Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические аспекты гипоксического повреждения нервной ткани и его коррекция производными многоатомных фенолов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические аспекты гипоксического повреждения нервной ткани и его коррекция производными многоатомных фенолов"

МИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

УДК 615.272:576.72:611-018.8

РГБ ОД

2 7 ОКТ ^ЭЙ'63611 ^нна и°с,,Фовна

БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ГИПОКСИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ НЕРВНОЙ ТКАНИ И ЕГО КОРРЕКЦИЯ ПРОИЗВОДНЫМИ МНОГОАТОМНЫХ ФЕНОЛОВ

биохимия - 03.00.04

Автореферат

диссертации на сонскание ученой степенн кандидата биологических наук

Минск- 1998

Работа выполнена в лаборатории психонейрохирургии ЦНИЛ Минского Государственного медицинского института

Научный руководитель: д.м.н. ФЕДУЛОВ A.C. Научный консультант: д.х.н., профессор ШАДЫРО О.И.

Официальные оппоненты: - д.б.н., профессор Морозкина Т.С.

д.х.н. Костюк В.А.

Оппонирующая организация: Институт биорганической химии

НАНРБ

Защита диссертации состоится «/<£ » 1998 года

в/5"^-^асов на заседании совета [Д 03.18.08] по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Минском Государственном медицинском институте [220116 г.Минск, пр-т Дзержинского, 83, тел. 272-55-98].

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Минского Государственного медицинского института

Автореферат разослан «» г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность те.иы диссертации

Изучение биохимических механизмов, лежащих в основе нейродеструктивных процессов при гипоксии нервной ткани, является актуальной задачей экспериментальной и клинической неврологии.

Важным звеном в цепи метаболических нарушений в клеточных структурах мозга при гипоксии является активация свободнорадикальных реакций (СРР) [В.М. Виноградов, 1985; М.В. Биленко, 1988; А.И. Джафаров, 1981; А.Е. Дубенко, 1991; S.Voshida,1982; J.A. James,1991].

Это приводит к необходимости дальнейшего поиска средств коррекции гипоксического повреждения нервной ткани, которые являются эффективными акцепторами свободных радикалов (CP) и ингибиторами процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - антиоксидантами (АО).

Особое значение данный вопрос приобретает в условиях Республики Беларусь, где на значительной территории отмечается наличие высокого уровня радионуклидов, что способствует активации СРР в биосистемах.

До сих пор малоизученными остаются вопросы о взаимосвязи антиоксидантной активности соединений с их структурой.

В последнее время привлекают внимание исследования в области синтеза АО, близких по строению к природным АО и обладающих низкой токсичностью.

Интерес к фенольным соединениям и к их воздействию на метаболические процессы вызван широким распространением этих веществ в растительном и животном мире, наличием у них достаточно высокой и разнообразной биологической активности [В.А. Барабой, 1976; М.А. Запраметов, 1988; В.А. Рогинский, 1988].

В биологии и медицине наиболее изученными из этих соединений являются одноатомные фенолы, аналоги токоферолов, флавоноидов [Г.В. Донченко, 1988; А.Д. Дурнев, 1990; А.И. Журавлев, 1982; И.И. Иванов, 1975; P.A. Иванова, 1989]. Однако, возможности получения принципиально новых АО в ряду одноатомных фенолов практически исчерпаны. Весьма перспективным представляется поиск АО среди производных многоатомных фенолов, обладающих высокой антиокислительной активностью, благодаря их влиянию на различные типы СРР. В своей работе мы неходили из того, что поиск таких универсальных ингибиторов СРР надо проводить среди производных орто-замещенных фенолов. Это предположение основано на том, что данные вещества эффективно ингибируют как процессы ПОЛ, так и другие типы свободнорадикальных реакций, в частности реакции фрагментации [O.I. Shadyro, 1993]. Указанные соединения могут взаимодействовать с радикальными интермедиатами любой природы (как кислород-, так и углеродцентрированными радикалами) [Л.И. Юркова, 1992; O.I. Shadyro, 1993].

На кафедре радиационной химии и химической технологии БГУ под руководством доктора химических наук, профессора О.И. Шадыро и кафедре органической химии БГУ кандидатом химических наук Ю.П. Лосевым синтезирован ряд производных двух- и трехатомных фенолов, которые в модельных экспериментах проявили выраженное ингибирующее влияние на процессы СРО. Исходя из изложенного, целесообразным было изучение биологической активности этих соединений на экспериментальных моделях in vitro и in vivo.

Связь работы с круппъши научными программами Работа выполнена в рамках отраслевой научно-технической программы в области медицины С. 09 «Разработать новые методы диагностики, комплексного лечения и реабилитации, создать научно-обоснованную систему организации помощи больным с травмой центральной нервной системы» (Утверждена приказом МЗ СССР №1137 от 26.08.85г. регистрационный номер 01.85.008198) и хоздоговорных тем лаборатории психонейрохирургии ЦНИЛ МГМИ: №85-02 «Исследовать биологические свойства стабилизаторов радиационно-сшитого полиэтилена» и №89-01 «Исследовать токсичность, аллергенность и антиоксидантные свойства производных фенола».

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель исследования - провести сравнительное изучение антиоксидантной активности впервые синтезированных производных орто-замещенных фенолов и полидисульфида галловой кислоты с известными одноатомными фенолами и исследовать некоторые механизмы нейропротекторного действие этих веществ при гипоксическом повреждении нервной ткани in vitro и in vivo.

Задачи исследования

1. Изучить антиокислительную активность производных орто-замещенных фенолов и полидисульфида галловой кислоты в общем гомогенате мозга крыс в сравнении с одноатомными фенолами;

2. Разработать модель гипоксического повреждения астроцитов в культуре клеток, которая бы позволяла проводить скрининг соединений и изучать характер гипоксического повреждения на клеточном и ультраструктурном уровнях;

3. Изучить нейропротекторное действие производных орто-замещенных фенолов и полидисульфида галловой кислоты в культуре глиальных клеток при гипоксии;

4. На моделях черепно-мозговой травмы и гипоксической гипоксии изучить влияние производных двухатомных фенолов и полидисульфида галловой кислоты на уровень продуктов перекисного окисления липидов в головном мозге крыс;

5. Исследовать влияние производных многоатомных фенолов на выживаемость крыс при гипоксической гипоксии;

6. Провести предварительную токсикологическую оценку исследуемых соединений.

Объект исследования - головной мозг лабораторных крыс, культура клеток нервной ткани

Предмет исследования - гипоксические нарушения в мозге крыс и культуре клеток нервной ткани без и на фоне производных многоатомных фенолов.

Гипотеза

Производные орто-замещенных фенолов по антиокислительной активности превосходят одноатомные фенолы и могут обладать протекторным действием при гипоксическом повреждении нервной ткани.

Методология и методы проведенного исследования В работе были применены следующие методы исследования: биохимические (определение содержания продуктов ПОЛ, уровня активности супероксиддисмутазы (СОД), концентрации альфа-токоферола), метод культуры клеток, методы световой и электронной микроскопии, цитоморфологические, биофизические.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ЗНАЧИМОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведено комплексное и биохимическое изучение впервые синтезированных соединений из ряда производных орто-замешенных фенолов.

Экспериментально доказано наличие высокой антиоксидантной активности (значительно превышающей таковую у ионола и альфа-токоферола) у обладающих новизной производных многоатомных фенолов.

