Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные закономерности биологического действия халькогенорганических соединений

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные закономерности биологического действия халькогенорганических соединений"

На правах рукописи

Русецкая Наталья Юрьевна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ХАЛЬКОГЕНОРГАНИЧЕСКИХ

СОЕДИНЕНИЙ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

24 АПР 2014 005547398

Ростов-на-Дону 2014

005547398

Работа выполнена на кафедре биохимии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздрава России (г. Саратов).

Научный руководитель: Бородулин Владимир Борисович,

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: Микашинович Зоя Ивановна, доктор

биологических наук, профессор, зав. кафедрой общей и клинической биохимии №1 с курсом органической и неорганической биохимии Ростовского государственного медицинского университета (г. Ростов-на-Дону)

Цейликман Вадим Эдуардович, доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой биохимии Южно-Уральского государственного медицинского университета (г. Челябинск) Островский Олег Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой теоретической биохимии с курсом клинической биохимии Волгоградского государственного медицинского университета (г. Волгоград)

Ведущая организация: ФГБУН «Институт эволюционной физиологии и

биохимии им. И.М. Сеченова» РАН (г. Санкт-Петербург)

Защита диссертации состоится «10» июня 2014 г. в «1300» часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 по биологическим наукам в ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» (344090, г. Ростов-на-Дону, просп. Стачки, 194/1, актовый зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного федерального университета (344000, г. Ростов-на—Дону, ул. Зорге, 21 Ж).

Автореферат разослан « 2 » 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, , | Е.В. Асланян

кандидат биологических наук, с.н.с. '' * 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, количество и характер потребляемых продуктов питания являются одним из основных факторов, определяющих здоровье человека {ВОЗ, 1993). По современным данным, до 80% населения России имеет недостаточную обеспеченность селеном (Сенькевич O.A. и др., 2011; Давыденко Н.И. и др., 2012). В то же время проблема болезней, связанных с дефицитом селена, остается нерешенной до сих пор (Распоряжение Правительства Российской Федерации № 1873-р, 2010). В этой связи значительную актуальность приобретает коррекция питания населения с целью снижения распространенности селенодефицитных состояний (Баранова Т.А., 2008; Ширшова Т.И. и др., 2011).

В настоящее время для борьбы с селенодефицитом применяются биологически активные добавки, содержащие неорганический селен, главным образом селенит натрия (Перепелкина Л.И. и др., 2012). В то же время органические соединения селена по сравнению с неорганическими являются менее токсичными, более биодоступными и лучше усваиваемыми живыми организмами. Поэтому научные разработки последних лет направлены на синтез и использование органических форм селена в целях профилактики селенодефицита и ряда заболеваний (беломышечной болезни, некроза и жирового перерождения печени, экссудативного диатеза, энцефаломаляции, расстройства сперматогенеза и др.) (Комзалова A.B. и др., 2012; Бикчантаев И.Т., Шакиров Ш.К., 2013; Фроловичев A.C., Трошин А.Н., 2013).

Одним из перспективных селеноорганических соединений является диацетофенонилселенид (ДАФС-25) (производитель: ЗАО «Сульфат», г. Саратов), который позволяет нормализовать деятельность иммунной, антиоксидантной и детоксицирующей систем организма животных и птиц, приводит к увеличению яичной и мясной продукции (Древко Б.И. и др., 2001; Иванова И.В., 2009). ДАФС-25 в 40 раз менее токсичен селенита натрия, селен в нем находится в органической, более доступной для животных форме (Кулешов К.А., Трифонов Г.А., 2008). Известно, что селен расположен в VI группе Периодической системы элементов Д.И. Менделеева, все элементы которой относятся к халькогенам, являются электронными аналогами и обладают сходными химическими свойствами, что, вероятно, будет обусловливать близость биологических свойств этих элементов и их соединений (Паперная JI.K., 2007).

В связи с этим несомненный интерес представляет обнаружение взаимосвязи между структурой и биологической активностью халькогенов (серы, селена, теллура). В настоящее время отсутствуют систематизированные данные о биологической активности халькогенорганических соединений.

Целью исследования явилось установление биологической активности халькогенорганических соединений в зависимости от их структуры, включая наличие гетероатома халькогена (серы, селена, теллура) и боковых заместителей (атомов хлора, фтора и нитрогрупп) в составе этих соединений.

Залами исследования:

1. Изучить влияние халькогенорганических соединений на антиоксидантный статус и процессы свободнорадикального окисления в тканях белых мышей.

2. Установить эффекты халькогенорганических соединений на отдельные стороны обмена веществ и функциональное состояние тканей крыс при интоксикации сульфатом кадмия, нитратом свинца и нитратом ртути, а также оценить интоксикацию тяжелыми металлами и антитоксическое действие халькогенорганических соединений по гематологическим показателям крови крыс и лейкоцитарным индексам интоксикации.

3. Выявить способность халькогенорганических соединений подавлять рост клинических штаммов Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa.

4. Установить влияние халькогенорганических соединений и глюкокортикоидных препаратов на отдельные стороны углеводного и белкового обмена мышей.

5. Провести компьютерное прогнозирование биологической активности халькогенорганических соединений при помощи системы PASS С&Т, а также квантовохимические расчеты, выявляющие структурно-функциональные аналогии препарата ДАФС-25, его производных и ряда стероидных гормонов.

6. Установить структурно-функциональные закономерности, объясняющие разнообразные биологические свойства органических соединений, содержащих гетероатомы халькогенов (серы, селена и теллура), а также различные боковые заместители (атомы хлора, фтора и нитрогруппы).

Научная новизна работы. В работе впервые установлена взаимосвязь между структурой органических соединений, содержащих гетероатомы халькогенов (серы, селена и теллура), различные боковые заместители (атомы хлора, фтора и нитрогруппы) и их биологической активностью.

Впервые доказано, что нитро- и хлорсодержащие производные ДАФС-25 оказывают антиоксидантное действие, которое выражается в снижении концентрации продуктов перекисного окисления липидов и увеличении активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы в тканях и крови мышей.

Впервые установлена антитоксическая активность нитро- и хлорсодержащих производных ДАФС-25, а также его серосодержащего аналога при интоксикации экспериментальных животных солями тяжелых металлов: сульфатом кадмия, нитратом свинца и нитратом ртути.

Впервые показана зависимость антибактериальной активности соединений от их токсичности. В ряду селеноорганических соединений наиболее токсичный препарат - фторированный аналог ДАФС-25, а в ряду халькогенпроизводных ДАФС-25 - теллурорганическое соединение, которые подавляли рост колоний клинических

штаммов Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa даже в низких концентрациях 0,0001-0,001 мг/мл.

В работе впервые проведен компьютерный анализ биологической активности селен-, серо и теллуроорганических соединений, а также квантово-химические расчеты, выявляющие структурно-функциональные аналогии препарата ДАФС-25 (1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5), его производных и ряда стероидных гормонов. Установлено сходное действие ДАФС-25 и глюкокортикоидных препаратов на отдельные стороны углеводного и белкового обменов экспериментальных животных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Халькогенорганические соединения в зависимости от наличия гетероатома халькогена (серы, селена и теллура) и боковых заместителей (атомы хлора, фтора и нитрогруппы) в различной степени оказывают влияние на антиоксидантный статус и процессы свободнорадикального окисления в тканях белых мышей. Селеноорганические соединения 1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5 (ДАФС-25); 1,5-ди-(м-нитрофенил )-3-селенапентандион-1,5; 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандион-1,5 демонстрируют лучшие антиоксидантные свойства.

2. Селеноорганические соединения 1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5; 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5; 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандион-1,5 обладают низкой токсичностью и при предварительном введении per os крысам снижают интоксикацию солями тяжелых металлов, о чем свидетельствуют биохимические, гематологические показатели крови и лейкоцитарные индексы интоксикации. Серосодержащий аналог препарата ДАФС-25 (1,5-дифенил-З-тиапентандион-1,5) оказывает аналогичное действие, тогда как теллурсодержащее соединение в силу своей собственной токсичности не проявляет антитоксической активности при интоксикации солями тяжелых металлов.

3. Наибольшей токсичностью и антибактериальной активностью в отношении клинических штаммов Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa обладают соединения 1,5-ди-(п-фторфенил)-3-селенапентандиона-1,5 и 1,5-дифенил-З-теллуропентандиона-1,5 даже в низких концентрациях 0,00010,001 мг/мл.

4. Соединение ДАФС-25 оказывает стимулирующее действие на отдельные стороны углеводного и белкового обменов мышей подобно глюкокортикоидному препарату преднизолону.

5. Согласно квантово-химическим расчетам, молекула препарата ДАФС-25 (1,5-дифенил-З-селенапентандиона-1,5) наиболее близка к молекулам глюкокортикоидов преднизону и преднизолону как по размеру, так и по расстояниям между полярными реакционноспособными группами, которые потенциально могут участвовать в связывании с рецептором как посредством электростатических сил, так и за счет водородных связей.

6. В ряду халькогенорганических соединений, лишенных боковых заместителей (1,5-дифенил-З-тиапентандион-1,5; 1,5-дифенил-З-селенапентандион-1,5 и 1,5-

дифенил-З-теллурапентандион-1,5), а также в ряду ДАФС-25 (1,5-дифенил-З-селенапентандиона-1,5) и его производных, содержащих боковые заместители (1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандиона-1,5; 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-

селенапентандиона-1,5 и 1,5-ди-(п-фторфенил)-3-селенапентандиона-1,5), установлены следующие закономерности: снижаются антиоксидантная и антитоксическая активности, возрастает антибактериальное действие.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в настоящей работе результаты представляют существенный интерес для фундаментальной науки в понимании молекулярных механизмов реализации биологической активности органических соединений серы, селена и теллура. Экспериментально показана антитоксическая активность соединения 1,5-дифенил-3-тиапентандиона-1,5, что можно связать с наличием в структуре этого соединения фенильных радикалов, лишенных боковых заместителей. Результаты исследований позволяют рекомендовать соединения 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5; 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-

селенапентандион-1,5 и 1,5-дифенил-3-тиапентандиона-1,5 для дальнейших исследований с перспективой использования в качестве протекторов для предотвращения отравления тяжелыми металлами на производстве и средств, повышающих окислительную резистентность организма, а соединения 1,5-ди-(п-фторфенил)-3-селенапентандиона-1,5 и 1,5-дифенил-3-теллуропентандиона-1,5 могут применяться при госпитальных инфекциях, либо в качестве бактериостатических средств в медицинской практике и ветеринарии. Получены свидетельство на полезную модель № 22478 от 21.11.2001 «Кювета для выращивания микроорганизмов» и патент №016974 от 26.04.2007 «Средство для лечения и профилактики отравлений соединениями тяжелых металлов». Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре биохимии ГБОУВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России.

Апробация диссертационной работы. Материалы диссертации докладывались на межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Молодежь и наука: итоги и перспективы» (Саратов, 2007, 2008, 2009, 2010), Российской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009), 2-ой международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика» (Томск, 2010), IX межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2010), VII международной научно-практической конференции «Ключевые вопросы в современной науке» (София, 2011), Международной научно-практической конференции «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области» (Пенза, 2011), V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2013), Международной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Франция, Париж,

2013), Международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (ОАЭ, Дубай, 2013), Международной конференции «Фундаментальные исследования» (Израиль, Тель-Авив, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 работ, в том числе 13 статей в изданиях, рекомендованных ВАК, 1 монография; получены 2 патента на изобретения № 016974 от 26.04.2007 и №2011118470/15 от 06.05.2011 и свидетельство на полезную модель № 22478 от 21.11.2001. Общий объем публикаций 13,19 п.л., личный вклад 85%.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 318 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания постановки экспериментов, методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 43 таблицы и иллюстрирована 19 рисунками. Список использованной литературы включает 528 наименований, в том числе 431 зарубежный источник.

Исследуемые соединения впервые были синтезированы в Саратовском военном институте биологической и химической безопасности под руководством д.х.н., профессора Б.И. Древко. Соединения являются структурными аналогами (халькогенсодержащие арилалифатические дикетоны). Формулы исследуемых соединений представлены ниже:

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1,5-дифенил-З-селенапентандион-1,5 (ДАФС-25, ДАФС(8е), Соединение 1)

1,5-ди-(п-хлорфенил)-3- селенапентан-дион-1,5 (ДАФС(СЬ), Соединение 2)

1,5-ди-(п-фторфенил)- селенапентан' дион-1,5 (ДАФС(Р2), Соединение 3)

1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентан-дион-1,5 (ДАФС(Ы02)2, Соединение 4)

1,5-дифенил-З-тиапентандион-1,5 (ДАФС(8), Соединение 5)

1,5-дифенил-З-теллуропентандион-1,5 (ДАФС(Те), Соединение 6)

Исследования были выполнены на белых беспородных крысах и мышах. Контрольные и экспериментальные группы формировали из самцов. Возраст животных составлял 3-4 месяца. Масса мышей 20±3 г и крыс 200+25 г.

Всего было составлено 12 контрольных и 29 экспериментальных групп. Каждая контрольная группа включала 12, а экспериментальные - 10 особей. Общее количество животных, использованных в работе, составило 460 особей (таблица 1).

Для изучения влияния халькогенорганических соединений на биохимические и гематологические показатели крови крыс, показатели антиоксидантной системы и углеводного обмена мышей экспериментальным животным вводили per os растворы препаратов в растительном масле на протяжении 14 дней. Суточную дозу препаратов рассчитывали из соотношения 200 мкг Se/кг массы (ВОЗ, 1989). Растворы препаратов в растительном масле готовили ex tempore при нагревании до 60°С на водяной бане. Мышам вводили per os суточную дозу препарата утром натощак в объеме 10 мкл, крысам - в объеме 50 мкл с помощью микродозатора («Gilson», Франция).

Дизайн эксперимента Таблица 1.

Серии эксперимента Экспериментальные исследования Количество особей

1 Антитоксическое действие при подостром отравлении солями тяжелых металлов (РЬ(Ы03)2, Нё(Ы03)2, Сс)804) 300 крыс

2 Антиоксидантная активность 80 мышей

3 Антимикробная активность Клинические штаммы Staphylococcus aureus (n=60), Escherichia coli (n=60), Pseudomonas aeruginosa (n=60)

4 Определение показателей углеводного обмена 80 мышей

Гормоноподобное действие: Квантово-химические расчеты проводили гидридным методом теории функционала плотности (DFT) Расчеты вероятной биологической активности PASS

Все работы с лабораторными мышами проводили согласно принципам гуманного отношения к животным в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных», «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003).

