Структурно-функциональные свойства некоторых лигандных форм гемоглобина человека в условиях УФ-облучения и различного микроокружения

Путинцева, Ольга Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональные свойства некоторых лигандных форм гемоглобина человека в условиях УФ-облучения и различного микроокружения
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные свойства некоторых лигандных форм гемоглобина человека в условиях УФ-облучения и различного микроокружения"

На правах рукописи

Путинцева Ольга Васильевна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА НЕКОТОРЫХ ЛИГАНДНЫХ ФОРМ ГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ УФ-ОБЛУЧЕНИЯ И РАЗЛИЧНОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ

Специальность 03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Воронеж 2007

003060772

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный консультант-

доктор биологических наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор Артюхов Валерий Григорьевич

Официальные оппоненты

доктор физико-математических наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор Холмогоров Владимир Евгеньевич

доктор биологических наук, профессор Потапенко Александр Яковлевич доктор биологических наук, академик РАЕН, профессор Пашков Александр Николаевич

Ведущая организация- Московский государственный университет им М В Ломоносова

Защита диссертации состоится " 3 " июля 2007 г, в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 212 038 03 при Воронежском государственном университете по адресу. 394006, г Воронеж, Университетская пл, 1, ауд 59

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета

Автореферат разослан « 31» мая 2007 г Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Грабович М.Ю

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. УФ-свет и температура - два важнейших экологических фактора, под воздействием которых возникала жизнь на Земле. Понять сложные механизмы резистентности и адаптации живых систем по отношению к УФ-излучеиию и температурному фактору можно, только изучив их влияние на клеточно-молекулярном уровне отдельных индивидуумов. В качестве модельных объектов для изучения фото- и термостабильности белков очень удобно использовать компоненты крови, и в частности, гемоглобин эритроцитов. Последний относится к гетерогенным белкам (Н.Ф. Стародуб, В.И. Наза-ренко, 1978) В организме человека и животных он существует в комплексе с целым рядом малых лигандов (02, СО, N0, Н20 и др.) в виде молекул окси-, карбокси-, нитрозо-, метгемоглобина и др., физико-химические свойства и функциональная активность которых резко отличаются в зависимости от формы их существования тетрамерной, димерной или мономерной (Л.И. Иржак, 1975; Г А Вашанов, 2004) Исследований, посвященных изучению вклада отдельных компонентов гембелков в процессы фотоповреждения различных структурных форм гемоглобина в условиях различного микроокружения (В.Г Артюхов и др., 1997), крайне недостаточно. Основные фотохимические исследования гемопротеидов проведены в основном без учета их структурной неоднородности и лигандного состава.

В норме соотношение отдельных лигандных форм гемоглобина поддерживается на определенном уровне Однако оно может значительно изменяться за счет поступления оксидов азота и углерода извне В настоящее время всё большую актуальность приобретают исследования, посвященные изучению физико-химических и функциональных свойств препаратов гемоглобина с различным соотношением окси- и карбоксиформ, окси- и нитрозоформ

Процессы с участием оксидов азота и углерода в биосистемах, подвергнутых воздействию УФ-света от естественных и искусственных источников, остаются практически неизученными; недостаточно полно определены пути фотопревращения комплексов белок-лиганд при этих воздействиях. Принимая во внимание усиливающуюся роль коротко- и средневолнового УФ-излучения в формировании антропогенной нагрузки на окружающую среду, а также широкое использование в клинической практике метода аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК) и других видов фототерапии, становится понятной необходимость проведения подобного рода исследований.

Особый интерес представляет изучение структурного статуса молекул оксигемоглобина в присутствии различных концентраций лекарственных средств - источников N0.

Функционирование молекул N0 в клетках организма человека тесно связано с низкомолекулярными серосодержащими пептидами, и в частности, с

восстановленным глутатионом (С8Н), молекулы которого входят в состав глу-татионовой антиоксидантной системы Соединяясь с оксидом азота, в8Н образует Б-нитрозоглутатион (ОБМО), который защищает N0 от различных воздействий при внутри- и межклеточном переносе. Важная роль глутатиона и его производных в нормальном функционировании клеток, тканей и организма человека, а также недостаточная изученность влияния этих молекул на эритроци-тарные белки крови стимулировали нас к проведению исследований третичной и четвертичной структуры нативного и УФ-облученного оксигемоглобина человека в присутствии восстановленного глутатиона и 8-нитрозоглутатиона

Весьма перспективным является разработка кислородпереносящих кровезаменителей на основе гемоглобина, химически модифицированного некоторыми органическими молекулами, защищающими его от разного рода внешних воздействий. В связи с вышеизложенным нами было постулировано использование в качестве стабилизирующего агента гемоглобина окисленного производного клинического декстрана (реополиглюкина) - диальдегиддекст-рана (ДАД), разработаны методы получения конъюгатов оксигемоглобина человека с данным полисахаридом, выяснены условия их образования, исследованы физико-химические характеристики и стабильность полученных комплексов.

Изучению действия температуры на белковые молекулы посвящено значительное количество работ (М Жоли, 1968; В.Я Александров, 1975; ЕГ. Франк и др., 1994). Вместе с тем мало внимания уделено исследованию природы конформационных превращений сложных (олигомерных) белков, приводящих к их термоинактивации. Недостаточно изучены вопросы, касающиеся выявления физико-химических основ тепловой денатурации этих биополимеров Всё это убеждало нас в необходимости проведения подобного рода исследований. В качестве объектов исследования в данной серии экспериментов выступили оксигемоглобин человека в растворе, в присутствии реополиглюкина, в комплексах с диальдегиддекстраном и в составе эритроцитов, что позволило провести сравнительный анализ термоустойчивости оксиформы гемопротеида в зависимости от условий микроокружения и исходной кон-формации белка.

Таким образом, исследование фото- и термоиндуцированных структурных превращений гемоглобина человека и его производных, изучение функциональной активности оксигемоглобина в меняющихся условиях окружающей среды имеет важное теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи диссертационной работы.

Целью настоящей работы явилось определение степени УФ-чувствитель-ности и термостабильности ряда структурных (лигандных) форм гемоглобина человека и его производных в условиях различного микроокружения

Задачи работы предусматривали:

1. Оценку физико-химических характеристик гемоглобина человека с различными аксиальными лигандами (02, СО, N0, Н20) в координационной сфере атома железа порфиринового кольца.

2. Изучение влияния различных диапазонов и доз УФ-света на спектральные, хроматографические и электрофоретические характеристики различных лигандных форм (окси-, карбокси-, нитрозо- и метформы) гемоглобина человека.

3. Вьмвление влияния сочетанного воздействия «терапевтических» доз УФ-света и различных концентраций НЬСО и НЬЫО на функциональные свойства оксигемоглобина человека.

4.Сравнительный анализ фоточувствительности различных лигандных форм гемоглобина человека (НЬ02, НЬСО, НЬЖ), МШЬ).

5. Изучение структурного состояния молекул оксигемоглобина человека, модифицированного воздействием восстановленного глутатиона (К)"4 4- 10"2 моль/л) и УФ-излучения в дозах 151 4530 Дж/м2.

6. Исследование изменений физико-химических свойств оксигемоглобина человека, индуцированных 8-нитрозоглутатионом в концентрациях 10"5 -10'3 моль/л, а также сочетанным воздействием этого модификатора и УФ-света (240-390 нм) в дозе 151 Дж/м2.

7. Изучение влияния длительного хранения крови доноров при пониженной температуре на структурно-функциональные характеристики гемоглобина эритроцитов Определение оптимальных сроков использования донорской крови для её трансфузии.

8. Подбор оптимальных условий химического синтеза комплексов окси-гемоглобин-диальдегиддекстран и определение некоторых физико-химических характеристик их молекул.

9. Изучение термостабильности молекул оксигемоглобина человека в растворе, в присутствии реополиглюкина и в комплексах с ДАД

Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным анализу влияния эндогенных низкомолекулярных биорегуляторов -малых неионных лигандов (оксидов азота и углерода) и тиолсодержащих соединений (восстановленного глутатиона и Б-нитрозоглутатиона), лекарственных препаратов (нитроглицерина, МОНОЧИНКВЕ®), высокомолекулярных полианионов на основе декстрана (реополиглюкина и диальдегиддекстрана), УФ-излучения и температурного фактора на структурно-функциональное состояние молекул гемоглобина человека. Выявлено, что от природы аксиального лиганда (Ог, СО, N0) в координационной сфере атома железа молекулы гемоглобина, прочности связи гем-проксимальный гистидин и конформации ближайшего белкового окружения гема зависят состояние высших типов пространственной организации молекул гемоглобина, его физико-химические свойства и фоточувствительность.

