Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антиокислительная активность производных пиримидина и бензимидазола в биохимическом механизме их антитоксического действия

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Антиокислительная активность производных пиримидина и бензимидазола в биохимическом механизме их антитоксического действия"

?ГБ ОД

г 3 МАЙ 1354

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЗДЕРЩМ БАНКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

ГГа правах рукописи

ХАПБУЛЛИНА Зулъфш Гатиятовна

УДК 577Л :547.853.3; 5ЛТ.ТВ5.55615.373.3

АНТИОНИСЛИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОИЗВОДНЫХ ПИРИМИДИНА И БЕНЗИОДДАЗОЛА В БИОХИМИЧЕСКОМ МЕХАШЗЖ Ж АНТИТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ 03.СЮ.О-4. - Биолотчаская южия 14.00.26. - Фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соксктшо ученой степени кандидата, биологических наук

Уфа - 19Э4

работа выполнена в Башкирском государственном ■ медицинском институте

Научные руководители - доктор медицинских наук,

профессор Э.Г.Давлетов; ! кандидат медицинских наук, доцент В.А.Мшикин Офидаелыше оппононты - академик АНРБ,

доктор биологических наук, профессор В.А.Байтов; !

доктор медицинских наук, : ;!

- ¡'

профессор Х.М.Насыров !

Ведущая организация - Российский государственный •

медицинский университет ¡';

Заэдта диссертации состоится "Л^" ШШС^ 1994 г. ■ в {О, часов на заседании специализированного Совета < , К (384.35.02 при Башкирском государственном медщданск<и| институте по адресу: 450000, г.Уфа, ул.Лешша, 3. ;

О диссертацией моиио ознакомиться в библиотеке института. ! Автореферат разослан г.

Ученый секретарь специализированного совета, I

доктор медицинских наук, профессор Э.Г.Давлетов

-3-

ОБЩЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Возрастающее количество новых химических соединений, потенциально опасных для человека, сформировало ситуацию, которая по праву определена как токсическая (Голиков С.Н.,1930, Оксенгендлер Г.И.,1991). Ухудшение экологической ситуации в глобальном масштабе привело к появлению нового понятия "экотоксикология" (Голиков С.Н.,1990, Барышников И.И.,Лойт А.О..Савчеюсо М.Ф.,1991).

В этой связи многочислешше аспекты химической опасности поставили перед наукой новые проблемы. Важнейшая из гак -изучение биохимических механизмов токсичности и антитоксического действия соединений, разработка эффективных средств профилактики и лече!шя интоксикаций. В работах Л.А.Тиу-нова (1986, 1990) биохимические механизмы токсичности рассматриваются как совокупность двух взаимосвязанных и взаимообусловленных процессов - молекулярных механизмов повреждения и компенсации. Особенно интенсивно в последнее время исследуются молекулярные механизмы компенсации,направленные на поддержание гомоостаза, т.к. они открывают новые пути для разработки лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения отравлений (Голиков С.Н. и соавт.,1985, Тиунов Л.А.,1976-1992).

Методологической основой данного направления исследования является концепция "общих механизмов токсического действия", разработанная С.Н.Голиковым, И.В.Саноцккм и Л.А.Тиуновнм (I98G). К общим механизмам токс:гшости авторы концепции относят, п частности, активацию процессов перекисного окисления липидоп. Внимание биохимиков, токсикологов и фармакологов з последние годы привлекают препараты антиоксидантов в ряду производных пиримидина и бензимидазола - ингибиторов свсбоднорадккального окисления (Камилов Ф.Х., Лазарева Д.Н. ОяоюИ B.B. ,1902, Дзвлотов Э.Г. ,IMcj, Гйвпши В.А. ,1976-1993). В частности, получен1.! этрримонталышо донные о поропчк-ткглюсти 1П'5"1йнвпия nnp;;.'.v.';.;;io!:yx прочгводпнх при отраглптал.х Т'-,тряглор.'-.,такг'М и тксторгт «{oKjwpnpr'.im' rrawa соеян!г>п;!~:"л (Силаева (I.A. К coarv:1., 1992, И'И'скн н соавт. . 199" i.

Цал ь ю исследования явилось изучение антиокислительной активности производных гафимидина и бензимидазола и ее роли в биохимическом механизма антитоксического действия при острых отравлениях карбофосом и тетрахлорыетаном.

В соответствии с поставленной целью были определены сладувдш задачи:

1 - исследовать антирадикальные и антиокислителыше свойства производных гафимидина и бензимидазола в модельных системах различной слозщости in vitro;

2 - изучить активность процессов ПОЛ в мозге, сердце, печени и эритроцитах у животных при отравлешш карбофосом;

3 - оценить антитоксическую эффективность гафимидиноБых и бенз-шдазолышх производных в постинтоксикащюнном периоде острого отравлетщ карбофосом и те грахлорлэ таном;

4 - исследовать вероятные биохимические механизмы влияния производашх пиримидина и Сензимздазола на эффективность атропина и дашироксима;

Б - провести факторный анализ в системе взаимосвязей биохимических показателей крови для выяснения особенностей механизма действия ксенобиотиков.

