Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотомодификация окрашенных макромолекул в растворах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фотомодификация окрашенных макромолекул в растворах"

На правах рукописи

Никиян Анк Николаевич

Фотомодификация окрашенных макромолекул в растворах

03.00.02-Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Саратов - 2004

Работа выполнена в Институте микро- и нанотехнологий Оренбургского государственного университета.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

Летута Сергей Николаевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Мельников Геннадий Васильевич

Защита диссертации состоится 29 июня 2004 года в 1530 на заседании диссертационного совета Д 212.243.05 в Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского по адресу: 410012, Саратов, Астраханская 83, Физический факультет, Большая физическая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке СГУ. Автореферат разослан мая 2004 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.243.05,

доктор физико-математических наук, профессор Ульянов Сергей Сергеевич

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН.

доктор физико-математических наук

Актуальность проблемы

Макромолекулы нуклеиновых кислот (НК) устойчивы к прямому действию ближнего УФ и видимого светаОднако в присутствии органических красителей природных или синтезированных - в растворах и биосистемах возможны светоиндуцированные процессы, сопровождающиеся модификацией полимерных цепей. Важность исследования фотомодификации нуклеиновых кислот в том, что любое нарушение компонентов ДНК приводит к изменениям в метаболизме клетки и ее генетических свойств.

Совместное действие света и органических красителей на макромолекулы НК получило название фотодинамического действия (ФДЦ) или фотодинамического эффекта (ФДЭ). Хотя ФДЭ известен давно и опубликовано большое число работ описывающих его проявление, молекулярные процессы, лежащие в основе явления, еще не полностью объяснены.

Обоснованием актуальности изучения процессов адресной фотомодификации макромолекул НК с помощью органических красителей служат реальные перспективы применения полученных результатов для совершенствования современных биомедицинских технологий, включая технологии, основанные на пространственно локализованной модификации биополимеров in vivo. В этой связи необходимо решить две основные задачи, во-первых, найти оптимальные фотосенсибилизаторы реакций, отвечающих основным требованиям по физико-химическим, биологическим и технологическим критериям, во-вторых, оптимизировать режимы лазерного облучения окрашенных систем, обеспечивающих высокую эффективность оптического воздействия на вещество.

Эффективность фотопревращений в макромолекулах, характеризующихся специфической организацией, зависит от состава, строения и упаковки полимерных цепей. Применительно к нуклеиновым кислотам, эффективность модификации зависит от их структуры (вторичной или третичной) и служит источником информации о свойствах полимеров.

Цель настоящей работы - разработка методов модификации окрашенных макромолекул нуклеиновых кислот лазерным излучением видимого диапазона и установление механизмов процессов.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

• исследовать взаимодействие органических красителей различных классов с макромолекулами нуклеиновых кислот в водных и буферных растворах;

• изучить спектрально-люминесцентные свойства связанных макромолекулами мономеров, димеров и ассоциатов органических красителей, исследовать кинетику дезактивации возбужденных состояний и определить о

рос национальная

БИБЛИОТЕКА С Петербург /^л

%619

1 09 JOO

шение эффективности конкурирующих каналов внутримолекулярной релаксации в связанных молекулах;

• исследовать действие лазерного излучения видимого диапазона на нуклеиновые кислоты в окрашенных растворах, содержащих свободные и связанные макромолекулами органические красители и установить, какое возбужденное состояние - синглетное или триплетное - ответственно за фотодинамическое действие красителей;

• определить роль кислорода в фотодинамическом эффекте и установить, на какой стадии в облучаемых растворах образуются химически активные формы молекулярного кислорода;

• разработать методы идентифицикации типов повреждений полимерных цепей и установить механизмы фотодеструкции окрашенных макромолекул.

Научная новизна.

1. Исследовано взаимодействие органических красителей различных классов с макромолекулами нуклеиновых кислот в водных и буферных растворах. Показано, что в результате самоорганизации лигандов при кооперативном связывании с макромолекулами, за счет слабых межмолекулярных взаимодействий на внешней стороне двойной спирали формируются устойчивые наноструктуры определенной формы и размеров. Изучены особенности формирования органических наноструктур в растворах, оценено количество молекул красителей в них, исследовано распределение образующихся субмикронных структур вдоль двойной спирали ДНК и их слияние в более крупные агрегаты.

2. Оптимизированы условия синтеза наноструктур, определены критические концентрации самоагрегации молекул, исследована зависимость степени связывания от ионной силы растворов и его состояния; изучена зависимость константы диссоциации от типа иона и ингибирование связывания ионами различных металлов. Показано, что связанные красители могут инактивировать нуклеиновые кислоты за счет стерического экранирования формирующимися структурами.

3. Исследованы фотопреврашения биополимеров под воздействием интенсивного лазерного излучения в растворах, сенсибилизированных органическими красителями. Осуществлено селективное лазерное разрезание макромолекул нуклеиновых кислот с помощью слабо связанных хромофоров и установлены молекулярные механизмы явления. Установлено, что первичным процессом фрагментации полимерных цепей с помощью красителей с малым - выходом интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние является безрадиационный синглет-синглетный перенос энергии с высоких

электронно-возбужденных уровней молекул красителей на хромофорные группы макромолекул.

4. Изучена кинетика термостимулированной замедленной флуоресценции молекул красителей в условиях кратковременного импульсного нагрева среды и экспериментально доказано возникновение областей локального разогрева среды. За счет гипертермии макромолекул в результате тепловыделения при безызлучательной дезактивации высоковозбужденных электронных состояний связанных хромофоров осуществлена денатурация ДНК и изучены конформационные изменения двойной спирали под влиянием локальных температурных полей.

5. Экспериментально показано, что фотосенсибилизированная генерация химически активных форм молекулярного кислорода связанными и несвязанными люминофорами приводит к деструкции полимерных цепей. Установлено, что предварительное связывание красителя с субстратом, в общем, не является необходимым условием фотодинамического действия.

Практическая значимость результатов

1. Использование синтезированных органических наноструктур в качестве функциональных элементов фотомодификации полимерных цепей может быть положено в основу разработки нового метода локального фотовоздействия на биополимеры. Разработка таких методов, в свою очередь, приблизит к решению важнейшей проблемы биофизики, связанной с комплексными исследованиями молекулярных механизмов селективной лазерной (фотохимической и тепловой) модификации нуклеиновых кислот.

2. Результаты исследования взаимодействия молекул органических красителей с нуклеиновыми кислотами могут быть использованы для разработки методов контрастирования биообъектов, в диагностических и терапевтических целях. Установленные закономерности существенно облегчат поиск оптимальных фотосенсибилизаторов физико-химических процессов в биосистемах.

3. Сведения о теплофшичсских свойствах связанных макромолекулами наноструктур окажутся полезными при использовании их в качестве микротеплогенераторов и сенсоров в современных биомедицинских технологиях.

4. Лазерная модификация окрашенных макромолекул, характеризующихся специфической организацией, дает важную информацию о структуре макромолекул для фотофизики и фотохимии полимеров, биофизики и молекулярной биологии.

5. Представленные методы селективного поражения лазерным излучением макромолекул в присутствии специфических красителей будут способствовать дальнейшему развитию метода фотодинамической терапии. Полученные нами сведения о лазерном локализованном воздействии на макромолекулы посредством синтезированных наноструктур также будут полезными при совершенствовании данного метода терапии.

Методы исследования

Основные экспериментальные результаты, представленные в работе, получены при изучении спектрально-люминесцентных свойств окрашенных растворов нуклеиновых кислот методами стационарной и кинетической спектро-фотометрии и флуориметрии, упругого рассеяния света, а также зондовой сканирующей атомно-силовой и туннельной микроскопии.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Кооперативное связывание молекул органических красителей-катионов с дезоксирибонуклеиновыми кислотами в растворах сопровождается формированием на внешней стороне двойной спирали плоских субмикронных стэкинг-структур со стопочной укладкой слоев молекул. Устойчивость таких структур сохраняется за счет слабых межмолекулярных взаимодействий.

2. При воздействии интенсивным лазерным излучением видимого диапазона на связанные комплексы органический краситель - нуклеиновая кислота происходит фотомодификация макромолекул. Фрагментация полимерных цепей с помощью слабо связанных лигандов инициируется безрадиационным переносом энергии с высоких электронно-возбужденных синглетных уровней молекул красителей на хромофорные группы макромолекул.

3. Для органических молекул, являющихся эффективными фотосенсибилизаторами химически активных форм молекулярного кислорода, в водных растворах предварительное связывание с нуклеиновыми кислотами не является необходимым условием их фотодннамического действия. Фотомодификация биополимеров в растворах с несвязанными красителями происходит в результате их химического взаимодействия с электронно-возбужденными молекулами кислорода.

4. Тепловыделение при безызлучательной дезактивации высоких электронно-возбужденных состояний связанных хромофоров приводит к гипертермии макромолекул и сопровождается локальной денатурацией двойной спирали с коиформационными изменениями полимерных цепей.

