Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мембранно-протекторные свойства новых производных госсипола и ионола

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Мембранно-протекторные свойства новых производных госсипола и ионола"

РГ6 од

НАШОрЯШАЯ ''.АКАДЕМИЯ НАУК .ЕЕСПУБЖКИ КАЗАХСТАН —й&ЙКУЖРНОИ БИОЛОГИИ И БИОХИМИИ т. М.А. АИТХОЗША

На правах рукописи $Ж 677. 352

МУХАМЕДЩАНОВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

МЕМБРАННО - ПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ Г0ССШ10ЛА И ИОНОЛА

ОЗ. 00. 04 - Биохимия

Автореферат 1 диссертация на соискание ученой стеяеНИ-колдадято биологических наук

А I М А Т 11, 1993

Работа выполнена в лабораторий,- тонкого оргаиичэскога

синтеза физиологически активных веществ Института

биооргашщеской химии им. A.C. Садакова Национальной АН Республики Узбекистан.

Научнне руководители: Доктор химических

наук Д.Н. ДАЛИМОВ

кандидат биологических

наук В.В. ШНЕИВАИС

Официальные оппоненты:

доктор биологических

Наук О.В. ЕСЫРЕВ

доктор биологических

Наук О.В. ФУРСОВ

Ведущая организация: Институт физиологии й биофизики АН Республики Узбекистан, Ташкент.

Защита состоится " 1993 г.

в _ Чао. йа заседании специализированного советь

К 008. 22. 01 По защите диссертаций на соискание ученой стейэни кандидата биологических наук йри Институте молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина Национальной АН PH üo адресуi 480012, г. Алматы, ул. Мичурина* 86.

О диссертацией можно ознакомиться в библиотека АН PK (г. АЛматы, ул. Шевченко, 28).

Автореферат разослан "¿ff* ¿LoL-f./^Ul 199Э г.

Учений секретврь у •

специализированного совета кандидат биологических Наук. jf^T^ КОЛШБЕТОВА

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние года резко возрос интерес к биологическим эффектам свободных радикалов кислорода и их производным.

• Изучение молекулярных механизмов патогенеза большого ряда заболеваний человека, животных к растений в той или иной степени оказались пязшштя; ^ активэниэй ила, напротив, с подавлением свободно - радикальных процессов. В связи с этим чрезвычайно актуальной становится проблема создания новых химических регуляторов свободно-радикальных процессов на основе как синтезированного, так и природного сырья.

Эта проблема тем болэе актуальна, что, несмотря im громадное количество научных . публикаций, количество антиоксидантов, используемых в клинике и народном хозяйстве, исчисляется всего лишь единицами.

Создание и скрининг новых гоедоиеянй представляется чрезвычайно важной народно-хозяйсхгэшюй задачей.

Предшествующие исследования Показали высокую эффективность госсипола и его производных в качестве ышгоксидантов. .

На сегодняшний день наиболее эффективным аятиоксидантом как в технических, так и в медико-биологических целях признан ионол и неко-орно-его производные.

В связи с этим актуальным и перспективным нагл представлялась проблема синтеза новях соединений, препятствующих оксигенным повреждениям мембран с введением в молекулярную структуру функциональных групп, обусловливающих антиокислитвльную и антахолинэстеразнуго активность зтих соединений.

Получошшо результаты позволили выделить ряд новых производных госсшюла, перспективных для формэкологического использования.

Было интересно сопоставить свойства этих новых соедшюниий с аналогичными свойствами ролерного антиокедцан-та ионола и ряда его новых производных, синтезированных в Институте злвментоорганичсской химии РАН в лаборатории проф. H.H. Годовикова H.A. Кардвновнм.

Целью работы являлось создание новых химических веществ, обладающих способность» сохранять структуру и регулировать функции биологических мембран клетки.

Задачи исследования I; Сшгез швах аналогов госсипола, обладающих наряду с антирадикальной, также и антихолинаствразной активностью.

2) Изучение антирадикальной и антиокислительной активности новых аналогов госсшола и ионола при окислении биомекбран: в) влияние их на микросомальное окисление при ферментативной и неферментативной индукции переписного окисления липидов. б) влияние этих препаратов ка ПОЛ синаптосом из мозга крыс.

3) Изучение влияния производных госсипола и ионола на кислород - зависимые процессы перитонеальных макрофагов.

4) Изучение кинетики взаимодействия новых производных госсипола и ионола с холинэстеразами.

Научная новизна

Были впервые синтезированы производные госсипола, обладающие шрига иными антиоксидантными свойствами. В процессе синтеза было предусмотрено придать новым производным госсипола антихолинэстеразнув активность, вводя ' в структуру химические группы, являющиеся обратимыми ингибиторами АХЭ.

