр рибосомного белка S12, а также на 4 рибосомный белок (9735 Да). Производные хиназолин-2,4-диона и аллоксазина способствуют уменьшению

спектров второго и третьего рибосомных белков с массами 9229, 9533 (соединения 12,14) (рис. 7 Г, Д).

белков Escherichia coli F 50: А) контроль - масс-спектры рибосомных белков E.coli F-50 с молекулярными массами 9064, 9229, 9533 и 9735 Да; Б) воздействие стрептомицина в VfHK-25 мг/л на биосинтез рибосомных белков E.coli F-50).

Рис.7. Влияние макроциклических и ациклических ониевых производных урацила на биосинтез биомаркерных рибосомных белков Escherichia coli F 50: А) контроль - масс-спектр рибосомных белков Е. coli F-50; Б) влияние триэтилдециламмония бромида; В) влияние ациклического ониевого производного урацила (соединение 9); Г) влияние производного хиназолин-2,4-диона (соединение 12); Д) влияние производного аллоксазина (соединение 14).

Воздействие макроциклического ониевого производного урацила с самой высокой антимикробной активностью (соединение 6) приводит к значительному уменьшению спектра третьего рибосомного белка с массой 9533 Да (рис. 8).

биомаркерных рибосомных белков Е. coli F-50 (А) контроль- спектр рибосомных белков Е. coli F-50; Б) Влияние макроциклического ониевого производного урацила (6). 2.3. Изучение острой токсичности макроциклических и ациклических ониевых производных урацила

Для соединений обладающих высокой антимикробной активностью была проведена оценка острой токсичности (Таблица 6). Все протестированные соединения относятся к категории веществ «умеренно токсичных » (III класс опасности по степени воздействия на организм).

Таблица 6. Острая токсичность исследованных соединений

№ соединения ЛД50; мг/кг, внутрибрюшинно, мыши.

МЦ-4 18,8 (16.3- -21.6)

МЦ-4 18,8 (16.3- -21.6)

МЦ-6 22.6 (19.9- -25.4)

АЦ-7 19.8 (17.3- -22.5)

АЦ-9 17.5 (15.6- -19.8)

ХД-12 18,6 (16,1- -22.5)

АЛ-14 20.9 (17.6- -24.7)

AJI-15 19,2 (14.9- -23.1)

Триэтилдециламмония бромид 28.3 (22.9- -34.8)

Грамицидин С 28.0 (25.4- -31.5)

МЦ (4 - 6) - макроциклические ониевые производные урацила; АД (7, 9) - ациклические ониевые производные урацила; ХД (12) ациклическое ониевое производное хиназолин-2,4-диона; АЛ (14,15) - ациклические ониевые производные аллоксазина.

2.4. Оценка гемолитического действия макроциклических и ациклических ониевых производных урацила

Из каждого ряда, исследуемых соединений был выбран представитель с самой высокой антимикробной активностью для оценки гемолитического действия. Соединения исследовали в минимальных концентрациях вызывающих ингибиро зание роста бактерий и грибов. В соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993 4-99, если гемолиз > 2 %, вещество считают гемолитически активным. Все протестированные соединения в исследованных концентрациях не обладают гемолитическим действием (рис. 9).

з ■

2,5 2

| 1,5

0,5 0

Рис. 9. Гемолитическое действие макроциклических и ациклических ониевых производных урацила.

Концентрации соединений (мг/л): триэтилдециламмония бромид (МС) - 62,5; макроциклическое ониевое производное урацила (МЦ 6 ) - 15,6; ациклическое оииевое производные урацила (АЦ 9) - 0,97; производное хиназолин-2,4-диона (ХД 12) - 31,3; производное аллоксазина (АЛ 14) - 0,39, ПК-0,5 % ЫаС1.

2.5. Генотоксические свойства макроциклических и ациклических ониевых производных урацила

Для оценки мутагенного эффекта использовали те же концентрации исследуемых соединений, что и при определении гемолиза. В тесте Эймса без метаболической активации было показано, что число индуцируемых ониевыми соединениями №я+ ревертантов не превышало спонтанный фон мутирования (рис. 10).

Так как число колоний-ревертантов в опыте и контроле различаются менее чем в 2,5 раза, можно считать, что макроциклические и ациклические ониевые производные урацила в исследуемых концентрациях не обладают мутагенной активностью.

К Эритроциты человека Ш Эритроциты барана

МС МЦ 6 АЦ9 ХД 12 АЛ 14 ПК

К MC МЦ6 АЦ9 ХД12 АЛ 14 ПК

Рис. 10. Оценка мутагенного эффекта макроциклических и ациклических ониевых производных урацила.