Публикации

Основные результаты проведенных исследований опубликованы в 15 печатных работах. В перечне опубликованных работ 4 статьи в центральных отечественных и международных журналах, рецензируемых научных сборниках и материалах конференций, 11 тезисов докладов на международных, всероссийских конференциях.

Апробация работы

Основные результаты работы обсуждались на:

Региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Оренбург, 2000 г.); Third International Conference "Electronic Processes in Organic Materials" (ICEPOM-3), (Kharkiv, Ukraine, 2000 г.); Международной конференции "Ломоносов-2001" (Москва, 2001); II международной конференции молодых ученых и специалистов «0птика-2001» (Санкт-Петербург, 2001 г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 30-летию ОГУ (Оренбург, 2001 г.); VII Международной конференция "Лазерные и лазерно-информационные технологии: фундаментальные проблемы и приложения" (Суздаль, 2001 г.); XVII International Conference on Coherent and Nonlinear Optics (IC0N0-2001), (Minsk, Belarus, 2001 г.); Международной конференции "Оптика, оптоэлектроника и технологии О Т-2001", (Ульяновск, 2001 г.); V Международной конференции "Импульсные лазеры на переходах атомов и молекул", (Томск, 2001 г.); IX Всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием (Москва, 2002 г.); International Quantum Electronic Conference IQEC - 2002, (Moscow, Russia, 2002 г.).

Структура работы

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, списка использованных источников из 211 наименований, содержит 167 страниц машинописного текста, 53 рисунка и 3 таблицы.

Краткая аннотация глав диссертации

Во Введении обосновывается актуальность темы диссертационного исследования, определяются основные задачи и формулируется цель работы, отмечается научная новизна и практическая значимость полученных результатов, приводятся сведения об апробации работы, определяются основные положения

диссертации выносимые на защиту и дается краткая аннотация содержания глав работы.

Первая глава диссертации посвящена анализу современного состояния проблемы фотодинамического действия молекул органических красителей.

В первом параграфе главы представлены имеющиеся литературные сведения о взаимодействии органических молекул с нуклеиновыми кислотами. Различают два типа связывания лигандов с макромолекулами - внутреннее связывание или интеркалирование и внешнее связывание. Сильное внутреннее связывание, характерное для соединений с плоской гетероциклической структурой, объясняется в рамках модели интеркалирования молекулы в двойную спираль ДНК. Энергетически более слабое внешнее связывание молекулы красителя с наружной частью полимерной цепи происходит за счет электростатического притяжения. Слабое взаимодействие характерно для соединений, содержащих в своем составе громоздкие заместители, и происходит по типу кооперативности, при котором связывание одной молекулы красителя способствует связыванию следующей молекулы.

Во втором параграфе Главы 1 приведен обзор работ, посвященных действию лазерного излучения на макромолекулы в окрашенных растворах при различных условиях облучения. Действие лазерного излучения на систему фотосенсибилизатор - ДНК приводит к изменениям в структуре макромолекулы, вплоть до двунитевых разрывов. Доминирующий механизм фотоповреждения зависит от состояния среды, параметров лазерного излучения, а также, концентрации фотосенсибилизатора в растворе.

На основании представленного обзора сформулирована цель и определен круг задач решаемых в данной работе.

Во второй главе приводится описание используемых в работе экспериментальных установок, методов регистрации коыформационных изменений полимерных цепей в результате ФДД красителей, методик приготовления образцов и обоснован выбор объектов исследования.

В первом параграфе представлены экспериментальные установки для стационарных и кинетических спектрофото- и флуориметрических измерений.

Для измерения спектров поглощения исследуемых растворов использовалась автоматизированная установка, созданная на основе монохромагора МДР-41. Синхронизация работы узлов измерительного комплекса осуществлялась микропроцессорным контроллером "Униспек" под управлением ПЭВМ. Интегрированный пакет программ SpLab обеспечивал отображение, обработку,

хранение и обмен данными, описывающими экспериментальные и расчетные спектры.

Основу экспериментальной установки для измерения кинетики затухания наведенного поглощения и просветления образцов при двухквантовом возбуждении составляли два моноимпульсных лазера - твердотельный лазер на

и жидкостный лазер на красителях 650 нм). Твердотельный лазер использовался для возбуждения молекул в длинноволновой Sor^iSi полосе поглощения. Лазер на красителях использовался для заселения высоких синглетных и триплетных уровней молекул в результате S„ или Tt~* Тт переходов.

Концентрация молекул в триплетном Т\ состоянии определялась методом зондирования образцов в полосе электронного триплет-триплетного поглощения монохроматическим светом, сформированным на основе стационарного источника света. Кинетика затухания наведенного поглощения регистрировалась через монохроматор МДР-41 с помощью соответствующего ФЭУ. Сбор, накопление и первичная обработка экспериментальных данных осуществлялись с помощью автоматизированной установки, включающей ПЭВМ и крейт КАМАК, с длительностью фронта переходной характеристики 300 не.

Детектирование и оценка эффективности лазерного разрезания макромолекул на фрагменты проводились путем измерения пространственно-временной зависимости оптической плотности НК, возникающей в результате эффекта све-тоиндуцированной диффузии. Экспериментально измерялось относительное изменение оптической плотности раствора AD/D0, как функция поперечной пространственной координаты. Эксперименты по светоиндуцированному дрейфу коротких фрагментов макромолекул позволили определить квантовый выход фоторазрезания ДНК.

Во втором параграфе Главы 2 приведено описание атомно-силового микроскопа. Для визуализации молекул ДНК и ее конформационных изменений использовался сканирующий зондовый мультимикроскоп СММ-2000Т, работающий в режиме контактной атомно-силовой микроскопии (АСМ) в воздушной среде. Анализ полученных изображений выполнялся с помощью набора инструментов, входящих в состав программного обеспечения микроскопа, представленного программой Scan Master.

Завершается глава описанием объектов исследования и представлением методик их приготовления. В качестве объектов исследования в работе выбраны водные растворы двунитевой ДНК (фирмы "Sigma"), выделенной из тимуса теленка, селезенки быка или молок лосося. Для окрашивания макромолекул ис-

пользовались ксантеновые, трифенилметановые, акридиновые и тиазиновые красители: катионы - родамин 6Ж, кристаллический фиолетовый, акридиновый оранжевый, метиленовый голубой и др. и анионы — флуоресцеин и его галоген-замещенные: эритрозин, эозин.

В Главе 3 приведены результаты исследования взаимодействия органических красителей различных классов с ДНК. В первом параграфе представлены результаты изучения взаимодействия родаминовых красителей с нуклеиновыми кислотами. Большая часть экспериментов выполнена с красителем родамин 6Ж. Показано, что при м а л(< 10"5 моль/л) нтрациях краситель присутствует в растворе ДНК в виде связанных макромолекулами мономеров с максимумом поглощения на длине волны X,^ = 526 НМ. С ростом концентрации красителя появляются максимумы поглощения на \„х ~ 505 НМ И \тк = 500 НМ, сдвинутые в коротковолновую область и ответственные за возникновение димеров и более крупных агрегатов красителя соответственно. В присутствии ДНК коротковолновые максимумы отчетливо наблюдаются уже при концентрациях, когда в водных растворах процессы ассоциации лишь начинают проявляться. Образование ассоциатов красителя есть результат кооперативного связывания органических молекул макромолекулами нуклеиновых кислот. Первичным процессом связывания молекул красителей является кулоновское взаимодействие. На вклад электростатических сил в общее взаимодействие красителя с ДНК указывает зависимость степени связывания от ионного состава растворов. Ионная сила раствора в наших экспериментах изменялась путем добавления соли MgCl2. Присутствие в водном растворе, содержащем 5-Ю'4 моль/л ДНК и 2-10"4 ]моль/л родамина 6Ж, соли AIgClj концентраци1&"1юль/л приводит к полному исчезновению связанных агрегатов красителя. Ионы образуя комплексы с фосфатными группами макромолекул, уменьшают число мест связывания красителя и тем самым ингибируют кооперативное внешнее связывание. Следовательно, обработка водных растворов ДНК хлористым магнием Л/gCA позволяет подбором концентраций реагентов регулировать число "посадочных" мест красителя и получать различные состояния хромофоров - мономеры, димеры и ас-социаты. Этот прием важен при осуществлении лазерной фотомодификации макромолекул, так как механизмы модификации с помощью мономеров и ассо-циатов красителей существенно различны.

В результате кооперативного связывания органических молекул с макромолекулами нуклеиновых кислот образуются устойчивые молекулярные агрегаты. Эти агрегаты распределяются вдоль спирали ДНК.

Г"

I

Рисунок 1 АСМ-изображе-ние молекулярных агрегатов родамина 6Ж на поверхности ДНК.

На рисунке 1 отчетливо видны наноструктуры преимущественно овальной формы, расположенные вдоль полимерной цепи. Наименьшие устойчивые молекулярные агрегаты имеют среднюю длину продольной оси около 150 нм, длину поперечной оси 50 нм и высоту 5 нм.