Выли исоледованы новые производные ионола, обладающие антиокислительными и антихолинэ стэразными свойствами. Была изучена антихолинэотераэная актиыюоть этих соединений.

Были установлены ранее. неизвестные свойства регулировать свободно - радикальные процессы в микросомах печени и синаптосомах мозга новыми производными госсипола и ионола.

Была обнаружена ранее неизвестная способность указанных соединений в регуляции флогогенного потенциала фагоцитирующих клеток.

Практическое и теоретическое значение

Полученные результаты являются основой для создания физиологически активных препаратов, регулирующих нейромодиа-торныэ и окислительные Процессы в организме человека и животных.

Возможна перспективность использования новых соедгаю-

ний в качестве антидотов прь интоксикации, вызванных ингибиторами ацеталхолинесгеразы, а также при заболеваниях с нарушениями регуляции окислительных процессов.

Полученные результаты позволяют наладить новые скриникговые метода оценки еф^кгивнрсти синтезированных соединений для выявления и внедрения в народное хозяйство новых биологически активных веществ.

Апробация работы. По полученным результатам исследования опубликовано 4 работа. Материалы диссертации докладывались на IX Советско-индийском симпозиуме по химии природных соединений (Рига, 1989), III Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1989).

Структура диссертации; Текст диссертации изложен на {££_ машинописных листах и состоит из следующих частей: введения, главы литературного обзора, описания использованных в работе материалов и методов исследования, главы с изложением ц обсуждением собственных экспериментальных результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего (<ГМ наименований- Диссертация иллюстрирована рисунками и jj^ таблицами.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Синтез производных госсиполэ, а тэкке соответствующих промежуточных продуктов мы осуществляли, используя общие метода, описанные в литературе, а в некоторые вводили изменения.

Микросомалшую Фракцию из печени крыс получали по методу Арчакова (Арчаков и др., 1968). Активность ПОЛ в опытах в НАДФН- и в аскорбат-зависимых системах окисления изучали по выходу малонового диальдегида, определяемому по реакции с тиобарбитуровой кислотой (Косткж и др., 1983).

Синвдтосомн из мозга крыс получали по методу (Gray et el, 1962}. Активность синаптосом опрэдэляли положительной реакцией на реактив Эллмана. Действие полученных препаратов на ПОЛ синаптосом изучали методом Fe-индуцированноЙ ХЛ. (Лопухин и др.,1983).Скорость окисления липидов в присутствии изучаемых соединений оценивали по изменению угла наклона медленной вспышки, а тагам по интенсивности уровня свечения.

Перитонеальные макрофаги бвдэлялй из брюшной полости крыс. Влияние препаратов на активность оксидазных систем перитоне альных макрофагов изучали методом лшинол-зашсимой ХЛ, активируемой опсонизмрованвдм зимаэаном (Alien et

.л,1976).

Для определения ингибиторных констант использовали метод Бресткина (Брэсткин и др., 1963). В вкспериментах ферментами служили очщенныэ препараты АХЭ " эритроцитов человека (к. ф. 3, II. 7) и ЕуХЭ сыворотки крови лошади (к. ф. 3. II. В). Каталитические свойства ферментов определяли колориметрическим методом Эллмана (Ellman et al., 1961). Ацетилхолинэстеразнуга активность синтезированных препаратов оценивали по величине обобщенной ингибиторной константы Kj. Концентрацию белка в биосубстратах определяли по методу БрвдйюрД (Bradford, 1976).

Результаты обрабатывали статистически. Достоверность различий средних оценивали по критерии Стьюдента. Измерения ХЛ проводили в трех повторностях. Брали среднее значение.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБОЭДЕНИЕ L. Синтез производных госсипола »

Производные госсипола сийтевировалй по следующей схеме:

RH + 01-0Н2-СН2-Ш2 HOI—*-•> R-OHg-CHg-HHg

г

!

I

II •

III

-Б-

Wï СИ Qit CH3

fU

HO HO

a-cH он ~

OÔcf/j

НдС Ъ3

(0gH5)2N

¿H

■NH- (G2H5>2n- m (IV); (с2н5)2н- п (7)

Физико-химические константа, выхода синтезировании?, веществ приведены в - табл I. Все синтезированные соединения охарактеризованы ЙК-, ШДР— и УФ-сиектрами.

Табл. I

Физико-химические свойства п-атлэмшов, R-агашов (I) л продуктов их конденсации о госсиголом (II)

II

nD 44 Т кип. Виход т пл. Шил

О0 % О0 %

I .(O2H5)2N 1, 4250 0,3165 105- -106 75 222 70

2 ■о5н10к 1. 4663 0.89ЭЭ 125- -127 44.6 181-182 55

3 .о4я8ш 1, 4654 0,9300 150- -152 40,3 178-180 40

4 .M-C10H16N2 120 (1 мм) 41 183 52

Б. .п-с10н1бк2 126 (1 км) 46 186-187 56

Новые производные госсипола были получены путем конденсации с вещества™, содержащими аминогруппы. Ронвэ для госсипола не были получены производные такого типа. Получешше соединения представляют собой порошкообразные вещество, норостворшне в воде.

