Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Устойчивость нуклеиновых кислот при взаимодействии с биологически активными веществами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Устойчивость нуклеиновых кислот при взаимодействии с биологически активными веществами"

¿•—■¡о

{ у [

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

БАБА ЗД Юрик Степанович

УСТОЙЧИВОСТЬ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ

03.00.02.- биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Ереванском государственном университете

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

В.И. Иванов

доктор физико-математических наук, В.Я. Малеев

доктор биологических наук,. A.A. Александров

Ведущая организация - Физико-технический институт низких

температур АН Украйни

ОТ)

Защита состоится 12 декабря 1991 года в 15 часоь на заседании специализированного совета Д 053.05.53 по биофизике при МГУ по адресу: II9899 ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, аудитория _.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " q " ноября 1991г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук,

профессор Т.Е. Кренделева

общая характеристика работы

>т2!(ий

—--Актуальность проблемы. Известно, что во многих случаях процесс трансформации нормальной клетки происходит вследствие изменения структуры нуклеиновых кислот. Одновременно известно также, что многие биологически активные вещества, проникая в клетку, связываются в основном, с нуклеиновыми кислотами, чем и обусловлено их влияние на организм. Следовательно, вследствие этих процессов должна изменяться устойчивость нуклеиновых кислот. Поэтому возникает необходимость выяснения характера изменений термодинамических параметров, структуры и природы возможных изменений нуклеиновых кислот происходящих при вышеуказанных процессах. Подобного рода вопросы находятся сейчас в центре внимания, поскольку именно эта информация важна для понимания молекулярных механизмов 'функционирования нуклеиновых кислот, а также при разработки современных эффективных методов и средств терапии злокачественных новообразований. Исследование ус- . тойчивости комплексез биологически активних веществ с нуклеиновыми кислотами актуально еще и тем, что анализ полученных данных позволит определить пути улучшения лекарственных препаратов, и, в частности, антираковых препаратов, способных эффективнее связываться с нуклеиновыми кислотами, а также понять молекулярный механизм их воздействия.

Следует- отметить, что выяснению термодинамики, структуры и природы взаимодействия нуклеиновых кислот с биологически активными веществами посвящено огромное количество экспериментальных и теоретических работ (Волькенштейн, Франк-Каменецкий, Гурский, Заседателев, Lerman faring и т.д.). В этих работах подробно исследовании комплексы нуклеиновых кислот с интеркаляторами и неинтеркаляторами и получены основные закономерности характеризующие их взаимодействия. Однако, сравнительно недавно были синтезированы новые типы противоопухолевых соединений, которые содержат плоские циклы (способные интеркалироваться) и длинные заряженные алифатические хвосты (способные электростатически взаимодействовать с фосфатными остатками нуклеиновых кислот). Физико-химические свойства комплексов таких соединений с правоспиральными и левоспиральными формами дву-спиральных нуклеиновых кислот почти не исследованы.

Возможные структурные изменения молекул ДНК, происходящие при опухолевой трансформации клеток приводят к изменению не только ее биологических функций, но и ряда ее физико-химических свойств. К

- г -

выявлению возможных изменений в молекулах ДНК при опухолевой трансформации клеток приковано внимание многих исследователей (Ванюшин, Нонаселидзе, Есипова, Жижина, Шугалий и т.д.). Генетическая близость нормальных и опухолевых клеток приводит к появлению трудностей в поиске различий между ДНК нормальных и опухолевых клеток. Эти различия исследованы как в аспекте первичной структуры, так и в физико-химическом плане. Однако эти исследования выполнены не совсем полно, не выяснена природа возможных структурных изменений, не определены места локализации и т.д. В частности, в некоторых работах (Ванюшин, Жижина и т.д.) показано увеличение содержания 5-ме-тилцитозина и выявлени участки с измененной структурой в ДОК опухолевых клеток по сравнению с ДНК нормальных клеток. Увеличение метилирования и появление участков с измененной структурой приводит к изменению устойчивости ДНК. Поэтому, исключительно актуальным является предложенный нами подход в применении дифференциальных кривых плавления для исследования вопросов устойчивости ДНК выделенных из опухолевых клеток, выявления участков с измененной структурой и исследования сравнительного влияния биологически активных веществ на /ЩК опухоли и нормы.

Следовательно, разработка простых методов 01 знки устойчивости нуклеиновых кислот при опухолевой трансформации клеток и при взаимодействии с биологически активными веществами вышеуказанного ти--па представляет собой весьма актуальную задачу, решение которой позволит, вероятнее всего, выявить новые закономерности в поведении термодинамических параметров при образовании комплексов нуклеиновых кислот с биологически активными веществами и ответить на многие вопросы, стоящие перед молекулярной биофизикой.

Цель и задачи исследования. Исследование устойчивости нуклеиновых кислот при взаимодействии с биологически активными веществами и при опухолевой трансформации клетки на основе разработки новых методических подходов.

В задачи работы входило: — при помощи спектрофотометрически полученных кривых плавления исследовать распределение нуклеотидов вдоль цепи молекулы ДНК, отличить ДНК различного происхождения, в том числе и опухолевую ДНК от ДНК нормы, разработать способ определения средних характеристик первичной структуры ДНК (среднее в С -содержание, дисперсию и т.д.), выяснить избирательность влияния биологически активных веществ на нуклеотидные пары;

— с помощью оптических методов и микрокалориметрии исследовать термодинамику, конформацию и природу взаимодействия сравнительно недавно синтезированных противоопухолевых соединений содержащих плоские циклы и длинные заряженные хвосты (митоксантрон и аметан-трон) с двуспиральными природными и синтетическими нуклеиновыми кислотами, с опухолевой ДНК при различных ионных силах и температурах, а также их влияние на Bí 2 равновесие и термостабильность; с этой целью а) на первом этапе определено изменение термодинамических параметров при связывании классического интеркалятора бромистого этидия с синтетическими двуспиральными РНК; б) детально исследованы комплексы двуспиральных нуклеиновых кислот с митоксан-троном, аметантроном и нетропсином;

— изучение влияние in vivo и in vitro различных биологически активных веществ на ДНК опухолевых клеток при помощи спектрофотомет-рически полученных дифференциальных кривых плавления.

Научное значение и новизна. В диссертации

— исследовано распределение нуклеотидов вдоль цепи молекулы ДНК, дающее возможность отличить ДНК различного происхождения, в том числе и опухолевую ДНК от ДНК нормы, выяснить избирательность влияния биологически активных веществ на нуклеотидные пари и выявить структурные изменения в ДНК;

— разработан новый метод определения средних характеристик первичной структуры ДНК (среднее 6С -содержание, дисперсия и т.д.) при помощи разложения дифференциальной кривой плавления на гауссовые составляющие;

— обнаружено изменение термодинамических параметров и содержания 5-метилиитозина в ДНК опухоли по сравнению с ДЖ нормы. Проанализирована причина этих различий и возможные структурные изменения в ДНК, происходящие при опухолевой трансформации клетки;

— впервые экспериментально найдена сильная зависимость энтальпии связывания биологически активных веществ от степени заполнения нуклеиновых кислот, которая обнаружена для комплексов нуклеиновых кислот с аметантроном и митоксантроном;

— впервые показано, что наличие двух последовательно расположенных нуклеотидов А и Т недостаточно для специфического взаимодействия нетропсина с В-формой ДНК;

— предложен метод определения константы связывания биологически активных веществ с двуспиральными нуклеиновыми кислотами при слабом связывании, когда экспериментально невозможно фиксировать фи-

зические характеристики полностью связанного состояния; — проведен термодинамический анализ комплексов биологически активных веществ с опухолевой ДНК, с природными и синтетическими нуклеиновыми кислотами по данным спектрофотометрии, спектрофлуориметрии, микрокалориметрии и ВД-спектрам, проанализирован вклад энтропии и энтальпии связывания в избирательность взаимодействия бромистого этидия, митоксантрона и аметантрона с нуклеотидными парами.

Практическая ценность. Полученные результаты могут быть применены в различных областях молекулярной биологии и медицины. Прежде всего, они представляют интерес для химиотерапии опухолей, при, разработке новых эффективных противоопухолевых соединений и поиске оптимальных путей направленного синтеза биологически активных соединений и экспресс-анализа их молекулярного действия.

Разработанный способ анализа дифференциальных кривых плавления уже используется в ИТОХ АН Армении для обнаружения структурных отличий в опухолевых ДНК и для характеристики эффективности противоопухолевых препаратов. Результаты работы испол!эуются в лекционных курсах по структуре нуклеиновых кислот в Еревак-зком государственном университете, в Триестском университете (Италия) и могут быть рекомендованы для учебных заведений, где есть специализации по биофизике и молекулярной биологии.

Публикации. Основные результаты диссертации представлены в 56 печатных работах, включающих 26 статью в отечественных изданиях и 3 статьи в международных журналах.