Впервые в Республике Беларусь создана модель гипоксического повреждения нервных клеток и исследованы биохимические, структурно-функциональные изменения астроцитов и ультраструктура их органелл при гипоксии.

Показано наличие нейропротекторного эффекта у обладающих новизной производных двухатомных фенолов и полидисульфида галловой кислоты.

Развиты и углублены представления о структурно-функциональном состоянии мембран астроцитов в условиях экспериментальной гипоксии.

Получены новые данные о состоянии энергетического обмена в культуре астроцитов при гипоксии.

Установлено антигипоксантное действие у впервые синтезированных производных орто-замещенных фенолов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

У впервые синтезированных липидорастворимых и водорастворимых соединений из ряда пространственно-затрудненных многоатомных фенолов выявлена высокая антиокислительная активность и низкая токсичность и показано, что эти соединения по антиоксидантной и антигипоксантной активности превосходят одноатомные аналоги, что создает перспективу их применения в качестве новых лекарственных препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний и гипоксии мозга.

Изучение зависимости биологического действия исследуемых соединений от их химической структуры будет способствовать созданию веществ с заранее заданными свойствами, которые ь дальнейшем могут быть использованы в биологии и медицине.

Разработана модель гипоксического повреждения астроцитов в культуре клеток мозга новорожденных крыс, которая может быть использована для скрининга препаратов по их нейропротекторному действию.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Производные орто-замещенных фенолов и полидисульфид галловой кислоты обладают антиоксидантным свойством и по антиокислительной эффективности превосходят антиоксиданты, полученные на основе их одноатомных аналогов.

2. Гипоксия сопровождается активацией процессов свободнорадикального окисления в ткани мозга лабораторных животных, а использование производных двух- и трехатомных фенолов приводит к снижению уровня продуктов перекисного окисления липидов и повышает выживаемость лабораторных животных.

3. Гипоксическое воздействие на культуры глиальных клеток сопровождается сдвигом биохимических процессов в астроцитах и их структурно-функциональными изменениями. Применение производных двухатомных фенолов и полидисульфида

галловой кислоты способствует нормализации биохимических и структурно-функциональных изменений астроцитов, культивируемых в условиях гипоксии.

Личный вклад соискателя

Изложенные в диссертации результаты получены соискателем лично и совместно с другими исследователями.

Соискателем самостоятельно разработаны модели эксперимента, осуществлено их выполнение, проведена обработка результатов и их анализ.

Культивирование нервной ткани и изучение морфологии и ультраструктуры астроцитов проведено совместно с сотрудниками лаборатории электроннной микроскопии НИИ микробиологии и эпидемиологии МЗ РБ с.н.с., к.б.н. З.Б. Квачевой, с.н.с., к.м.н. Ю.Г.Илькевичем.

Изучение физико-химических характеристик мембран астроцитов при гипоксии проведено совместно с сотрудниками НИИ фотобиологии АН РБ с.н.с., к.б.н. Е С. Лобанок, с.н.с., к.б.н. H.A. Шукановой.

Изучение токсикологических свойств производных фенола проведено совместно с доцентом кафедры гигиены труда с курсом коммунальной гигиены МГМИ, к.м.н. Л.М. Бондаренко.

Научный руководитель и научный консультант оказывали консультативную помощь в разработке моделей, при постановке целей и задач исследования, обсуждении и трактовке полученных результатов.

Апробация результатов диссертации

Основные положения диссертации были изложены на IY конференции СНГ «Биоантиоксидант», 1992 г.; на Международной конференции «Наука и медицина. Чернобыль», 1993 г.; на конференции «Фармакологические свойства новых химических соединений и некоторых лекарственных препаратов», Минск, 1994г.; на X Европейском конгрессе нейрохирургов, Берлин, 1995 г.; на 1 Европейском конгрессе по неврологии, Франция, 1995 г., на XXXIII Международном конгрессе по физиологическим наукам, Санкт-Петербург, 1997г., на конференции "Молекулярная генетика и биотехнология", Минск, 1998г.

Опубликованность результатов

Основные положения диссертации изложены в 16 работах: 6 журнальных статей, из них 5 статей в международном сборнике, 10 тезисов докладов на международных симпозиумах и конференциях.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов (3 главы), обсуждения, заключения и списка литературы, включающего 235 источников. Работа изложена на 120 страницах, содержит 17 рисунков, 15 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал к методы исследования 1. Объект исследования: головной мозг лабораторных крыс, культура астроцитов мозга новорожденных крыс

2. Методы исследования

Методика оценки аптиоксидаптпой активности производных фенола и ПГК и состояния процессов ПОЛ в головном мозге крыс. Оценку ингибирования исследуемыми соединениями процессов ПОЛ, индуцированных железо-аскорбатной смесью, изучали по содержанию малонового диальдегида (МДА) в общем гомогенате мозга (ОГМ) крыс по методу Ю.А. Владимирова, А.И.Арчакова, [1972].

В качестве препаратов сравнения при оценке антиоксидантных свойств производных фенола и ПГК использовали альфа-токоферол, ионол, эмоксипин.

О состоянии процессов ПОЛ в мозге крыс судили по уровню диеновых конъюгатов (ДК), флюоресцирующих продуктов (ФП) ПОЛ и содержанию МДА.

Концентрацию альфа-токоферола определяли по методу S.L. Taylor [1976].

Методика моделирования черепно-мозговой травмы. ЧМТ моделировали на крысах, находившихся под эфирным наркозом, путем нанесения удара свободно-падающим грузом по конвекситальной поверхности черепа (0,45-50 Дж) с помощью специального устройства по методу J.M. Lighthall, [1989].

Исследования проведены в осенне-зимшш период на лабораторных животных, содержащихся на стандартном рационе вивария ЦНИЛ МГМИ. Для исследований в работе использовали 360 нелинейных белых крыс-самцов, массой 180-250 г, 30 белых мышей, массой 18-22г, 30 морских свинок. Животные были разделены на следующие группы (по 10-15 штук в каждой): 1-я группа - крысы, которым за 1 час до ЧМТ внутрибрюшинно вводили эмоксипин в дозе 25 мг/кг массы тела; 2-я группа -крысы, которым эмоксипин в указанной выше дозе вводили внутривенно; 3-я группа - крысы, которым за 1 час до ЧМТ внутрибрюшинно вводили полидисульфид галловой кислоты (ПГК) в дозе 25 мг/кг массы тела; 4-я группа - крысы, которым ПГК вводили внутривенно в указанной дозе за 1 час до ЧМТ; 5-я группа - крысы, которым за 1 час до ЧМТ внутрибрюшинно вводили 0,9% раствор NaCl в объеме равном объему растворителя для исследуемых веществ; 6-я группа - крысы, которым за 1 час до ЧМТ 0,9% раствор NaCl вводили внутривенно; 7-я группа -контрольная, в которой крыс подвергались только воздействию наркоза. Через 2 часа после ЧМТ крыс декапитировали, извлекали головной мозг и готовили ОГМ.

Методика моделирования гипоксической гипоксии. Гипоксическую гипоксию создавали, "поднимая" крыс в барокамере с приточно-вытяжной вентиляцией на высоту 12000 м. "Подъем" животных проводили в течение 8 минут (в 1-ю минуту на 5000 метров, а в каждую последующую на 1000 метров). На "высоте" 12000 метров подъем прекращали и животных выдерживали на этой "площадке" до гибели. В каждой серии проводили одновременно "подъем" контрольных и опытных животных.