мерных и межсубъединичных контактов и, как следствие, накопление минорных димерных и мономерных форм гембелка. Кроме того, фотомодификации гемопротеидов могут приводить к декомпактизации их частично спирализован-ных молекул и ассоциации гембелков вплоть до размеров октамеров.

Впервые исследовано влияние НЬЖ> в диапазоне концентраций 0,1-10% на функциональные свойства нативного и УФ-облученного в дозах 151 и 453 Дж/м2 оксигемоглобина человека Изучение динамики связывания кислорода гемопротеидом показало, что присутствие НЫЧО интенсифицирует начальные этапы процесса оксигенации и ослабляет кооперативные взаимодействия в тет-рамерах, вследствие чего сродство гемоглобина к кислороду в области физиологически важных парциальных давлений (40-100 мм рт. ст.) снижается.

Показано, что направленность УФ-индуцированных изменений функциональных свойств (снижение или возрастание величин Р50 и константы Хилла) оксигемоглобина и его смесей с НЬСО и №N0 определяется соотношением вкладов фотохимических превращений отдельных лигандных форм гембелка и процессами образования минорных компонентов системы гемоглобина Выявлены предельные концентрации НЬСО (менее 10 %), при которых возможна корректировка и восстановление исходных характеристик кислородсвязываю-щей способности гемопротеида УФ-светом, На основе метода кусочно линейной аппроксимации созданы математические модели процессов оксигенации гемоглобина человека, модифицированного воздействием некоторых агентов физической и химической природы.

Исследована возможность использования производных декстрана (реопо-лиглюкина и диальдегидцекстрана) в качестве стабилизаторов молекул гемоглобина. Впервые подобраны оптимальные условия химического синтеза комплексов гемоглобина с ДАД, позволяющие получать модифицированные образцы гемоглобина с определенными размерами, молекулярными массами и физико-химическими свойствами Определены а-1, б-О-глюкопиранозные остатки декстрана, подвергающиеся окислению и участвующие в образовании альдегидных групп при получении ДАД, выявлены участки (аминокислотные остатки) глобина, ответственные за комплексообразование с указанным поли-сахаридным производным. Созданы компьютерные модели трехмерной пространственной структуры молекул декстрана, ДАД, комплексов НЬ-ДАД I и II типа с различным соотношением белок, модификатор.

Проанализированы термоиндуцированные изменения молекул гемоглобина человека в растворе (в свободном состоянии), в составе эритроцитов крови, в присутствии реополиглюкина и в комплексах с ДАД. Выявлены оптимальные сроки хранения донорской крови при пониженной температуре, при которых структурные и функциональные характеристики гемоглобина остаются близкими к нативному состоянию Показано, что термостабильность молекул гемоглобина можно значительно повышать путем присоединения к ним определенного количества молекул окисленного декстрана

Практическая значимость. Результаты проведенных модельных экспериментов по исследованию динамики фотоиндуцированных превращений молекул НЬОг, НЬСО, №>N0 и МШЬ и выяснению структуры стабильных фото-

продуктов, образующихся при воздействии различных диапазонов длин волн УФ-света на гемопротеиды, можно использовать для подбора оптимальных доз УФ-облучения и длительности курса процедур при лечении заболеваний различной этиологии методом АУФОК.

Данные, полученные при изучении влияния различных концентраций карбоксигемоглобина (10 - 80%) и нитрозогемоглобина (0,1 - 10 %) на функциональную активность гемоглобина до и после воздействия УФ-света могут быть использованы в клинической практике для диагностики интоксикаций организма СО или N0 и разработки методов регулирования кислородгранспорт-ной функции гемоглобина.

Разработанные программы для ЭВМ типа IBM «Анализ кривых диссоциации оксигемоглобина человека, модифицированного воздействием факторов физической и химической природы», «Расчет точки полного насыщения кислородом оксигемоглобина человека, модифицированного воздействием факторов физической и химической природы», «Прогноз функциональной активности нативного и УФ-облученного оксигемоглобина человека в зависимости от концентрации оксида азота и углерода» (Свидетельства об официальной регистрации программ для ЭВМ № 2006614279, № 2006614280 и № 2006614281 Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам РФ, зарегистрированные в Реестре программ для ЭВМ 13 декабря 2006 г ) позволяют быстро и точно, не прибегая к использованию графической модели процесса, рассчитать наиболее важные параметры процессов оксигена-ции гемоглобина в условиях различного микроокружения

Результаты исследований, посвященных изучению структурно-функциональных характеристик молекул гемоглобина при длительном хранении консервированной крови доноров, необходимо принимать во внимание при разработке научно-обоснованных рекомендаций по использованию крови доноров в клинической практике.

Экспериментальные данные по исследованию физико-химических свойств препаратов гемоглобина в присутствии реополиглюкина и химически модифицированного гемоглобина (различные комплексы Hb-ДАД) могут быть использованы специалистами, работающими в области создания искусственных кровезаменителей.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского госуниверситета при чтении курсов "Фотобиология", "Общая биофизика", "Фотофизика, фотохимия и фотоиммунология компонентов крови", при проведении спецпрактикума по фотобиологии, выполнении магистерских и кандидатских диссертационных работ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной конференции "Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах (Суздаль, 1995); I и II Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1995, 1998); Second Int Conf on development directions of the radio communication systems and means (Voronezh, 1995), Int. Sei. Conf. "Mathematical models of non-linear excitation, transport, dynamics, control in

condensed system and other mediums" (Tver, 1996); 12th Int Congress on photo-biology (Viena, 1996); 2nd Internat. Symposium "Molecular order and mobility m polimer systems" (Saints-Petersburg, 1996); I и II Всероссийской конференции фотобиологов (Пущино, 1996, 1998); Международном симпозиуме "Кислород и свободные радикалы" (Гродно, 1996); 3-й и 5-й Международных научных конференциях "Математические модели нелинейных возбуждений, динамики, переноса, управления в конденсированных системах и других средах" (Тверь, 1998; Москва, 2000); II и III съезде биофизиков России (Москва, 1999; Воронеж, 2004), II и III Международном конгрессе "Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2000, 2003); 13th Congress on Photobiology (San-Francisco, 2000); IV съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология и радиационная безопасность) (Москва, 2001); 7-й и 8-й Международной конференции по химии и физико-химии олигомеров "Олигомеры-2000, 2002" (Пермь, 2000, Москва-Черноголовка, 2002); III съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001), IV съезде по проблемам радиационной биологии (Москва, 2001); 3 Int. Symposium on Separaüon m BioSciencies SBS'03 "100 yeares of chromatography" (Moskau, 2003), Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2001, 2006), IX Международной научно-практической конференции "Экология и жизнь" (Пенза, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 48 работ, в том числе коллективная монография, учебное пособие с грифом Министерства образования и науки РФ.

На защиту выносятся следующие положения.

1. Состояние третичной и четвертичной структуры молекул гемоглобина и его УФ-чувствительность определяются природой аксиального лиганда и зависят от ближайшего микроокружения гемовой группы белковой макромолекулы. Фотомодификации различных лигандных форм тетрамерной молекулы гемоглобина (НЬСЬ, HbCO, HbNO, MtHb) затрагивают области контактов диме-ров и отдельных субъединиц, что приводит к накоплению минорных димерных и мономерных форм, или к декомпакгизации тетрамерных молекул и образованию октамерных форм.

2 Схемы возможных физико-химических процессов, приводящих к УФ-модификации молекул карбокси-, нитрозо- и метгемоглобина человека

3. Математические модели процессов оксигенации интактного и модифицированного УФ-излучением гемоглобина человека в присутствии оксидов углерода и азота

4. Диальдегиддекстран - эффективный стабилизатор и модификатор структурно-функционального состояния молекул гемоглобина человека

5. Компьютерные модели трехмерной пространственной структуры дек-страна, диальдегидцекстрана, комплексов гемоглобин- диальдегиддекстран I и II типов.

6. Схема процессов, протекающих в растворах интактных и термостатированных молекул гемоглобина человека в присутствии реополиглюкина и диальдегидцекстрана

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 385 страниц машинописного текста, 80 таблиц, 92 рисунка. Состоит из "Введения", 11 глав, "Заключения", "Выводов", "Приложения" Список цитируемой литературы состоит из 362 работ, из них 211 отечественных и 151 зарубежных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе представлен свод основных работ, посвященных физико-химическим свойствам, механизмам образования и физиологической роли эндогенных низкомолекулярных биорегуляторов (монооксиды азота и углерода, восстановленный глутатион, нитрозоглутатион), а также анализу особенностей структурно-функциональных свойств различных лигандных форм гемоглобина человека и их УФ-индуцированных превращений.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оксигемоглобин (НЬОг) выделяли из крови доноров по методу Б.Ь. ОгаЫоп (1946) с модификациями Л.А Блюменфельда (1957). Перевод НЬОг в карбоксиформу осуществляли путем пропускания оксида углерода (СО) через раствор гемопротеида. Метгемоглобин (МШЬ) получали путем окисления водных растворов НЬОг 2-% раствором феррицианида калия. Нитрозогемоглобин (НЬГЮ) получали, инкубируя НЬОг с Ь-нитрозоцистеином, синтезированным по методу А.А Монгина и др. (1998), в бескислородной среде.