В качества заместителей выбрали даэтиламинэтиламзш с целью получения производного госсипола, имеющего аналог хо~ лянового фрагмента, также готеридинэтилашш, морфожиэтил-амин, п-, м диэтиланилинамин, так как эти гетероциклы входят ^ оссгаз специфичных субстратов АХЭ.

В НИР-спектрах, госсипольшх производных имеются сигналы, характерные для самого госсипола: при 1,44 м.д. расположен дублет ташяьнцх груш изопродального фрагмента; синглет при 2,05 м.д. соответствует ароматической матоьной группе; мультмшют при 3.56 м.д. принадлежит метановому протону изопронильного радикала и, наконец, синглет при 7,42 м.д. соответствует ароматическому протону Н4. Наличие дублета при 9,48 м.д. и широкого сигнала при 14,2 м.д.,' принадлежащих екзомэтиновому и ин-протонам, соответственно» 'свидетельствует о существовании молекулы в раотворе а квтоиминной форме.

В ИК-спектрах полученных веществ имеются пики, соответствующие колебаниям ОН-группы госсипольного фрагмента при 3660 см-1, С=н-связи при 1685 и 1640 см"1, следовательно, етй вещэотва претерпевают кето-иминйую таутомс-ршо, переходя из кето-формы в иминную, Что также подтверждают данные ПМР-спектров.

УФ-спектр Сио-дивтиламинэтиламингоссипола имеет пик поглощений яри ЛСН3С0СНЭ 400-405 нм, Сио'-ттеридинэтапи-мингоссипола При 400 нм, бис-морфолйиэтилймингоссйпола При 350 нм и п-» м-био-диетялаяилишшингоссшолов ври 470 йм.

Таким образом, ва основам спектральных данных производных госсипола можно считать1 что они соответствуют йредполагаомш структурам.

Для Оис-даэтиЛаминетйлимиягассипола йроведен рентгено-Ьтруктурный анализ ^

Действие госсипола И его производных на Ферментативное ^ неферментативное пэрекионое Окисление лшшдоа мшисом гаченй крнс.

Следующим втапоМ наших Исследований было изучение влияний синтезированных йймй соединений на ферментативное и неферманТативное Перекислое Окйсление липидов микросом печени крыс (табл. 2» 3).

Таблща 2

Действие госсипола g его производных на НАДФН-¡зависимое перекисноэ окисление липидов микросом печени крыс (нМ УДА / мг белка) N/N Концен- Еао-даэи i- Пипэрвдин- Морфолин-

трация Госсипол аминэтил- этилшин- атилимин-

М имиягоссшол госсипол госсипол

I Контроль 18,6+0,01 18,6+0,01 18,6+0,01 18,6+0,01

2 1Л0~7 14,5+0,09 14,0+0,03 15,6+0,01 15,8+0,03

3 3.I0-7 12,7+0,02 12,5+0,01 12,5+0,02 12,8+0,02

4 6 Л О"7 11,5+0,02 11,7+0,07 11,6+0,03 11,8+0,01

Б 1Л0~6 9,9+0,01 9,9+0,03 10,2+0,01 11,2+0,01

6 ЗЛО-6 9,2+0,02 9,0+0,01 9,5+0,02 10,4+0,01

7 6Л0"6 9,0+0,01 8,8+0,02 8,7+0,01 9,8+0,01

8 1Л0~Б 7,8+0,02 8,0+0,09 7,8j_0,0I 8,0+0,02

9 Б Л О-5 7,4+0,07 7,4+0,01 7,0+0,07 7,2+0,07

10 1Л0~4 6,2+0,05 6,0+0,03 6,5+0,06 6,8+0,01

Таблица 3

Действиэ госс-'зтола и его .дюизвоцщх на аскорбат-зависшио ПОЛ микросом пэчэяи

к^чс i нМ ИДА / мг белка I N/N Концент- Бис-диэтил- Бис-шгоридин-Бис-морфо-

рация Госсипол вмивоэтил- этнлимин- линэтилимин-

(М) лмингоссипол госсипол госсипол

I Контроль 14,9+0,01 14,9+0,01 14,9+0,01 14,9+0,01

2 5 ЛО 12,4+0,02 13,9+0,07 13,9+0,01 13,9+0,01

3 1Л0~7 11,9+0,01 8,9+0,04 11,6+0,02 13,9+0,01

4 ЗЛО-7 9,3+0,03 8,1+0,03 11,1+0,09 13,0+0,01

5 6 Л 0~7 6,8+0,01 - 9,2+0,01 12,6+0,01

6 1Л0"6 2,9+0,01 - 7,9+0,01 11,6+0,01

7 ЗЛО-6 - 6,9+0,01 8,8+0,01

8 6 Ю-5 - _ 4,9+0,01 5,5+0,02

9 ькг6 _ - 4,9+0,01 5,1+0,01

10 5Л0~б - - 4,2+0,01 4,2+0,01

Для самого госсипола и его производных в аскорбат- и 1ЩФН-эависимых системах микросомэльного окисления

