Оценка биологической активности антиоксидантов на основе анализа экспрессии стресс-индуцибельных бактериальных оперонов

Празднова, Евгения Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оценка биологической активности антиоксидантов на основе анализа экспрессии стресс-индуцибельных бактериальных оперонов
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Оценка биологической активности антиоксидантов на основе анализа экспрессии стресс-индуцибельных бактериальных оперонов"

На правах рукоп/и

Празднова Евгения Валерьевна

ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТОВ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ЭКСПРЕССИИ СТРЕСС-ИНДУЦИБЕЛЬНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ОПЕРОНОВ

03.01.04 - биохимия, 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ОЬВ 2014

Ростов-на-Дону 2013

005544697

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте биологии Академии биологии и биотехнологии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» и на кафедре генетики Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет».

Научные руководители: Чистяков Владимир Анатольевич,

доктор биологических наук, заведующий лабораторией экспериментального

мутагенеза НИИ биологии ЮФУ (Ростов-на-Дону)

Усатов Александр Вячеславович

доктор биологических наук, профессор кафедры генетики ЮФУ (Ростов-на-Дону)

Официальные оппоненты: Крукиер Ирина Ивановна, в.н.с. отдела медико-биологических проблем РНИИАП, доктор биологических наук

Морданов Сергей Викторович, зав. лаб. медицинской генетики РостГМУ, кандидат медицинских наук

Ведущая организация: Саратовский государственный медицинский университет.

Защита диссертации состоится «4» марта 2014 г. в «11.00» часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 в ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» (г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/1, акт.зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148.

Автореферат разослан «/У»2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, с.н.с. Г \ Е.В. Асланян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время в биологии и медицине широкое распространение приобретает концепция системного подхода, рассматривающая живой организм в качестве сложной системы прямых и обратных связей. Многие патологические явления при детальном исследовании их механизмов демонстрируют свою «системность», являясь, по сути, результатом не столько активации, либо инактивации отдельных молекулярных механизмов, сколько результатом дисбаланса в общеорганизменных процессах.

Одним из наиболее ярких примеров системного дисбаланса в живых организмах является окислительный стресс. Существует мнение, что за счет этого механизма (роста свободнорадикальных повреждений на молекулярном уровне, нарушения баланса в работе антиоксидантной системы организма, нарушения регуляции клеточного гомеостаза) реализуются такие явления, как феноптоз (Skulachev, 1997), старение и связанные с ним патологии (Зенков, 2001; Хавинсон, 2003; Дубинина, 2006, Skulachev, 2007). Генерация активных форм кислорода (АФК) значительно усиливается также при развитии стрессорных реакций и воспалительных процессов (Часовских, 2009). Поэтому актуальным является поиск соединений, обладающих системным биологическим эффектом, среди антиоксидантов, способных противостоять окислительному стрессу. При скрининге этих соединений необходимо рассматривать как биохимические, так и генетические аспекты их функционирования - и способность прямо или опосредованно инактивировать АФК (антиоксидантную активность), и способность защищать генетический аппарат клетки от окислительных повреждений (антигенотоксическую, или ДНК-протекторную активность).

Первые шаги в этом направлении уже были предприняты российскими и зарубежными геронтологами при изучении свойств олигопептидов (Хавинсон, 2001), фуллеренов (Baati, 2012), соединений ряда SkQ (производных пластохинона) (Skulachev, 2007; 2011; 2012). Геропротекторные и прочие системные эффекты этих соединений могут быть частично или полностью основаны на их антиоксидантной активности.

Однако исследования in vivo на животных достаточно трудоемки и требуют длительного времени. Очевидно, что необходимы более простые и информативные модельные системы. В качестве таковых систем можно использовать бактериальные биосенсоры - генно-модифицированные штаммы бактерий, способные сигнализировать об изменении внутриклеточной среды, увеличивая экспрессию определенных генов. Было сформулировано предположение о возможности прогнозирования системного биологического эффекта у млекопитающих путем оценки способности соединений снижать окислительный стресс в ходе экспресс-скрининга с применением системы LUX-биосенсоров (Чистяков и др., 2013). Возможность подобной экстраполяции логически вытекает из общности

антиоксидантных механизмов для всех живых организмов, поскольку поддержание редокс-статуса клетки является одной из первых эволюционных задач, решенных природой еще на уровне прокариот.

Согласно данным литературы, смеси антиоксидантов могут проявлять более высокую протекторную активность, чем отдельные вещества, т.е., для таких смесей наблюдается синергетический эффект (Greul, 2002; Lin, 2003). В связи с этим были исследованы как отдельные вещества, так и комплексные смеси.

Цель и задачи исследования. Целью работы является исследование антиоксидантной и ДНК-протекторной активностей ряда соединений в экспресс-тестах с применением бактериальных LUX-биосенсоров и прогнозирование их антимутагенной и системной биологической активности на основе результатов тестов.

Были поставлены следующие задачи:

1) Провести сравнительный анализ чувствительности к индукторам окислительного стресса этимологических методов и метода, основанного на детекции уровня экспрессии оперонов, объединяющих стресс-промоторы, промоторы SOS-репарации и структурные гены люциферазного оперона.

2) Изучить способность ряда веществ с подтвержденной в опытах на млекопитающих геропротекторной и адаптогенной активностью (SkQl, олигопетиды) защищать клетки биосенсоров от повреждения индукторами окислительного стресса и генотоксинами.

3) Изучить антиоксидантную и антигенотоксическую активности синтетических и природных соединений (экранированных фенолов, каротиноидов бактерии Deinococcus radiodurans) с целью отбора наиболее эффективного протектора для дальнейших испытаний на экспериментальных животных.

4) Оптимизировать условия культивирования D. radiodurans для получения максимального содержания каротиноидов.

5) Изучить способность диоксидина индуцировать устойчивость к рифампицину у Escherichia coli.

6) Изучить антимутагенную активность каротиноидов D. radiodurans в модели индуцированного мутагенеза у Е. coli.

7) Определить влияние каротиноидов, экстрагированных из D. radiodurans, на динамику заживления ран у мышей линии CD-I и уровень окислительных модификаций белков в сыворотке крови.

Научная новизна. С помощью системы бактериальных биосенсоров впервые изучены антиоксидантная, антигенотоксическая и антимутагенная активности каротиноидов D. radiodurans, ионола и соединений из ряда экранированных фенолов: 4(3',5'-дитретбутил-4'-гидроксифенил) тиобутилтрифенилфосфоний бромида и 3-бис(3',5'-дитретбутил-4'-гидроксибензил) аминопропилтриметиламмоний иодида, липофильного катиона с антиоксидантной нагрузкой (SkQl), четырех олигопептидов

(панкраген, пинеалон, везуген, изовилона), ряда пробиотических препаратов бактериальной природы.

Впервые продемонстрирована супероксидустраняющая активность SkQl (производного пластохинонилдецилтрифенилфосфония) в опытах in vivo. Показано, что соединения, для которых в литературе описана адаптогенная и/или геропротекторная активность, обладают еще и свойствами антиоксидантов и антигенотоксинов.

Впервые показана способность нелетальных для бактерий доз диоксидина вызывать значительное усиление частоты устойчивых к рифампицину мутантов Е. coli, а также способность природных каротиноидов снижать интенсивность этого эффекта.

Практическая значимость. Экспериментально подтверждена возможность прогнозирования системной биологической активности соединений на основании результатов экспресс-тестов на антиоксидантную и антигенотоксическую активности.

Показано, что каротиноиды D. radiodurans стимулируют заживление ран как при наружном, так и при сочетанном (наружном и пероральном) введении, и более эффективно повышают скорость регенерации кожных ран у мышей со стрептозоциновым диабетом I типа, чем ликопин.

Подобраны оптимальные параметры культивирования D.radiodurans, позволяющие повысить прирост биомассы и содержание каротиноидов по сравнению с культурой, выращенной на стандартной среде.

Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых фармакологических и косметических препаратов. Область применения — медицина, фармакология, косметология.

Материалы работы используются при чтении лекций на кафедрах биохимии и генетики Южного федерального университета в спецкурсах «Свободные радикалы в биологических системах», «Современные проблемы генетики», «Мутагены окружающей среды».

Положения, выносимые на защиту.