Подготовка биологического материала. Забор крови подопытных и контрольных животных проводили в утренние часы. В качестве антикоагулянта использовали раствор гепарина (0,6 мл гепарина в 12 мл 0,9% NaCl) в соотношении стабилизатор/кровь 1:5. С помощью центрифугирования проводили отделение плазмы крови от форменных элементов. Для приготовления гемолизата эритроцитов к 50 мкл отмытых эритроцитов добавляли 10 мл дистиллированной воды (разведение 1:200) (Карпищенко А. И., 1999; Артюхов В. Г., Наквасина М. А., 2000). Супернатант плазмы готовили путем добавления к 50 мкл плазмы 10 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) (разведение 1:200). В исследованиях также использовались гомогенаты мозга, печени, почек и легких мышей. Навески тканей механически гомогенизировали в течение 1 минуты в фарфоровой ступке при 0°С до получения однородной массы (Кирова Ю. И., 2004). Объем полученного гомогената доводили до 5,0 мл 0,01 М фосфатного буфера (pH 7,4).

Определение показателей свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы проводилось в гемолизате эритроцитов, плазме крови, гомогенатах тканей (мозга, печени, почек и легких) мышей. Содержание диеновых конъюгатов (ДК) определяли в хлороформном экстракте по поглощению света при длине волны 233 нм (Стальная И.Д., 1977). Уровень малонового диальдегида (МДА) оценивали по реакции с 2-тио-барбитуровой кислотой (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977). Концентрацию ДК и МДА выражали в ммоль/1г ткани или на I мл для плазмы крови и эритроцитов. Активность глутатионпероксидазы (ГПО) в цельной крови определяли по окислению восстановленного глутатиона гидропероксидом кумина при длине волны 340 нм с использованием набора реактивов фирмы "Randox" (Великобритания) (Paglia D.E., Valentine W.N., 1967). Активность супероксидцисмутазы (СОД) в гемолизате эритроцитов, плазме крови и гомогенатах тканей проводили по реакции восстановления формазанов из солей тетразолия в слабощелочной среде (Дубинина Е.Е. и др., 1983). Активность каталазы определяли по скорости утилизации перекиси водорода в реакционной смеси при длине волны 260 нм (Карпищенко А.И., 1999). Активность ГПО выражали в ед/г Hb, СОД - в усл.ед., каталазы - в ммоль/мин на 1 мл плазмы крови и эритроцитов или на 1 г ткани.

Антитоксическое действие халькогеноргаиических препаратов при интоксикации Pb(N03)2, Hg(N03)2, CdS04 оценивалось по нормализации основных биохимических и гематологических показателей плазмы крови крыс: количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, содержание гемоглобина, гематокрит, активность ферментов (у-глутамилтрансферазы (ГТТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), а-амилазы), белково-образующая функция печени (альбумин, общий белок), состояние мочевыделительной системы (креатинин, мочевина), концентрация глюкозы как главного метаболита углеводного обмена и холестерина как метаболита липидного обмена.

Дозировки тяжелых металлов рассчитывались с учетом полулетальных доз: Hg(N03)2 (26 мг/кг), Pb(N03)2 (93 мг/кг), CdS04(47 мг/кг) (Филов В.А., 1988).

Подсчет количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов производили в счетной камере Горяева, определение уровня гемоглобина - гемометром Сали. Лейкоцитарную формулу получали посредством дифференцированного подсчета форменных элементов белой крови на мазках, приготовленных общепринятым способом (Зупанец И.А., 2005). Лейкоцитарные индексы интоксикации (ЛИИ) рассчитывали по формулам Я.Я. Кальф-Калифа (1941) и В.К. Островского (2006, 2007).

Определение биохимических показателей крови проводили с помощью полуавтоматического биохимического анализатора «HOSPITEX Screen master», оборудованного термостатом, фотометром и микропроцессором. В работе использовали набор жидких реагентов, готовых к определению показателей в плазме крови. Производитель ЗАО «Диакон» (Россия). Методы являются унифицированными.

Определение антибактериального действия халькогенорганическнх соединений на бактериальные клетки клинических штаммов кишечной палочки (Escherichia coli), синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa) и золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) проводили по числу выросших клеточных колоний. Эксперимент проводили на десяти таксономически идентичных клинических штаммах бактерий, выделенных от больных с гнойными осложнениями, находящихся на лечении в травматолого-ортопедическом стационаре Саратовского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии (СарНИИТО). Видовую идентификацию штаммов проводили на основании изучения фенотипических свойств. Бактерии обладали резистентностью к пяти и более профильным антибиотикам: бета-лактамам (цефалоспорины 1-2 поколения, оксациллин, метициллин), макролидам (эритромицин), фторхинолонам (ципрофлоксацин, левофлоксацин), аминогликозидам (гентамицин) и ванкомицину. Суспензию бактерий готовили по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича, путём последовательных разведений до конечной концентрации бактерий - 3105 клеток в 1 мл.

Халькогенорганические соединения растворяли в смеси диметилформамида (ДМФА) с 0,9% NaCl в соотношении 1:10 и с использованием этой смеси готовили разведения соединений в концентрациях 0,0001-1 мг/мл. В пробирки с разведениями препарата добавляли по 100 мкл конечной суспензии (3 105 КОЕ/мл) микроорганизмов, встряхивали и инкубировали в течение 30, 60, 90, 120, 150 мин при комнатной температуре.

В качестве контроля использовали такие же количества бактериальной взвеси, разведенные в аналогичных пропорциях с контролем (ДМФА с 0,9%-ным NaCl), а также выдержанные в течение тех же промежутков времени. После этого бактериальные взвеси из каждой пробирки в количестве 100 мкл высевали на чашки Петри с твердой питательной средой (мясо-пептонный агар), которые затем помещали в термостат на 24 часа при 37°С. Подсчет колоний производили на следующий день.

Изучение гормоноподобного действия халькогенорганических соединений

включало определение некоторых показателей обмена углеводов и белков: концентрации пирувата в цельной крови по методу Умбрайта (Бабаскин Б.Н., 1976), глюкозы в плазме крови, концентрации гликогена в печени и цельной крови по методу Хорейши (Покровский A.A., 1969), активности ферментов глюкозо-6-фосфатазы и фруктозо-1,6-бисфосфатазы в печени по изменению количества неорганического фосфора, образующегося при дефосфорилировании глюкозо-6-фосфата и фруктозо-1,6-бисфосфата соответственно (Уварова Е.В., 2005), а также активности ферментов АлАТ и АсАТ в плазме крови,.

Квантовохимические расчеты проводили гидридным методом теории функционала плотности (DFT) (Кон В., 2002) по программам пакета Gaussian 98 W. В рамках SCF использован гибридный функционал B3LYP, сочетающий трехпараметровый обменный функционал Беке [Becke A.D., 1988, 1993] и корреляционный функционал LYP [Lee С. et al., 1988]. Взят базисный набор 631 lG(d,p) [Ditchfield R. et al., 1971]. В гармоническом приближении рассчитывались частоты колебаний. Все равновесные структуры без мнимых частот отвечают точкам минимумов на поверхностях потенциальной энергии. Условия сходимости по RMS-матрице плотности составляло 1-Ю"8 в течение 200 итерационных циклов, по МАХ-матрице плотности - 1-Ю"6 а.е. Начальная геометрия генерировалась по программам HypeChem [HypeChem (TM), Hypercube, Inc., Gainesville, Florida 32601, U.S.A.] и оптимизировалась методом PM3 [Stewart J.J.P., 1989; 1989]. Размер молекул оценивался как радиус (ао) сферической полости, занимаемой молекулой растворенного вещества в континууме растворителя методом Онзагера. Автор благодарит докт. хим. наук, профессора А.Н. Панкратова за консультативную помощь и техническое содействие в проведении квантово-химических расчетов.

Компьютерное прогнозирование биологической активности халькогенорганических соединений проводилось с использованием компьютерной системы предсказания спектра биологической активности (PASS С&Т). Список прогнозируемых PASS биологических активностей включал около 4000 наименований, характеризующих активирование/ингибирование ферментов, экспрессии транскрипционных факторов, блокирование/стимулирование биологических процессов, ионных каналов, фармакотерапевтическое, токсическое и другие действия. Интерпретация полученных результатов осуществлялась с помощью программы «Pharma Expert» (Поройков B.B. и др., 2009). Результат прогноза спектра биологической активности представляется в PASS в виде упорядоченного списка названий соответствующих активностей и вероятностей Ра «быть активным» и Pi «быть неактивным» для прогнозируемого соединения, имеющие значения от 0 до 1. Чем больше для конкретной активности величина Ра и меньше величина Pi, тем больше шанс обнаружить данную активность в эксперименте (Поройков В.В. и др., 2009).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы Microsoft Excel на персональном компьютере. Проверяли

гипотезы о виде распределений (критерий Шапиро-Уилкса). Большинство данных не удовлетворяют закону нормального распределения случайной величины, поэтому для сравнения значений использовали Г-критерий Манна-Уитни, на основании которого оценивали уровень доверительной вероятности 1-а (комплементарная ей величина а называется уровнем значимости). Критический уровень доверительной вероятности при проверке статистических гипотез принимали равным 1-а=0.95 (критический уровень значимости а=0,05), что соответствует показателю достоверности р. Для вычисления Г-критерия Манна-Уитни данные контрольной и опытной групп объединяли и упорядочивали по возрастанию. Ранг 1 присваивали наименьшему из всех значений, ранг 2 - следующему и так далее. Наибольший ранг присваивали самому большому среди значений в обеих группах. Если значения совпадали, им присваивали один и тот же средний ранг. Для меньшей группы вычисляли Т- сумму рангов ее членов. Полученное значение Т сравнивали с критическими значениями. Если Т меньше или равно первому из них либо больше или равно второму, то нулевая гипотеза отвергалась (различия статистически значимы). U-критерий Манна-Уитни вычисляли по формуле: U = Т-nM(nM + 1) / 2, где пм- численность меньшей из групп [Гланц С., 1998].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Антиоксидантная активность органических соединений селена, серы и теллура. Проводилось изучение содержания диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА), а также активности антиоксидантных ферментов каталазы и СОД в плазме крови, гемолизате эритроцитов и гомогенатах тканей (мозга, печени, почек и легких), а также активности ГПО в цельной крови мышей. Следовательно, мы выбрали 3 ткани с низкой оксидорезистентностью (мозг, легкие и почки) и 3 - с высокой (эритроциты, печень и плазма крови). Литературные данные свидетельствуют, что применение различных антиоксидантов способствует снижению содержания продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и нарастанию активности антиоксидантных ферментов каталазы, СОД и ГПО в тканях экспериментальных животных (Костюк В.А., Потапович А.И., 2004).

Согласно полученным данным, концентрация ДК достоверно снижалась по сравнению с контролем только в органах с низкой оксидорезистентностью - легких и/или мозге, (рис. 1). Например, пероральное введение белым беспородным мышам селеноорганических соединений 1, 2 и 3 приводило к снижению концентрации ДК в легких на 47,6%, 29,1%, 45,5% соответственно, а действие селеноорганического соединения 4 приводило к снижению концентрации ДК в мозге на 24,3%. Теллурорганическое соединение вызывало снижение содержания ДК в мозге и легких мышей на 26,6% и 66,0% соответственно.

Рис. 1. Концентрация диеновых конъюгатов в гемолизате эритроцитов, плазме крови и гомогенатах тканей мышей, получавших per os халькогенорганические соединения. Обозначения: *-р<0,05 по сравнению с контролем, п=10; 1-4, 6 - группы мышей, получавших соединения: 1 - 1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5; 2 - 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандиона-1,5; 3 - 1,5-ди-(п-фторфенил)-3-селенапентандиона-1,5; 4 - (1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандиона-1,5 и 6 - 1,5-дифенил-3-теллурапентандион-1,5. Влияние соединения 5 (1,5-дифенил-3-тиапентандион-1,5) на свободнорадикальное окисление липидов установлено ранее (Кирова Ю.И., 2004), поэтому изучение его антиоксидантной активности в нашем эксперименте не проводилось.

Малоновый диальдегид (МДА) как вторичный продукт ПОЛ является более информативным показателем окислительных процессов в тканях. Все исследованные соединения при введении мышам per os способствовали снижению концентрации МДА во всех тканях, гемолизате эритроцитов и плазме крови (рис. 2).

Рис. 2. Концентрация малонового диальдегида в гемолизате эритроцитов, плазме крови и гомогенатах тканей мышей, получавших per os халькогенорганические соединения. Обозначения как на рис. 1.

Антиоксидантная активность соединения 1 (ДАФС-25) проявлялась снижением содержания МДА в гемолизате эритроцитов, плазме крови, мозге, легких на 42-50% и

почках на 20,7%. Действие соединения 2 in vivo приводило к снижению концентрации МДА в гемолизате эритроцитов (на 77,7%), мозге (на 35,1%) и легких (на 63,7%), а соединения 3 - только в мозге (на 13,7%) и легких (на 24,7%). Антиоксидантное действие соединения 4 было сопоставимо с действием препарата ДАФС-25 (соединение 1), поскольку его пероральное введение сопровождалось снижением концентрации МДА в гемолизате эритроцитов, плазме крови, мозге на 50-63% и легких на 22,4%. Теллурсодержащий аналог препарата ДАФС-25 способствовал снижению содержания МДА только в плазме крови (на 59,5%), печени (на 43,8%) и мозге (на 57,9%). Согласно полученным результатам, соединение 3 обладало наименьшей антиоксидантной активностью в тканях мышей, а кроме того, действие этого соединения сопровождалось увеличением концентрации МДА в плазме крови на 90,5% (рис. 2).

Ключевым антиоксидантным ферментом является СОД, которая катализирует дисмутацию супероксидного радикала в перекись водорода и молекулярный кислород, защищая, таким образом, клетки, ткани и биомолекулы от воздействия свободных радикалов. В нашем эксперименте наиболее выраженное повышение активности СОД в плазме крови, гемолизате эритроцитов и гомогенатах тканей наблюдалось у мышей, получавших per os селеноорганические соединения 1 -4 (рис. 3). Причем ДАФС-25 (соединение 1) вызывал наибольший эффект, что выражалось в увеличении активности СОД в гемолизате эритроцитов (в 25 раз), плазме крови (на 46,5%), печени (на 449,5%), мозге (на 267,5%), легких (на 54,9%) и почках (на 91,2%).