Апробация. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Всесоюзных совещаниях по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1977; Телави, IS80; Тбилиси, 1985); на Симпозиуме стран СЭВ по биофизике (Таллин, 1981); на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); на Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1977,1981,1984,1988,1991) на Симпозиуме стран СЭВ и СФРЮ "Гидратация биополимеров" '(Цущино, 1987) на Всесоюзном совещании "Механизмы влияния электрического поля на свойства водных систем" (Киев, 1989); на международном симпозиуме "Физико-химия ДНК и молекулярные механизмы функционирования генома" (Тбилиси, 1987); на Всесоюзном совещании "Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов (Рига, 1982); на III Всесоюзном совещании "Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей" (Черноголовка, 1987); на СССР-ЧСФР совещани-

ях - "Динамика и активность биологических макромолекул" (Вильнюс, 1984; Ереван, 1988); на международной школе по теоретической биофизике (Триест, 1986).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и списка литературы (209 ссылок). Она содержит 227 страниц, в том числе 78 рисунков и 13 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В первой главе приводится описание материалов и методики исс- ' ледований, математического метода обработки кривых плавления ДНК и нахождения средних характеристик ДНК, рассмотрен процесс самоассоциации ксследов; нных соединений.

В работе были использованы следующие препараты нуклеиновых кислот (НК) : ДНК Micrococcus lysodeikticus и тимуса теленка (" sigma "), печени крысы и Е. coli (были выделены в лаборатории академика Г.П. Георгиева, ИМБ АН СССР), поли^(А-Т)] , поли/WCS -С)], поли[г/(А-С)]-поли[Л(6 -Т)] и поли[с/(1 -С)] (" Р.Ъ. Biochemicala "), поли(А>поли(и), поли(1)поли(С), поли(6) и поли(С) ("Pharmacia "). Дзуспиральный полирибонуклеотид поли(б)-поли(С) был приготовлен нагреванием раствора смеси поли(6) и поли(С) в эквимолярных количествах. Помимо указанных препаратов нуклеиновых кислот был использован также самокомплементарный олигонуклеотид d(GCGA.SCGC)

В работе были использованы следующие биологически активные соединения: бромистый этидий (БЭ), митоксантрон (MX), аметантрон (AM), нетропсин, фосфемид и сарколизин (рисЛ). БЭ, AM, MX и не-тропсин представляют препараты фирмы " Farmitalia ".

Исследования проводились: в водно-солевом растворе O.ISSC ; в водном растворе, содержащем 0,1 M A'aCt, 0,01 M Трис, 0,5 мМ ЭДТА, pH 7,4 (буфер А); 0,5 M Na. Cl , 0.05 M Трис, 0,5 мМ ЭДТА, pH 7,4 (буфер Б) и 0,01 M ■ NaCt , I м.4 Трис, 0,5 мМ ЭДТА pH 7,4 (буфер С). Трис, ЭДТА, Ncx.CE. , мочевина и спирты - препараты фирмы " aerva

Спектры поглощения, кривые плавления и спектрофотометрическое титрование реализованы на спектрофотометрах " Сагу -219" (США) и "Unicam ЗР - 8000" (Англия). Термостатирование проводили, с использованием термостата "Haake -F 3" (Италия), температура и

скорость нагревания регулировалась температурным програмником " Haake PG 10" (Италия). Изотермические микрокалориметрические измерения проводились с использованием микрокалориметров типа "flow' и " batch" (" 1KB ", Швеция). Теплоту перехода спираль-клубок определяв на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокало-риметрь "ДАСМ-1М" (СССР). Спектры флуоресценции были сняты на спек-трофлуориметре "Perkin Dimer MPF -3" (Швеция). Длина волы возбуждения 510 нм. Спектры кругового дихроизма (КД) сняты на дихро-графах "Jasco J -500Д" (Япония) и "Roussel- Joua» II" (Франция). Расчеты проводили на персональном микрокомпьютере " Olivetti " (Италия).

Самопроизвольная ассоциация плоских циклических молекул в растворе. При исследовании характера связывания низкомолекулярных соединений с нуклеиновыми кислотами и последующем определении термодинамических величин связывания необходимо работать с такими концентрациями низкомолекулярных соединений, при которых можно пренебречь процессом ассоциации молекул. Некоторые 13 исследованных соединений (MX, AM и БЭ) содержат циклы и имеют функциональные группы способные образовать водородные связи между собой, и поэтому, возможно образование физических (стопкообразование) и химических ассо-циатов этих молекул, что должно приводить к неточности в количественных расчетах. Поэтому, специально рассмотрен процесс самопроизвольной ассоциации молекул и вычислена максимальная концентрация, при которой в пределах погрешности эксперимента можно пренебречь процессом ассоциации. Расчеты показывают, что процессом самоассоциации молекул БЭ можно пренебречь при концентрациях cQ< IO-^ М, а молекул MX или AM - с0< 5-10"^ М.

Применение дифференциальных кривых плавления для исследования ДНК. Возможные структурные изменения молекул ДНК которые происходят как при изменении структуры самой молекулы ДНК вследствии транс формации клетки, так и при взаимодействии с окружающими ДНК молекулами, приводят к изменению кривой плавления ДНК. Однако, очень часто, на кривых плавления особенности первичной и вторичной струк туры ДНК проявляются слабо. Поэтому, целесообразно переходить к дифференциальным кривым плавления (ДК11), в которых даже незначительные изменения кривой плавления выявляются в виде пиков. ДКП были получены путем численного дифференцирования нормированных кривых плавления. Программа дифференцирования предназначена для получения сглаженной ненормированной, сглаженной нормированной кри

n.

(а)

С^С//'г ^ СИг ^ 0//

он о

(б)

н О иИСИхСНгЫН(.Нх см^н

н о ынщи/^ыни/^о/^он

^ /V7

(в)

(г)

(се-снлснх)гм соон

(д)

И N Н Н

I I

®)С - /V- снх~ с - ыл 0

н

I

N

' /v о

сн, •

(е)

/v о I

Рис Л. Химические формулы исследованных лекарственных соединений: а) этидиум бромид, б) митоксантрон, в) аметантрон, г) фосфемид, д) сарколизин и е) нетропсин

вой плавления и ее первой производной при пяти режимах сглаживания. Одостоверности полученных ДКП ДНК можно судить, сравнивая полученные ДКП с ДКП данного организма полученной другими способами и сравнением с кривыми теплопоглощения. Указанное сравнение показывает достоверность полученных ДКП ДНК предложенным способом. В данной работе ДКП применяются для исследования структурных особенностей ДНК опухолевых клеток (глава II), для исследования избирательности влияния различных биологически активных веществ на цук-леотидные пары НК и для расчета средних характеристик первичной структуры ДНК.

ДКП ДНК тимуса теленка и печени крысы. Известно, что GC -содержание ДНК выших организмов варирует в узком интервале. Однако, когда переходим к ДКП, наблюдается качественно иная картина. Как следует из рис.2 и 3, где показаны ДКП ДНК тимуса теленка и печени крысы, эти кривые очень сильно отличаются," они имеют совершенно иную форму. Причем, как показывают экспериментальные данныо, ДКП ДНК каждого организма совершенно непохож на ДКП ДНК другого организма, даже при почти одинаковом их QC -содержания. Следовательно, обобщая выэесказанное, можно сказать, что , КП ДНК представляет собой как бы "характеристику" данного организма.

Расчет сроднтос характеристик первичной структуры ДНК. Среднее GC -содержание ДНК данного организма ( X ) является его важным таксонометрическим признаком. Наиболее простым и часто применяемым является метод определения X по температуре плавления ДНК ("£,). При этом используется формула (I)

где а.- ~ТАт , Т6с - Тат ' Таг и - температуры

плавления полинуклеотидов полиУА)поли(сЛ) и поли (с/С )-поли (с/С) соответственно. определяется из условия Т^, ) = 0,5 ( ХГ~ степень спиральности ДНК). Однако, для некоторых ДНК определение X по формуле (I) дает результаты, отличающиеся от полученных путем химического анализа гидролизата (Ванвкин, 1970). При этом отличия существенно превышают погрешности указанных методов. Причина такого несоответствия обусловлена блочной организацией ДНК определенных организмов. Действительно, последовательность пар в пределах каждого блока близка к случайной. Тогда средний б С-содержание ДНК и дисперсия 6С -содержания блоков (Я ) можно определить по формулам:

"9"_ '

X=$xß(x)Jx (2)

55 = // x-iffMJx (3)

где f(x) - функция плотности распределения звеньев ДНК по блокам с различным SC -содержанием. При определении f>(x) осуществляется численное дифференцирование исходных кривых плавления ДНК. Полученная ДКП разлагалась на составляющие, представленные в виде функции Гаусса. Были определены значения X и для ДНК тимуса теленка и Е. coli . Как показывают экспериментальные данные в С -содержание, определенное по. формуле (2) в пределах погрешности эксперимента совпадает с GC -содержанием, определенным путем химического анализа гидролизата ДНК. Отметим, что предложенный метод, в отличие от других, ранее предложенных методов, позволяет кроме GС-содержания ДЩ определись дисперсию б С-содержания, а также центральные моменты более высоких порядков, являющиеся важными характеристиками первичной структуры ДНК.

Отличие значения среднего GС -содержания блочных ДНК, определенного по формуле (I), от истинного значения обусловлено тем, что определение Тм из условия "Т^ ) = 0,5 вносит существенное искажение в определение Тм для блочных ДНК. Нами показано, что в общем случае для нахождения следует вместо условия Ты )= 0,5 пользоваться первым моментом функции —ЩТ).