1) Оценка уровня экспрессии плазмидного KatG оперона в биолюминесцентном тесте является более чувствительным методом определения уровня перекиси водорода, чем стандартный энзимологический тест на активность катал азы.

2) Препарат, проявивший максимальный протекторный эффект в экспресс-тестах, проявляет также антимутагенную активность и стимулирует заживление ран у экспериментальных животных.

3) Механизмы системной биологической активности ряда веществ могут быть в значительной мере обусловлены их влиянием на антиоксидантный баланс и стабильность генетического аппарата клетки, поэтому возможно прогнозирование подобной активности на основании экспресс-тестов на антигенотоксическую и антиоксидантную активность веществ.

Апробация результатов исследований. Материалы, положенные в основу работы, были представлены на следующих конференциях: на XLIX Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», 2011 г. (Новосибирск); IV Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины", 2011г. (Ростов-на-Дону); Международной конференции «Биология - наука XXI века», 2012 г. (Москва); Научно-практической конференции на базе Южного Федерального Университета «Миссия молодежи в науке», 2012 г. (Ростов-на-Дону); Научной конференции «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии», 2013 г., (Ростов-на-Дону); V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», 2013 г. (Ростов-на-Дону).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 5 статей в журналах, рецензируемых ВАК Минобрнауки РФ. Получено одно свидетельство о регистрации электронного ресурса «База данных по бактериальным LUX-биосенсорам». Общий объем публикаций составил 2,88 п.л., личный вклад -35,4 %.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 173 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, выводов, списка литературы (199 источников) и 2 приложений. Иллюстрационный материал включает 68 рисунков, 13 таблиц.

Работа выполнена при финансовой поддержке НИИ митоинженерии МГУ, Министерства здравоохранения и социального развития РФ, и Министерства науки и образования РФ в рамках проекта 4.5835.2011 «Исследование механизмов действия негативных антропогенных и экстремальных факторов среды с помощью клеточных биосенсоров».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы исследования. В работе использовали рекомбинантные штаммы E.coli, содержащие плазмиды с опероном luxCDABE фотобактерии Photorhabdus luminescens, поставленным под контроль соответствующих промоторов Е. coli. Данный оперон содержит гены люциферазы и их регуляторы и обеспечивает биолюминесценцию, используемую в данном тесте в качестве репортерной функции. Были использованы следующие штаммы: Е. coli MG 1655 (pSoxS-lux), Е. coli MG1655 (pKatG-lux), E. coli AB 1157 (pRecA-lux), E. coli MG1655 (pRecA-lux), E. coli C600 (pPLS-1), E. coli C600 (pPBA-5), E. coli MG1655 pColD-lux, E. coli MG1655 pXen7. Биосенсоры с промоторами PkatG и PsoxS фиксируют наличие в среде окислителей, образующих в клетке гидроперекиси и супероксид-анион-радикал. Биосенсоры с плазмидами pRecA, pColD, pPLS-1 фиксируют наличие в клетке факторов, вызывающих повреждение ДНК. Штаммы, несущие промоторы рХеп7+ и рВА+, содержат конститутивные промоторы, позволяющие оценить влияние изучаемых

факторов на функционирование люциферазной системы, чтобы исключить ложно-положительные и ложно-отрицательные результаты.

В качестве индукторов окислительного стресса использовали источники ультрафиолета (УФ) 3 типов (С12-эксилампа высокой интенсивности, излучающая УФ с длиной волны 258 нм, доза 2,7 Дж/м2-с; С12-эксилампа низкой интенсивности, Х.=311 нм, доза 12,2*10'7 Дж/м2-с; ртутная лампа низкого давления (HG-125), Х.=300-400 нм, доза 13 Дж/м2-с; гипербарическую оксигенацию (ГБО) в режиме 0,3 мПа, 60 минут; паракват (1,Г-диметил-4,4-дипиридилий дихлорид); диоксидин (1,4-диоксид 2,3-хиноксалиндиметанол); пероксид водорода. В качестве протекторов использовали: Ю-(б'-пластохинонил) децилтрифенил фосфоний (SkQl); токоферола ацетат; аскорбиновую кислоту; тролокс; олигопептиды (панкраген, пинеалон, везуген, изовилон); пробиотические препараты на основе ряда микроорганизмов и их метаболитов (препараты на основе метаболитов: 1 («Хилак форте») - Lactobacillus helveticus, Escherichia coli, Streptococcus faecalis и Lactobacillus acidophilus (беззародышевые водные субстраты), 2 («Споробактерин») - Bacillus subtilis 534, 3 («Нормазе») - лактулозы, 4 («Бифиформ») - Bifidobacterium longum и Enterococcus faecium, 5 («Бифидобак») - Bifidobacterium longum, B.olescentis, B.infantis и Streptococcus hermophilus, 6 (Бактисубтил) - Bacillus cereus IP 5832, 7 («Натто») -Bacillus subtilis natto, 8 («Линекс») - Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium infantis и Enterococcus faecium, с содержанием лактозы); экстракт каротиноидов штамма D.radiodurans ВКПМ В-8209; соединения из группы экранированных фенолов, синтезированные в Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского НЦ РАН. Для первичного скрининга среди группы экранированных фенолов были использованы 14 соединений, полученных на основе 3',5'-дитретбутил-4'-гидроксифенола. Для дальнейших опытов из них были отобраны 4(3',5'-дитретбутил-4'-гидроксифенил) тиобутилтрифенилфосфоний бромид (2) и 3-бис (3',5'-дитретбутил-4'-гидроксибензил) аминопропилтриметиламмоний иодид (7).

Мыши аутбредного стока CD-I в количестве 102 особи получены из «Питомника лабораторных животных» ФИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Работа выполнена с соблюдением принципов Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.).

Методы исследования. Этимологические исследования и тесты in vitro.

Супероксидустраняющую активность SkQl in vitro определяли в стандартной тест-системе (SOD determination kit 19160, Sigma). Измерения оптической плотности проводили на планшетном ридере автоматического анализатора Alisei (Radim). Активность рассчитывали по Фридовичу (1979). Активность каталазы определяли по методу Королюка (1988). Для определения концентрации белка использовали метод Эрисманна (Ehresmann, 1973). Каротиноиды экстрагировали смесью ацетона и

метанола 1:1 - 10 мл на 1 г сырой массы бактерий. Оценку содержания каротиноидов производили спектрофотометрически (Lichtenshaller, 1987).

Для оценки биомассы использовали центрифугирование культуры на 14500 об/мин с последующей сушкой осадка в пробирках «Эппендорф» объема 1,5 мл при 70°С.

Биолюминесцентный тест. Количественную оценку уровня повреждений ДНК и окислительного стресса производили, измеряя уровень биолюминесценции биосенсорных штаммов. Антиоксидантную и ДНК-протекторную активности соединений изучали путем оценки влияния вносимых в систему антиоксидантов на экспрессию ряда оперонов бактериальных клеток под действием химических и физических индукторов окислительного стресса.

Фактор индукции SOS ответа (Is) и показатель протекторной активности (А, %) рассчитывали по формулам:

Is 1 (1), Л = (1-^-)100% (2)

Lk Ip

где: Lk - интенсивность люминесценции контрольной пробы (в условных единицах); Le - интенсивность люминесценции опытной пробы (в условных единицах); 1а - фактор индукции SOS-ответа исследуемым воздействием в присутствии протектора; 1р - фактор индукции SOS-ответа исследуемым воздействием.

Признаком достоверности эффекта SOS-индукции считали статистически достоверное превышение Le над Ц, оцениваемое по t-критерию.

Микробиологические методы. Оценку интенсивности роста D.radiodurans в разных условиях проводили с использованием стандартной методики параллельных разведений в физиологическом растворе, посева на плотные агаризованные среды и учета количества КОЕ/мл в соответствии с санитарными правилами 1.2.731-99 и ГОСТ Р 51446-99 (ИС07218-96).

Тест на антимутагенную активность. Для изучения антимутагенной активности использовали определение частоты устойчивых к рифампицину (100 мг/л) мутантов в присутствии потенциальных протекторов и без них. Индуктором мутагенеза служил диоксидин. Уровень индукции рассчитывался как отношение числа КОЕ (колониеобразующих единиц) в контроле к числу КОЕ в опыте.

