Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Селекция продуцентов тимина и тимидина у BREVIBACTERIUM AMMONIAGENES и BACILLUS SUBTILIS

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Селекция продуцентов тимина и тимидина у BREVIBACTERIUM AMMONIAGENES и BACILLUS SUBTILIS"

• ; ■ ■ t ■ '-' и

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

ГАРИБЯН-Араик Генрикович

03.00.15 - Генетика

СЕЛЕКЦИЯ ПРОДУЦЕНТОВ ТИМИНА И ТИМИДИНА У BREVIBACTERIUM AMMONIAGENES И BACILLUS SUBTILIS

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Научные руководители

доктор биологических наук, профессор

Г.И. Бурд

кандидат биологических наук

А.А. Нудлер

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Д.А. Перумов

кандидат биологических наук

А.С. Миронов

Ведущая организация - кафедра генетики биологического

14 час. на заседании Специализированного Совета Д 098.12.U1 при ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, г.Москва, 1-й Дорохный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов. Автореферат разослан "/'/ " 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

кандидат биологических наук В.И. Щербакова

факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации

1992 г. в

< ;

' лн-г . . ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследование микробиологического синтеза дезоксинуклеозидов приобретает в последние годы все более важное теоретическое и практическое значение. Повышенный интерес к производным пиримидинового ряда объясняется не только их особой ролью в важнейших процессах развития и жизнедеятельности клетки, но и значительным расширением аспектов их применения в медицине и химической промышленности, а также в различных сферах экспериментальной биологии. Эти соединения, обладая высокой метаболической активностью, имеют большие перспективы использования в медицине как средства метаболической терапии. Они служат основой для создания антиметаболитов, лекарственных препаратов антимикробного и антиканцерогенного действия. В связи с этим все острее и актуальнее становятся вопросы их практического получения. Так например, тимидин служит как стартовый материал для синтеза азидотимидина. Азидотимидин обладает противоретровирусной активностью и на сегодняшний день является самым эффективным средством против такой болезни как СПИД (РЫзЬеН, 1987). Ценность азидотимидина также заключается в том, что он используется как средство антиканцерогенного действия (Ногу^з, 1964). Азидотимидин применяется как средство профилактики против СПИДА, (БЫгег, 1987) что определяет большие масштабы его производства. Познание механизмов биосинтеза нуклеотидов и нуклеозидов представляет несомненный теоретический и практический интерес, так как создает предпосылки для направленного изменения регуляции клеточного метаболизма и управления процессом биосинтеза.

Объектами наших исследований служили аденинзависимые штаммы Вгеу1Ьаогег1иш ammoniagenes и штаммы ВасШиз зиЫ;111з, несущие ауксотрофности по аденину, гистидину и тиразину.

Целью настоящей работы являлось получение высокоактивных штаммов-продуцентов тимина и тимидина на основе разработки и применения селективных методов отбора мутантов Вг. атлюп1аяепез и В. виЬЪШз. Поскольку метаболизм пиримидинов у В.атлюп1агепез изучен недостаточно, представляло интерес исследование некоторых метаболических реакций и путей усвоения экзогенных пиримидиновых предшественников нуклеиновых кислот. С этой целью необходимо было выделение и подробное изучение различных классов мутантов, резистентных к аналогам пиримидинов, что

- 2 -

помогло подойти к решению селекционных задач.

Научная новизна работы заключается в следующих аспектах:

1) Разработаны селективные методы отбора высокоактивных мутантных штаммов - продуцентов производных тимидилата.

2) На основе изучения различных классов мутантов с нарушенными путями метаболизма пиримидинов и приминения структурных аналогов пиримидиновьл оснований и нуклеозидов введен ряд дополнений в схему метаболизма пиримидинов для культуры Br. ammoniagenes, в значительной степени отличающейся от таковой у классических объектов: Esherichia coli, Salmonella typhimurium и В. subtilis. Описана новая ферментативная активность, учавствующая в катаболизме тимидина у В. ammoniagenes.

3) Выделены и описаны мутанты, резистентные к ультрафиолету. УФ лучи использованы как селективный фактор, с помощью которого получены мутанты продуцирующие тимин и тимидин.

Практическая ценность. На основе разработанных нами методов селекции у культуры Br. ammoniagenes и В. subtilis выделены мутанты продуценты тимина, уридина и тимидина.

На штамм Br. ammoniagenes NG - 339 получено авторское свидетельство N 4695294.

На штамм В. subtilis подана заявка на получение авторского свидетельства.

Апробация Результаты работы докладывались на лабораторном семинаре, семинаре отдела прикладной генетики 1991 г. Публикации По теме диссертации опубликовано две работы, получено авторское свидетельство, подана заявка на авторское свидетельство.

^труктура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы 58 стр, экспериментальной части 50 стр, результатов 21 стр, выводов 1 стр. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 18 рисунков, 7 таблиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили мутантные штаммы Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872, Bacillus subtilis 168 и их производные. В настоящей работе использованы следующие питательные среды

(состав сред на 1 л дистиллированной воды):

Среда 1 - полноценная агаризованная среда Хоттингера с добавлением 0,1 тМ аденина, среду использовали для кратковременного хранения штаммов (до 7-10 суток), выращивания биомассы и выделения отдельных клонов бактерий.

Среда 2а - синтетическая агаризованная среда: глюкоза - 20,0 г; мочевина 2,0 г; (Ш^гБСи - 3 г; КНгРО.» - 1 г; КгНРСи - 3 г; Ма50*х7Н20 - 0,3 г; СаС12х2Н20 - 10 мг; РеБ04х7На0 - 10 мг; гпБ04х7Нг0 - 1 мг; МпС12х4Н20. - 3,6 мг тиамин - 5 мг; биотин - 30 мкг; агар-агар - 20 или 7 г; рН - 7,3. среду использовали для выделения и идентификации мутантов (Кигиуа, е!.а1 1968).

