Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Окислительно-восстановительное взаимодействие фотосистемы II с кислотами ароматического ряда

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Окислительно-восстановительное взаимодействие фотосистемы II с кислотами ароматического ряда"

РГВ од

1 3 I:-:» V •

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 577.3

ГУБАНОВА Ольга Николаевна

ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФОТОСИСТЕМЫ II С КИСЛОТАМИ ..........АРОМАТИЧЕСКОГО РЯДА

(03.00.04 - биохимия)

Автореферат-------------------

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

\

МОСКВА 1995

Диссертационная работа выполнена на кафедре клеточной физиологии и иммунологии биологического факультета МГУ.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор В. Д. Самуилов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

А. Ю. Семенов

доктор физико-математических наук, профессор А. Н. Тихонов

Ведущая организация: Институт биохимии им. А. Н.Баха РАН

Защита состоится 1995 года в часов

на заседании Специализированного совета Д.053.05.32 в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 2 У 1995 года.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биол. наук

Ю. Н. Лейкин

Актуальность проблемы. Фотосистема II высших растений и ци-анобактерий функционирует как НгО-пластохинон оксидоредуктаза. В этом процессе участвует ряд компонентов: H2O-»(Mn)4-*Yz-»P680-*Pheo-*QA->QB->.Qp-»Qz (bf-комплекс)

Фотосинтетическое окисление воды происходит путем последовательного накопления окислительных эквивалентов в Mn-кластере и включает четыре одноэлектронные стадии (Debus 1992). Состояния Mn-кластера обозначаются S,, где i - число окислительных эквивалентов. Состояния So и S| стабильны в темноте. Состояние S4 в мил-лисекундном временном интервале преобразуется в состояние So с сопутствующим выделением молекулярного кислорода. Состояния S2 и S3 не стабильны и релаксируют в темноте за десятки секунд до состояния St.

Несмотря на достигнутый прогресс, механизм окисления воды еще не выяснен. Один из подходов при решении этой проблемы включает использование соединений, способных ускорять дезактивацию S2- и Бд-состояний. Эта группа веществ представлена производными фенилгидразона, анилинотиофена и рядом других. Такие соединения предложено называть ADRY-агентами (Renger et al. 1973). Высказывались предположения об окислительно-восстановительном механизме действия этих соединений в ФС II. Известно, что ФС II способна окислять вещества различной химической природы, обладающие высоким окислительно-восстановительным потенциалом.

Сокращения: КВК, комплекс выделения кислорода в фотосистеме II; РЦ, реакционный центр; ФС, фотосистема; ANT2p, 2-(3-хлор-4-трифторметил)анилино-3,5-дннитротиофен; DBMIB, 2,5-дибром-3-метил-6-изопропил-п-бензохинон; DNP-INT, 2-йод-6-изопро1шл-3-метил-2',4,4'-тринитродифениловый эфир; DPIP, 2,6-дихлорфенолиндофенол; FeCy, феррицианид калия; HQNO, 2-н-гептил-4-гидроксихинолин-Ы-оксид; (Mn)i, тетраядерный Mn-кластер КВК; Р680, реакционный центр ФС II; Pheo, промежуточный акцептор электрона в ФС II, феофитин в; Од и Ов, первичный и вторичный пластохиионы ФС II; Qc и Qz, центры связывания пластохинона в bf-цитохромном комплексе; Qp, пластохинон мембранного фонда; SiMo, кремнемолибдат натрия; Yd и Yz, остатки тирозина-161 в полипеи-тндах D2 и D, ФС II.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизмов взаимодействия ФС II с кислотами ароматического ряда, представителями различных химических классов - фе-нилгидразона, бензимидазола и фенола. В качестве исследуемых веществ были отобраны следующие соединения: протонофорные разобщители - л-хлоркарбонилцианидфенилгидразон (ХКФ), одновременно являющийся сильным ЛОЛУ-агентом; 4,5,6,7-тетрахлор-2-трифторметилбензимидазол (ТТФБ) и пентахлорфенол (ПХФ), а также новое для исследований в области фотосинтеза вещество, ан-тиоксидант 2,6-дитретбутил-4-метилфенол, ионол (рис. 1).

Все эти вещества являются липофильными ароматическими кислотами, но обладают различной способностью к диссоциации протона. В задачи исследования входило:

1. Изучить действие протонофорных разобщителей и ионола на перенос электронов в хлоропластах и мембранах цианобактерий.

. 2. Изучить действие разобщителей на фотооксидазную активность хроматофоров Rhodospirillum rubrum.

3. Выяснить природу взаимодействия этих веществ с ФС II независимыми физико-химическими методами.

4. Исследовать электрохимические свойства исследуемых веществ методом циклической вольтамперометрии.

Научная новизна работы. Протонофорные разобщители ХКФ, ТТФБ и ПХФ являются эффективными ингибиторами фотосинтетического выделения Ог и сопряженного восстановления FeCy, но не

ХКФ

ХКФ ТТФБ ПХФ ио

Рис. 1. Структурные формулы исследуемых соединений

ионол

51Мо, в тилакоидных мембранах хлоропластов и цианобактерий. В присутствии разобщителей в ФС II формируется искусственная циклическая электронтранспортная система, включающая компоненты системы окисления воды в Бг- и Бз-состояниях, компоненты РЦ ФС II, пластохинон мембранного фонда и молекулу разобщителя, функционирующего как редокс-переносчик. Эта система конкурирует за восстановительные эквиваленты с акцептором электронов, в результате одновременно подавляется выделение О2 и восстановление РеСу. Антиоксидант ионол подавляет активность ФС II в тилакоидных мембранах цианобактерий и хлоропластов. В основе ингибиру-готцего эффекта лежит способность ионола конкурировать с системой окисления воды за окислительные эквиваленты, возникающие в ходе фотохимической реакции, и проявлять свойства донора электронов для ФС II. В отличие от протонофорных разобщителей ионол не способен к образованию редокс-цикла в ФС II, его ингибирующий эффект является необратимым.