Эксперименты на животных. Диабет I типа вызывали у 10-11 недельных самцов мышей аутбредного стока CD-I путем внутрибрюшинного введения стрептозоцина (Kunjathoor, 1996). Диабет I типа был выбран ввиду более резкой выраженности клинических симптомов при данной форме заболевания по сравнению со II типом. Заболевание диагностировали у мышей с уровнем глюкозы >250 mg/dl (14 ммоль/л) и полиуремией. Проводили также дополнительное измерение уровня глюкозы каждые 2 суток при пероральном введении каротиноидов D. radiodurans. Через 3-4 недели наносили полнослойную кожную рану путем удаления лоскута кожи диаметром 7-12 мм с площадью 1,5 % относительно площади поверхности тела

мыши. Каротиноидную фракцию D. radiodurans, растворенную в оливковом масле наносили на поверхность раны один раз в сутки, при пероральном введении использовали зонд. Контрольные животные получали оливковое масло, прошедшее все этапы обработки, которые использовались для получения препарата каротиноидов, в аналогичных формах и дозах. Использовались три способа введения препарата - накожно, перорально и сочетанно. Измерение площади раневой поверхности (планиметрическое исследование) в процессе заживления ран проводили с помощью цифровой макрофотосъёмки в 1, 3, 7,14и21 сутки после нанесения раны. Для оценки динамики заживления ран на фоне сахарного диабета рассчитывали общий процент снижения площади раны между последовательными измерениями. С помощью программы MathCad 2001 вычисляли средний процент уменьшения площади раны за неделю.

Степень спонтанного и металл-катализируемого окисления белков в сыворотке крови определяли по методу Левина (Levine, 1990) в модификации Дубининой (Дубинина, 1995).

Статистическая обработка дачных. Статистическую значимость определяли по t-критерию Стьюдента для независимых выборок при р<0,05. Нормальность распределения оценивали с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Расчеты производились в программе STATISTICA 5.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ результатов биохимического теста на активность кагал азы и уровня экспресии Kat-onepoiia в клетках биосенсорного штамма Е. coli MG 1655 (pKatG-Iux).

На рисунке 1 приведены результаты сравнительного анализа индукции биосенсорного штамма пероксидом водорода и степени увеличения в его клетках активности каталазы. Степень увеличения активности каталазы в этих случаях значительно различается: в биохимическом тесте активность фермента увеличилась в 3,1 раза, а в биолюминесцентном тесте в тех же пробах уровень экспрессии возрастал в 62,7 раза по сравнению с контролем (культурой, не обработанной перекисью).

Следовательно, экспрессия рекомбинантного оперона pkatG::/ia: CDABE, введенного в плазмиду, в 20,3 раза интенсивнее, чем экспрессия локализованного в бактериальной хромосоме kat-onepoHa, измеренная по его продуктам. Вероятно, этот эффект достигается за счет более высокой копийности плазмиды, несущей генноинженерный оперон, по сравнению с бактериальной хромосомой. Кроме того, классические методы определения активности каталазы отличаются невысокой специфичностью. Очевидно, что оценка уровня экспрессии плазмидного оперона с помощью биолюминесцентного теста является более чувствительным методом.

10"5 5-Ю"5 10"" 5-10" концентрация перекиси, М

концентрация перекиси, М

А Б

Рис. 1. Уровень экспрессии каталазного оперона в культуре E.coli MG 1655

(pKatG-lux), активированной рядом концентраций пероксида водорода:

А - в энзимологическом тесте, Б - в биолюминесцентном тесте. Тонкой линией обозначена линия аппроксимации, формула аппроксимации приведена над кривой.

Максимальная экспрессия рекомбинантной конструкции с промотором pkatG вызывается концентрацией перекиси водорода, в десять раз превышающей концентрацию, вызывающую максимальную индукцию каталазы, определенную методом Королюка (5-10"3 и 5-10"4 М соответственно). Тем не менее, область кривой, на которой возможна аппроксимация, значительно шире в случае биолюминесцентного теста.

Таким образом, модификация биохимических методов с использованием биосенсорных штаммов позволяет провести более точную оценку экспрессии оперонов системы антиоксидантной защиты. Преимуществом использования бактериальной люциферазы в качестве биохимического репортера является также возможность оценки ее активности люминометрическим методом, без разрушения клеток.

Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности липофильных катионов (SkQl). При изучении антиоксидантной и ДНК-протекторной активностей веществ с известными адаптогенным и геропротекторным эффектами было показано, что эти соединения обладают свойствами антиоксидантов. Поскольку окислительный стресс лежит в основе множества патологических процессов, механизмы адаптогенной и геропротекторной активности веществ могут быть в значительной мере обусловлены их влиянием (прямым или опосредованным) на антиоксидантный баланс в клетке.

Был изучен антиоксидантный и ДНК-протекторный потенциал производного пластохинонилдецилтрифенилфосфония (SkQl). Результаты биолюминесцентного теста (рис. 2) были также подтверждены в экспериментах in vitro (рис. 3).

Для Экр 1 максимальное значение ДНК-протекторной активности составило 94,7 % в концентрации 10"8 М, диапазон эффективных концентраций - 10"'-10"9 М. По-видимому, агентом взаимодействия 8к(31 среди АФК является супероксид-анион-радикал (или гидроксильный радикал), его инактивация была максимально эффективна в концентрации 10"5 и достигала 61,3 %, тогда как инактивации перекиси водорода под действием ЭкСИ не наблюдалось.

10-16 10-15 10-14 10-13 10-12 10-11 10-1О 10-Э 10-8 10-7 10-6 10-5

концентрация 5кЦ1, М

Рис. 2. Протекторный эффект вкр 1 в условиях гипербарической оксигенации (0,3 МПа; 60 мин) для штамма Е.соИ М01655 (рЭох8-1их). Обозначения: * - р<0,05

0,6

шшшшшш.

0,0

ю-6 ю-5 ю-"

концентрация SkQl, М

Рис. 3. Супероксидустраняющая активность (СУA) SkQl in vitro в концентрациях 10"6-10"4 М.

Защищая клетки от генерации супероксид-анион-радикала при ГБО, SkQl действует эффективнее, чем аскорбиновая кислота: максимальный протекторный эффект аскорбата в аналогичных условиях составил 30,2 %.

Супероксидустраняющая активность SkQl проявляется in vitro в концентрациях, на 9 порядков меньших, чем in vivo. Это может быть связано, с одной стороны, с накоплением вещества в клетках бактерий путем описанного в литературе (Skulachev, 2007) электрохимического механизма, и, с другой стороны, за счет формирования циклов окисления/восстановления, сопряженных с ферментами дыхательной цепи, в результате чего баланс окисленной и восстановленной форм остается постоянным без жесткой зависимости от концентрации (Skulachev, 2010).

Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности олигопептидов

Была изучена протекторная активность четырех олигопептидов (табл.1), адаптогенные свойства которых показаны в ряде работ Хавинсона В.Х (2003).

Таблица 1

Протекторная активность олигопептидов

Протектор Индуктор Штамм Эффективная концентрация, М Максимальный эффект, %

Панкраген УФЗ11 нм RecA-lux ю-' 6,1

KatG-Iux 10"4 14,1

Диоксидин RecA-lux ю-4 21,5

Пероксид водорода KatG-Iux ю-8 90,2

Пинеалон УФЗ 11 нм RecA-lux - -

KatG-Iux ю-4 3,8

Диоксидин RecA-lux Ю-3 34,0

Пероксид водорода KatG-Iux 10"6 42,9

Везуген УФЗ 11 нм RecA-lux ю-' 8,1

KatG-Iux ю-4 19,7 -

Диоксидин RecA-lux 10-J 62,7

Пероксид водорода KatG-Iux ю-7 23,6

Изовилон УФЗ 11 нм RecA-lux ю-' 31,7

KatG-Iux - -

Диоксидин RecA-lux ю-5 72,9

Пероксид водорода KatG-Iux ю-7 25,0

Обозначения: RecA-lux - штамм Е. coli MG1655 pRecA-lux, KatG-Iux- Е. coli MG1655

pKatG-lux.