наблюдается- подавление выхода малонового диальдегида п

-7 -4

диапазоне коннонтр^цпЖ от ЕЛО до 1Л0 IL

Мз таб. 2 и 3 видно, что бис-дизтиламинэтилимингоссипол проявлял большую антиокислительную активность по сравнению с самим госсиполом в аскорбат-вависимой системе. 6С.%-иоо ингибирование выхода МДА по сравнению с контролем в двух илсаемах микросомального окисления было следующим (табл. 4):

Таблица 4

Концентрация производных госсшгола,

при которых происходит 50 %-ное • ' ингибирование выхода МДА.

Соединение

Аскорбат- НАДФН-

5,4 Ю-7 М 2,0 10~б N

3,2 ЛО-7 М 2,0 10~В N

1,4.10"® М 3,2.10~6 М

6.10"® м в,0Л0~6 м

1. Госсипол

2. Бис-даэталат»„.и-этилишшгоссилол

3. Бис-пиперидинэтил-ишшгоссипол

4. Еио-кюрфолинэтил-имингоссшюл

Госсипол и его производные оказались более активны в вскорОат-зависимой системе по сравнению с НАДФН-зависимой системой микросомального окисления.

Как видно из рассмотрения Данных< приведенных в табл. 4, существует четкая зависимость Ь0 Х-ного шгибироввния выхода МДА от структуры молекулы ингибитора. Так, переход от диэтиламшшой группы в аскорбат-зависнмой системе к пиперидинсодержащему йройэЬодному снижает ингибиторную активность Ь & раз» а По сравнению с Морфолинсодержащюц Производным На йорядок.

Аналогичная закономерность зависимости структуры от Действйя Наблюдается И Для ЩФН-завйсимоЙ системы. Видимо снижение ингибиторной активности при усложнении даалкилашнйой грушш у йройэводнмх госсипола связано о ухудшением условий сорОЦии молекул ингибитора на мембранной Поверхности.

По убыванию антиокислитель»« свойств госсипол и его

проиэводные располагаются следующим образом: бис-диэтиламинэтилимингоссипол > госсипол > бис-пиперидин-втилимингоссипол > бис- морфолинэтилимингоссипол.

Действие ионола и его производных на ферментативное и неферментативноз перекисное окисление липддов №.- росом печени крыс.

Известно, что одним из эффективных антиоксидантов полифункционалыюго действия является известный препарат 2,6-дитрет-бугил-4-метилфенол ( ионол) (71), на его основе синтезировали ряд фосфорорганических производных? фосфат ионола (H0-I6I) (711), диэгилфосфятиокола (КФ-124) (VIII), этилфо1шлфосфонатионола (КФ-131) (IX:) я дкфеиилфосфдаат--ионола (КМЗЗ) -(X).

С(СН})3

(С113)3С

н X

«O-jf-OH'

0 ш . ■ иШБ

,сн3,эс '>««,,», (C1V3C^.C(CW3|3 . . • F«i

Ж

При исследовании ионола и его фосфорорганичеслк производных в двух системах микросомального окисления в диапазоне вводимых концентраций от 1.1О-7 до 1.10"^ М они показали себя в качество антиокислитолышх препаратов

(табл.Б).

Таблица 5

Концентрации производных ионола, при которых происходит 50 Я-ное ингибирование выхода «алонового диальдегида.

Соединение

Аскорбат-

НАДФН-

1. ионол

2. H0-I6I

3. КФ-124

4. НФ-Ш Б. КФ-13Э

8.I0-6 М Б.Ю~б М I.I0-5 М 8 Л О-6 М 7.6.I0"6 М

гб

6.I0_D м

Б .10 Ы 1.10"Б Ы

С ТП-6 «I

6.10~° М 6.I0-6 М

В аскорбат-зависимой системе микросомального окисления

ионол (VI) и КФ-131 (IX) имели одинаковое значение

концентраций, при которых происходит 60 Ж-ное ингибирование

выхода ЫДА (8.Ю-6 Ы) , для КФ-133 (X), имеющего два фениль-

ных заместителя у атома фосфора это значение было равным -6

7,6.10 М. Вамена двух фенильных заместителей1 у атома фосфора на два втоксилышх радикала (КФ-124) (YIII) уменьшает его АО активность для двух систем окисления (1.10~Б М), а препарат K0-I6I (vil), у которого водород ме ьной

Антиокислительная активность Новых фосфорорганических производных ионола существенно зависит от строения Молекулы ингибитора, увеличение Гидрофобности Молекулы усиливает эту активность на Порядок, что( видимо, связано о сорбционной активностью ¡этих соединений йа поверхности мембраны.