Практическое значение работы. Полученные в работе результаты демонстрируют возможность функционирования ФС II в присутствии протонофорных разобщителей в циклическом режиме. Действие разобщителей при оксигенном фотосинтезе следует учитывать при интерпретации результатов исследований в области физиологии растений и биоэнергетики. Антиоксидант ионол может быть использован в качестве эффективного донора электронов для ФС II.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Всесоюзных конференциях "Преобразование световой энергии в фотосинтетических системах и их моделях" (Пущино, 1989), "Структурно-функциональная организация фотосинтетических мембран" (Пущино, 1993), на заседании кафедры клеточной физиологии и иммунологии Биологического факультета МГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на lid страницах, иллюстрирована 2S рисунками и таблицами.

В обзоре литературы изложены современные представления о структурно-функциональной организации фотосинтетической элект-ронтранспортной цепи высших растений и цианобактерий. Рассмотрены ингибиторы переноса электронов, применяемые в работе. Обсуждены последние достижения в изучении механизма фотосинтетического окисления воды.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили клетки и мембранные фрагменты цианобактерии Anacystis nidulans, хроматофоры пурпурной бактерии Rhodospirillum rubrum. Мембранные фрагменты цианобактерий и хроматофоры выделяли ранее описанными методами (Pakrasi and Sherman 1984, Isaev et al. 1970). В работе также использовали хлоропласта гороха (Jagendorf 1960), пшеницы (Рузиев с соавт. 1987) и субхлоропластные частицы, обогащенные ФС II (Климов с соавт. 1980). Удаление Мп2+ и водорастворимых полипептидов 33, 24 и 17 к Да проводили с помощью 1 М Tris-HCl (pH 8,0) и 0,5 М MgCl2 (Klimov et al. 1982).

Светозависимое выделение или поглощение Oj измеряли полярографическим методом, используя электрод, образец освещали белым светом интенсивностью 0,1 Вт/см2. Концентрация хлорофилла или бактериохлорофилла составляла 20-30 мкг/мл. Мембранные фрагменты цианобактерий инкубировали в среде, содержащей 0,5 М сахарозу, 0,3 М цитрат натрия, 50 мМ ШНгРОд (pH 7,0), 20 мМ KCl; хроматофоры - в среде, содержащей 0,25 М сахарозу и 50 мМ Tris-HCl (pH 7,6); хлоропласта - в среде, содержащей 0,4 М сахарозу, 35 мМ NaCl, 50 мМ трицин-КОН (pH 7,8). В качестве акцеп-

торов электронов использовали 2 мМ FeCy, смесь 50 мкМ SiMo и 2 мМ FeCy, 100 мкМ метилвиологен с 0,5 мМ азидом натрия. Смесь 0,5 мМ аскорбата натрия и 0,1 мМ TMPD или DPIP, а также 0,2 мМ дурохинол использовали в качестве доноров электрона. Светоза-висимое восстановление FeCy или DPIP измеряли на однолучевом спектрофотометре Uvidec-4 Jasco при 420 или 590 нм соответственно. Генерацию ДрН измеряли по фотоиндуцированным изменениям флуоресценции 9-аминоакридина. Фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции и изменения поглощения регистрировали в совместной работе с В.В.Климовым с помощью фосфороскопической установки, описанной ранее (Карапетян и Климов 1971). Кинетику затухания флуоресценции хлорофилла в хлоропластах измеряли на лазерном пикосекундном спектрометре описанным ранее методом (Васильев с соавт. 1986) в совместной работе с В.З.Пащенко. Сигналы ЭПР хлоропластов измеряли на радиоспектрометре РЭ-1307 в совместной работе с К.Н.Тимофеевым. Определение редокс-потенциалов проводили методом циклической вольтамперометрии на анализаторе GMP-673 совместно с Б.А. Киселевым (для ионола) и на электрохимической измерительной системе ЕСМ-700 совместно с Ю.Н. Козловым (для разобщителей).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение эффекта протонофорных разобщителей на реакции фотосинтеза 1.1. Действие разобщителей на фотосинтетический перенос электронов ХКФ известен как разобщитель фотосинтетического и окислительного фосфорилирования. Это соединение, снимая ДрН, ускоряет перенос электронов в энергопреобразующих мембранах. В то же время ХКФ является ADRY-агентом и способен ускорять дезактивацию S2- и Бз-состояний системы окисления воды и препятствовать

300

и 2

выделению 02 в условиях импульсного освещения (Rengeг сЬ а1. 1973, НапБзит е1 а1. 1985).

На рис. 2 показано, что ХКФ и грамицидин Б, образующий в мембране ионпроводящие каналы, стимулируют фотосинтетический перенос электронов от Н2О к РеСу, регистрируемый по выделению

о2.

Грамицидин Б более эффективен в стимуляции реакции Хилла, чем ХКФ. В отличие от грамицидина Б, ХКФ по мере увеличения концентрации вслед за стимулирующим действием вызывает подавление выделения 02. В условиях, когда образование ДрН подавлено грамицидином Б, наблюдается лишь ингибирую-щий эффект разобщителя Рис. 2. Действие ХКФ и грамицидина (рис. 3). Очевидно подав-В на фотосинтетическое выделение 02 ление ВЫделения О, вызвав хлоропластах гороха.

