Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экотоксикологическая характеристика нового класса ингибиторов холинэстеразтетраалкиламмониевых производных урацила на батарее биотестов

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Экотоксикологическая характеристика нового класса ингибиторов холинэстеразтетраалкиламмониевых производных урацила на батарее биотестов"

РГБ ОД

1 3 ДЕК 2303

На правах рукописи БЕРЕЗИНСКИЙ Леонид Александрович

ЭКОТОКСИКОЛОГ11ЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО КЛАССА ИНГИБИТОРОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗ -ТЕТРААЛКИЛАММОНИЕВЫХПРОЮВОДНЫХУРАЦИЛА НА БАТАРЕЕ БИОТЕСГОВ

Специачьность 03.00Л б - Экология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань 2000

Диссертационная работа выполнена в лаборатории химико-биологических исследований ИОФХ им. А.Е. Арбузова КНЦ РАН и на кафедре прикладной экологии Казанского государственного университета.

Научный руководитель: Кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Зобов В.В. Научный консультант: Доктор химических наук, профессор Латыпова В.З. Официальные оппоненты: Доктор биологических наук

Ведущее учреждение - Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, Борок

Защита диссертации состоится » 2000 г.

в Ч"Ь часов на заседании диссертационного совета К 053.29.24 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Казанского государственного университета.

Автореферат разослан «-¡Ъ » _2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Гайнутдинов Х.Л.'

Кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Сабиров P.M.

доктор химических наук, доцент

Евтюгин Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. К числу ведущих токсикантов окружающей среды относятся ингибиторы холинэстераз, составляющие основное ядро ядов сельско-хозяйственной (пестициды) и военной химии. В настоящее время холинэстеразы и их ингибиторы продолжают привлекать особое внимание ученых в связи с целенаправленным конструированием нового поколения высокоселективных пестицидов, малотоксичных для млекопитающих (Кабачник и др, 1965; Михельсон, Зеймаль, 1970; Резник и др., 1998). Кроме того, интенсивно производится поиск тест-объектов с целью создания альтернативных методов оценки эколого-токсикологической обстановки с привлечением представителей иных, нежели млекопитающие, таксономических групп (Тонкопий и др., 1993).

В конце 80-х годов в лаборатории химико-биологических исследований (ХБИ) Института органической и физической химии им. А.Е. Арбузова (ИОФХ) были синтезированы производные урацила, содержащие со-тетраалкиламмониевые группы при Ni и N3 атомах пиримидинового цикла, классифицированные, в дальнейшем, как новый класс необратимых и высокоселективных ингибиторов ацетилхолинэстеразы (АХЭ; НФ 3.1.1.7) (табл.1., формулы 1 и 3). Существенной особенностью их строения является наличие в составе молекулы урацильной структуры, с которой связывают антитоксические и адалтогенные и специфические свойства пиримидин-содержащих веществ по отношению к млекопитающим (Ани-киенко и др., 2000; Камилов и др., 1992).

Необычно высокий для ингибиторов АХЭ индекс безопасности (широта эффективного действия, ШЭД=ЛД5о/ЭД5о >30) в опытах in vivo на крысах (и мышах) позволяет рассматривать тетраалкиламмониевые производные 6-метилурацила в качестве перспективного класса агентов, на базе которых могут быть созданы высокоизбирательные пестициды, менее ток-

I т

сичные для млекопитающих, чем фосфорорганические соединения (ФОС) (Зобов и др., 1998). Поэтому весьма актуальной задачей является оценка токсикометрических характеристик этого нового класса ингибиторов хо-линэстеразы на батарее биотестов, составленной из представителей разных таксономических групп, входящих в природные экосистемы (от гидробио-нтов до млекопитающих).

Целью данной работы является определение биологической активности некоторых тетраалкиламмониевых производных урацила в батарее биотестов «гидробионты-млекопитающие».

В связи с этим решались следующие задачи:

1. Оценить острую токсичность известных холиноблокаторов, холиноми-метиков и антихолинэстеразных агентов методом биотестирования на лабораторной культуре Daphnia magna.

2. Дать сравнительную оценку острой токсичности тетраалкиламмониевых производных урацила на Daphnia magna и мышах; выявить зависимость «химическая структура - токсичность» в ряду химических гомологов.

3. Оценить острую токсичность наиболее активных тетраалкиламмониевых производных 6-метилурацила в батарее биотестов «Algotoxk.it F™ (Selenastrum capricornutum) - Rotoxkit F (Brachionus calyciflorus -Thamnatoxkit F (Thamnocephalus platyurus) - Protoxkit F™ (Tetrachyrnena thermojila) - лабораторная культура Paramecium caudatum».

4. Определить антиферментную активность 1,3-бис{ю-(диэтил-орто-нитробензиламмонио)пентил}-6-метилурацил дибромида (соед. № 547) в отношении холинэстеразы Daphnia magna.

5. Провести фармакологический анализ механизма токсического действия соед. № 547 на Daphnia magna с помощью холинотропных агентов с известным механизмом действия.

6. Определить параметры хронической и специфической токсичности различных концентраций (1/3-1/100 от ЛК50) соед. № 547 методом биотестирования на лабораторной культуре Daphnia magna.