Ореда 26 - жидкая синтетическая, отличается от среды 2а•отсутствием агар - агара, среду использовали для изучения особенностей роста 5актерий (влияние ингибиторов роста, ростовых факторов и т.д.) ~реда 3 - посевная ферментационная среда : глюкоза 20 г; 5акто-пептон (Б1Гсо) - 10 г; дрожжевой экстракт (Б1:Гсо) - 10 г; *аС1 - 2,5 г (Нага, еЪ. а1 1967)

-реда 4 - Ферментационная синтетическая среда :глюкоза - 100 г

СН2РО4 - 10 г; К2НРО4 - 10 г; МйБО^НгО - 10 г;

?аС1гх2Нг0 - 0,1 г; Ке30*х7Нг0 - 10 мг; МяС1гх4Н20 - 1 мг;

гиамин - 5 мг; Б-пантотенат Са - 10 мг; биотин - 30 мкг; мочевина -

> г; рН - 7,8. (Кигиуа, е!;. а1 1969).

;реда 5 - комплексная ферментационная среда :

-люкоза - 100 г; КН2РО4 - 10 г; КгНРО« - 10 г; Мв304х7Н20 - 10 г

:аС1гх2Н20 - 0,1 г; мочевина - 6,0 г; пептон - 1,5 г; рН - 7,5.

:реда 6 - комплексная ферментационная среда.

•люкоза - 100 г; (ЫН.»)250* - 20 г; КН2РО4 - 2 г;

[гНРО* - 2 г; Мд304х7Нг0 - 4 г; дрожжевой экстракт - 10 г;

;акто-пептон - 5 г; мочевина - 6 г; СаСОз - 20 г; рН - 7,5.

:реда 7 - комплексная ферментационная среда.

•люкоза - 100 г; мочевина - 6 г; КНгРО.» - 10 г; КаНРО* - 10 г ЙЗО-» - 7Нг0 - 10 г; кукурузный экстракт - 20 г; биотин - 30 мкг; « - 8.

ри составлении сред МвБО.» растворяют отдельно; мочевина и глюкоза терилизуются отдельно (0,5 ат./ЗО мин).

реда 8 (Зр1г1геп, 1961) (МНч)2304 - 2 г; К2НРО4 - 14 г;

Н2РО4 - 6 г; цитрат Ыа-^; - 0,2 г; агар-агар - 20 г; рН - 7,2

реда 9 Комплексная ферментационная среда: глюкоза - 100 г; и (БВК)

белково-витаминный концентрат - 30 г; ЫНлЫОэ - 25 г; MgClz - 5 г; СаСОз - 20 г; рН - 7,4.

Условия экспериментов.

Культивирование бактерий. Способность к усвоению пуринов и пиримидинов как источников нуклеотидов или углерода и чувствительность к действию антиметаболитов оценивали по эффективности роста бактерий на среде 26 (5 мл) в стандартных пробирках (20x200 мм) на круговой качалке (220 об/мин) при 34°С. Отмытый физиологическим раствором инокулят бактерий, выращенных в течение суток на среде 3, вносили в количестве, соответствующем 0,05 ед.опт.плотности (O.D. ) в конечной концентрации. При изучении динамики роста бактерий использовали конические колбы Эрленмейера емкостью 250 мл, содержащих 25 мл среды. Определение способности к накоплению пиримилиновых производных. Для определения количества накопления пуриновых и пиримидиновых производных в культуральной жидкости (к.ж.) клетки выращивали в стандартных пробирках, содержащих 5 мл ферментационной среды на круговой качалке (220 об./мин) в течение 4-6 суток при 34°С. При изучении динамики накопления пуринов и пиримидинов использовали колбы Эрленмейера емкостью 250 мл, содержащих 15 мл среды. Выращивание посевного материала проводили в стандартных пробирках, содержащих 5 мл среды N 26, в течение 24 часов. Инокулят в количестве 4% вносили в колбы с ферментационной средой. В опытах по влиянию ионов Мп-1"1-, Mg2+ на рост бактерий использовали инокулят отмытых клеток в средах, приготовленных на бидистиллированной воде.

Рост бактерий определяли турбидиметрически на КФК 2-МП (длина волны 590нм, толщина кювет - 3 мм) и выражали в единицах оптическо; плотности.

Мутанты выделяли на соответствующих селективных средах, описанных тексте.

Метопы анализов'.

Количественный и качественный анализ нуклеозидов и нуклеотидов, накапливаемых в культуральной жидкости проводили несколькими способами: а) методом хроматографии на бумаге (Grossman), б) метод тонкослойной хроматографии (Grossman), б) методом жидкостной хроматографии, г) путем сравнения спектров поглощения УФ лучей (пр рН 2,0; 7,0; 12,0 в диапазоне длин волн от 200 до 300 нм) элюатов

из соответствующих пятен, вырезанных из бумажных хроматограмм. Определение активности Ферментов в бесклеточных экстрактах. Фосфорибозилтрансферазы определяли по скорости образования 8-С14-нуклеозидмонофосФатов из соответствующих в-С^-оснований по модифицированной методике (Yo3hlmoto, 1971). Рибонуклеозиддифосфатредуктазу определяли по скорости окисления NADFH (Thelander, 1969).

Пиримидиннуклеозидфосфорилазу определяли спектрофотометрически, измеряя поглощение УФ\ лучёй (300 нм) при образовании тимина из тимидина ( Schwarts, 1978).

Дигидрооротатоксидазу определяли спектрофотометрически, измеряя поглощение УФ лучей (290 нм), при образовании оротата (Karlbian, 1978).

Оротидилатдекарбоксилазу определяли спектрофотометрически по снижению концентрации оротидилата при 285 нм в результате его превращения в 4MP (Yoshimoto, 1978).

Обработку УФ лучами проводили по методике (Witkin, 1969).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выбор исходных штаммов и получение продуцента

уридинмонофосфорной кислоты (ÜMP) и урацила (Ura).