о/0 3000 2500 2000 1500 1000

500 0

-500

£ *

ё. 2 — ¿

- 2

S: g: Ь: S. _ — 'fft д

se = 5 f 5 — £ я г

s -i1 « i а ~ i £ t = 5

sbs

— Г41

О д

X

Рис. 3. Активность супероксиддисмутазы в гемолизате эритроцитов, плазме крови и гомогенатах тканей мышей, получавших per os халькогенорганические соединения. Обозначения как на рис. 1.

Соединение 4 демонстрировало сходный эффект на активность СОД, которая повышалась в гемолизате эритроцитов (в 13 раз), плазме крови (на 163,6%), печени

(на 138,4%), мозге (на 77,8%), легких (на 44,5%) и почках (на 96,6%). Фторсодержащее производное препарата ДАФС-25 (соединение 3) оказывало заметно меньшее действие на активность СОД in vivo, она возрастала в гемолизате эритроцитов (на 462,2%), плазме крови (на 55,8%), печени (на 115,9%), мозге (на 117,1%) и легких (на 43,8%). Действие хлорсодержащего производного препарата ДАФС-25 (соединение 2) характеризовалось наименьшим стимулирующим действием на этот показатель среди изученных селеноорганических соединений. При пероральном введении мышам этого препарата активность СОД увеличивалась в гемолизате эритроцитов (на 720,6%), печени (на 154,2%), легких (на 61,3%) и почках (на 252,9%), тогда как в плазме крови, напротив, наблюдалось достоверное ее снижение на 51,2% по сравнению с контролем. Пероральное введение мышам теллурорганического аналога препарата ДАФС-25 сопровождалось увеличением активности СОД только в гемолизате эритроцитов (на 1123%), печени (на 291,3%) и мозге (на 92,1 %), а в плазме крови, легких и почках, наоборот, снижалась на 20-55%.

Следовательно, селеноорганический препарат ДАФС-25 и его производные, содержащие у фенильных радикалов атомы хлора, фтора и аминогруппы, оказывали выраженное стимулирующее действие на активность одного из главных антиоксидантных ферментов - СОД, который обезвреживает высокоактивный супероксид-анион до перекиси водорода и кислорода.

Образованная под действием СОД Н202 относится к активным формам кислорода и может оказывать повреждающее действие на все компоненты клетки. Поэтому для нормальной жизнедеятельности клетки необходимо своевременное обезвреживание перекиси водорода ферментами каталазой и глутатионпероксидазой.

Наибольшее увеличение активности каталазы в тканях и крови мышей вызывало введение per os хлор-, фтор- и нитропроизводных препарата ДАФС-25 (соединения 2, 3 и 4). Причем фторсодержащий аналог ДАФС-25 оказывал максимальный эффект, что выражалось в увеличении активности каталазы в гемолизате эритроцитов (на 358,3%), плазме крови (на 115,4%), печени (на 490%), мозге (на 219,2%), легких (на 309,1%) и почках (на 111,9%). Действие нитропроизводного препарата ДАФС-25 (соединение 4) ш vivo характеризовалось повышением активности каталазы в гемолизате эритроцитов (на 210,9%), плазме крови (на 146,2%), печени (на 320%), мозге (на 65,4%), легких (на 381,8%) и почках (на 54,8%) (рис. 4). Хлорсодержащее производное препарата ДАФС-25 (соединение 2) при пероральном введении мышам оказывало стимулирующее действие на активность каталазы, что выражалось в достоверном увеличении активности этого фермента в гемолизате эритроцитов (на 50,6%), плазме крови, гомогенатах печени, мозга, легких и почек на 108-186%. У мышей, получавших per os препарат ДАФС-25

(соединение 1), отмечалось повышение активности каталазы в гемолизате эритроцитов (на 169,2%), печени (на 47,5%), мозге (на 219,2%) и легких (на 236,4%).

% 600 .................................................................................................................................~

1 2 3 4 6

Рис. 4. Активность каталазы в гемолизате эритроцитов, плазме крови и гомогенатах тканей мышей, получавших per os халькогенорганические соединения. Обозначения как на рис. 1.

Действие соединения ДАФС-25 и его теллурсодержащего аналога были сопоставимы. Пероральное введение теллурорганического соединения сопровождалось увеличением активности каталазы в гемолизате эритроцитов (на 165,1%), плазме крови (на 66,9%), печени (на 215%), мозге (на 92,3%) и легких (на 354,6%).

Главным антиоксидантным ферментом, участвующим в разрушении токсичной перекиси водорода, является селензависимая глутатионпероксидаза. Согласно полученным результатам, достоверное увеличение активности ГПО в цельной крови наблюдалось у мышей, получавших per os органические соединения селена 1-4 на 64,7%, 51,9%, 43,7%, 98,9% соответственно и теллуроорганическое соединение - на 23% (р<0,05).

Значительное повышение активности ГПО в крови при действии in vivo нитропроизводного препарата ДАФС-25 (соединение 4) можно объяснить более легким разрывом связи «C-Se», благодаря чему селен быстрее освобождается из этого соединения и вступает в синтез селенопротеинов и ферментов, главным из которых является ГПО. Разрыву связи «C-Se» способствуют карбонильные группы в составе исследованных соединений, которые обладают отрицательным индуктивным эффектом и способны оттягивать на себя электроны, приводя к разрыхлению этой связи и освобождению атома селена из молекулы. Кроме того, нитрогруппа в составе соединения 4 также способна вызывать разрыхление связи «C-Se», т.к. она обладает отрицательным мезомерным эффектом и способна оттягивать на себя электронную плотность в сопряженной системе (Тюкавкина H.A., 2004). Таким образом, в разрыхление связи «C-Se» соединения 4 вносят вклад как карбонильные группы, так и

нитрогруппы, поэтому, можно предположить, что атом селена из этого соединения будет освобождаться быстрее, чем из других селеноорганических соединений, что подтверждается более высокой активностью ГПО при действии этого соединения.

Следовательно, исследованные халькогенорганические соединения наиболее эффективно оказывали антиоксидантное действие на ткани с низкой оксидорезистентностью, главным образом, на легкие и мозг. Более слабый антиоксидантный эффект наблюдался в высокооксидорезистентных гемолизате эритроцитов и плазме крови. Наименьшая антиоксидантная активность исследованных соединений обнаружена в печени и почках. Подобную неэффективность антиоксидантов в клетках этих тканей можно объяснить их участием в метаболизме и экскреции ксенобиотиков. В печени происходит детоксикация гидрофобных веществ, а почки участвуют в их выведении.

Установленные ранее (Кирова Ю.И., 2004) эффекты серосодержащего аналога ДАФС-25 (соединение 5) на показатели свободнорадикального окисления в тканях мышей с различной оксидорезистентностью позволяют нам сделать вывод о сходной антиоксидантной активности этого соединения с действием селеноорганических соединений 2 и 4.

Подводя итог представленным выше данным, можно заключить, что антиоксидантная активность изученных халькогенорганических соединений убывала в ряду: 1>4>5>2>3>6.

Очевидно, что наличие боковых радикалов в фенильных заместителях, а также замена атома селена на теллур снижает антиоксидантные свойства халькогенорганических соединений.

Антитоксическое действие халькогенорганических соединений при интоксикации солями тяжелых металлов. В настоящее время значительно ухудшилась экологическая обстановка вследствие загрязнения окружающей среды токсическими веществами, главными из которых являются соли тяжелых металлов (8а1апщ Б. й а1., 2010). Токсические эффекты ионов металлов РЬ2+, Н§2+ и Сс12+ заключаются в образовании прочных комплексов с аминокислотами и другими биомолекулами, содержащими концевые тиогруппы (МаЬтс V. й а1., 2011; ТЬеуепос! Р., 2009), в вытеснении эссенциальных металлов из металлсодержащих комплексов, приводящем к потере последними биологической активности (1кес1юЫ С.О. е1 а1., 2004), а также в активации перекисного и свободно-радикального окисления (Коес^ЬЬ Р., Бео У.К., 2011). Для оценки тяжести интоксикации соями тяжелых металлов и антитоксической активности халькогенорганических препаратов в нашем эксперименте определялись основные биохимические и гематологические показатели крови крыс. В плазме крови контрольных и экспериментальных животных

определяли концентрацию основных метаболитов (глюкозы, общего белка, альбумина, креатинина, мочевины и холестерина) и активность ферментов АсАТ, АлАТ, амилазы, ЩФ, ГГТ и ЛДГ.

Приведенные результаты свидетельствуют о незначительном токсическом воздействии халькогенорганических соединений на организм экспериментальных животных, который выражался, главным образом, в воздействии на почки и печень крыс. Из исследованных соединений наибольший токсический эффект оказывал теллуроорганический препарат, а наименьший - серосодержащий аналог ДАФС. Соли тяжелых металлов оказывали выраженное токсическое действие на белых крыс, что подтверждается увеличением концентрации креатинина и мочевины в плазме крови (нефротоксическое действие), а также изменением активности всех исследованных ферментов в плазме крови (гепатотоксическое действие). Нефротоксическое действие солей кадмия, свинца и ртути подтверждалось увеличением концентрации креатинина на 63-117% и концентрации мочевины на 3395% в плазме крови по сравнению с контрольной группой животных (рис. 5).

£ с о г г

2 О.

Крсатишш в Мочевина

Рис. 5. Концентрации креатинина и мочевины в плазме крови крыс. Обозначения: 1-6 -халькогенорганические соединения (*-р<0,05, п=10).

Гепатотоксическое действие солей кадмия, свинца и ртути характеризовалось изменением активности индикаторных ферментов печени и поджелудочной железы (рис. 6 а, б и 7) в плазме крови. Несмотря на то, что все использованные соли тяжелых металлов обладали как нефротоксическим, так и гепатотоксическим

действием, наибольший сдвиг в биохимических показателях крови крыс наблюдался при ведении per os солей свинца и кадмия.

% 300 250 200 150 100 50 О -50 -100

"У " г.....ГТП^.....Г

I . V

1

д ......" -

* *

РЧ гч — ГЧ РЧ -it N N ^ -с г« гч ц- It «1 РЧ РЧ ГЧ О ■ч- РЧ РЧ

РО р? о р^ п О « Р? О <*> РО о t** РЛ О рл" О Р*1

о О -у. •а С /■ч V. ■в С о и ■э о О V5 •О О О к /-v W о VI ■э О О

Z Z и Z Z CJ z г: и г CJ CJ Z Z \J Z Z

SC А + si + ей S + si .с + 'Э л + si + С£>

я т- * fi ¡2 л Я а. <п I о 5 е.

+ + + + + + + + + + + +

РЧ г» о рр> ■ч- ч- V5 ■л ve

ACT *АЛТ

%

250 200 150 100 50 0 -50 -100

а)

J 1JJ

тс N Р) - ч

О Я S о

ig О О 2

и 5. о

JS +

2 0- —

РЧ

Г) п

О О z Z

si £

2 —

+ +

NftNNr^ftMM

р^Г РЛ О РЛ р? С О РЛ1 р^"

О О ¡А О о и О о С О

Z Z ZJ г Z и Z Z Z Z

ей £ + ТЗг л + si л + ей

Е в- + + <*> + а. + -т S е. + + 1Л, 2 а- + +

гч рч г) p*i «г, «Л

РЧ rj

О О Z Z si 2а 2 о.

ггт ■ лдг

б)

Рис. 6. Активность индикаторных ферментов в плазме крови крыс: a) ACT и AJTT; б) ГГТ и ЛДГ. Обозначения как на рис. 5.

Все исследованные халькогенорганические препараты оказывали нефропротекторное действие при интоксикации сульфатом кадмия, что подтверждалось нормализацией концентрации креатинина в плазме крови экспериментальных животных. Однако в данной серии экспериментов концентрация

креатинина осталась повышенной на 35-69%, а концентрация мочевины при действии препаратов 4, 5 и 6 - на 35-46% по сравнению с контролем (рис, 5).

Пять из шести исследованных халькогенорганических препаратов (кроме соединения 6) оказывали нефропротекторное действие при подостром отравлении крыс нитратом свинца. Наиболее выраженными антитоксическими свойствами обладало соединение ДАФС-25, поскольку при его предварительном введении нормализовалась концентрация креатинина и мочевины в плазме крови. Антитоксический эффект препаратов 2, 3, 4 и 5 был менее выраженным, т.к. при превентивном введении этих препаратов нормализовалась только концентрация мочевины, а концентрация креатинина в плазме крови оставалась повышенной на 3845% по сравнению с контрольной группой. Максимальный нефропротекрорный эффект при отравлении солью ртути продемонстрировали соединения 1 и 5, поскольку при их предварительном введении per os практически нормализовалась концентрация креатинина и мочевины в плазме крови крыс.

% 200 150 100 50 0 -50 -100

* *

*

* * Ц .......... . 1

* *Ш *1 .........JL.......** I 1 1 1..... * J......1.......i.......J.........ii...........1

Г * " '! ......** f

.........................................*...................................... "

N N -

С О G

ioo 'zz

ею л £ а.

^ N « N

Опт Щ о о

6ZZ

+ ел л + +

N N П

О о Z Z us js 2

А

Ч N N

С Яп

2 о о у z z + ею S 2*

А <->

^ N N V}

С

200

uZZ + ею JS

С*

■+ ±

-t ~т

п го

0 О Z Z

01 л

X е-

t N N

О in io £ О с 6zz

+ ею л

nC с*

i i

Амилаза ■ ЩФ

Рис. 7. Активность амилазы и ЩФ в плазме крови крыс. Обозначения как на рис. 5.

Кроме того, необходимо отметить, что при совместном использовании халькогенорганических препаратов и солей тяжелых металлов изменялась активность всех исследованных ферментов в плазме крови, что можно расценить как гепатотоксический эффект. Причем наибольшее токсическое действие оказывали соединения 3 и 6 (рис. 6, 7).

Тяжесть интоксикации при прероральном введении крысам сульфата кадмия, нитрата свинца и нитрата ртути и антитоксическое действие халькогенорганических соединений также оценивались по гематологических показателям крови и

лейкоцитарным индексам интоксикации (ЛИИ) по формулам Я.Я. Калъф-Калифа и В.К. Островского.

Благодаря своей гидрофобной структуре, исследуемые халькогенорганические соединения оказывали некоторое токсическое действие на организм экспериментальных животных, что выражалось в увеличении числа лейкоцитов и ЛИИ (рис. 8, 9). По степени токсичности халькогенорганические соединения можно расположить в следующей последовательности: 6>3>4>2> 1>5.

*

А •к •к

......~......1.........................................................*.................Г ......