но функционированием ХКФ в качестве АОИУ-агента, препятствующего накоплению в КВК четырех окислительных эквивалентов, необходимых для окисления воды и сопряженного выделения 02. Однако эти процессы на донор-ной стороне ФС II не должны влиять на перенос электронов от КВК на РЦ ФС II и далее на искусственные акцепторы, поскольку АОИУ-агенты лишь сокращают время жизни Б2- и Бз-состояний, но не препятствуют донированию электронов на фотоокисленный Р680+.

Дальнейшие опыты показали, что ХКФ одинаково эффективен в подавлении выделения 02 и сопряженного фотовосстановления РеСу

I 150-з

X С Ч И

т—I I м I ||-1—I—г II III]-1—I—г I ми

0.1 1 10

ХКФ или грамицидин Б, мхМ

100

(рис. 3). Вместе с тем, ХКФ практически не влияет на нечувствительное к диурону выделение О2 с SiMo (рис. 3). Разобщители ТТФБ и ПХФ действовали сходным образом.

100

сц о и и

50 -

ХКФ, мкМ

Рис. 3. Действие ХКФ на фотовосстановление РеСу и выделение С>2 я хлоропластами, инку-¿Г бируемыми с грамицидином Б (4 мкМ). В экспериментах с РеСу и диуроном использовали 50 мМ морфолиноэтан-сульфонат. 100% скорости выделения О2 с ЕеСу и 8|Мо составляли 250-300, с РеСу при рН 4,7 - 50-60 мкмоль/ мг хлорофилла за 1 час, а восстановления РеСу 900-1100 мкмоль/ мг хлорофилла за 1 час.

Дальнейшие опыты показали, что ХКФ одинаково эффективен в подавлении выделения О2 и сопряженного фотовосстановления РеСу (рис. 3). Вместе с тем, ХКФ практически не влияет на нечувствительное к диурону выделение О2 с Б^Мо (рис. 3). Разобщители ТТФБ и ПХФ действовали сходным образом.

Пластохинон <3д окисляется РеСу при нейтрализации отрицательного поверхностного заряда тилакоидной мембраны снижением рН или добавлением катионов металлов ШоЬ 1978). Эта реакция устойчива к диурону. На рис. 3 показано, что устойчивое к диурону выделение О2 с РеСу при рН 4,7, подобно реакции Хилла с 51Мо, не чувствительно к ХКФ.

Разобщители подавляли фотосинтетический перенос электронов не только в хлоропластах, но и в мембранах цианобактерий. Изолированные тилакоиды Апасу$Из тёи1ат представляют особый иите-

юо

pec по двум причинам: (1) по результатам транспорта проникающих ионов и тушения флуоресценции 9-аминоакридина эти мембраны не способны к светозависимой генерации ДДН, поэтому они не нужда ются в дезнергизации с помощью грамицидина D; (2) перенос электронов с последовательным участием ФС II и ФС I в этих мембранах нарушен вследствие удаления пластоцианина и цитохрома C553 при выделении мембран. Это позволило исключить вклад ФС I в восстановление добавленных акцепторов электронов. На рис. 4 показано, что ХКФ подавляет выделение О2 в мембранах A. nidulans, инкубируемых с FeCy. Реакция Хилла с SiMo также, как и в хлороплас-тах, практически не подавлялась ХКФ. Сходные данные получены и

с ТТФБ.

Рис. 4. Действие ХКФ на фотосинтетический перенос электронов в мембранах А. nidulansAOOX скорости реакций H20->FeCy, Н2О-» SiMo, ДФК ->ДФИФ и NH2OH-+ FeCy составляли 300-350, 250-300,50-80 и 100150 мкмоль/мг хлорофилла за 1 час соответственно.

ю

хкф. мкм

В мембранах с инактивированным в результате тепловой обработки КВК дифенилкарбазид является искусственным донором электронов и восстанавливает тирозин Yz+ (Blubaugh , Cheniae 1990). NH2OH экстрагирует Мп, подавляет фотосинтетическое окисление воды и также служит донором электронов для ФС II (Debus 1993). Светоиндуцированный перенос электронов с участием дифенилкар-базида или NH2OH эффективно подавляется ХКФ (рис. 4). Сходные данные получены с ТТФБ.

50-

Таким образом, испытанные протонофорные соединения ХКФ, ПХФ и ТТФБ сходным образом влияют на реакцию Хилла в хло-ропластах и мембранах цианобактерий. В низких концентрациях они одинаково эффективно подавляют выделение О2 и восстановление РеСу, но практически не влияют на реакцию с 51Мо: Это свидетельствует о наличии дополнительной мишени действия разобщителей в фотосинтетической электронтранспортной цепи. Помимо донорной стороны ФС II (АГЖУ-эффект) разобщители взаимодействуют также и с компонентом цепи переноса электронов, расположенным между участками восстановления Б1Мо и РеСу.