Среди изученных олигопептидов в условиях окислительного стресса, индуцированного химическими соединениями, наиболее эффективными ДНК-протекторами являются везуген (активность составила 62,7 % для концентрации 10"3 М) и изовилон (72,9 % для концентрации 10"5 М). Диапазон эффективных концентраций - 10"4-10"8 М. Агентами взаимодействия являются пероксид водорода и, по-видимому, пероксильный радикал (см. ниже).

Протекторная активность в отношении повреждений ДНК, вызванных УФ, возрастала в ряду: пинеалон (0 %) —► панкраген (6,1 %) —> везуген (8,1 %) —> изовилон (31,7 %). Очевидна прямая корреляция с содержанием лизина в этом ряду: пинеалон (0%) < панкраген (25%) < везуген (33,3%) < изовилон (50%). Можно заключить, что для защиты ДНК от повреждающего действия УФ с длиной волны 311 нм ключевую роль играет наличие в молекуле остатка лизина (2,6-диаминогексановой кислоты). Для производных лизина, таких, как нацистилин (nacystelyn), известна способность инактивировать пероксид водорода (Gillissen, 1997). Кроме того, в работах Корниенко И.В. с соавт. (2001) и Чистякова В.А. с соавт. (2005) путем квантовохимических расчетов ab initio и модельных экспериментов было показано, что отдельные аминокислоты в водных растворах, в частности, лизин, могут быть эффективными перехватчиками супероксид-анион-радикала. Причиной высокой супероксидустраняющей активности лизина может являться его способность к образованию устойчивого межмолекулярного комплекса, сопровождающемуся переносом протона с аминокислоты на радикал. Подобный механизм позволяет уменьшить энергию, необходимую для восстановления 02" до Н202.

Степень защиты от действия диоксидина возрастала в ряду панкраген —* пинеалон —> везуген —► изовилон, что также согласуется с предположением о значимой роли лизина. Протекторная активность пинеалона может быть объяснена наличием в его молекуле ароматической аминокислоты триптофана, которая, как известно, обладает антиоксидантной активностью, перехватывая пероксильный радикал (Christen, 1990; Reiter, 1999).

При изучении защиты клеток от пероксида водорода, образующегося под действием УФ, активность олигопептидов возрастала в ряду пинеалон —> панкраген —» везуген, что также коррелирует с содержанием лизина в молекулах пептидов. Однако изовилон не проявил даже слабой активности в этом тесте. Это может быть связано с содержанием в молекуле других аминокислот с антиоксидантными свойствами, таких, как аспарагиновая кислота (Abad, 2002). Следует отметить, что антиоксидантные свойства олигопептидов могут быть обусловлены не только их непосредственным взаимодейстием с АФК, но и опосредованным влиянием на внутриклеточные механизмы поддержания антиоксидантного баланса.

Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности бактериальных пробиотических препаратов.

Данные по протекторной активности ряда пробиотических препаратов представлены на рисунке 4. Как и следовало ожидать, исходя из данных о синергетическом эффекте антиоксидантных комплексов (Allemann, 2008), среди пробиотических препаратов более эффективными оказались более многокомпонентные, представляющие собой смесь пробиотических микроорганизмов, субстратов для них и продуктов их жизнедеятельности.

{S 80I..........

2 70|

аI

» 60I.........

« 50I-

g о?I

а 40Г"

2 30Я—

и 20I

| 101 0 ■—1

Рис. 4. Эффективность препаратов при защите от действия диоксидина штамма Е. coli MG1655 pColD. Обозначения: * - р<0,05. 1-8 - пробиотические препараты (состав указан в разделе «Материалы и методы»).

Препараты проявили максимальную эффективность в разных участках диапазона доз: от 10"" до 10"'. Наименьшую протекторную активность показал препарат № 1, изначально содержавший только беззародышевые водные субстраты ряда штаммов. Наиболее эффективным протектором можно считать препарат № 8 -протекторный эффект составил 84,5 % в концентрации 10"6 М.

Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности экранированных фенолов

Соединения из группы экранированных или т.н. пространственно-затрудненных фенолов достаточно широко используются в качестве антиоксидантов. В данной работе была исследована протекторная активность ряда лигандов на основе пространственно-затрудненных фенолов и их металлокомплексов, синтезированных химиками Казанского ИОФХ. Поскольку ионол является простейшим соединением в гомологическом ряду экранированных фенолов, была произведена проверка его протекторных свойств в аналогичной системе биосенсоров и индукторов. По результатам предварительного скрининга (рис. 5) было отобрано 2 наиболее эффективных соединения, в дальнейшем обозначенных номерами 1 и 2 (полные

химические названия приведены в разделе «Материалы исследования»). На рисунке 5 эти соединения обозначены номерами 2 и 7, соответственно. 80

Рис. 5. Максимальный протекторный эффект исследованных веществ при действии перекиси водорода (10'3 М) на штамм Е. соИ М01655(рКа10-1их). Обозначения: * - р<0,05. 1 - 14 — соединения из группы экранированных фенолов.

Данные о протекторной активности двух наиболее эффективных соединений из группы экранированных фенолов, а также ионола в качестве контрольного соединения представлены в таблице 2.

Таблица 2

Максимальные значения протекторной активности экранированных

фенолов

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ионол

10-6 10-5 10-7 10-7 10-7 10-8 10-7 10-7 1()-в 1()-7 Щ"! Щ-7 1()-9 1()-10

Номер вещества, эффективная концентрация

Облучение Соединение 1 Соединение 2

RecA-lux KatG-lux RecA-lux KatG-lux

Время Доза УФ, Доза Эффект Доза, Эфф Доза, Эфф Доза, Эфф

облучения, Дж/м2 , М ект, М ект, М ект,

мин м % % % %

УФ 258 нм 1 162,18 кг1 44,1 ю-5 42,1 ю-5 60,5 10"5 43,4

5 810,9 10"s 32,2 10"ь 52,6 10"5 42,5 10"5 52,2

10 1621,8 10"' 44,2 Ю"10 35,0 10"s 59,4 ю-7 59,9

УФ 311 нм 5 61 -10"7 10_i 23,6 10"'° 55,8 ю-5 32,7 10"9 61,0

12 146,4-10"' 10"' 50,1 10"6 30,9 10"8 54,7 ю-5 43,2

20 244-10"7 10"6 26,0 ю-5 42,8 ю-5 43,2 10"6 42,3

Обозначения: RecA-lux - штамм Е. coli MG1655 pRecA-lux, KatG-lux- Е. coli MG1655

pKatG-Iux.

Антигенотоксический эффект составил 66 % для более эффективного из этих соединений - соединения 1 в концентрации 10"7 М, диапазон эффективных концентраций - 10~7-10" . Агентом взаимодействия для него является супероксид-анион-радикал, его инактивация была максимально эффективна в концентрации 10~7 М и достигала 56 %.

Соединение 1 проявляет антиоксидантную активность относительно широкого спектра физических и химических агентов, и, кроме нейтрализации отдельных АФК, демонстрирует способность защищать клетки от повреждения ДНК в целом, поскольку снижает индукцию прооксидантными агентами биосенсора с гибридным опероном ЛесА. Максимальные значения протекторной активности составили: 56 % для штамма Е. соИ Мй1655 (р8ох8-1их) при действии параквата в качестве прооксиданта; 33,4 % для штамма К соИ Мв1655 (КаЮ-1их) под действием перекиси водорода, и 52,6 % для этого же штамма в условиях облучения УФ с длиной волны 260 нм; 66,0 % для штамма Е. соН Мв 1655 (ЯесА-1их) под действием диоксидина и 32,3 % для него же при действии УФ с длиной волны 260 нм.

Для соединения 1 показан широкий спектр протекторной активности, следовательно, избирательность взаимодействия с отдельными АФК для него не характерна.

Соединение 2 обладает более высокой протекторной активностью относительно эффектов УФ-излучения (максимальный эффект 61,0 %) по сравнению с веществом 1, для которого максимальный эффект составил 55,8 %. Соединение 2 является катионом за счет положительного заряда на азоте в остатке тетраметиламмония. Известно, что тетраметиламмоний (ТМА) способен адсорбироваться на мембранах. Кроме того, в концентрациях порядка 10"3 М ТМА известен как блокатор мембранных каналов, действующий на упаковку липидов в бислое благодаря усилению гидратации полярных групп (Борисова, 1984; Ермаков, 2005). Поскольку за счет присутствия катиона ТМА соединение 2 должно скорее адсорбироваться на мембранных структурах, чем проникать в клетку, а также изменять проницаемость мембран, можно предположить, что его антиоксидантный эффект частично обусловлен торможением свободнорадикапьных процессов, происходящих в мембранах.