Научная новизна работы, Впервые получена сравнительная ток-сикометрическая характеристика 28 представителей нового класса ингибиторов холинэстераз на батарее биотестов «гидробионты (водоросли, простейшие, коловратки, ракообразные) - млекопитающие (мыши)»: показано, что острая токсичность некоторых новых соединений на дафниях в 10000 раз уступает острой токсичности параоксона и в 5 раз - острой токсичности прозерина; показаны различия в требованиях к молекулярному устройству высокоэффективных представителей новых соединений на гидробионтах и мышах; выявлено, что взаимодействие одного из активных представителей ряда - соед. №547 с холинэстеразным и холинорецептор-ным аппаратом дафний не играет существенной роли в токсикогенезе. Определено место представителей нового класса ингибиторов холинэстераз в ряду известных холинотропных токсикантов: «параоксон (0.001 мкМУл) -прозерин (2.7 мкМ/л) - изученные тетраалкиламмонивые производные урацила (2.5 - 400 мкМ/л) - изо-ОМПА (1000 мкМ/л)».

Научно-практическая ценность. Проведенное в работе ранжирование изученных тетраалкиламмониевых производных урацила по уровню эколого-токсикологической опасности и определение приемлемых для биоты нормативных концентраций в природной среде может быть использовано при конструировании нового поколения высокоселективных пестицидов.

Результаты работы используются в учебном процессе экологического факультета КГУ при чтении общепрофессионального курса «Организм и среда» и специального курса «Экологическая токсикология».

Диссертация выполнена на базе лаборатории ХБИ ИОФХ и кафедры прикладной экологии Казанского государственного университета

(КГУ) в рамках госбюджетной темы «Развитие теоретических и прикладных основ экологического мониторинга» (№ ГР 0/98006937), а также по гранту АН РТ № 22-07/99 (Ф).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Классификация изученных представителей тетраалкиламмониевых производных урадила по степени их опасности для Daphnia magna и определение места этих соединений в ряду известных холинотропных агентов.

2. Характеристика связи «химическая структура - токсичность» в ряду тетраалкиламмониевых производных урацила на батарее биотестов «гидробионты-млекопитающие».

3. Анализ характера взаимодействия 1,3-бис{со-(диэтил-орто-нитробензиламмонио)пентил}-6-метилурацил дибромида (соед. № 547) с холинэстеразным и холинорецепторным аппаратом дафний.

4. Характеристика хронической и специфической токсичности 1,3-бис{сз-(диэтил-орто-нитробензиламмонио)пентил} -6-метилурацил дибромида (соед. № 547) в 4-х последовательных поколениях (P-F1-F2-F3) Daphnia magna.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на итоговой научной конференции ИОФХ КНЦ РАН (Казань, 1999), на итоговой научной конференции КГУ (Казань, 1999), VI и VII Всероссийских школах молодых ученых "Актуальные проблемы ней-робиологии" (Казань, 1999, 2000), IV и V Всероссийских научно-практических конференциях «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности» (Санкт-Петербург, 1999,2000).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация объемом 155 страниц состоит из введения, обзора литературы, 3 глав, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Список цитируемой литературы включает 220 источников, из них 135 - на иностранных языках. Диссертация содержит 27 рисунков и 11 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На лабораторной культуре Daphnia magna проводилась оценка параметров острой токсичности (ЛК50 при 24-48 часов наблюдения) следующих индивидуальных химических соединений: армин (Россия), прозерина метилсульфат (Россия), физостигмина салицилат (Россия), изо-ОМПА (Россия), ГД-42 (Россия), ацетилхолина хлорид (Sigma), карбахолина хлорид (Россия), d-тубокурарина хлорид (Orion), амизила гидрохлорид (Россия), атропина сульфат (Россия), дитилина дийодметилат (Россия), декаметония хлорид (Россия), 6-метилурацил (Россия), тетраэтиламмония бромид (ТЭА) (Россия).

Также на Daphnia magna была исследована острая токсичность moho-, бис-тетраалкиламмониевых производных урацила (всего 28 соединений) и тиофосфонового производного 6-метилурацила (соед. № 729), химические структуры приведены в таблице 1.

Оценка острой токсичности синтезированных производных урацила проводилась на 780 белых беспородных мышах обоего пола массой 17-22 грамм при внутрибрюшинном (в/'б) способе введения.

Биотестирование эффективности некоторых из синтезированных производных урацила проводилась на: I) ракообразных - Daphnia magna (лабораторная культура) и Thamnocephalus platyurus (Thamnotoxkit F) (Методика определения..., 1999; РД, 1991; Thamnotoxkit F, 1995); 2) водорослях - Seíenastrum capricornatum (Algotoxkit F™, 1996); 3) простеиших -Paramecium caudatum (лабораторная культура) и Tetrachymena thermofila

(Prototoxkit F™) (РД, 1991; Prototoxkit F™, 1998); 4) коловратках - Bra-chionus calyciflorus (Rotoxkit F, 1999).