Для выявления этой мишени мы провели ингибиторный анализ различных участков электронтранспортной цепи хлоропластов. Было обнаружено, что ингибиторы Ьб^цитохромного комплекса ОВМ1В, ОЫР-ШТ (оба соединения блокируют окисление HQNO (блокирует восстановление Ос цитохромом Ь) и разобщители

Таблица 1: Действие разобщителей и других агентов на перенос электронов в хлоропластах, инкубируемых с грамицидином Р._

Агент Концент Скорость электронного транспорта (%)

рация Выделение о2 Поглощение о2 Поглощение о2 Выделение о2

мкМ н2о ТМРОвосст Дурохинол н2о

4 1 4 4

$1Мо метил в полотен +диурон метилвиоло-ген + диурон РеСу

ОВМШ 1 96 98 5 45

ПЫР-ЮТ 10 98 100 3 40

нош 10 96 95 90 10

ХКФ 10 98 104 80 5

ТТФБ 1 89 98 97 7

ПХФ 30 92 94 101 8

Концентрации грамицидина О и диурона составляли 4 и 1 мкМ. 100% скорости электронного транспорта в каждой колонке, начиная слева: 100, 85, 75 и 115 мкмоль Оз/мг хлорофилла за 1 час.

практически не влияют на перенос электронов от НгО к SiMo с участием ФС II или от восстановленного TMPD к метилвиологену с участием ФС I (табл. 1). Окисление дурохинола с участием компонентов bgf-цитохромного комплекса и ФС I подавлялось DBMIB и DNP-INT, но не разобщителями. Перенос электронов от Н2О к FeCy на 60% тормозился DBMIB и DNP-INT (что указывает на восстановление FeCy обеими фотосистемами - II и I) и существенно подавлялся HQNO и разобщителями.

На основании полученных результатов сделан вывод, что FeCy, как акцептор электронов, взаимодействует, вероятно, с компонентом электронтранспортной цепи, расположенным между пластохинонами Qb и Qzi т е- с пластохиноном мембранного фонда Qp. Поскольку мишень действия разобщителей расположена между участками восстановления SiMo и феррицианида, a SiMo, вероятно, восстанавливается негемовым Fe2+ (Schansker, Van Rensen 1993), можно утверждать, что разобщители действуют на пластохиноны Qg или Qp.

1.2 Наносекундная флуоресценция хлорофилла в фотосистеме II хлоропластов: эффект ингибиторов переноса электронов и разобщителей

Кинетика затухания флуоресценции хлорофилла в хлоропластах высших растений содержит несколько экспоненциальных составляющих с различным временем жизни. Относительная амплитуда на-носекундной компоненты не превышает нескольких процентов. Увеличение её наблюдается при переходе РЦ ФС II в состояние с восстановленным Qa (Karukstis, Sauer 1983). Представленные в таблице 2 данные показывают, что амплитуда наносекундной флуоресценции хлорофилла при низкой интенсивности света существенно возрастает при добавлении диурона и HQNO (ингибитора реокисления Qb). Хинонные аналога DBMIB и DNP-INT, а также разобщители ХКФ, ТТФБ и ПХФ не влияют на флуоресценцию хлоропластов. Разобщители не действуют на наносекундную флуоресценцию на фоне HQNO, что свидетельствует о расположении исследуемой мишени непосредственно за пластохиноном Qß. Свет высокой интенсивности

увеличивает амплитуду наносекундной флуоресценции, подобно ди-урону (табл. 2). В этих условиях диурон, Н<2Ж), ЭВМШ, ОМР-ШТ и ПХФ не действуют, тогда как ХКФ снижает амплитуду флуоресценции. Сходный, но менее выраженный эффект вызывает ТТФБ.

Таблица 2. Действие разобщителей и других агентов на наносекунд--ную флуоресценцию хлорофилла в хлоропластах пшеницы_

Агент Концен- Амплитуда флу- Концен- Амплитуда флу-

трация оресценции при трация оресценции при

мкМ низкой интен- мкМ высокой интен-

сивности света * сивности света*

Без добавок - 3 - 97

диурон 25 100 25 100

HQNO 50 90 30 94

DBMIB 5 3 10 94

DNP-INT 5 3 10 94

ХКФ 20 3 20 52

ТТФБ 2 3 2 88

ПХФ 40 3 40 100

HQNO+ХКФ 50+20 110 - -

Диурон+ 25+200+ 25+200+

SiMo+FeCy 6000 3 6000 3

SiMo+FeCy - - 200+6000 2

Ионол 200 3 200 75

nh2oh 10000 3 10000 88

* Величины приведены в относительных единицах.

Принимая во внимание способность ADRY-агентов (ANT2p, ХКФ) при освещении хлоропластов усиливать окисление хлорофилла а (Yamashita et al. 1969) и каротиноидов (Schenk et al. 1982), можно предположить, что окисленные катион-радикалы хлорофил-лов и каротиноидов тушат флуоресценцию хлорофилла по механизму реабсорбции излучения. Однако перекрывание спектра поглощения окисленного каротиноида со спектром флуоресценции хлоро-

филла незначительно (Schenck et al. 1982, Mathis, Rutherford 1984). Очевидно, причины тушения флуоресценции хлорофилла следующие: (1) замедление скорости переноса электронов на донорной стороне ФС II в присутствии ADRY-агента (Packham, Ford 1986) и торможение, вследствие этого, накопления восстановленного QA. Однако в присутствии ингибитора HQNO этот механизм, вероятно, не реализуется (табл. 2); (2) ускорение реокисления фотовосстанов-ленного Qa в результате оттока электронов на эффективный акцептор. Справедливость этого предположения подтверждается данными таблицы 2. Добавление SiMo, эффективного окислителя QA, сопровождается тушением наносекундной флуоресценции.