Причиной таких процессов может быть интенсифицировавшееся за счет энергии квантов УФ-света «вытекание» электронов из электрон-транспортной цепи (ЭТЦ), локализованной в мембране, во внутриклеточное пространство. Кроме того, может иметь место защита клетки от перекисных соединений, образующихся в питательной среде, за счет изменения проницаемости мембран.

Сравнительно высокая эффективность соединения 1, которое, как можно ожидать, благодаря катиону трифенилфосфония проникает сквозь мембрану и накапливается внутри клетки, свидетельствует о значительном вкладе внутриклеточных процессов в биохимические последствия УФ-излучения.

Ионол, в отличие от двух более сложных соединений, не проявляет супероксидустраняющей активности, однако проявляет высокую активность в отношении пероксида водорода и повреждений ДНК. По-видимому, при устранении эффектов диоксидина и перекиси водорода степень делокализации электронов в активном центре антиоксиданта не имеет столь решающего значения и действие ионола в данном случае является скорее опосредованным, нежели прямым.

Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности каротинондов 1)е'и\ососси% гшйоЛигат.

Для каротиноидной фракции £>. гасИос/игапя максимальное значение ДНК-протекторной активности составило 64,8 % в концентрации 10 мкг/мл, диапазон эффективных концентраций - 0,001-10 мкг/мл, агентом взаимодействия среди АФК является пероксид водорода, инактивация которого была максимально эффективна в концентрации 1 мкг/мл и достигала 19,3 %. Данные о протекторной активности каротиноидов О. гасИойигат и а-токоферола представлены в таблице 3.

Таблица 3

Протекторная активность каротиноидов £>. гасНо(1игап$ и токоферола в системе

биосенсоров (%)

Антиоксидант Биосенсор Индукторы

Пероксид водорода Паракват Диокси-дин

Смесь каротиноидов й. гасИойигат Е. соИ М61655(р8ох8-1их) 23 0 64,9

Е. соН М01655 (рКаЮ-1их) 100 37 -

Е. соИ АВ1157 (рЯесА-1их) 54 28 36

Токоферол Е. соИ Мй 165 5 (рБохЭ -1их) 0 0 0

Е. соИ МС1655 (рКаЮ-1их) 0 0 -

Е. соИ АВ1157 (р!1есА-1их) 49,3 0 70,4

Сопоставление результатов, полученных для выделенного нами препарата и классического природного антиоксиданта а-токоферола, убеждает, что смесь каротиноидов О. гасИос1игат проявляет качественно и количественно больший протекторный эффект, а-токоферол не способен защищать бактериальные клетки от прооксидантного действия параквата, в то время, как исследованные каротиноиды £>. гасИо/Зигапя снижают уровень генерации перекиси и уровень повреждения ДНК. Каротиноиды, в отличие от а-токоферола, способны снижать уровень генерации супероксид-анион-радикала под действием перекиси водорода и диоксидина, а также значительно усиливать работу клеточных механизмов, обеспечивающих разложение перекиси водорода при ее экзогенном введении.

Для дальнейших экспериментов на животных использовали каротиноиды £). гасНоёигапз. Решающим фактором отбора стала их способность защищать клетки от

окислительного стресса, развивающегося в результате облучения УФ-В (рис. 6), поскольку это постоянно присутствующий в среде естественный экологический фактор. Кроме того, каротиноиды Д. гасИосЗигапя - это наиболее доступный в лабораторных условиях биотехнологический продукт, являющийся антиоксидантным комплексом природного, а не синтетического происхождения.

80 т-

Рис. 6. Протекторная активность потенциальных адаптогенов под действием

УФ-В.

^Каротиноиды Р.гас1юс1игап5 ^Соединение 1 ^Соединение 2

КагС-штамм

ИесА-штамм

Оптимизация параметров культивирования Ое/пососсия пиЯайигапа и экстракция каротиноидов.

Применение оптимизированных параметров культивирования (соевая среда, 25°С, 5 г/л глюкозы, в концентрации 5 10"2 г/л) статистически достоверно повышало прирост биомассы и содержание каротиноидов по сравнению с культурой, выращенной на стандартной среде МПА (рис. 7).

1_ ш т

■1 I 1 1111 щЬ И1

Яш....................

Соевая среда. Соевая среда, Соевая среда, Соевая среда, МПА, 37"С рН=6,5 глюкоза 5 г/л 5-10-2 г/л 25°С (контроль)

и биомасса, г/л ■ каротиноиды, мг/л

Рис. 7. Прирост биомассы и содержание каротиноидов Оетососсиз гасНо/Зигапя при культивировании в среде с оптимизированными параметрами.

Изучение антимутагенной активности каротиноидов D. radiodurans.

Эксперименты показали, что диоксидин является мощным индуктором мутаций устойчивости к рифампицину у Е. coli. Максимальный мутагенный эффект зарегистрирован для концентрации 2,25- 10"5М, что проявляется в максимальном Rec-ответе в тесте на биосенсорах.

Деиноксантин статистически значимо снижает как частоту спонтанного мутагенеза, так и частоту мутаций, индуцированных диоксидином - на 85,9 % по сравнению для концентрации 15,5 мг/л и на 53,2 % для концентрации 1,55 мг/л (рис.8).

120

100 80

г 60 >

40 20 0

94,1

44 1

13,25

6,6 4<25

контроль каротиноиды D. radiodurans 15,5 мг/мл

диоксидин

диоксидин + каротиноиды D. radiodurans 1,55 мг/мл

диоксидин + каротиноиды D. radiodurans 15,5 мг/мл

Рис. 8. Количество рифампицин-резистентных (Rif1) мутантов на мл культуры (108 клеток) в присутствии диоксидинаи каротиноидов D. radiodurans.

Влияние каротиноидов Оетососсиз radiodw^ans на динамику заживления ран у млекопитающих.

Было изучено влияние каротиноидов Д radiodurans на динамику заживления ран у мышей СД-/ с искусственно вызванным сахарным диабетом. В модели иеинфицированной механической полнослойной кожно-мышечной раны изучали эффекты влияния экстракта каротиноидной фракции Д гас1Мигапя и ликопина. Исследовали эффективность использования трех способов введения каротиноидов (накожное, пероральное, накожное+пероральное) и две дозы препаратов.

Результаты планиметрического анализа раны представлены на рисунке 9, картина изменения раневой поверхности - на рисунке 10.

Как можно видеть из представленных данных, каротиноиды Д radiodurans стимулируют процесс регенерации кожных ран при сочетанном введении (накожно в дозе 0,5 мкг/сутки+перорально 250 мкг/кг/сутки) у мышей с стрептозоциновым СД. Накожное введение препарата каротиноидов Д radiodurans вызывало статистически

значимое уменьшение площади раны как на стадии образования и созревания грануляционной ткани, так и на стадии рубцевания.

•i 2

? г

54 52 50

100

01 ч

3 Я

J -- 2

s i 5

г i to

го tt

ГО О. 0)

Щ- ВЦ

контроль

каротиноиды D. radiodurans

контроль каротиноиды ликопин £>. гаЛМигапз

А В

Рис. 9. Динамика уменьшения площади раны, среднее значение в неделю: А при нанесении протектора накожно, в дозе 0,5 мкг/сутки, В - при сочетанном введении протектора (накожно и перорально).

I сутки

14 емки

21 сутки

Рис. 10. Динамика изменения раневой поверхности у мышей CD I с стрептозоциновым сахарным диабетом при сочетанном введении каротиноидной фракции D. radiodurans (накожно и перорально): А - контроль, В - опыт.

Средний процент уменьшения площади раны (PAR) за неделю при сочетанном введении каротиноидов D. radiodurans составил 76,1% и являлся самым высоким по сравнению с другими группами наблюдения. Ликопин, взятый в эксперимент в качестве препарата сравнения, также обладал способностью повышать скорость заживления хронических кожных ран, но его эффект был менее выражен, чем эффект каротиноидов D. radiodurans.