Обнаружение таких агрегатов позволило выделить два вида регулярности при связывании родамина 6Ж с ДНК. Во-первых, это стэкинг-регулярность (стопочная укладка молекул) и, во-вторых, соединение молекул в стык друг с другом. При таком соединении образуются молекулярные цепи и получаются структуры со стопочной укладкой слоев молекул.

Принимая размер молекулы красителя а расстояние между молекулярными слоями на основании принципа наибольшей плотности упаковки молекул красителей, мы определили, что в один слой агрегата укладываются до 50 цепей, содержащие около 150 звеньев каждая. Количество слоев составляет примерно 3-4. Следовательно, в первичных наноструктурах содержится около 1.5-104 молекул красителей.

На рисунке 1 видны также более крупные структуры (их размеры достигают 220 нм в длину, 90 нм в ширину, а их средняя высота - 20 нм). Мы полагаем, что они образованы слиянием первичных агрегатов.

Устойчивость образующихся органических структур зависит от температуры раствора. С повышением температуры ассоциаты красителя разрушаются. Процесс разрушения наноструктур идет в два этапа. При температуре 50ЛС крупные агрегаты красителя распадаются лишь частично, а димеры практически пе разрушены. Это видно по смещению максимума спектра поглощения в длинноволновую область спектра. При в растворе примерно в равном соотношении присутствуют димеры и мономеры родамина 6Ж. После повышения температуры до 97°С в растворе остаются лишь мономеры красителя. Процесс разрушения наноструктур характеризуется потерей изобестической точки. Стабилизация ассоциатов свидетельствует о формировании устойчивого комплекса, образуемого молекулой лиганда с макромолекулой ДНК.

Размеры органических наноструктур, формирующихся при кооперативном связывании красителей с НК, нами были определены независимым методом

углового рассеяния. Цель этих экспериментов состояла в том, чтобы установить на какой стадии образуются наноструктуры — в растворе или после иммобилизации макромолекул на поверхности слюды? Рассчитанные размеры частиц в растворах составили 49 нм, что хорошо согласуется с данными атомно-силовой микроскопии и позволяет сделать вывод о том, что органические наноструктуры, представляющие собой ассоциаты молекул красителей формируются именно в растворах ДНК.

Для построения пространственной модели связывания родамина 6Ж с ДНК в растворах мы использовали программу HypefChem 6.0, предназначенную для молекулярного моделирования и позволяющую выполнять различные виды молекулярных и квантово-механических расчетов. Взаимное расположение молекул хромофора при связывании друг с другом вычислено методом молекулярной механики Мт+, входящего в комплект программы.

Рисунок 2 Пространственная ориентация молекул Р6Ж. Модель связывания четырех пар димеров друг с другом.

Расчет показал, что молекула родамина 6Ж не является плоской, а представляет собой сложную пространственную структуру, в которой можно выделить «главную» плоскость, образованную тремя бензольными кольцами. Плоскость, в которой находится четвертое кольцо, находится под углом ~ 75° относительно плоскости трех других колец.

В качестве основной «строительной» единицы ассоциатов мы приняли димеры красителя. Оптимизация геометрии 4 пар ассоциированных димеров показана на рисунке 2. Димеры красителя, составляющие ассоциаты, ориентированы друг по отношению к другу под некоторым углом (модель «карточного домика»).

Предполагаемая модель связывания дикатионных молекул родамина 6Ж с двойной спиралью ДНК показана на рисунке 3. Каждая молекула красителя представлена на рисунке в виде плоскости, в которой она находится. Мы пола-

гаем, что молекулы родамина 6Ж, связываясь с двойной спиралью, располагаются вокруг оси макромолекулы, стремясь уложиться в большой желобок.

Во втором параграфе Главы 3 приведены результаты исследования взаимодействия акридиновых и тиазиновых красителей с ДНК в водных растворах.

Характер взаимодействия акридиновых (акридиновый оранжевый) и тиазиновых (ме-тиленовый голубой) красителей с ДНК отличается от связывания с нуклеиновыми кислотами ро-даминовых красителей. При малых (по отношению к нуклеоти-дам ДНК) концентрациях красителей в растворе в спектрах поглощения наблюдается незначительный сдвиг в длинноволновую область спектра. При этом изменяются физические свойства ДНК. Это проявляется в повышении температуры плавления комплекса краситель-ДНК по сравнению со свободной нативной ДНК, а также в изменении гидродинамических свойств растворов - растет их вязкость. Дальнейшее увеличение концентрации красителей в растворе (при отношении концентрации красителя к концентрации нуклеотидов превышающем ~ 1/5 -1/7) сопровождается сдвигом максимума поглощения в коротковолновую область спектра. По мере увеличения количества вещества последовательно наблюдаются два максимума поглощения. Один указывает на образование диме-ров красителей, второй - на возникновение более крупных агрегатов.

Подобные спектральные смещения обусловлены двумя энергетически различными типами связывания. Первый соответствует сильному связыванию мономеров - интеркалированию. После насыщения первого типа связывания появляются слабые комплексы. Молекулы красителей связываются с внешней частью полимерной цепи и вступают в "стэкинг-взаимодействие" друг с другом. В результате образуются димеры и более крупные наноструктуры красителей.

В заключительной части этой главы показано, что ксантеновые красители - флуоресцеин и его галогенпроизводные эозин и эритрозин в водных растворах не взаимодействуют с макромолекулами нуклеиновых кислот.

Рисунок 3 Предполагаемая модель связывания молекул родамина 6Ж с двойной спиралью ДНК.

В Главе 4 представлены результаты экспериментов по модификации макромолекул нуклеиновых кислот лазерным излучением видимого диапазона в растворах с помощью связанных и свободных органических красителей.

В первом параграфе Главы 4 рассмотрено совместное действие лазерного излучения видимого диапазона и слабо связанных красителей на макромолекулы на примере комплексов родамин 6Ж - ДНК. При концентрации родамина 6Ж в водном растворе ДНК не выше 105 моль/л, краситель присутствует в растворе преимущественно в виде связанных макромолекулами мономеров. После импульсного воздействия на такие системы лазерным излучением, спектрально совпадающем с полосой поглощения молекул красителя и малой плотностью мощности Р возбуждающего излучения (вторая гармоника лазера на УАО:№,

видимых изменений оптических свойств нуклеиновых кислот в растворах не наблюдается. Увеличение Р до уровня 30 - 50 МВт/см2 сопровождается ростом оптической плотности ДНК на 15-20%.

Природа гиперхромизма ДНК - нарушение ее исходной (нативной) структуры - расплетание двойной спирали в результате локальной тепловой денатурации. При денатурации происходят разрывы водородных связей между комплементарными парами оснований, в результате чего ДНК переходит из двуни-тевой формы в однонитевую.

Локальный нагрев, по нашему мнению, осуществляется за счет безызлу-чательной релаксации высоких синглетных состояний молекул родамина 6Ж. При интенсивности излучения соответствующей Р ~ 1 МВт/см2 заселяются нижние возбужденные /ровни молекул, которые релаксируют преимущественно путем флуоресценции. Анализ спектров поглощения молекул родамина 6Ж показал, что у данного красителя сильно перекрываются полосы ЗЬ-» и поглощения, и при воздействии интенсивным лазерным излучением возбуждаются оба перехода. Поэтому, при высокой (Р л 10 МВт/см2) плотное и мощности возбуждения с высокой эффективностью заселяются высокие еннг-летные -состояния хромофора по схеме в результате последова-

тельного поглощения молекулой двух квантов излучения с

Релаксация высоковозбужденных синглетных состоянии родамина 6Ж происходит в основном путем безызлучагельной внутренней конверсии Энергия, выделяющаяся при переходе 5„-» ^ () = срУАТ, где V = - ттЛ* • • облучаемый

объем, расходуется на нагрев среды. Если принять плотность раствора (р) равной а его удельную теплоемкость (с) равной

то при безызлучательной релаксации электронно-возбужденных состояний молекул красителей после поглощения кванта света с длиной волны X = 532 нм в радиусе 10 А температура повышается примерно на ДТ— 30 - 50 К. При начальной температуре раствора 25°С такого температурного скачка вполне достаточно для тепловой денатурации двойной спирали.

Данное предположение было подтверждено прямым наблюдением конформационных изменений нитей ДНК методом атомно-силовой микроскопии. На рисунке 4 приведено АСМ-изображение ДНК, взятой из раствора облученного в течение 1 мин при Р = 30 МВт/см2 и частоте повторения импульсов 10 Гц, в присутствие родамина 6Ж с концентрацией 10"5 моль/л. Отчетливо видно, что целостность нити сохраняется, но вдоль полимерной цепи появляются участки с увеличенными геометрическими размерами. Мы полагаем, что эти участки образуются в результате переплетения одиночных цепей ДНК, образованных вследствие тепловой денатурации двойной спирали.