Тимидилат и его производные, (тимидин (TdR) и тимин (Thy)) являются продуктами сложных реакций превращения рибонуклео-тидов в дезоксирибонуклеотиды. В связи с этим первой естественной мыслью при селекции продуцентов тимидилата было предварительное получение мутантов с увеличенным пулом общего предшественника пиримидинов, т.е. UMP. Для получения продуцента тимидина первоначально использовали штаммы Br. ammoniagenea по двум причинам:

1) В лаборатории генетики и селекции продуцентов нуклеотидов впервые получен штамм Вг. anmoniagenea ВНИИ генетика 79 -продуцент уридинмонофосфата (UMP) и урацила (Ога) общих предшественников пиримидинов (Нудлер, 1987) и

2) У Br. ammoniagenes по данным Нудлера A.A. отсутствуют пути деградации пуриновых дезоксирибонуклеозидов, что дало основание предполагать об отсутствии деградации и пиримидиновых дезоксирибонуклеозидов. Это предположение в наших экспериментах

подтверждалось неспособностью роста Br. ammoniagenes на среде с дезоксирибонуклеозидами, как единственными источниками углерода. Штамм N 79 продуцирует UMP в среду культивирования до 8 г/л путем прямой ферментации. Однако механизм сверхпродукции пиримидинов остался до конца не выясненным. Штамм N 79 получен на селективной среде, содержащей гистидин и AMP (в качестве источника аденина) с применением мутагена и проверки более 10000 клонов.

Поэтому для анализа мутации, приводящей к сверхсинтезу UMF имело смысл получить подобный штамм без использования нитрозогуанидина. Изучение штамма H 79 дало возможность получения подобных штаммов более прямым способом.

В настоящей работе в качестве штамма дикого типа, использовали адениловый ауксотроф AN 225-5 (Нудлер, 1976) выделенный из природного штамма Br. ammoniagenes АТСС 6872. Штамм AN 225-5 способен продуцировать инозин-5-монофосфат и гипоксантин. Клетки штамма AN 225-5 отличаются повышенной проницаемостью не только для нуклеотидов, но и нуклеозидов, что также являлось одной из причин его использования для получения продуцентов TdR.

Основой для получения мутантов с дерепрессией ферментов пути биосинтеза пиримидинов de novo у Br. ammoniagene3 послужило изучение фенотипических свойств штамма 79, среди которых, кроме ауксотрофности по аденину обнаружена брадитрофность по аргинину и полная резистентность к фторурацилу и фторуридину и др. аналогам пиримидиновых оснований и рибонуклеозидов. Мутанты с дерепрессией Ферментов пути биосинтеза пиримидинов de novo у S. typhimurium получены как резистентные к FU и FUR (Енсен, 1981).

Поскольку карбамоилфосфат является стартовым материалом для синтеза пиримидинов и аргинина мы предположили, что сверхпродуценты пиримидинов могут нуждаться в аргинине, а также других аминокислотах (аспартате и глутамине), входящих в состав пиримидинового кольца. Исходя из вышесказанного селективная среда имела следующий состав: FU, FUR, аргинин, аспартат, глутамин, и AMF в качестве источника аденина. Используя данную систему селективных факторов без применения мутагена из штамма 225-5 с относительно высокой частотой 5x10"® получены мутанты продуцирующие UMP и Ura.

Для дальнейшей работы взят типичный представитель данного класса мутантов - штамм Ыв 513.

1.1. Изучение фенотипических свойств и механизма продукции ОМР.

Мутанты, в отличие от родительского штамма, характеризовались следующими фенотипическими свойствами:

1) увеличенным примерно в 2 раза периодом генерации, (табл 1); Табл.1 Время генерации (мин)

Штаммы Среда 1 Среда 26

!) высокой устойчивостью к ряду аналогов пиримидинов;

способностью к выделению пигмента; ) ауксотрофностью по аргинину (орнитину или цитрулину); (рис 1) ) повышенной чувствительностью к аденину (рис 2)

жидкая

AN 225-5 NG 513

77

173 ■

91 196

00 МО ига

00 Л40 пш

1.4

О*-1-1-,-,--

о а.001 од1 ол 1 г

б ю » го га time (Moure)

ис.1. Влияние аргинина на

ост штамма NG 513.

Мвп1пв (тМ) Рис.2. Влияние аденина на рост -т— штамма Ыв 513 и родительского штамма АЫ 225-5.

резистентностью к рифампицину при сохранении чувствительности

к другим антибиотикам (табл. 2).

Табл 2. Влияние антибиотиков на рост штаммов NG 513 и AN 225-5.

риф- неомицин стрепто- ампи- пуромицин стрепто-

штаммы ампицин ледигин циллин мицин

AN 225-5 0,03 0,25 0,5 0,2 0,5 0,25

NG 513 0,3 0,25 0,5 0,2 0,5 0,25

Значения концентраций антибиотиков указанные в таблице вызывают 50% ингибирование роста бактерий, (концентрация выражена в мкг/мл)

7) способностью к сверхпродуции пиримидинов, в частности (JMP и Ura (рис 3).

00 640

uup and Ur« (дЛ)

Рис.3.

Динамика накопления UMP и Ura у штамма NG 513.

UMP Ura Çoct

Этими же свойствами обладал и штамм N 79, взятый в качестве контроля.

Реверсионый анализ показал, что 35% ревертантов arg-*-теряли все перечисленные свойства и возвращались к исходному фенотипу штамма 225-5.