Научная новизна работы состоит в том, что: - выявлещ новые стороны биохимического механизма антн-.окислительного действия пириыидановых производных: б-метил-урацшт, Б-окси-б-метлурацила и его литиевой соли, 4-метил-изовдтозшт, 5-окси-4-мвтшшзоцитозина. Выявлена зависимость их аитиокислительной активности от некоторых физико-химических свойств. Установлены противоположные про- и антиоксидантные эффекты некоторых производных пиримидина (6-метилурацила) в зависимости от условий окисления в мод елышх системах спонтанного, вскорбат- и НАДфН-зависимого ПОЛ;

установлено отсутствие корреляции между реакционной способностью пиримидинов в двухфазной системе этилбонзол-уксусная кислота (константа К?) и антиокислительной активностью в более сложной системе природного происхождения (гомогенат печени);

впервые показано влияние ядов и производных пиримидина на электрофоретическую подвижность эритроцитов;

выявлшш новые водорастворигшэ аитиоксиданты - производим пиримидина (&-гидроси-3,6-диметилурацил, Б-гидрокси-1,3, б-трямэ-тилурацил, литиевая соль оксиметацяла ) и бензимвдазола. Вскрыты некоторые биохимические механизмы повышения данными ■ соединениями эффективности холинолитика атропина.

Научно-практическая значимость исследования заключается в тем, что:

- предложена удобная и адекватная биохимическая схема оцошп; анткокислптельной активности химических вецэств в кодолыкх системах 1п г Иго инициировашого окисления этилбензола, спси-тэнного, НАДФН-зависимого и аскорбатиндуцированного перекисного окисления липидов;

- теоретически и экспериментально обоснована возможность сочетанного применения производных пиримидина (Б-гидрокса-3,6-димэтилураиил, 5-гидрокси-1,3,6-триметилурацил) и бензимидазола (2-(3,4-дигидроксифенацилтио)бвнзиК!1дазол) с антирадикольяой активностью и М-холииолитика атрошша для коррекции процэсЬов ПОЛ в постинтоксикационном периоде отравления карбофосом.

Апробация работы. Основные материалы диссертации долоазпа и обсукдены на 57-ой, 59-ой научных конференциях молодых ученых БШИ (Уфа, 1992, 1394) и на заседании Уфимского отделзпия Всероссийского биохимического общества (Уфа, 1994).

Публикации. По (материалам настоящего исследования опубликовано 6 печатных ' работ, оформлено 2 заявки на изобретение. '

Объем и структура дассертации. Работа изложена на

_ страшщах, содержит 6 рисунков, 9 таблиц. Состоит пз

введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, приложения и списка цитируемой

литературы, содержащего _ отечественных и _ иностранны::

источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 820 половозрелых беспородных лабораторных крысах-самцах массой 150-200 г. Экспериментальной моделью токсического действия химических веществ служило острое отравление крыс тетрахлорметаном (СС1^) и карбофосом. СС14 вводили' в келудок крыс в дозе 400 мг/кг в виде 25% масляного раствора из расчета 0,16 мл на 100 г массы животного (Губский Ю.И. и соавт.,1990). Биохимические и гематологичскиэ исследования проводили через 2 часа после отравления.

Действие карбофоса изучали на 14-е сутки после пероралыюго введения карбофоса в дозе ДЦзд и на 30-е сутки после отравления карбофосом в дозе 0,7

Антиоксадантн' при остром отравлении тетрахлорметаном вводила ваутрдбршмнно за 20 минут до СС14 в дозе 50 мг/кг. При отравлении карбофосом исследуемыэ соединения вводили на 2, 6, 14, 21-е сутки (в периода максимального накопления продуктов ПОЛ) в дозах:понол - 120 мг/кг, литиевую соль оксимэтацила -25 мг/кг, оксиметацил - 2Ь мг/кг.

Глвотшх забивали дикапитацией и определяли в тканях содержание диеновых конывгатов (ДК) спсктрофотокетрпчески (May Y.E.,Rsed D.J.,19?3, Tappel A.L.,1973), уровень малононэго даальдэгидо (ЭДА) - по реакции с тнооарСитуровой кислотой (Стальная И.Д.,Гэршвили Т.Г. ,1977), активность каталазн -титрованием перекиси водорода раствором перманганата калия в кислой среде (Бах А.Н., Еубкова С.3.,1963). Определение содэрзапня конов к+, С1~ проводили на биологическом кикро-аналазаторе 0Р-266. Гемоглойш, количество эритроцитов определяли общепринятыми методами. Ретикулоакты рассчитывали на 1000 эритроцитов в мазках крови, окрашенных эозином.