Для модификации молекул НЬОг человека использовали лекарственные препараты - источники оксида азота: нитроглицерин (10"6-г10'2 моль/л), МО-НОЧИНКВЕ® (10"6т-10"3 моль/л) и Э-нитрозоглутатион (10"5-103 моль/л), а также водные растворы восстановленного глутатиона ("КеапаГ, Венгрия) в концентрациях 10'4-10"2 моль/л. ОвЫО получали по методике, описанной И.И. Степуро и др (1997). Концентрацию ОБГТО определяли по величине оптической плотности в области 335 нм (е = 774 л/моль см) (А.Ф. Ванин, 1995). Полученные смеси гемоглобина с лекарственными препаратами инкубировали при 37 °С, а с ОБН и СБГЮ при комнатной температуре в течение 20 мин.

Оксигемоглобин человека модифицировали растворами реополиглюкина (ОАО "Красфарма", Россия) Конечное молярное соотношение белок'декстран составляло 1:1 и 1'4. Приготовление диальдегиддекстрана (ДАД) из реополиглюкина проводили с помощью реакции периодатного окисления (Методы химии углеводов, 1967). Степень окисления ДАД (у) определяли методом йодо-метрического титрования (В.А. Боландин, 1957). Конъюгат оксигемоглобина с ДАД синтезировали путем восстановительного алкилирования. Отмывку конъ-югата гемоглобин-ДАД от несвязавшегося белка, определение его фракционного состава и величин кажущейся молекулярной массы фракций осуществляли методом гель-фильтрации (Г Детерман, 1970) Содержание полисахарида в конъюгатах гемоглобин-ДАД определяли по методу М. Дюбуа (И.П.Гладышева и др , 2001). Определение природы ионогенных групп, участвующих в образовании комплекса гемоглобин-ДАД осуществляли методом протеолитического титрования, количество ионогенных групп в расчете на одну молекулу белка и величины буферной емкости растворов нативного и модифицированного гемоглобина определяли по методике, описанной В Г Артю-ховым и соавт. (2001)

Растворы гембелка в объеме 3 мл облучали светом ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 в термостатируемой кювете (20±1° С) на расстоянии 0,23 м от оси лампы при постоянном перемешивании магнитной мешалкой. Интегральный поток УФ-света (240-390 нм) выделяли с помощью светофильтра УФС-1. Интенсивность облучения составляла 151 Дж/м2 мин. Время экспозиции -1,3, 6, 9, 15 и 30 мин. Для выделения длинноволнового УФ-излучения (320-390 нм) использовали светофильтр УФС-3 (А^м =365 нм). Интенсивность облучения составляла 11,7 Дж/м2-мин. Время экспозиции - 3,6,9,15,30 и 60 мин.

Растворы нативного и модифицированного гемоглобина инкубировали в термостате иТи-4 в диапазоне температур 30 - 80 °С в течение 30 мин., а затем охлаждали до комнатной температуры не менее 20 мин., после чего исследовали их физико-химические свойства О термопревращениях гемопротеида в присутствии модификаторов судили на основе анализа изменений интенсивности светорассеяния т (%) растворов гемоглобина, которую рассчитывали по величине коэффициента светопропускания (Т) образцов при 490 нм

Регистрацию электронных спектров поглощения (ЭСП) растворов гемоглобина осуществляли на спектрофотометре СФ-46 или СФ-56 (ЛОМО, Россия) в диапазоне длин волн 230-650 нм.

Гель-фильтрацию растворов гемопротеидов и их электрофоретических фракций проводили по методу Г. Детермана (1970) на хроматографических колонках, упакованных сефадексом в-100 или в-75 ("РИагтаета", Швеция) и уравновешенных (в зависимости от поставленных задач) натрий-фосфатным буфером, рН 7,4 или трис-глициновым буфером, рН 8,3.

Электрофоретические характеристики гемоглобина и его производных исследовали методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле (Г.Маурер, 1971). Используя денситограммы образцов гембелка, рассчитывали электрофо-ретическую подвижность (ЭП) фракций, процентное содержание белка в них и ширину отдельных полос. Для исследования природы электрофоретических фракций НЬСО и №N0 их вырезали из столбиков геля и экстрагировали в на трий-фосфатном (НЬЫО) или трис-глициновом (НЬСО) буфере в течение 20 ч.

Молекулярные массы электрофоретических фракций нативного НЬ02, а также его комплексов с ДАД определяли методом электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли (и К. Ьаешш1у, 1980). Кривые диссоциации НЬ02 и его смесей с №>N0 или НЬСО регистрировали спектрофото-метрическим методом (В.Г. Ариохов и др, 1989). Оценку функциональной активности гемоглобина осуществляли традиционным способом по величинам давления полунасыщения (Р50) и константы Хилла (а). Для учета сложного характера взаимодействий дериватов гемоглобина между собой и для уточнения, в какой фазе оксигенации происходят те или иные изменения, нами был предложен расчет содержания оксигемоглобина в интактном образце и смесях при различных парциальных давлениях кислорода: 3,19; 7,98; 15,96; 23,94; 31,92; 63,84; 95,76 мм рт ст Расчет проводили графическим методом по определению положения соответствующих точек на сатурационной кривой, а также используя математическое модели на основе метода кусочно линейной аппроксимации.

Для создания трехмерных пространственных моделей гема, гемоглобина человека, декстрана, ДАД, а также комплексов гемоглобин-ДАД I и II типов использовали программный пакет HyperChem 7.0 Professional. С целью поиска наиболее вероятной конформации исследуемых молекул производили оптимизацию их геометрии методом молекулярной механики с силовым полем OPLS с использованием алгоритма сопряженных градиентов Полака-Рибери. Динамику атомного остова молекулы гемоглобина изучали с помощью метода молекулярной динамики (МД), который рассчитывает непрерывную фазовую траекторию движения каждой частицы во времени. Расчеты методом МД проводили при температуре 310 К. Длительность расчета составляла 1 пс с шагом 0,001 пс.

Количество реакционноспособных SH-групп в молекулах различных ли-гандных форм НЬ определяли спектрофотометрическим титрованием по методу H.D. Воуег (1954) с модификациями Х.М. Рубиной и Л.А. Романчука (1978). Для вычисления процентного содержания основных лигандных форм гемоглобина использовалась эмпирическая система уравнений (JI.K. Стусь, Б.Д. Розанова, 1992). Рассчитывали константу скорости фотоокисления гема, константу равновесия процесса перехода железа гема в высокоспиновое состояние, стандартную свободную энергию молекул нативного и УФ-облученного гемоглобина. Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакета прикладных программ "Stadia", контрольные и опытные показатели сравнивали по t-критерию Стьюдента при 95%-ном уровне значимости. Кластерный анализ осуществляли с использованием метрики корреляции, стратегия классификации - группового соседа (А.П. Кулаичев, 1996).

ГЛАВА 3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И УФ-ОБЛУЧЕННОГО ОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА

Электронные спектры поглощения (ЭСП) водных и буферных растворов НЬОг человека характеризовались наличием максимумов при 275, 342, 412, 542 и 576 нм. Инггактиые препараты ИЬОг были представлены тетрамерами с молекулярной массой 65,1±0,4 кДа. Облучение УФ-светом (240-390 нм) в дозах 4531510 Дж/м2 приводило к увеличению молекулярной массы белка до 66,910,4 -68,2±0,2 кДа. Для изучения природы продуктов, образующихся при УФ-облучении растворов гембелка, нами были зарегистрированы ЭСП его хроматографической фракции. В спектрах поглощения этой фракции, выделенной из растворов НЬ02, УФ-облученных в дозах 453 - 1510 Дж/м1, наблюдалось смещение полосы Соре в сторону коротких длин волн (406 нм) и появление максимума при 630 нм, что свидетельствует об образовании в растворе окисленных форм белка - MtHb (В.Г. Ар-тюхов, 1995). Воздействие УФ-излучения в дозах 151 - 906 Дж/м2 вызывало снижение количества реакционноспособных SH-rpynn в гембелке с 1,85±0,14 (контроль) до 0,88±0,07 мкмоль/100 мл. Наблюдаемый эффект может быть обусловлен как фотолизом части SH-групп, экспонированных на поверхности белковой глобулы, так и перестройками третичной структуры молекул исследуемого гемопротеи-да, которые сопровождаются частичным экранированием остатков Cys 93(3, что затрудняет доступ к его сульфгцдрильной группе молекул ПХМБ.