В результате определения активности ферментов, учавствующих в биосинтезе UMP, в экстрактах из клеток штамма NG 513 и родительского штамма обнаружено, что активности оротатфосфорибозилтрансферазы (ОРИТазы), оротидин-5-монофосфат декарбоксилазы (ОМР-ВСазы) и дигидрооротатоксидазы (БНОазы)

в 4-, 3,5-, и 4,5 раза выше у мутанта, чем у родительского штамма, соответственно. Более того, у штамма NG 513 синтез этих Ферментов не репрессируем: так, в присутствии урацила активность ОРИТазы увеличена в 17 раз, ОМР-БСазы в 14,5 раз и ШОазы в 20 раз по сравнению с AN 225-5 (табл 3). Таким образом, сверхпродукция пиримидинов является следствием дерепрессии ферментов биосинтеза пиримидинов de novo. Табл.3 Активность ферментов, участвующих в биосинтезе UMP de novo (ед/мг белка)

Штаммы Добавление ОРНТаза 0MP-DCa3a БНОаза

0,1 тМ

AN 225-5 -- 15 18 11

0га 3 4 2

NG 513 — 60 62 49

Ura 57 60 46

Изменение чувствительности к аденину, резистентность к рифампицину, а также другие проявления плейотропии свидетельствуют о том, что данная мутация может иметь отношение к РНК полимеразе. В этой связи представляет интерес результаты серии работ датских и американских ученых. Начало этих исследований было положено Енсеном, когда автором среди мутантов S. typhimurium, устойчивых к действию комбинации структурных аналогов пиримидинов ( 5-фторурацила и 5-фторуридина) выделен класс мутантов с повышенным внутриклеточным пулом DTP и UDP и увеличенной экспрессией структурных генов биосинтеза пиримидинов. В результате данной мутации ферменты биосинтеза UMP de novo не подвержены репресии экзогенными пиримидиновыми основаниями и нуклеозидами. Мутанты характеризовались увеличенным периодом генерации и способностью к выделению незначительного количества урацила. Авторы локализовали мутацию на хромосоме S. typhimurium в районе генов гро ВС, кодирующих р и р' субъединицы РНК-полимеразы. Можно заметить сходство фенотипических свойств гро ВС мутантов и полученных нами продуцентов UMP, К сожалению авторы не

- 1С -

привели данные о чувствительности клеток гро ВС мутантов к действию рифампицина.

Как оказалось у мутантного фермента снизилась скорость элонгации транскрипции in vitro, а также в 4-6 раз снизилось сродство фермента к OTP и АТР-субстратам РНК-полимеразы. Основываясь на консерватизме РНК-полимеразной реакции в различных системах, а такхе фенотипическом сходстве гро мутантов S. typhimurlum и полученных нами продуцентами (IMP мохно представить аналогичный механизм регуляции биосинтеза пиримидинов у Вг. ammonlag enе а.

Повышенная чувствительность к аденину у штамма KG 513 проявляется не только в присутствии гистидина, как у родительского штамма 225-5, но и в его отсутствии, и концентрация аденина, необходимая для полного ингибирования роста штамма NG 513 значительно меньше. Мы предположили, что субъединица РНК полимеразы имеющая сайты связывания с АТР и UTP, изменилась таким образом, что в результате мутации повысилось сродство к АТР и уменьшилось к UTP, т.е. с одной стороны в клетке создались условия как бы имитирующие недостаток субстрата (UTP) для РНК полимеразы, что выражается в дерепрессии пиримидиновых генов, с другой стороны повышение сродства РНК-полимеразы к АТР мохет объяснить сверхчувствительность клеток штамма NG 513 к действию аденина. Данные, приводимые в настоящей работе такхе свидетельствуют об изменении РНК-полимеразы у продуцента UMP и Ura. Прехде всего об этом говорит тот факт, что штамм NG 513 приобрел резистентность к рифампицину - специфическому ингибитору этого фермента. Косвенным свидетельством в пользу указанного предположения является плейотропный характер мутантного класса ( замедление роста, повышенная чувствительность к токсическому действию аденина, появление пигментации), т.к. плейотропия является одной из характерных особенностей мутаций, задевающих РНК полимеразу. В частности у некоторых гif* мутантов Е. coli увеличивается период генерации при росте на минимальных и богатых средах и появляется чувствительность к 5-FUR и Ura (Jin and Gross, 1989) .

Интересным физиологическим следствием дерепресии ферментов биосинтеза пиримидинов у штамма NG 513 является возникновение аргининзависимости. Брадитрофность по аргинину, по-видимому, является результатом перерасхода карбамоидфосфата на синтез

пиримидинов, и ограничения его потока для синтеза аминокислоты.

2. Поиск тест-культуры и последовательная селекция первичных продуцентов производных тимидилата у Br. ammoniagsne3.

Следующей задачей являлось определение узкого звена в цепи последующих реакций, приводящих к образованию тимидина. Поскольку основными этапами этого анаболитического пути являются реакции, катализируемые рибонуклеотидредуктазой и тимидилатсинтетазой, то мутации, приводящие к увеличению активности одного из этих ферментов должны были привести, по нашему мнению, к продукции производных тимидилата.

Для первичного отбора мутантов проводили поиск тест культуры, позволяющей обнаружить экскрецию тимидина или тимина. Тест-культуру выбирали среди тимин- и тимидинзависимых штаммов Е. coll, несущих мутации по тимидилатсинтетазе (thy) и тимидинфосфорилазе, (tpp), любезно предоставленных нам проф. В.В.Суходольцем. Тест культуру применяли не только для качественного, но и для количественной оценки продукции (Thy, TdR) первичных продуцентов, используя как критерий, диаметр зоны роста клеток Е. coli во вторичном слое агара. С этой же целью использовали штамм Bacillus thuringiensis, чувствительный к TdR и несущий мутацию по дезоксирибоальдолазе (dra). Однако, недостатком этого штамма было то, что его рост подавлялся не только тимидином, но и другими дезоксинуклеозидами; кроме того определенную сложность представлял подбор состава минимальной среды для одновременного выращивания обоих культур. Поэтому в дальнейшем в качестве тест-культуры использовали тимин- и тимидинзависимые штаммы E.coli.