T^fp^r/jl^r М)

Tat T*r

Что верно независимо от типа распределения нуклеотидов вдоль цепи

ДНК, и для ДНК с квазислучайным распределением нуклеотидов совпадает со значением , определенным из условия )= 0,5. Тогда, подставляя выражение Тм из (4) в (I), получаем

. _ jftf-rtc/T . . (5)

г 'sc Tser Iat

где ^Т/я'^ есть численное значение площади, ограничен-

ной кривой плавления данной ДНК, осью Т и прямой T=TgC.

Полученная формула (5) для определения среднего ffC-содержания ДНК из кривых плавления имеет универсальный Характер; справедлива независимо от характера распределения нуклеотидов вдоль цепи

ДНК и не требует применения специального математического аппарата, как это было в формуле (2). С использованием формулы (5) были определены х для ДНК с блочным (ДНК тимуса теленка и Е. coli) и квазислучайным (фага Т2) распределением нуклеотидов. Расчеты показывают, что в пределах погрешности эксперимента наблюдается полное совпадение GС -содержания, определенного по формуле (5) и химическим способом.

ГЛАВА II. СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ ДНК

Несмотря на то, что к сравнительному исследованию структуры и свойств ДОС из нормальных и опухолевых клеток приковано внимание многих исследователей (Монаселидзе, Кикина и т.д.), тем не менее сведения о структуре и метилировании ДНК в раковых клетках все еще крайне малочисленны и противоречивы. Поэтому, спектрофотометричес-ки и микрокалориметрически был исследован процесс плавления, определены параметры плавления и нуклеотидный состав ДНК опухолевых (саркома 45, карциносаркома 256 Уокер, лимфосарчома Плисс и лимфо-лейкоз Швец) и нормальных ;кеток. Опыты показы1 «от, что наблюдается незначительная разница в кривых плавления и теплопоглощения опухолевых и нормальных ДНК. Поэтому, был осуществлен переход к ДКП, в попытке еыяснить, возможность при помощи ДКП отличить опухолевую ДНК от ДНК нормы, заранее зная, что эти отличия незначительны. Обобщая экспериментальные данные, полученные для четырех опухолей, можно сказать, что ДКП опухолевой ДНК существенно отличается от ДКП ДНК нормы, что в дальнейшем было подтверждено и по температурным зависимостям спектров ВД. Одновременно, существенно отличаются параметры плавления и нуклеотидный состав, особенно, содержание 5-метилцигозина (м^С). Следовательно, структурные нарушения ДНК возможные при опухолевой трансформации клетки можно выявить исследуя процесс плавления и изменение содержания м^С. Более подробно исследовались возможные структурные нарушения для ДНК опухоли саркомы 45.

Исследование возможных структурных нарушений в ДНК опухоли саркомы 45. На рис.3 приведены ДКП ДНК из печени здоровых крыс (3ДНК) и опухоли саркомы 45 (фДНК). Аналогичный вид имеют и микрокалориметрические кривые теплопоглощения. Как следует- из рис.3, наблюдается различие ДКП для дДНК и 3ДНК: кривая для дДЩ смещена в сторону низких температур, на ней появляются дополнительные низкотемпературные пики в области 54-62°С. Как свидетельствуют дан-

Таблица I

S ^ ...

Содержание м С, G*C+muC и параметры плавления ДНК при воздействии противоопухолевых

соединений in vivo в 0,02 М NaCl , 1мМ Трис, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,4

Условия Источник м5С, дТ,°С Т. ,°С й'Н , 5

опыта ДЦК моль % «ал/г G + C+ м С, моль %

1,13Ю,02 6,4*0,1 0,6310,02 6,6±0,1

Здоровые

животные печень введены:

фосфемид печень сарколизин печень

Животные с

саркомой 45 опухоль 1,4510,03 7,410,1 введены:

фосфемид опухоль 1,351 0,02 6,610,2

сарколизин опухоль 1,1610,02 6,7 ±0,1

1,02±0,02 6,51 0,1 71,9+0,2 14,110,2

70,11 0,1 71,8Ю,1

70,81 0,1

70,310,2 71,710,1

15,410,3

13,110,2 14,4 * 0,3

44,6 43,6

46,0 44,8

ныв табл.1 помимо общего вида ДКП - для 0ДНК заметно изменяются и термодинамические параметры процесса плавления: уменьшается (на ^10С), увеличиваются дТ (на ~ 0,7-1°) и АН (на ~ 1,3кал/ г). Как еле " т первичная структура 0ДНК:

на 1,5-2 мол.% больше соответствующих значений для 3ДНК. Увеличение м^С и б С-содержания в 0ДКК должно приводить к дополнительной стабилизации ее молекул. Однако, вопреки ожиданию из табл.1 следует, что ~Тт 0ДНК приблизительно на 1°С меньше Т„ для 3ДНК. Следовательно, уже такое сопоставление данных, приведенных в табл.1 и рис.3, свидетельствует о том, что первичная и вторичная структуры 0ДНК отличаются от соответствующих структур 3ДНК. А это означает, чтолибо 0ДНК почти "ничего общего" на имеет со 3ДНК, либо 0ДНК возникает при вполне определенных изменениях первичной и, возможно, вторичной структур ДЩ нормы.

Предположим, что 0ДНК имеет отличающуюся от ДНК нормы первичную структуру и не имеет никаких особенностей вторичной структуры. Тогда образование дополнительных пиков на ДКП обусловлено специфичностью первичной структуры 0ДНК. Но, так к к 6 С -содержание 0ДНК больше, чем 6С -содержание 3ДНК, то она должна плавиться при более высоких температурах, чем 3ДНК. Следовательно, если считать, что 0ДНК ке имеет никаких структурных особенностей, то экспериментальные данные, приведенные в табл.1 и на рис.3, приводят к противоречивому результату. Остается предположить, что 0ДНК возникает в результате трансформации нормальной ДНК, в которой в определенных местах нарушается первичная, а может быть и вторичная структура. Принято считать, что в опухолевых ДНК содержатся дефектные у» частки (плавление которых, возможно, и приводит к образованию добавочных пиков и к смещению ДКП), природа которых пока остается неясной. Согласно литературным данным, дефектные участки представляют собой участки с нарушенной первичной (точечные мутации и изменение содержания м^С) или вторичной (образование открытых участков) структурой, либо участки, прочно связанные с негистоновыми белками. Чтобы сделать выбор между этими концепциями, исследовались: а) термическое плавление 0ДНК и 3ДНК при разных ионных силах; б) повторное плавление 0ДНК (нагрев раствора осуществлялся до момента завершения плавления низкотемпературных пиков (до 60°С для 0ДНК в исследуемых условиях), далее раствор охлаждался до 25°С, с последующим повышением температуры); в) особенности конформационных переходов

содержание

содержание 6+С+ м^С -

"1т г\

0,06 / \ ~

°Р" / \ /

0,02/

66 74 82 т°с

Рис.2. Дифференциальная кривая плавления ДНК тимуса теленка в 0,1 SSC

Рис. 3. Дифференциальные кривые плавления 3ДДК (I) и0ДНК (2) в 0,1 ssc

Рис.4. Изменение спектров поглощз!шя MX при связывании а ДНК тимуса теленка в буфере А при 35°С. В процеесе титрования концентрация MX остается постоянной ( со=3,0«10~^ М). Концентрация

ЦНК (с ) в расчете на I п.н. равна: -4-5

I,35•ID М (I), 2,9-10 Ю-5 (3) и 9-Ю"5 (4), 5 тоглощения чистого MX

-5

(2), 4,6-спектр

toe.5. Кривые плавления поли[с<(А-Т)} в комплекое е MX. а - в буфе-е А, с0/с =0 (I), 0,08 (2), 0,15 (3) и 0,3 (4); б - в буфере С, о/Ср=0 (D, 0,02 (2), 0,07 (3), 0,2 (4) и 0,35 (5)

0ДНК с повышением температуры, в пределах сохранения биспиральной структуры; г) изменение свойств 0ДНК при длительном ( ~ 1год) хранении под спиртом; д) термическое плавление 0ДНК при кислых и ще- . лочных рН; е) изменение конформации 0ДНК под действием //а.С£ , мочевины и температуры. Анализ совокупности полученных экспериментальных результатов позволяет предположить, что структурные нарушения ДОК вследствие малигнизации могут происходить за счет негистоновых белков, прочно связанных, вероятно, с м^С обогащенными участками ДНК, что приводит к нарушению функции клетки.

ГЛАВА III. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ПРИРОДНЫМИ И СИНТЕТИЧЕСКИМИ ДНК

В третьей главе рассматриваются термодинамика, структура и природа взаимодействия МХ, АМ и нетропсина с двуспиральными ДНК.

Взаимодействие МХ и АМ с ДНК. МХ и АМ представляют собой сравнительно недавно синтезированные противоопухолевые соединения содержащие плоские циклы и длинные заряженные хвосты (рис.1). Взаимодействие МХ и АМ с двуспиральными НК отражаете: в изменении спектров поглощения в видимой и УФ-области спектра, а также спектров ВД в УФ-области. Исследования показали, что МХ и АМ не являются флуоресцирующими соединениями. Одновременно, их связывание с НК также не приводит к увеличению интенсивности флуоресценции. Следует отметить, что молекулы МХ и АМ оптически не активны и не становятся оптически активными при связывании с НК. Связывание приводит только к изменению интенсивности и положения полос в спектрах КД в области оптической активности ДНК.