1 ... 1 1 Its

й i*., .7 ** * * 1

m 1 | J | 5 . *** * * IT * 1 1 '* i '

йг

гч — -f N N N ci те Г4 N (М Ш -г <4 О rv)

Я4 <*> О f) f^ о т О «*> S4 о Й f-J О й О

о О !Л rs О с £ о О О С с с О И с о

Z г О Z Z Z Z О Z Z и Z Z Z Z и Z Z

С£ л + С£> Ж + м ^ + ех + "3d £■ + ci —. + сх> ¿а

йт __ 2_ г» ЗИ Zm Г*1 д •t ЦП ^ 1Г. Я \в S ft.

+ + + + + + + + + + + +

f4 л ■t t "Г; 1Г, ЧО «

4 Лейкоциты ■ Тромбоциты

Рис. 8. Число лейкоцитов и тромбоцитов в крови крыс. Обозначения как на рис. 5.

Соли кадмия, свинца и ртути оказывали выраженное токсическое действие на организм экспериментальных животных, о чем свидетельствовало значительное увеличение ЛИИ (рис. 9). Токсичность исследованных солей тяжелых металлов снижается в следующем направлении: Pb(N03)2 > CdS04 > Hg(N03)2.

Наилучшими антитоксикантами при отравлении солями тяжелых металлов являлись препарат ДАФС-25 (соединение 1) и его серосодержащий аналог (соединение 5), поскольку при их превентивном введении per os наблюдалась нормализация гематологических показателей крови крыс. Соединение 4 было также эффективно при интоксикации сульфатом кадмия и нитратом свинца. Однако можно отметить повышенное значение ЛИИ по формуле Я.Я. Кальф-Калифа (на 56-66%) при совместном действии сульфата кадмия и соединений 4 и 5. Соединение 2 оказывало антитоксический эффект только при интоксикации нитратом ртути, тогда как совместное применение этого препарата с сульфатом кадмия и нитратом свинца сопровождалось значительным увеличением ЛИИ по формуле Я.Я. Кальф-Калифа на 480-510% по сравнению с контролем (рис. 9).

%

4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

-500

:.ЙЛ*

**.....

...............

ГЦ (Ч

О й я

2 с с

б ^ £ 51 л

I 2-

Ч N N N

О

Щ о о

+ 5* Л

" + +

N N ^

Я" Я С с г, г

ей л

£

+ +

А «ч

N м Опт ¡500 бгг

+ -О —

5 А

М N V.

Я ¡л О

£ О О £

с£ ¿г 2 в-

4 4

мм« Я4 Я" О С г г

51 2" 1?, »Г,

л

О

и ' г

■А

СИ .а — —

ЛИИ Кальф-Калифа ■ ЛИИ Островского

Рис. 9. Лейкоцитарные индексы интоксикации по формулам Я.Я. Кальф-Калифа и В.К. Островского, рассчитанные на основании лейкоцитарных формул экспериментальных животных. Обозначения как на рис. 5.

Соединения 3 и 6 в силу своей собственной токсичности не проявляли антитоксической активности при отравлении солями тяжелых металлов.

Суммируя биохимические и клинические показатели крови крыс при интоксикации солями тяжелых металлов, можно сделать вывод о значительной антитоксической активности соединений 1, 4 и 5. Причем антитоксическая активность этих соединений при отравлении сульфатом кадмия убывала в направлении 1>4>5. Антитоксический эффект этих соединений при отравлении нитратом свинца уменьшался в направлении 4>5>1. Наконец, при подостром отравлении нитратом ртути были эффективны препараты 1 и 5. В заключение следует отметить изменение антитоксической активности исследованных халькогенорганических соединений в направлении: 1>5>4>2>3>6. Предположительный механизм антитоксической активности халькогенорганических соединений может быть обусловлен, с одной стороны, связыванием ионов тяжелых металлов с атомами серы/селена в составе соединений 1, 4 и 5, а, с другой, инактивацией радикалов кислорода, образованных под действием тяжелых металлов.

Следовательно, антитоксическая активность халькогенорганических соединений зависит от антиоксидантных свойств этих соединений. Соединения 1 и 4 обладали как антиоксидантной, так и антитоксической активностью. А препараты 3 и 6, напротив, проявляли слабые антиоксидантные свойства, обладали собственной токсичностью и поэтому не оказывали антитоксического действия при отравлении солями тяжелых металлов.

Антибактериальная активность халькогенорганических соединений.

Синтез и изучение биологической активности новых антимикробных агентов, к которым бы не развивалась лекарственная устойчивость, является чрезвычайно актуальным в современной биологии и медицине. В связи с этим значительный интерес представляет изучение антибактериальной активности халькогенорганических соединений - аналогов диацетофенонилселенида (ДАФС-25) на клинические штаммы грамположительных (Staphylococcus aureus) и грамотрицательных (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) бактерий. Наименьшей антимикробной активностью обладало селеноорганическое соединение 1, лишенное боковых групп у фенильных радикалов (таблица 2).

Таблица 2.

Антибактериальное действие соединения 1 на клинические штаммы грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов_

Условия Количество колоний на твердых питательных спелах

эксперимента Контроль Опытные группы, концентрация вещества, мг/мл

(п=10) 1 (п=10) 0,1 (п=10) 0,01 (п=10) 0.001 (п=10)

3 30 915,3 ± 105,6 794,4± 95,5 676,4± 73,2* 731,3± 95,4* 753,4± 63,3*

я S 60 842,4 ± 235,2 722,2± 237,3 761,3± 158,6 657,7± 141,2 891,6± 89,5

О [W X 3 к 2 90 906,5 ± 150,4 609,7± 197,5* 753,5± 87,3 713,4± 227,6 786,3± 176,4

V с. CQ 120 820,2 ± 139,6 710,4± 149,2 595,6± 203,7 938,2± 176,5 868,7± 131,3

со 150 824,5 ± 205,4 718,3± 170,4 925,6± 241,4 1026,6± 236,7* 991,4± 80,3*

30 1332,4± 235,3 985,6± 102,2* 1021,4± 119,8 976,3± 87,8* 972,4± 24,6*

8 о С to о о X S я 60 1156,3± 180,3 1059,2± 201,4 971,1± 195,3 966,4± 95,5 983,3± 154,4

5 .5 •S ос « р 90 983,3 ± 123,3 676,1± 128,4* 880,3± 54,7* 828,8± 93,4 675,2± 203,3*

я i. <i) tu «сQ CJ О. ш 120 912,5 ± 151,2 389,4±164,3** 657,4± 206,6* 882,3± 139,4 915,6± 76,2

150 880,4 ± 65,6 158,3± 74,5** 476,2± 220,8* 693,4± 83,4* 771,2± 134,4*

30 937,6± 52,3 1005,6± 131,5 937,5± 37,8 973,3± 202,4 773,3± 91,2*

<J о 3 я 60 882,4 ± 163,3 611,3± 110,4* 895,6± 41,3 789,2± 169,7 892,4± 111,6

-с .о of 90 821,2 ± 118,2 465,4± 156,7* 685,8± 230,4 929,9± 152,6 762,3± 210,3

-с о ¿3 и О. ш 120 804,7 ±291,5 118,6± 76,4** 677,8± 259,6 724,3± 222,4 854,5± 191,2

150 943,3 ± 87,8 114,4± 59,5** 362,3± 86,5** 778,3± 204,4 823,2± 131,4

* -р<0,05 ,** -р< 0,001

Это соединение оказывало выраженное антибактериальное действие только в высокой концентрации 1 мг/мл на штаммы грамотрицательных бактерий, подавляя рост колоний на 18-88% (Е. coli) и 26-82% (P. aeruginosa) в зависимости от времени инкубации 30-150 минут. Рост штаммов S. aureus в присутствии соединения 1

снижался на 20-33% по сравнению с контролем в концентрациях 0,001-1 мг/мл и при инкубации 30-150 минут.

Хлорированный аналог препарата ДАФС-25 (соединение 2) обладал большим антибактериальным действием по сравнению с препаратом ДАФС-25 по отношению к клиническим штаммам золотистого стафилококка, кишечной палочки и синегнойной палочки (таблица 3).

Таблица 3.

Антибактериальное действие соединения 2 на клинические штаммы

грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов_

Условия эксперимента Количество колоний на твердых питательных средах

Контроль (п=10) Опытные группы, концентрация вещества, мг/мл

1 (п=10) 0,1 (п=10) 0,01 (п=10) 0,001 (п=10)

Staphylococcus aureus Время, мин 30 713,4± 152,2 341,3± 139,3* 954,4± 217,6 565,6± 110,5 609,3± 215,4

60 781,2± 154,4 414,4±146,6** 356,7± 161,7* 455,6± 115,4* 537,5±153,4*

90 787,6± 136,6 95,6± 61,4** 318,6± 167,7** 170,2± 70,6** 376,7±207,2*

120 684,7± 166,7 Нет роста 94,3± 65,6** 32,2± 12,4** 201,2±91,3**

150 719,8± 125,6 Нет роста Нет роста Нет роста 61,3± 21,4**

Pseudomonas aeruginosa Время, мин 30 939,8±107,4 563,3± 99,6* 728,4± 158,3* 774,5±122,3* 750,2±248,5

60 900,6 ±57,7 350,3± 52,5** 530,2± 169,5** 677,8±192,3* 629,4±258,5*

90 1067,8±138, 5 118,2± 89,4** 265,4± 137,8** 171,2±136,2** 360,4±127,5* *

120 900,6±62,5 15,6± 5,2** 64,4± 55,6** 188,9±153,4** 349,2± 203,6*

150 869,4± 76,5 Нет роста 19,8± 9,2** 18,2± 14,6** 249,4± 188,6* *

Escherichia coli Время, мин 30 896,7 ±48,5 225,6± 50,6** 564,4±108,2** 836,3±96,5 926,7± 105,5

60 908,9±135,5 276,7± 134,5** 458,2±95,5** 604,3±234,5* 765,6±92,3*

90 982,3± 120,5 98,4± 24,3** 480,3±249,2** 676,7±112,5** 694,4±192,5*

120 787,4±62,5 Нет роста 192,3±125,6* 464,5±158,5* 604,3±156,2*

150 702,3±89,5 Нет роста 169,2±78,4** 371,2±213,4** 347,4±110,5* *

* -р<0,05 ,** -р< 0,001

Наиболее эффективно это соединение подавляло рост колоний золотистого стафилококка на 31-92% (в концентрации 0,001 мг/мл), 42-100% (0,01 мг/мл), 54100% (0,1 мг/мл) и на 52-100% (1 мг/мл) в зависимости от времени инкубации 30-150

минут. Колонии P. aeruginosa также были чувствительны к соединению 2, поскольку инкубирование клинических штаммов P. aeruginosa с этим соединением в течение 30150 минут приводило к подавлению роста колоний на 30-71% (в концентрации 0,001 мг/мл), 18-98% 0,01 мг/мл), 23-98% (0,1 мг/мл) и на 40-100% (1 мг/мл) соответственно.

Наконец, клинические штаммы кишечной палочки были менее чувствительны к соединению 2, тем не менее, отмечалось достоверное снижение числа колоний после инкубации с этим соединением на 16-51% (в концентрации 0,001 мг/мл), 3447% (0,01 мг/мл), 37-76% (0,1 мг/мл) и на 75-100% (1 мг/мл) в зависимости от времени инкубации 30-150 минут (таблица 3). Очевидно, что больший антибактериальный эффект соединения 2 по сравнению с соединением 1 обусловлен наличием двух атомов хлора в пара-положении фенильных заместителей этого соединения.

Фторсодержащий аналог препарата ДАФС-25 (соединение 3) проявлял выраженную антибактериальную активность в широком диапазоне концентраций (от 1 до 0,0001 мг/мл) при разном времени инкубации (30-150 минут) в отношении клинических штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий (таблица 4). Причем антибактериальная активность этого препарата возрастала прямо пропорционально увеличению концентрации и времени инкубации. Так, в низких концентрациях 0,0001-0,01 мг/мл это соединение подавляло рост колоний золотистого стафилококка на 25-100% при инкубации 30-150 минут, а в концентрациях 0,1-1 мг/мл и при всех интервалах инкубации рост колоний S. aureus подавлялся полностью. Инкубация клинических штаммов синегнойной палочки в течение 60-150 минут с соединением 3 в низких концентрациях 0,0001-0,001 мг/мл приводила к подавлению роста колоний на 29-86% по сравнению с контролем.

В концентрациях 0,01-1 мг/мл это соединение подавляло рост колоний Р. aeruginosa на 27-100% при увеличении концентрации этого соединения и в зависимости от времени инкубации (30-150 минут) (таблица 4). Антибактериальная активность препарата 3 в отношении клинических штаммов E.coli возрастала по мере увеличения концентрации (0,0001-1 мг/мл) и времени инкубации (30-150 минут). Длительная инкубация (150 минут) E.coli с данным препаратом во всех концентрациях приводила к полному подавлению роста колоний, а кратковременная инкубация (30 минут) характеризовалась снижением роста колоний на 20-79% при увеличении концентрации соединения 3 от 0,0001 мг/мл до 1 мг/мл. При этом следует отметить, что антибактериальная активность соединения 3 в отношении клинических штаммов золотистого стафилококка, синегнойной палочки и кишечной палочки была значительно выше, чем у соединений 1 и 2, что можно объяснить наличием двух

атомов фтора в пара-положении фенильных заместителей соединения 3. Фтор является самым электроотрицательным элементом и мощным окислителем. Вероятно, подвергаясь метаболическим превращениям в клетках бактерий, препарат 3 запускает свободно-радикальные процессы, приводящие в конечном итоге к гибели клеток.

Таблица 4.