Известно, что у Br. ammoniagenes специфическим ингибитором рибонуклеотидредуктазы является оксимочевина. Поэтому на первом этапе селекции применяли оксимочевину с использованием тест-культуры. После отбора оксимочевино-резистентных мутантов (Ниг) проверяли их фенотипические свойства. Оказалось, что один класс Hur мутантов способен к накоплению тимина. Мутанты этого класса также приобрели резистентность к 5-фтордезоксиуридину (5-FüdR) специфическому ингибитору тимидилатсинтетазы. Имеются ограниченные сведения о генетической регуляции рибонуклеотидредуктазы, однако есть сообщение, что у культуры

- 12 -

Бсепейезтиз оЬИчииз активности рибонуклеотидредуктазы и тимидилатсинтетазы тесно связаны на уровне генной экспресии (Ко11тап, 1983). Поэтому одним из предположений, объясняющих возникновение одновременной устойчивости к Ни и 5-ги<Ш, может быть общий механизм регуляции рибонуклеотидредуктазы и тимидилатсинтетазы. С другой стороны устойчивость к 5-ки<1Н может быть результатом повышения синтеза дезоксиуриди-лата в результате увеличения рибонуклеотидредуктазной активности. Косвенным свидетельством в пользу обоих предположений говорят и результаты ферментации. Так, если тимидилатсинтетаза являлась бы узким звеном в цепи образования тимина, то наряду с тимином в культуральной жидкости должны присутствовать и производные дезоксиуридилата. Однако в к.ж. их не обнаружено. Ни* мутанты данного класса выделяли в среду культивирования тимин в количестве (200-300 мкг /мл).

Как известно, Ри<Ш является структурным аналогом тимидина, поэтом» следовало ожидать, что экзогенный тимидин будет уменьшать или снимать бактериостатическое действие КИИ. Однако тимидин не оказывал влияния на рост клеток в присутствии Еи<1В. Это можно объяснить отсутствием механизмов активации тимидина, т.е. отсутствием тимидинкиназы у этой культуры, что подтверждается нашими данными об отсутствии включения меченого тимидина в ДНК, хотя 14С-ТсШ эффективно поступал в клетки. Эти результаты совпадают с мнением Аулинга, который также не обнаружил включения тимидина в ДНК (Аи11пе, 1981).

Для дальнейшей селекции использовали селективную систему, в состав которой входили комбинация селективных факторов, включающая Ни и КОсШ в более высоких концентрациях и отобран класс мутантов, продуцирующий в среду роста до 1,5 г/л тимина. Типичным представителем данного класса является штамм Ив 64. После этого этапа селекции клетки продуцента приобрели полную резистентность к используемым аналогам и дальнейшей задачей являлось поиск условий, которые позволили бы повысить чувствительность клеток к данным аналогам.

2.1 Составление среды культивирования для увеличения чувствительности клеток к действию селективных факторов.

Для роста культуры Вг. аттоп!аёепев в качестве источника азота,

как правило используется мочевина (Тигиуа, 1968) однако нами обнаружено, что мочевина, добавленная в среду резко снижает чувствительность клеток к оксимочевине, т.е. мочевина конкурентно подавляет токсическое действие оксимочевины. Поэтому среди ряда проверенных источников азота мы остановились на сернокислом аммоние (в эквимолярных количествах с мочевиной), который эффективно усваивался клетками для роста и не влиял на ингибирующее действие оксимочевины. Известно также, что кофактором рибонуклеотидредуктазы у Вг. аттоп!аяепез является ионы Мп"|'+1 которые частично заменяются ионами Мв^"1'. Поэтому мы предположили, что в условиях лимитированного содержания этих ионов активность фермента будет снижена, и тем самым может возрасти чувствительность к Ни. Действительно, если для полного подавления роста клеток штамма N0 64 оксимочевиной в обычных условиях необходимо 10 тМ оксимочевины,(рис 4) то в среде при максимально возможных низких концентрациях ионов марганца и магния, которые позволяют условия эксперимента, полное подавление роста наблюдалось при 5,0 шМ (рис 5), а в случае замены источника азота (мочевины) сернокислым аммонием для остановки роста достаточно 2,5 тМ (рис 6).

00 640 пт 00 (540 пт)

Рис.4. Влияние оксимочевины на рост штаммов ЫЯ 513, N0 64. Ый 513 N0 64

Рис.5. Возростание ингибиру-ющего действия оксимочевины на рост N0 64 при недостатке ионов Мп**, Ме^"1"• без ^-•"'■.-«-без , Мп"**

- 14 -

Синтез тимидилата можно блокировать также, подавив регенерирование тетрагидрофолата аналогами фолиевой кислоты аминоптерином, аметоптерином и триметопримом. Показано, что среди этих аналогов ингибирующим действием на рост штаммов Вг. атшоп1аяепез обладает триметаприм (Тгтр). Т.о. на данном этапе селекции, используя модифицированную среду (без мочевины и ионов ^-•"'-и Мп^*), а также комбинации трех селективных факторов (Ни, КЧсШ, Тгтр) был отобран класс мутантов продуцирующих тимин до 2,3 г/л. Типичным представителем данного класса является штамм N0 339 (рис 7).

Ни (тМ) Сутки

Рис,6. Ингибирование роста штамма Рис.7. Динамика накопления NG 64 оксимочевиной в среде содер- тимина, урацила. жащей в качестве источника азота * - Thy, Ora

— мочевину, (NH-OaSCU. -Х-рост.

2.2. Сравнительное изучение действия УФ лучей на различные штаммы Brevibacterium ammoniagenes.

Известно, что одной из основных причин летального и мутагенного действия ультрафиолетовых лучей на клетки бактерий это возникновение тиминовых димеров (Hollanger, 1954). Кроме того известно, что азотистые основания в интактном виде или в составе нуклеозидов или нуклеотидов в значительной степени

поглощают УФ лучи (Веег1пй, 1962). Поэтому можно было предположить, что повышенный эндогенный пул производных нуклеиновых кислот может экранировать ДНК от летального действия УФ лучей. Для проверки данного предположения проверяли выживаемость ряда мутантных штаммов. Показано, что наибольшая выживаемость наблюдается у штамма N0 339 продуцента тимина (рис 8).