Приготовление культуры астроцитов и методы их исследования . Культуру нервной ткани получали по методу J.Boocher, M.Sensenbrenner, [1972] в модификации З.Б. Квачевой, [1987]. Использовали головной мозг новорожденных крыс 1-2 недельного возраста. Содержание глиального фибриллярного кислого белка (ГФЬСБ) оценивали непрямым методом флюорисценции антител с использованием кроличьей поликлональной сыворотки в рабочем разведении (1 : 20) (фирмы Sigma). Для морфологического изучения культур их фиксировали в разные сроки культивирования фиксатором Дюбоск-Бразиль-Буэна, окрашивали гемотоксилином Бемера и 0,5% водным раствором эозина. Препараты культур анализировали в световом микроскопе "Biostar", используя увеличение в 100-450 раз.

Пролиферативную активность клеток оценивали по плотности насыщения клеток в монослое и их митотической активности. Для определения митотической активности подсчитывали в поле зрения микроскопа по 3000-5000 клеток, выделяя среди них клетки в стадии деления. Активность выражали в %о (промилле). Гипоксическое воздействие на культуры осуществляли в герметической камере с газовой смесью 95% азота и 5% углекислого газа. Для изучения протективного действия исследуемых веществ в культуре астроцитов соединения вносили в питательную среду за 30 минут до помещения культур в гипоксическую камеру. Для ультраструктурного изучения астроцитов, культивируемых в условиях гипоксии, применяли общепринятую методику на фиксированных 2,5% глутаральдегидом в 0,1М какодилатном буфере (pH 7,3) и 1% 0s04 в том же буфере в клетках монослоя и осадке, обезвоженных в спиртах возрастающей концентрации и заключенных в аралдит. Полученные ультратонкие срезы изучали в электронном микроскопе JEM-100-СХ (Япония).

Количественный морфометрический анализ площадей астроцитов проводили с использованием компьютерной системы анализа изображения "BIOSCAN -AT" по программе, разработанной в лаборатории морфологических методов исследования МГМИ [А.Ф. Рубенчик, Г.М. Карапетян, A.M. Недзьведзь]

Изучения физико-химических свойств мембран астроцитов. Физико-химических свойств мембран астроцитов проводили с помощью флуоресцентных методов на спектрофотометре Jobin Yvon (Франция). В качестве биофизических тестов использовали интенсивность флуоресценции (16) клеточных белков, а также отношение интенсивностей эксимерной к мономерной флуоресценции пирена (1э/1м), характеризующих вязкость липидного слоя мембран. Интенсивность флуоресценции выше указанных хромофоров определяли при длинах волн возбуждения/регистрации 280/330, 340/460, 335-475, 393 нм, соответственно. Состоянием энергетического обмена в клетках можно исследовать, используя флуоресцентный метод, поскольку ключевые интермедиа™ такого обмена (никотинамиды и флавины) обладают флуоресценцией. Для определения относительного содержания восстановленных пиридиннуклеотидов в астроцитах исследовали интенсивность в максимуме флуоресценции в суспензии клеток при возбуждении излучением с >.=340 нм. В культуре астроцитов оценивали активность супероксиддисмутазы (СОД) по методу C.Beachamp, J.Fridovich, [1971]. Содержание МДА в культуре астроцитов оценивали по методу L.K. Dahle е.а., [1988].

Методы первичной токсикологической оценки исследованных соедииений. Токсичность препаратов при введении в желудок изучали в опытах на белых нелинейных крысах массой 180-240 г и белых мьппах массой 18-22 г. Дозу, вызывающую гибель 50% подопытных животных (ЛД50), определяли методом пробит-анализа по Литчфилду-Уилкоксону. Сроки гибели животных и характер токсического действия веществ регистрировали в течение 2 недель. Изучение местного раздражающего действия соединения Т-3 через неповрежденную кожу проводили в соответствии с методическими указаниями Минздрава СССР от 1979 г.: "Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно допустимых уровней загрязнений кожи" на 2 группах морских свинок путем 20-кратных (по 6 раз в неделю) эпикутанных апликаций препарата на растительном (1-я группа) и вазелиновом масле (2-я группа).

Ориентированная оценка кожно-резорбтивного действия Т-3 выполнена в опытах на белых мышах "пробирочным методом" в течение 14 дней с экспозицией 2 часа. Статистическую обработку полученных экспериментальных данных производили с использованием непараметрических методов статистики с выделением значимости различий по ^критерию.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Антиоксидантные свойства производных двухатомных фенолов п ПГК. При

сравнительном изучении базовых фенольных соединений установлено, что наиболее активными в антиоксидантном отношении являются пирокатехин и гидрохинон, которые в диапазоне концентраций 10'5 - 10"3 снижают образование МДА в ОГМ крыс на 2,3-90% и 47,4-82,1%, соответственно. В этой связи, пирокатехин и гидрохинон были выбраны в качестве исходных веществ для последующего синтеза антиоксидантов этого ряда.

На 1 этапе наших исследований из 24 синтезированных соединений по оценке их антиоксидангной активности в ОГМ было отобрано 4 наиболее эффективных соединения.

Антиоксидантную активность впервые синтезированных производных многоатомных фенолов сравнивали с таковой известных антиоксидантов, аналогов одноатомных фенолов - альфа-токоферолом и ионолом.

Из группы производных пирокатехина и гидрохинона наиболее эффективными оказались соединения Т-3, Т-37. Уровень МДА в ОГМ крыс при концентрациях соединения Т-3 10"7- 10"3 М не превышал 9,4-3,1% . В концентрации 10"8 М соединение Т-3 ингибирует скорость образования МДА на 61,5%. Соединение Т-37 в концентрациях 10"6- 10"3 М снижает образование МДА на 80,6-98,7 %. Антиокислительная активность этих соединений значительно превосходит ионол и альфа-токоферол (рис. 1), особенно в диапазоне низких концентраций, где последние не влияют на содержание МДА.

А

Рис.1. Влияние соединения Т-3 (А), Т-37 (Б), ионола и альфа-токоферола на содержание малонового диальдегида в общем гомогенате мозга крыс

В связи с этим соединения Т-3 и Т-37 были отобраны для дальнейших углубленных исследований.

Наиболее эффективным из впервые синтезированных серосодержащих производных двухатомных фенолов по антиоксидантной активности явилось соединение Т-15, которое в интервале концентраций Ю^-Ю"4 М ингибирует образование МДА в ОГМ крыс на 95,6-97%. Соединение Т-15 по ингибирующей активности также существенно превосходит альфа-токоферол и ионол (рис.2). В связи с этим соединение Т-15 также было отобрано для дальнейших экспериментальных исследований.

120 -

£100 - __-

||||.

-4 -5 -в -7 -8

концентрация 10Ап

Рис.2. Влияние соединения Т-15, ионола, альфа-токоферола на содержание малонового диальдегида в общем гомогенате мозга крыс

Галловая кислота относится к классу трехатомных фенолов и является природным водорастворимым антиоксидантом. Поскольку галловая кислота и ее производное полидисульфид галловой кислоты (ПГК) относится к водорастворимым соединениям их антиоксидантную активность сравнивали с известным водорастворимым препаратом - эмоксипином. У полидисульфида галловой кислоты в нашей постановке эксперимента выявлена высокая антиокислительная активность (табл.).

Таблица.