Антибактериальное действие соединения 3 на клинические штаммы

грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов_

Условия эксперимента Количество колоний на твердых питательных средах

Контроль (п=10) Опытные группы, концентрация вещества, мг/мл

1 (п=10) 0,1 (п=10) 0,01 (п=10) 0,001 (п=10) 0,0001 (п=10)

Staphylococcus aureus к s s of s d> Cl. ffl 30 959,9± 42,5 78,8± 24,4** 74,4± 14,5** 260,4 ± 59,5** 563,4± 13,5** 715,6± 204,4*

60 866,4 ± 60,3 21,3± 10,5** 3,3± 1,1** 196,6± 94,3* 432,4± 58,5** 575,6± 185,8*

90 891,2 ± 189,7 Нет роста Нет роста 123,3± 49,7** 211,2± 76,7** 344,4± 83,6*

120 875,6 ± 170,4 Нет роста Нет роста 11,2± 9,3** 114,4± 96,7** 294,2± 176,4*

150 904,3± 43,5 Нет роста Нет роста Нет роста 13,2± 3,3** 163,3± 76,2**

Pseudomonas aeruginosa я я s о? s a> n. CQ 30 829,6± 54,4 183,5± 141,2** 197,2± 91,4** 606,3± 103,5* 729,4± 166,7 688,8± 203,4

60 985,6 ± 98,5 25,2± 13,1** 77,8± 34,3** 389,4± 148,5** 693,3± 154,5* 675,6± 190,4*

90 849,2 ± 62,5 Нет роста 15,2± 4,4** 181,2± 64,4** 433,3± 107,3* 348,4± 91,2**

120 805,3 ± 89,5 Нет роста 7,6± 3,3** 73,4± 55,6** 173,3± 50,2** 159,7± 82,5**

150 829,5 ± 51 Нет роста Нет роста 20,4± 8,2** 166,2± 74,6** 104,5± 65,6**

Escherichia coli 35 S 2 of S tu Q. CQ 30 967,8± 44,5 200,6± 155,5** 222,3± 131,5** 358,4± 193,5** 570,3± 280,2** 775,6± 207,5*

60 896,7 ± 96,2 28,5± 21,2** 78,6± 62,4** 204,3± 162,5** 446,4± 269,5* 575,6± 197,5**

90 1003,4 ± 97,3 Нет роста Нет роста 54,2± 43,1** 225,7± 137,5** 498,2± 210,1**

120 877,2 ± 82.5 Нет роста Нет роста Нет роста 90,2± 56,6** 69,2± 25,2**

150 893,4 ± 79,5 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста 57,3± 36,3**

* - р<0,05 , ** - р< 0,001

Особый интерес представляло соединение 4 - нитропроизводное препарата ДАФС-25, поскольку наличие двух нитрогрупп в мета-положении фенильных радикалов соединения 4 позволяет проводить аналогию с нитрофуранами. Однако селеноорганическое соединение обладало гораздо меньшей антибактериальной

активностью по сравнению с нитрофуранами. Препарат 4 обладал антибактериальной активностью только в высоких концентрациях (0,1 и 1 мг/мл), тогда как в малых концентрациях 0,01 и 0,001 мг/мл антибактериальное действие этого препарата было незначительным или недостоверным (таблица 5).

Таблица 5.

Антибактериальное действие соединения 4 на клинические штаммы _грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов

Количество колоний на твердых питательных средах

мента Контроль Опытные группы,

(п=10) концентрация вещества, мг/мл

1 (п=10) 0,1 (п=10) 0,01 (п=10) 0,001 (п=10)

30 974,4 ± 92,3± 455,1± 891,3± 1125,6±

90,5 31,1** 62,5** 62,2* 105,5*

г 60 956,3 ± 69,7± 294,2± 695,4± 1017,4±

3 о X 91,2 61,3** 69,5** 137,5* 107,5

3 5 90 960,5 ± Нет 339,8± 903,3± 905,2±

о § 99,3 роста 141,5** 149,4 54,1

о. 03 120 942,4 ± Нет 151,2± 876,2± 71,5 976,1±

132,5 роста 91,5** 210,1

11 150 1023,3 ± Нет Нет 797,6± 1138,2±

148,4 роста роста 213,5 87,5

30 1002,2 ± 83,3± 298,2± 661,2± 975,4±

о 70,3 55,5** 46,5** 109,7** 140,4

*ВЬ 60 1034,4 ± 76,2± 278,9± 641,3± 1016,4±

Я я 138,7 52,1** 83,4** 128,5** 65,5

о S 90 947,3 ± 9,2± 170,1± 462,5± 894,4±

§ £ 94,5 5,3** 46,5** 180,1* 50,2

5 о. а 120 977,6 ± Нет 74,5± 627,2± 762,4±

138,5 роста 47,4** 136,4** 125,5*

150 885,2 ± Нет 6,2± 378,2± 803,2±

о. 86,5 роста 3,1** 259,8* 162,5

30 1081,2 ± 261,3± 472,4± 654,2± 1020,4±

95,5 46,5** 65,5** 132,5** 49,2

60 971,3 ± 66,4± 276,3± 485,6± 980,7±

о X я 63,4 32,2** 30,1** 198,5* 99,9

с ^ 90 1046,3 ± 50,1± 156,2± 368,2± 977,2±

'С s! 153,5 41,4** 65,7** 124,5** 151,5

1 о, 03 120 898,7 ± Нет 82,6± 185,4± 779,4±

3 130,1 роста 64,5** 90,5** 126,5

150 830,3 ± Нет 62,3± 30,1± 615,1±

128,5 роста 35,2** 11,1** 118,5*

* - р<0,05 , ** - р< 0,001

Например, по мере увеличения времени инкубации (30-150 минут) клинических штаммов S. aureus с соединением 4 отмечалось значительное подавления роста колоний на 53-100% (0,1 мг/мл) и на 91-100% (1 мг/мл).

Грамотрицательные бактерии E.coli и Р. aeruginosa были чувствительны к концентрации 0,01 мг/мл этого соединения. Рост колоний синегнойной палочки снижался на 34-57% по мере увеличения времени инкубации 30-150 минут. Инкубация штаммов Р. aeruginosa с соединением 4 в концентрациях 0,1 мг/мл и 1 мг/мл приводила к подавлению роста колоний на 70-99% и 92-100% соответственно.

Антибактериальное действие соединения 4 на клинические штаммы E.coli выражалось снижением роста колоний на 39-96% (0,01 мг/мл), 56-93% (0,1 мг/мл) и на 76-100% (1 мг/мл) соответственно. Следует также отметить меньшую антибактериальную активность препарата 4 по сравнению с препаратами 2 и 3. Тем не менее, несмотря на низкую антибактериальную активность препарата 4 в малых концентрациях, необходимо отметить, что она была гораздо выше, чем у препарата 1 - ДАФС-25, что, безусловно, зависело от наличия в структуре препарата 4 двух нитрогрупп. Вероятно, нитрогруппы в составе препарата 4 подвергаются окислению под действием бактериальных ферментов, примерно так же, как это происходит с нитрогруппами нитрофуранов, но в значительно меньшей степени, поскольку антибактериальная активность нитрофуранов на несколько порядков выше, чем у препарата 4.

Наконец, теллурсодержащий аналог препарата ДАФС-25 (соединение 6) оказывал выраженное антибактериальное действие на клинические штаммы золотистого стафилококка, кишечной палочки и синегнойной палочки, что выражалось в снижении роста колоний S. aureus на 36-47% (0,0001 мг/мл), 61-98% (0,001 мг/мл), 82-100% (0,01 мг/мл) или сопровождалось полным подавлением роста колоний при инкубации с данным соединением в концентрациях 0,1 мг/мл и 1 мг/мл в течение 30-150 минут (таблица 6).

Антибактериальная активность теллуроорганического соединения на клинические штаммы Р. aeruginosa характеризовалась подавлением роста колоний на 30% (0,001 мг/мл), 58-87% (0,01 мг/мл) и на 92-100% (0,1-1 мг/мл). Инкубация клинических штаммов E.coli с данным препаратом в течение 30-150 минут приводила к уменьшению числа колоний по сравнению с контролем на 38-78% (0,001 мг/мл), 5893% (0,01 мг/мл) или к полному подавлению роста колоний (0,1-1 мг/мл) (таблица 6). Достаточной высокие антибактериальные свойства соединения 6 по сравнению с селеноорганическими соединениями обусловлены наличием атома теллура в его структуре. Согласно литературным данным, отмечается существенное понижение энергии связей «Углерод-Халькоген» в ряду S, Se, Те, поэтому связь «С-Те» разрывается легче, чем связи, образованные другими халькогенами и происходит освобождением атома теллура в виде неорганического теллура (IV), который значительно токсичнее своей органической формы.

Таблица 6.

Антибактериальное действие соединения 6 на клинические штаммы

Условия Количество колоний на твердых питательных средах

эксперимента Контроль Опытные группы, концентрация вещества, мг/мл

(п=10) 1 (п=10) 0,1 (п=10) 0,01 (п=10) 0,001 (п=10) 0,0001 (п=10)

30 972,3 ± 140,1 Нет роста 14,2± 11,1** 179,4± 36,4** 379,7± 93,3** 620,1± 55,6**

а ь. а Q a 60 983,3 ± 86,5 Нет роста Нет роста 55,6± 40,1** 197,4± 84,5** 674,2± 164,5**

ä о У § s s о?" 5 о 90 977,2 ± 86,5 Нет роста Нет роста 58,7± 46,4** 111,4± 26,2** 724,2± 182,3*

£ & Со СО 120 869,4 ± 68,5 Нет роста Нет роста Нет роста 50,1± 42,2** 515,6± 271,4*

150 789,9 ± 84,5 Нет роста Нет роста Нет роста 16,4± 11,1** 422,4± 168,2**

а 30 907,4± 80,2 34,3± 14,2** 74,4± 40,1** 378,4± 52,6** 729,4± 157,5* 1041,4± 207,5

0 с 1 3 60 862,4 ± 103,5 Нет роста 98,7± 87,6** 321,2± 76,7** 785,4± 115,6 976,3± 100,2

а ьэ а с 2 а> 90 880,3 ± 90,2 Нет роста 20,2± 12,1** 319,9± 98,4** 619,2± 206,5* 1082,3± 150,4

5 Qi CQ 120 892,2 ± 98,4 Нет роста Нет роста 270,2± 129,7** 645,3± 135,6* 1066,7± 135,6*

сС 150 879,9 ± 61,5 Нет роста Нет роста 114,3± 56,2** 650,1± 207,5* 947,4± 272,3

30 906,8 ± 86,3 Нет роста 67,4± 49,3** 385,4± 43,2** 562,2± 54,5** 872,2± 26,1

"о Я 60 903,4 ± 72,2 Нет роста Нет роста 304,2± 90,5** 547,5± 67,8** 776,7± 163,5*

•S -5 .о С и a вГ s <и 90 938,3 ± 89,9 Нет роста Нет роста 266,4± 134,5** 385,4± 86,9** 713,2± 154,1*

Чз «3 Я 120 926,4 ± 103,3 Нет роста Нет роста 178,2± 60,5** 390,1± 133,5** 724,2± 194,5*

150 936,2 ± 94,1 Нет роста Нет роста 67,3± 48,4** 202,2± 55,5** 729,3± 214,5

■ р<0,05 ,**-р< 0,001

Однако грамотрицательные бактерии родов Escherichia и Pseudomonas способны обезвреживать токсичные для них оксианионы теллурита до элементарного

теллура, которые нетоксичны (Choudhuiy Н. G. et al., 2011). Этим можно объяснить меньшую антимикробную активность теллурсодержащего препарата 6 в отношении клинических штаммов К coli и Ps. aeruginosa в сравнении с S. аигешКромс того, следует отметить, что антибактериальная активность препарата 6 достаточно высока и сопоставима с активностью препарата 3 (фторсодержащего аналога препарата ДАФС) в отношении клинических штаммов золотистого стафилококка. Однако препарат 3 был самым эффективным среди исследованных в отношении клинических штаммов Е. coli и Ps. aeruginosa.

Ввиду низкой антимикробной активности сероорганических препаратов (Deidda D. et. al., 1997; Nozawa R. et al., 1989) в данной серии экспериментов не проводилось исследование антибактериальной активности серосодержащего аналога препарата ДАФС-25 (соединение 5).

Следовательно, суммарная антибактериальная активность исследованных халькогенорганических соединений на клинические штаммы грамположительных и грамотрицательных бактерий снижалась в направлении: 3>6>2>4>1>5.

Элементы структурного подобия молекул как предпосылка сходного биологического действия халькогенорганических соединений и глюкокортикоидов. В предсказательных целях нами дана квантовохимическая трактовка структурного сходства препарата ДАФС-25 и глюкокортикоидов (преднизона и преднизолона). Не имея информации о механизме и энергетике взаимодействия глюкокортикоидов и аналогичных по физиологическому действию веществ с рецепторами живых организмов, можно, тем не менее, полагать, что взаимная комплементарность молекул эффектора и рецептора в значительной степени определяется принципами топологического и электростатического соответствия. Чтобы молекула эффектора должным образом встраивались в структуру рецептора, необходимо ее геометрическое соответствие полости последнего.

Молекулярному распознаванию, взаимодействию биологически активных веществ с рецепторами биосубстратов предшествует отбор химических соединений по электростатическому механизму.

На рисунке 10 представлены химическое строение гормонального препарата преднизолон и селеноорганического соединения ДАФС-25 в оптимизированной форме:

СН2ОН

ДАФС-25 Преднизолон

ДАФС-25 в оптимизированной форме Преднизолон

Рис. 10. Черты сходства гормонального препарата преднизолон и

селеноорганического соединения ДАФС-25 в оптимизированной форме

В качестве дескрипторов геометрии нами выбраны величина ао, характеризующая размер молекулы в целом, молярный объем У„„ а также расстояния между атомами углерода, связанными с кислородными атомами (/,), и между самими атомами кислорода (/2). Величины 11 и /2 в значительной степени характеризуют топологию (форму) молекулы, во всяком случае, дают прямую информацию о расстоянии между полярными реакционноспособными карбонильными группами (или между группами С=0 и С-ОН в молекуле преднизолона), участие которых в связывании эффектора с рецептором наиболее вероятно. Как интересная характеристика электрических свойств и геометрии молекул, мера их электростатического (ион-дипольного, диполь-дипольного) взаимодействия с другими молекулярными системами использован дипольный момент (ц).

Как видно из всех рассмотренных нами 1,5-дикарбонилов молекула препарата ДАФС-25 (1,5-дифенил-3-селенпентадион-1,5) наиболее близка (особенно это касается величин 1\ и /2) к молекулам глюкокортикоидов преднизона и преднизолона как по размеру (а0, ^ш), так и по расстояниям (/, и /2) между полярными реакционноспособными группами С=0, С-ОН, которые потенциально могут участвовать в связывании с рецептором как посредством электростатических сил, так и за счет водородных связей или более глубокого химического взаимодействия (таблица 7).

Таблица 7.