Одновременно имеет место и двунитевое разрезание макромолекул ДНК. Это обнаруживается по появлению коротких фрагментов полимерных цепей на некоторых АСМ-сканах. Мы полагаем, что такие повреждения нитей вызваны безызлучательным переносом энергии фотовозбуждения с высоких синглетных уровней красителей на макромолекулы.

Плотность числа однонитевых разрывов - число раз-

рывов на одну нить ДНК, ¿щ - длина ДНК в нуклеотидах, определяется выражением:

где К^ ^л/ = + ) - константа скорости реакции образования

однонитевых разрывов, - квантовый выход процесса, - чис-

ло импульсов, соответствующее дозе облучения Б при интенсивности возбуж-

Рисунок 4 АСМ-изображение ДНК, высаженной на поверхность слюды из водного раствора, окрашенного родамином 6Ж (С= 10*5 моль/л) и облученного светом

дающего излучения /и длительности импульса Тлт, вероятность переноса энергии с красителя на ДНК, перенормированная из-за обратного возврата возбуждения на донор и определяемая как

где Н = 2Др2 средняя частота перескоков (при диффузионном переносе) между соседними акцепторами по синглетным уровням, Д - коэффициент диффузии.

Плотность числа двунитевых разрывов равна:

где £о - максимальное расстояние между однонитевыми разрывами в противоположных нитях.

Расчет дает для квантового выхода процесса разрезания в наших экспериментах величину ¿ЮЛ Таким образом, доминирующим процессом фото модификации ДНК при малых концентрациях родамина 6Ж является локальная тепловая денатурация двойной спирали.

Существенно иной характер повреждений полимерных цепей, при тех же условиях облучения, наблюдается в растворах с концентрацией родамина 6Ж С ^5-104 моль/л. Образование ассоциатов родамина 6Ж влечет за собой изменение скоростей внутримолекулярной релаксации. Важным является увеличение в ассоциатах (примерно в 20 раз по сравнению с мономерами) квантового выхода в триплетное состояние. Облучение таких растворов сопровождается эффективной генерацией синглетного кислорода в результате туше-

ния молекулярным кислородом триплетных состояний ассоциатов красителя:

где 5о и Т - основное и триплетное электронные состояния красителя соответственно, - основное и синглет-возбужденное состояния молекулярного кислорода. Химическая активность синглетного кислорода хорошо известна, он способен оказывать деструктивное действие на нуклеиновые кислоты. Генерация синглетного кислорода ассоциатами родамина 6Ж, сформированными на нитях ДНК в результате кооперативного связывания макромолекулами, исследована нами по кинетике затухания замедленной флуоресценции хромофоров.

Разрезание двойной спирали на фрагменты сопровождается эффектом светоиндуцированной диффузии (СИД) НК. Эффект состоит в том, что плот-

ность макромолекул в облученном объеме уменьшается, а в прилегающих к нему областях, наоборот, увеличивается. Это объясняется более быстрой диффузией образовавшихся коротких фрагментов макромолекул из облученной зоны, чем проникновение в нее целых молекул НК из соседних областей.

Для наблюдения эффекта СИД НК мы сканировали кювету с раствором (вакуумируемая кварцевая кювета толщиной 1 мм) в направлении перпендикулярном зондирующему лучу с шагом 10 мкм. Возникновение пространственной модуляции оптической плотности ДНК после облучения растворов указывает на эффективное двунитевое разрезание макромолекул.

Наблюдение фрагментов полимерных цепей методами АСМ подтверждает выводы о разрезании макромолекул на фрагменты, сделанные на основе оптических измерений. На рисунке 5 представлено АСМ-изображение фрагментов ДНК, полученных ние фрагментов ДНК, полученных в результате облучения раствора ДНК, ок-в результате облучения раствора ранненного родамином 6Ж, с концентрацией ДИК, окрашенного родамином 6Ж, £ = 5-10"4 м о, ь /, Хорошо видно, что разре-с концентрацией моль/л. зание происходит только в местах образова-

ния ассоциатов красителя и, наоборот, цепи свободные от агрегатов красителей (на рисунке нижняя спираль) остаются неповрежденными.

Во втором параграфе Главы 4 представлены результаты изучения лазерной модификации нуклеиновых кислот с помощью несвязанных хромофоров. Облучение растворов ДНК, содержащих полигалогенфлуоресцеины излучением второй гармоники лазера на также приводит к появлению эффекта

светоиндуцированной диффузии нуклеиновых кислот. В спектрах поглощения водных растворов ДНК, окрашенных эрмтрозином и облученных в течение 30 секунд светом с длиной волны им при плотности мощности излучения

Р = 50 МВт/см1 и частоте повторения импульсов 5 Ги, на длине волны 260 им наблюдается провал оптической плотности, а после перемещения кюветы на 1 мм в поперечном направлении относительно неподвижного зондирующего луча, наоборот, увеличение оптической плотности раствора. При этом пространственный интеграл 1&Л(х) с1х близок к нулю. Наблюдения эффекта свето-индуцированной диффузии свидетельствует о двунитиевых разрезах ДНК.

Рисунок 5 ЛСМ-изображс-

АСМ-изображение фрагментов ДНК, приведенные на рисунке 6, указывают на то, что при таких дозах облучения чаще всего наблюдаются фрагменты, длины которых примерно равны 0 3-0.5 длины исходной ДНК, хотя всегда присутствуют и более короткие фрагменты.

Мы полагаем, что фотомодификация ДНК в этих экспериментах является результатом протекания двух независимых процессов - деструктивного действия синглетного кислорода и безызлучательного индуктивно-резонансного переноса энергии с высоковозбужденных синглетных состояний молекул красителей на макромолекулы. Данное предположение экспериментально проверено путем измерения относительного изменения величины оптической плотности в аэрированных и дезаэрированных растворах и при изменении плотности мощности возбуждающего излучения.

При удалении кислорода из растворов, при Р ~ 50-70 МВт/см2 эффект СИД существенно снижается (с 7-10 % в присутствие кислорода, до <л % в обескислороженных растворах), однако не исчезает полностью. В то же время, уменьшение плотности мощности возбуждающего излучения до уровня Р ~ I МВт/см в обескислороженных растворах приводит к полному исчезновению эффекта. В растворах насыщенных кислородом при такой интенсивности возбуждающего излучения эффект появляется, а при значениях Р превышающих ~5 МВт/см2, начинает возрастать с увеличением интенсивности возбуждающего света.

Попытки осуществить модификацию НК через высокие триплетные >ров-ни в дезаэрированных растворах закончились безрезультатно - обнаружить каких-либо изменений оптических характеристик растворов нам не удалось.

При воздействии на молекулы красителей интенсивным лазерным излучением без дополнительного экспериментального обоснования нельзя было исключить фотохимический распад сенсибилизаторов в растворах. Продукты фотораспада сенсибилизаторов могут также оказывать деструктивное действие на макромолекулы. Для обнаружения возможного возникновения таких продуктов мы исследовали кинетику и спектры наведенного поглощения

| * НО пт

Рисуноко АСМ-изображе-ние фрагментов ДНК, ооразовавших-ся после воздействия на раствор, окрашенный эритрозином, излучением второй гармоники лазера

(просветления) окрашенных растворов в широком спектральном диапазоне от 220 до 700 нм. Нам не удалось наблюдать трансформацию спектров наведенного триплет-триплетного поглощения и просветления основной полосы поглощения образцов. Мы также не обнаружили каких-либо изменений в кинетике затухания наведенного поглощения в различных участках спектра. На этом основании был сделан вывод о несущественном вкладе продуктов фотохимического распада сенсибилизаторов в нарушении целостности макромолекул нуклеиновых кислот в растворах.

Для исследования фотопроцессов в окрашенных растворах ДНК при непрерывном возбуждении молекул красителей мы воздействовали на образцы излучением аргонового лазера. Как и в случае импульсного возбуждения в этих экспериментах в качестве фотосенсибилизаторов использовались анионные органические красители гидроксантеновой группы - флуоресцеин, эозин и эритрозин.

По длинноволновым участкам спектров поглощения молекул красителей были определены их молярные коэффициенты экстинкции на длинах волн генерации аргонового лазера. Это позволило рассчитать время воздействия на образцы с тем, чтобы поглощенная доза во всех экспериментах была одинакова.

Спектры поглощения облученной и необлученной ДНК в присутствии эритрозина, представлены на рисунке 7 (а). Продолжительность облучения составляла 30 секунд. Видно, что после облучения раствора происходит трансформация спектра поглощения ДНК. Появляются новые максимумы на длинах волн 274 нм и 257 нм. Одновременно наблюдается снижение оптической плотности на нм. В обескислороженных растворах эффект не проявляется (рисунок 7, б).

»»мвожоптаотш штятшпжмми

а) б)

Рисунок 7 Спектры поглощения волных растворов ДНК в присутствии эритро-зина а) раствор в присутствии кислорода; б) обескислороженный раствор. 1 - до облучения, 2 - после облучения.