В качзстзо одного из чувствительных показателей структурно -функциональных изменений вритроцитарннх мембран исследовали аяоктрсфэретичзскую подвижность эритроцитов (ЭШЭ). Ее изкоряли на автоматическом приборе- "Пармзквзнт-2" в среде Гвнгеро яри 25°С. По данным 100 клеток рассчитывали параметры Э1ПЭ: среднюю ЭСПЭ ((Дх), стандартное otiuiohoihju (Sfl), коэффициенты остаиетрии

(Аа) и эксцесса (Ех), строили гистограмму распределения эритроцитов по ЭФП.

В качестве ингибиторов свободнорадикалыюго окисления исследовали 2 ряда соединений! производила беизишдазола, предоставленные кандидатами фармацевтических наук Катаевым В.А. и Диановым В.М.(БШЙ), И производные пиримидина, синтезированные сотрудником института химии БНЦ РАН Кривоноговым В.П.

Методом хемилюминесценции в модельной система щшциирован-ного окисления этилбензола били определены константа К^, харак-теризукдие антсфадикалыше свойства соединений (Шляшштох В.Я. ц соавт. ,1963). Аитиокислителыше свойства соединений исследовали в модельных системах индуцированного и неиндуцировашгога 1ЮЛ (Челнакова И.С. и соавт., 1989, Бакалова Р. и соавт.,1987). В пробы, содеряащие I мг/мл белка , вносили изучаете соедщдашя в конечной концентрашш Ю""4 М. Определение МДА проводил! через каждый час в течение 4 часов инкубации.

Полученные результаты обработаны статистически с использованием одаофанторного дисперсношюго анализа (Р-крцтерий Фишера) и факторного анализа по способу главных компонент на ЭЕ!1 "Искра-1256", СМ-1420. При малочисленных выборках применяли Т-критериЯ Стьидента , различия считали достовернытя) при уроЕне значимости не более 5% (Р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Исследоваш!е ант1фадикальной активности и

антиокислнтелышх свойств производных пиримидина ji бензимидазола в модельных системах In vitro

Задачей первого раздела работы явилась сравнительная оценка антиокислительной активности исследуемых соединений в моделышх системах окислительных реакций in vitro.

В системе инициированного окисления этилбензола нами была исследована реакционная способность 20 производных бензимидазо-ла (ПБ), включая сам бензимидазол, его простейшие аналоги, тио-дигидроксифенацилтио- производные и две лекарственные $optsu:

ТаОлица I

Антираирсальная активность (рощташ константы К7) производи« бвнзшадазола н пиримидина

Соединив К^,л/моль.с

I. воиол 2,30x1О4

ПроизЕодаща бшшимндваола

2. оацзимидавол а

а. Свивкаидааолтиац-З 9,93х103

4. 2-ыая:лтиобеизимидазол 1,97х102

6. 2-пропокси-1- (тиетшшл-3) Оензимидазол 4,05x10"

б. I-(тиотанил-З)-г-меркаптобонзшадвзол 2,аахш3

7, 2- (3,4-игкдроксн4виацш1Тио)б0Изю,адазол 1.БШ04

8. 2-(3,4-д?!гидроксифэнацилгао)-1-!.:атлл- 6,40х103

Озрзимидааол

3.' 3- (3,4-Д1Ш1дрот:фзгои) тиазоло-13,2-0- ] - 4,оадо2

Ознаяшдазол

10. вэлггил 1.03Х103

II. ДИБАЗОЛ ЬрЬУХЮ2

Производные пиримэдииа

12. 6-штклурацил (матилураидп) -3,00x10

13. Б-скси-б-цвгаяурацил (оксшлотавдл) . 2.60ХЮ4

14. Б-оиси-б-ыетилурацил-Ы 2,90ХЮ3

(литиевая соль оксиметацвда)

16. Б-гидроксп-З,б-диыэтилуращ1л 1,07X1О4

16. й-гидрокса-1,3,6-триметадурацил 6.78Х104

IV. 4-ЬЮТ|ШЗОЦИТОЗНН 0

18. 5-окси-4-метилиаоцитозин . 8.60Х104

бедатил н дибазол. Высокие значения константы К^, характеризующей антирадикальную активность (АРА) соединений, выявлены для тио- и дигидроксифанацилтио- производных банэимидазола (тазд.1). Сам банзимидазол антирадикальной активностью не обладает. Реакционная способность ПБ увеличивается с появлением боковых радикалов. Наибольшее среда ПБ значение константы К,-,, сопоставимое с ¡С, ионола, характерно для сое дине-

ния 2-(3,4~дигидроксифонаилтио)бензимидазол.

Присутствие в структуре бензимидазолов гидроксильных групп, соединенных с ароматическим кольцом, приближает их по строению и свойствам к фзвольным антиоксидантам, реакционная способность которых обусловлена относительно легким отрывом атома водорода от гидроксильной группы.