Значения а0, Ут, /ь /2 и ц для молекул 1,5-дикарбонильных соединений и

кортикостероидов, рассчитанные на уровне теории ВЗЬУР/б-З) Щ(с1,р)

Соединение до, А V ' т» ст3-тоГ' />,А /2, А

1,5-дифенилпентадион-1,5 4,90 160,790 5,069 6,504 0,162

1,5-дифенил-З-тиапентадион-1,5 5,09 183,491 3,413 3,386 0,882

1,5-дифенил-З-селенпентадион-1,5 5,45 229,866 5,267 7,021 3,711

Преднизон * 5,70 266,403 5,162(4,777) 6,504(6,120) 4,743

Преднизолон * 5,84 287,321 5,037(4,816) 6,825(5,816) 4,198

* Сначала приводится расстояние между двумя атомами углерода или кислорода, входящими в состав экзоциклических групп С=0 или С-ОН, а в скобках - расстояние между соответствующими атомами экзоциклической и внециклической групп

Применительно к стероидным гормонам (преднизон и преднизолон) в качестве величин ¡1 и 12, близких к таковым в молекуле ДАФС-25, выступают расстояния между атомами, входящими в состав экзоциклических групп С=0 или С-ОН. Как молекулу ДАФС-25, так и системы преднизон и преднизолон отличают высокие значения дипольных моментов, причем величины моментов диполей для этих соединений сопоставимы между собой и заметно отличны от таковых для 1,5-дифенилпентадион-1,5 и 1,5-дифенил-3-тиапентадион-1,5.

Таким образом, налицо как геометрические {а0,Ут, 1\, /2 и (I), так и электростатические (р) предпосылки сходного характера биологической активности препарата ДАФС-25 и глюкокортикоидов.

Квантовохимический прогноз, основанный на установлении электронно-топологического подобия молекул препарата ДАФС-25 и кортикостероидов, подтвержден нами экспериментально.

Влияние препарата ДАФС, его производных и преднизолона на показатели углеводного обмена экспериментальных животных. Учитывая полученное нами подтверждение структурного подобия препарата ДАФС и глюкокортикоидов, нами было проведено изучение влияния селеноорганического препарата 1,5-дифенил-3-селенпентадиона-1,5 (ДАФС-25), его производных и гормонального препарата преднизолона на показатели углеводного обмена у самцов белых беспородных мышей.

Известно, что преднизолон обладает выраженным дозозависимым действием на метаболизм углеводов, белков и жиров. Он стимулирует глюконеогенез, способствует захвату аминокислот печенью и почками и повышает активность ферментов глюконеогенеза. В печени преднизолон усиливает депонирование

гликогена, стимулируя активность гликогенсинтетазы (Lecocq F.R. et al., 1964). Кроме того, данный гормон подавляет захват глюкозы жировыми клетками, что приводит к активации липолиза (Fain J.N., Czech М.Р., 1975).

На примере другого синтетического глюкокортикоида — дексаметазона -показано, что его пероральное введение индуцирует экспрессию гена киназы пируватдегидрогеназы, следствием чего является снижение активности этого мультиферментного комплекса, замедление процесса окисления глюкозы и накопление пирувата и глюкозы в цитозоле клеток (Qi D. et al., 2004). Кроме того, дексаметазон уменьшает фосфорилирование фермента гликогенсинтазы, что приводит к восстановлению ее активности. Избыток глюкозы (при наличии активной гликогенсинтазы) используется для синтеза гликогена в печени, скелетных мышцах и миокарде (Qi D. et al., 2004; Puthanveetil P. et al., 2008). Также следует отметить, что глюкокортикоиды увеличивают экспрессию ферментов глюконеогенеза - глюкозо-6-фосфатазы и фосфоенолпируваткарбоксикиназы, что влечет за собой усиление реакций глюконеогенеза в печени, выход свободной глюкозы в кровь и развитие гипергликемии (Yabaluri N., Bashyam M.D., 2010). Субстратами для реакций глюконеогенеза служат аминокислоты, образующиеся в процессе катаболизма тканевых белков (Wilcke J.R., Davis L.E., 1982; Jin J.Y., Jusko W.J., 2009). Гипергликемия усиливается за счет снижения поступления глюкозы в клетки периферических тканей (Baxter J.D., 1976; Andrews R.C., Walker B.R., 1999; Vila G. et al., 2010).

Таблица 8 содержит результаты некоторых показателей углеводного обмена контрольной и экспериментальных групп животных.

Полученные результаты демонстрируют стимулирующее действие гормонального препарата преднизолон и селеноорганического соединения ДАФС-25 (соединение 1) на показатели углеводного обмена экспериментальных животных. Активность одного из ключевых ферментов глюконеогенеза глкозо-6-фосфатазы печени достоверно увеличивалась у мышей обеих экспериментальных групп: на 128,9% (преднизолон) и 60,7% (ДАФС) соответственно по сравнению с контролем (р<0,05). Однако активность данного фермента у мышей, получавших хлор-, фтор- и нитропроизводные препарата ДАФС-25 (соединения 2, 3 и 4), снижалась на 50%, 41,9% и 49,1% по сравнению с контролем.

Активность другого фермента глюконеогенеза — фруктозо-1,6-бисфосфатазы -достоверно увеличивалась у мышей, получавших per os ДАФС-25 (на 46,7%), а действие преднизолона приводило к увеличению активности фермента на 130%. Применение нитропроизводного препарата ДАФС (соединение 4) сопровождалось снижением активности этого фермента на 40%.

Таблица 8.

Влияние препарата ДАФС, его производных и преднизолона на показатели обмена _углеводов и белков обмена экспериментальных животных_

Показатели Контроль Преднизолон Селеноорганические соединения

обмена (п=12) (п=8) 1 (п=10) 2 (п=10) 3 (п=10) 4 (п=10)

углеводов и белков

Глюкозо-6- 11,2 ± 1,1 25,5 ±2,6* 17,9 ± 5,6 ± 6,5 ± 5,7 ±

фосфатаза 2,4* 0,7* 0,7* 0,9*

Фруктозо-1,6-бисфосфатаза 3,0 ±0,4 6,9 ± 0,7* 4,4 ± 0,6* 2,3 ± 0,5 3,8 ± 0,5 1,8 ± 0,4*

гликоген печени 3,6 ±0,3 6,2 ±0,4* 5,3 ± 4,1 ± 1,9 ± 1,9 ±

0,3* 0,6 0,2* 0,2*

гликоген крови 3,9 ± 0,5 6,1 ±0,3* 5,3 ± 4,2 ± 5,5 ± 4,5 ±

0,4* 0,6 0,2* 0,4

глюкоза 3,4 ± 0,3 6,8 ±0,3* 4,8 ± 2,9 ± 2,8 ± 2,0 ±

0,2* 0,3 0,3 0,2*

пируват 10,8 ± 1,0 5,7 ±0,5* 6,6 ± 0.3 * 7,9 ± 0,5* 7,5 ± 0,8* 8,1 ± 0,8*

АлАТ 112,8 ±6,5 283,7 ± 11,2* 271,3 ± 84,8 ± 88,1 ± 148,7 ±

15,5 * 4,9* 6,4* 8,7*

АсАТ 174,7 ± 7,2 191,7 ± 13,5 183,0 ± 134,7 ± 148,5 ± 168 ±

8,8 6,7* 9,3 11,5

* - р <0,05 по сравнению с контролем.

Активность АлАТ в плазме крови также увеличивалась на 151,5% (преднизолон), 140,5% (ДАФС-25) и 31,8% (ДАФС(Ш2)2) соответственно (р<0,05). Однако введение per os галогенопроизводных препарата ДАФС-25 (соединений 2 и 3) сопровождалось падением активности АлАТ на 24,8% и 21,9% соответственно.

Следует отметить, что активность другой аминотрансферазы АсАТ оставалась неизменной почти у всех экспериментальных животных (только у мышей, получавших per os соединение 2, активность АсАТ снижалась на 22,9%).

Значительное увеличение активности АлАТ сопровождалось достоверным снижением концентрации пиру вата в плазме крови на 47,2% (преднизолон), 38,9% (соединение 1 - ДАФС), 26,9% (соединение 2), 30,6% (соединение 3) и 25,0% (соединение 4) соответственно по сравнению с контролем. Это явление можно объяснить усилением распада тканевых белков, обратимым трансаминированием пирувата до аланина при участии фермента АлАТ, включением пирувата/аланина в глюкозо-аланиловый цикл, а в дальнейшем и в процесс новообразования глюкозы в печени.

Следует также отметить, что концентрация глюкозы в плазме крови увеличивалась только у мышей первой и второй экспериментальных групп на 101,0% (преднизолон) и 40,6% (ДАФС-25) соответственно по сравнению с контролем. У

мышей, получавших per os соединение 4, концентрация глюкозы в плазме крови снижалась на 41,2% (р<0,05).

Гормоноподобное действие соединения ДАФС-25 также подтверждалось увеличением содержания гликогена в печени и крови. Следует отметить, что содержание гликогена в печени возрастало только у мышей, получавших преднизолон (на 72,2%) и ДАФС-25 (на 47,2%) соответственно. Вместе с тем применение селеноорганических соединений 3 и 4 сопровождалось снижением содержания гликогена в печени на 47,2% (р<0,05). Концентрация гликогена в крови возрастала на 53,3% (преднизолон), 32,0% (ДАФС) и 41,0% (препарат 3) соответственно по сравнению с контролем.

Полученные нами данные демонстрируют усиление процессов глюконеогенеза и синтеза гликогена в печени у мышей, получавших гормональный препарат преднизолон и селеноорганический препарат ДАФС-25 (соединение 1). При этом глюкокортикоидный препарат вызывал более выраженное усиление углеводного обмена, чем органическое соединение селена. Учитывая приведенные выше результаты квантовохимических расчетов, отражающих геометрические и электростатические предпосылки сходного характера биологической активности препарата ДАФС-25 и глюкокортикоидов, можно предположить, что диацетофенонилселенид в оптимизированной конформации способен взаимодействовать с рецепторами глюкокортикоидов и через них оказывать гормоноподобное действие на клетки экспериментальных животных.

Селеноорганические соединения 2, 3 и 4 - производные препарата ДАФС-25 -подобного эффекта не оказывали, вероятно, это связано с наличием боковых групп, которые могут препятствовать взаимодействию этих соединений с глюкокортикоидными рецепторами.

В заключение необходимо подчеркнуть, что наличие в структуре препарата ДАФС-25 атома селена и 1,5-дифенилпентадиона-1,5 вносит решающий вклад в биологическую активность этого соединения и определяет его гормоноподобное действие.

Результаты предполагаемой биологической активности

халькогенорганических соединений, полученные с использованием компьютерной программы PASS, лишь отчасти совпадали с полученными нами данными. Теоретические расчеты предполагали высокую вероятность рациопротекторного, гепатопротекторного и антибактериального действия всех исследованных нами соединений (Ра > 0,7), что соответствует описанным ранее результатам. Однако, несмотря на полученные нами данные по превентивному антитоксическому действию соединений селена при интоксикации солями кадмия, ртути и свинца, потенциальная

способность (Ра) предотвращать отравление тяжелыми металлами для всех соединений была невелика (Ра<0,7). Несоответствие полученных нами результатов с показателями потенциальной биологической активности, рассчитанной компьютерной программой PASS, вероятно, связано с наличием в структуре исследованных соединений новых дескрипторов. Так, для соединений 1, 2, 3 и 4 обнаружены два новых дескриптора, для соединения 6 — три и лишь серосодержащий аналог ДАФС (соединение 5) не содержал новых дескрипторов.

Учитывая наличие в исследованных халькогенорганических соединениях двух и более десктрипторов, результаты предполагаемой биологической активности этих соединений следует считать приблизительными (Филимонов Д.А., Поройков В.В., 2006).

ВЫВОДЫ

1. Антиоксидантная активность халькогенорганических соединений убывает в ряду: ДАФС(8е)>ДАФС(Ы02)2^ДАФС(5^ДАФС(С12)>ДАФС(Т2)>ДАФС(Те). Наличие боковых радикалов у фенильных заместителей, а также замена атома селена на теллур в составе халькогенорганических соединений подавляет процессы свободнорадикального окисления липидов во всех исследованных тканях белых беспородных мышей: мозге > легких > эритроцитах > плазме крови > печени > почках.

2. Антитоксическая активность халькогенорганических соединений при интоксикации солями тяжелых металлов (CdS04, Hg(N02)2 и Pb(N02)2) зависит от антиоксидантных свойств исследованных соединений и снижается в направлении: ДАФС(8е)> ДАФС(8)> ДАФС(Ы02)2)>ДАФС(С12)>ДАФС(Р2)> ДАФС(Те).

3. Препараты ДАФС(Р2) и ДАФС(Те) значительно подавляют рост колоний клинических штаммов Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa даже в низких концентрациях 0,0001-0,001 мг/мл, что соответствует результатам компьютерного прогнозирования с использованием программы PASS. Меньшую антибактериальную активность проявляет препарат ДАФС(С12). Наличие атомов хлора и фтора у фенильных заместителей, а также замена атома селена на теллур усиливают антибактериальную активность халькогенорганических соединений, которая убывает в ряду: ДАФС(Р2)>ДАФС(Те)>ДАФС(С12)>ДАФС(К02)2>ДАФС(8е)>ДАФС(8).

4. Препарат ДАФС-25 в отличие от других халькогенорганических соединений стимулирует глюконеогенез и гликогеногенез у экспериментальных животных подобно глюкокортикоидному препарату преднизолону.

5. Молекула препарата ДАФС-25 наиболее близка по структуре к глюкокортикоидам преднизону и преднизолону: размеру и расстояниям между полярными реакционноспособными группами С=0, С-ОН, которые потенциально могут участвовать в связывании с рецептором.

6. В ряду халькогенорганических соединений, лишенных боковых заместителей, но содержащих гетероатомы халькогенов - ДАФС(8е), ДАФС(8), ДАФС(Те), а также в ряду производных ДАФС-25, содержащих боковые заместители -ДАФС(Ж>2)2, ДАФС(С12), ДАФС(Р2), снижаются антиоксидантная и антитоксическая активности, возрастает антибактериальное действие.

7. Теоретически обоснован и экспериментально подтвержден новый подход к пониманию лиганд-рецепторного взаимодействия, в основу которого положено

представление о структурно-функциональном подобии молекул, относящихся к различным классам органических соединений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Бабушкина, И. В. Действие селеноорганического соединения на клинические штаммы Staphylococcus aureus / И. В. Бабушкина, Д. М. Пучиньян, В. Б. Бородулин, Е. П. Меркулова, Н. Ю. Русецкая, Б. И. Древко // Вестник РУДЫ, серия Медицина. - 2009. - № 4. С. 336-339.

2. Меркулова, Е. П. Изучение влияния группы селеноорганических соединений на биохимические показатели крови мышей / Е. П. Меркулова, Б. И. Древко, Н. Ю. Русецкая, А. Н. Мольченкова, И. А. Горошинская, В. Б. Бородулин // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. -2010 - № 4. - С. 92-95.

3. Русецкая, Н. Ю. Антитоксическое действие органических соединений селена, серы и теллура при отравлении азотнокислой ртутью белых мышей / Н. Ю. Русецкая, Е. П. Меркулова, В. Б. Бородулин, Б. И. Древко, И. А. Горошинская // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки.-2010. №5.-С. 69-71.