Аналогичные, хотя и менее выраженные изменения кривой спектра поглощения ДНК наблюдаются и в присутствии эозина. Облучение растворов, окрашенных флуоресцеином, никак не сказывается на виде спектра поглощения ДНК, даже при трехкратном увеличении времени облучения,

Флуоресцеин относится к соединениям с высоким квантовым выходом флуоресценции 1.0), поэтому в растворах ДНК+флуоресцеин практически

не происходит фотосенсибилизированной генерации синглетного кислорода. Напротив, у эритрозина квантовый выход интеркомбинационной конвер-

сии (ИКК) в воде составляет <Д,КК ~ 1.0 и он является эффективным генератором синглетного кислорода возникающего в результате тушения триплет-

ных состояний молекул красителей. Квантовый выход ИКК у эозина он занимает промежуточное положение между флуоресцеином и эритрозином.

Синглетный кислород чрезвычайно активен химически. В нук-

леиновых кислотах он разрушает углеводные мостики между нуклеотидами и, таким образом, разрывает цепи ДНК. Поэтому, в растворах содержащих эритро-зин и эозин наблюдаются разрывы полимерных цепей, а в растворах с флуорес-цеином таких нарушений целостности макромолекул нет.

Появление новых максимумов в спектрах поглощения по нашему мнению вызвано разрезанием исходной нити ДНК с отщеплением от спирали гуанина.

Представленные нами экспериментальные результаты позволяют сделать важный вывод о том, что предварительное связывание красителей с макромолекулами, в общем, не является необходимым условием их фотодинамического действия.

Одним из ключевых вопросов при описании механизмов фотодинамического действия органических соединений состоит в том, может ли синглетный кислород возникать при тушении триплетных состояний интеркалированных красителей? Для ответа на этот вопрос мы исследовали действие красителя акридинового оранжевого в обескислороженных и насыщенных кислородом растворах. Концентрация красителя выбиралась так, чтобы он преимущественно был интеркалирован в двойную спираль. Облучение таких растворов не дает видимых изменений спектра поглощения ДНК. Таким образом, для молекулярного кислорода интер калированный краситель недоступен. Следовательно, синглетный кислород в водных растворах возникает в результате тушения триплетных состояний несвязанных или слабо связанных молекул красителей.

Основные результаты и выводы

1. Исследовано взаимодействие органических красителей различных классов с макромолекулами нуклеиновых кислот и установлено, что в результате кооперативного связывания лигандов с полианионами на наружной стороне макромолекул образуются плоские органические наноструктуры. Устойчивые субмикронные молекулярные структуры имеют размеры 150*50*5 нм3 с числом молекул красителей в них до

2. Определены критические концентрации самоагрегации молекул красителей в растворах полианионов, исследованы зависимости степени связывания от ионной силы растворов и его состояния, изучено ингибирование связывания ионами различных металлов, исследована динамика образования молекулярных агрегатов и их распределение вдоль макромолекул нуклеиновых кислот. Показано, что из отдельных наноструктур, при высоких концентрациях красителей, могут формироваться микрокристаллы, стерически экранирующие полимерную цепь ДНК.

3. Разработаны способы лазерной фотомодификации макромолекул нуклеиновых кислот и методы идентификации повреждений полимерных цепей с помощью связанных и свободных органических красителей.

4. Показано, что возможно двунитевое разрезание макромолекул ДНК с помощью слабо связанных органических красителей. Механизм разрезания основан на безызлучательном переносе энергии фотовозбуждения с высоких синг-летных уровней молекул красителей на хромофорные группы макромолекул. Квантовый выход такого процесса не превышает значения 10"4.

5. Экспериментально доказана возможность локальной гипертермии макромолекул в результате тепловыделения при безызлучательной дезактивации высоких электронно-возбужденных состояний молекул слабо связанных хромофоров. Осуществлена адресная денатурация биополимеров и исследованы кон-формационные изменения полимерных цепей под влиянием локальных температурных полей. Установлено, что локальная тепловая денатурация является доминирующим процессом фотодеструкции макромолекул с помощью слабо связанных красителей.

6. Для органических молекул, являющихся эффективными фотосенсибилизаторами синглетного кислорода, предварительное связывание с нуклеиновыми кислотами не является необходимым условием их фотодинамического действия в растворах. Фотомодификация биополимеров в растворах с несвязанными красителями происходит в результате их химического взаимодействия с электронно-возбужденными молекулами кислорода.

7. Экспериментально показано, что в окрашенных водных растворах ДНК синглетный кислород возникает только в результате тушения триплетных состояний несвязанных или слабо связанных молекул красителей. Интеркалиро-ванные красители не являются генераторами синглетного кислорода.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Летута С.Н., Кецле Г.А., Левшин Л.В., Никиян А.Н., Давыдова O.K. Исследование взаимодействия родамина 6Ж с ДНК методами спектрофотометрии и зондовой микроскопии // Оптика и спектроскопия, 2002, т. 93, № 6, С. 916-919.

2. Alidjanov E.K., Lantukh Yu.D., Letuta S.N., Nikiyan H.N., Pashkevitch S.N. Investigation of photomodified polymer films surface structure by scanning probe microscopy // Third International Conference "Electronic Processes in Organic Materials" (ICEPOM-3), Kharkiv, Ukraine, Published "Naukoviy svif, 2000, P. 96-97.

3. Никиян А.Н., Давыдова O.K., Раздобреев Д.А., Сираева P.P. Взаимодействие родаминовых красителей с ДНК // Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2001», Москва, 2001, С. 152.

4. Letuta S.N., Nikiyan H.N., Davydova O.K. Photosensitized and thermal destruction of macromolecules doped by dyes // Proceedings of SPIE, 2001, V. 4644, P. 232-235.

5. Летута С.Н., Никиян А.Н. Свойства высоких триплетных состояний молекул акридиновых красителей // Материалы международной конференции, посвященной 30-летию ОГУ, 2001, С.348-349.

6. Летута С.Н., Никиян А.Н., О Давыдова O.K. Синтез наноструктур на поверхности полианионов // Международная конференция "Оптика, оптоэлектро-ника и технологии О2Т-2001", Ульяновск, 2001, Сборник трудов, С. 106-107.

7. Letuta S.N., Lantukh Yu.D, Pashkevitch S.N., Nikiyan H.N. Laser photomodification of nucleic acids by xanthene dyes // XVII International Conference on Coherent and Nonlinear Optics (1CONO-2001), Minsk, Belarus, 2001, P. 171.

8. Летута С.Н., Никиян А.Н.. Взаимодействие родаминовых красителей с полианионами // V Международная конференция "Импульсные лазеры на переходах атомов и молекул", Томск, 2001, Тез. докл., С. 54.

9. Никиян А.Н., Давыдова O.K. Исследование взаимодействия ксантеновых красителей с макромолекулами методом сканирующей зондовой микроскопии //Региональная научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов Оренбуржья, Оренбург, 2001, Тез. докл., С. 53-54.

10. Letuta S.N., Lantukh Yu.D., Pashkevitch S.N., Nikiyan H.N. Laser photomodification of nucleic acids by xanthene dyes // Proceedings of SPIE, 2001, V. 4749, P.384-389.

11. Шакиров Т.М., Никиян А.Н. Деструкция окрашенных макромолекул под действием излучения видимого диапазона // II Международная конференция молодых ученых и специалистов «0птика-2001», Санкт-Петербург, 2001, С. 269.

12. Летута С.Н., Никиян А.Н., Давыдова O.K. Фотосенсибилизированная и тепловая деструкция окрашенных макромолекул // VII Международная конференция "Лазерные и лазерно-информационные технологии: фундаментальные проблемы и приложения": Программа и аннотации докладов, Владимир, 2001, С. 103.

13. Летута С.Н., Никиян А.Н., Давыдова O.K. Взаимодействие родаминовых красителей с ДНК // Вестник ОГУ, 2001, № 4, С. 62-65.

14. Никиян А.Н., Давыдова O.K. Исследование взаимодействия родаминовых красителей с макромолекулами методом сканирующей зондовой микроскопии // II Международный конгресс студентов, молодых ученых и специалистов «Молодежь и наука — третье тысячелетие», Москва, 2002, Тез. докл., С. 74-75.

15. Lantukh Yu. D, Letuta S. N, Pashkevitch S. N, Alidjanov E. K., Razdobreev D.A., Davydova O. K.., Nikiyan H.N. Holographic investigation of interaction of organic dye with DNA // "International Quantum Electronic Conference IQEC-2002", Moscow, Russia, 2002, Conf. Prog, and Abs., P.72.

§12*57

Лицензия № ЛР020716 от 02.П. 98. Подписано в печать 20.05.04. Формат 60x84 Чи>. Бумага писчая. Усл.печ. листов 1,0. Тираж 100. Заказ 285.

РИК ГОУ ОГУ

460352, г. Оренбург, ГСП, пр. Победы 13, Государственное образовательное учреждение «Оренбургский государственный университет»

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Никиян, Айк Николаевич

Введение ф Актуальность проблемы.