Исследуем взаимодействие МХ и АМ с ДНК по характеру изменения спектров поглощения в видимой области спектра. Вначале рассмотрим взаимодействие МХ с ДНК. Как следует из рис.4, при постоянной концентрации МХ с увеличением содержания ДНК тимуса теленка в растворе наблюдается гипохромизм и смещение максимума поглощения при 665 нм в сторону длинных волн. При этом имеется четко выраженная изобести-ческая точка при 676 нм. Следовательно, в буфере А (ионная сила 0,11) при температуре 35°С МХ взаимодействует с ДНК одним способом. При некоторых значениях Ср/с0 (где ср - концентрация ДНК в расчете на пару оснований, а с0 - концентрация МХ в растворе) прекращается дальнейшее изменение спектров поглощения - все молекулы МХ находятся в связанном состоянии. Одновременно исследовался характер изменения спектров поглощения при взаимодействии МХ с ДНК при срав-

нительно малой ионной силе в буфере С (J*-0,011). Как показывают экспериментальные данные, при постоянной концентрации MX с увеличением содержания ДНК в растворе спектры поглощения изменяются, причем при этих ионных силах никаких закономерностей в изменении спектров не наблюдается: в указанных условиях возможно одновременно, покрайней мере, 2 различных способа взаимодействия молекул MX с ДНК. Следовательно, уже из рассмотрения спектров поглощения следует, что характер взаимодействия MX с ДНК зависит от ионной силы раствора. Полученные закономерности следуют также и из спектров КД, полученных в области оптической активности ДНК.

Исследовалась также тепловая денатурация комплексов ДНК с MX в буферах А и G по изменению поглощения при 260 нм. Как видно из рис. 5, связывание приводит к увеличению термостабильности поли[с^(А-Т)] , причем характер изменения формы кривой плавления комплексов в зависимости от концентрации MX различен при различных ионных силах раствора. При уИ-=0,0П кривые плавления становятся двухфазными. Вышеописанные закономерно ;ти полностью остаются в силе и для взаимодействия AM с ДНК.

Связывание MX и AM с ДНК может осуществлятся при помощи интер-каляции ароматических колец и за счет электростатического взаимодействия отрицательно заряженных фосфат:гых групп с /УН -группами MX, которые при нейтральных рН заряжаются положительно. Возможно также внешнее связывание - образование стопкообразннх структур молекул MX вдоль цепи ДНК. Согласно результатам работ ( Lovm , 1985, Kapuscinski ,1988), несмотря на способность MX взаимодействовать с ДНК несколькими способами, основным механизмом связывания является интеркаляция, а в зависимости от условий среды, одновременно с интеркаляцлей, могут реализоваться и другие способы связывания. Поэтому, можно считать, что при ионных силах JJ.- 0,11, когда отрицательно заряженные фосфатные группы полностью экранированы, !! согласно спектрам поглощения (рис.4) и спектрам ВД связывание происходит одним способом, связывание носит в основном интеркаля-ционный характер. Определим параметры, характеризующие интерполяционное связывание MX с двуспиральными ДНК.

Определение параметров, характеризукиих связывание MX и AM с ДНК. Константа связывания и стехиометрия насыщения комплекса !1Х и AM с ДНК рассчитаны из спектров спектрофотометрического титрования. Для расчета из спектрофстометрических кривых титрования (рис.4) по формулам (6) определяли концентрации свободного ( Сг ) и свя-

занного ( С( ) МХ и была построена изотерма адсорбции в координатах Скэтчарда.

■ (6>

Здесь Л^ и А( - поглощение при 665 нм свободного и связанного МХ, Д - поглощение при промежуточных концентрациях МХ. А^ была определена из линейной экстраполяции зависимости А от 1/Ср при 1/Ср— 0. Как следует из рис.6, связывание МХ с ДНК характеризуется нелинейной изотермой адсорбции, которая хорошо описывается теоретической зависимостью (7) для некооперативного связывания лигандов на гомополимере.

где 1= , К - константа связывания, Л. - параметр, характеризующий стехиометрию комплекса полимер-лигавд при насыщении и равный числу.пар оснований полимера, занимаемых одной связанной молекулой лиганда.

Значение К и /г. , для комплексов МХ и А ! с природными и синтетическими ДНК при разных температурах, приведены в табл.2. Как следует из табл.2 для комплексов МХ-ДЧК и АМ'ДНК и - 2-3 и наблюдается избирательность связывания исследованных соединений с различными нуклеотидными парами, причем для МХ - более выраженно.

Используя значение К , определялось изменение свободной энергии Гиббса Д<3 при связывании по фор.'.уле (8)

дб = - кТ^кК (8)

где /? - газовая постоянная, Т - абсолютная температура. Значения Дб? для исследованных комплексов также приведены в табл.2.

Изменение энтальпии йН при связывании МХ с ДНК было определено из анализа Вант-Гоффа зависимости К от температуры. Согласно формуле (9), тангенс угла наклона кривой -Д./с в зависимости от 1/Г дает величину - , если зависимость линейная

АН = -Я "суп (9)

Изменение энтропии А 5 при связывании вычислялось по формуле (10) используя значение Д <5 и Д Н

- 17 -

дБ^-Слв- дн)/т

Величина ДН для комплексов МХ и АМ с ДНК М. 1узос1е1к-Ь1сиа была определена также при помощи изотермического микрокалориметра. Результаты измерений приведены в табл.3. Как следует из табл.3 величина аН для обоих исследованных систем отрицательна, и увеличивается по абсолютному значению с увеличением с0/Ср, достигая Д//--(3,0 ± 0,5) ккал/моль. Для ДН результаты того же порядка получаются и при вычислении по формуле (9). Расчеты показывают, что величина Д$ положительно и составляет соответственно 171 2 и 1212 кал/моль град, для комплексов МХ и АМ с ДОС М. 1узоа.е1к*1си^ Полученное значение для ДН по знаку и по порядку совпадает с величиной энтальпии связывания, определенной микрокалориметрически при интеркаляции др тих соединений с ДНК ( <2иаа.г1:Сов11о ,1974, 1982), однако, следует отметить, что для других интеркаляторов и неинтеркаляторов величина йН почти не зависит от степени заполнения полимера. Этот качественно новый результат получен впервые.

При сравнении полученных закономерностей изменения термодинамических величин при связывании МХ и АМ с ДНК с общими закономерностями наблюдаемыми для других интеркалирующих и ьеинтеркалирую-щих соединений, можно утверждать, что при взаимодействии Ж и АМ с ДНК имеет место интеркаляция ароматических колец молекулы и, одновременно, происходит межмолекулярное взаимодействие боковых групп этих соединений расположившихся в желобках с ДНК, что оказывает существенное влияние на термодинамические параметры связывания. Суммарным взаимодействием, обусловленным этими двумя явлениями и вызвано изменение ДН при связывадаи МХ с ДНК.

Изменение геометрии ДНК вследствие взаимодействия с МХ и АМ. Для характеристики степени изменения геометрии спирали при взаимодействии в зависимости от последовательности оснований, исследовано поведение относительного изменения дихроичного поглощения в максимуме в зависимости от с0/ср. Судя по относитель-

ному изменению л5 для.трех исследованных полинуклеотидов с чередующейся последовательностью оснований в буфере А наблюдается следующая закономерность в характере изменения геометрии пар оснований вследствие взаимодействия АМ и МХ: GC >1С> АТ . Одновременно, связывание одной молекулы АМ приводит к более сильному изменению геометрии спирали, чем связывание МХ.

Исследована также степень изменения геометрии спирали вслед-

Таблица 2

Термодинамические параметры связывания митоксантрона и аме-тантрона с ДНК при нескольких температурах в буфере А

Препарат Т°,С К- -дб!> ккал/моль п.

митоксантрон

М. 1узо<1е1к. 35 6,71 0,5 8,210,1 2,8± 0,2

и 45 3,110,6 8,010,2 2,8*0,2

1« 50 3,010,5 8,110,1 3,01 0,2

м 60 1,910,5 8,110,2 3,010,2

тимуса теленка 35 5,2 ± 0,4 8,110,2 2,410,2

к 50 1,81 0,5 7,8 ¿0,2 2,610,2

к 60 1,310,5 7,810,3 2,4 ¿0,2

поли [<1(о -С)] 35 13,11 0,5 8,7 ¿0,1 2,410,2

аметантрон

тимуса теленка 35 0,3010,1 6,35± 0,15 < 3

М. 1увос1е1к1;1сиз 35 0,3110,1 6,40 ± 0,2 2,7 ± 0,3

поли [¿(о -С)] 35 0,45±0,15 6,6010,2 2,510,2

Таблица 3

Значении онтальпи связывания дН митоксантрона и аметантрона с ДНК К. 1узоае1кг1сиз в буфере А при 25°С

со/ср ~ йИ • ккал на МХ 1 моль препарата АМ

0,015 0,3 0,5 0,146 2,4 _

0,04 0,5 — 0,15 — 3,0

0,08 1,1 — 0,176 2,8 —

0,1 — 1,8 0,2 3,2 —

0,12 1,8 — 0,25 3,1 3,1

0,135 2,3 1,7 0,3 2,8 —

ствие взаимодействия в буфере С. Судя по относительному изменении величины 46 в зависимости от с0/°р» для комплексов трех исследованных полинуклеотидов с МХ наблюдается следующая закономерность в способности изменять геометрию пар оснований з зависимости от последовательности оснований при взаимодействии с одной молекулой

MX: GC>AT>IC .