Влияние полидисульфида галловой кислоты и эмоксипина на содержание МДА в ОГМ крыс (% содержания МДА от контроля-«норма»)(п=9)

-й№,иГПГК--- ¿Эмоксипин - ■

10" М±Л1 1,94±0,54 6.67±1.82 94,8510,72

Р1-2 <0,05

Р1-3 <0,001

10" М±т 1,82±2,48 14,47±1,04 108 812,48

Р1-2 <0,05

Р1-3 <0,001

10-' М±т 43,68±2,65 65,18±6,26 99 4911,35

Р1-2 <0,001

Р1-3 <0,001

10* Man 83,1414,62 88,57±4,03 94.6011.19

Р1-2 >0,5

Р1-3 >0.5

10' M±m 97,59±1,12 105 1±9,31 96,011,44

Р1-2 >0,5

Р1-3 >0 5

10" МУЛ 94,72+2,22 108.2±9,41 96,25+0,99

Р1-2 >0,5

Р1-3 >0 5

Примечание: Р1-2 - достоверность различий при сравнении ПС с эмоксипином Р1-3 - достоверность различий при сравнении ПГК с эмоксипином

Таким образом, синтезированные производные двухатомных и трехатомных фенолов являются эффективными ингибиторами СРО, причем наиболее высокой антиокислительной активностью обладает Т-3.

Биологическую активность отобранных соединений далее изучали на моделях in vitro (в культуре клеток) и in vivo (в организме лабораторных животных).

Протекторные свойства производных двух- и трехатомных фенолов в культуре астроцитов в условиях гипокспи Исследования по влиянию гипоксии на астроцитарные клетки in vitro относительно немногочисленны. В экспериментах используются, как правило, перевиваемые опухолевые линии. Для создания наиболее адекватных условий изучения гипоксического повреждения астроцитов, приближенных к таковым в организме, нами были приготовлены и использованы первичные монослойные культуры, полученные из мозга новорожденных крыс 2-х недельного возраста.

В целях достижения достоверности и воспроизводимости результатов исследования на первом этапе работы были отработаны и стандартизированы условия

приготовления культур астроцитов для последующего их применения в экспериментах. Для этого использовали первичные культуры мозга новорожденных крыс 2-х недельного возраста и культуры 1-го пассажного уровня на 4-5 сутки роста in vitro (посевная доза 70000-100000 клеток/мл питательной среды) в фазе стационарного роста. Полученные культуры мозга новорожденных крыс состояли на 95% из ГФКБ - положительных клеток и были представлены протоплазматическими и фибриллярными астроцитами. 2-3% из всех представителей популяции составили клетки мезенхимальной природы. Нейроны отсуствовали. Протоплазматические астроциты среди астроглиальных клеток преобладали. Они имели звездчатую, иногда несколько вытянутую форму, с разной длины цитоплазматическими отростками. Характерной особенностью их при обработке антисывороткой к ГФКБ являлось наличие равномерного специфического свечения тел и отростков. При ультраструктурном изучении их цитоплазма и ядра имели низкую электронную плотность. В цитоплазме содержалось небольшое количество глиофибрилл и рибосом. Эндоплазматический ретикулум и комплекс Гольджи представлены короткими цистернами. Количество митохондрий, их размеры и форма варьировали в широких пределах. Ядра протоплазматических астроцитов имели округлую или овальную форму, содержали равномерно диспергированный хроматин, в большинстве случаев 2-3 нуклеолонемных ядрышка. Фибриллярные астроциты сходны по форме с протоплазматическими, однако, имели меньшую площадь тела клетки, более крупные ядра и длинные дихотомически ветвящиеся отростки. Специфическое свечение в реакции на ГФКБ преобладало у них вокруг ядер. При улътраструюурном исследовании отличительными признаками фибриллярных астроцитов являлось наличие мощных пучков глиофибрилл, часто начинающихся от перинкулеарной области цитоплазмы и идущих по периферии к отросткам. В их ядрах, как правило, содержалось не более 2-3 нуклеолонемных ядрышка. В культурах встречались единичные клетки олигодендроглии.

Таким образом, данные световой, электронной микроскопии и цитоиммунохимических исследований подтверждают высокую степень дифференцировки и функциональной активности астроцитарных клеток, которые использовались нами в качестве экспериментальной модели для изучения гипоксического повреждения астроцитов и защитного действия исследуемых веществ.

Существенное значение имеет выяснение взаимосвязи динамики морфо-функциональных характеристик астроцитов, подвергнутых гипоксии, с изменением их биохимических показателей.

Влияние гипоксии на морфо-функциональиые характеристики астроцитов in vitro

Первичные морфологические изменения в культурах астроцитов, подвергшихся гипоксическому воздействию, начинали прослеживаться через 16 часов в пассируемой культуре и 18 часов в первичной культуре астроцитов и характеризовались гипертрофией и увеличением размеров клеток в 2-8 раза (площадь цитоплазмы от 1700 мкм2 до 4000 мкм2), вакуолизацией цитоплазмы, появлением многоядерных клеток, снижением уровня митотической активности клеток и патологией митоза (неупорядоченное расположение хромосом в мета- и анафазе). Степень выраженности этих изменений усиливалась после 20 часовой гипоксии: вовлекались в поражение ядра (просветление ядерного вещества, отсутствие

ядрышек), появлялась эозинофилия в цитоплазме. Поражение клеток имело очаговый характер. Целостность монослоя в эти сроки еще сохранялась. Дальнейшая инкубация культур в гипоксической камере в течение 24 часов приводила к нарушению целостности монослоя с отторжением части клеток от поверхности флакона. Клетки сморщивались, отмечался пикноз ядер с появлением светлой перинуклеарной зоны в цитоплазме.

Электронно-микроскопический анализ астроцитов, находившихся в условиях гипоксии в течение 20 часов, выявил следующие ультраструктурные сдвиги в ядре и цитоплазме клеток. Большая часть ядерного хроматина была диспергирована с узкой полоской конденсированного хроматина у внутреннего листка нуклеолеммы; однако в ряде клеток наблюдалось возрастание количества глыбок гетерохроматина; в ядрах в плоскость среза обычно попадали одно или два ядрышка, часто имеющих нуклеолонемную организацию; перенуклеарное пространство имело локальные расширения. В цитоплазме наблюдалось очень большое количество различных органелл округлой формы. Фаголизосомы, часто заполненные у одного из полюсов мелкогранулярным или аморфным элекгронноплотным материалом; митохондрии различных размеров и формы - вытянутые изогнутые филаментозные формы с сохранившимися обеими мембранами, кристами и матр иксом умеренной электронной плотности (функциональное состояние) и разбухшие округлые или овальные митохондрии с деструкцией крист и разреженным матриксом (нефункциональное состояние), в котором часто наблюдаются небольшие скопления темных глобул диаметром 10-15 им; цистерны шероховатого эндоплазматического ретикулума (ШЭР) слабо расширены и заполнены мелкогранулярным материалом. В цитоплазме обнаруживалось большое количество мелких липидных капель, а также свободные рибосомы, аномальные мембранные образования, микротрубочки и небольшие пучки промежуточных филаментов и другие структуры.

Наряду с вышеизложенными изменениями органелл клеток нами отмечены клетки (5-7%) с признаками развивающегося апоптоза, характеризующегося наличием апоптозных тел в цитоплазме за счет отшнуровывания фрагментов ядра, фрагментации и конденсации хроматина, деструкцией части цитоплазматической мембраны. При этом, митохондрии в этих клетках были сохранены.