Исследование реакционной способности производных пиримиди-па (ПП) подтвердило зависимость их АРА от присутствия п 5-ом полодатш гидроксильной группи (Мышкин В.А. и соавт.,1992). Гидроксилыше производные пиримидина обладают высокими значениями К7, сопоставимыми с К? ионола, тогда как 6-мэтилурацил и ¿-метилизоцитозш» онтирадакалышми свойствами не обладают (табл.1). Среди аналогов оксиметацила особый интерес представляют водорастворимые формы: 5-гидроКси-1,3,6- . тргелетилуроцил и литиевая соль оксиметацила.

Известно,что урацил* и его производные является эффективными ингибиторами ссободиорадикального окисления в простых химических системах (Амирагова М.И, 1978, Мяпсип В.А.,1992, Меньшикова К.В., Зешгов Н.К.,1993). Однако, вопрос о характере и механизме их действия в более сложных бпохиютесгспх системах остается открытым. В качестве такой системы нами бил взят гомогенат печени, и в моделях спонтанного, НАДФН-завискмо-го и аскорбатиндуцированного перекисного окисления ляпидов изучены антиоксидаптто эффекты произвэдамх тгрймидина,

Система спонтанного окисления лятдов характеризует базэльные процессы окисления, протекавшие в гомогенате пэчояи без активации ферментативной ила изферментгтгоиай систеки. В модельной системе спонтзшюго ПОЛ пошл Полностью ¡игибггрует накопление МДА (табл.2). Из ПП наибольшей ингибирующей активностью обладают гидроксипроизводные, имеющие высокие значения констант« К?. Антиокислительная активность (АОА) 6-1гатплурацила и 4-кетилизоцитозина была незначительна.

Модельная система ИАДФН-завясйэдго ПОЛ предполагает активацию ферментативного окисления внесением в пробы субстрата окисления. В данной системе АОА активность пиримидине» более выражена, чем в модельной системе спонтанного ПОЛ. Практически одинаково с ионоло^ ингибируют накопление ЦДА литиевая соль оксиметацила, 4-метилизоцитозин, 5-окси-4-метилизоцитозин.

Таблица 2.

Показатели антиокислительной (АОА), антирадикальной активности (К?) и коэффициент распределения (Р) ниримидинов в системе октанол-вода

Соодашештв АОА, % к7 Р

спонтанное ПОЛ ферментативное ПОЛ неферментативное ПОЛ

I. понол 100 65 100 2,ЗХЮ4 7,20

2. б-мотилурацил 25 43 - -3,0x10 0,26

3. оксиыетацил 66 46 8 2,6хЮ4 0,18

■1. оксиметацнл-Ы 52 61 95 2,9x103 1,27

5. 4-квт5ш130цит03'.ш 21 58 19 0 18,76

6. 5-оксп-4-метш1- 55 70 39 8,6хЮ4 1,94

изоцитозгаг

Отсутствует четкое соответствие антиокислительных свойств пири-мидшювых соединений их антирадикальной активности. Но обнаруживается взаимосвязь между антиокислительной активность» и характером распределения вещества в полярной и неполярной фазах, оцениваемым по коэффициенту распределения в системе октанол-вода (Р). Высокая антиокислительная активность в системе ферментативного ИОЛ характерна для липофильных соединений, ныещпх коэффициент распределения Р больше единицы (табл. 2).

6-метилурацил и 4-метилизоцитозин не обладают АРА, но ингибируют ферментативное ПОЛ, что подтверждает дашше литературы о возможном их'влиянии через,регуляцию процессов окисления (Шишкина Jl.il. и соавт.,1992, Плотникова М.Б. и соавт.,1992).

Иыгибмрование ферментативного окисления в организме имеет большое значение, т.к. ферментативная микросомальная НАДФН-зависимая система может выполнять роль индуктора нзферментатявного ПОЛ, пр:; котором наблюдается значительно большее образование продуктов липопероксидации (Ланкин №3.,1981, Артемьева Г.Б. и сонет..1992).

В модельной системе аскорбатзависшлого (нефермеНтативного) ПОЛ наш выявлен» следующие особенности эффектов ПП: выраженное прооксидантнов действие 6-мэтилурацила, незначительная АОА большинства пнр:ггаданов и высокий ингибирую-щий эффект литиевой соли оксиметацила (табл.2).

Литиевая соль оксиметацила обладает АОА во всех рассматриваемых модельных системах. По способности ингибировать нёферментативнов перекисное окисление лилидов она сопоставима с ЛИПИД1ШМ антиоксвдзнтом ионолом.

Таким образом, исследование свойств ПП в модельных системах In vitro индуцированного и неиндуцированного окисления липидов выявило зависимость антиокислительной активности соединений не только от их реакционной способности, но и от условий окисления, характера распределения соединения в лигшдной и водной фазах, а также возможность ингибирущего влияния через регуляцию процессов окисления.