При проведении экспериментов на гидробионтах использовалась «биологизированная» аквариумная вода с оптимальным рН, населенная биотой и насыщенная кислородом (Методика выполнений ...,1997).

Опыты по определению хронической токсичности соед. №547 проводили на лабораторной культуре Daphnia magna в возрасте до 24 часов в стандартных условиях (РД, 1991).

Исследование влияния соед № 547 на активность АХЭ гомогената Daphnia magna проводилось по методу Эллмана.(Е11шап et al, 1961). Концентрация белка в пробе определялась по методу Брэдфорда (Bradford et al, 1976).

Для определения острого токсического действия рассчитывали ЛК(Д )50 [Е(1)С5о] и ее доверительные границы (CL - confidence limits). Расчет проводился методом Литчфилда-Уилкоксона в модификации Рота (Беленький, 1963) с помощью специального пакета программ статистической обработки данных на ПЭВМ. Для определения достоверности различий средних значений двух выборок использовали t-критерий Стьюдента с уровнем значимости р<0.05. Статистическую обработку производили с помощью программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Оценка острой токсичности известных холинотропных агентов на дафниях и мышах. Перед исследованием биологической активности представителей нового класса ингибиторов холинэстераз нами была проведена серия экспериментов по установлению токсикометрических параметров известных ингибиторов холинэстераз, холиномиметиков и холинолитиков на Daphnia magna. Данный этап исследования был предпринят нами с целью определения места тетраалкиламмониевых произ-

водных урацила в ряду известных токсикантов и классификации уровня их относительной эколого-токсикологической опасности (рис.2.).

Симптоматика поражения Daphnia magna всеми изученными ингибиторами холинэстераз (в том числе производными урацила), а также хо-линомиметиками концентрационно-зависима и в целом аналогична наблюдаемой на мышах - гиперактивность, иммобилизация и последующая гибель. Уровень токсичности холиномиметиков (анабазин, цитизин, ацетилхолин, карбохолин и лобелии) значительно ниже токсичности ингибиторов холинэстеразы (ЛК5048= 2,7-120.0 мкМ/л и Ж5048= 0,0005-0,78 мкМ/л, соответственно). На действие холинолитиков дафнии реагировали иммобилизацией без «судорожной» стадии; различий в эффективности Мили Н-холинолитиков не отмечалось.

Результаты сравнительного анализа токсикометрических данных, полученные в рядах известных холинотропных агентов (ингибиторы холинэстераз, холиномиметики, холинолитики, п=27 шт.) на дафниях и мышах, показали отсутствие корреляции между ними.

Полученные результаты сравнительно-токсикологического исследования позволяют следующим образом выстроить относительную шкалу среднесмертельных концентраций (JIKso48) изученных агентов: «параоксон (Ж5048=О.ОООЕ мкМ/л ) - дихлофос (JIK5o48=0.0018 мкМ/л ) - прозерин (ЛК5о48=2.7 мкМ/л) - декаметоний (JIK5048=17.2 мкМ/л ) - атропин (ЛК5048=3 3 5.8 мкМ/л ) - изо-ОМПА (Ш5048=9}5.2 мкМ/л)».

Оценка острой токсичности тетраалкиламмониевых производных урацила на дафниях и мышах. Элементарные структурные составляющие соединений - 6-метилурацил, тетраэтиламмония бромид (ТЭА), а также бис-триэтилпентиламмониевое производное 6-метилурацила (соед. А-1) практически нетоксичны для дафний - Ж5о48>1 г/л (8000.0 мкМ/л), ЛК5048=

957.0 (730.0 - 1263.0) мкМ/л и ЛК5048= 935.0 (719.0 - 1215.0) мкМ/л, соответственно.

Замена двух этильных радикалов в бис-триэтилпентиламмониевом производном 6-метилурацила (соед. А-1) на два бензильных (соед. № 416, табл. 1.) ведет к увеличению токсичности на дафниях в 10 раз, на мышах среднесмертельные дозы достоверно не различимы (р<0.05) (табл.1.).

Анализ результатов, приведенных в таблице 1, показывает, что наиболее токсичными на дафниях оказались соединения, имеющие в бензиль-ном радикале орто-МОг заместители.

Кроме того, при увеличении длины полиметиленовой цепочки в 5-ом положении урацилового цикла с К2=Н (соед. №547) до С4Н9 (соед. №858), СюН21 (соед. №846) и С^Нзз (соед. №853) отмечена тенденция к увеличению токсичности до 2-7 крат по сравнению с токсичностью соед. № 547. Вероятно, это связано с широко известным феноменом повышения общей липофильности и токсичности молекулы при введении углеводородных радикалов (Альберт, 1989), что влечет за собой «пробой» гисто-гематического барьера дафний и рост общетоксических нарушений непосредственно в биофазе.

Переход от ароматического 6-метилурацилового цикла в молекуле соед. № 547 к деформированной плоскости барбитурового цикла в молекуле соед. № 716 не сопровождается достоверным изменением токсичности соединения как на дафниях, так и на мышах (табл. 1., формула 1.). Токсичность на мышах в противоположность данным, полученным на дафниях, с увеличением длины полиметиленовой цепочки уменьшается в ряду: соед. № 547 (ЛД50= 1.2 мкМ/кг) - соед. № 858 (ЛД50= 1.3 мкМ/кг) -соед. № 846 (ЛД50=1О.8 мкМ/л) - соед. № 853 (ЛД50= 39.7 мкМ/кг) (табл.1.).