При электрофорезе в ПААГ с пониженным содержанием акриламида в концентрирующем геле (10 мг на 100 мл) были выделены две фракции НЬОг. ЭП 1-й фракции гембелка равняется 0,89±0,02, 2-Й - 0,62±0,02. На долю 1-й фракции приходится 14,2±0,1% белка, а 2-й - 85,840,1 % (рис. 1). С помощью метода гель-фильтрации на сефадексе в-100 (трис-глициновый буфер, рН 8,3) мы определили, что молекулярная масса белка, входящего в состав 1-й фракции, соответствует величине 18,6±0,1 кДа, а 2-й - 47,3±0,2 кДа. Действие УФ-света (240-390 нм) в дозах 151-4530 Дж/м2 на растворы оксигемоглобина человека не влияло на количество электрофоретических фракций и их ЭП, статистически достоверные изменения ширины полос фракций фотомодифициро-ванного гембелка отмечались только при максимальной дозе УФ-света (4530 Дж/мг), при этом содержание белка в 1-й фракции увеличивается до 18,0±0,01

Ь, а во 2-й -уменьшается до 82,0±0,01

0,12 0,10' 0,08 0,06 0.Р4 0,02 0

I %

3 . 4

6.'

6 • 7 см

Рис. 1. Денситограмма оксигемоглобина человека в стандартных условиях проведения электрофореза (а) и при пониженном содержании акриламида в концентрирующем геле (б)

В стандартных условиях проведения электрофореза (Г. Маурер, 1971) ок-сигемоглобин человека разделяется на 4 гемсодержащие белковые фракции (рис. 1а), их ЭП равняется 1,01±0,02, 0,58±0,03, 0,40±0,02 и 0,32±0,02, а процентное соотношение белка во фракциях составляет 0,98:95,37:2,16.1,49. Следовательно, контрольный образец НЬОг в обоих условиях эксперимента был представлен практически второй фракцией. Число фракций, выделенных в процессе электрофореза УФ-облучекных растворов гембелка, не изменяется по сравнению с его контрольными образцами, оно остается равным 4. Однако электрофоретические характеристики облученных и нативных препаратов ок-сиформы гемоглобина значительно различаются. Воздействие УФ-радиации вызывало достоверное увеличение ЭП 3-й (151 и 2265 Дж/м2) и 4-й фракции (453 и 755 Дж/м2), уменьшение ширины 2-й (453-4530 Дж/м2) и 3-й фракции (1359 и 2265 Дж/м2), переход части белка из 1-й фракции в 3-ю (151 Дж/м2), из 2-й фракции - в 4-ю (453 Дж/м2). При больших дозах УФ-излучения (1359-4530

Дж/м2) в процессе перераспределения белка участвуют все 4 элек-трофоретические фракции»

Таким образом, согласно данным гель-хроматографии на сефадексах после облучения растворов оксигемоглобина человека УФ-светом (240-390 им) в дозах 151*1510 Дж/м2 Наблюдается незначительное увеличение кажущихся молекулярных масс фракции фотомодифицированного гембелка при переходе его молекул из оксигенированного в окисленное состояние, что свидетельствует об ослаблении межсубъединичных контактов и о частичном разворачивании полипептидных цепей, входящих в состав белковых глобул, об увеличении объема и размеров последних. Конформационные перестройки молекул УФ-об-лученного гемопротеида подтверждает также регистрируемое спекгрофотомегг-рически уменьшение количества титруемых SH-групп. Однако изменения ширины полос электрофоретических фракций НЬОг человека и процентного содержания белка в них свидетельствуют не только об ослаблении, но и о разрыве слабых связей в молекуле гемопротеида, вызванных, по-видимому, изменением поверхностного заряда глобул вследствие их разворачивания. Аналогичные результаты были получены нами ранее при изучении влияния различных доз УФ-света на физико-химические свойства оксигемоглобина мышей и его фракций (О.В. Путинцева, 1982; В.Г. Артюхов, О.В. Путинцева, 1986).

ГЛАВА 4. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И УФ-ОБЛУЧЕННОГО МЕТГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА

ЭСП нативных растворов MtHb человека характеризовались наличием максимумов при 275, 4Ö5, 540, 580 и 630 нм. Облучение растворов MtHb ДУФ-светом (320-390 нм) в дозах 17,5-175 Дж/м2, поглощаемым только гемовым компонентом, вызывает сложные динамические перестройки его молекул. После 1 мин. облучения на ЭСП MtHb исчезает максимум при 630 нм. Более длительное воздействие ДУФ-света (3-15 мин.) индуцирует сдвиг максимума поглощения ароматических аминокислот до 278-280 нм и полосы Соре - до 410411 нм, а также появление полосы поглощения при 341-342 нм, что указывает на переход части молекул облученного белка из окисленной в оксигенирован-ную форму. Интактные образцы MtHb после гель-фильтрации (сефадекс G-100, трис-глициновый буфер, pH 8,3) разделялись на две фракции с молекулярными массами, соответствующими тетрамерной (63,9±0,7 кДа) и мономерной (18,2±0,2 кДа) формам белка Воздействие ДУФ-излучения в течение 1 мин. приводит к появлению дополнительной, высокомолекулярной фракции гембелка (178,3±0,8 кДа), т.е вызывает процессы фотоассоциации исходных молекул MtHb. После 3 мин. облучения было получено 2 фракции - тегграмер (63,3±0,2 кДа) и димер (36,4±0,2 кДа), после 6 мин. - только одна тетрамерная фракция (64,6± 0,5 кДа), после 9 и 15 мин. - по две фракции с молекулярными массами, близкими к тетрамерам (64,2±1,7 и 64,0±0,4 кДа ) и мономерам (14,8±0,3 и

10,1± 0,2 кДа). Совместное использование методов хроматографии и спектро-фотометрии в УФ- и видимой области позволило установить, что наблюдаемые процессы ассоциации или диссоциации молекул УФ-облученного МШЬ тесно связаны со сменой электронного состояния атома железа гема, с появлением молекул НЬОг, постепенным их накоплением, почти полным переходом белка в оксиформу, а в конечном счете образованием фотопродуктов, физико-химические характеристики которых отличаются и от мет-, и от оксиформы гембелка.

^ ЙМ ММ

Рис. 2. Денситограммы интактного (а) и облученного ДУФ-светом (320 -390 нм) в течение 1 (б), 3 (в), 6 (г), 9 (д), 15 (е) и 30 (ж) мин метгемоглобина человека

Нативный МШЬ при электрофорезе в ПААГ перемещается к аноду одной фракцией (ЭП=0,42±0,01) диффузного типа, шириной 0,50±0,01см. Воздействие ДУФ-света в течение 1 и 3 мин. приводит к росту ширины (0,8410,02 см) и асимметричности пика на денситограммах МШЬ (рис. 2). Более длительное об-

лучение (6, 9, 15 и 30 мин.) вызывает образование двух электрофоретических фракций MtHb, четкость разделения которых улучшается с увеличением дозы облучения, но не достигает такого уровня разрешения, которое наблюдается на электрофореграммах НЬ02.

| УФ-облученшг (320-390 нм) 0 Дж/м'1

HjO-Fe^Hb электрофоретичееки однородная смесь теграмерных (68,9 кДа) и мономерных (18,2 кДа) молекул

электрофоретичееки неразделяющаяся смесь H20-Fe НЬ и Os-Fe,vHb с преобладанием окисленной формы белка и появлением высокомолекулярной фракции (178,3 кДа) _вследствие фотоассоциации молекул метгемоглобина

35 Дж/мг 1

смесь HjO-Fe^Hb и 0,-Fe^Hb с возрастающей гетерогенностью

ЭФ свойств, но не разделяющаяся на отдельные ЭФ фракции, с лребладанием тетрамерной оксиформы НЬ (63,3 кДа) _ и появлением новой димерной фракции - 36,4 кДа

70 Дж/м!,

03-Fe"Hb тетрамерная оксиформа НЬ (64,6 кДа), разделяющаяся _ на две ЭФ фракции_____

105 Дж/м! \

Оз-Ре'ЧНЬ смесь тетрамеров (64,2 кДа) и мономеров (14,8 кДа), разделяющаяся на две ЭФ фракции

175 Дж/м1

03-Fe"Hb смесь тетрамеров (64,0 кДа) и мономеров (10,1 кДа), разделяющаяся на две ЭФ фракции

Рис 3 Схема процессов УФ-превращений молекул метгемоглобина человека

Итак, характер и степень изменения хроматографического и элек-трофоретического поведения фотомодифицированного метгемоглобина человека зависят от дозы ДУФ-излучения. Мы предлагаем следующую схему процессов УФ-превращений молекул метгемоглобина человека (рис. 3)