В результате- проведенных исследований в модельных системах In vitro из ряда производных пиримидина и бензкмидазо-ла для дальнейших исследования In vivo в качестве корректоров нарушений окислительного метаболизма нам» были выбраны следующие наиболее активные соединега1я:

2-(3,4-Д1!гидраксифснадатно)бензш,!идазол (соединение 7, табл.1) 5-гидрокси-3,6-димвтиилурацил (соединение 15,- табл.1), 5-гидрокси-1,3, fi-тршетилурацил (соединение 16, табл Л), литиевая соль оксиметацила (соединение 14, табл.1).

II. Изменения окислительных процессов в органах и тканях животных при отравлении карбофосом и их коррекции производными бензимидазола и пиримидина

Полученные в модельных экспериментах In vitro данные об антирадщсалыюй и антиокислитэльной активности производных пиримидина и бензта/мдазола явились основанием дли исследования способности указанных соединений предупреждать In vivo разшггн.з токсического синдрома пероксидации, характерного для отравл-зг:;;.-лрооксидашчшми ядами, и повышать эффективность спвцитгпос::;;'. антидотной терапии.

На модели отравления крыс карбофосом в дозе ЛД50 исследовали антитоксическую эффективность производных бензимидазола (соединение 7, табл.1) и пиримидина (соединения 15, 16, табл.1) в комбинации со специфическими антидотами.

Антидоты: атропин (5 ыг/кг) и дшшроксиы (25 мг/кг) вводили внутркОрюшинно'сразу после карбофоса, через 2 и 8 часов. Но 2, 3, 4-е сутки вводили исследуемые соединения: ионол (120 мг/кг), производное Сензимвдазола (25 мг/кг, 12,5 мг/кг), производные пиримидина - соединение 15 (БО мг/кг, 25 мг/кг) и соединение 16 (50 мг/кг, 25 мг/кг, 12,6 мг/кг). На 14-е сутки ¡эксперимента определяли 'содержание диеновых конъвгатов (ДК) в полушариях головного мозга и миокарда крыс.

Наш! оонаруконо, что карбофос вызывает достоверное увеличение содеркаетя ДК в полушариях головного мозга и миокарде крыс (табл.3). Антидотная терапая снижает уровень ДК незначительно. Со^ашшоо применение антидотов и колола нормализует содержание Д!£ в козге, в сердца содержание первичного продукта ПОЛ остается поршдашгым. Производное бзизшиздазола (соединение 7) в кшбшю-• дац с антидот нормализует уровень ДК в головном мозге и сордцо (тсбл.З). Аналоги окизыэтацило! Б-гидрокси-З.б-димети-урацал (соединенна 15) к ь-гядрокси-I ,Э,б-тримотилурацил (соединение 16), совкэство с атрашшзм и дапзроксиаоа нормализуют уровень ДК в мозге и pisHbumxif его содаршше в миокарде, как и колол в комбинация с антидота®, но при мэвьса дозах.

Цроводашш исследования подтверждает важность оценки в патогенезе токсических поражают как специфических, так и неспе-щйнчосша мэхадшвков повракдепия мамзрашшх структур и необхо-дщость проводапип комплексной терапии. В работах ряда ис-слодазотелва показано, что специфическая антидоткая терапия эффективна ваш в начальных стадиях интоксикац»;, в некоторых случаи оно малоэффективна, И отмечен витмтоксичэасий аффект антиоксидаитов в отсутствие, антидотов (Бадагин И.С. ,1863, 1374, Кулагин В.К.,1976, Треде Ф.Я.,1933, Зацепин Э.П..19У0).

На Модели отравления крае карбофосом в дозе 0,7Д^0 наш было исследовано внтитойсачвскоа дъйотево нонола, окешетацила и его литиевой соли В бадвр Низдаив сраки отравлежя по истечении токсикогенноА фазы без примзныая специфических антидотов.

ТаОлнвд 3.

Содержание ДК в органах крыс, отравленных. карбофосом

Группы яивотшк

Сддерас'Дв /ПС,ад.опт.плотя.на I ;гг лтпилоп

голосшД мозг

гдскард

1. Контроль (штактные животные)

2. Карбофос (Д%0)

3. Карбофос + лечение

антидотам»

4. Карбофос +

антидоты и ионол

5. КРБФ + антидота и

соединение 7 (25 мг/кг)

6. КРБФ + антидоты и

соединение 7

(12,5 мг/кг)

7. КРБФ + антидота и

соединение 15 (50 кг/кг)

8. КРБ5 + антидоты л

соединенна 15 (25 ;<г/кг)

9. КРБФ + антидоты и

соединение 16 (50 мг/кг)

Ю.НРЕФ + пнтндоты л

соединение 16 (25 >,<х/кг)

11.КРБФ + антидоты и

соединение 16 (12,5 м/кг)

0,18 ± 0,01

0,59 ± 0,03 0,40 ± 0,06*

0,22 ± 0,04

0.17 ± 0,ф

0.17 * 0,02

0,17 ± 0,02

*

0,29 ± 0,02 0,19 ± 0,04 0,16 ± 0,03 0,17 ± 0,01

0,37 ± 0,012.