Таким образом, анализ результатов биотестирования выявил существенные расхождения в требованиях к молекулярному устройству бис-четвертичных соединений, токсичных на дафниях и на мышах. Средне-

смертельные концентрации всех изученных бисчетвертичных структур (21 соединение) для дафний находятся в диапазоне 2.5 - 404.9 мкМ/л; средне-смертельные дозы этих же соединений для мышей изменяются в диапазоне 0.80 - 39.7 мкМ/кг и находятся на уровне прозерина и эзерина - ЛД50=2.3 и 3.9 мкМ/кг соответственно.

Изученные 3-(со-бензилдиэтиламмонио-алкил)урацилы несколько уступали токсичности своих 1-са-бензилдиалкиламмониоалкильньк аналогов. Их токсичность характеризуется ЛД50=54.0-94.0 мкМ/л (табл.1., формулы 2 и 3).

Наиболее важное наблюдение при сравнении двух групп моно-ониевых структур заключается в том, что различие в токсичности соед. № 627 и № 857 для дафний статистически недостоверно (при р<0.05), тогда как для мышей наблюдается существенная (23-кратная) разница в средне-смертельных дозах данных соединений (та6л. 1.). Также следует отметить, что токсичность моно-ониевых производных 6-метилурацила №№ 627 и 857 в 3.2 -3.4 раза уступает токсичности их бис-ониевого аналога - соед. №547 на дафниях. Таким образом, местоположение тетраалкиламмониевой группировки при N[ или N3 атомах урацилового цикла не имеет значения для токсичности соединений на дафниях и весьма существенно для токсичности соединений на мышах.

Среднесмертельные концентрации всех семи изученных моно-ониевых производных урацила на дафниях находятся в диапазоне 43.4 -228.5 мкМ/л, среднесмертельные дозы этих же соединений на мышах находятся в диапазоне 2.3 -60.3 мкМ/кг.

Соед. № 729, имеющее вместо бензилдиэтилпентиламмониевого фрагмента в Из-положении урацилового цикла тиофосфоновой фрагмент, проявило на дафниях существенно более высокую токсичность, чем любой из изученных нами бис- или моно-ониевых производных урацила (табл. 1). Так, токсичность соед. № 729 характеризуется величиной ЛК5о48=0.012

мкМ/л, что в 200 - 650 раз токсичнее самых активных тетраалкиламмоние-вых производных урацила (соед. №№ 858, 846, 853), имеющих Ж5048=2.5 -7.7 мкМ/л. Возможно, это связано с более высокой липофильностью тио-фосфоновой головки, обеспечивающей высокую проникающую способность соединений через систему гисто-гематических барьеров дафний (Тонкопий и др., 1993; 1994).

Таблица 1.

Химическое строение тетраалкиламмониевых производных урацила и их токсичность на D. magna и мышах

Формула 1.

О2Н5

J.+ „

CjHs \

R

Формула 2.

N-СНз

Вг"

с2н5 \

Формула 3. 5 ¿Hs

№ п.п. формула Ri R2 R ЛК^4* на D.magna (мкМ/л) ЛД50 на мышах (икМ/кг)

А1 1 0 X f| (CHjii-N'-CiHs HjG—11 J=0 С2Н5 N Cft 1 I* (CHjJr-Ni-CjHs -2Вг CjHi 935.0 (719.0-1215.0) 1.7 (1.3 - 2.2)

416 I CH3 н н 95.0(72.5-124.4) 2.0(1.5 + 2.6)

547 I CHj н O-Nch 18.7(14.6 + 23.9) 1.2(0.9+ 1.5)

558 1 СНз н о-Вг 19.4 (13.8 + 27.4) 1.1(0.8 + 1.5)

716 н*, I i2"' /Рл HjCt-V^N—(CHJs-N^-CHj-/ у 0=L J=0 СаН, ^^ т if 29.3 (22.4 + 38.4) 2.6 (1.9 + 3.3)

731 г Н н o-CN 186.6(130.5+266.8) 1.9(1,3 + 2.7)

732 I Н н O-N02 79.7 (60.4 + 105.3) 1.9 (1.1 + 2.5)

735 I СН3 н 0-1 22.6(15.0 + 33.8) 2.0(1.3 + 2.9)

736 I СНз Bz о-ЫОг 11.4(9.4+13.8) 1.1 (0.8+1.2)

738 I СНз н o-CN 200.7(147.6 + 273.0) 1.5(1.1 + 2.0)

Окончание таблицы 1

744 I Н СК т-СЫ 205.1 (145,4 + 289.1) 1.4(1.0 + 2.0)

746 I Н Е т-СЫ 103.4 (78.9+135.5) 2.0(1.5 + 2.6)

792 1 X I2"5 /ГЛ ^ >=0 С2Н5 ^ 404.9 (309.1 +530.4) 8.1 (6.2 + 10.6)