Концентрации соединений (мг/л): триэтилдециламмония бромид (MC) - 62,5; макроциклическое ониевое производное урацила (МЦ 6) - 15,6; ациклическое ониевое производное урацила (АЦ 9) - 0,97; производное хиназолин-2,4-диона (ХД 12) - 31,3; производное аллоксазина (АЛ 14) - 0,39; ПК - позитивный контроль (азид Na); К - контроль (спонтанный фон мутирования).

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 3.1. Антимикробная активность макроциклических и ациклических ониевых

производных урацила Макроциклические ониевые производные урацила узко специфичны в отношении грамположительных бактерий S. aureus 209-Р и Bacillus cereus 8035. Такая избирательность действия, по всей видимости, связана с трехмерным строением их молекул, соответствие которых трехмерной структуре биомишени может обеспечивать возможность селективного и прочного связывания. Большая конформационная однородность макроциклических производных, по сравнению с ациклическими соединениями, позволяет им достигать определенной биомишени без неспецифических потерь. Подобным образом действуют многие природные антибиотики и токсины, имеющие сложную циклическую структуру.

Очевидно, что антимикробная активность макроциклических производных связана с присутствием в их молекулах пиримидинового фрагмента. По видимому, в данном случае, макроциклические производные нуклеотидных оснований выступают в качестве неспецифического фрагмента, усиливающего антимикробное действие специфического фармакофора (ониевая группа, содержащая липофильный радикал децил) и даже придает ему новую направленность (селективность по отношению к грамположительным бактериям).

Ациклические ониевые производные урацила, как и макроциклические соединения, обладают высокой актибактериальной активностью в отношении грамположительных бактерий. Причем в отношении Е. faecalis 8043 антимикробная активность большинства ациклических производных 3 раза выше, чем у самого

активного макроцикла.

Установлено, что ациклические ониевые производные урацила оказались более активными в отношении грибов и грамотрицательных бактерий. Такие изменения антимикробных свойств, в сторону расширения спектра действия, возможно, связаны с меньшей конформационной однородностью ациклических производных урацила по сравнению с макроциклическими производными.

Переход к конденсированным производным урацила содержащим хиназолин-2,4-дионовый фрагмент приводит к появлению селективности по отношению к бактериям и снижению противогрибковой активности.

Введение аллоксазинового фрагмента позволило получить соединение с самой высокой антимикробной активностью и широким спектром действия.

Модельное соединение (триэтилдециламмония бромид), являющееся классическим ПАВ, значительно уступает по активности всем исследованным соединениям.

Таким образом, очевидным является влияние природы заместителей при урациловом фрагменте на антимикробную активность, и полученные данные позволяют говорить о специфическом механизме действия, обусловленном непосредственно урациловым фрагментом и структурными особенностями соединения, а не только их солюбилизирующей способностью, что наблюдается в случае классических ПАВ.

Анализ связи «структура - активность», показал, что основными структурными факторами, влияющими на антимикробную активность исследованных соединений являются: 1) присутствие децильного радикала в составе ониевых групп; 2) пента- и гекса-метиленовые цепи между атомами азота ониевой группы и N-гетероцикла. 3.2. Оценка влияния макроциклических и ациклических ониевых производных урацила на биохимические процессы микроорганизмов

3.2.1. Влияние макроциклических и ациклических ониевых производных урацила на активности дегидрогеназ и липаз S. aureus 209-Р и С. albicans 885-653.

В связи с тем, что обмен веществ в клетках микроорганизмов неразрывно связан с деятельностью ферментов и ни одна биохимическая реакция не происходит без их участия, совершенно очевидно, что изучение влияния различных веществ (в том числе и лекарственных препаратов) на процессы метаболизма клеток связано с исследованием их воздействия на ферментативные процессы.

Были проведены эксперименты, позволяющие оценить влияние исследуемых соединений на такие важные ферменты в клетке, как дегидрогеназы и липазы, так как изменение активности данных ферментов в достаточной степени отражает динамику развития патологических процессов, возникающих в организме. Многими исследователями отмечается угнетение активности дегидрогеназ и липаз микроорганизмов различными антимикробными и химиотерапевтическими препаратами (Очерки по микробиологии, 2011-2014), (Plewig, 1993).

Были проведена оценка влияния исследуемых соединений на дегидрогеназы и липазы S. aureus 209-Р и С. albicans 885-653. Выбор тестерных штаммов был связан с тем, что эти микроорганизмы оказались наиболее чувствительными ко всем исследованным соединениям.