Влияние МХ и АМ на B~Z равновесие в молекулах поли [4(6 -С)] стимулируемое No.it. . Известно, что поли[сН<3 -С)] полностью переходит в 2 -форму, когда концентрация IV&Ci больше 2,5 М ( Pohl , 1972). В то же время, если все центры связывания поли[d(б -C)J заняты интеркаляторами, то В-»Н переход не наблюдается при увеличении концентрации ¡Va.CZ . По от ому, исследовалось связывание МХ и АМ с поли[d(G -С)] , когда полимер находится в B-форме и в 2 -форме, стимулированной 3,1 М fi/aCC . Опыты показывают, что когда поли [d (G-С)] находится в B-форме, добавление МХ приводит к изменению спектров ВД. Когда же поли[Д£-С)] находится в 2 -форме, добавление МХ не приводит к заметным изменениям спектров КД. Одновременно, из рассмотрения спектров КД ДНК К. lysoüeiicticiis (которая всегда находится в правоспиральной форме) при добавлении МХ и АМ в раствор ДНК при 3,1 М Ua.CZ. , молено утверждать, что наблюдаемое постоянство спектров ВД Z -формы ДНК при добавлении МХ обусловлено левоспиральностью конформаций поли[d(б -С)] и особенностью взаимодействия МХ и АМ с 2 -ДНК. Исследовалась также кинетика В-»Z перехода в поли[с<(б -С)] в комплексе с MX, АМ и БЭ. Как показывают экспериментальные данные, как и другие интеркаляторы, МХ и АМ затрудняют B-»Z переход стимулированный MxCi -ом в молекулах no^n[d(G -С)] .

Взаимодействие нетропсина с олигонуклеотидом a(GCGATCiiC). Известно, что нетропсин специфически взаимодействует с АТ-парами B-формы ДНК неинтерполирующим способом, располагаясь в узком желоб! се (Рурский, 1976; Dicherson. , 1985). Положительно заряженные НИ^ ~ "РУппи электростатически взаимодействуют с фосфатами ДНК, а пептидные группы образуют три водородные связи с атомом 02 тимина и атомом N3 адзнина. Поэтому интересно было выяснить связывание нетропсина с двуспиральным олигонуклзотидсм, содержащим всего два последовательно расположенных нуклеотида типа А и Т, как имеет место в олигонуклеотиде d(GCGATCGC) . Специфическое взаимодействие нетропсина с B-формой ДНК приводит к появлении оптической активности в области 300-350 нм. Как показывают спектры

КД (рис.7), полученные при трех концентрациях нетропсина, с увеличением содержания нетропсина в растворе, вне области собственной активности ДНК дополнительная полоса не появляется. Между тем наблюдается монотонное уменьшение максимума дихроичного поглощения при 283 нм и смещение точки с нулевым дихроичныы поглощением в сторону длинных волн (рис.7). Такой характер изменения спектров ВД аналогичен изменениям, происходящим в ДНК под действием мочевины, что подробно рассмотрено в главе 5. Следовательно, наличие двух последовательно расположенных нуклеотидов А и Т недостаточно для специфического взаимодействия нетропсина с В-формой ДНК.

В четвертой главе рассмотриваются вопросы устойчивости двуспи-ральных РНК при образовании комплексов с БЭ, МХ и АМ.

Взаимодействие БЭ с двусгогральными синтетическими полирибонук-леотидами. Взаимодействие БЭ с двуспиральными полирибонуклеотида-ми отражается в изменении спектров поглощения, КД и флуоресценции БЭ в видимой области спектра. Сначала рассмотрим взаимодействие БЭ с поли(Акюли(и) в буфере А. Согласно спектрам поглощения в исследуемых условиях БЭ взаимодействует с поли(А)-поли(У) одним интер-каляционным способом. Для данного типа взаимодействия константа связывания и стехиометрия насыщения комплекса БЭ-поли(А)-поли(С/) рассчитаны из спектров спектрофотометрического и флуориметрического титрования. Для расчета из кривых титрования определялись концентрации свободного и связанного БЭ по формулам (6) и была построена изотерма адсорбции. Расчеты изотерм связывания, проведенные по данным спектрофотометрического и флуориметрического титрования при трех температурах показаны в виде диаграмм Скэтчарда. Связывание БЭ с поли(А)-поли(0 характеризуется нелинейной изотермой адсорбции, которая хорошо описывается теоретической зависимостью (II), полученной для антикооперативного связывания лигандов на гомополимере, со стехиометрией насыщения одна молекула БЭ на две пары оснований.

ГЛАВА 1У. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ДВУСПИРАЛЬНЫМИ П0ЛИРИБ0НУКЛЕ0ТИДАМИ

где СО - параметр, характеризующий антикооперативность.

Расчеты показали, что при стехиометрии насыщения одна молекула БЭ на две пары оснований (tb— 2), получаются следующие значения: для константы связывания К- (2,5±0,5)-10^ М~ ( дбсв = -8,8±0,2 ккал/моль) и параметра антикооперативности С0=0,4±0,1 ( Д<S ак =0,55±0,15 ккал/моль) при 30°С и ^=0,11. Изменение &G при связывании определено по формуле (8).

Изменение энтальпии ЛН при связывании БЭ с поли(А)лоли(и) определено при помощи изотермического "flow " микрокалориметра. Как показывают экспериментальные данные, величина д/V почти не зависит от степени заполнения *Z и приблизительно равна Д//=-7,2 ± 0,3 ккал на I моль связанного БЭ. Величина йН была также определена при помощи флуориметрического титрования, проведенного при трех разных температурах, и анализа зависимости К от температуры по формуле (9) и составила&Н= ~8± 2 ккал/моль, что согласуется с калориметрическими данными.

Аналогические измерения были проведены и при исследовании взаимодействия БЭ с поли( S )поли(С). При связывании БЭ с поли(<Зкюли (С) в спектрах КД, поглощения и флуоресценции наблюдаются те же изменения, что и для взаимодействия БЭ с поли(А)поли(СО. Однако эти изменения гораздо слабее, чем для взаимодействия БЭ с поли (А)-поли(С) при одинаковых относительных концентрациях полинуклеотидов, и помимо этого необходимо на порядок больее количество поли(£5>по-ли(С) по сравнению с поли(Акюли(и), чтобы получить спектр поглощения БЭ в полностью связанном с поли(£»Уполи(С) состоянии. При взаимодействии с поли(Акголи((/) БЭ находится в полностью связанном состоянии, когда концентрация полимера в растворе почти на порядок больше концентрации БЭ. Во время спектрофотометрического титрования Ю-4 М БЭ при концентрациях поли(б>поли(С) порядка 10"^ М только часть молекул БЭ находится в связанном состоянии, и связывание практически завершается, когда концентрация полимера достигает примерно Ю-^ М, т.е. при большом избытке полимера в растворе. Для количественного описания связывания БЭ с поли(бХполи(С) при помощи линейной экстраполяции было определено поглощение БЭ при 480 нм в полностью связанном состоянии и построена изотерма адсорбции в координатах Скэтчарда. Однако при таком слабом'связывании пользоваться общепринятым представлением изотерм адсорбции нельзя/>тах как невозможно получить '.'очные значения К и ft . to такого рассмотрения следует, что стехгометрия комплекса при насыщений'*составляем не менее 0,2 молекул БЭ на пару оснований, а К порядка

ю3 м-1.

Для более точного определения К предложен следующий метод обработки кривых титрования. Титрование М БЭ проводили при комнатной температуре. Как следует из рис.8, с возрастанием концентрации поли(6>поли(С) наблюдается монотонное увеличение относительной интенсивности флуоресценции. При малых степенях заполнения (когда полимер в избытке), т.е. при достаточно малых значениях 'Ь , взаимодействие между связанными с полимером молекулами БЭ можно не учитывать и для исследования связывания лигандов можно использовать уравнение (II), полагая 60=1, т.е. без учета ан-тикооперативности взаимодействия молекул БЭ. Поскольку в этих условиях /11 не может быть больше 0,05, то, упрощая уравнение (II), получаем: ^ £

— * л* 1У

СГ С;Ср~К . (12)

Относительную интенсивность флуоресценции (где Р - флуоресценция раствора при наличии полимера, а Ро флуоресценция без

полимера) можно выразить следующим образом:

= Ш)

Ра Со С0 ' Чэ

где - отношение величин квантовых выходов флуоресценции моле-

кул БЭ в связанном и свободном состоянии. Преобразуя урав. (13), с учетом урав. (6) я (12), имеем

+ л— X С14)

Р-р0 Ир'1 к(Ь-0 СР

Как следует из урав. (14), зависимость Р0/(Р-Р,,) от 1/ср должна быть приблизительно линейной и из этой зависимости можно определить и К • Экспериментальные данные и результаты расчетов приведены на рис.8. Из них получаются следующие значения: -13± I и К =(4±I)• 10%"*', последнее из которых согласуется с изотер мами адсорбции, построенными по спектрам титрования.