805 I СНз Н о-БСМ 113.4 (80.4 + 160.0) 3.4 (2.4 + 4.3)

809 I СНз Н р-ЭОг И 49.4(37,4 + 65.2) 3.2 (2.4 + 4.3)

821 I СНз Н 3,4 (-СН20-) 117.3 (82.1 + 167.8) 1.0(0.7+1.5)

822 I 0 I 'гН) Ул Н3С-^ ^¡=0 ¿¡н5 У сн, 0 ¿Л м=/ 279.0(218.0 + 357.0) 10.5 (8.2+13.4)

834 I СН30 Н о-К02 137.5(107.4 + 176.0) 0.8 (0.6+1.0)

858 I СНз С4Н9 £>-N02 7.8(6.0+10.1) 1.3(1.0+ 1.7)

846 1 СНз С10Н21 о-КОг 4.0(3.1+5.2) 10.8(8.3+14.0)

853 I СНз С,6Нзз о-ЫОг 2.5(2.0 + 3.2) 39.7 (31.1+50.9)

627 II СНз Н о-ЬГОг 58.9(44.6 + 77.7) 60.3 (45.7-79.6)

711 II 0 II N1—СНз (СН2)е—N1—СНг—$ \ С2Н5 228.5(159.8 + 326.8) 4.8 (3.4 + 6.9)

849 И СНз С1 £>-N02 96.0(72.6+126.6) 15.0(11.4 + 19.9)

859 II СНз Вг о-К02 43.4(31.0 + 60.7) 26.0(18,6 + 36.4)

857 III СНз Н о-М02 64.3 (47.3 + 87.5) 2.6(1.9 + 3.6)

864 III СНз Н 2-Е б-ко2 94.2(71.3 + 124.3) 2.3(1.8 + 3.1)

865 III СНз Н 2-Н0г 54.1 (38.4 + 76.3) 3.7(2.6 + 5.2)

729 0 X Гз [{^у—(СНЛ-З—Р-ОС.Н, * ¿и, 0.012 (0.009 + 0.015) 0.72 (0,56 +0.92)

Проведенный корреляционный анализ токсикометрических характеристик тетраалкиламмониевых производных урацила на дафниях и мышах выявил отсутствие корреляции и диаметрально различные структурные требования к молекулярному устройству молекул, токсичных для представителей данных таксономических групп животных (рис. 1.).

Соед. №547 (одно из наиболее эффективных соединений для млекопитающих) и соед. №853 (наиболее токсичное соединение на дафниях) приближаются по уровню токсичности на дафниях к ониевому карбамату прозерину, в 3.500 - 25.000 раз уступая токсичности параоксона (рис. 2.).

500

400

300

200

^ 100

10

-0.0856Х +98.117

И!-0.0002

20

30 40

ЛД50 мыши (в/6)

50

60

70

А

*

А

Рис. 1. Сопоставление величин Ж5048 дафний и ЛД50 мышей (в/б) 28 новых тетраалкиламмониевых производных урацила

р

* 0.1 ■

5 X • я

! й I 1

штrf

Рис. 2. Токсичность некоторых представителей тетраалкиламмониевых производных урацила (соед. № 547 и № 853) в ряду известных холинотропных агентов на дафниях

Токсикологическая классификация нового класса ингибиторов холи-нэстераз. По уровню токсичности на дафниях тетраалкиламмониевые производные урацила можно условно разделить на 3 группы по классификации H.L.Brooks (Brooks et al., 1973) (рис. 2., рис. 3.):

В 1-ю группу практически нетоксичных соединений (уровень d-тубокурарина с ЛК5048=175.4 мкМ/л) входят бис-ониевые структуры с тет-раэтильными радикалами (соед. А-1, табл. 1.) и с а-пиридил-К-оксидными циклами (соед. № 792 и № 822, табл. 1.) при ониевых головках.

Во 2-ю группу малотоксичных соединений (уровень декаметония с ЛК504^=17.2 мкМ/л) входит подавляющее большинство изученных нами производных урацила.

В 3-ю группу умеренно токсичных соединений (уровень прозерина с ЛХ5048=2 . 7 мкМ/л) входят бис-ониевые структуры с длинными алифатическими и объемными заместителями в 5-м положении 6-метилурацилового цикла. По результатам опытов на мышах эти же соединения также относятся к умеренно токсичным (Измеров и др., 1973).

дафнии 48 ч. ■ мыши

Рис. 3. Токсичность изученных соединений на дафниях (1/ЛК5048) и мышах (1/ЛД50).

Хроническая токсичность соединения № 547 на дафниях. Были изучены эффекты длительного действия малых концентраций соед. № 547, кратных долям 1/100, 1/20, 1/10 и 1/3 от Ж5о24==22Л мкМ/л., составляющие 0.2 мкМ/л, 1.2 мкМ/л, 2.4. мкМ/л и 6.0 мкМ/л соответственно.