Основным показателем при оценке сахарного диабета является гликемия. Было показано, что при моделировании стрептозоцинового диабета у мышей наблюдалось

устойчивое повышение уровня глюкозы, тогда как пероральное введение каротиноидов В.гай'юйигапз или ликопина не вызывало изменений содержания глюкозы в крови, следовательно, эффекты данных соединений не могут быть объяснены за счет их влияния на регуляцию уровня глюкозы.

Эффект каротиноидного препарата О. гасИо/Зигапя, по-видимому, обусловлен его способностью снижать сроки и интенсивность воспалительного процесса, подготавливая ложе раны к фазам регенерации и эпителизации за счет снижения интенсивности генерации АФК.

При анализе спонтанной и металл-катализируемой деструкции белков сыворотки крови мышей с СД 1 типа было обнаружено снижение интенсивности окислительной модификации белков (ОМБ) сыворотки крови на фоне сочетанного введения каротиноидов £>. гай'юйигат (5,89 усл.ед. против 4,03 в контроле). Повышение уровня ОМБ в крови у больных сахарным диабетом — известный клеточный маркер метаболических изменений (Сак^ау, 2000). Можно предположить, что коррекция процессов ОМБ при СД с помощью антиоксидантов будет иметь большое значение в терапии этого заболевания и снижении риска осложнений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, выдвинутая гипотеза о возможности прогнозирования адаптогенной активности на основании результатов экспресс-тестов на антигенотоксическую и антиоксидантную активность веществ была экспериментально подтверждена в рамках исследованных моделей. Адаптогенный и геропротекторный эффект изученных в работе веществ и комплексов, по-видимому, обусловлен их способностью инактивировать внутриклеточные АФК, тем самым, защищая от повреждения молекулы ДНК и важнейшие структуры клетки. Данные о наличии антиоксидантной и антигенотоксической активностей у химических соединений и комплексов могут служить основанием для прогноза их адаптогенной активности. Результаты экспериментальных исследований демонстрируют, что экстракт каротиноидов В. гайюйитпЕ, для которого в экспресс-тестах показана антиоксидантная, антигенотоксическая и антимутагенная активности, стимулирует заживление ран и способствует быстрому восстановлению эпителиального покрова и его барьерной функции при хронизации раневого процесса у экспериментальных животных. При этом, пероральное введение каротиноидной фракции В. гайюйигат не вызывало изменения содержания глюкозы в крови мышей в данной модели. Поэтому представляется вероятным, что антиоксидантное действие препарата, показанное ранее, имеет определяющее значение для ранозаживляющего эффекта.

выводы

1) Оценка уровня экспрессии плазмидного оперона с помощью биолюминесцентного теста демонстрирует в 10 раз большую чувствительность при определении уровня окислительного стресса, нежели стандартный энзимологический тест на активность антиоксидантных ферментов.

2) Соединения, для которых показана адаптогенная и геропротекторная активность, демонстрируют антиоксидантную активность в биолюминесцентном тесте. Для большинства изученных соединений показана избирательность при взаимодействии с разными АФК. Так, (б'-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний (SkQl) проявлял способность инактивировать супероксид-анион-радикал (максимальный протекторный эффект достигал 61 %), среди пептидов наиболее эффективным антиоксидантом был панкраген (его способность инактивировать перекись водорода достигала 90 %). Эти соединения также проявляют антигенотоксическую активность: изовилон снижает повреждения ДНК на 73 %, пробиотический препарат № 8 - на 85 %, SkQl-на95%.

3) Для изученных каротиноидов и соединений из группы экранированных фенолов также показана антиоксидантная и ДНК-протекторная активности. Каротиноиды D. radiodurans снижают количество повреждений ДНК на 65 %, а инактивация ими перекиси водорода может достигать почти 100%; 4(3',5'-дитретбутил-4'-гидроксифенил) тиобутилтрифенилфосфоний бромид снижает число повреждений ДНК на 66 %, а уровень его супероксидустраняющей активности достигает 56 %.

4) Оптимизация параметров культивирования D. radiodurans повышает прирост биомассы на 52 % и содержание каротиноидов на 28 % по сравнению с культурой, выращенной на стандартной среде.

5) Экстракт каротиноидной фракции D. radiodurans проявляет антимутагенную активность в модели индуцированного мутагенеза у Е. coli, статистически значимо снижая частоту мутаций, индуцированных диоксидином - на 53 % и 86 % соответственно для концентраций 1,55 и 15,5 мг/л.

6) Диоксидин является мощным индуктором мутаций устойчивости к рифампицину у Е. coli. Максимальный мутагенный эффект зарегистрирован для концентрации 2,25-10"5 М, которая также индуцирует максимальный Ree-ответ в тесте на биосенсорах.

7) Экстракт каротиноидной фракции D. radiodurans стимулирует заживление ран у мышей CD-1 на фоне стрептозоцинового сахарного диабета как при наружном, так и при сочетанном введении (скорость заживления на 21 % выше по сравнению с контролем), и более эффективно повышает скорость регенерации кожных ран; чем контрольное соединение — ликопин (скорость заживления на 5 % выше по сравнению с контролем), а также снижает уровень окислительной модификации белков в сыворотке крови на 32 % при сочетанном введении.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Празднова Е.В. Методика оценки эффективности антимикробных агентов на биопленки бактерий по данным биолюминесценции/ Чистяков В.А., Сазыкина М.А., Лысенко В.А., Вардуни Т.В., Севрюков A.B., Шкурат Т.П., Празднова Е.В. / Валеология, 2009. №1. С.32-38 (0,29 п.л., личный вклад 20.%).

2. Празднова Е.В. Перекись водорода и генотоксичность ультрафиолетового излучения с длиной волны 300-400 нм/ Празднова Е.В., Чистяков В.А., Сазыкина М.А., Сазыкин И.С., Кхатаб З.С. / Известия ВУЗов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки, 2012. №1. С. 85-87 (0,12 п.л., личный вклад 40 %).

3. Празднова Е.В. Супероксидустраняющая активность производного пластохинона - Ю-(б'-пластохинонил) децилтрифенилфосфония (SkQl)/ Чистяков В.А., Празднова Е.В., Гутникова Л.В., Сазыкина М.А., Сазыкин И.С./ Биохимия, 2012. Т. 77. №7. С.932-935 (0,16 п.л., личный вклад 30 %).

4. Празднова Е.В. Антиоксидантаная активность пробиотического препарата на основе Bacillus subtilis /Новикова Е.М., Празднова Е.В., Костина Н.В./ Врач-аспирант, 2012. Т.6. №.55. С.49-55 (0,28 п.л., личный вклад 30 %).

5. Празднова Е.В. Концепция феноптоза и системный подход в нефрологии / Чистяков В.А., Цветков Д.С., Празднова Е.В., Чистякова И.Б./ Нефрология, 2013. №5.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

6. Празднова Е.В. Прооксидантные эффекты УФ-компоненты солнечного света / Материалы XLIX Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск, 2011. С.36 (0,04 п.л., личный вклад 100 %).

7. Празднова Е.В. Влияние ультразвука на биопленку Vibrio ßsheril Севрюков A.B., Празднова Е.В., Сазыкин И.С., Лысенко B.C., Сазыкина М.А, Чистяков В.А. /Материалы IV Международной научно-практической конференци "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины". Ростов-на-Дону, 2011. С.31 (0,04 п.л., личный вклад 30 %).

8. Празднова Е.В. Прооксидантные эффекты УФ-компоненты солнечного света/ Материалы IV Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологй и медицины". Ростов-на-Дону, 2011. С. 27. (0,04 п.л., личный вклад 100 %).

9. Празднова Е.В. Супероксидустраняющая активность производного пластохинона - Ю-(б'-пластохинонил) децилтрифенил фосфония (SkQl) / Празднова Е.В., Чистяков В.А., Гутникова Л.В., Сазыкина М.А., Сазыкин И.С. / Материалы Международной конференции «Биология - наука XXI века», Москва, 2012. М.: МАКС Пресс, 2012. С. 737-738 (0,08 п.л., личный вклад 30 %).

10. Празднова Е.В. Исследование УФ-протекторной активности липофильных катионов, содержащих пространственно-затрудненные фенольные фрагменты /

Празднова Е.В., Грызлова Ю.В., Бухаров C.B. / Материалы научно-практической конференции на базе Южного Федерального Университета «Миссия молодежи в науке.» Т. 1.Естественные и технические науки. Ростов-на-Дону, 2012. С. 314 (0,04 п.л., личный вклад 50 %).