4. Русецкая, Н. Ю. Сравнительная характеристика антибактериальной активности селеноорганических препаратов на клинические штаммы золотистого стафилококка / Н. Ю. Русецкая, В. Б. Бородулин, С. А. Коннова, И. В. Бабушкина, Г. Б. Вайнер // Известия Саратовского университета. Новая серия. Химия. Биология. Экология. 2011. - Т. 11.- Вып. 1. - С. 62-66.

5. Русецкая, Н. Ю. Антитоксическое действие селеноорганических соединений при отравлении нитратом свинца самцов белых крыс / Н. Ю. Русецкая, В. И. Дьякова, В. Н. Чупис, Б. И. Древко, Н. В. Емельянова, В. А. Мартьянова, Я. В. Бородулин, В. Б. Бородулин // Теоретическая и прикладная экология. — 2012. -№2. — С. 59-65.

6. Русецкая, Н. Ю. Антибактериальная активность селеноорганического соединения диацетофенонилселенид и его хлорпроизводного на клинические штаммы синегнойной палочки / Н. Ю. Русецкая, И. А. Горошинская, В. Б. Бородулин, Д. П. Димидов, Я. В. Бородулин // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. - 2012. - № 4. - С. 69-72.

7. Русецкая, Н. Ю. Сравнительная антиоксидантная активность селеноорганического соединения ДАФС-25 и его хлорпроизводного в органах мышей с различной оксидорезистентностью / Н. Ю. Русецкая, В. Б. Бородулин, И. А. Горошинская, В. А. Мартьянова, Я. В. Бородулин, А. П. Димидов // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки.-2013.-№ 2.-С. 52-56.

8. Русецкая, Н. Ю. Сравнительная антиоксидантная активность селеноорганического соединения диацетофенонилселенид и его нитропроизводного в органах и тканях мышей с различной оксидорезистентностью / Н. Ю. Русецкая, В. Б. Бородулин, А. В. Саратцев, Я. В. Бородулин // Фундаментальные исследования. - 2013. № 4 (часть 1). С. 125129.

9. Бородулин, В. Б. Рактопамин, преднизолон и диацетофенонилселенид: структурное сходство и биологическая активность / В. Б. Бородулин, Н. Ю. Русецкая // Фундаментальные исследования. - 2013. - №4. - С. 1124-1127.

10. Русецкая, Н. Ю. Антибактериальное действие селеноорганического препарата диацетофенонилселенида и его галогенопроизводных на клинические штаммы Escherichia coli / Н. Ю. Русецкая, Д. П. Димидов, А. В. Саратцев, И. А. Горошинская, В. Б. Бородулин // Современные проблемы науки и образования. -2013. - № 3. URL: www.science-education.ru/109-9367.

11. Русецкая, Н. Ю. Антибактериальное действие фторсодержащего селеноорганического препарата на клинические штаммы Staphylococcus aureus / Н. Ю. Русецкая, Д. П. Димидов, А. В. Саратцев, И. А. Горошинская, В. Б. Бородулин // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 6. - С. 1432-1435.

12. Русецкая, Н. Ю. Антибактериальное действие теллурорганического соединения на клинические штаммы Escherichia coli / Н. Ю. Русецкая, А. В. Саратцев, Б. И. Древко, И. А. Горошинская, В. Б. Бородулин // Современные проблемы науки и образования.-2014.-№ 1; URL: http://www.science-education.ru/115-12006.

13. Русецкая, Н. Ю. Гипотетическая связь между метаболизмом селена и углеводным обменом / Н. Ю. Русецкая // Современные проблемы науки и образования. - 2014. -№ 2; URL: www.science-education.ru/116-12266.

Изобретения

14. Бородулин, В. Б. Средство для лечения и профилактики отравлений соединениями тяжелых металлов / В. Б. Бородулин, Н. Ю. Фомина (Русецкая), О. В. Федотова, Я. Б. Древко, А.Н. Мольченкова. Патент №016974 от 26.04.2007.

15. Древко, Б. И. 2,6-дифенил-4-(п-метоксифенил)-4Н-селенопиран - средство для лечения и профилактики отравлений соединениями ртути / Б. И. Древко, В. Б. Бородулин, Я. Б. Древко, Н. Ю. Русецкая, Я. В. Бородулин, В. И. Рагузина, И. В. Бабушкина, А. Б. Иванов //Патент №2011118470/15 от 06.05.2011.

Авторские свидетельства

16. Бабушкина, И. В. Кювета для выращивания микроорганизмов / И. В. Бабушкина, В. Б. Бородулин, А. М. Гнетнев, Е. Г. Чеботарева, Ю. И. Кирова, Н. Ю. Фомина (Русецкая) // Свидетельство на полезную модель № 22478 от 21.11.2001.

Монография

17. Глыбочко, П. В. Нитрофураны: химическое строение и биологическая активность / П. В. Глыбочко, А. А. Свистунов, В. Б. Бородулин, Н. Ю. Русецкая // Саратов: Издательство Саратовского медицинского университета, 2010 — 199 с.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

18. Русецкая, Н. Ю. (Фомина, Н. Ю.) Изучение антитоксического действия некоторых селеноорганических препаратов при отравлении азотнокислой ртутью / Н. Ю. Фомина (Русецкая), Е. П. Меркулова, Ю. С. Дудакова, И. А. Клименко // Молодежь и наука: итоги и перспективы. Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. Саратов, 2007. - С. 61-62.

19. Русецкая, И. Ю. (Фомина, Н. Ю.) Изучение антитоксического действия селеноорганического препарата «Селенес» при отравлении азотнокислой ртутью / Н. Ю. Фомина (Русецкая) // Астраханский медицинский журнал. — 2007. — Т. 2.-№2.-С. 195.

20. Хохлова, М. С. Изменение биохимических показателей сыворотки крови при действии 1,5-дифенил-3-тиапентадиона-1,5 в отношении солей кадмия / М. С. Хохлова, Е. П. Меркулова, Н. Ю. Фомина (Русецкая) // Аспирантские чтения. Выпуск 2, - Саратов: Изд-во СГМУ -2008.-С. 156-157

21. Жук, А. Н. Нормализация биохимических показателей сыворотки крови при действии селенсодержащего препарата / А. Н. Жук, Е. П. Меркулова, Н. Ю. Фомина (Русецкая) // Аспирантские чтения выпуск 2, - Саратов: Изд-во СГМУ-2008.-С.155-156.

22. Русецкая, Н. Ю. Изучение гормоноподобного действия препарата ДАФС-25 / Н. Ю. Русецкая // Молодежь и наука: итоги и перспективы : материалы межрегион, науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием. -

Саратов: Изд-во Сарат. мед.ун-та, 2008. - С. 96.

23. Меркулова, Е. П. Изучение влияния селеноорганического препарата на показатели крови белых беспородных мышей при отравлении тяжелыми металлами / Е. П. Меркулова, Н. Ю. Русецкая, В. Б. Бородулин // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии: Росс, конф., посвященная 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица. Челябинск. 2009. - С. 23 8-241.

24. Русецкая, Н. Ю. Изучение антиоксидантной активности теллуроорганического соединения in vitro и in vivo / Н. Ю. Русецкая, О. Ю. Финашкина, А. Б. Шпак // Материалы 70 науч.-практ. конференции студентов и молодых ученых СГМУ. Саратов. 2009.-С. 84.

25. Русецкая, Н. Ю. Антиоксидантное действие селеноорганических соединений in vivo / Н. Ю. Русецкая, В. Б. Бородулин // Сборник научных работ 2-ой международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика». 2010. -Т. 1. - № 2. - С. 100-101.

26. Русецкая, Н. Ю. Антитоксическое действие селеноорганических соединений при отравлении солью свинца / Н. Ю. Русецкая, В. Б. Бородулин // Обмен веществ при адаптации и повреждении (дни медицинской лабораторной диагностики): материалы IX межвузовской конференции с международным участием. - Ростов-на-Дону, 2010.-С 111.

27. Елагина, В. Ю. Антибактериальное действие нового теллуроорганического препарата на клинические штаммы Pseudomonas aeruginosa / В. Ю. Елагина, Н. Ю. Русецкая // Материалы 71-й межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 65-летию со Дня Победы в Великой Отечественной войне. Часть 1. Саратов. 2010.-С. 97-98.

28. Калугина, М. С. Антибактериальное действие нового теллуроорганического препарата на клинические штаммы золотистого стафилококка / М. С. Калугина, Н. Ю. Русецкая // Материалы 71-й межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 65-летию со Дня Победы в Великой Отечественной войне. Часть 1. Саратов. 2010. - С. 98-99.

29. Конищева, О. М. Антитоксическое действие селенорганических препаратов при отравлении солями ртути / О. М. Конищева, Н. Ю. Русецкая // Материалы 71-й межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 65-летию со Дня Победы в Великой Отечественной войне. Часть 1. Саратов. 2010.-С. 100-101.

30. Никитин, В. А. Антитоксическое действие селеноорганических соединений при отравлении солью кадмия / В. А. Никитин, Н. Ю. Русецкая // Материалы 71-й межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 65-летию со Дня Победы в Великой Отечественной войне. Часть 1. Саратов. 2010. — С. 109-110.

31. Русецкая, Н. Ю. Сравнительная антиоксидантная активность селеноорганического соединения диацетофенонилселенида и его галогенпроизводных / Н. Ю. Русецкая, Б. И. Древко, В. Б. Бородулин // Материалы VII международной научно-практической конференции «Ключевые вопросы в современной науке» — София, 2011. — Т 33. - С. 107-109.

32. Русецкая, Н. Ю. Антибактериальное действие 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентадиона-1,5 на золотистый стафилококк / Н. Ю. Русецкая, В. Б. Бородулин // Международная научно-практическая конференция Современные проблемы отечественной и медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области. Пенза. 2011. - С. 70-72.

33. Русецкая, Н. Ю. Антиоксидантная активность селеноорганического соединения 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5 in vivo / Н. Ю. Русецкая, В. Б. Бородулин, В. А. Мартьянова, Я. В. Бородулин, А. П. Димидов // Актуальные вопросы геронтологии / Сборник научно-практических и публицистических работ. Москва, 2012. - С. 108-111.

34. Русецкая, Н. Ю. Сравнительный анализ антибактериального действия селеноорганических соединений на клинические штаммы Staphylococcus aureus / Н. Ю. Русецкая, В. Б. Бородулин // Материалы международной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине», Франция (Париж), 15-22 октября 2013 г. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2013. -№ 10 (часть 2).-С. 246-248.

35. Русецкая, Н. Ю.Антибактериальная активность соединения 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5 на клинические штаммы Escherichia coli /

H. Ю. Русецкая, В. Б. Бородулин // Материалы международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии», ОАЭ (Дубай), 16-23 октября 2013 г. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2013. - № 10 (часть 2). - С. 276-278.

36. Русецкая, Н. Ю. Антибактериальное действие селеноорганического соединения

I,5-ди-(п-фторфенил)-3-селенапентандион-1,5 на клинические штаммы Pseudomonas aeruginosa / Н. Ю. Русецкая, В. Б. Бородулин // Материалы международной конференции «Фундаментальные исследования», Израиль

(Тель-Авив), 16-23 октября 2013 г. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2013. - № 10 (часть 2). - С. 260-262.

37. Русецкая, Н. Ю. Нефропротекторное действие селеноорганического препарата 1,5-дифенил-З-селенапентандион-1,5 (ДАФС-25) при интоксикации белых крыс солями кадмия и ртути / Н. Ю. Русецкая, А. В. Саратцев, В. Б. Бородулин // Материалы V Междунар. науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», г. Ростов-на-Дону, 3-5 октября 2013 г. Издательство Южного федерального университета, 2013. - С. 355-356.

38. Древко, Б. И. Селенсодержащие препараты для снижения тяжести отравлений соединениями тяжелых металлов / Б. И. Древко, В. Б. Бородулин, Н. Ю. Русецкая, Я. Б. Древко, А. А. Волков, А. Б. Иванов // «Восьмой Саратовский салон изобретений, инноваций и инвестиций», Секция «Животноводство и ветеринария», г. Саратов, 19-20 сентября 2013 г. - С. 106-107.

39. Русецкая, Н. Ю. (Rusetskaya N.J.) The comparative analysis of selenorganic Compounds effect on clinical strains of Escherichia coli / N. J. Rusetskaya, N. A. Belskaya, А. V. Sarattsev, V. B. Borodulm // International journal of experimental education. 2014. - №2. -C. 57-59.