ГЛАВА 5. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И УФ-ОБЛУЧЕННОГО КАРБОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА И ЕГО ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ

ЭСП нативных растворов НЬСО человека характеризовались наличием максимумов при 270, 342, 418, 538 и 568 нм УФ-облучение в дозах 453-4530 Дж/м2 приводило к постепенному сглаживанию пика при 342-345 нм, сдвигу полосы Соре до 407 нм, падению оптической плотности в а- и (3-максимумах и появлению новых полос поглощения при 495 и 630 нм (рис 4) Исследование

кинетико-термодинамических характеристик нативных и УФ- облученных молекул НЬСО показало, что большие дозы облучения (2265-4530 Дж/м2) сдвигают равновесие реакции фотоокисления-фотовосстановления в сторону образования окисленного продукта (МШЬ) и значительного его накопления (до 46,4%) в фотомодифицированных растворах НЬСО, которое сопровождается

снижением величины Р0 молекул НЬСО, свидетельствующем о переходе молекул гемопротеида в энергетически более выгодное конформационное состояние

Рис. 4. Электронные спектры поглощения нативного (1) и УФ-облученного в дозе 4530 Дж/м2 (2) карбоксигемоглобина человека

Интактные препараты НЬСО были представлены тетрамерами массой 62,1 кДа УФ-облучение (151-453 Дж/м2) не вызывало образования межмолекулярных сшивок или разрывов связей между субъединицами НЬСО. Отмечено снижение молекулярной массы белка до 58,9-59,9 кДа.

Нативные образцы НЬСО состояли из электрофоретически однородных молекул: в условиях эксперимента выделена одна фракция с ЭП=0,53±0,02, шириной 0,45±0,02 см УФ-облучение НЬСО в дозах 151-4530 Дж/м2 приводило к появлению на электрофореграммах гембелка двух минорных фракций (рис. 5) Основная фракция сохранялась во всех исследуемых препаратах УФ-модифицированного НЬСО в различных количествах (от 86,4±0,9 до 62,5±1,0%). Электрофоретические характеристики минорных фракций НЬСО были весьма лабильны и зависели от дозы У Ф-света.

ЭСП основной электрофоретической фракции НЬСО полностью совпадали со спектральными характеристиками исходного раствора. ЭСП минорных фракций имели искаженный вид. интенсивность поглощения в видимой области спектра была значительно ниже таковой, характерной для растворов тотального НЬСО. УФ-облучение (1359-4530 Дж/м2) вызывало сглаживание пика при 345 нм, сдвиг полосы Соре до 412 нм, появление новых максимумов при 495 и 630 нм на ЭСП основной электрофоретической фракции.

Рис. 5, Электре форе граммы на-т вено го к УФ-облученного в дозах 151 -4530 Дж/м2 кар бокси гемоглобин а человека. Обозначения:

1 - контроль; 2 - 151 Дж/м ; 3 - 453 Дж/м2; 4 - 906 Дж/м2; 5 - 1359 Дж/м2; 6 - 2265 Дж/м2; 7 - 4530 Дж/м2

На ЭСП 1-ой минорной фракции НЬСО зарегистрировано исчезновение полос поглощения при 340 и 540 им, сдвиг полосы Соре до 402 нм с одновременным значительным снижением оптической плотности в ней, а также в а-подосе и появление новых пиков при 495 и 630 нм. Для 2-ой минорной фракции обнаружено снижение интенсивности св его поглощения при 272, 342-345, 538540, 575 нм, сдвиг полосы Соре до 410-412 нм и появление новых максимумов при 495 и 630 нм.

Молекулы НЬСО в составе основной электрофорстической фракции были нестабильны и при гель-хром это граф пи образовывали 2 подфракции с молекулярными массами 61,0 и 39,4 кДя, содержащие 69,8 и 30,2% от общего белка соответственно. С увеличением дозы облучения от 151 до 4530 Дж/м2 В основной электрофорез и чес кой фракции накапливалась тетрамерная форма гемопро-геида (до 85,9%). 1-ая минорная фракция распадалась при хроматографии на приблизительно равные количества (47,4 : 52,6%) тетрамеров (60,2±1,4 кДа) и дпмеров (38,5±0,4 кДа). Большие дозы УФ-света вызывали накопление димер-ных форм гембелка в составе указанной фракции (до 90,1%), При гель-фильтрации 2-ая минорная фракция НЬСО разделялась на тетрамериую (58,8±М кДа) и димернуго (39,9±1,1 кДа) подфракции с преобладанием последней (32,6 : 67,4%). После УФ-облучения изменений молекулярных масс подфракций 2-ой минорной элсктроферетической фракции НЬСО и содержания белка в них не заре ги стр и рова ио.

Выявленные модификации исследуемых свойств НЬСО указывают на фотопревращения как гемового, так и глобинового компонентов молекул, характер которых зависит от дозы УФ-облучения.

ГЛАВА 6. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА РАСТВОРОВ ГЕМОГЛОБИНА С РАЗЛИЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ОКСИ- И КАРБОКСИФОРМ

ЭСП смесей гемоглобина с соотношениями окси- и карбоксиформ, равными 9:1, 5:5 и 1:9, по своей форме и значениям оптической плотности в основных максимумах занимают промежуточное положение между таковыми исходных растворов НЮ2 и НЬСО.

Образцы НЬ02 и НЬСО человека были представлены тетрамерами с молекулярными массами, равными соответственно 65,1 и 62,1 кДа. В процессе гель-фильтрации смеси гембелка, содержащие окси- и карбоксиформу в соотношениях, равных 9 1, 8 2, 5.5 и 1:9, сохраняли свою гомогенность, величина молекулярной массы белка с ростом количества НЬСО в исследуемых образцах статистически достоверно снижалась до 64,3-62,9 кДа.

Присутствие карбоксиформы значительно изменяет электрофоретичес-кое поведение молекул оксигемоглобина. Так, число электрофоретических фракций гембелка с 4 (контрольный образец НЬОг) при увеличении содержания НЬСО в смеси до 40 и 60 % уменьшается до 3, а до 50 и 70 % - до 2 Это указывает на возможность взаимодействия небольшой части молекул НЬ02 и НЬСО друг с другом, что приводит к образованию новых минорных электрофоретических фракций, свойства которых отличаются от таковых исходных форм гембелка.

Таблица 1

Величины кажущихся молекулярных масс (кДа) электрофоретических фрак-

ций смесей гемоглобина с различным соотношением окси- и карбоксиформ

ньо2. НЬСО 1-я фракция 1а-фракция 2-я фракция 3-я фракция 4-я фракция 5-я фракция

1-я под-фракция 2-я под-фракция

ньо2 22,0±1,6 - 65,0±1,5 18,3±1,3 20,1 ±1,2 18,4±1,4 -

91 20,9±1,4 20,9±1,4 66,0±1,9 19,5±1,4 - - 17,8±0,7

5:5 17,7±0,5* - 64,7*0,8 17,5±0,5 - - -

1.9 17,5±1,2* 17,5±1,2 64,1±0,5 17,3±0,6 - 17,6±0,5 -

НЬСО - - 61,0±0,8* 39,0±0,9 - - -

На всех электрофореграммах НЬОг, НЬСО и их смесей (9.1, 8:2, 7.3, 6:4, 5:5, 4:6, 3 7, 2.8 и 1:9) присутствует основная фракция гембелка, ЭП которой варьирует от 0,47±0,03 (смеси с соотношением НЬОг:НЬСО = 4.6) до 0,58+0,03 (образцы чистого НЬ02) Количество белка в этой фракции изменяется от 100 % (НЬСО) до 72,5 % (смеси, содержащие 20% НЬСО), а её ширина из-за присутствия разнородных по величине суммарного поверхностного заряда мо-

лекул НЬ02 и НЬСО постепенно возрастает. Отмечается также асимметричность пика этой фракции в основном за счет возрастания в ней количества более медленно передвигающихся молекул гемопротеида, по-видимому, принадлежащих его карбоксиформе, т к ЭП НЬСО меньше таковой НЬ02.

Во всех образцах, содержащих оксиформу гемоглобина, обнаружена 1-я, быстро мигрирующая фракция, ЭП которой варьирует от 0,89 до 1,01.