10000 ■

Рис.8. Выживаемость клеток штаммов NG 513, NG 339, АТСС 6872 при действии УФ лучей. -»- АТСС 6872 NG 513

NG 513 + TdR или Thy NG 339

Время (сек)

Действительно, при добавлении тимина или тимидина в облучаемую суспензию клеток наблюдается наибольшая выживаемость, в то время как при добавлении аденина или гуанина, выживаемость была выше относительно контроля, но ниже, чем при добавлении тимина или тимидина. Известно, что пиримидиновые основания обладают более эффективным экранирующим действием в отношении УФ лучей (Deering, 1962). Эти результаты дали нам основание предполагать о возможности использования УФ лучей, как один из селективных факторов при получении продуцентов Thy и TdR. В данном случае УФ лучи были использованы как составная часть селективной системы, в которую входили также FUdR 5,0 mM; Ни 10 тМ; Тгтр 0,1 тМ в максимально возможных концентрациях. Хотя клетки штамма продуцента тимина NG 339 полностью устойчивы к вышеуказанным концентрациям FUdR, Ни, Тгтр, их присутствие в среде было необходимо для ограничения возникновения побочных мутантов, вызванных мутагенным действием УФ лучей. Таким образом получен новый продуцент тимина NG 7-2, выделяющий в среду культивирования 3,5 мг/мл тимина. Этот штамм

проверяли на УФ резистентность относительно родительского шт. МС 339. Его выживаемость была примерно в два раза выше. В качестве контроля ту же облученную суспензию высевали на минимальную среду без содержания селективных факторов. При анализе полученных клонов не обнаружено мутантов с повышенной продукцией тимина. Следует отметить, что клетки всех штаммов обнаруживают одинаковую чувствительность к УФ лучам после инкубирования в течении 24 часов в физиологическом растворе с последующим отмыванием клеток. Эти результаты свидетельствуют, что резистентность продуцентов к УФ лучам обусловлена повышенным эндогенным пулом азотистых оснований (в частности производных тимидилата).

2.3. Биохимическое изучение рибонуклеотидредуктазы у штаммов-продуцентов тимина.

Так как на всех этапах в качестве одного из селективных факторов использовали оксимочевину, то представляло интерес изучение активности рибонуклеотидредуктазы у различных представителей мутантных классов - продуцентов тимина. Рибонуклеотидредуктазная активность в бесклеточных экстрактах из штамма N0 339 примерно на порядок превышала таковую активность у исходного родительского штамма (табл 4). Табл.4 Активность рибонуклеотидредуктазы у различных штаммов. Вг. аштоп1авепез

Штаммы СОР Субстраты СТР СГОР итр смр.имр, СИ, ОН СРР+ Ни 5,0 СТР+ Ни 10 С0Р+ Ни 30 (тМ)

АЫ 225-5 86 37 47 28 __ — — —

№ 513 87 35 49 28 — — —

№ 14 168 63 187 93 21 — —

№ 64 619 315 745 367 — 387 147 —

№ 113 634 338 764 389 — 467 376 —

№ 339 648 347 778 397 — 639 456 —

N0 7-2 657 354 782 412 — 654 463 —

№ 98 649 359 786 415 — 650 470 —

Как показано в табл 4 качественное изменение активности фермента наблюдалось у штамма NG 64 (2-ой этап селекции):

1) активность этого фермента увеличена в 6 раз по сравнению с родительским штаммом NG 513;

2) При добавлении оксимочевины в инкубационную смесь 5 тМ, активность фермента из штамма NG 339 не снижалась, тогда как при той же концентрации наблюдалось полное подавление активности фермента у штамма NG 513. Ингибирование фермента из шт. NG 339 наблюдали только при увеличении концентрации Ни до 30 тМ.

На 3-ем этапе также произошло незначительное увеличение активности фермента, в то время как на 4-ом этапе селекции изменения активности редуктазы нами не обнаружено. Увеличение уровня накопления тимина на последнем этапе может быть связано с изменением активности других ферментов на пути образования тимина. Изучение субстратной специфичности у всех мутантов показало, что фермент выделенный из дикого штамма и из мутантов катализирует восстановление рибозы на нуклеозидди- и нуклеозидтри-фосфатном уровне, хотя в последнем случае с меньшей активностью. В литературе описаны бактерии у которых также редукция происходит на нуклеозидди- и трифосфатном уровне (Inukai, 1979). После второго этапа селекции фермент изменился таким образом, что в качестве субстрата с большей эффективностью использовал UDP, тогда как у родительского штамма редукция предпочтительна с использованием в качестве субстрата CDP.

При использовании в качестве субстратов нуклеозидмонофосфатов, а также нуклеозидов восстановления рибозной части не обнаружено.

2.4. Изучение катаболизма тимидина у Br. ammoniagenea.

В начале работы мы предположили отсутствие путей катаболизма тимидина у Br. ammoniagenes и это действительно подтверждалось тем, что тимидин, добавленный в суспензии клеток, а также в бесклеточный экстракт из штамма АТСС 6872 не разрушался, однако на всех этапах селекции мы получали продуценты тимина, поэтому было интересно изучить механизмы возникновения тимина. Единственный известный источник тимина в клетке бактерий -это тимидин. В зависимости от того, каким ферментом разрушается' тимидин, продуктами его катаболизма совместно с тимином

- 18 -

могут быть дезоксирибоза или дезоксирибоза-1-фосфат. По мнению Аулинга у Вг. аттоп1а£епез отсутствует тимидинфосфорилаза. Достоверных результатов о наличии у этой культуры фермента тимидингидролазы не имеется (Аи11пе 1984). Эти данные подтверждаются нашими измерениями активности тимидинфосфорилазы и гидролазы в бесклеточных экстрактах, а также тем, что в культуральной жидкости не обнаружена дезоксирибоза или дезоксирибоза-1-фосфат. При инкубации суспензий клеток штаммов АТСС 6872, Ыв 513 и Ыв 339 в присутствии тимидина частичное разрушение последнего наблюдали после 48ч только у штаммов Ыв 513, Ыв 339 - продуцентов пиримидинов. Это дало основание предположить, что в деградации тимидина непосредственное участие принимает урацил. В последующих опытах в бесклеточных экстрактах штамма АТСС 6872 обнаружили эффективное разрушение тимидина в присутствии урацила, независимо от содержания неорганического фосфата в инкубационной смеси. В отсутствие урацила разрушение тимидина не наблюдалось.