Список использованных сокращений

АлАТ - аланинаминотрансфераза АсАТ - аспартатаминотрансфераза ГГТ - у-глутамилтрансфераза ГПО - глутатионпероксидаза

ДАФС-25, ДАФС(8е) - Диацетофенонилселенид, 1,5-дифенил-3-селенапентадион-1,5

ДАФС(С12) - 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандион-1,5

MOC(F2) - 1,5-ди-(п-фторфенил)-3-селенапентандион-1,5

ДАФС(Ы02)2 - 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5

ДАФС(З) - 1,5-дифенил-3-тиапентадион-1,5

ДАФС(Те) - 1,5-дифенил-3-теллурапентадион-1,5

ДК- диеновые конъюгаты

ДМФА - диметилформамид

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЛИИ-лейкоцитарный индекс интоксикации

МДА - малоновый диальдегид

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД — супероксиддисмутаза

ЩФ - щелочная фосфатаза

E.coli - Escherichia coli

PASS - Prediction of Activity Spectra for Substances P. aeruginosa - Pseudomonas aeruginosa S. aureus - Staphylococcus aureus

Подписано в печать 06.03.2014 г. Формат 60х 84 1/16. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Объем 1,8 ус.печ.л. Тираж 100 экз. Заказ 39

Типография ЦВП «Саратовский источник» г. Саратов, ул. Кутякова 138 «Б»,4 эт. т. 52-05-93

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Русецкая, Наталья Юрьевна, Саратов

Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского

На правах рукописи

Русецкая Наталья Юрьевна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ХАЛЬКОГЕНОРГАНИЧЕСКИХ

СОЕДИНЕНИЙ

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор В.Б. Бородулин

Саратов 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список используемых сокращений.......................................................5

Введение.........................................................................................7

Глава 1. Обзор литературы..............................................................14

1.1. Халькогены. Физико-химические свойства, биологическая активность, метаболизм в клетках эукариот и прокариот..........................................14

1.2. Окислительный стресс: механизмы развития и предотвращения...........30

1.3. Антитоксическая активность халькогенорганических соединений при интоксикации солями кадмия, свинца и ртути........................................56

1.4. Антибактериальная активность халькогенорганических соединений в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов.............................................................................73

1.5. Гормоноподобное действие синтетических нестероидных

соединений......................................................................................90

Глава 2. Материалы и методы исследования.......................................108

2.1. Халькогеноорганические препараты, использованные в исследовании..................................................................................108

2.2. Постановка эксперимента.............................................................109

2.2.1. Подготовка препаратов к исследованиям......................................109

2.2.2. Подготовка биологического материала.......................................111

2.2.3. Изучение свободнорадикального окисления липидов и антиоксидантного статуса в тканях мышей....................................................................112

2.2.4. Изучение антитоксического действия халькогенорганических препаратов при подостром отравлении солями тяжелых металлов............................113

2.2.5. Изучение антибактериальной активности халькогенорганических соединений....................................................................................115

2.2.6. Изучение гормоноподобного действия халькогенорганических соединений....................................................................................116

2.3. Методы исследования.................................................................117

2.3.1. Методы изучения свободнорадикального окисления липидов и антиоксидантной системы.................................................................117

2.3.2. Методы исследования биохимических показателей плазмы крови.......121

2.3.3. Методы исследования гематологических показателей плазмы крови...........................................................................................123

2.3.4. Методы определения показателей углеводного обмена...................126

2.3.5. Определение антибактериального действия халькогенорганических соединений по числу выросших клеточных колоний..............................129

2.4. Квантово-химические расчеты.....................................................130

2.5. Компьютерное прогнозирование биологической активности с использованием компьютерной системы предсказания спектра биологической активности (PASS С&Т)....................................................................131

2.6. Статистические параметры, использованные в работе.......................133

Глава 3. Антиоксидантная активность халькогенорганических соединений...................................................................................134

3.1. Антиоксидантные показатели гемолизата эритроцитов, плазмы крови и тканей интактных мышей с различной оксидорезистентностью.................135

3.2. Концентрации продуктов перекисного окисления липидов в гемолизате эритроцитов, плазме крови и тканях мышей с различной оксидорезистентностью...................................................................137

3.3. Активность антиоксидантных ферментов в гемолизате эритроцитов, плазме крови и тканях мышей с различной оксидорезистентностью.....................................................................140

3.4. Механизм антиоксидантного действия халькогенорганических

соединений....................................................................................147

Глава 4. Антитоксическое действие халькогенорганических соединений при интоксикации солями тяжелых металлов.....................................151

4.1. Оценка функциональной активности органов и тканей белых крыс при использовании халькогенорганических препаратов в качестве антитоксикантов при интоксикации солями тяжелых металлов........................................153

4.2. Оценка антитоксической активности халькогенорганических препаратов по результатам гематологических показателей крови крыс............................170

4.3. Механизм антитоксического действия халькогенорганических

препаратов.....................................................................................184

Глава 5. Антибактериальная активность халькогенорганических соединений...................................................................................187

5.1. Антибактериальное действие халькогенорганических соединений на клинические штаммы Staphylococcus aureus..........................................187

5.2. Антибактериальное действие халькогенорганических соединений на клинические штаммы Pseudomonas aeruginosa.......................................196

5.3. Антибактериальное действие халькогенорганических соединений на клинические штаммы Escherichia coli..................................................205

5.4. Механизм антибактериального действия халькогенорганических

соединений....................................................................................214

Глава 6. Элементы структурного подобия молекул как предпосылка сходного физиологического действия халькогенорганических соединений и глюкокортикоидов........................................................................219

6.1. Компьютерное прогнозирование биологической активности халькогенорганических соединений, полученные с использованием компьютерной системы предсказания спектра биологической активности PASS...........................................................................................220

6.2. Квантовохимические расчеты, подтверждающие структурное сходство селеноорганического соединения ДАФС-25, его производных и глюкокортикоидов..........................................................................226

6.3. Влияние препарата ДАФС, его производных и преднизолона на показатели

углеводного обмена экспериментальных животных................................230

Заключение..................................................................................236

Выводы........................................................................................261

Список использованной литературы.................................................263

Список используемых сокращений

АлАТ - аланинаминотрансфераза АсАТ - аспартатаминотрансфераза АОЗ - антиоксидантная защита АОС - антиоксидантная система АФА - активные формы азота АФК - активные формы кислорода ГГТ - у-глутамилтрансфераза ГК - глюкокортикоид ГКР - глюкокортикоидный рецептор ГПО (вРХ) - глутатионпероксидаза ГР - глутаредоксин

ДАФС-25, ДАФС(8е) - Диацетофенонилселенид, 1,5-дифенил-З-селенапентадион-1,5

ДАФС(С12) - 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандион-1,5

ДАФС(Р2) - 1,5-ди-(п-фторфенил)-3-селенапентандион-1,5

ДАФС(К02)2 - 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5

ДАФС(8) - 1,5-дифенил-3-тиапентадион-1,5

ДАФС(Те) - 1,5-дифенил-3-теллурапентадион-1,5

ДК - диеновые конъюгаты

ДМФА - диметилформамид

КК (КФК) - креатинкиназа

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЛИИ — лейкоцитарный индекс интоксикации

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

МДА - малоновый диальдегид

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПР - прогестероновый рецептор

СОД - супероксиддисмутаза

СРО - свободно-радикальное окисление

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ТР -тиоредоксин

ТРР (ТгхЯ, ТХЯ) - тиоредоксинредуктаза УФ - ультрофиолетовый ФАД - флавинадениндинуклеотид ФАФС — фосфоаденозинфосфосульфат

ЦПЭ - цепь переноса электронов

ЩФ - щелочная фосфатаза

icoli - Escherichia coli

G-SH — восстановленный глутатион

GS-SG - окисленный глутатион

eNOS - эндотелиальная NO синтаза

iNOS - индуцибельная NO синтаза

nNOS - нейронная NO синтаза

'NO - оксид азота

Nox - НАДФН-оксидаза

ONOO" - пероксинитрит

ONOOCO2" - нитрозо-пероксокарбоксилат

PASS - Prediction of Activity Spectra for Substances

P. aeruginosa - Pseudomonas aeruginosa

S. aureus - Staphylococcus aureus

Введение

Актуальность исследования.

Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, количество и характер потребляемых продуктов питания являются основными факторами, определяющими здоровье человека [ВОЗ, 1993]. В «Основах государственной политики Российской Федерации в области здорового питания населения на период до 2020 г.» особое внимание уделяется профилактике заболеваний, обусловленных неполноценным и несбалансированным питанием [Распоряжение Правительства РФ №1873-р, 2010]. В этой связи значительную актуальность приобретает коррекция питания населения с целью снижения распространенности селенодефицитных состояний [Баранова Т.А., 2008; Ширшова Т.И. и др., 2011]. По современным данным, до 80% населения России имеет недостаточную обеспеченность селеном [Сенькевич O.A. и др., 2011; Ширшова Т.И. и др., 2011; Давыденко Н.И. и др., 2012]. В то же время проблема болезней, связанных с дефицитом селена, остается нерешенной до сих пор.

В настоящее время для борьбы с селенодефицитом применяются биологически активные добавки, содержащие неорганический селен, главным образом, селенит натрия [Перепелкина Л.И. и др., 2012]. В то же время органические соединения селена по сравнению с неорганическими являются менее токсичными, более биодоступными и лучше усваиваемыми живыми организмами [Комзалова A.B. и др., 2012; Бикчантаев И.Т., Шакиров Ш.К., 2013; Фроловичев A.C., Трошин А.Н., 2013]. Поэтому научные разработки последних лет направлены на синтез и использование органических форм селена в целях профилактики селенодефицита и ряда заболеваний (беломышечной болезни, некроза и жирового перерождения печени, экссудативного диатеза, энцефаломаляции, расстройства сперматогенеза и др.) [Комзалова A.B. и др., 2012; Бикчантаев И.Т., Шакиров Ш.К., 2013; Фроловичев A.C., Трошин А.Н., 2013].

Одним из перспективных селеноорганических соединений является диацетофенонилселенид (ДАФС-25) (производитель: ЗАО «Сульфат», г. Саратов), который позволяет нормализовать деятельность иммунной, антиоксидантной и детоксицирующей систем организма животных и птиц, приводит к увеличению яичной и мясной продукции [Древко Б.И. и др., 2001; Иванова Л.В., 2009]. ДАФС-25 в 40 раз менее токсичен селенита натрия, селен в нем находится в органической, более доступной для животных форме [Кулешов К.А., 2008].

Известно, что селен расположен в VI группе Периодической системы элементов Д.И. Менделеева, все элементе которой относятся к халькогенам, являются электронными аналогами и обладают сходными химическими свойствами, что, вероятно, будет обусловливать близость биологических свойств этих элементов и их соединений [Паперная Л. К., 2007].

В связи с этим несомненный интерес представляет обнаружение взаимосвязи между структурой и биологической активностью халькогенов (серы, селена, теллура), расположенных в VI группе Периодической системы элементов Д.И. Менделеева. В настоящее время отсутствуют систематизированные данные о биологической активности халькогенорганических соединений.

Целью исследования явилось установление биологической активности халькогенорганических соединений в зависимости от их структуры, включая наличие гетероатома халькогена (серы, селена, теллура) и боковых заместителей (атомов хлора, фтора и нитрогрупп) в составе этих соединений.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние халькогенорганических соединений на антиоксидантный статус и процессы свободнорадикального окисления в тканях белых мышей.

2. Установить эффекты халькогенорганических соединений на отдельные стороны обмена веществ и функциональное состояние

тканей крыс при интоксикации сульфатом кадмия, нитратом свинца и нитратом ртути, а также оценить интоксикацию тяжелыми металлами и антитоксическое действие халькогенорганических соединений по гематологическим показателям крови крыс и лейкоцитарным индексам интоксикации.

3. Выявить способность халькогенорганических соединений подавлять рост клинических штаммов Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa.

4. Установить влияние халькогенорганических соединений и глюкокортикоидных препаратов на отдельные стороны углеводного и белкового обмена мышей.

5. Провести компьютерное прогнозирование биологической активности халькогенорганических соединений при помощи системы PASS С&Т, а также квантовохимические расчеты, выявляющие структурно-функциональные аналогии препарата ДАФС-25, его производных и ряда стероидных гормонов.

6. Установить структурно-функциональные закономерности, объясняющие разнообразные биологические свойства органических соединений, содержащих гетероатомы халькогенов (серы, селена и теллура), а также различные боковые заместители (атомы хлора, фтора и нитрогруппы).

Научная новизна работы.

В работе впервые установлена взаимосвязь между структурой органических соединений, содержащих гетероатомы халькогенов (серы, селена и теллура), различные боковые заместители (атомы хлора, фтора и нитрогруппы) и их биологической активностью.

Впервые доказано, что нитро- и хлорсодержащие производные ДАФС-25 оказывают антиоксидантное действие, которое выражается в снижении концентрации продуктов перекисного окисления липидов и увеличении

активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы в тканях и крови мышей.

Впервые установлена антитоксическая активность нитро- и хлорсодержащих производных ДАФС-25, а также его серосодержащего аналога при интоксикации экспериментальных животных солями тяжелых металлов: сульфатом кадмия, нитратом свинца и нитратом ртути.

Впервые показана зависимость антибактериальной активности соединений от их токсичности. В ряду селеноорганических соединений наиболее токсичный препарат - фторированный аналог ДАФС-25, а в ряду халькогенпроизводных ДАФС-25 - теллурорганическое соединение, которые подавляли рост колоний клинических штаммов Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa даже в низких концентрациях 0,00010,001 мг/мл.

В работе впервые проведен компьютерный анализ биологической активности селен-, серо и теллуроорганических соединений, а также квантово-химические расчеты, выявляющие структурно-функциональные аналогии препарата ДАФС-25 (1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5), его производных и ряда стероидных гормонов. Установлено сходное действие ДАФС-25 и глюкокортикоидных препаратов на отдельные стороны углеводного и белкового обменов экспериментальных животных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Халькогенорганические соединения в зависимости от наличия гетероатома халькогена (серы, селена и теллура) и боковых заместителей (атомы хлора, фтора и нитрогруппы) в различной степени оказывают влияние на антиоксидантный статус и процессы свободнорадикального окисления в тканях белых мышей. Селеноорганические соединения 1,5-дифенил-З-селенапентандион-1,5 (ДАФС-25); 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5; 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандион-1,5 демонстрируют лучшие антиоксидантные свойства.

2. Селеноорганические соединения 1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5; 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5; 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандион-1,5 обладают низкой токсичностью и при предварительном введении per os крысам снижают интоксикацию солями тяжелых металлов, о чем свидетельствуют биохимические, гематологические показатели крови крыс и лейкоцитарные индексы интоксикации. Серосодержащий аналог препарата ДАФС-25 (1,5-дифенил-3-тиапентандион-1,5) оказывает аналогичное действие, тогда как теллурсодержащее соединение в силу своей собственной токсичности не проявляет антитоксической активности при интоксикации солями тяжелых металлов.

3. Наибольшей токсичностью и антибактериальной активностью в отношении клинических штаммов Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa обладают соединения 1,5-ди-(п-фторфенил)-3-селенапентандиона-1,5 и 1,5-дифенил-3-теллуропентандиона-1,5 даже в низких концентрациях 0,0001-0,001 мг/мл.

4. Соединение ДАФС-25 оказывает стимулирующее действие на отдельные стороны углеводного и белкового обменов мышей подобно глюкокортикоидному препарату преднизолону.

5. Согласно квантово-химическим расчетам, молекула препарата ДАФС-25 (1,5-дифенил-3-селенапентандиона-1,5) наиболее близка к молекулам глюкокортикоидов преднизону и преднизолону как по размеру, так и по расстояниям между полярными реакционноспособными группами, которые потенциально могут участвовать в связывании с рецептором как посредством электростатических сил, так и за счет водородных связей.

6. В ряду халькогенорганических соединений, лишенных боковых заместителей (1,5-дифенил-3-тиапентандион-1,5; 1,5-дифенил-З-селенапентандион-1,5 и 1,5-дифенил-3-теллурапентандион-1,5), а также в ряду ДАФС-25 (1,5-дифенил-3-селенапентандиона-1,5) и его производных, содержащих боковые заместители (1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандиона-1,5; 1,5-ди-(п-хлорфенил)-3-селенапентандиона-1,5 и 1,5-

ди-(п-фторфенил)-3-селенапентандиона-1,5), установлены следующие закономерности: снижаются антиоксидантная и антитоксическая активности, возрастает антибак