Нами были изучены хроматографические свойства и определены величины молекулярных масс (табл. 1) биомолекул, входящих в состав электро-форетических фракций препаратов гемоглобина с различным содержанием окси- и карбоксиформ (9:1,5:5 и 1 9)

Минорные электрофоретические фракции НЬ02 были представлены мономерами с молекулярными массами 22,0, 20,1 и 18,4 кДа. Молекулы НЬ02 в составе основной, 2-й фракции были нестабильными и образовывали две под-фракции - тетрамер (65,0 кДа) и мономер (18,3 кДа). Единственная электро-форетическая фракция НЬСО в результате гель-хроматографии разделялась на две подфракции, соответствующие тетрамерной (61,0 кДа) и димерной (39,0 кДа) формам. Во всех смесях окси- и карбоксиформ гемоглобина сохранялась нестабильность молекул 2-й основной электрофоретической фракции.

На основании анализа вышеприведенных результатов можно сделать следующее заключение. Процесс электрофореза в ПААГ в щелочной среде приводит к ослаблению связей между субъединицами тетрамерных молекул основной 2-й электрофоретической фракции НЬОг, НЬСО и их смесей, появляются неустойчивые формы молекул гембелка, которые при последующей гель-фильтрации на сефадексах диссоцируют с образованием димерных форм у НЬСО и мономерных форм у НЬОг и смесей этих двух белков. Следует отметить, что в препаратах смесей НЬОг и НЬСО не обнаружено димерных форм белка, характерных для карбоксигемоглобина, в них преобладают тетрамерные и мономерные формы, имеющие место у оксигемоглобина, те проявляются эффекты, обусловленные превращениями НЬОг, даже тогда, когда НЬСО составляет 90 % смеси гембелков

Воздействие факторов физической или химической природы на гембелок приводит к изменению интенсивности и эффективности присоединения 02 Так, СО успешно конкурирует с кислородом за центры связывания и даже вытесняет его из гемоглобина, переводя гемопротеид в неактивную форму - НЬСО. УФ-облучение способствует диссоциации лиганда (СО) от атома железа тема НЬСО (Л А Блюменфельд и др., 1977, B.I Green et al, 1978, С A Sawinski, Q.H. Gibson, 1979; В.Г. Артюхов, 1995) и, следовательно, может приводить к восстановлению физиологической функции гемоглобина. Однако в диапазоне каких концентраций НЬСО действенен данный фактор, остается неясным Выявление предельных концентраций НЬСО, при которых возможно восстановление ис-

ходных характеристик кислородтранспортной функции гемопротеида под действием УФ-излучения, явилось целью данного раздела

При выборе концентраций НЬСО в смесях исходили из данных о том, что насыщение крови НЬСО до 10% соответствует верхней границе нормы, на 3080% - отравлениям различной степени тяжести (Е А Лужников, Л.Г. Костомарова, 1989)

Анализ КДО оксигемоглобина человека и его смесей с НЬСО (рис. 6), осуществленный нами совместно с В Г.Артюховым, Е.А Катаевой, А.П. Преображенским (2007), позволил установить следующее

%ньо;

т%ньо.

70 80 Ро,, мм рт. cf

SO to SO

g Ро,, ММ РТ СТ,

%НЬ0,

%HbOr

50 70 90 С Роа, мм рт СТ

Обозначения а - окснгемогаобин, б - смесь НЬОг(90%) и НЬСО (10%), в - смесь НЬОа (70%) и НЬСО (30%), г - смесь НЮ2(50%) к НЬСО (50%), Д- смесь НЬОг (20%) и НЬСО(80%),

1 • нативный образец,

2 - облучение в дозе 15) Дж/м1;

3 - облучение в дозе 453 Дж/м'

70 60 д Ро,, мм рт СТ

Рис 6 Кривые диссоциации нативного и УФ-облученного оксигемоглобина человека и смесей окси- и карбоксигемоглобина

Процесс насыщения кислородом нативного гемоглобина человека подчиняется логистической зависимости Интактные образцы НЬОг ха-

растеризовались величиной Р5о=20,42±0,92 мм рт. ст. и а=2,63±0,06. Основные параметры кривых сатурации смеси 90% окси- и 10% карбоксигемоглобина не отличались от таковых НЬОг (Р5о=22,00±1,23 мм рт. ст.; а=2,68±0,04), а сама кривая описывается уравнением степенной зависимости (полиномом с количеством членов п=5). УФ-облучение растворов НЬОг в дозах 151 и 453 Дж/м2 индуцировало сдвиг кривых диссоциации оксигемоглобина влево, повышение сродства гемоглобина к кислороду и снижение степени гем-гемового взаимодействия (Р5о=15,35±1,50 и 14,85±1,29 мм рт ст.; а=2,34±0,11 и 2,20 ±0,09 соответственно), но не вызывало изменения логистического характера зависимости анализируемых кривых Повышение содержания НЬСО в смесях до 30-50% приводило к снижению давления полунасыщения до 16,26±0,95 и 16,97±1,24 мм рт. ст. соответственно, а константы Хилла - до 1,13±0,10 и 1,51±0,07 соответственно, при этом сохраняется степенной характер зависимости скорости насыщения гемоглобина кислородом от его парциального давления при уменьшении числа членов в уравнении до 4. УФ-свет в дозе 151 Дж/м2 вызывал уменьшение Р50 до 12,57±1ДЗ и 13,95±1,21 мм рт ст соответственно, величина а оставалась ниже контрольных показателей После воздействия УФ-радиации в дозе 453 Дж/м2 не было выявлено достоверных изменений регистрируемых параметров по сравнению с таковыми необлученных смесей.

При содержании в образце 80% НЬСО величина Р5о составила 16,30±0,55 мм рт ст, а а - 1,14±0,07. Облучение в дозе 151 Дж/м2 способствовало снижению Р50 до 13,16±0,48 мм рт ст, а в дозе 453 Дж/м2 , напротив, - увеличению давления полунасыщения до 19,96±1,08 мм рт. ст. Величина константы Хилла облученных смесей гембелка оставалась очень низкой (а=1,18±0,04 и 1,13±0,09 соответственно).

Таким образом, содержание НЬСО в крови в пределах нормы (до 10%) не оказывало заметного влияния на кислородтранспортные свойства НЬОг человека. Увеличение концентрации НЬСО до уровней, вызывающих патологические изменения состояния организма (30% и более), индуцировало повышение сродства гемоглобина к кислороду и снижение степени гем-гемового взаимодействия. Стимулирующее воздействие УФ-света (151-453 Дж/м2) на функциональные свойства модифицированного оксидом углерода гемоглобина человека наблюдается лишь при условии, что концентрация карбоксиформы гембелка в растворе не превышает 10%. Нарушение кислородсвязывающей способности гемоглобина при воздействии больших концентраций НЬСО носит необратимый характер и не корректируется УФ-светом.

ГЛАВА 7. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И УФ-ОБЛУЧЕННОГО НИТРОЗОГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА И ЕГО ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ

ЭСП растворов нативного HbNO характеризовались наличием пиков при 270-272, 355-358, 418, 542-545 и 572-575 нм. После облучения образцов HbNO УФ-светом в дозах 151-4530 Дж/м2 изменений оптической плотности при 270272 нм по сравнению с необлученным белком не было зарегистрировано. Таким образом, выявлена высокая устойчивость глобинового компонента нитрозоНЬ к действию широкого диапазона доз УФ-излучения. Возможно, фотостабильность глобина HbNO обусловлена блокированием SH-групп Cys93ß оксидом азота (методом спектрофотометрического титрования растворов HbNO ПХМБ реакционноспособных SH-групп выявить не удалось), что ограничивает кон-

формационную подвижность апобелка и повышает его фоторезистентность. Большие дозы УФ-излучения (1359-4530 Дж/м2) индуцировали исчезновение на ЭСП растворов HbNO полос поглощения при 355-358, 542-545, 572-575 нм и появление новых максимумов при 495-500 и 630 нм, сдвиг полосы Соре до 405-407 нм (рис. 7).

Рис. 7 Электронные спектры поглощения нативного (1) и УФ-облученного в дозе 4530 Дж/м2 (2) нитро-зогемоглобина человека

Анализ кинетико-термодинамич еских характеристик показал, что после воздействия больших доз УФ-света наблюдаются существенные (необратимые) изменения исследуемых параметров, свидетельствующие о смещении равновесия фотореакций в сторону окисления гема HbNO и переходе молекул гембелка в новое конформационное состояние, и накопление значительных количеств метгемоглобина (до 54,7%) в облученных растворах

Образцы белка элюировали с хроматографической колонки одной фракцией с молекулярной массой 61,9 кДа. УФ-облучение в дозах 151-906 Дж/м2 приводило к колебаниям молекулярных масс тетрамеров вследствие процессов сворачивания-разворачивания белковой глобулы Дозы УФ-света в диапазоне 1359-4530 Дж/м2 индуцировали необратимые конформационные перестройки апоглобина, сопровождающиеся снижением молекулярной массы HbNO до 58,7-59,5 кДа

При электрофорезе в ПААГ были выделены 4 гемсодержащие белковые фракции (рис. 8) с электрофоретической подвижностью, равной 0,91±0,02,

0,72±0,02; 0,64+0,02 и 0,57+0,02, содержащие 17,9±1,2; 12,1+0,9; 30,4±1,9 и 39,6±1,6% белка со ответствен но. УФ-радиация в дозах 1359-4530 Дж/м вызывала перераспределение бе.пка между электрофоретическими фракциями гемо-протеида: увеличение его содержания в 1-ой фракции (почти до 30%) и снижение -в 3-ей (до 19-20%).