Цель работы.

Научная новизна.

Практическая значимость результатов.

Методы исследования.

Публикации.

Апробация работы.

Краткая аннотация глав диссертации.

Глава 1 Лазерная фотомодификация макромолекул.

1.1 Взаимодействие молекул органических красителей с ДНК.

1.2 Фотодинамическое действие органических красителей.

Глава 2 Методика эксперимента.

2.1 Оптические методы.

2.1.1 Измерение спектров поглощения.

2.1.2 Измерение наведенного поглощения.

2.1.3 Установка кинетической флуориметрии

2.1.4 Лазерное разрезание макромолекул и измерение пространственно-временной зависимости оптической плотности.

2.1.5 Методика измерения интенсивности рассеянного света.

2.2 Атомно-силовой микроскоп.

2.3 Объекты исследования. Приготовление образцов.

Глава 3 Взаимодействие органических красителей с макромолекулами нуклеиновых кислот.

3.1 Взаимодействие родаминовых красителей с нуклеиновыми кислотами.

3.1.1 Определение размеров ассоциатов молекул красителей методом углового рассеяния света. олошсиппл ридашгша u/iv v / ixv • • • • •. ймодействие трифенилметановых, акридиновых, флуоресц зиновых красителей с ДНК. ймодействие трифенилметановых красителей с ДНК в воде имодействие акридиновых и тиазиновых красителей с ДНК имодействие флуоресцеиновых красителей с ДНК.]

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фотомодификация окрашенных макромолекул в растворах"

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Макромолекулы нуклеиновых кислот (НК) устойчивы к прямому действию ближнего УФ и видимого света. Однако в присутствии органических красителей - природных или синтезированных - в растворах и биосистемах возможны светоиндуцированные процессы, сопровождающиеся модификацией полимерных цепей. Важность исследования фотомодификации нуклеиновых кислот в том, что любое нарушение компонентов ДНК приводит к изменениям в метаболизме клетки и ее генетических свойств.

Совместное действие света и органических красителей на макромолекулы НК получило название фотодинамического действия (ФДД) или фотодинамического эффекта (ФДЭ). Хотя ФДЭ известен давно и опубликовано большое число работ, описывающих его проявление, молекулярные процессы, лежащие в основе явления, еще не полностью объяснены. Все существующие теории физико-химических механизмов ФДД предполагают, что на первой стадии реакции краситель поглощает видимый свет и переходит в возбужденное состояние. Вторая стадия - передача энергии хромофорным группам макромолекул. Вместе с тем, до настоящего времени окончательно не выяснено через какое возбужденное состояние - синглетное или триплетное - идут реакции, не завершена дискуссия о роли кислорода в ФДЭ органических красителей, требуются дополнительные исследования, подтверждающие необходимость для ФДД предварительного связывания красителей с макромолекулами, а также, изучение влияния на этот процесс локального нагрева среды и продуктов фотохимического распада. Поиск ответов на перечисленные вопросы открывает перспективы разработки методов избирательного управления процессами в молекулярных системах для целенаправленного изменения их свойств и характеристик.

Обоснованием актуальности изучения процессов адресной фотомодификации макромолекул НК с помощью органических красителей служат реальные перспективы применения полученных результатов для совершенствования современных биомедицинских технологий, включая технологии, основанные на пространственно локализованной модификации биополимеров in vivo. В этой связи необходимо решить две основные задачи, во-первых, найти оптимальные фотосенсибилизаторы реакций, отвечающих основным требованиям по физико-химическим, биологическим и технологическим критериям, во-вторых, оптимизировать режимы лазерного облучения окрашенных систем, обеспечивающих высокую эффективность оптического воздействия на вещество.

Эффективность фотопревращений в макромолекулах, характеризующихся специфической организацией, зависит от состава, строения и упаковки полимерных цепей. Применительно к нуклеиновым кислотам, эффективность модификации зависит от их структуры (вторичной или третичной) и служит источником информации о свойствах полимеров.

Цель работы

Цель настоящей работы — разработка методов модификации окрашенных макромолекул нуклеиновых кислот лазерным излучением видимого диапазона и установление механизмов процессов.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

• исследовать взаимодействие органических красителей различных классов с макромолекулами нуклеиновых кислот в водных и буферных растворах;

• изучить спектрально-люминесцентные свойства связанных макромолекулами мономеров, димеров и ассоциатов органических красителей, исследовать кинетику дезактивации их возбужденных состояний и определить соотношение эффективности конкурирующих каналов внутримолекулярной релаксации в связанных молекулах;

• исследовать действие лазерного излучения видимого диапазона на нуклеиновые кислоты в окрашенных растворах, содержащих свободные и связанные макромолекулами органические красители и установить, какое возбужденное состояние - синглетное или триплетное - ответственно за фотодинамическое действие красителей;

• определить роль кислорода в фотодинамическом эффекте и установить, на какой стадии в облучаемых растворах образуются химически активные формы молекулярного кислорода;

• разработать методы идентифицикации типов повреждений полимерных цепей и установить механизмы фотодеструкции окрашенных макромолекул.

Научная новизна

1. Исследовано взаимодействие органических красителей различных классов с макромолекулами нуклеиновых кислот в водных и буферных растворах. Показано, что в результате самоорганизации лигандов при кооперативном связывании с макромолекулами, за счет слабых межмолекулярных взаимодействий на внешней стороне двойной спирали формируются устойчивые наноструктуры определенной формы и размеров. Изучены особенности формирования органических наноструктур в растворах, оценено количество молекул красителей в них, исследовано распределение образующихся субмикронных структур вдоль двойной спирали ДНК и их слияние в более крупные агрегаты.

2. Оптимизированы условия синтеза наноструктур, определены критические концентрации самоагрегации молекул, исследована зависимость степени связывания от ионной силы растворов и его состояния, изучена зависимость константы диссоциации от типа иона и ингибирование связывания ионами различных металлов. Показано, что связанные красители могут инактивиро-вать нуклеиновые кислоты за счет стерического экранирования формирующимися структурами.

3. Исследованы фотопревращения биополимеров под воздействием интенсивного лазерного излучения в растворах, сенсибилизированных органическими красителями. Осуществлено селективное лазерное разрезание макромолекул нуклеиновых кислот с помощью слабо связанных хромофоров и установлены молекулярные механизмы явления. Установлено, что первичным процессом фрагментации полимерных цепей с помощью красителей с малым выходом интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние является безрадиационный синглет-синглетный перенос энергии с высоких электронно-возбужденных уровней молекул красителей на хромофорные группы макромолекул.

4. Изучена кинетика термостимулированной замедленной флуоресценции молекул красителей в условиях кратковременного импульсного нагрева среды и экспериментально доказано возникновение областей локального разогрева среды. За счет гипертермии макромолекул в результате тепловыделения при безызлучательной дезактивации высоковозбужденных электронных состояний связанных хромофоров осуществлена денатурация ДНК и изучены конформационные изменения двойной спирали под влиянием локальных температурных полей.

5. Экспериментально показано, что фотосенсибилизированная генерация химически активных форм молекулярного кислорода связанными и несвязанными люминофорами приводит к деструкции полимерных цепей. Установлено, что предварительное связывание красителя с субстратом, в общем, не является необходимым условием фотодинамического действия.

Практическая значимость результатов

1. Использование синтезированных органических наноструктур в качестве функциональных элементов фотомодификации полимерных цепей может быть положено в основу разработки нового метода локального фотовоздействия на биополимеры. Разработка таких методов, в свою очередь, приблизит к решению важнейшей проблемы биофизики, связанной с комплексными исследованиями молекулярных механизмов селективной лазерной (фотохимической и тепловой) модификации нуклеиновых кислот.

2. Результаты исследования взаимодействия молекул органических красителей с нуклеиновыми кислотами могут быть использованы для разработки методов контрастирования биообъектов, в диагностических и терапевтических целях. Установленные закономерности существенно облегчат поиск оптимальных фотосенсибилизаторов физико-химических процессов в биосистемах.

3. Сведения о теплофизических свойствах связанных макромолекулами наноструктур окажутся полезными при использовании их в качестве микротеплогенераторов и сенсоров в современных биомедицинских технологиях.

4. Лазерная модификация окрашенных макромолекул, характеризующихся специфической организацией, дает важную информацию о структуре макромолекул для фотофизики и фотохимии полимеров, биофизики и молекулярной биологии.

5. Представленные методы селективного поражения лазерным излучением макромолекул в присутствии специфических красителей будут способствовать дальнейшему развитию метода фотодинамической терапии. Полученные нами сведения о лазерном локализованном воздействии на макромолекулы посредством синтезированных наноструктур также будут полезными при совершенствовании данного метода терапии.