Полученные результаты показали, что отличие от триэтилдециламмония бромида все исследованные соединения достаточно активно ингибируют дегидрогеназы S. aureus 209-Р и С. albicans 885-653.

На основе этих данных можно предположить, что механизм действия исследованных соединений связан с ингибированием ферментных систем дыхательной цепи микроорганизмов на ранних стадиях взаимодействия с клеточными мишенями, что приводит к нарушению нормального течения синтеза жизненно необходимых соединений в клетке микроорганизма.

Липазы S. aureus 209-Р и С. albicans 885-653 наиболее сильно угнетают производные аллоксазина. Остальные соединения менее активны в отношении этих ферментов. Возможно, влияние этого ряда соединений на микроорганизмы вызывает нарушение метаболических процессов в клетках, связанных с действием липолитических ферментов.

3.2.2. Влияние макроциклических и ациклических ониевых производных урацила на синтез биомаркерных рибосомных белков Escherichia coli F 50

Использование метода масс-спектрометрии MALDI-TOF позволило достаточно точно проиллюстрировать механизм действия известного антибиотика стрептомицина. Исчезновение пика белка S12 свидетельствует, по всей видимости, о нарушении его синтеза в клетках Е. coli F 50.

Получив достаточно четкую картину воздействия известного антибиотика на синтез рибосомных белков E.coli F 50, мы предприняли попытку изучить влияние макроциклических и ациклических ониевых производных урацила на биосинтез биомаркерных рибосомных белков E.coli F 50 при помощи метода MALDI-TOF масс-спектрометрии. Анализ полученных результатов позволил предположить, что механизм действия исследованных соединений связан с нарушением синтеза белка в бактериальной клетке.

3.3. Оценка острой токсичности, гемолитического действия и генотоксических свойств макроциклических и ациклических ониевых

производных урацила Полученные результаты свидетельствуют о том, что все протестированные соединения относятся к категории веществ «умеренно токсичных» (III класс опасности по степени воздействия на организм). Токсические свойства исследуемых соединений проявляются на уровне известного антибиотика Грамицидина С, но в отличие от него ониевые производные урацила не обладают гемолитическим действием. Генотоксических свойств в тесте Эймса в рядах макроциклических и ациклических ониевых производных урацила не выявлено.

Таким образом, анализ полученных результатов показал, что исследованные соединения могут быть рекомендованы для работы с живыми объектами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Макроциклические и ациклические ониевые производные урацила проявили высокую антимикробную активность на уровне известных препаратов: ципрфлоксацина, офлоксацина, клотримазола, кетоконазола, амфотерицинз В. Установлена связь структуры исследованных соединений с их антимикробной активностью. В ряду макроциклических ониевых производных урацила были выявлены узко специфичные в отношении грамположительных бактерий соединения, Ациклические ониевые производные урацила оказались менее специфичными в отношении использованных в экспериментах микроорганизмов и проявили достаточно высокую противогрибковую активность на уровне широко применяемых препаратов клотримазола, кетоконазола и амфотерицина В. Данные по изучению воздействия макроциклических и ациклических ониевых производных урацила на биохимические процессы микроорганизмов позволили предположить, что механизм действия этих соединений связан с ингибированием таких важных ферментов клетке как дегидрогеназы и липазы и биосинтеза белка. В ходе экспериментов было установлено, что все протестированные соединения относятся к категории «веществ умеренно токсичных», не проявляют гемолитических и мутагенных свойств и могут применяться для работы с живыми объектами.

Дальнейшие исследования, направленные на более тщательное изучение механизма действия и новых фармакологических свойств, помогут разработать стратегию для создания нового класса биологически активных веществ.

ВЫВОДЫ

1. В отношении грамположительных бактерий макроциклические и ациклические ониевые производные урацила демонстрируют антимикробную активность на уровне ципрофлоксацина и офлоксацина (МИК = 0,2-3,9 мг/л); в отношении грамотрицательных бактерий наиболее активны ациклические производные хиназолин-2,4-диона и аллоксазина (МИК=3,1-31,3 мг/л); в отношении грибов наиболее активны ациклические производные аллоксазина и урацила противогрибковая активность которых, проявляется на уровне кетоконазола, клотримазола и амфотерицина В (МИК=0,39-3,9мг/л).