По мере увеличения концентрации соед. № 547 выживаемость дафний в ряду последовательных поколений падает. В родительском поколении (Р) она составляет 90%, 80%, 60% и 10% при концентрациях 0.2 мкМ/л, 1.2 мкМ/л, 2.4 мкМ/л и 6.0 мкМ/л, соответственно. В первом поколении (Fi) выживаемость составляет 90%, 60%, 50% и 10%, во втором (F2) - 80%, 55%, 45% и 10%, а в третьем (F3) - 85%, 50%, 20% и 0 %. В концентрации 0.2 мкМ/л (1/100 от ЛК50М) соед, № 547 не влияет на выживаемость дафний во всех изученных поколениях (P-F^Fr-Fj).

В условиях однократной затравки соед. № 547 в концентрациях 1.2, 2.4 и 6.0 мкМ/л только одного родительского поколения (Р) изменения плодовитости дафний в ряду Р—F)—F2—F3 отличаются от контрольных показателей ASTM (Annual Book..., 1993) в прямо-пропорциональной зависимости от величины действующей концентрации. В режиме постоянной затравки соед. № 547 всех 4-х поколений дафний подавление плодовитости рачков в ряду поколений P-F1-F2-F3 значительно более выражено. Концентрация 0.2 мкМ/л не влияет на плодовитость дафний во всех изученных поколениях - P-F1-F2-F3, оставаясь на уровне контрольных 60-70 экз/самку.

Таким образом, концентрация 0.2 мкМ/л (1/100 от Ж5024) для соед. №547 может считаться безопасной (NOEC) для дафний, т.е. не влияющей в условиях длительной затравки на выживаемость и плодовитость в ряду 4-х поколений.

Влияние соед. №547 на активность АХЭ гомогената Daphnia magna.

Концентрация, угнетающая активность АХЭ гомогената дафний на 50% -

Iso =188 мкМ/л, а, по полученным на дафниях в острых экспериментах данным, значение токсичности соед. № 547 ЛК5024=22.1 мкМ/л.

Величина соотношения IjoAUKjo является характеристичной, и для высокотоксичных ингибиторов холинэстеразы паратиона, дихлофоса, ал-дикарба на дафниях составляет 0.26, 0.73 и 0.42, соответственно (Sturm, Hansen, 1999). Т.е. ингибирование фермента предшествует и, вероятно, является причиной гибели дафний. В случае соед. № 547, его среднесмер-тельная концентрация в 8.5 раз меньше концентрации, ингибирующей АХЭ дафний на 50% in vitro - соотношение 15о/ЛК5о=8.5, т.е. ингибирование фермента развивается уже после гибели дафний и, вероятно, не является ее причиной. Эффективность взаимодействия 1,3-бис[со-(диэтил-орто-нитробензиламмонио) пентил]-6-метилурацил дибромида (соед. № 547) с АХЭ Daphnia magna (k2=L.2xl02 М^мин'1) в 1000000 раз ниже эффективности взаимодействия с АХЭ эритроцитов быка (k2=6,4xlOs М"'мин'') и в 1000 раз ниже эффективности взаимодействия с БуХЭ сыворотки крови лошади (к2=4.9х104 М"'мин'') (Аникиенко и др., 2000; Резник и др., 1998).

Фармакологический анализ механизма токсического действия соед. №547 на дафниях. В качестве эффекта регистрировали острую токсичность (ЛКИ) за 24 часа контакта дафний с композицией «агент + соед. №547».

Атропин в диапазоне концентраций 1/7-1/280 от ЛК5048, d-тубокурарин в диапазоне концентраций 1/6-1/240 от ЛК5048> а также селективный ингибитор БуХЭ изо-ОМПА в диапазоне концентраций 1/2.5 -1/200 от ЛК5048 не влияют на токсичность соед. № 547 на дафниях. Соед. №547 в диапазоне концентраций 1/2.5-1/80 от Ж5048 не изменяет токсичности гидролизуемого холинэстеразами миорелаксанта дитилина. Это можно интерпретировать как свидетельство отсутствия у соед. № 547 спо-

собности ингибировать холинэстеразу дафний до физиологически (функционально) значимых для выживания величин.

Оценка острой токсичности некоторых ониевых производных 6-метилурацила на батарее биотестов «гидробионты-млекопитающие».

В батарею биотестов вошли стандартные лабораторные культуры Paramecium caudatum и Daphnia magna, а также коммерческие наборы микро-биотестов (предоставлены к.б.н. Н.Ю.Степановой) «Algotoxkit F™ (Selenastrum сарпсогпишт-оддошеточная водоросль)», «Protoxkit F™ (Tetrachymena thermofila-простейшее), «Rotoxkit F (Brachionus calyciflorus-коловратка)», «Thamnatoxkit F (Thamnocephalus platyurus-пресноводный рачок)».

В качестве модельных соединений нами были избраны: (1) соед. № 547, как одно из наиболее эффективных на млекопитающих и умеренно-токсичное на дафниях, (2) соед. № 858, № 846 и № 853, как наиболее токсичные на дафниях, (3) соед. № 627 и № 857 - моно-ониевые аналоги соед. № 547, показавшие на мышах существенную разницу в уровнях токсичности (23 крат).