Таким образом» оба класса соединений оказывают влияние как йа йскорбат-, так и ка НАДФН-зависимую систему микросомального окисления. Эффективность Производных ионола в двух сйстеках окислений была одинакова, что указывает на йнгййированиэ реакций разветвления цепей, а на зарождения их. Производные госсипола в основном более аффективна в аскорбат-зависймой системе и несколько теряли свою активность в ферментативных цепях.

группы замещен на фосфат, еще Менее активен (6.10 М)

Д8ЙСТВИЭ гоосшола и его производных на иерекисноэ окисление липидов синаптосом из мозга крыс При действии антихолинэствраэных веществ, тормозящих активность ацетилхолинэстеразы, происходят нарушения мембранных процессов, в том числе и оксигенных.

В связи о этим производные госсшхола н ионола были исследованы в качестве антиоксидантов в пэрекисном окислении липидов синаптосом мозгаа также изучена их айтихолин-встеразная активность.

Изучено действие госсипола и его производных на уровень ПОЛ синаптосом методом в'е-индуцированной хэшшшинесценвдн (табл. 6)-

Таблица 6 ■ Действие госсипола и его производных на ПОЛ синаптосом из мозга крыо

Концент- Гос- I II III IV V

рация сипол

■ (М) . а tgа а tga а а ¡в* а 1;«а а

I. Контроль 75 3,73 75 3,73 75 3,73 75 3,73 76 3,73 75 3,73

2. 1.10"' 74 3,48 14 3,48 74 3,48 75 3,73 74 3,48 74 3,48

3. ЗЛО-7 70 2,74 71 2,90 73 3,27 74 3,48 73 3,27 73 3,27

4. БЛО"7 64 2,05 64 2,05 72 3,07 73 3,27 72 3,07 72 3,07

5. 1.10"6 60 1,73 66 1,48 68 1,60 70 2,74 69 2,60 70 2,74

б. 3-Ю"6 54 1,37 47 1,07 45 1,0 55 1,4 68 2,47 67 2,35

7. 5ЛО"6 43 0,93 35 0,7 35 0,7 67 2,34 68 2,47 65 2,14

8. 1.10"5 - - - 22 0,4 31 0,6 65 2,14 63 1,96

9. 5.10"6 - _ - БЭ 1,66 60 1,7Б

I - бис-диатиламинатилшингоссипол

II - бис-шперндгаэтшгишнгоссйлол

III - бис-морфолинатилимйнгоссипол

IV- м- бис-даэтиланилюшмингоссипол

V - п- бис-диэтиланилинимингоссипол

Из таб. 6 видно, что в диапазоне ко}щентраций от 1.1 до 5.10"6 М госситтол и его произподянч проявляла

антиокиолительноо действие. БО %-яоа ингибирование свечения ХЛ имело место при следуицих еначешях концентраций веществ (табл.7):

Таблица 7.

Значение концентраций,производных госсилола, при которых происходит БО %-ноэ ингибирование дарэяисного окисления липадов синаптосом.

Соединение Концентрация .

1. Госсипол ¥,5-10"^ М

-7

2. Бис-даэ ти ламшэтилимингос сипол 8,6-10 М

3. Бис-шшеридинэгилимингоссипол 3 -Ю-6 М

4. Бис-морфолинэтилимингоссипол б-Ю-6 М

Б. М-био-дизтиланилинимингоссипол 3 'Ю-5 М

6. П-бис-диэтиланилинимингоссипол 4 -Ю-6 М

Из значений 50 Ж-ного ингибирования видно, что бис-дизтиламинэтилимингоссипол и сам госсипол являются самыми активными ангиокислителышми препаратами, для них это значение было равным 8,6-Ю""7 М: Замена диэтиламинэтилимин-ной группы на пиперидинэтилиминную приводит к увеличению значения концентрации для ВО %-ного ингибирования ПОЛ йа порядок. Замена этильного мостика в молекулах этих, ингибиторов на ароматическое кольцо на два порядка увеличивает значения концентраций, вызывающее 50 Ж-ное ингибирование ПОЛ, т.е. эти вещества существенно уступают по своей антиокислительной активности бис-диэтиламинэтилишн-госсиполу и самому госсиполу.