Следовательно, полученные результаты показывают следующие деструктивные изменения астроцитов при гипоксии: снижение митотической активности, клеточный отек, нарушение ультраструктуры клеток, апоптоз. Выраженность этих структурно-функциональных изменений астроцитов зависит от длительности гипоксии и максимального развития достигает через 20 часов. Полученные результаты ясно показывают, что гипоксия изменяет структуру и функцию астроцитов в культуре. Астроцитарная реакция на любое повреждающее воздействие, по мнению авторов [W.J. Goldberg, 1986; А.И. Ройтбак, 1993; И.А. Заволишин, 1996], является начальной, первичной реакцией мозга. Реактивация, по утверждению А.П.Новожиловой является универсальной компенсаторной реакцией ЦНС. В наших исследованиях размеры некоторых культуральных клеток увеличивались в 2-10 раз (в норме размеры площадей клеток 150-1700 мкм2). При морфологическом анализе астроцитов, увеличенных в размере, их функциональное состояние можно разделить на реактивацию (увеличение размера клеток в 2-3 раза)- адаптивную реакцию и отек (увеличение размера клеток в 4-10 раз) - патологическое состояние.

Влияние производных многоатомных фенолов на морфо-функциональное состояние астроцитов при гипоксии

В предварительной серии экспериментов в культуре астроцитов были определены нетоксичные переносимые дозы исследуемых веществ. Эмоксипин вносили в концентрации 1,5 мкг-30 мг/мл ростовой среды. Нетоксичной для клеток оказалось концентрация эмоксипина 1,5-15 мкг/мл питательной среды. 15% спиртовой раствор альфа-токоферола добавляли в питательную среду в дозе 15-150 мкг/мл ростовой среды. Нетоксичной для астроцитов оказалась доза 15-30 мкг/мл ростовой среды. 1% спиртовой раствор ионола, Т-3, Т-15, Т-37, ПГК исследовали в концентрации 0,01-15 мкг/мл ростовой среды. Нетоксичной для клеток оказалось доза препаратов 0,01-0,05 мкг/мл питательной среды. В серии экспериментов было установлено, что спирт в применяемых для растворения препаратов разведениях токсического действия на клетки культуры нервной ткани не оказывал.

Для оценки протекторного действия исследуемых соединений на культуры нервной ткани в условиях гипоксии было выбрано время гипоксического воздействия 20 часов. Это обусловлено тем, что при указанной длительности гипоксии сохранность клеточного монослоя еще не нарушается. В то же время, при анализе морфо-функционального состояния клеток выявлены наиболее характерные индуцированные гипоксией нарушения, которые и были выбраны в качестве критериев для количественной сравнительной оценки состояния культур в опыте и контроле. Этими критериями оказались: количество гипертрофированных клеток и уровень митотической активности.

Так, в частности, число гипертрофированных клеток в культурах, подвергнутых гипоксии, увеличилось в 10 раз, при этом митотическая активность снизилась в 2,4 раза по сравнению с контролем .

Предварительное, за 30 минут, внесение соединений Т-3 и ПГК в ростовую среду в концентрации 0,05 мкг/мл способствовало уменьшению числа гипертрофированных клеток в культурах, подвергнутых гипоксии, в 17 и 5,3 раза, соответственно. Митотическая активность при этом увеличилась в 1,9 и 1,7 раза, приближаясь к уровню контрольных культур.

При добавлении ионола в концентрации 0,05 мкг/мл питательной среды отмечено снижение в 3,8 раза числа гипертрофированных клеток в культурах, подвергнутых гипоксии, но митотическая активность при этом оставалась на уровне культур, находившихся в условиях гипоксии без добавления соединений.

Внесение в питательную среду культур, подвергнутых гипоксии, альфа-токоферола в концентрации 30 мкг/мл ростовой среды приводило к снижению количества гипертрофированных клеток до уровня контрольных культур, митотическая активность при этом возросла в 1,3 раза.

Изучение протекторного действия эмоксипина и соединений Т-37, Т-15 проводили на пассированной 3 дневной культуре астроцитов в ранней фазе стационарного роста, где митотическая активность клеток очень высока.

В условиях гипоксии митотическая активность астроцитов снизилась в 2 раза (р<0,05). Число гипертрофированных клеток увеличилось в 4 раза (р<0,001). При внесении в ростовую среду культур с гипоксией 3% водного раствора эмоксипина в дозе 15 мкг/мл питательной среды уменьшалось число гипертрофированных клеток в 1,4 раза, а митотическая активность достоверно возрастала на 59%.

Внесение в ростовую среду спиртового раствора соединения Т-15 способствовало снижению числа гипертрофированных клеток в 2,4 раза, митотическая активность при этом возросла на 53%. При добавлении соединения Т-37 снизилось число гипертрофированных клеток в 1,6 раза, митотическая активность увеличилась на 41%. Культуры астроцитов, подвергшихся гипоксическому воздействию с предварительным внесением соединения Т-3, имели ультраструктуру, сходную с вышеописанными контрольными культурами.

Как видно из экспериментальных данных, добавление исследуемых соединений в питательную среду значительно снижало повреждающее действие гипоксии на морфо-функциональное состояние астроцитов и приближало их к контрольным.

Влияние гипоксии и соединения Т-3 на морфно-функциональное состояние мембран астроцитов Вязкость мембранных липидов астроцитов в норме и при экспериментальной гипоксии. Одним из подходов, позволяющих достоверно тестировать состояние мембранных липидов, находящихся как в бислое, так и прибелковых (анулярных) липидов является определение степени эксимеризации мембраносвязанного флуоресцентного зонда пирена. При гипоксии в астроцитах происходит увеличение отношения интенсивностей эксимерной к мономерной флуоресценции красителя при возбуждении излучением с Х=335 нм более, чем в 2 раза, что свидетельствует о снижении вязкости лшшдного бислоя мембран астроцитов. Исследование состояния прибелковых липидов в этих клетках с использованием пирена, возбуждаемого излучением с Х=280 нм, также выявило значительное увеличение исследуемого параметра. Полученные данные указывают на снижение вязкости и анулярных липидов астроцитов более, чем в 1,8 раза.

Рис. 3. Зависимость отношения интенсивности эксимерной к мономерной флуоресценции пирена, связанного с астроцитами в норме (1,2) и при экспериментальной гипоксии (3,4): 1, 3 - X возбуждения = 335 нм, 2, 4 - X возбуждения = 280 нм

Возникающие при гипоксии структурные перестройки липидной компоненты мембран, изменения физико-химических параметров липидного бислоя, нарушение оптимальных белок-липидных взаимодействий играют существенную роль в

цитодеструктивных процессах, инициирующих последующие сдвиги обменных процессов в клетках нервной ткани.

Добавление соединения Т-3 в среду инкубации культур значительно снижало индуцированные гипоксией изменения физико-химических параметров как липидного бислоя, так и анулярных липидов, что проявлялось в частичном или полном возврате к норме исследуемых параметров зондовой флюоресценции.

Флуоресценция восстановленных пиридиннуклеотидов астроцитов в норме и

при гипоксии.