Наименее токсикорезистентным видом к соед. № 547, № 858, № 846, № 853 оказалась пресноводная коловратка Brachionus calycifloriis (табл. 2.). Наиболее резистентными к соед. № 547, № 858, № 846, а также JVk 853 оказались инфузории Paramecium caudatum и Tetrachymena thermofila, соответственно.

Из таблицы 2 видно, что при увеличении длины полиметиленовой цепочки в 5-ом положении урацилового цикла с R2=H (соед. № 547) до С4Н9 (соед. № 858), СюНп (соед. № 846) и Ci6H33 (соед. № 853) на гидро-бионтах (водоросли - 1 вид, простейшие - 2 вида, коловратки - 1 вид коловратки, ракообразные - 2 вида) отмечена четкая тенденция к увеличению токсичности до 7-21 крат по сравнению с токсичностью соед. № 547.

Таблица 2.

Токсичность некоторых бис- и моно- ониевых производных 6-метилурацила (95% СЬ, п=6 опытов) на различных

микробиотестах и мышах

№ 547 №858 №846 №853 №627 №857

ТЬатпоЮхкП Б ЛК5024, мкМ/л 24.5 20.1-29.3 13.8а 9.8-17.6 0.8° 0.7-1.2 0.2" 0.1-0.4 64.8 56.7-72.3 68.7 60.1 -75.4

Б. та§па ЛК5048, мкМУл 18.7 14.6-23.9 7.8а 6.0-10.1 4.0° 3.1-5.2 2.5В 2.0-3.2 58.9 44.6 - 77.7 64.3 47.3 - 87.5

Рго1охк*Рш 1С50г\ мкМ/л 74.7 47.2 — 117.2 15.1а 11.3-19.8 10.4Ь 5.2-15.7 4.4" 1.2-7.8 203.3 175.4-231.7 197.1 168.2-229.4

Р. caudatuш ЕС501, мкМ/л 159.7 101.5 — 207.8 87.7а 68.1 - 103.2 20.1° 14.7 - 25.3 нет нет нет

ЯоЮхкк Р Ж5024, мкМ/л 1.6 1.1 - 1.9 0.9а 0.5-1.2 0.4° 0.3 - 0.6 0.2" 0.1-0.3 193.6 167.5-227.3 207.2 181.3-241.1

Л1§аЮхккР1М 1С5072, мкМ/л 4.8 2.0-7.3 2.7а 1.1-3.2 0.4° 0.2 - 0.6 0.2" 0.1-0.3 13.8 8.7-20.3 11.8 6.3 - 17.7

Мыши ЛД50, мкМ/кг 1.2 0.9- 1.5 1.3 1.0- 1.7 10.8° 8.3-14.0 39.7" 31.1-50.9 60.3 45.7-79.6 2.6Г 1.9-3.6

а - значимое различие (р<0.05) между №547 и №858; - значимое различие (р<0.05) между №858 и №846; 8 - зна-

чимое различие (р<0.05) между №846 и №853;г - значимое различие (р<0.05) между №627 и №857; нет - нет данных

Это свидетельствует о тесной связи между липофильными свойствами молекул с длинными углеводородными радикалами и их токсичностью для гидро-бионтов.

По данным таблицы 2 видно, что на гидробионтах разница между уровнями токсичности соед. № 627 и № 857 отсутствует (р<0.05), тогда как на мышах это различие 23 кратное. Следовательно, молекулярная организация биомишеней, с которыми взаимодействуют изученные моно-ониевые производные 6-метилурацила у гидробионтов и у млекопитающих существенно отличается.

ВЫВОДЫ

1. Охарактеризована биологическая активность нового класса селективных ингибиторов ацетилхолинэстеразы (НФ 3.1.1.7) - 28 тетраалкиламмоние-вых производных урацила и 6-метилурацила на батарее биотестов «гидро-бионты - млекопитающие». Показано, что острая токсичность 28 изученных моно- и бис-тетраалкиламмониевых производных урацила на Daphnia magna находится в диапазоне ЛК5048 чассв = от 2.5 до 400.0 мкМ/л («нетоксичные-умеренно-токсичные агенты» по H.L. Brooks). Исключительно высокую острую токсичность на Daphnia magna проявляет фосфо-рорганическое тиофосфоновое производное 6-метилурацила с ЛК5048 = 0.01 мкМ/л.

2. Острая токсичность (1/ЛК50) известных холинотропных агентов на лабораторной культуре Daphnia magna возрастает в ряду (в мкМ/л): «изо-ОМПА (ЛК5048=915.2) - атропин (ЛК5048 =335.8) - d-тубокурарин (Ж5048 =175.4) — дитилин (ЛК5048=18.б) - декаметоний (Ж5048=17.2) — карбахо-лин (ЛК5048=5.5) - прозерин (ЛК504 -2.7) - эзерин (ЛК5048=0.57) - параок-сон (ЛК5048=0.0008)».