На ЭСП 1-ой электрофоретической фракции нативного НЬШ был зарегистрирован максимум при 407 им и перегибы при 270-272 и 570-572 нм, на ЭСП 2-ой фракции - полосы поглощения при 270-272, 352-355, 417-418, 540542 и 570-572 нм. 3-я и 4-ая электрофоретические фракции НЬМО характеризовались наличием пиков при 270-272, 355-358, 417^18, 542-545 и 570575 нм. На ЭСП 1-ой фракции облученного НЬЫО (4530 Дж/м1) обнаружены сдвиг полосы Соре до 395-402 нм и новые максимумы при 335-340 И 495 нм.

Рис. 8. Электрофоре1раммы нативного и У Ф-облу ценного в дозах 151-4530 Дж/м2 нитрозоге-моглобина человека Обозначения:

1 - контроль; 2 - 151 ДжУм2; 3 - 453 Дж/м2; 4 - 906 Дж/м2; 5 - 1359 Дж/м2; 6 - 2265 Дж/м2; 7 - 453.0 Дж/м5.

Основные модификации спектральных характеристик 2-оЙ, 3-ей и 4-ой электрофоретических фракций, вызванные УФ-излучением, совпадали с таковыми облученных растворов НЪШ, однако, проявлялись они в меньшей степени.

Молекулы НЬЫО в составе всех электрофоретических фракций были представлены компактными димерами с кажущимися молекулярными массами 29,3±2,8; 27,9±0,8; 27,1±1,3 и 30,6+1,3 кДа соответственно, уф-облучение в дозах 453-4530 Дж/м2 приводило к диссоциации димеров НЫЧО в составе 1-ой электрофоретической фракции на мономеры с молекулярной массой, колеблющейся от 17,4±1,2 до 13,3±0,9 кДа в зависимости от дозы облучения. Наблюдалось увеличение молекулярной массы димеров 2-ой фракции до 35,9±1,7-

42,7±0,8 кДа. Хроматографические характеристики 3-ей и 4-ой электрофорети-ческих фракций не претерпевали достоверных изменений.

Описанные изменения исследуемых характеристик растворов №N0 указывают на локальные конформационные перестройки третичной структуры молекул гемопротеида, что влечет за собой изменение общего поверхностного заряда молекул и их объема. Хотя растворы тотального НЫ*Ю демонстрировали высокую фотостабильность, скрытые повреждения структуры молекул в составе электрофоретических фракций ослабляли субъединичные контакты в ди-мерах НЬИО 1-ой фракции и вызывали изменение размеров его молекул. НЬМО в составе 3-ей и 4-ой фракций проявлял более высокую устойчивость к действию УФ-света в указанном диапазоне доз. Необратимое фотоокисление гемово-го компонента приводило к накоплению МАНЬ, который представлял собой конечный продукт фотопревращений НЫМО.

Для изучения функциональных характеристик нативных и УФ-облучен-ных смесей окси- и нитрозогемоглобина человека использовали растворы белка, содержащие 0,1; 1,0; 5,0 и 10,0% нитрозоформы гемоглобина При концентрации НЬЫО в смеси 20% и более зарегистрировать кривые сатурации не удавалось.

Кривые диссоциации гемоглобина, модифицированного присутствием НЫчЮ, описываются не уравнениями логистической зависимости, а полиномами с количеством членов от 3 до 6 в зависимости от концентрации модифицирующего агента. Интактные образцы, содержащие 0,1 и 1,0% НЬЫО, характеризовались сдвигом кривых диссоциации вправо (Р5о=25,80±1,61 и 25,97±0,69 мм рт. ст соответственно), константа Хилла исследуемых смесей была значительно снижена по сравнению с контролем (а=1,42±0,05 и 1,59±0,07 соответственно) УФ-облучение растворов гемопротеида в дозах 151 и 453 Дж/м2 не приводило к статистически достоверным изменениям регистрируемых параметров Модификации функциональной активности смесей, содержание НЬЫО в которых превышало физиологический уровень, могут быть связаны с обратимым разрушением связи Ре-Н1з87а в присутствии N0 в концентрациях, меньших, чем концентрация гема (У. ТакавЫ, 1999), что приводит к снижению аффинности гемоглобина к кислороду

В нативных и УФ-облученных в дозе 151 Дж/м2 смесях 5,0% НЬИО и 95,0% НЬ02 величины Р50 (23,47±1,29 и 24,27±0,69 мм рт ст) статистически достоверно не отличались от таковой нативного НЬ02 (20,42±0,92 мм рт ст). Значения константы Хилла были заметно ниже исходного уровня (1,46±0,07 и 1,47±0,08 мм рг. ст. соответственно) УФ-радиация в дозе 453 Дж/м2 индуцировала сдвиг кривых диссоциации вправо (Р50=30,53±1,15 мм рт ст.), форма кривых отклонялась от в-образной и приближалась к гиперболической

а Ро„ мм рт ст г Ро,, ММ Р"Г ст

Рис. 9. Кривые диссоциации нативных и УФ-облученных смесей окси- и нитро-зогемоглобина.

Обозначения: а - смесь НЬ02 (99,9%) и НЬЫО (0,1%); б - смесь НЮ2 (99,0%) и №N0 (1,0%); в - смесь НЬОг (95,0%) и НЬИО (5,0%); г - смесь НЬ02 (90,0%) и №N0 (10,0%); 1 - необлученный образец; 2 - облучение в дозе 151 Дж/м2; 3 -облучение в дозе 453 Дж/м2

УФ-облучение смесей гембелка с 10%-ным содержанием НЫЧО в дозе 151 Дж/м2 индуцировало снижение Р50 от 30,31±1,31 до 24,67±1,23 мм рт. ст и увеличение а от 1,29±0,07 до 1,53±0,04. При воздействии УФ-светом в дозе 453 Дж/м2 изменений давления полунасыщения и константы Хилла по сравнению с необлученным образцом не зафиксировано (рис 9)

Кластерный анализ показал, что все изучаемые смеси НЫЧО + НЬОг группировались в единый кластер, отличающийся от контроля Наиболее близкими к контрольному образцу (НЫЭ2) свойствами обладал препарат с ОД %-ным содержанием №>N0, наименее - препарат с 10,0 %-ным содержанием №N0. УФ-облучение в дозах 151 и 453 Дж/м2 не приводило к значительной перегруппировке объектов: смеси НЬЖ) + НЬ02 по-прежнему представлены единым кластером. Поэтому можно высказать предположение, что диссоциации НЬЫО на гембелок и лиганд и его элиминации из растворов при УФ-модификации не происходило Более того, №N0 во всех концентрациях оказывал заметное влияние на функциональные характеристики гемопротеида и стабилизировал его по отношению к воздействию УФ-радиации в исследуемом диапазоне доз.

Установленный эффект активации нитрозогемоглобином начального этапа оксигенации, ослабления гем-гемовых взаимодействий в тетрамере и снижения сродства гемоглобина к кислороду в области физиологических значений Ро2 может пролить свет на механизм действия лекарственных препаратов-доноров NO. По-видимому, оксид азота способствует активизации начальных стадий присоединения кислорода гемоглобином, более быстрой его оксигенации, снижение сродства НЬ к 02 при увеличении его парциального давления благоприятно влияет на отдачу кислорода гемоглобином окружающим тканям, остро нуждающимся в нем. Продукты взаимодействия НЬ02 с HbNO демонстрируют высокую устойчивость к воздействию «терапевтических» доз УФ-излучения. Возможно, что именно этот образующийся низкоаффинный фотостабильный комплекс обеспечивает достаточный уровень оксигенации периферических тканей даже в условиях УФ-индуцированного повышения сродства гемоглобина к кислороду.