В астроцитах, культивируемых в условиях гипоксического стресса, наблюдалось значительное ( в 4,4 раза ) увеличение по сравнению с контролем флуоресценции восстановленных пиридиннуклеотидов (рис.4) при воздействии излучением с X =340 нм

Рис. 4. Интенсивность флуоресценции восстановленных пиридиннуклеотидов в суспензии астроцитов в норме (1) и при экспериментальной гипоксии (2)

Столь резкое увеличение данного показателя сопряжено с возрастанием в астроцитах восстановленных пиридиннуклеотидов. Полученные результаты согласуются с литературными данными, в которых отмечается быстрое накопление восстановительных эквивалентов, коррелирующее с увеличением отношения НАД Н7НАД' в цитозоле клеток в ответ на дефицит кислородного обеспечения. Вторым возможным компонентом, ответственным за флуоресценцию клеток в данной области спектра, являются продукты ПОЛ, типа шиффовых оснований. Это подтверждается появлением дополнительного максимума в области 380-390 нм в спектрах возбуждения флуоресценции астроцитов, находившихся в условиях гипоксии. В целом, приведенные результаты свидетельствуют о том, что исследование флуоресценции клеток в синей области спектра дает возможность получить важную информацию о состоянии энергетических систем и сопряженности их с ПОЛ.

Влияние гипоксии, реоксигенации и соединения Т-3 на процессы перекисного

окисления липидов в астроцитах При 20 часовой гипоксии отмечалось значительное - в 1,9 раза - уменьшение в гомогенате культуры клеток астроцитов содержания СОД, а при 20 часовой гипоксии и 3 часовой реоксигенации - в 15 раз. Уровень МДА при этом снижался при гипоксии на 28,6% и незначительно при гипоксии и реоксигенации. Полученные результаты

показывают, что в условиях гипоксии в астроцитах происходит снижение активности антиоксидантных систем. Реоксигенация усугубляет эти процессы. Это может привести к интенсификации продукции активных форм кислорода и активации СРР. Однако, эти СРР, по-видимому, не затрагивают реакций ПОЛ и протекают в водной, а не липидной фазе клетки, так как не увеличивается уровень ТБК-активных продуктов.

Полученные результаты показывают, что гипоксия в культуре клеток мозга новорожденных крыс приводит к отеку (увеличение размеров клеток в 1,5-10 раз) и гибели части клеток, снижению уровня митотической активности, нарушению структуры клеточных органелл, что особенно выражено проявляется у митохондрий. При этом снижается активность антиоксидантных систем клеток и активируются СР процессы, изменяется структура и функция клеточных мембран. Добавление исследуемых соединений в питательную среду предотвращало повреждение и гибель клеток и их органелл и снижало структурные нарушения липидного бислоя клеточных мембран в астроцитах, культивируемых в условиях гипоксии.

Изучение влияния гипоксии и производных фенола на астроциты в монослойных культурах, полученных из ткани мозга новорожденных крысят, показали, что астроцитарные культуры являются удобной моделью, позволяющей проводить скрининг антиоксидантов, антигипоксантов, а также изучать механизмы гипоксического повреждения нервной ткани.

Существенный интерес представляла оценка антиоксидантной и антигипоксантнон активности производных многоатомных фенолов при моделировании таких патологических состояний организма, как гипоксия и ЧМТ.

Влияние производных фенола на процессы перекисного окисления липидов в

мозге при черепно-мозговой травме и гипокснческой гипоксии Спустя 2 часа после ЧМТ скорость накопления МДА в ОГМ крыс по отношению к контрольной группе животных возросла на 34,5%, концентрация ДК -в 2,2 раза, а уровень ФП ПОЛ увеличился в 3,4 раза. Предварительное за 1 час до ЧМТ внутрибрюшинное введение эмоксипина в дозе 25 мг/кг веса приводило к снижению концентрации образования МДА в ОГМ на 36% и уменьшению содержания ФП ПОЛ в 2,1 раза. Содержание ДК и НЭЖК при этом увеличилось на 25% и 12%, соответственно.

При предварительном за 1 час до ЧМТ внутрибрюшинном введении ПГК в дозе 25 мг\кг веса содержание МДА в ОГМ крыс снизилось на 34,8%, концентрация ДК -на 65,4% по сравнению с животными с ЧМТ, которым препарат не вводился. Уровень НЭЖК уменьшился на 38%, содержание ФП ПОЛ - на 48,7%. При внутривенном введении за 1 час до ЧМТ крысам эмоксипина в дозе 25 мг/кг веса скорость накопления МДА снизилась на 20%, а уровень НЭЖК - на 33,7% , концентрация ДК и ФП ПОЛ увеличилась в 2,1 раза и 2,3 раза, соответственно. Внутривенное введение за 1 час до ЧМТ ПГК в дозе 25 мг\кг веса способствовало снижению скорости образования МДА на 19,7%, ФП ПОЛ - на 32,7%, НЭЖК - на 50% . При внутрибрюшинном профилактическом за 1 час до создания гипоксии введении соединения Т-3 в дозе 25 мг/кг веса выживаемость животных по сравнению с контролем увеличилась в 1,95 раза. При введении ионола в дозе 60 мг/кг веса и эмоксипина в дозе 25 мг/кг веса в данной постановке эксперимента эффекта не наблюдалось. Профилактическое введение за 30 минут до подъема животных

соединения Т-3 в указанной дозе приводило к снижению скорости накопления МДА в ОГМ на 15,3% по сравнению с контролем и сопровождалось увеличением содержания альфа-токоферола в ткани мозга крыс на 21,5%.

Таким образом, полученные результаты показали, что гипоксическая гипоксия и ЧМТ сопровождаются активацией процессов ПОЛ в мозге и накоплением продуктов ПОЛ. Профилактическое за 1 час до нанесения ЧМТ введение животным ПГК способствовало снижению концентрации всех исследуемых продуктов ПОЛ. В данной постановке эксперимента ПГК по антиоксидантному действию превосходит эмоксипин. Соединение Т-3 снижает концентрацию продуктов ПОЛ и повышает содержание альфа-токоферола в мозге крыс при гипоксии по сравнению с животными, не получавшими эти препараты. При введении соединения Т-3 у крыс при гипоксической гипоксии также увеличивается и продолжительность жизни. При внутрибрюшинном введении соединений ионола и эмоксигаша в указанных дозах этот эффект отсутствует. Полученные результаты указывают на наличие и антигипоксантного эффекта у соединения Т-3.

Итак, описанные выше результаты исследования показывают, что в мозге при ЧМТ и гипоксии активируются процессы ПОЛ. Применение производных многоатомных фенолов значительно ингибирует процессы СРО, что способствует снижению выраженности цитодеструктивных изменений в клетках нервной ткани.

Таким образом, синтезированные производные орто-замещенных фенолов являются эффективными антиоксидантами и обладают антигипоксантным действием. Изложенное подтверждает целесообразность поиска и создания лекарственных средств на основе двух- и трехатомных фенолов.

Предварительная токсикологическая оценка соединения Т-3

По параметрам острой токсичности соединение Т-3 относится к умеренно опасным соединениям (Ш класс опасности по ГОСТу 12.1.007-76 "Вредные вещества").

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Производные орто-замещенных фенолов обладают высокой антиокислительной активностью, превосходящей таковую у известных аналогов одноатомных фенолов, таких как альфа-токоферол, ионол.

2.Разработана модель гипоксического повреждения астроцитов мозга новорожденных крыс, культивируемых in vitro и предложены морфо-функциональные критерии (количество гипертрофированных клеток и уровень митотической активности, функциональное состояние мембран и ультраструктура клеток), позволяющие провести количественную оценку влияния гипоксии и протекторного эффекта исследуемых соединений на астроциты, помещенные в гидаксические условия.