Таким образом в отличие от большинства микроорганизмов, включая энтеробактерии, псевдомонады и бациллы, у которых функцию катаболизма тимидина осуществляют фосфорилазы или гидролазы с разной степенью специфичности, у Вг. аттоп1авепез деградацию тимидина осуществляет фермент трансдезоксирибозилаза, катализирующий перенос дезоксирибозильной группы с тимидина на урацил, о чем свидетельствует образование дезоксиуридина и тимина. Реакция фосфат независимая:

таи + ога-аин + тьу

Тимин, образовывающийся в результате этой реакции экскретируется в культуральную жидкость, а дезоксиуридин претерпевая дальнейшие преобразования превращается в тимидин. Так как урацил присутствует в культуральной жидкости у продуцентов пиримидинов в достаточных количествах, то получается замкнутый футильный цикл. Таким образом чтобы получить продуцент тимидина необходимо ввести мутацию по этому ферменту.

К сожалению пока мы не смогли сконструировать селективную систему, позволившую вести отбор мутантов с дефектом по

- 19 -

этому ферменту. Поэтому для получения подобных мутантов мы использовали традиционные методы с применением мутагена СНГ), и отбором мутантов, продуцирующих тимидин. С помощью тест-культуры, мы получили группу мутантов с частичным дефектом по трансдезоксирибозилазе, накапливающее смесь смесь тимина и тимидина. Однако эти мутанты отличались нестабильностью накопления тимидина.

3.1. Получение мутантов В. subtills с увеличенным пулом пиримидинов.

Учитывая те трудности с которыми мы столкнулись при селекции продуцентов тимидина у Br. ammoniagenes, дальнейшую работу вели также с известным промышленным объектом В. subtills, у которой генетически изучены пути деградации тимидина (Суходолец 1979).

В качестве исходного штамма использовали штамм В. subtills, несущий мутацию cpm ( control of pyrine metabolism) ( Мазница, Нудлер, 1991).

Штамм является ауксотрофом по аденину, гистидину и тирозину и выделяет в среду культивирования инозин.

Следуя стратегии селекции продуцентов тимина у Вг. ammoniagenes на первом этапе мы получали мутанты В. subtlllis с увеличенной продукцией пиримидинов, обеспечивая достаточный уровень эндогенных субстратов для образования тимидина. С этой целью определяли ингибирующие концентрации широкого спектра аналогов пиримидинов. Так же сак и у Br. ammoniagenes наиболее эффективным действием обладали фторированные аналоги уридина и урацила. Тоэтому селективная система была идентична системе для юлучения пиримидинов у Br. ammoniagenes и отличалась ювышенным содержанием FU и FUR. В качестве источника 1денина использовали аденин, поскольку использование AMP в ;анном случае было нецелесообразно, так как у В. subtilis (орошо развиты механизмы деградации экзогенных нуклеотидов, :ем более, что у штамма, взятого в качестве объекта селекции, В. subtilis ВМ 817) активность 5"-нуклеотидазы увеличена >олее чем на два порядка (Мазница, Нудлер, 1991). Среди мутантов, >езистентных к данной селективной системе ( FUr и FURr),

- 20 -

отобран класс, способный продуцировать уридин и урацил. Для дальнейшей работы выбран типичный штамм (GNM 37) данного класса, продуцирующий уридин 2,5 мг/мл, урацил 1,0 мг/мл.

3.2. Селекция мутантов с дефектом по катаболизму тимидина у В. subtilis.

Поскольку пиримидиннуклеозидфосфорилаза (ПНФаза) у В. subtilis хорошо изучена и чтобы не столкнуться с проблемой накопления тимина решено было получить мутанты с дефектом по ПНФазе. Поскольку фермент считается катаболитическим, то получение соответствующих мутантов связано с применением аналогов нуклеозидов, имея ввиду, что токсическое действие оказывает активированное основание, полученное эндогенно в результате действия этих ферментов. Вместе с тем по нашим данным аналоги пиримидиновых оснований действуют более эффективно, нехели соответствующие аналоги рибонуклеозидов в эквимолярных концентрациях, и штамм GNM 37 сохранил чувствительность к FU. Поэтому при получении мутантов с дефектом по (ПНФазе) мы использовали аналоги оснований, в частности FU. Среди фторурацил резистентных (FUr) клонов обнаружен класс мутантов, выделяющий в среду культивирования уридин и тимидин утрачивая способность накапливать пиримидиновые основания, что дало нам возможность предполагать об инактивации ПНФазы. Один из мутантов данного класса (GNM-39) накапливающий 2,5 мг/мл уридина и 150 мкг/мл тимидина был взят для дальнейших исследований.

При изучении фенотипических свойств данного мутанта обнаружено, что он в отличие от штаммов ВМ 817, GNM 37, GNM 39 не может использовать тимидин, дезоксиуридин и уридин в качестве единственного источника углегрода (табл 5).

Табл. 5 Усвоение глюкозы, тимидина, дезоксиуридина, аденозина у уридина как единственных источников углерода штаммами ВМ 817, GNM 37, GNM 39.

Штаммы

глюкоза аденозин тимидин дезоксиуридин уридин

ВМ 817 вЫМ 37 вИМ 39

+ рост штамма, - отсутствие роста.

Проверка активности фермента в бесклеточных экстрактах шт. СШ 39 с использованием в качестве субстрата тимидина, дезоксиуридина и уридина отсутствие в мутантных клетках активности ПНФазы.