Методы исследования

Основные экспериментальные результаты, представленные в работе, получены при изучении спектрально-люминесцентных свойств окрашенных растворов нуклеиновых кислот методами стационарной и кинетической спектро-фотометрии и флуориметрии, упругого рассеяния света, а также зондовой сканирующей атомно-силовой и туннельной микроскопии.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Кооперативное связывание молекул органических красителей-катионов с дезоксирибонуклеиновыми кислотами сопровождается формированием на внешней стороне двойной спирали плоских субмикронных стэкинг-структур со стопочной укладкой слоев молекул. Устойчивость таких структур сохраняется за счет слабых межмолекулярных взаимодействий.

2. При воздействии интенсивным лазерным излучением видимого диапазона на связанные комплексы органический краситель - нуклеиновая кислота происходит фотомодификация макромолекул. Фрагментация полимерных цепей с помощью слабо связанных лигандов инициируется безрадиационным переносом энергии с высоких электронно-возбужденных синглетных уровней молекул красителей на хромофорные группы макромолекул.

3. Для органических молекул, являющихся эффективными фотосенсибилизаторами химически активных форм молекулярного кислорода, в водных растворах предварительное связывание с нуклеиновыми кислотами не является необходимым условием их фотодинамического действия. Фотомодификация биополимеров в растворах с несвязанными красителями происходит в результате их химического взаимодействия с электронно-возбужденными молекулами кислорода.

4. Тепловыделение при безызлучательной дезактивации высоких электронно-возбужденных состояний связанных хромофоров приводит к гипертермии макромолекул и сопровождается локальной денатурацией двойной спирали с конформационными изменениями полимерных цепей.

Публикации

Основные результаты проведенных исследований опубликованы в 15 печатных работах. В перечне опубликованных работ 4 статьи в центральных отечественных и международных журналах, рецензируемых научных сборниках и материалах конференций, 11 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях.

Апробация работы

Основные результаты работы обсуждались на:

Региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Оренбург, 2000 г.); Third International Conference "Electronic Processes in Organic Materials" (ICEPOM-3), (Kharkiv, Ukraine, 2000 г.); Международной конференции "JIomohocob-2001" (Москва, 2001); II международной конференции молодых ученых и специалистов «0птика-2001» (Санкт-Петербург, 2001 г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 30-летию ОГУ (Оренбург, 2001 г.); VII Международной конференция "Лазерные и лазерно-информационные технологии: фундаментальные проблемы и приложения" (Суздаль, 2001 г.); XVII International Conference on Coherent and Nonlinear Optics (ICONO-2001), (Minsk, Belarus, 2001 г.); Междул народной конференции "Оптика, оптоэлектроника и технологии О Т-2001", (Ульяновск, 2001 г.); V Международной конференции "Импульсные лазеры на переходах атомов и молекул", (Томск, 2001 г.); Международном форуме "Инновации - 2002", (Оренбург, 2002 г.); IX Всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием (Москва, 2002 г.); International Quantum Electronic Conference IQEC - 2002, (Moscow, Russia, 2002 г.).

Структура работы

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, списка использованных источников из 211 наименований, содержит 167 страниц машинописного текста, 53 рисунка и 3 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Никиян, Айк Николаевич

Основные результаты и выводы

1. Исследовано взаимодействие органических красителей различных классов с макромолекулами нуклеиновых кислот и установлено, что в результате кооперативного связывания лигандов с полианионами на наружной стороне макромолекул образуются плоские органические наноструктуры. Устойчивые субмикронные молекулярные структуры имеют размеры 150*50*5 нм3 с числом молекул красителей в них до 1.5-104.

2. Определены критические концентрации самоагрегации молекул красителей в растворах полианионов, исследованы зависимости степени связывания от ионной силы растворов и его состояния, изучено ингибирование связывания ионами различных металлов, исследована динамика образования молекулярных агрегатов и их распределение вдоль макромолекул нуклеиновых кислот. Показано, что из отдельных наноструктур, при высоких концентрациях красителей, могут формироваться микрокристаллы, стерически экранирующие полимерную цепь ДНК.

3. Разработаны способы лазерной фотомодификации макромолекул нуклеиновых кислот и методы идентификации повреждений полимерных цепей с помощью связанных и свободных органических красителей.

4. Показано, что возможно двунитевое разрезание макромолекул ДНК с помощью слабо связанных органических красителей. Механизм разрезания основан на безызлучательном переносе энергии фотовозбуждения с высоких синглетных уровней молекул красителей на хромофорные группы макромолекул. Квантовый выход такого процесса не превышает значения 10"4.

5. Экспериментально доказана возможность локальной гипертермии макромолекул в результате тепловыделения при безызлучательной дезактивации высоких электронно-возбужденных состояний молекул слабо связанных хромофоров. Осуществлена адресная денатурация биополимеров и исследованы конформационные изменения полимерных цепей под влиянием локальных температурных полей. Установлено, что локальная тепловая денатурация является доминирующим процессом фотодеструкции макромолекул с помощью слабо связанных красителей.

6. Для органических молекул, являющихся эффективными фотосенсибилизаторами синглетного кислорода, предварительное связывание с нуклеиновыми кислотами не является необходимым условием их фотодинамического действия в растворах. Фотомодификация биополимеров в растворах с несвязанными красителями происходит в результате их химического взаимодействия с электронно-возбужденными молекулами кислорода.

7. Экспериментально показано, что в окрашенных водных растворах ДНК синглетный кислород возникает только в результате тушения триплетных состояний несвязанных или слабо связанных молекул красителей. Интер-калированные красители не являются генераторами синглетного кислорода.

Заключение

На протяжении двух последних десятилетий интенсивно исследуются процессы совместного действия света и органических молекул различных классов на нуклеиновые кислоты. Результаты этих исследований нашли применение при разработке современных методов диагностики и терапии, основанных на возможности селективного окрашивания и фотовоздействия на биологически важные макромолекулы. Повышение эффективности адресного воздействия на макромолекулы требует установления молекулярных механизмов фотосенсибилизированных реакций взаимодействия излучения с веществом.

Представленный в настоящей работе материал, по мнению автора, существенно дополняет имеющиеся сведения о природе фотореакций в окрашенных растворах биополимеров. Разумеется, мы не утверждаем, что полностью изучены все особенности связывания органичесюгх красителей с ДНК в растворах и дальнейшие исследования не дадут новых сведений о взаимодействии органических соединений с нуклеиновыми кислотами и специфике фотопроцессов с их участием. Скорее наоборот, полученные нами результаты дают возможность планирования дальнейших фундаментальных и прикладных исследований, и в первую очередь, в области фотобиологии. Так, локальная гипертермия макромолекул, осуществленная нами in vitro, может быть положена в основу принципиально нового метода поражения полимерных цепей. А выявленные закономерности связывания органических красителей с биологическими макромолекулами позволяют уже в настоящее время приступить к разработке методов флуоресцентной диагностики ранней патологии клеток и тканей.

Таким образом, решенные в настоящей работе задачи позволили с одной стороны достичь определенного уровня понимания особенностей фотопроцессов с участием биологически важных макромолекул, а с другой, определить перспективные направления использования уже полученных результатов и дальнейших исследований.

В завершение благодарю сотрудников института микро- и нанотехноло-гий Оренбургского государственного университета - доцентов С.Н. Пашкевича, Ю.Д. Лантуха, Э.К. Алиджанова, аспирантов O.K. Давыдову и Д.А. Раздоб-реева за помощь в работе и понимание. Я глубоко признателен доктору физико-математических наук, профессору Гарри Альбертовичу Кецле за заботу и внимание к моей работе.

Особую благодарность выражаю моему научному руководителю доктору физико-математических наук Сергею Николаевичу Летуте за моральную и интеллектуальную поддержку и оказавшему мне значительную помощь в работе над диссертацией.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Никиян, Айк Николаевич, Саратов

1. Waring M.J. DNA modification and cancer // Ann. Rev. Biochem. 1981. -Vol. 50.-P. 159-92.

2. Морошкина Е.Б., Сафьянникова М.Г. Взаимодействие ДНК с соединениями феназинового ряда // Биофизика. 1999. - Т. 44. - №3. - С. 425-429.

3. Лохман Э.-Р., Михелер А. Связывание органических красителей с • нуклеиновыми кислотами и фотодинамический эффект.- В кн.: Физикохимические свойства нуклеиновых кислот. М.: Мир, 1976, - С.233-273.

4. Coury J.E., Anderson J.R., McFail-Isom L., Williams L.D. and Bottomley L.A. Scanning Force Microscopy of Small Ligand-Nucleic Acid Complexes: Tris(o-phenanthroline)ruthenium(II) as a Test for a New Assay // J. Am. Chem. Soc. 1997. - 119. - P. 3792-3796.

5. Reinert K.E. //J.Mol.Biol. 1972. - Vol. 72. - P.393.

6. Благой Ю.П. Взаимодействие ДНК с биологически активными веществами (ионами металлов, красителями, лекарствами) // Соросовский образовательный журнал. 1998. - №10. - С. 18-24.

7. Южаков В.И. Агрегация молекул красителей и ее влияние на спектрально-люминесцентные свойства растворов // Успехи химии. -1992. Т.61, -№6. - С.1114-1141.