Аналогичные исследования проведены и для поли(1)-поли(С). Как следует из рис.8, в этом случае относительное увеличение флуоресценции более сиьно выражено по сравнению с поли(б)-поли(С). В случае поли(1кюли(С) получается: 35± I и К= (1,51 0,3)-Ю4 Как видил, значение К для поли(<3)-поли(С) немного меньше, чем для поли(1 кюли(С) и значительно меньше, чем для поли(А)поли(С). Изменение энтальпии йН при связывании БЭ с поли(<3>поли(С)

Рис.6. Изотермы связывания в координатах Сквтчарда, построенные с помощью спектрофотометрического титрования МХ с ДНК М. 1узо<1ехИхсиз в буфере А при 35 (I), 45 (2), 50 (3) и 60°С (4)

о,и оаг г

Рис.7. Спектры КД олигонуклео тида 6.{^0аАТСй0)2 (С =

1,4»Ю-4 М) при трех концентрациях нетропсина г : I - 0; 2 - 0,2; 3 - 0,7; (г - относительная концентрация нетропсина в молях на

А, нм

один моль фосфата. При г = 0,2 наблюдается насыщение при связывании нетропсина с поли

Рис.8. Зависимость относительного изменения флуоресценции от концентрации полирибонукле-отида в расчете на пару оенова-ний для поли(<Нполи(С) (I), поли(1 кюли(С) (2) и поли(А)-поли (и) (3) в буфере А при 25°С. В правом углу показана зависимость V от 1/с„ для поли

г "" ""о ( Р

(О-поли(С) (I) и поли(х)поли (С) (Й

0.05

0.04

0.03

было определено при помощи изотермического микро'калориметра типа "Ъа-ЬсЬ". При нормировании АН по БЭ, связанному с полий)-поли (С), получается, что АН слабо зависит от % ив пределах ошибки эксперимента равна -(7,5± 0,5)-ккал на I моль связанного БЭ. В табл.4 приведены термодинамические параметры связывания БЭ с исследованными полирибонуклеотидами. Из данных, приведенных в табл. 4 можно сделать вывод, что значение ДН для поли(£»>поли(С) и поли (А>поли(С) почти одинакого и совпадает со значением для ДНК. Поэтому природа сил," обеспечивающих взаимодействие БЭ с синтетичес-• кими двуспиральными полирибонуклеотидами, носит преимущесвенно эн-тальпийный характер, тогда как высокая избирательность обусловлена различием в энтропии связывания с поли(б>поли(С) и поли(АкюлиШ).

Взаимодействие БЭ с поли(£). В отличие от других полинуклеоти-дов поли(£) не находится в одноцепочечной форме. Взаимодействие БЭ с поли((3) исследовалось по характеру изменения спектров поглощения БЭ в видимой области спектра при связывании с поли(й). Константа связывания и стехиометрия комплекса поли«3)*БЭ при насыщении определены из кривых спектрофотометрического титрования по формулам (б) и (7). Расчеты показали, что в буфере А при 25°С К~ (5,2+0,8> 10^ М-* и «.= 2,5, то есть одна молекула БЭ при насыщении связывается с 5 азотистыми основаниями. Для сравнения отметим, что /г. комплекса БЭ с комплементарными двуспиральными нуклеиновыми кислотами составляет П~2.

Взаимодействие МХ и АМ с двуспиральными синтетическими полирибонуклеотидами. При взаимодействии МХ и АМ с двуспиральными полирибонуклеотидами поли(А)-поли(С), поли((3)-поли(С) и поли(1кюли(С) в спектрах НД и поглощения наблюдаются, в основном, такие же изменения, что и при взаимодействии указанных соединений с ДНК. Значения Кап., для комплексов МХ и АМ с двуспиральными полирибонуклеотидами приведены в табл.5. Как следует из табл.5, значение П. для комплексов РНК-МХ составляет /1=6-8, что почти в три раза больше, чем П. для комплексов ДНК-МХ, для которых п.- 2-3. Константы связывания МХ почти на порядок больше при связывании с ДНК, чем с РНК. Наблюдается также избирательность связывания МХ с различными рибонуклеотидными парами. По величине сродства к МХ их можно расположить в ряд:- (з С>1С>Аи , что противоположно сродству БЭ с теми же парами. Константа связывания МХ с РНК, почти на порядок меньше, чем для комплексов МХ-РНК. Из общепринятого анализа изотерм связывания следует, что стехиометрия комплекса при насыщении сос-

25 - Таблица 4

Термодинамические параметры связывания БЭ с двуспиральными поли-рибонуклеотидами в буфере А при 25°С

полимер

К (ЬГ1)

-Аб

(ккал/моль)

■АН

¿Б п.

(кал/моль,К)

поли(Акюли(и) поли(отполи(С) поли(г)-поли(С)

(2,510,5)-10 (411)'10^ (1,510,3)- Ю4

8,810,2 5,010,3 5,810,2

7,210,3 7,510,5

512 -813

2 <5 <5

Таблица 5

Термодинамические параметры связывания митоксантрона и аметан-трона с поли(А}поли(и), поли(с кгали(С) и поли(1 >поли(С) при некоторых температурах в буфере А

полимер Т ,°с к-кг4, м-1 -дб ккал/моль п.

митоксантрон

поли(й >поли(С) 35 9,811,5 7,110,1 5,810,3

н 50 5,71 1,0 7,110,2 6,6±0,3

м 60 3,3± 1,0 6,810,3 6,7 ± 0,4

поли (г )-поли(С) 35 8,211,2 7,0Ю,2 6,210,5

поли(А)-поли&1) 35 3,110,5 6,410,1 7,2Ю,5

аметантрон

поли (й )-поли(С) 35 1,210,8 5,8Ю,3 < 10

полиСГ >поли(С) 35 1,010,5 5,710,2 <10

поли(А)лоли41) 35 1,0±0,6 5,610,2 < 10

тавляет не менее 0,1 молекул АМ на пару оснований, а К порядка 10^ Более точное значение /с приведенное.в табл.5, получено при помощи обработки спектров титрования по способу, описанному выше, согласно формуле (14).

Изменение знтальпии &Н при связывании МХ с поли(£Гкюли(С) было определено при помощи изотермического микрокалориметра и по формуле (9). Результаты измерений показывают, что АИ отрицательно, что характерно для интеркалирующих соединений, и увеличивается по абсолютному значению с увеличением с0/Ср, достигая приблизительно АН =-(3,2±0,2) ккал на I моль МХ.

Если сравнить изменение термодинамических параметров при связывании МХ с ДНК и РНК, можно заключить, что для обоих комплексов зти параметры изменяются аналогичным образом, следовательно, и связывание этих соединений с ДНК и РНК происходит аналогичным образом. Разница,в значениях параметров, характеризующих связывание указанных соединений с ДНК и РНК, обусловлена тем, что ДНК в исследуемых условиях находится в В-форме, а РНК - в А-форме (Иванов, 1973), геометрии спиралей которых существенно отличаются друг от друга.

ГЛАВА У. ВЛИЯНИЕ МОЧЕВИНЫ НА К0Н<ЮРМАДИ0НН0Е СОСТОЯНИЕ ДВУСПИРАЛЬШХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

В третьей главе было показано, что не наблюдается специфическое связывание нетропсина с олигонуклеотидом сКосаАТССС) . С этой точки зрения имеет смысл также проводить модельные исследования, и исследовать взаимодействие НК с низкомолекулярными соединениями, содержащими такие же функциональные группы, что и нетроп-счн (- А/Н^, -СО, -НЮ. С этой целью для простоты была взята мочевина ( ( ^2^00 ), которая содержит и группы. Из предварительно проведенных экспериментов известно, что под действием мочевины спектры КД ДНК изменяются таким же образом, что и при неспецифическом взаимодействии нетропсина с ДНК.

Конформационные переходы ДНК и двуспиральных РНК под действием мочевины. О конформационных переходах, происходящих в НК при увеличении концентрации мочевины в растворе можно судить по изменению спектров КД: с увеличением концентрации мочевины уменьшается положительная полоса, увеличивается абсолютное значение отрицатель ной полосы и происходит смещение точки с нулевым дихроичным поглощением в сторону длинных волн (аналогично изменениям спектров КД,

при неспецифическом связывании нетропсина с ДНК). Изменение спектров ВД ДНК в водных растворах под действием мочевины может быть обусловлено: а) образованием в растворе межмолекулярных и внутримолекулярных агрегатов; б) образованием комплексов ДОК с мочевиной; в) изменением конформации самой молекулы ДНК. Проведенные нами специальные исследования показывают, что изменения в спектрах КД обусловлены конформационными изменениями самой молекулы НК в пределах сохранения двуспиральной структуры, внутри данного семейства форм. Нам представляется, что изменение конформации ДНК и РНК под действием мочевины обусловлено уменьшением гидратации присутствующих в растворе ионов щелочных металлов, и является результатом структуроразрушающего действия мочевины на воду. Для обоснования вышесказанного, исследовано влияние различных факторов (ионы щелочных металлов, температура, бС- содержание) на конформацион-ное состояние ДНК, реализуемое под действием мочевины а также зависимость термостабильности полинуклеотидов от концентрации мочевины. Обобщая экспериментальные данные, можно заключить, что информационное состояние ДНК, реализуемое под действием мочевины, качественно не отличается от конформации, реализуемой в солевых растворах.