таблица 6. Активность ПНФазы у штаммов ВМ 817, СЮМ 39.

Субстраты ПНФазы

Штаммы тимидин дезоксиуридин уридин

ВМ 817 110 112 100

СИМ 39 — — —

Это позволило нам на последующих этапах селекции оценивать штаммы по продукции исключительно тимидина. Следует заметить, что на всех этапах селекции продуцентов тимидина мы использовали тест-культуру.

3.3. Дальнейшая селекция продуцентов тимидина у В. зиЪ-ЫНз

Как и в случае получения продуцентов тимина у Вг. ammoniageneз мы вели поиск ингибиторов рибонуклеозиддифосфат-редуктазы у В. зиЬ-ЬШз.

В отсутствие мочевины в среде (среда Спицайзен) незначительное ингибирование роста штамма СИМ 39 наблюдали только при очень высоком содержании в среде оксимочевины (50 шМ). Однако это было недостаточным для выделения Ниг мутантов, поэтому в качестве селективного фактора, в отличие от Вг. аштоп1а0епез использовали гидроксиламин, который у бацилл в большей степени влияет на активность редуктазы, чем Ни. К сожалению это соединение обладает также мутагенным действием, и поэтому для вели поиск других селективных агентов-аналогов дезоксирибонуклеотидов.

Обнаружено, что среди ряда проверенных аналогов ингибирующим действием обладали такие соединения, как 3-фтортимидиндидезокси-рибозид (ЗКТсЗИ), дидезокситимидин, бромдезоксиуридин (ВИИ) , фтордезоксиуридин . Критерием выбора ингибитора для

составления селективной системы был эффект снятия торможения роста клеток при добавлении тимидина (рис 9).

00 х 10 640 пт

Время (ч)

Рис.9. Эффект снятия торможения роста клеток при добавлении тимидина. ЗЭ.-Х-СЫМ 39 + ЗГТаЛ + ТёИ, -*- вЫМ 39 + ЗГТёН

Следует отметить, что в отличие от Вг. аттоп1анепез, этот прием можно было использовать в связи с наличием у культуры В. эиЬЪШз фермента активации тимидина - тимидинкинаэы (Ро1;у1п, 1975).

В конечном итоге в состав селективной системы, которая позволила выделить класс мутантов, продуцирующих тимидин до 1 гр/л, входили гидроксиламин, 3-фтортимидиндидезоксирибозида и бромдезоксиуридин. Применение этих аналогов ограничивало селективный отбор побочных мутантов, вызванных мутагенным действием гидроксиламина. Мутантные клоны продуцирующие тимидин возникали с частотой 6-9х10~е. Следует напомнить, что во всех операциях связанных с селекцией мы использовали тест-культуру.

Идентификацию тимидина проводили различными методами (см. в материалы и методы), включая метод жидкостной хроматографии НРЬС. Таким образом, обобщив результаты нашей работы, можно сказать,

что те методы, которые мы разработали, могут быть использованы для получения более продуктивных штаммов у коринебактерий и бацилл, а также для селекции этих соединений у других микроорганизмов с известными путями метаболизма.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствована схема селекции продуцентов UMF и Ura у Br. ammoniagenes. Выделен класс мутантов, накапливающий

5'-уридинмонофосфорную кислоту в пределах 4 мг/мл и урацил до 2 мг/мл. Сверхпродукция UMP и Ога является следствием плейотропной мутации, приводящей к дерепрессии ферментов биосинтеза пиримидинов de novo.

Среди плейотропных свойств, привнесенных данной мутацией, обнаружена аргининзависимость и устойчивость к рифампицину.

2. Рибонуклеотидредуктаза у Br. ammoniagenes катализирует восстановление рибонуклеотидов до дезоксирибонуклеотидов на уровне нуклеозидди- и трифосфатов.

Разработан метод селекции и выделен класс мутантов с 10 кратным увеличением активности рибонуклеотидредуктазы. Фермент отличается повышенной устойчивостью к оксимочевине.

3. У Br. ammoniagenes не обнаружено тимидингидролазной и тими-динфосфорилазной активности. Катаболизм тимидина у данной культуры обеспечивает фермент дезоксирибозилтрансфераза, катализирующий реакцию переноса дезоксирибозы с тимидина на урацил с образованием тимина и дезоксиуридина. Реакция фосфатнезависимая.

4. Впервые УФ лучи использованы в качестве селективного фактора при получении продуцентов тимина.

5. Разработана схема селекции и выделен класс мутан-1ив Br. ammoniagenes - продуцентов тимина (до 2,5 мг/мл). (Авторское свидетельство N 4695294).

6.'Разработан новый метод отбора мутантов В. subtilis с дефектом по пиримидиннуклеозидфосфорилазе, используя аналог пиримидинового основания 5-фторурацил.

7. Разработана схема селекции и выделен класс мутантов Bacillus subtilis - продуцентов тимидина (до 1 мг/мл). Подана заявка на получение авторского свидетельства.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гарибян А.Г. Нудлер А.А. Мазница И.И. Бурд Г.И.

Мутанты Bacillus subtilis с дефектом по пиримидиннуклеозид-фосфорилазе продуцирующие пиримидиновые нуклеозиды. Тезисы VII Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов". Москва 1990.

2. Nudler A.A., Garibyan A.G., Bourd G.I.

The derepression of enzymes of de novo pyrimidine biosynthesis pathway in Brevibacterium ammoniagenes producing uridine-5-monophosphate and uracil.

FEMS Microbiology Letters 82 (1991) 263-266.

3. Нудлер А.А., Гарибян А.Г., Бурд Г.И.

"Штамм Brevibacterium ammoniagenes ВКПМ 5435 - продуцент тимина Авторское свидетельство N 4695294. 1989.

4. Нудлер А.А, Гарибян А.Г., Мазница И.И., Бурд Г.И. "Штамм Bacillus subtilis - продуцент тимидина".

Подана заявка на авторское свидетельство от 17.05.1991.