«Ь. Действие ионола и его производных на перекисное окисление липидов синаптосом из мозга крыс

Исследовали действие ионола и ого производных на перекисное окисление липидов синаптосом из мозга крыс. Использовали ту же хошлшинесцентную модель, что и в случае госсилола и его производных. Измеряли уровень звечения медленной всшшки (рис. 3).

Из рис. 3 видно, что до концентрации I • 1СГ6 М все изученные вещества снижают уровень свечения ХЛ лишь на 7 % ог первоначального контрольного уровня. При увеличении та

юнцентрации в пробе синаптосом их АО активность увеличивалась в равной степени. Наиболее сильно АО активность увеличивалась для ионола (VI), затем по мере убывания активности для НФ-133 (X), КФ-131 (IX) и КО-161

К0НЦ5НГРАВДЯ ( и )

Рис.- 3. Взаимодействие ионола (I), №-133 (2), КФ-131 (3), КФ-124 (4) й КО-161 (Б) о синаптосомами Из мозга крыс. БО %-ное ингибироваййэ свечение уровня ХЛ имело место лри следующих значениях концентраций производных ионола (табл. 8).4

Таблица 8.

Значения концентраций, прй которых происходит ВО %-яов ингибирование ПОЛ синаптосом

Соединенна Концентрация

I. Ионол 6.10"6 и,

2. К0-1Б1 I -ю-4 м

3. КФ-131 6Ю'Б ы

4. КФ-133 2 10"Б м

Как видно из полученных данных, замещение различными $осфорорганическши радикалпмй водорода ыотилыгой группы в вдлокулп ионолл пришдит к йпменотт пптиокислителышх

свойств. Дифенилфосфинат ионола (КФ-133) (X) в меньшей степени ослабляет антиокиолительныэ свойства по сравнению с самим ионолом (VI). Наименьшей АО активностью обладал фосфатионол (К0т161) (VII).

И в атом случае существует определенная закономерность влияния антиокислительной активности от структуры молекулы ингибитора, которая была обнаружена наш в предыдущих исследованиях.

При сравнении действия госсиполышх производных на ПОЛ синаптосом по сравнению с невольными производными видно, что и в этом случае соединения госсшольного ряда оказались более активными, что подтверждает преимущество природных соединений при действии на биологические объекты.

6.Действие госсипола и его производных на хешлтине сценцию шритонвальных макрофагов

Влияние препаратов на активность оксидазных систем перитонвальных макрофагов изучали методом лшинол-зависимой хемилюминесцвнции, активируемой оисонизированным зимазаном. Стимуляадя макрофагов радикально меняет их метаболический профиль. Происходит "респираторный взрыв" - резкое увеличение расхода глюкозы с одновременным возрастанием потребления кислорода и образованием мощных биооксидантов-лерекиси водорода и свободных радикалов.

Было важным исследовать действие госсипольшх производных (рис. 4) на иммунно-компетентные клетки, к которым относятся макрофаги.

Из рис. 4 видно, что госсипол, бис-диэтиламинетшшшн-госсипол и м-бис-диэтилашшшимингоссипол одинаково влияют на уровень свечения ХЛ, а п-бис-диэтиланилинимингоссяпол обладал менее выраженными АО свойствами.

50 % ингибироваяие свечения имело место при следующих концентрациях: госсипол - 6,4 Ю"7 М, бис-диэтиламинэтил-имингоссипол - 6,4 10"''' М, м-бис-диэтиланилинимингоссипол -Г.,4 Ю"7 М и п-бис-диэтшшшлшпшингоссипол - 1,2. Ю"6 М.

Из этих данных видно, что АО действие п- и м-изомеров производных госсипола зависит от полокения заместителей в анилиновом кольце: м-яроизводное обладает большой антиокислительной активностью но сравнении с п-изомером. 50 2

-ное пошкение уровня люминол-зависимой ХЛ макрофагов для м-изомэра происходит при концентрации на порядок меньше (6,4Л0~7 М>, чем для п-изомера (1,2Л0~6 М). При сравнении антиокислительных эффектов п- и м-бис-диетиланилинимингос-сиполов с яативннм госсиполом и с бис- диметилампнэтил-имингоссиполом видно, что 10 действие можно усилить или ослабить при Помощи вводимых функциональных групп в молекулу госсипола. :

кшютршя (10

Рис. 4. Взаимодействие госсипола (I), бис-диэтил-ашнэтилимингоссипола (2), м-бис-диэтиланилинимин-госсипола (3) и п-бис-даэтиланшпшшингоссипол (4) с иеритонвалышми макрофагами.

Действие йонола и его производных на хемшшминасценции перитонеальных Макрофагов

Для изучения влияний ионолЬных. соединений на активность оксидазных систем Перитонеальных макрофагов Использовали ту же Модель< что й в случае госсипольных производных (рис* 5}.