Таким образом, снижение амплитуды наносекундной флуоресценции вызвано, вероятно, ускорением реокисления пластохинона Qa на акцепторной стороне ФС II. В совокупности с данными раздела 1.1 это означает, что взаимодействие ХКФ и ТТФБ с пласто-хиноном Qp приводит к ускорению реокисления пластохинона QA. 1.3. Зависимость эффективности действия разобщителей от скорости электронного транспорта

Ранее в литературе высказывалась точка зрения об индукции ADRY-агентами циклических окислительно-восстановительных превращений в ФС II (Renger et al. 1973; Packham, Barber 1984). Рассматривая разобщители как окислители хинолов, мы полагали, что они способны конкурировать с акцепторами (FeCy) и bgf-цито-хромным комплексом за восстановительные эквиваленты, образующиеся при функционировании ФС II. В результате, под действием разобщителей формируется искусственная циклическая система, а

нециклический перенос электронов подавляется:

FeCy

H20->(Mn)4->Yz-»P680->QA->QB->Q ХКФ

-ТТФБ <_

ПХФ

>-»Qz (ЬбГ-комплекс)

В этом случае, ингибирующее действие разобщителей должно зависеть от скорости переноса электронов: <32, феррицианид и разоб--щители будут конкурировать между собой за электроны, поставляемые пластохиноном <2р, а электронный поток через ХКФ, ТТФБ или ПХФ будет определяться их концентрациями. На рис. 5 показано, что величины 150 для диурона и НС^ХЮ не зависят от интенсивности света. Наоборот, величины 150 для разобщителей увеличивают-

Рис. 5. Зависимость скорости выделения СЬ в реакции Хил-ла с феррицианидом и величии 150 для диурона, НС^ЫО и разобщителей от интенсивности света в хлоропластах гороха, инкубируемых с 5 мкМ грамицидина О. 100% скорости выделения С>2 составляли 250 -300 мкмоль /мг хлорофилла за 1 час. Величины ¡50 для диурона, НОМО, ХКФ, ТТФБ и ПХФ при максимальной интенсивности света составляли 0,02, 2, 2, 0,11 и 5 мкМ соответственно.

ся с ростом скорости электронного транспорта и в целом описывают профиль световой кривой насыщения. Таким образом, эффективность разобщителей возрастает при снижении интенсивности света, лимитирующем скорость оборота ФС И. Как известно, эффективность ADRY-агентов в реакциях восстановления S2- и Бз-состояний КВК при импульсном освещении также зависит от скорости оборота ФСП (Renger et al. 1973). Это означает, что природа явлений в импульсном и стационарном режимах работы ФСН одна и та же: разобщитель (ADRY-агент) окисляется КВК и затем ревосстанавливается в реакции с пластохинолом Qp. В этом случае молекулу разобщителя можно рассматривать как редокс-катализатор, обеспечивающий быстрый

1-1-1--1-1-

0 25 50 7Ь 100- 125

Интенсивность света, отн. ед.

обмен окислительно-восстановительными эквивалентами между фр и Б-состояниями КВК. Одновременно циклическая система конкурирует за восстановительные эквиваленты с РеСу, и, в целом, процесс сопровождается как подавлением фотосинтетического выделения О2, так и восстановления акцептора. Однако это происходит только при наличии восстановленного пластохинона <3р. В присутствии 51Мо, эффективного окислителя пластохинолов, циклическая система не образуется.

1.4. Зависимость эффекта разобщителей от рН

Существенной особенностью исследуемой группы веществ является их протонофорная активность. Подавление реакции Хилла в мембранах А. пгйи1ап$ посредством ХКФ и ТТФБ зависит от рН среды. Эффект максимален в интервале рН от 5,5 до 6,0. Эти величины близки рКа для ТТФБ и ХКФ, равным 5,5 и 5,95 соответственно (Тега<1а 1981). Таким образом, подавление реакции Хилла разобщителями максимально при значениях рН, соответствующих их рКа, т.е. максимальной активности в качестве переносчиков протонов через мембраны. Это может означать, что разобщители, восстанавливая КВК в Бг* и 8з-состояниях, действуют не только как доноры электронов, но и как доноры Н+.

1.5. Разобщители как доноры электронов в ФС II

В предыдущих разделах работы показано, что выделение О2 в присутствии Б1Мо + РеСу, нечувствительное к диурону, не подавляется ХКФ в концентрации 7-10 мкМ. С увеличением концентрации разобщителя выделение О2 ингибируется (150= 20 мкМ), а скорость фотовосстановления 51Мо практически не меняется (рис. 6).

Ранее было предположено, что взаимодействие ДОИУ-агентов с окислительной стороной ФС II может приводить к образованию Н2О2 (5ауге, Нотапп 1979). Очевидно этот процесс будет маскировать истинную скорость выделения О2 при окислении воды..

Н2О2, образующаяся в интактных препаратах ФС II, выявляется по увеличению скорости выделения О2 при добавлении экзогенной ката лазы (Wydrgynsky еЬ а1. 1989). Было обнаружено, что ингиби-

FeCy (Н20 -* FeCy) FeCy (Н20 -> SiMo + FeCy) О, (H20 SiMo + FeCy)

10 100 хкф, mkm

Рис. 6. Действие ХКФ на фотовосстановление SiMo и сопряженное выделение СЬ в хлоропластах. Фотовосстановление SiMo измеряли по образованию фер-роциапида в реакции: SiMoreii+FeCyolc -> SiMoox + FeCyred Добавки: 50 мкМ SiMo+0,5 мкМ FeCy, 10 мкМ диурон, 4 мкМ грамицидин D. 100% скорости выделения СЬ и восстановления FeCy с SiMo составляли 125 и 380-420 мкМ/мг хлорофилла за 1 час соответственно.