1,41 ± 0,10 0,80 ± 0,04*

*

0,51 ± 0,003 0,33 ± 0,01

0,37 ± 0,04

0,45 ± 0,05*

А

0,63 ± 0,09

*

0,65 ± 0,11

А

0,85 ± 0,14

*

0,45 1 0,07

Примечание: * - достоверность различий с контролем при уравпз вероятности Р$0,05

О постинтоксикацксшюм периоде на 30-е сутки посла острого отравления крыс карбофосом в дозе О^ДД^ были сбнарумии изменения биохимических показателей кропи и печени, Со,ггерг.-;п:э

МДА в мембранной фракции эритроцитов превысило контрольное значащ® на 29,63Ь,и на 69,1% уменьшилась активность каталазц крови (табл.4).

В условиях опытов наблюдалось'снижение электрофоретической подвижности эритроцитов: уменьшалось значение средней Эйй, суммарная гистограмма распределения вритроцитов отравленных крыс сио да на влево, в область низких значений ЭФП по отношению к гис-тограима контроля (рис.1,А), что свидетельствует о снижении заряда всей популяции эритроцитов.

Следует отмэтить, что в физиологических. условиях поверхностный заряд вритроцитов является стабильным показателем. Его гашише связывают с конформациошшми изменениями в юыбрале, приводящими к погружению в мембрану сиаловых кислот (Sato С..197Т).

В печени отравленных кшходшх значительно увеличился уровень ИДА, его значение составило 2,68*0,03 нмаль/мг белка против 0,97+0,07 нноль/мг балка в контроле (ркс. 2).' Возросла скорость его накопления; максимЕльные значения содержания УДА . достигаются к концу первого часе юзхубацзш, тогда как в контроле - посла 4-х часов идаубацж!, что отражает снижение аддажцслителыюЯ активности лнгодов пачега отравленных крыс.

Лечение крыс ионолом, окснштащиюм и его литиевой солью нормализует биотические показателя (табл. 4): снизилось содержанка (Щ. в тонях эритроцитов, повысилась активность каталазц, т.е. ингкбирстанио антиоксидантами перекисного окисления предотвратило истощение ферментативной антиокислительной системы. В оритрацитах увеличилось содерхашга гемоглобина. Использование пнримидицов привело к повшвниа поверхностного заряда эритроцит аршх мембран: увеличились значения- средних ЭФПЭ, гистогри.аи распределения соответствуют Гистограмме интактних мкктшх (рис. I,ВГ), В случае применения ионола восстановление Э*ПЭ прокзоало аа счет увеличения доли эритроцитов со средшш зарядом, тогда как гистограмма распределения эритроцитов но &1Я а болькей степени соответствует гистограмме отравленных крыс (рас. I,Е).

Виохинические и геиатологичесиие показатели крови крас в постинтоксипационнои периода отравления карбофосом и лечения антиоксадэнтаыи (ионол. оксиавтацил-Li, оксиметацил)

эксперим. группы показатели 1.контроль 2.карбофос 3.карбофос+ ионол 4.карбофас+ 0H-Li 5,карбофос+ OH

гемоглобин (Нв), г/л эритроциты (Эр), 10 показатель каталази(ПК).усл.ед Ш. наоль/иг белка средняя ЭФПЭ (Их). 10 u/v.с 151,00+3,15 • 4,1?±0.1Э 0,69+0.0? 0.26t0.U 1,147+0,013 144.40+2.08 4.30+0.24 0,21+0.03* 0,33±0.03 1,080+0.016 148,60+2,65. 4.94i0.3~ 0.52+0.06" 0.25+0,07 1,102+0.006 156.00+3, s!' 4,39+0,18. 0.55+0,0$ o.os+o.of 1.194+0,005 148.40+2.65 3.58i0,15»* 0,30+0,12*" 0.31i0,06 i, 155+0,CO?