8. Теренин А.Н. Фотоника молекул красителей и родственных органических соединений. Ленинград: Наука, 1967, - 616 с.

9. Park С.Н., Park H.A., Kim Y.I., Sock S. Thermodynamic study on molecular associations of some organic dyestaffs in aqueous solutions // Thermochim. Acta. 1984. - Vol. 80. -№1. - P. 131-136.

10. Imae T. Formation of molecular aggregates of surface-active azodyes // Hyomen. 1984. - Vol. 22. - №8. - P. 444-458.

11. Schiebe G. Reversible Polymerisation aus Urache neuartiger Absorptionsbanden von Farbstaffen Kolloid // Kolloid Z. 1938. - Bd. 82. -№1. - S. 1-14.

12. Schiebe G. Uber die Veranderlichkeit der Absorptiospektren in Losungen und die Nebelvalenzen ais ihre Urache // Z. Angen. Chem. 1937. - Bd. 50. -S.212-219.

13. Schiebe G. Die Stereoisomerie Organischer Frbstoffe und ihr Zusamenhang mit konstitution und Eigenschaften reversibel polymerer Farbstaffe // Zs. Agnew. Chem. 1937. - Bd.52. - S.631-642.

14. Schiebe G. Fluoreszenzumtersuchungen an Monomethin Farbstoffen, insbesondere an reversibel polymeren Monomethin Zyaninen // Kolloid Z. -1940. Bd. 93. - №3. - S.28-50.

15. Кецле Г.А., Левшин Л.В., Славнова Т.Д., Чибисов А.К. Внутримолекулярные процессы деградации энергии электронного возбуждения в мономерах и ассоциатах родамина 6Ж // Известия АН СССР, Серия физическая. 1972. - Т.36. - №5. - С. 1078-1081.

16. Лёвшин Л.В., Салецкий A.M. Лазеры на основе сложных органических соединений. М.: Изд-во МГУ, 1992. - 330 с.

17. Красовицкий Б.М., Болотин Б.М. Органические люминофоры. Л.: Химия, 1976.

18. Клочков В.П., Верховский Е.Б. Спектр испускания высококонцентрированных растворов красителей при возбуждении лазерным излучением большой мощности // Оптика и спектроскопия. 2000.-Т. 89. -№1. С.114-118.

19. Клочков В.П., Верховский Е.Б.Коллективное испускание молекул родамина 6Ж в жидком растворе // Оптика и спектроскопия 1998. - Т. 85. - №3. - С.427-433.

20. Левшин JI.B., Рыжиков Б.Д., Савельев В.П. Спектральные свойства ассоциатов разнородных молекул красителей // Вест. Мое. Ун-та, сер. физ., астр. 1974. - Т.15. - №2. - С. 156-162.

21. Рыжиков Б.Д., Салецкий A.M. Исследование процессов ассоциации разнородных молекул красителей в водных растворах // Вест. Мое. Унта, сер. физ.,астр. 1991. - Т.32. - №4. - С. 71-76.

22. Зуауи А., Левшин Л.В., Салецкий A.M. Структура разнородных ассоциатов красителей в полимерных матрицах // Оптика и спектроскопия. 1989.- Т. 66.- Выпуск 2.- С. 301-304.

23. Левшин Л.В., Салецкий А.М. Исследование разнородных люминесцируюгцих ассоциатов красителей родамина 6Ж и метиленового голубого в бинарных растворителях // Оптика и спектроскопия. 1990. -Т. 68. - № 2. - С.354-358.

24. Шурдов М.А., Кгаценко Г.П. Взаимодействие красителей акридинового оранжевого и этидиума бромида с ДНК в фаге X II Биофизика. 1982. -Т.27. - №2. - С. 148.

25. Nygren J., Svanvik N., Kubista M. The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA // Biopolymers. 1998. - Vol. 46. - P. 39-51.

26. Malicka J., Gryczynski I., Maliwal B.P., Fang J., Lakowicz J.R. Fluorescence spectral properties of cyanine dye labelled DNA near metallic silver particles//Biopolymers. 2003. -Vol. 72. - №2. - P. 96-104.

27. Norden В., Tjerneld F. Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroizm // Chemical physics letters. 1977. - Vol. 50. -№3. - P. 508-512.

28. Norden В., Tjerneld F. Structure of methylene blue-DNA complexes studied by linear and circular dichroizm spectroscopy // Biopolymers. 1982. - Vol. 21.-P. 1713-1734.

29. Морошкина Е.Б., Кривцова M.A., Глибин E.H. Влияние природы заместителей амидов актиноцина на способ их связывания с ДНК // Биофизика. 2002. - Т. 47. - №.3. - С.444-448.

30. Морошкина Е. Б., Загоруйко Н. В., Глибин Е. Н. Взаимодействие ДНК с бензокраун-производными актиноцина // Физика и физическая химия биополимеров. 2001. - Т. 35. - №1. - С. 109-116.

31. Todor G. Deligeorgiev, Daphinka A. Zaneva, Haralambos E. Katerinopoulos and Vihren N. Kolev A novel method for the preparation of monomethine cyanine dyes // Dyes and Pigments. 1999. - Vol. 41. - № 1-2. - P. 49-54.

32. Todor G. Deligeorgiev, Daphinka A. Zaneva, Seok Hong Kim and Ram W Sabnis Preparation of monomethine cyanine dyes for nucleic acid detection // Dyes and Pigments. 1998. - Vol. 37. - №3. - P. 205-211.

33. Megnin F., Faustino P.J., Lyon R.C., Lelkes P.I., Cohen J.S. Studies on the mechanism of selective retention of porphyrins and metalloporphyrins by cancer cells // Biochim. Biophys. Acta C. 1987. - Vol. 929. - P.173-181.

34. Marzilli L.G. Medical aspects of DNA-Porphyrin interactions // New. J. Chem. 1990. - Vol.14. - №7. - P.409-420.

35. Benett M, Krah A., Wien F., Garman E., McKenna R., Sanderson M. A DNA-porphyrin minor-groove complex at atomic resolution: The structural consequences of porphyrin ruffling // Proc. Natl.Acad.Sci. USA. 2000. -Vol. 97.-P. 9476-9481.

36. Далян Е.Б. Взаимодействие мезо-тетра(Т-оксиэтилпиридил)порфиринов с ДНК. Эффект положения боковых групп // Биофизика. 2002. - Т. 47. -Вып.2. - С.253-258.

37. Благой Ю.П., Галкин B.JL, Гладченко Г.О. и др. Металлокомплексы нуклеиновых кислот в растворах. Киев: Наук, думка, 1991.

38. Благой Ю.П., Сорокин В.А., Валеев В.А. Спектральное исследованиесвязывания оснований ДНК с ионами магния и кальция // Молекулярная биология. 1980. - Том 14. - Вып.З. - С.595-605.

39. Тимченко М.А., Первушина Е.В., Ташлицкий В.Н., Кубарева Е.А., Крынецкая Н.Ф.- Взаимодействие фталоцианинового комплекса кобальта с ДНК-дуплексами // Молекулярная биология,- 2000. -Том 34. №1. -С.101-109.

40. Sigman D.S. Chemical nucleases // Biochemistry. 1990.- Vol. 29. - №39. -P.9097-9105.

41. Вольпин M.E., Кнорре Д.Г., Новодарова Г.Н., Тувин М.Ю., Федорова О.С., Фролова Е.И. // Доклады АН СССР. 1998,- Т.298. -С.363-366.

42. Пескин А.В. Воздействие активных форм кислорода с ДНК // Биохимия. f 1997.- Т.62. - №12. - С.1571-1578.

43. Белков В.М., Крынецкая Н.Ф., Шабарова З.А., Новодарова Г.Н., Вольпин М.Е. Кобальт-корриновые производные олигонуклеотидов как реагенты для избирательного расщепления нуклеиновых кислот // Биоорганическая химия. 1995. - Том 21. - № 6. - С. 446-454.

44. Бурилков В.Н., Крочик Г.М. Биологическое действие лазерного излучения. Институт хим. генетики. Кишенев: Штиинца, 1989. 101 с.

45. Шиниашвли Д.М., Лисцов В.Н., Мошковский Ю.Ш. Об изменениях вторичной структуры ДНК под действием ионов палладия. М.:Наука, 1973.-С. 48-51.

46. Raab О., Uber die Wirkung fluoreszierenden Stoffe auf Infusoria // Z. Biol. -1900.- V.39.-P. 524-546.

47. H. von Tappeiner, Uber die Wirkung Fluorescierenden Stoffe auf Infusiorien nach Versuchen von O. Raab // Munch. Med. Wochenschr. 1900. - V.47. -P. 5-8.

48. H. von Tappeiner and A. Jodlbauer, Die sensibiliserende Wirkung fluorescierender Substanzer. Gasammette Untersuchungen tiber die photodynamische Erscheinung. FCW Vogel, Leipzig, 1907.