Ионол и его производные подавляли уровень свечения хемиляминёсценции в диапазоне концентраций от I Ю-7 до I Ю-4 М. 25 Ж-Еоэ снижение уровня свечения ХЛ для КФ-133 и ионола имело место при концентрации ЗЛО"7 и 3,7Л0~7 II, соответственно. 50 ж-ное йнгйбировшше свечения уровня хемилттясисшти происходило при следупиих ко(п(<>1ггр<шия*

шгибпторов (табл. 9).

Рис. Б. Взаимодействие КФ-133 (I), ионола (2), КФ-131 (3), КФ-124 (4), И КО-161 (Б) с перитонэальшми макрофагами.

Таблица 9.

. Значения концентраций ингибиторов, при которых происходит 5СЖ-НОЭ ингибирование уровня свечения ХЛ.

Соединение Концентрация

1. Ионол 4,8.10"® Ы

2. КО-161 2,1 Л0~5 М

3. КФ-124 9,1. КГ6 М

4. К&-131 6,5 Л О"6 Ы

5. КФ-133 2-Ю-6 М

КФ-133 сильнее подавлял уровень свечеши хемялшинесцонцяи по сравнению с ионолом, КФ-131 немног< уступал ионолу но антиокислительной активности. Как вид» из полученных дашшх, для рассматриваемых препаратов прояв ляотся одно л та же тенденция: введение объемных гидрофоб

ншс груш (КФ-133) увеличивает АО свойства, вводе- гше более полярных заместителей (КФ-124, К0-161) в молекулу ионола уменьшает АО свойства. Следует отметить, что в этом случаа модификация молекулы ионола дифенилфосфинатным радикалом (КФ-133)привело к усилению антиокислительной активности.

Изучение антихолинзсгеразной активности производных госсипола и ионола Анализ структуры производных госсипола указывает на то, что эти соединения могли бы обратимо угнетать каталитическую активность холинэстераз ( АХЭ и БуХЭ ). Поэтому в атом разделе представлены результаты по изучению антихолинэстеразщх свойств полученных наш производных госсипола по отношению к ацетилхолинэстаразе (АХЭ)' эритро цитов крови человека и бутирилхолинэстераза сыворотки крови лошади (таблЛО). В качестве •характеристики реакционной способности ингибиторов приведены значения констант ингибирования, ' выракенныа в величинах рК^, отражающих связывание ингибитора с ферментом.

Таблица 10 Антихолинэствразная активность производных госсипола

ДО Название рКА АХЭ рк1 Рк11 БуХЭ «1*

I Бис-диэтиламин-

БТИЛИМИНГОССИПОЛ 3,09 3,48 3,19 4,07 3,35 3,00

2 бис-пипвридиа-

этилимингоссипол 4,04 3,92 2,50 4,9 3,42 3,1

3 Бис-морфолин-

этйлимингоссипол 3,55 2,28 2,96 4,27 - 4,3

4 П-бис-диэтилани-

линимингоссипол 2,91 2,78 2,00 3,42 3,35 3,8

5 М-Оис-диэтилани-

линимингоссипол 3,69 3,48 3,15 4,07 3,32 3,55

к1' К1 ~ обобщенная, конкурентная и бесконкурентная ингибиторные константы.

В табл. 10 лредотавлонн результаты по изучении внтихолинастеразной активности этих препаратов. 0Ш1 являются типичными обратимыми ингибиторами, так как эффект шггибирования этшли соединениями не зависит от времени инкубации с ферментами и наступает сразу же после добавления ингибитора в реакционную' среду. Эти вещества тормозят активность АХЭ и БуХЭ по смешанному типу, т.е. .помимо связывания с активным центром они также связываются с периферическими участкам ферментов и таким образом препятствуют полному контакту субстрата с их активным центром. __

Присутствие в молекуле ингибиторов четвертичной аммониевой группы указывает на то, что они сорбируются в районе анионного участка фермента.

Связывание препаратов с холиыэстеразами в первую очередь происходит за счет ион-ионных взаимодействий, а также в результате гидрофобного взаимодействия. циклических структур с гидрофобными участками, обрамляющими анионный центр фермента. Величины констант обратимого ингибкрования показывают, что способность угнетать активность холшшстераз зависит от природы фрагментов, включенных в молекулу госсипола.