примечание: достоверность различий при Р^0,05 * - с контролем; ** - с карбофосом Таблица 5. Биохимические и гематологические показатели крови крыс при действии тетрахлорнетана-и антиоксидантов (ионода, оксииетацила-И, оксиметацила)

зкспериа, группа показатели 1 .контроль 2. СС1 З.СС1 +ионол 4.CC1+DM-Li 5.CC1+0M

геиоглобкн (Нв), г/л эритроциты (Эр), 10 /л ретикулоциты (Рт).на 1000 зр. показатель каталазы(1Ю,усл.ед МДЙ, ныоль/иг белка На плазмы, ыыодь/л К плазма, ымоль/л средняя ЭФПЭ (Нх>. 10 м/у.с 130.77+3,61 3.87+0.42 27,50±0.Э9 0.50±0.03 0,36+0.04 131,62+3,63 5,82±0,21 1,112+0,013 116.20i6.4f 4.36^0.24 28.10±1.2Э 0,78i0.li 1.07i0,li 120.80±1,33* 5.70+0.31 l,100i'0,010 141,40+5,3*3* 4.73±0.3Э 28,20±3.44 0,51±0,1 ff 0.43i0,0"f 115,90i2.3i 3.83i0.2f 1, 158±0,004* ЧЙГ 144,20+3,11 3.25+0,2? 29,30i2.59 0.33+0,0*4* о.го+о.оТ 136,60t3,96 S,33i0,2^ 1.136i0,00*9 161 л'+з.г'з 3,53+0,22 22.78il.56 0.38+0,0*4 0,24+0,04 133.11+4.7*? 4.50+0, l4/ 1.132+0. OOf

прииечаиие; достоверность различий при Р^0,05 * - с контролен; ** - с

Э'ДВ

ЭИ1Э

Ряс Л Гистограммы распределения эритроцитов по ЭФП (КГ^/у.с) при отравлении карбофосом и лочотт антиоксидантами Обозначения: —г— интактше крысы,

—о— краен, отравлешше карбофосом,

яочешю монолом, —лечение оксиметацилом-Ы, --0- лечение оксиметацилом

Рис. 2 Содврэаиие ИДА (нмоль/мг белка) в печени крыс: пнтакт-' ннх (А), отравленных карбофосом (Б), лечешшх литиевой солью оксиметацила (В) в системах —«— спонташюго, —0— НАДШ-зависимого, —А— аскорбатзависимого ПОЛ.

В печени лечение антиоксидаитами снизило нсходныА уровень ИДА (до 0,62±0,03 нмоль/мг белка), восстановило динамику его накопления (рис. 2). Лечение литивой солью оксиметацила привело к суцествшгаму ¡шгнб!грованию накопления ИДА при неферментативном окислешш липидов, что и было характерно для данного соединения в модельных системах In vitro.

III. Биохимические изменения в крови крыс при отравлении тетрахлорметаном и их коррекция пиримэдяновими производными

Тетрахлорметан является одним из классических агентов, активирующих перекисное окисление в мембранных структурах. Представляло штерос изучение ого влияния на эритроцитарные мембраны ¡1 возможности защиты мембранных струфр от поврездаицего действия ССЬ выявленными активными ингибиторами

ЭФПЭ

Рис.3 Гистограммы распределения эритроцитов по ЭФП (10~внР/г.с) при отравлении тетрахлорметаном и предварительном введении антиоксидантов

Обозначения: —интактные крцси,

—©— крысы, отравленный тетрахломаном, -¿г- отравление на фона ионола, -х- оксиметацила-Ы,

-в- оксиметацила

-19-

свободнорадикального о!шслош1Я.

Нами обнаружено, что остров отравление тетрахлометшго« вызывает значительное (более, чем в три раза) повышети содержания МДА в мембранной фракции эритроцитов и отчетливую ак тивацзш каталазы (на 36$) (табл. 5). Как показали розультвт факторного анализа, с увеличением уровня МДЛ взаимосвязан снижение содержания гемоглобина« активация эритропоэза, повышение активности каталазы сопряжено с уменьшением выхода плазму ионов калия.

В условиях эксперимента отмечено снижение заряда эрктроц*. тарных мембран: уменьшилось значение средней ЭФПЗ (тобл, 5), сут,марше гистограммы распределения эритроцитов смещены в область низких значений ЭФП практически без изменения форг.я кривой распределения (рпс. 3,А). Проведенный факторный анализ взаимосвязывает снижение ЭФПЭ с увэличешим в мембранах МДА (опосредова!го через дисперсия и коэффициент асккметрю), уменьшением ионов натрия в плэз?/,е и количества эритроцитов в крова.

Предварительное введение ионола, литиевой со ли опскмотащма и окскметацяла предупреждает активации перекиспого окислгняя: значе1ШЯ содержания ЦДЛ и активности каталазы соответствуют значениям контроля. Введение анткоксидантоа привело к поютештл содержания гемоглобина, нормализация содержания ионов натрия а плазме (за исключением понола), повыиетм средней 3-ЖЭ (тсбл. 5) и нормализация суммарных гистограмм распределения эритроцитов (рис. З.БВГ).

Таким образок, проведенные нами исследования показывают, что рассматривание производные_ пиримидина и бензимидазола обладают антирадикальной и антиокислительной активность» в модельных системах In vitro, сникают уровень продуктов ПОЛ в мозге, миокарде, эритроцитах и печени отравлэтшх кгаотшх. Выявленные антиокси/.ант;' способны регулировать перокненоо окисление и предотвращать структурко-ф.у:'дгональтш кзгдаячгаи иэмброванх систем клетки про впгохсгкгияа порбофооом и тетра-хлорметалом.