рующий эффект ХКФ на выделение О2 с SiMo не устраняется при добавлении каталазы. Предположено, что ХКФ является донором электронов для фотовосстановлення SiMo в ФС П., происходящего без выделения О2. Сходные данные были получены в экспериментах с разобщителями ПХФ и ТТФБ, а также сильным ADRY-агентом ANT2p. Величины I50 для ПХФ, ТТФБ и ANT2p как ингибиторов выделения О2 с SiMo составляли 45, 3 и 1 мкМ соответственно. NH2OH, ингибитор фотосинтетнческого окисления воды и эффективный донор электронов для ФС II, действовал сходно. Таким образом, испытанные разобщители в низких концентрациях катализируют циклический перенос электронов, а при высоких концентрациях являются эффективными донорами электронов при нециклическом электронном транспорте в ФС II.

1.6. Влиянне разобщителей на перенос электронов в хроматофорах Rhodospirillum rubrum Согласно современным представлениям РЦ ФС II и пурпурных бактерий в значительной степени гомологичны. Хроматофоры пурпурной бактерии Rh. rubrum, инкубируемые с TMPD и аскорбатом,

поглощают Ог при освещении. Как показано ранее, фотооксидазная активность хроматофоров обусловлена взаимодействием фотовосста-новленного убихинона (^в с О2 (Яетепшкоу, БатиПоу 1979). Фото-оксндазная активность хроматофоров возрастает с увеличением концентрации ТМРЭ с 10 до 100 мкМ. Это означает, что часть РЦ Р870 остается на свету в окисленном состоянии при концентрации ТМРО 10' мкМ. На фоне 10 мкМ ТМРО добавление ХКФ, ПХФ или ТТФБ в концентрации от 50 до 100 мкМ лишь слабо стимулирует, но не ингибирует фотооксидазную активность. Таким образом, исследованные разобщители не подавляют фотооксидазную активность хроматофоров. Причина, вероятно, состоит в том, что редокс-компоненты цепи переноса электронов в хроматофорах, включая Р870+ с Ео'=+0,45 В, не способны, в отличие от Р680+, окислять молекулы разобщителей.

2. Изучение эффектов антиоксиданта ионола на реакции

фотосинтеза __

Антиоксиданты - соединения, способные взаимодействовать со свободными радикалами липидов, возникающими в мембранах при перекисном окислении. Антиоксиданты применяются для защиты тканей и клеток растений от развития в них патологических процессов. Вместе с тем, ряд антиоксидантов ингибирует фотосинтетические реакции. В разделе 1 показано, что протонофорные разобщители вступают в окислительно-восстановительное взаимодействие с ФС II. Ионол, подобно испытанным разобщителям, является липофильным ароматическим соединением, но, в отличие от разобщителей, не обладает протонофорными свойствами. Ионол - активный редокс-агент, и поэтому может вступать во взаимодействия с радикальными компонентами ФС II. Задачей данного раздела работы явилось сравнение действия ионола на реакции фотосинтеза с действием про-тонофорных разобщителей.

2.1. Ингибируюшее действие ионола на перенос электронов в

фотосистеме II высших растений и пианобактерий Ионол подавляет активность ФС II в мембранах A.nidulans и хлоропластах-гороха, измеряемую по выделению 02 при переносе электронов от Н20 на FeCy, но не оказывает влияния на активность ФС I, измеряемую по поглощению 02 при переносе электронов от восстановленного DPIP на метилйиологен (рис. 7).

Рис. 7. Действие ионола на выделение 02 мембранами А. nidu-lans и хлоропластами гороха в реакции Хилла с FeCy (1 и 2) и на поглощение 02 в реакции Мелера (3 и 4). 100% скорости выделения 02 мембранами A. nidulans и хлоропластами составляли 240 и 160, а скорости поглощения 02 165 и 150 мкмоль 02 на 1 мг хлорофилла за 1 ч соответственно.

0 50 100 150 200

Ионол, мкМ

Диурон и диносеб в концентрации до 10 мкМ, в отличие от ионола, не оказывают существенного влияния на реакцию Хилла с SiMo. Следовательно, мишенью ингибирующего действия ионола не является акцепторная сторона ФС II. Ионол и NH2OH, ингибитор КВК, эффективно подавляют выделение 02 хлоропластами в реакции Хилла с FeCy и SiMo, но практически не действуют на фотовосстановление DPIP (Табл. 3). Скорость переноса электронов от донора дифенилкарбазида на DPIP с участием ФС II не изменяется под действием этих агентов. Полученные данные позволяют заключить, что ионол, подобно NH2OH, подавляет перенос электронов на до-норной стороне ФС II и, вероятно, проявляет свойства донора электронов для ФС II.

Таблица 3. Действие ионола, ИН2ОН и диурона на светоиндуциро-ванное выделение Р2 и восстановление РР1Р в хлоропластах_

Добавки Концентрация мкМ Выделение О2 в реакции Хилла (%) Фотовосстановление ОР1Р (%)

с 51Мо с РеСу

ЫН2ОН 2000 7 5 92

ЫНгОН+диурон 2000+5 _» - 5

Иоиол 200 22 17 76

Ионол+диурон 200+5 - - 3

* Измерения не проводили.