11. Празднова Е.В. Оптимизация параметров культивирования Deinococciis radioduransl Празднова Е.В., Сазыкина М.И./ Материалы научно-практической конференции на базе Южного Федерального Университета «Миссия молодежи в науке.» Т.1. Естественные и технические науки. Ростов-на-Дону, 2012. С. 316 (0,04 п.л., личный вклад 70 %).

12. Празднова Е.В. Пробиотики как антидоты эндогенных генотоксинов /Чистяков В.А., Празднова Е.В., Колмакова Т.С., Дудникова Э.В., Шестопалов A.B., Моргуль Е.В., Оксенюк О.С., Кобзева H.H., Приходская Е.С. / Тезисы докладов научной конференции «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии». Изд-во ЮНЦ РАН. Ростов-на-Дону, 2013. С. 105 (0,04 п.л., личный вклад 20%).

13. Празднова Е.В. Прогноз адалтогенной активности соединений на основании экспресс-тестов на бактериальных биосенсорах / Празднова Е.В., Демьяненко C.B. /Материалы V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» Ростов-на-Дону, 2013. С. 353 (0,04 п.л., личный вклад 60 %).

14. Празднова Е.В. Концепция феноптоза и системная медицина/ Чистяков В.А., Цветков Д.С., Чистякова И.Б., Празднова Е.В. / Bulletin de lAcadémie Internationale CONCORDE V.l 2013. P.25-45 (0,87 п.л., личный вклад 20 %).

Патенты:

1. Программный комплекс «База данных по бактериальным LUX-биосенсорам»: Свидетельство о регистрации электронного ресурса № 16198 / Сазыкина М.А., Сазыкин И.С, Севрюков А.В, Денисенко Ю.В. № 50201001549; Заявл., 23.09.2010; Выдано 04.10.2010.

Список использованных сокращении:

8к(31 - Ю-(б'-пластохинонил) децилтрифенил фосфоний АФК - активные формы кислорода ГБО - гипербарическая оксигенация КОЕ - колониеобразующая единица ОМБ - окислительная модификация белков

СД - сахарный диабет

СУА - супероксидустраняющая активность

ТМА - тетраметиламмоний

УФ - ультрафиолет

ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1.0 уч.-изд.-л. Заказ № 3300. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Празднова, Евгения Валерьевна, Ростов-на-Дону

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южный федеральный

университет»

На правах рукописи /

04201456309

Празднова Евгения Валерьевна

ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТОВ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ЭКСПРЕССИИ СТРЕСС-ИНДУЦИБЕЛЬНЫХ

БАКТЕРИАЛЬНЫХ ОПЕРОНОВ

Специальность 03.01.04 - биохимия; 03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Доктор биологических наук Чистяков В.А.;

Доктор биологических наук, профессор Усатов A.B.

Ростов-на-Дону - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13

1.1 Современная концепция окислительного стресса 13

1.1.1 Свободнорадикальные процессы 13

1.1.2 Роль окислительного стресса в развитии воспалительных процессов

и старения 23

1.2 Антиоксиданты с потенциальным системным эффектом 27

1.2.1 Каротиноиды 30

1.2.2 Экранированные фенолы 38

1.2.3 Липофильные катионы 42

1.2.4 Олигопептиды 44

1.2.5 Бактериальные пробиотические препараты 46

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 50

2.1 Материалы исследования 50

2.1.1 Биосенсорные штаммы 51

2.1.2 Индукторы окислительного стресса 54

2.1.3 Потенциальные протекторы. 57

2.1.4 Экспериментальные животные 60

2.2 Методы исследования 62

2.2.1 Энзимологические исследования и тесты in vitro. 62

2.2.2 Биолюминесцентный тест 64

2.2.3 Культивирование Deinococcus radiodurans 66

2.2.4 Определение концентрации каротиноидов Deinococcus radiodurans 68

2.2.5 Тест на антимутагенную активность. 68

2.2.6 Работа с экспериментальными животными 69

2.3 Статистическая обработка данных и достоверность результатов 77

3 РЕЗУЛЬТАТЫ 78

ЗЛ Изучение антиоксидантной и ДНК-протекторной активностей ряда соединений в биолюминесцентном тесте 78

ЗЛ.1 Определение эффективных нелетальных доз прооксидантов и оптимальной плотности культуры для системы биосенсоров. 78

3.1.2 Сравнительный анализ результатов биохимического теста на активность каталазы и уровня экспресии Kat-оперона в клетках биосенсорного штамма E.coli MG 1655 (pKatG-lux) 78

3.1.3 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности контрольных соединений: тролокс, аскорбат, а-токоферол 79

3.1.4 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности липофильных катионов 81

3.1.5 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности олигопептидов 84

3.1.6 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности бактериальных пробиотических препаратов 93

3.2 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности потенциальных адаптогенов в биолюминесцентном тесте 95

3.2.1 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности экранированных фенолов 95

3.2.2 Антиоксидантная и ДНК-протекторная активности каротиноидов Deinococcus radiodurans 108

3.3 Оптимизация параметров культивирования Deinococcus radiodurans для экстракции каротиноидов. 116

3.4 Изучение антимутагенной активности каротиноидов D.radiodurans. 117

3.5 Изучение влияния каротиноидов Deinococcus radiodurans на динамику заживления ран у млекопитающих 118 3.5.1 Динамика уровня глюкозы в крови мышей CD-I при моделировании стрептозоцинового сахарного диабета и на фоне перорального введения каротиноидов 118

3.5.2 Анализ данных планиметрических исследований влияния каротиноидов в модели механической раны на фоне сахарного диабета I типа 121

3.5.3 Анализ спонтанной и металл-катализируемой деструкции белков сыворотки крови мышей CD-I при моделировании стрептозоцинового сахарного диабета и на фоне введения каротиноидов 127 4 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 129 ВЫВОДЫ 146 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 148 Приложение 1 167 Приложение 2 173

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГБО - гипербарическая оксигенация

ГПО (С8Н) - глутатионпероксидаза

КОЕ - колониеобразующая единица

ОМБ - окислительные модификации белков

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СД - сахарный диабет

СОД - супероксиддисмутаза

СУА - супероксидустраняющая активность

УФ - ультрафиолет

10-(б'-пластохинонил) децилтрифенилфосфоний

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в биологии широкое распространение приобретает концепция системного подхода, рассматривающая живой организм в качестве сложной системы прямых и обратных связей. Многие патологические явления при детальном исследовании демонстрируют свою «системность», являясь, по сути, результатом не столько активации либо инактивации отдельных молекулярных механизмов, сколько результатом дисбаланса в общеорганизменных процессах.

Одним из наиболее ярких примеров системного дисбаланса в живых организмах является окислительный стресс. Существует мнение, что за счет этого механизма (роста свободнорадикальных повреждений на молекулярном уровне, нарушения баланса в работе антиоксидантной системы организма, нарушения регуляции клеточного гомеостаза) реализуются такие явления, как феноптоз (8ки1ас11еу, 1997), старение и связанные с ним патологии (Зенков, 2001; Хавинсон, 2003; Дубинина, 2006; 8ки1асЬеу, 2007). Генерация АФК значительно усиливается также при развитии стрессорных реакций и воспалительных процессов (Часовских, 2009). Поэтому логичным решением является поиск соединений, обладающих системным биологическим эффектом, среди синтетических и природных антиоксидантов - веществ, способных противостоять окислительному стрессу. При скрининге этих соединений необходимо рассматривать как биохимические, генетические аспекты их функционирования - как способность прямо или опосредованно инактивировать АФК (антиоксидантную активность), так и способность защищать генетический аппарат клетки от окислительных повреждений (антигенотоксическую, или ДНК-протекторную активность).

Первые шаги в этом направлении уже были предприняты российскими и зарубежными геронтологами при изучении адаптогенных свойств олигопептидов (Хавинсон, 2001), фуллеренов (ВааП, 2012), соединений ряда

} 8к(^ (8ки1ас11еу, 2007; 2011; 2012). Адаптогенные и геропротекторные эффекты

]

этих соединений могут быть частично или полностью основаны на их антиоксидантной активности.