3. Максимальную острую токсичность на лабораторных культурах Daphnia magna, Paramecium caudatum, а также на коммерческих тест-наборах «Algotoxkit F™ (Selenastrum capricornutum)», «Protoxkit F™ (Tetrachymena thermofila), «Rotoxkit F (Brachionus calyciflorus)», «Thamnatoxkit F (.Thamnocephalus platyurus)» в ряду изученных гомологов 6-метилурацила проявляют бис-тетраалкиламмониевые структуры с длинными (Сю, С16) алифатическими заместителями в 5-м положении 6-метилурацилового цикла, а именно, соед. № 846 и № 853 с JIKjo48 от 0.2 до 20.1 мкМ/л.

4. Моно-тетраалкилламмониевые структуры (соед. № 627 и № 857) с аммо-ниоалкильными фрагментами при Nj и N3 атомах 6-метилурацилового цикла проявляют на Daphnia magna идентичную токсичность (ЛК5о48 час=5 8.9-64.3 мкМ/л); на белых мышах их токсичность различается в 23 раза (ЛД5о = 60.3 и 2.6 мкМ/кг, соответственно).

5. Требования к молекулярному устройству активных на Daphnia magna тет-раалкиламмониевых производных урацила отличны от таковых на мышах; корреляция токсикометрических данных на Daphnia magna и мышах отсутствует.

6. Наибольшую чувствительность к ряду бис-тетраалкиламмониевых структур (соед. N° 547, № 858, N° 853 и № 846) демонстрируют пресноводная коловратка (Brachionus calyciflorus) и одноклеточная водоросль (Selenastrum capricornutum). Наименьшая чувствительность характерна для простейших (Tetrachymena thermofila и Paramecium caudatum. Чувствительность пресноводных рачков (Daphnia magna и Thamnocephalus platyurus) занимает промежуточное положение.

7. Эффективность взаимодействия 1,3-бис[ш-(диэтил-орто-нитробензиламмонио) пентил]-6-метилурацил дибромида (соед. № 547) с АХЭ Daphnia magna (k2=1.2xl02 M'Wh'1) в 1000000 раз ниже эффектов-

ности взаимодействия с АХЭ эритроцитов быка (к2=6.4х108 М"'мин"') и в 1000 раз ниже эффективности взаимодействия с БуХЭ сыворотки крови лошади (к2=4.9х104 М'Чшн'1). Агенты с холинотропным механизмом действия (атропин, d-тубокурарин, дитилин, изо-ОМПА) не влияют на токсичность соед. № 547 на Daphnia magna.

8. Величина NOEC соед. № 547 составляет 0.2 мкМ/л (1/100 от JIK5024) и характеризуется отсутствием эмбриотоксических эффектов в 4-х последовательных поколениях Daphnia magna (P-F1-F2-F3).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зобов В.В., Березинский Л.А., Резник B.C. Исследование токсичности представителя нового класса ингибиторов ацетилхолинэстеразы (соед. № 547) на Daphnia magna /Труды 4-й Всерос. научно-практ. конф. «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности». СПб. - 1999. - Т.З. -С. 282.

2. Березинский Л.А., Зобов В.В., Резник B.C. Оценка эффективности производных нового класса ингибиторов холинэстераз на дафниях и мышах/Тезисы докл. на VI Всерос. школе молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии». - Казань. 1999. - С. 34-36.

3. Березинский Л.А., Зобов В.В. Изучение холинергических агентов на Daphnia magna Straus // Вестник Татарстанского отделения Российской экологической академии. - 1999. - №2, С. 35-36.

4. Степанова Г.С., Зобов В.В., Петрова Л.М, Латыпова В.З., Березинский Л.А, Романов А.Г., Степанова Н.Ю. Исследование токсичности химических поллютантов на Daphnia magna (Straus) Ч Токсикологический Вестник. - 1999. - №3. - С.22-27.

5. Березинский Л.А., Зобов В.В., Акамсин В.Д., Галяметдинова И.В. Фармакологический анализ токсичности соединения № 547 на Daphnia magna / Тезисы докл. на VI Всерос. школе молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии».- Казань. 2000. - С. 26-27.

6. Березинский Л.А., Степанова Н.Ю., Зобов В.В., Акамсин В.Д. Биологическая активность производных нового класса ингибиторов холинэ-стераз на батарее микробиотестов / Тезисы докл. на VI Всерос. школе молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии». - Казань. 2000. - С. 27-28.

7. Березинский Л.А., Зобов В.В., Латыпова В.З., Резник B.C. Токсичность тетраалкиламмониевых производных 6-метилурацила на Daphnia magna (S) и мышах. / Труды 4-й Всерос. научно-практ. конф. «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности». СПб.- 2000. - Т. 2. - С. 297.

8. Березинский Л.А., Зобов В.В,, Латыпова В.З., Акамсин В.Д. Токсичность представителей нового класса высокоселективных ингибиторов ацетилхолинэстеразы на Daphnia magna (Straus) и мышах. // Вестник Татарстанского отделения Российской экологической академии, 2000. -№3. - С.33-35.

9. Зобов В.В., Березинский Л.А., Бузукина И.В., Резник B.C., Акамсин В,Д., Галяметдинова И.В., Латыпова В.З. Токсичность нового тетраал-киламмониевого производного 6-метилурацила (соед. № 547) на Daphnia magna и млекопитающих // Экологическая химия, 2000 . -Т.9 - №3.