3. Производные двухатомных фенолов (Т-3, Т-37, Т-15) и полидисульфид галловой кислоты при добавлении в питательную среду в концентрации нетоксичной для клеток (0,05 мкг/мл) снижают повреждающее действие гипоксии на астроциты, что проявляется в возрастании митотической активности на 41,3-90 %, снижении количества гипертрофированных клеток на 48,4-94,2%, нормализацией функционального состояния мембран астроцитов и ультраструктуры клеток.

4. Гипоксия сопровождается активацией процессов ПОЛ в мозге и снижением антиоксидантной защиты. Соединение Т-3, полидисульфид галловой кислоты в нетоксичной дозе (25 мг/кг веса) при внутрибрюшинном введении снижают уровень

продуктов ПОЛ и способствуют увеличению содержания альфа-токоферола в мозге лабораторных животных при черепно-мозговой травме и гипоксической гипоксии.

5. Соединение Т-3 в дозе 25 мг/кг веса при внутрибрюшинном введении проявляет антигнпоксантное действие, повышая в 2 раза выживаемость крыс, подвергнутых гипоксической гипоксии.

6. Производное двухатомных фенолов соединение Т-3 относятся к III классу опасности и является умеренно опасным соединением (по ГОСТУ 12.1.007-76 "Вредные вещества").

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

1.Мезен Н.И., Квачева З.Б., Федулов А.С., Шадыро О.И., Тимощук В.А., Олешкевич Ф.В. Антиокислительная активность некоторых дву- и тризамещенных производных фенола в гомогенатах мозга и культуре нервной ткани,- Тезисы докладов 4-ой Всесоюзной конференции «Биоантиоксидант». Москва. 2-4 июня 1992г.- с.256.

2. Fedulov A., Sheleg S., Oleshkevich F., Kvacheva Z., Mezen N., Zhavrid E.. Predicting the efficacy of curability of malignant brain gliomas in cell.- X International Congress of Neurological Surgery. Acapulco, Mexico, October 17-22 1993, F-145-K-20.

3. Харламова A.H., Мезен Н.И., Федулов A.C., Пленина Л.В., Хлюстов С.В.. Анализ возрастных особенностей противогипоксического действия диавитола и актовегина. -Материалы конференции «Фармакологические свойства новых клинических соединений и некоторых лекарственных препаратов». Минск, 1994, с.65-67.

4.Ахрем А.А., Долгопалец В.И., Кисель М.А., Мезен Н.И., Тимощук В.А., Федулов А.С., Шадыро О.И. Синтез и свойства мембраноадресованных антиоксидантов на основе фосфорилированных пирокатехинов,- Биорганическая химия.-1995-T.21-№5-с.391-395.

5.Fedulov A., Mezen N., Kvacheva Z., Plenina L., Hlustov S„ Babuk L., Oleschkevich F., Marchenko L. Molecular and Cellular Basis of Protektive Emoxipin and Diavitol Action Duaring Traumatic Brain Injuris. - 10th Europen Congress of Neurosurgery. Berlin, Germany, 7-12 May 1995. Abstract -P.239 (Poster 108).

6.01eshkevich F., Fedulov A., Kamyshko V., Plenina L., Hlustov S., Mezen N„ Kvacheva Z., Lobanok E., Shukanova N., Shemagonov A. Complex Antioxidant Treatment of Ischemic Stroke (Clinical and Experimental Study).- Europen J. of Neurology, Vol.2, Suppl.l. Abstracts of the Iя Congress of the European Federation of Neurological Societies. Marsielle, France, 9-14 September 1995.-P. 79.

8. Мезен Н.И., Квачева З.Б., Федулов A.C., Олешкевич Ф.В., О.И. Шадыро Ф.В., Тимощук В.А. Влияние гипоксии на морфо-функциональные параметры астроцитов в монослойной культуре.- Бюл. экспер. Биологии и медицины 1996, №11, т.122, с.581-584.

9. Mongin А.А., Aksentsev S.L., Orlov S.N., Kvacheva Z.B., Mezen N.I., Fedulov A.S., Konev S.V. Swelling-induced activation of Na+,K+, 2CL- cotransport in C6 glioma cells: kinetic properties and intracellular signalling mechanisms/-Biochemica et Biophysica Acta. Vol.1285, 1996, P.229-236.

10. Шадыро О.И., Шилов Г.Н., Тимощук В.А., Власова В.И., Федулов А.С., Мезен Н.И. Биоантиоксидантная активность 3,5-ди-трет-бутилпирокатехина и его влияние на гипоксию, воспалительный процесс, болевой синдром и ожоги. - Вопросы медицинской химии 1-997, т.43, вып.З, с. 153-157.

11. Oleshkevich F., Fedulov A., Mezen N.. Plenina L„ Hljustov S.. Marchenko L.. Neuroprotective properties of emoxipin and diavitol in brain trauma: Experimental and clinical aspects. II1 International congress of Neurological surgery, Amsterdam. 6-11 july 1997, P3-307. - Clinical Neurology and Neurosurgery 1997, Vol.99, p. 142.

12. Mongin A.A., Aksentsev S.L., Fedulov A.S., Kvacheva Z.B., Mezen N.I., N. S.Orlov. Hypotonic cell swelling changes Na\ 1С,2 СГ cotransport activity and a mode of its operation in cultured glial cells.-J. Neurochemistry 1997, Vol.69, p.31.

13. Mongin A.A., Aksentsev S.L., Fedulov A.S., Kvacheva Z.B.. Mezen N.I., N. S.Orlov. Hypotonic cell swelling changes Na\ K',2 СГ cotransport activity and a mode of its operation in cultured glial cells.- XXXIII International Congress of Physiological sciences. 30 june -5 jule 1997, St.Peterburg, P.025.04.

14.Mezen N., Kvacheva Z., Lobanok L., Shukanova N., Ilkevich Y., Fedulov A., Marchenko L. Correction of posthypoxic injuries of astrocytes by a new antihypoxant diavitol in vitro.-1th International update on Neuro-Anesthesia and Neuro-Intensive Care. Anestesia 1998, Vol.1, N1,N. 146.

15.Fedulov A., Kvacheva Z., Mezen N., Lobanok L., Shukanova N.. Ilkevich Y„ Shadyro O. Protective effect a new synthetic antioxidant in hypoxic damage of astrocytes in vitro. 1th International update on Neuro-Anesthesia and Neuro-Intensive Care. Anestesia 1998, Vol. 1, N1,N.T.48.

16.Фсдулов A.C., Мезен Н.И., Квачева З.Б., Плешша JI.В., Илькевич Ю.Г., Полещук Н.Н., Карапетян Г.М. Влияние гипоксии на морфо-функциональное состояние культуры астроцитов и протекторный эффект диафена. - Сборник материалов конференции "Молекулярная генетика и биотехнология" 6-8 апреля 1998г. г. Минск, стр.118-121.

РЕЗЮМЕ

Метен Нина Иосифовна

«Биохимические аспекты гипоксического повреждения нервной ткани и его коррекция производными многоатомных фенолов»

Ключевые слова: гипоксия, головной мозг, перекисное окисление липидов, антиоксиданты, культура астроцитов, производные двухатомных фенолов, полидисульфид галловой кислоты.

Объект исследования: головной мозг лабораторных животных, культура астроцитов, синтезированные производные двухатомных фенолов и полидисульфид галловой кислоты.

Цель работы: - провести сравнительное изучение антиоксидантной активности впервые синтезированных производных орто-замещенных фенолов и полидисульфида галловой кислоты с известными одноатомными фенолами и исследовать некоторые механизмы нейропротекторного действие этих веществ при гипоксическом повреждении нервной ткани in vitro и in vivo. Методы исследования' Определение продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), альфа-токоферола и супероксиддисмутазы в ткани мозга лабораторных животных и культуре нервной ткани; оценка структурно-функциональных характеристик культуры нервной ткани.