В следующей серии опытов показано, что ионол и МНзОН лишь незначительно снижают амплитуду наносекундной флуоресценции хлорофилла в условиях насыщающей и не влияют на флуоресценцию при низкой интенсивности света (раздел 1.2, табл. 2). В совокупности с данными таблицы 3 этот результат свидетельствует об отсутствии эффекта на акцепторной стороне и способности ионола к донированию электронов на ФС II. Это предположение подтверждается данными по действию ионола и ЫН2ОН на ЭПР сигнал II. Спектр ЭПР хлоропластов, инкубируемых в темноте, содержит сигнал с g-фaктopoм 2,0045, отражающий функционирование тирозина Уц. Добавление ионола снижает амплитуду этого сигнала как в темноте, так и на свету. ЫН2ОН сходным образом, но эффективнее, уменьшает величину сигнала ЭПР. Эти данные показывают, что ионол и ЫН2ОН восстанавливают окисленный тирозин Ур+ Вероятно, ионол также способен восстанавливать фотоокисленный вторичный донор электронов в ФСН - тирозин У2+.

2.2. Окислительно-восстановительное взаимодействие ионола с фотосистемой II

Переход РЦ фотосистемы II в состояние с восстановленным Од сопровождается увеличением выхода флуоресценции хлорофилла в светсобирающей антенне, получившим название переменной флуоресценции (ДФ). Измерение ДФ широко используется при изучении функционального состояния РЦ и переноса электронов в ФС II.

-И

3-

30 с

Ф-.

ЛФ

ф.

\

л t

V

т

т

т

Рис. 8. Кинетика фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла (ДФ) у фрагментов ДТ-20 после удаления Mn: (1) в отсутствие добавок и после добавления 200 мкМ ионола (2), 0,5 мкМ МпС12 (3) и 5 мкМ диурона (4).

В результате удаления ионов Мп из субхлоропластных частиц, обогащенных ФС II, происходит существенное уменьшение АФ, а также практически полностью подавляется фотовосстановление DPIP и выделение О2, что свидетельствует об инактивации донорного участка ФС II. Последующее добавление ионов Мп2+ приводит к восстановлению донирования электронов на РЦ ФС И, проявляющемуся в реактивации АФ и фотовосстановления DPIP (Klimov efc al. 1982).

На рис. 8 показано, что добавление ионола к субхлоропластным частицам, лишенным Мп, приводит к реактивации ДФ, что свиде-

тельствует о восстановлении локирования электронов на РЦ ФСН. Сходные эффекты наблюдаются при добавлении искусственных доноров электрона для ФС И: Мп2+, аскорбата или ЫНгОН. Реактивация ДФ у фрагментов ДТ-20 в присутствии ионола означает, что ионол, подобно Мп2+, аскорбату и ЫНгОН, может служить донором электронов для ФС II. Этот вывод подтверждается также данными по уменьшению величины фотоиндуцированных ДА (связанных с фотоокислением Р680) при добавлении ионола к частицам ДТ-20 с удаленным Мп.

Наиболее убедительно донорные свойства ионола показаны в экспериментах по фотовосстановлению ОР1Р в частицах ДТ-20, лишен

Рис. 9. Фотовосстановление DPIP частицами ДТ-20 после удаления Мп: без добавок (1) и после добавления 0,5 мкМ МпС12 (2) или 200 мкМ ионола (3).

♦ ft

ных Мп. При добавлении ионола восстановление DPIP реактивируется и достигает 75% от скорости, измеряемой в присутствии Мп2+ (рис. 9). Добавление 200 мкМ ионола к частицам, содержащим Мп, практически не влияет на фотовосстановление DPIP, тогда как выделение С>2 в этих препаратах подавляется 100 мкМ ионола на 80%.

Таким образом, полученные результаты выявляют способность ионола служить, подобно испытанным разобщителям, донором электронов для ФС II. В отличие от разобщителей ионол не способен к

образованию редокс-цикла в ФС II и подвергается, вероятно, необратимому окислению.

3. Исследование электрохимических свойств иоиола и ________разобщителей

Существенное значение для понимания механизма взаимодействия исследуемых веществ с ФСН могут иметь данные об их ре-докс-свойствах. Показано, что при концентрации ионола 10 мкМ на Pt электроде в ацетонитриле наблюдается квазиобратимое окисление ионола с величиной Ео=+1,27 В. В водном растворе ацетона при рН 7,0 зарегистрировано одноэлектронное обратимое окисление ионола с Ео=+0,43 В.

Протонофорные разобщители ХКФ, ТТФБ и ПХФ также способны окисляться в водных буферных средах на электроде при потенциалах +1,09-+1,17 В. Восстановление окисленного продукта наблюдается при потенциалах +0,28-+0,43 В. Разница потенциалов окисления и восстановления составляет 0,8-0,86 В, что свидетельствует о необратимом характере процессов. Необратимость может быть связана с димеризацией на поверхности электрода радикальных форм, образующихся при одноэлектронном окислении разобщителей. Для димеризации необходимо накопление радикалов. Это условие, вероятно, не реализуется в хлоропластах, где в присутствии разобщителя формируется циклический перенос электронов и фото-окисленный /\DRY-areHT быстро восстанавливается. В отличие от разобщителей, одноэлектронное окисление ионола по стерическим причинам не сопровождается димеризацией и является обратимым. Ре-докс-потенциал наиболее сильного окислителя в ФС И, Р680+, оценивается равным +1,12 В (Климов с соавт. 1979). Таким образом, данные циклической вольтамперометрии подтверждают выдвинутые предположения о способности ХКФ, ТТФБ, ПХФ. и ионола окисляться в фотосистеме П.

ВЫВОДЫ

1. Протонофорные разобщители ХКФ, ТТФБ и ПХФ подавляют реакцию Хилла с РеСу в хлоропластах и мембранах цианобактерий. В низких концентрациях они ингибируют вьщеление О2 и сопряженное восстановление РеСу, но практически не влияют на реакцию Хилла с кремнемолибдатом и перенос электронов в ФС I от восстановленного ТМРО или дурохинола к метилвиологену.