2. Анализ связи «структура - активность», показал, что макроциклические ониевые производные урацила проявляют селективные свойства в отношении грамположительных бактерий. Ациклические ониевые производные оказались менее специфичными и проявили высокую антимикробную активность как в отношение грамположительных и грамотрицательных бактерий, так и в отношении грибов. Основными структурными факторами, влияющими на антимикробную активность исследованных соединений являются: 1) присутствие децильного радикала в составе ониевых групп; 2) пента- и гекса-метиленовые цепи между атомами азота ониевой

группы и N-гетероцикла.

3. Максимальное угнетение активности дегидрогеназ и липаз достигается при действии производных аллоксазина: дегидрогеназная активность S.aureus 209-р ингибируется на 60%, Candida albicans 885-653 - на 70%, липазная активность S. aureus 209-р ингибируется на 82%, С. albicans 885-653 - на 38%. Все исследованные соединения оказывают воздействие на биосинтез белка в клетках E.coli F 50.

4. Макроциклические и ациклические ониевые производные урацила относятся к категории веществ «умеренно токсичных» (мыши, внутрибрюшинно in vivo).

5. Исследованные соединения не проявляют гемолитических и генотоксических свойств in vitro.

6. Макроциклические и ациклические ониевые производные урацила могут быть рекомендованы к разработке в качестве антимикробных препаратов, как селективных в отношении грамположительных бактерий (макроциклические производные), так и обладающие более широким спектром действия (ациклические производные аллоксазина и урацила).

Публикации по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Zakharova, L. Ya. Amphiphilic macrocycles bearing biofragment: Molecular design as factor controlling self-assembly / L. Ya. Zakharova, V.E. Semenov, V.V. Syakaev, M.A. Voronin, D.R. Gabdrakhmanov, F.G. Valeeva, A.S. Mikhailov, A.D. Voloshina, V.S. Reznik, Sh. K. Latypov, A.I. Konovalov // A.I. Materials Science and Engineering. - 2014. -Vol. 38. - No. 1. - P. 143-150.

2. . Semenov, V.E. Antimicrobial Activity of Pyrimidinophanes with Thiocytosine and Uracil Moieties / V.E. Semenov, A.S. Mikhailov, A.D. Voloshina, N.V. Kulik, A.D. Nikitashina, V.V. Zobov, S.V. Kharlamov, Sh. K. Latypov, V.S. Reznik // Eur. J. Med. Chem.- 2011. Vol. 46. № 9. P. 4715 - 4724.

3. Николаев, A.E. Синтез и антимикробная активность пиримидинофанов содержащих один урациловый фрагмент и атом серы в мостике / А.Е. Николаев, В.Э. Семенов, А.Д. Волошина, Н.В. Кулик, B.C. Резник // Хим.-фарм. ж. - 2010. - № 3.- С. 21-24.

4. Семенов, В.Э. n-Толуолсульфонаты пиримидинофанов - водорастворимые пиримидинсодержащие макроциклы / В.Э. Семенов, Е.С. Романова, А.С. Михайлов, А.Д. Волошина, Н.В. Кулик, С.Ю. Уралева, А.В. Козлов, Ш.К. Латыпов, B.C. Резник // Журнал общей химии - 2009. - Т. -79 - № 1 - С. 138 -141.

5. Семенов, В.Э. Антимикробная активность пиримидинофанов, содержащих два урациловых фрагмента и атом азота в мостиках / В.Э. Семенов, А.Д. Волошина, Н.В. Кулик, С.Ю. Уралева, Р.Х. Гиниятуллин, А.С. Михайлов, В.Д. Акамсин, Ю.А. Ефремов // Хим.-фарм. ж. - 2009. - № 8 - С. 21 - 26.

6. Semenov, V.E. Antibacterial and antifungal activity of macrocyclic uracil derivatives with quarternized nitrogen atoms in spacers / V.E. Semenov, A.D. Voloshina, E.M. Toroptzova, N.V. Kulik, V.V. Zobov, R. Kh. Giniyatullin, A.S. Mikhailov, A.E. Nikolaev,

V.D. Akamsin, V.S. Reznik // Eur. J. Med. Chem. - 2006. - Vol. 41 - № 9 - P. 1093 - 1101.

7. Семенов, В.Э. Амфифильные пиримидинофаны и мультипиримидинофаны: синтез и антимикробная активность / Семенов, Р.Х. Гиниятуллин, А.С. Михайлов, А.Е. Николаев, А.Д. Волошина, Н.В. Кулик, В.В. Зобов, B.C. Резник // Первая Российская конференция по медицинской химии (MedChem Russia - 2013), 8-12 сентября 2013 г., Москва. - Тезисы докладов. - С. 139.