Полученные результаты и их новизна: Проведено комплексное и биохимическое изучение впервые синтезированных антиоксидантов из ряда орто-замещенных фенолов на биологических моделях. Проведен скрининг синтезированных, обладающих новизной, производных многоатомных фенолов и выявлен ряд соединений с достаточно высокой антиокислительной активностью (АОА). На разработанной модели гипоксического повреждения нервных клеток впервые исследованы биохимические и структурно-функциональные изменения астроцитов при гипоксии и выявлен нейропротекторньш эффект производи ых двухатомных фенолов и полидисульфида галловой кислоты. Изучено влияние гипоксии на ультраструктуру органелл астроцитов мозга новорожденных крыс. Получены дополнительные данные о структурно-функциональном состоянии мембран астроцитов в условиях экспериментальной гипоксии. Расширено представление о состоянии энергетического обмена в астроцитах при гипоксии. Впервые показано, что производные орто-замещенных фенолов обладают антигипоксантным действием. Разработанная модель гипоксического повреждения культур астроцитов мозга новоржденных крыс позволит изучать механизм гипоксического повреждения нервной ткани и проводить скрининг препаратов с нейропротекторным действием. Полученные в работе результаты показали, что производные многоатомных фенолов ингибируют ПОЛ в мозге крыс при черепно-мозговой травме и гипоксической гипоксии. Впервые синтезированные производные многоатомных фенолов относятся к малотоксичным соединениям.

Область применения' биохимия, фармакология, неврология.

РЭЗЮМЭ

Мезен Hiiia 1опфауна

"Б|ях1м1чныя аспекты пашкоджання нервовай тканк! i яго карэкцыя вытворны>11 шмататомных фенолау"

Ключавыя словы: ппакЫя, галауны мозг, перагаснае аисленне лтщау, антыаксщанты, культура астрацытау, вытворныя двухатомных фенолау, полЫсульфш галавай юслаты.

Аб'ект доследования: галауны мозг лабараторных жывел, культура астрацытау, Ынтазаваныя вытворныя двухатомных фенолау , полцнсульфщ галавай юслаты. Мзта работы: правесщ параунальнае вывучэнне антыакс1дантнай актыунасш упершыню антазаваных вытворных двухатомных фенолау i полщсульфщу галавай юслаты з найболыл вядомым! аднаатомным! фенолам! ¡ даследаваць некаторыя мехашзмы нейрапратэктарнага уздзеяння пры ппакЫчным пашкоджанш нервовай тканм in vitro, in vivo.

Методы даследананпя: выяуленне прадуктау переюснага аюсленне л!шдау (ПАЛ), апьфа-токаферолу i супераксщцысмутазы у тканцы мозгу лабараторных жывел i культуры нервовай тканю; ацэнка структурна-функцыянальных характарыстык культуры нервовай ткани.

Атрылшныя ebiHÍKÍ i ix нав^зна: праведзена комплекснае i 6Uxi.4Í4Hae вывучэнне упершыню Ынтазаваных антыаксщантау з шэрагу орта-замешчаных фенолау на бшлапчных мадэлях. Упершыню праведзены скрышнг у шэрагу упершыню сштазаваных вытворных двухатомных фенолау i полшысульфщу галавай юслаты BbiflBiy злучэнш з высокай антыаюсляльнай актыунасцю (AAA). На распрацаванан мадэл1 ппакЫчнага пашкоджання нервовых клетак упершыню даследаваны бЬшмжныя i структурна-функцыянальныя змены астрацытау пры ппаксп i выяулена нейрапратэктарнае уздзеянне вытворных двухатомных фенолау i полщысульф1ду галавай юслаты. Вывучана уздзеянне ппаксц на ультраструктуру арганэлау астрацытау мозгу лабараторных пацукоу. Атрыманы дадатковыя вынш аб структурна-функцыянальнам становшчы мембран астрацытау ва умовах доследнай rinaKcii. Пашырана уяуленне аб становшчы энэргетычнага абмену у астрацытах пры rinaKcii. Упершыню паказана, што вытворныя орта-замешчаных фенолау валодаюць антыппатчным уздзеяннем. Распрацаваная мадэль ппакс1чнага пашкоджання культуры астрацытау мозгу навароджаных пацукоу дазволщь вывучаць мехашзм ппашчнага пашкоджання нервовай тканю i праводзщь скрышнг прэпаратау з нейрапратэктарным уздзеяннем. Атрыманыя у рабоце вынш паказал!, што вытворныя шмататомных фенолау ¡нгтаруюць ПАЛ у мазгу пацукоу пры чэрапна-мазгавым пашкоджанш I гшакачнай Нпаксп Упершыню сштазаваныя вытворныя шмататомных фенолау належаць да малатакЫчных злучэнняу.

Галша прымяненне: б1яхь\пя, фармакалогш, нейралогЫ.

SUMMARY

MEZEN Nina Iosifovna

"Biochemical aspects of hypoxic damage of neuro tissue and its correction by polyatomic phenol derivatives "

Key words: hypoxia, brain, free lipid peroxide, antioxidants, culture of astrocytes, bi-atomic phenol derivatives, polydisulfide of gallic acid.

Object studied, the laboratory animals of brain, astrocytes of culture, synthesized biatomic phenol derivatives and polydisulfide of gallic acid.

Subject of work: comparative study of antioxidant activity of biatomic phenol derivatives and polydisulfide of gallyc acid with known monoatomic phenols and research of some mechanisms on neuroprotective effect of these substances in hypoxic damage of nerve tissue in vivo and in vitro.

Methods of research: determination of lipid peroxide products (LPP), alfa-tocopherol and superoxide dismutase in tissue of the laboratory animal brain and nerve tissue culture; an estimation of the structurall and functional characteristics of nerve tissue culture.

Results and their novelty: complex and biochemical study of first synthesized antioxidants from orto-replaced phenols on biological models has been conducted. Screening of newly synthesized byatomic phenol derivatives and polydisulfide of gallic acid has been conducted and a number of substances with high antioxidant activity (AOA) has been revealed. Biochemical and structural and functional changes of astrocytes in case of hypoxia have been investigated on the developed model of the hypoxic damage of nerve cells and the neuroprotective effect of biatomic phenol derivatives and polydisulfide of gallic acid has been investigated. The influence of hypoxia on ultrostructure of the organells of the astrocytes in newborn rat brain has been studied. Additional results of structurall and functional condition of astrocytic membranes in case of experimental hypoxia have been obtained. Understanding of the condition of energy exchange in astrocytes in hypoxia has been extended. It has been shown for the first time, that orto-replaced phenol derivatives have antihypoxic effect. The developed model of hypoxic damage of astrocyte cultures of new-born rat brain will allow to study the mechanism of hypoxic damage of nerve tissue and to carry out screening of preparations wits neuroprotective action. The results received in the work have shown that polyatomic phenol derivatives inhibit LPP in rat brain in case of brain trauma and hypoxia. Polyatomic phenol derivatives for the first time synthesized have little toxicity.

Fields of use: biochemistry, pharmacology, neurology.

Подписано в печать 2b.0Q Q8. Формат 6Сх84Л16. Объем 1 печл. Заказ тираж 100. Бесплатно.

Отпечатано в МГМИ. г. Минсх, уп. Ленинградская, 6.