ВЫВОДЫ

1. В модельных системах In vitro инициированного окислешя этилбензола, спонтанного, аскорбатзависимого и НАДФ-индуциро-ванного перекисного окисления липидов не наблюдается отчетливого параллелизма между антирадикальной активностью изученных соединенна и их способностью угнетать ферментативное и неферментативноа звенья лгоюперонсидации, что свидетельствует о необходимости комплексного исследования внтиокислителышх свойств веществ с использованием различных модельных систем,

2. В ряду производных бензимвдазола активными ингибиторами свободнорадокального окислешя являются тио- и дигидроксифен-ацилтио- производные. Наибольшей антирадикальной активностью, составляющей 663 вффокта ионола, обладает 2-(3,4-дигидроКсифэн-ацилтио)бензкмидаоол.

Среди пиримадиновых производных высокой антирадикальной активностью харакгер!гзуются метилпроизводные, содержащие б-гид-роксигруппу. Наиболее выражв!шую онтиокисллтельную активность В различных модельных системах окисления In vitro проявляет литиевая соль 5-гидрокси-6-метилурацила.

3. 3 патогенезе эксториментального отравления карбофосом развивается существенные нарушения окислительных процессов, прояв-лящиеся накоплением диеновых конъюгатов и малонового дйальде-гида в органах и тканях подопытных кивотных, снижением антиокислительной активности печени и каталазной активности крови.

Сочеташ'.э специфической автвдотной терапии с антиоксидан-тачи пиримидинового и бензимидазолыгого ряда в эксперименте способствует нормализации нарушенных звеньез окислительного метаболизма .

4. Снижение элоктрофоретичоской подвижности эритроцитов кр;;с при отравлении карбофосом указывает на Еозникношшив деструктивных изменений в эритроцитарной мембране, сопряженных с активацией процессов ПОЛ.

Оксиметацил и его литиевая соль оказывают корригирующее влияние на структурно-функциональные изменения мембран

оритроцитов в постинтоксикационном периоде отравления крнс карбофосом.

5. Литиевая соль оксиметацила и ионол предупреидают интенсификацию процессов ПОЛ в мембране эритроцитов, повышение активности каталазы, снижение уровня гемоглобина, нормализуют электрофоретическую подвижность эритроцитов и ионный состав плазмы крови крыс, отравленных тетрахлорметаном.

факторный анализ взаимосвязей показателей крови животных позволил выявить различия в механизмах антитоксического действия литиевой соли оксиметацила и ионола.

6. Антиокислительная активность производных пиримидина и бенз-имидазола является одним из основшх звеньев биохимического механизма их антитоксического эффекта при отравлениях карбофосом и тетрахлорметаном.

Экспериментальные результаты работы позволяют рекомендовать пиримидиновые производные - 5-гндрокси-3,6-диме-' тилурзцил, 5-гидрокси-1,3,6-триметилурацил, литиевую соль б-гидрокси-б-метилурацила и производное бензимидазола 2-(3,4-дигидроксифенацилтио)бвнзншдазол для дальнейшего доклинического изучения в качестве корректоров мембранотоксического действия ядов.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Заявка на изобретение Л4917750. Положительное решение от

22.11.91.

2. Заявка на изобретение &4917756. Положительное решение от

19.03.92.

3. Влияние процессов ПОЛ на липидные и белковые компоненты мембран.// В сб.: Актуальные вопросы сан. химии и токсикологии синтетических материалов. Материалы 3 отраслевой научно-технической лонф. С.-Петербург,1991.-С.127-129.(Соавт. (Шишкин В.А. .Вакарица А.Ф., Сруоилин Д.В.).

4. пиримидиновые производные как антиоксидаати.// В сб.: Ученые Башкирского медицинского института - здравоохранению. Уфа, 1992.- С.73-77. (Соавт. Мишкин В.А., Вакарица А.<5.. Срубшпш Д.В.).

5. Метаболические нарушения в постинтоксикациокнсм периоде

отравления крыс карбофосом.// Вопр. теор.и практ. медицины. Уфа, 1992.-С.42-43.(Соавт. Шамратова В.Г.).

6. Производное бензимидазола - эффективный корректор свободнорадикального окисления липидов при отравлении карбофосом.// Вопр.теор. и практ. медицины. Уфа, 1992.-С.42-43.

7. Влияние тетрахлорметана и антиоксидантов на процессы ПОЛ и состояние мембран эритроцитов. // Тез. докл. 59-ой итоговой научной конференции БГМИ.Уфа,1994.-С.40-41.

8. Влияние производного оксиштацила на перекисное окисление липидов в печени крыс при отравлении карбофосом. // Тез. докл.59-ой итоговой научной конф.БГМИ.Уфа,1994.- С.42.