8. Nikolaev, А.Е. Dimeric pyrimidinophanes: synthesis and biological activity / A.E. Nikolaev, V.E. Semenov, R.Kh. Giniyatullin, A.D. Voloshina, V.S. Reznik // The 17th European Symposium on Organic Chemistry «ESOC 2011», 10 - 15 July 2011, Hersonissos, Crete, Greece. - Abstracts. - P. 53.

9. Nikolaev, A.E. Synthesis and antimicrobial activity of amphiphilic macrocycles and their acyclic counterparts / A.E. Nikolaev, V.E. Semenov, R.Kh. Giniyatullin, A.S. Mikhailov, A.D. Voloshina, N.V Kulik, V.V Zobov, V.S. Reznik // International Congress on Organic Chemistry, September 18 - 22, 2011, Kazan, Russian Federation. - Book of abstracts. - P. 358.

10. Nikolaev, A.E. Pyrimidinophanes as novel antimicrobial agents / A.E. Nikolaev, V.E. Semenov, A.D. Voloshina, R. Kh. Giniyatullin, V.V. Reznik // 47th International Conference on Medicinal Chemistry "Drug discovery and selection", 6-8 July 2011, Lyon, France. - Book of Abstracts. - P. 178.

11. Семенов, В.Э. Синтез и антимикробная активность амфифильных криптандоподобных и наноразмерных пиримидинофанов / В.Э. Семенов, Р.Х. Гиниятуллин, А.С. Михайлов, А.Е. Николаев, А.Д. Волошина, Н.В. Кулик, В.В. Зобов, B.C. Резник // Научно-практическая конференция «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения», 23 -28 мая 2011 г., п. Новый Свет, АР Крым, Украина. - Тезисы докладов. - С. 161.

12. Семенов, В.Э. Амфифильные пиримидинофаны и их ациклические аналоги: синтез и антимикробная активность / В.Э Семенов, Р.Х. Гиниятуллин, А.С. Михайлов, А.Е. Николаев, А.Д. Волошина, Н.В. Кулик, В.В. Зобов, B.C. Резник // Научно-практическая конференция «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения», 25 - 30 мая 2009 г., п. Новый Свет, АР Крым, Украина. — Тезисы докладов. - С. 165 - 166.

13. Семенов, В.Э. Амфифильные урацилсодержащие макроциклы и их ациклические аналоги: синтез и антимикробная активность / В.Э. Семенов, Р.Х. Гиниятуллин, А.С. Михайлов, А.Е. Николаев, А.Д. Волошина, Н.В. Кулик, В.В. Зобов, B.C. Резник // Научная конференции «Органическая химия для медицины (0рхимед-2008)», 7-11 сентября, 2008 г., Москва. - Тезисы докладов. - С. 233.

14. Nikolaev, А.Е. Pyrimidinophanes with heteroatoms in bridges: synthesis and biological activity / A.E. Nikolaev, V.E. Semenov, R. Kh. Giniyatullin, A.D. Voloshina, V.S. Reznik // International symposium «Advances in synthetic and medicinal chemistry», 27-31 August, 2007, St. Petersburg. - Abstracts. - P. 217.

15. Семенов, В.Э. Пиримидинофаны, содержащие атомы азота в мостиках: синтез и свойства / В.Э. Семенов, А.Е. Николаев, Р.Х. Гиниятуллин, O.A. Лодочникова, А.Д. Волошина, Л.Ф. Галиуллина, Ш.К. Латыпов, B.C. Резник // сб. Химия и биологическая активность синтетических и природных соединений, «Азотсодержащие гетероциклы», Москва: Издано Международным благотворительным фондом «Научное партнерство», МБФНП (ICSPF). - 2006 г., - Т,-1,-С. 450-452.

16. Семенов, В.Э. Антимикробная активность пиримидинофанов и изоструктурных им ациклических соединений, содержащих кватернизованные атомы азота в полиметиленовых мостиках / В.Э. Семенов, А.Д. Волошина, Е.М. Торопцова, Н.В. Кулик, В.В. Зобов, Р.Х. Гиниятуллин, А.Е. Николаев, B.C. Резник // сб. Новые лекарственные средства: успехи и перспективы. Уфа: Гилем, 2005 г., С. 203 - 204.

Подписано в печать 05.08.2015. Бумага офсетная. Печать цифровая. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Times New Roman». Усл. печ. л. 1,40. Уч.-изд. л. 0,16. Тираж 100 экз. Заказ 10/8

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства Казанского университета

420008, г. Казань, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел. (843) 233-73-59,233-73-28