Влияние мочевины на характер В-»2 перехода в поли(5-С)] под действием No.CZ. . Исследовали кинетику В-»Н перехода в присутствии мочевины при концентрациях 2,1 и 3,5 М <УаС£. Опыты показывают, что при комнатной температуре в присутствии мочевины наблюдаемый спектр КД аналогичен наблюдаемому под действием только , но

при высоких температурах. Одновременно характер изменения Л¿295 со временем показывает, что мочевина облегчает В-»2 переход.

ГЛАВА У1. ВЛИЯНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА СТРУКТУРУ дак ОПУХОЛИ САРКОМЫ 45

Во второй-главе было показано, что в опухолевых ДНК по сравнению с ДНК нормы существуют определенные структурные отличия, дефектные участки, которые можно выявить спектрофотометрически и микрокалориметрически. Наличие дефектных участков в опухолевых ДНК позволяет предположить, что взаимодействие противоопухолевых соединений с опухолевыми ДНК, возможно, отличается от взаимодействия этих же соединений с нормальными ДНК.

Особенности взаимодействия митоксантрона и аметантрона с ДНК опухоли саркомы 45. Взаимодействие МХ и АМ а дДНК и дДОК исследо-

вано при помощи спектрофотометрического титрования. Опыты показывают, что взаимодействие МХ с 0ДНК качественно отличается от взаимодействия МХ с 3ДНК. С увеличением концентрации (/ЩК не обнаруживается характерная для всех спектров изобестическая точка, как это наблюдается при взаимодействии МХ с 3ДДК (рис.4). Следовательно, МХ при ионной силе 0,11 взаимодействует с 0ДНК по крайней мере двумя различными способами: в 0ДНК помимо обычного интеркали-рования, центрами связывания могут быть и дефектные участки. В спектрах титрования изобестическая точка при 678 нм наблюдается при высоких значениях cQ/Cp. Можно, утверждать, что изобестическая точка, получаемая при высоких значениях cQ/Cp - результат почти одновременного насыщения всех центров связывания 0JJiK. Используя спектрофо'тометрические спектры титрования определены параметры к и Н, , характеризующие связывание МХ с 3ДНК и одновременное взаимодействие МХ с обоими центрами связывания 0ДНК, когда заполнение слабых и сильных мест связывания происходит в одинаковой степени. Расчеты показали, что для комплексов МХ с 3ДНК к~ 4*10^ и tv-2,5± 0,2, а для комплексов МХ *0ДНК М-1 и л.= 2,4±0,2. Воз-

можная причина наблюдаемого отличия в значениях АС обусловлена, скорее всего, структурными особенностями опухолевых ДНК.

Обобщая вышеизложенное, можно предположить, что при связывании МХ с ДНК опухолево трансформированных клеток наблюдается тенденция к более сильному связыванию. В конце отметим, что характеры взаимодействия МХ и АМ с 0ДНК и 3ДНК качественно не отличаются.

Влияние противоопухолевых соединений сарколизина и фоссЬемида на структуру ДНК. Не углубляясь в природу образования особенностей на ДКП 0ДНК исследовано влияние сарколизина и фосфемида на структуру 0ДНК in vivo и in vitro , исходя из характера изменения ДКП 0ДНК под действием этих соединений с одновременным сравнением с ДКП 3ДНКг Как показывают экспериментальные данные, под действием сарколизина и фосфемида!п vivo почти полностью исчезают характерные для 0ДНК низкотемпературные пики ( в области 54-62°С) и вид ДКП 0ДНК приближается к таковому ДНК в норме, но кривая смещена приблизительно на 0,5-1°С, в сторону низких температур. В табл.1 приведены значения , дТ , АН > м^С к 6 +С ■+ м5С в исследуемы; образцах ДНК. Как видно из табл.1, под действием исследуемых соединений изменяются указанные величины для 0ДНК, приближаясь к соо1 ветствующим параметрам для 3ДНК. Они также оказывают довольно сил: ное влияние и на структуру 3ДНК (табл.1). Одновременно, экспериме;

тальные данные показывают, что под действием фосфемида и сарколи-зина in vitro характерные особенности 0ДНК остаются почти неизменными. Следовательно, влияние фосфемида и сарколизина на 0ДНК in . vivo обусловлено не непосредственным взаимодействием этих соединений с опухолевыми ДНК.

Таким образом, при помощи ДКЛ, параметров плавления и нуклео-тидного содержания можно исследовать эффективность влияние фармакологически активных соединений на структуру ДНК на молекулярном уровне.

- ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В диссертационной работе при помощи полученных экспериментальных данных разработаны теоретические положения и предложены простые методы, дающие возможность выяснить термодинамику, структуру и природу взаимодействия биологически активных веществ с нуклеиновыми кислотами, в также исследовать вопросы устойчивости ДНК при опухолевой трансформации клеток.

В итоге проделанной работы, на основе разложения дифференциальной кривой плавления на гауссовые составляющие, предложен спо-собисследования распределения нуклеотидов вдоль цепи ДНК, при помощи которого можно выявить возможные изменения как в первичной, так и во вторичной структуре ДНК, вычислить средние характеристики первичной структуры ДНК и отличить опухолевую ДНК от ДНК нормы. В результате анализа полученных экспериментальных данных заключается, что возможной причиной отличия опухолевой ДНК отДНК нормы является наличие в опухолевой ДНК участков с измененной структурой, возникающих вследствие гиперметилирования цитозина в 5~ок положении. На основе полученных данных еозмокно указать к каким структурным изменениям молекулы ДНК может приводить гиперметилирование. При помощи предложенного метода можно исследовать также сравнительную устойчивость опухолевой ДНК и ДНК нормы под действием биологически активных Ееществ, выяснить избирательность влияния исследуемых соединений на нуклеотидные пары и т.д. В частности, при помощи указанного метода установлено, ч?о вопреки экспериментально наблюдаемой избирательности влияния фосфемида и сарколизина на клеточном уровне, избирательность влияния этих соединений на ДНК опухоли и нормы не обнаружена. Следовательно, избирательность влияния этих соединений, по-видимому, не обусловлена непосредственным взаимодействием этих соединений с ДНК. Возможно, комплексы опухолевых ДНК с

препаратами, вовлеченные в митотический цикл, становятся менее устойчивыми. Дальнейшее увеличение чувствительности регистрации кривой плавления ДНК, открывает новые возможности по ранней диагностике злокачественной трансформации клетки.

фи выяснении устойчивости комплексов нуклеиновых кислот с биологически активными веществами, необходимо определить термодинамические параметры связывания. При слабом связывании, когда экспериментально невозможно фиксировать физические характеристики полность связанного состояния, пользоваться общепринятым представлением изо-•терм адсорбции нельзя. Поэтому был предложен новый метод определения константы связывания. Предложенный метод математически прост и не требует большого количества нуклеиновых кислот. Для комплексов нуклеиновых кислот с митоксантроном и аметантроном, которые содержат плоские циклы и длинные заряженные хвосты, обнаружен качественно новый результат - сильная зависимость энтальпии связывания от степени заполнения нуклеиновых кислот, что не наблюдается для интеркаляторов и неинтеркаляторов. Одновременно, исследование устойчивости комплексов нуклеиновых кислот с митоксантроном и аметантроном имеет также фундаментальное значение, так как выявляет совершенно новые закономерности в термодинамических свойствах комплексов нуклеиновых кислот с биологически активными веществами, а полученные результаты могут создать предпосылки для даоьнейшей разработки теории адсорбции протяженных лигандов, способных одновременно взаимодействовать электростатически и интеркалироваться.

Результаты диссертации указывают на применение в дальнейшем предложенных разработок для исследования вопросов устойчивости комплексов биологически активных веществ с хроматином, использование дифференциальных кривых плавления для исследовании онкогенов и фрагментов ДНК с заданным точечными мутациями. Эти исследования в настоящее время начаты в Ереванском государственном университете совместно с сотрудниками Института тонкой органической химии АН РА.

ВЫВОДЫ

I. Предложен метод исследования распределения нуклеотидов вдоль молекулы ДНК на основе разложения дифференциальной кривой плавления на гауссовые составляющие. При помощи этого метода определены среднее нуклеотидное содержание, дисперсия и другие средние характеристики блочных ДНК. Минимальное число составляющих для ДНК тимуса теленка и Е. сл& равно пяти и трем, соответственно. Показана ус-

тойчивость вычисленных средних характеристик ДНК к выбору способов разложения дифференциальной кривой плавления.

2. Впервые применены спектрофотометрически полученные кривые плавления для выявления различий между ДНК из нормальных и опухолевых тканей. Показано, что при помощи дифференциальных кривых плавления и температурной зависимости спектров кругового дихроизма можно выявить возможные структурные изменения в опухолевых ДНК. Показано, что термодинамические параметры термического плавления и содержание 5-метилцитозина для ДНК опухоли отличаются от ДНК нормы. Причиной такого отличия является наличие в ДНК опухоли участков с измененной структурой, возникающих вследствие гиперметилирования цитозина в 5-ом положении.

3. Разработан новый способ определения константы связывания биологически активных веществ с двуспиральными нуклеиновыми кислотами при слабом связывании, когда экспериментально невозможно фиксировать и получить физические характеристики полностью связанного состояния. При помощи этого метода определены термодинамические параметры связывания бромистого этидия, митоксантрона и аметантрока с синтетическими двуспиральными полирибонуклеотидами. Показано, что наблюдается сильная избирательность связывания бромистого этидия

с рибонуклеотвдными парами, которая имеет энтропийную природу. По величине сродства к бромистому этидию рибо.чуклеотиднке пары располагаются в ряд: А и > 1С > 6С .