Бис - диэтиламинетилимингоссипол содержит фрагмент, который имеет сходство с холином, что должно было проявить сродство полученного вещества к холинэстергзе. Это вещество взаимодействует с холинэстеразами и вызывает ингибирование активности АХЭ и БуХЭ, причем , его активность занимает промежуточное положение среди изучаемых препаратов. Наиболее сильным ингибитором АХЭ и БуХЭ в ряду изучаемых веществ был бис - ттеридинэтилимйнгоссшгол. Его активность по отношении к БуХЭ более чем б 8 раз выше по сравнению с АХЭ. Замена пиперидина на морфолин ослабляет ингибирование по отношению к АХЭ в 3,06 раз и в 4,87 раза увеличивает его эффект по отношению к БуХЭ. Полученные результаты свидетельствуют, что структура анионного пункта каталитического центра АХЭ более адаптирована к сорбции Оис-шшеридинэтилимингоссяшола, а БуХЭ к бис-морфолинэтил-имингоссшолу.

При рассмотрешш п- и м-Оис-диэтилшшлшшмингоссшюлов видно, что на антихолинэстеразную активность оказывает влияние положение диэтиламиногрушш в бензольном кольце. При нахождении этой группы в мета-полокеши ингибирование АХЭ и БуХЭ более интенсивное, чем в пара-положении.

Следует отметить, что во всех случаях независимо от положения . аммониевой группировки торможение скорости гидролиза под действием БуХЭ заметнее выше, чем в' случае с АХЭ. Это мокет быть результатом дополнительных гидрофобных взаимодействий, происходящих как за счет самого госсиполыюго фрагмента, так и за счет функциональных груш, введенных в его молекулу.

Ионол и его производные оказались слабыми ингибиторами холинэстераз. Изменения в структуре ионола не вызывают уменьшения или увеличения их ингибирупцей. активности к холинэстеразам. Вез соединения ионольного ряда являются слабыми обратимыми ингибиторами АХЭ и БуХЭ. Следует отметить, что отличительной особенностью всех производных госсипола является их . 3-4 -кратная эффективность .по сравнению а ионольннми производными.

ВЫВОДЫ •

1. Синтезировано 5 новых производных госсипола, структура которых была доказана различными физико-химическими методами.

2. Показано, что новые производные госсипола и ионола оказались аффективными ингибиторами окислительной деструкции мембран микросом печени крыс. Ингибиторная активность существенно зависит от гидрофобности молекул ингибиторов. Новые производные госсипола являются более эффективными антиоксидантами по сравнению с фосфорорганическими производными ионола.

3. Госсипол и его производные в концентрации Ю-7 и ингибировали оксигенную деструкцию мембран синаптосом, причем бис-диэтиламинэтилимингоссипол является наиболее активным антиоксидантом. Ингибирупцая активность производных ионола проявлялась в концентрации Ю~е - и.

4. Показано, что производные госсипола и фосфороргттчоскио проипподттпе иопо.пп окапались яффпктиррмми рогуляторпмч

киалородзависимшс реакцш! пергтонвальных макрофагов. Действующая концентрация производных госстола (I0~7 I!) была на порядок ниже действующей концентрации производных ионола. Б. Показано, . что производные госсшгала по своей антихолинзстеразной активности на три порядка превосходят фосфороргашчэскиэ производные ионола.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Д.Н.Далимов, Е.Н.Мухамвдканова, 3. Тилябаев, В.Б. Шнейвайс, Л. Биктимиров, А.И.Исмаилов. Антиоксидант-ше свойства производных госсшола, обладающие холкн-сзргической активностью // Тезисы докл. Iii Всесоюзной

• конференции "Биоантиоксвданг", Москва, 198Э,С. 161- 162.

2. Д.Н. Далимов, E.H. Мухамеджанова, В.Б. Шнейвайс, Л. Биктимиров, А.И. Исмаилов, Ф.Г. Камаев. Сштез, строение и действие некоторых производных госскпола на переклепав окисление л:шидов биосубстратов // Химия природных соединений, 1989, Л 5, С. 707-712.

3. Д.Н. Далимов, E.H. Мухамедшюва, 3, Тилябаев, В.Б. Шнэйвайс, Л. Биктимиров, А.И.Исмаилов. Зависимость шк-ду структурой новых модифицированных форм госсшола и их биологической активностью // Тезисы докл. IX Советско-индийского симпозиума по химии природных соединений, Рига, 1989, С. 67-68.

А. E.H. Мухамеданова, Д.Н. Далимов, 3. Тилябаев, В.Б. Шнейвайс, Ф.Г. Камаев, Л. Биктимиров, А.И. Исмаилов. Синтез, строение бис - даэтиланилинимингоссиполов, их онтиокислигельная к антнхолинэстеразная активность /V Уцмлп природных. соединений, 1991, Х-2, С. 184-103.

Список использовашщх сокрадоний ПОЛ - лэрекисное окисление липидов; ХЛ - хемилшшэсцвнния; ВДА - малоновий даальдегид; АО активность витмокислитэльная активность; АХЭ - аиетилголшэотераза; ВуХЭ - Оутирилхоллнэстераза.