2. Амплитуда наносекундной флуоресценции хлорофилла в хлоропластах возрастает при добавлении диурона, диносеба и Н(2КО, но не меняется в присутствии разобщителей, БВМШ или БЫР-ШТ. Свет высокой интенсивности увеличивает амплитуду наносекундной флуоресценции, подобно диурону. В этих условиях ХКФ и в меньшей степени ТТФБ снижают амплитуду флуоресценции. Сделан вывод об ускорении разобщителями реокисления пластохинонов Од и

на акцепторной стороне ФС II.

3. В результате окисления разобщителей на донорной стороне ФС II (АОИУ-эффект) и их последующего восстановления посредством пластохинона мембранного фонда в ФС II формируется искусственная циклическая электронтранспортная система, включаю- — щая разобщители как окислительно-восстановительные переносчики. Циклическая система конкурирует за восстановительные эквиваленты с РеСу и в результате происходит одновременное подавление выделения Ог и восстановления акцептора.

4. Подавление реакции Хилла разобщителями максимально при значениях рН, соответствующих их рКа. Разобщители, функционируя как АБКУ-агенты, вызывают дезактивацию 52- и Бз-состояний, действуя не только как доноры электронов, но и как доноры протонов.

5. Разобщители участвуют в нециклическом переносе электронов на Б^Мо в ФС II, конкурируя с Н2О в качестве доноров электронов для окисленного РЦ ФС II, но не для РЦ пурпурных бактерий - фо-тоокисленного Р870+.

6. Антиоксидант ионол подавляет активность ФС II, но не влияет на активность ФС I в мембранах хлоропластов и цианобактерий. Ионол реактивирует фотоиндуцированные изменения флуоресценции и восстановление DPIP в частицах ФС 11, лишенных Мп. Ионол, подобно разобщителям, является донором электронов для ФС II, но в отличие от разобщителей не способен к образованию ре-докс-цикла, а его ингибирующее действие является необратимым.

7. Исследование электрохимических свойств ХКФ, ТТФБ, ПХФ и ионола методом циклической вольтамперометрии подтверждает выдвинутые предположения о способности этих соединений окисляться в фотосистеме II.

Материалы диссертации изложены в следующих работах:

1. Барский Е.Л., Губанова О.Н., Самуилов В.Д. Ингибирующее действие 2.6-дитретбутил-4-метилфенола на перенос электронов в фотосистеме II изолированных мембран Anacystis nidulans и хлоропластов гороха. Биохимия. 1988. Т.53. С.297-301.

2. Губанова О.Н., Аллахвердиев С.И., Киселев Б.А., Климов В.В. Влияние ионола на фотоиндуцированный перенос электронов в фотосистеме II.В кн.: Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Преобразование световой энергии в фотосинтетических системах и их моделях". Пущина. 1989. С.75.

3. Губанова О.Н., Аллахвердиев С.И., Киселев Б.А., Климов В.В. Окислительно-восстановительное взаимодействие ионола с фотосистемой II. Докл. АН СССР. 1989. Т.306. С.991-995.

4. Барский E.JI., Васильев С.С., Губанова О.Н., Кравцова Т.Р., Пащенко В.З., Самуилов В.Д., Тимофеев К.Н. Наносекундная флуоресценция в фотосистеме 2 хлоропластов: эффект ингибиторов переноса электронов. Биологич. мембраны. 1989. Т.6. С.372-377.

5. Барский Е.Л., Губанова О.Н., Еланская И.В., Самуилов В.Д., Станбекова Г.Э., Шестаков C.B. Мутанты цианобактерии

Synechocystis 6803 с нарушением в переносе электронов на донорной стороне фотосистемы II. Биологии, науки. 1989. Т.7. С.29-33.

6. Samuilov V.D., Gubanova O.N., Barsky E.L: Protonophoric uncouples СССР and TTFB suppress electron transfer at a site between photosystems I and II. Poster VHlth International Congress on Photosynthesis. Stochholm. Sweden. 1989. In: Physiol. Plantarum. 1989. V.3(2). A152.

7. Губанова O.H., Барский Е.Л., Самуилов В.Д. Подавление фотосинтетического переноса электронов на участке между фотосистемами I и II переносчиками Н+ через мембраны. В кн.: Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Преобразование световой энергии в фотосинтетических системах и их моделях". Пущино. 1989. С.74-75.

8. Барский Е.Л., Губанова О.Н., Самуилов В.Д. Ингибирующий эффект протонофорных разобщителей на фотосинтетический перенос электронов в мембранах Anacystis nidulam. Вестник Московского университета. Сер. Биология. 1991. Т.16. С.23-27.

9. Барский Е.Л., Губанова ^ХН^Самуилов-В.^г^Ингабирование _____________фотосинтетического переноса электронов в хлоропластах м-хлор-

карбонилцианидфенилгидразоном. Биохимия. 1991. Т.56. С.434-438.

10. Samuilov V.D., Renger G., Paschenko V.Z., Oleskin A.V., Gusev M.V., Gubanova O.N., Vasil'ev S."S., Barsky E.L. Inhibition of photosynthetic oxygen evolution by protonophoric uncouplers. Biochim. Biophys. Acta. 1995. (in press).

11. Samuilov V.D., Barsky E.L., Gubanova O.N., Klimov V.V., Kozlov Ju. N. Photoreductiorf of silicimolybdate in chloroplasts by agents accelerating the deactivation reactions of the water-oxidizing system. FEBS Lett. 1995 (in press). /Г'

и 3s~?- a ss-s?- ^