4. Впервые экспериментально обнаружена сильная зависимость энтальпии связывания митоксантрона и аметантрона от степени заполнения нуклеиновых кислот, которая не наблюдалась для интеркаляторов и неинтеркаляторов. Энтальпия связывания указанных соединений с двуспиральными нуклеиновыми кислотами отрицательна, увеличивается по абсолютному значению почти линейно с увеличением числа заполнений и достигает приблизительно -(3,0±0,5) ккал/моль.

5. Впервые показано, что наличие двух последовательно расположенных А и Т нуклэотидов недостаточно для специфического взаимодействия противоопухолевого соединения нетропсина с В-формой ДНК. Показано, что изменение спектра КД при этом мало и сходно с тем изменением, что было выявлено нами при исследовании взаимодействия ДНК с мочевиной.

6. Исследован характер взаимодействия противоопухолевых соединений

митоксантрона и аметантрона с ДНК опухоли саркомы 45. Показано, что в опухолевых ДНК наблюдается тенденция к более сильному связыванию.

7. При помощи дифференциальных кривых плавления выяснено влияние противоопухолевых соединений алкилирующего типа сарколизина и фос-фемида на структуру ДНК опухоли саркомы 45 опухоленосящих крыс и ДНК печени здоровых крыс in viva Вопреки экспериментально наблюдаемой избирательности влияния этих соединений на клеточном уровне, показано, что-не наблюдается избирательность влияния этих сое- ' динений на ДНК опухоли и нормы.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Асланян В.М., Бабаян Ю.С., Сагателян В.В., Логосян М.К. Определение нуклеотидного состава ДНК УФ-спектрофотометрическим методом // Биол. журнал Армении.- 1978.- Т.31.- №7.- С.676-682.

2. Асланян В.М., Бабаян Ю.С., Сагателян В.В., Погосян М.К. Кон-формационние переходы ДНК в водных растворах карбамида // Биол. журнал Армении.- 1978.- T.3I.- №8.- С.813-817.

3.Гарибян Д.В., Степанян Г.М., Даниелян И.С., Бабаян Ю.С., Гариб-джанян Б.Т., Асланян В.М. Сравнительное изучение структуры и свойства ДНК некоторых экспериментальных опухолей // Докл. АН Арм.ССР. - 1979.- Т.69.- №4.- С.236-242.

4. Асланян В.М., Арутюнян С.Г., Ясем II.П., Бабаян Ю.С., Гарибян Д.В., Степанян Г.М. Сравнительная характеристика ДНК, выделенных из тканей здоровых и опухоленосящих крыс в процессе опухолевого роста // Биол. журнал Армении.- 1979,- T.32.-WI.- C.I064-I069.

5. Асланян В.М., Бабаян Ю.С. Влияние мочевины на конформацию двойной спирали ДЖ // Биофизика.- 1979.- Т.24.- №5,- С.935-936.

6. Гарибян Д.В., Степанян Г.М., Даниелян И.С., Бабаян Ю.С., Арутюнян С.Г., Гарибджанян Б.Т., Асланян В.М. Изменение специфического метилирования ДНК в тканях здоровых и опухоленосящих крыс (с саркомой 45) под влиянием активного канцеролитика алкилирующего типа // Биохимия.- 1980.- Т.45.- №11.- С.2028-2035.

7. Вардеванян П.О., Бабаян Ю.С., Вардапетян P.P., Паносян Г.А., Асланян В.М., Карапетян А.Т. Простой способ определения среднего содержания нуклеотидов в ДНК из кривых плавления // Биофизика.-1983.- Т.28.- М.- C.I30-I3I.

8. Гарибян Д.В., Степанян Г.М., Даниелян И.С., Бабаян Ю.С., Асланян В.М., Гарибджанян Б.Т. Влияние дексаметазона на ДНК опухолевой

ткани // Докл. АН Арм.ССР.- 1983.- Т.76,- М.- С. 178-183.

9. Бабаян Ю.С., Вардеванян П.О., Гарибян Д.В., Арутюнян С.Г., Кулага Л.Л., Асланян В.М. Применение метода плавления в выявлении различий между ДНК из нормальных и опухолевых тканей // Биофизика.

- 1984.- Т.29.- »2.- С.313-314.

10. Асланян В.М., Бабаян Ю.С., Арутюнян С.Г. Конформация и термостабильность ДНК в водных растворах мочевины // Биофизика.- 1984.-Т.29.- №3.- С.372-376.

11. Бабаян Ю.С., Гарибян Д.В., Даниелян И.С., Асланян В.М., Гарибджанян Б.Т. Изменения в структуре ДНК, индуцируемые сарколизином in vivo и in vitro // Вопросы мед. химии.- 1984.- Т.30.- №5.-С.92-95.

12. Бабаян Ю.С., Асланян Л.Л., Ананян Г.В., Гарибян Д.В. Влияние фосфемида в сочетании с дексаметазоном на структуру ДНК саркомы 45 // Биофизика.- 1985.- Т.30.- №3C.4I4-4I7.

13. Асланян В.М., Бабаян Ю.С., Ясем П.П. Физико-химические особен-, ности ДНК, выделенной из опухолевых клеток // В сб.: Исследование структуры, физ. свойства и энергетики биологически активных молекул/ Вильнюс: 1986.- С.96-102.

14. Бабаян Ю.С., Асланян Л.Л., Асланян В.М. Выяснение механизма взаимодействия противоопухолевого препарата митоксантрона с ДНК // В сб.: Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей / Черноголовка: 1987,- С.90-92.

15. Бабаян Ю.С., Ксодо Л.Е., Манзини Д. Нетропсин не связывается с олигонуклеотидом d(GCGATCGC) // Биофизика.- 1988.- Т.33,-№4.- С.716-717.

16. Бабаян Ю.С., Манзини Д., Квадрифолио Ф. Взаимодействие бромистого этидия с синтетическими двуспиральными полирибонуклеотидами // Молекуляр. биология.- 1988.- Т.22.- №4.- С.898-910.

17. Бабаян Ю.С. Конформация и термостабильность двуспиральных нуклеиновых кислот водных растворах мочевины // Молекуляр. биология.- 1988,- Т.22.- C.I204-I2I0.

18. Гарибян Д.В., Даниелян И.О., Бабаян B.C., Галстян Г.Г., Захар-ян P.A., Гарибджанян Б.Т. Влияние воздействия препаратов нуклеиновых кислот на опухолевую ДНК // Яурн. экспер. и клинич. медицины.

- 1988.- Т.28.- М.- С.390-395.

19. Асланян В.М., Бабаян Ю.С., Арутюнян С.Г., Гарибджанян Б.Т., Даниелян И.С., Гарибян Д.В., Аджигитов Ф.И. Влияние афлатоксина Bj на ферментативное метилирование и вторичную структуру ДНК в

печени крыс // Вопросы онкологии.-1989.- Т.35.- №1.- С.48-52.

20. Бабаян Ю.С. Связывание бромистого этидия с полирибогуаниловой кислоты // Биополимеры и клетка.- 1989.- Т.5.- №3.- С.79-82.

21. Бабаян Ю.С., Туыян В.А., Асланян В.М. Взаимодействие противоопухолевого препарата митоксантрона с поли(Г>поли(Ц) // Биофизика. - 1990.- Т.35.- М,- С.679-680.

22. Бабаян Ю.С., Гарибян Д.В. Структурные особенности ДНК опухоли саркомы 45// Биофизмка.- 1990.- Т.35.- №4.- С.592-596.

23. Бабаян Ю.С.,.Манзини Д. Взаимодействие противоопухолевого соединения митоксантрона с двуспиральными нуклеиновыми кислотами // Молекуляр. биология.-. 1990.- Т.24.- №4.- C.I084-I094.

24. Бабаян Ю.С. Конформационное состояние молекул поли[с((I -С)] в водных растворах // Молекуляр. биология.- 1991.— Т.25.- №2.- С. 388-395.

25. Бабаян Ю.С., Манзини Д., Ксодо Л. Связывание митоксантрона и аметантрона с поли [д(Г-Ц)] не препятствует стимулированному В~2 переходу // Биофизика.- 1991.- Т.36.- №2.- С.266-270.

26. Бабаян Ю.С. Особенности взаимодействия противоопухолевого соединения митоксантрона с ДНК опухоли саркомы 45 // Биофизика.-1991,- Т.36,- №1.- С.35-38.

27. Aslanian V.M., Babaian Yu.,S., Haruoutyunian S.G., Tatevosian V.O. Influence of low molecular amins on the conformational state of DMA // Studia Biophysica.- 19S2.-V.87.-No2/3.-P.209-210.

28. Aslanian V.M., Babaian Yu.S., Yasem P.P. Investigation of DMA conformation and thermostability in Ji - alanine aqueous solutions // Studia Biophysica.- 1982.-V.87.-Но 2/3.-P.101-102.

29. Babayan Yu., Manzini G., Xodo L., Quadrifoglio P. Base specificity in the interaction of ethidium with synthetic polyribonucleotides // Hucleic Acids Res. -1987.- V.15.-No 14-.- P.5803-5812.