Однако исследования in vivo на животных объектах достаточно трудоемки и требуют длительного времени. Очевидно, что для выявления потенциальных системных адаптогенов среди всего разнообразия антиоксидантов необходимы информативные, более простые модельные системы. В качестве таковых систем можно использовать бактериальные биосенсоры. Было сформулировано предположение о возможности прогнозирования адаптогенного эффекта у млекопитающих путем оценки способности соединений снижать окислительный стресс в ходе экспресс-скрининга с применением системы LUX-биосенсоров (Чистяков и др., 2013). Возможность подобной экстраполяции логически вытекает из общности антиоксидантных механизмов для всех живых организмов, поскольку поддержание редокс-статуса клетки является одной из первых эволюционных задач, решенных природой еще на уровне прокариот.

Согласно данным литературы, смеси антиоксидантов могут проявлять более высокую протекторную активность, чем отдельные вещества, т.е. для таких смесей наблюдается синергетический эффект (Greul, 2002; Lin, 2003). В связи с этим были исследованы как отдельные вещества, так и комплексные смеси.

Были поставлены следующие задачи:

1) Провести сравнительный анализ чувствительности к индукторам окислительного стресса энзимологических методов и метода, основанного на детекции уровня экспрессии оперонов, объединяющих стресс-промоторы,

промоторы SOS-репарации и структурные гены люциферазного оперона.

2) Изучить способность ряда всществ с подтвержденной в опытах на млекопитающих геропротекторной и адаптогенной активностью (SkQl, олигопетиды) защищать клетки биосенсоров от повреждения индукторами окислительного стресса и генотоксинами.

4) Оптимизировать условия культивирования D. radiodurans для получения максимального содержания каротиноидов.

5) Изучить способность диоксидина индуцировать устойчивость к рифампицину у Escherichia coll

6) Изучить антимутагенную активность каротиноидов D. radiodurans в модели индуцированного мутагенеза у Е. coli.

В работе были использованы следующие генноинженерные штаммы: Е. coli pPLS-1, Е. coli рВА-5, Е. coli MG1655 pRecA-lux, Е. coli АВ1157 pRecA-lux, E. coli MG1655 pSoxS-lux, E. coli MG1655 pKatG-lux, E. coli MG1655 pColD-lux, E.coliMGl655 pXen7 (штамм с конститутивным промотором).

На первом этапе работы были исследованы антиоксидантные свойства

веществ, для которых уже установлена системная биологическая (адаптогенная

и геропротекторная) активность. Была показана связь между антиоксидантной

активностью химических соединений (пептидов, разработанных под

руководством В.Х. Хавинсона, ионов Скулачева и ряда пробиотических

препаратов) и их комплексов, и описанной в литературе адаптогенной

активностью. На основании полученных данных был сделан вывод о

возможности прогнозирования адаптогенного эффекта путем оценки

способности соединений снижать окислительный стресс в простых модельных системах.

В ходе дальнейшей работы была произведена оценка антиоксидантной и антимутагенной активности ряда новых синтетических и природных антиоксидантов. Существуют данные, свидетельствующие о том, что смеси антиоксидантов могут проявлять более высокую протекторную активность, чем отдельные вещества, т.е. для таких смесей наблюдается синергетический эффект (Greul, 2002; Lin, 2003). Поэтому в ряд исследованных веществ были включены такие комплексные смеси, как растительные экстракты.

Были получены данные по антиоксидантной активности изученных соединений и установлены механизмы этой активности - идентифицированы отдельные АФК, с которыми взаимодействуют те или иные антиоксид анты.

Полученные результаты позволили выделить группу перспективных соединений для испытания на животных моделях в качестве основы для препаратов системного действия. Для дальнейшего изучения по ряду параметров был выбран экстракт каротиноидов D. radiodurans. При испытании его на млекопитающих были получены результаты, свидетельствующие о его регенеративной активности, с высокой вероятностью обусловленной антиоксидантными свойствами.

Научная новизна

С помощью системы бактериальных биосенсоров впервые изучена

антиоксидантная, антигенотоксическая и антимутагенная активности

каротиноидов D. radiodurans, ионола и соединений из ряда экранированных

фенолов: 4(3',5'-дитретбутил-4'-гидроксифенил) тиобутилтрифенилфосфоний

бромида и 3-бис(3',5'-дитретбутил-4'-гидроксибензил)

аминопропилтриметиламмоний иодида; липофильного катиона с

антиоксидантной нагрузкой (SkQl), четырех олигопептидов (панкраген,

пинеалон, везуген, АВ-А (изовилон)), ряда пробиотических препаратов

бактериальной природы. Впервые продемонстрирована

супероксидустраняющая активность SkQl (производного

пластохинонилдецилтрифенилфосфония) в опытах in vivo. Показано, что соединения, для которых в литературе описана адаптогенная и/или геропротекторная активность, обладают и свойствами антиоксидантов и антигенотоксинов.

Впервые показана способность нелетальных для бактерий доз диоксидина вызывать значительное усиление частоты устойчивых к рифампицину мутантов у Е. coli, а также способность природных каротиноидов снижать интенсивность этого эффекта.

Практическая значимость

Экспериментально подтверждена возможность прогнозирования адаптогенной активности соединений на основании результатов экспресс-тестов на антиоксидантную и ДНК-протекторную активности.

Показано, что каротиноиды D. radiodurans стимулируют заживление ран как при наружном, так и при сочетанном (наружном и пероральном) введении, и более эффективно повышает скорость регенерации кожных ран у мышей с со стрептозоциновым диабетом I типа, чем ликопин.

Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых фармакологических и косметических препаратов. Область применения -медицина, фармакология, косметология.

Материалы работы используются при чтении лекций на кафедрах генетики, биохимии и микробиологии Южного федерального университета в спецкурсах: «Свободные радикалы в биологических системах», «Современные проблемы генетики», «Мутагены окружающей среды».

Положения, выносимые на защиту

1) Оценка уровня экспрессии плазмидного KatG оперона в

* биолюминесцентном тесте является более чувствительным методом

"г

определения уровня перекиси водорода, чем стандартный энзимологический тест на активность каталазы.

Апробация результатов

Материалы, положенные в основу работы, были представлены на следующих конференциях: на ХЫХ Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», 16-20 апреля 2011 г. Новосибирск; IV Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины", Ростов-на-Дону, 2011; Международной конференции «Биология - наука XXI века», г. Москва, 24 мая 2012 г; Научно-практической конференции на базе Южного Федерального Университета «Миссия молодежи в науке», 2012, Ростов-на-Дону; Научной конференции «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии». г.Ростов-на-Дону 25-29 марта 2013; V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов-па-Дону, 2013 г.

Работа проводилась в течение 2010-2013 гг. в ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» на базе лаборатории промышленных микроорганизмов и лаборатории экспериментального мутагенеза НИИ биологии ЮФУ, а также на кафедре генетики ЮФУ.

Автор выражает глубокую признательность за содействие в работе Скулачеву В.П., Арутюняну A.B., Манухову И.В., Демьяненко C.B., Сазыкиной М.А., Сазыкину И.С, Гутниковой J1.B, Кудеевской Е.М., а также всем соавторам публикаций.

Работа выполнена при финансовой поддержке НИИ митоинженерии МГУ, Министерства науки и образования РФ и Министерства здравоохранения и социального развития РФ. Автор как исполнитель участвовала в работе по грантам, поддержанным Министерством образования и науки Российской Федерации в рамках проекта 4.5835.2011 «Исследование механизмов действия негативных антропогенных и экстремальных факторов среды с помощью клеточных биосенсоров».

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Современная концепция окислительного стресса 1.1.1 Свободнорадикальные процессы

В живых системах существуют 2 основных типа использования

кислорода клеткой (2 пути окисления): оксидазный и оксигеназный. В первом

случае в результате последовательных реакций ферментативного

дегидрирования углеводов и жиров и последующего транспорта электронов в

митохондриях на конечном пункте этого транспорта - ферменте

цитохромоксидазе - происходит 4-электронное восстановление кислорода с

образованием воды. Таким образом в клетке синтезируется АТФ, а также вода и

углекислота. Оксидазный путь не предусматривает включения кислорода в

молекулу окисляемого субстрата.

Наряду с этим в клетках протекают реакции прямого присоединения