ГЛАВА 8. НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА В ПРИСУТСТВИИ ИСТОЧНИКОВ ОКСИДА АЗОТА - НИТРОГЛИЦЕРИНА, МОНОЧИНКВЕ® и S-НИТРОЗОГЛУТАТИОНА

Характер изменений спектральных свойств растворов НЮ2 человека в присутствии нитроглицерина в концентрациях 4-10"б-10 3 моль/л (статистически достоверное повышение светопоглощения исследуемых образцов в максимумах УФ-части и отсутствие изменений в видимой области спектра) свидетельствуют о том, что НГ вызывает более глубокие перестройки в глобиновой части молекулы исследуемого гембелка по сравнению с таковыми его железопорфи-ринового комплекса. Изменения в апобелковом компоненте молекул смесей НЮ2-НГ находят отражение на их электрофоретическом поведении. После инкубации смесей НЬ02 с НГ (10 6 - 4-10"3 моль/л) количество электрофоретиче-ских фракций, как и в контроле, оставалось равным 4. Увеличение концентрации модификатора до 10"2 моль/л приводило к разделению 2-й основной элек-трофоретической фракции на две подфракции с ЭП, равной соответственно 0,59±0,06 и 0,50±0,06, которые содержали 51,4 и 32,0% белка, что в сумме (83,4 %) ниже контрольного показателя (90,9±0,7%) Одновременно наблюдалось увеличение содержания белка во всех минорных фракциях, что позволяет говорить о перераспределении белка между фракциями под влиянием модификатора. По-видимому, в присутствии высокой концентрации НГ изменяется состояние поверхности белковых глобул части молекул гемопротеида, входящих в состав 2-й фракции, что приводит к некоторому снижению суммарного отрицательного поверхностного заряда этих молекул и изменению (падению) скорости их миграции к аноду.

Введение в растворы оксигемоглобина лекарственного препарата MOHO-

ЧИНКВЕ® (103,10"4, 10"5 И 10 6 моль/л) не приводит к окислению гембелка, отмечаются только незначительные конформационные перестройки его молекул: частичное экспонирование хромофоров ароматических аминокислот на поверхность глобулы при одновременном экранировании гема. Наиболее глубокие изменения железопорфиринового компонента выявляются при соотношении НЬ02. МОНОЧИНКВЕ®, равном 1 • 1 и 10 : 1, а глобиновой составляющей - при 1:100.

ЭСП буферных растворов НЮ2 человека (10"5 моль/л) в присутствии Б-ншрозоглутатиона (10 5 -ДО'3) моль/л свидетельствует о появлении в исследуемых смесях НЬСЬ-ОБИО метгемоглобина, количество которого увеличивается с ростом концентрации добавленного модификатора.

Воздействие УФ-света в дозе 151 Дж/м2 на смеси гембелка с Б-нитрозо-глутатионом приводит к резким изменениям спектров поглощения по сравнению с таковыми для необлученных смесей НЬСЬ-ОБЖ). В видимой части спектра четко регистрируются а- и Р-полосы (574-576 и 542-544 нм); исчезают максимумы при 500 и 630 нм; а полоса Соре без изменения интенсивности ее све-топоглощения сдвигается в длинноволновую область до 410 нм. Всё вышеперечисленное говорит о переходе атома железа гема из трехвалентного в двухвалентное состояние и о фотопревращении окисленной формы гембелка в низкоспиновую.

Таким образом, нами выявлено защитное действие Б-нитрозоглутатиона по отношению к молекулам гемоглобина человека при облучении его растворов малой «терапевтической дозой» УФ-света (240-390 нм), которое максимально проявляется при концентрации модификатора, равной 10'3 моль/л.

Воздействие Б-нитрозоглутатиона в концентрациях 10'5 - 10"3 моль/л не приводило к нарушению целостности молекул оксигемоглобина: величина молекулярной массы гемопротеида (68,8 - 70,8 кДа) была близка к таковой контроля (67,1 кДа). Препараты белка в присутствии С81ЧО, также как и интактный образец, были гомогенными по составу и сохраняли в условиях эксперимента свою тетрамерную форму. Облучение исследуемых смесей НЬОг с ОБИО УФ-светом в дозе 151 Дж/м2 вызывало модификацию хроматографических свойств белка, связанную с разворачиванием белковой глобулы, с частичным изменением расположения полипептидных цепей гемопротеида, увеличением их объема и статистически достоверным возрастанием молекулярных масс соответственно до величин 78,3 - 87,4 кДа.

ОвГТО (10"4 и 10"3 моль/л) оказывает значительное влияние на электрофо-ретические характеристики оксигемоглобина человека- возрастает гетерогенность исследуемого гембелка, число электрофоретических фракций увеличивается с 4-х (нативный НЬ02) до 5-ти. Появляющаяся новая минорная фракция 1а, занимает промежуточное положение между 1-й и 2-й фракциями, содержание

белка в ней увеличивается с ростом концентрации модификатора (с 1,8 до 10,2 %), Отмечается также перераспределение белка между основной (2-й) и всеми остальными фракциями (значительное количество белка из 2-й фракции переходит в 1-ю и 1а фракции гемопротеида).

Таким образом, физико-химические характеристики молекул НЬ02, модифицированного нитроглицерином, МОНОЧИНКВЕ® и Б-нитрозоглутатионом, определяются концентрацией используемого лекарственного препарата и зависят от соотношения молекул НЮ2 и модификатора в исследуемой смеси.

ГЛАВА 9. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И УФ-ОБЛУЧЕННОГО ОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА В ПРИСУТСТВИИ ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА

В присутствии восстановленного глутатиона (4-10"3 моль/л) образцы ок-сигемоглобина разделялись на две гемсодержащие белковые фракции (84,7±0,5 кДа и 48,8±0,4 кДа). Процентное соотношение белка во фракциях составило 79,5:20,5. вБН оказывает значительное влияние на структуру молекул НЮ2 человека: наблюдается разрыв связей между отдельными субъединицами данного гемопротеида, отрыв их от тетрамера, образование димеров и появление в растворе новых форм белка, нехарактерных для его нативного состояния.

Наряду с изменением хроматографических свойств присутствие глутатиона в растворах оксигемоглобина индуцирует изменения и спектральных характеристик молекул гембелка Трипептид в концентрации 10"4 моль/л (соотношение молекул НЮ2 : ОБН = 1:10), вызывает уменьшение интенсивности светопоглощения гембелка в области полосы Соре (на 6,3%) и ее рост при 274 нм (на 11,8%), т.е. затрагивает и глобиновый, и гемовый компоненты его молекул. Анализируя динамику изменений, происходящих в глобиновой и гемовой частях оксигемоглобина под воздействием нарастающих концентраций глутатиона, можно отметить следующее. При соотношении гембелок глутатион, равном 1:10, наблюдаются конформационные перестройки белковых глобул, сопровождающиеся частичным экранированием железопорфиринового комплекса и экспонированием в растворитель ароматических аминокислотных остатков. При соотношении гембелка и глутатиона, равном 1.100, спектрально выявляется присутствие в исследуемых образцах метформы гемоглобина, однако оксиформа белка является преобладающей. При концентрации модификатора 5 10'3 моль/л (соотношение 1.500) большинство молекул белка находится в окисленной форме в виде МЙЬ. Рост концентрации ввН до 10"2 моль/л (на 1 молекулу белка приходится 1000 молекул трипептида), по-видимому, приводит не только к интенсивному метгемоглобинобразованию, но и разрыву связей между гемином и глобином.

Изменения в структуре оксигемоглобина, наблюдаемые в присутствии ОБН, должны найти отражение на УФ-чувствительности его молекул.

Обнаружено, что восстановленный глутатион (5-Ю'4 моль/л) оказывает влияние на фоточувствительность глобиновой части гемопротеида: фоторезистентность ароматических аминокислотных остатков белка к малым дозам УФ-света (1514-755 Дж/м2) возрастает в присутствии молекул трипептида Однако их ответная реакция на воздействие больших доз (1359 - 4530 Дж/м2) аналогична таковой оксиформы гембелка без модификатора. В то же время анализ ЭСП фотомодифицированных смесей НЬОг-ОЭН выявил меньшую фотоустойчивость гемового компонента белка по сравнению с таковой глобина Таким образом, нами обнаружена защитная роль ОБН (5-Ю 4 моль/л) по отношению к молекулам НЬ02 человека, подвергнутого воздействию небольших доз УФ-излучения (151 -г 755 Дж/м2)).

Электрофоретические характеристики смесей НЮ2 человека с ОБН (10 3-10"2 моль/л) значительно отличаются от таковых интактного гемопротеида- возрастает гетерогенность молекул препарата оксигемоглобина, изменяется его фракционный состав. Во всех смесях появляется новая минорная фракция 1а, по-видимому, она представляет собой комплекс оксигемоглобина с глутатио-ном. Кроме неё в растворах оксигемоглобина, модифицированного большой концентрацией глутатиона (10"2 моль/л), образуется ещё одна минорная фракция с очень низкой ЭП= 0,15±0,01 при одновременном исчезновении 3-й фракции. Наблюдаемые процессы сопровождаются перераспределением гембелка: из основной 2-й фракции он переходит в 1-ю, 1а, 4-ю и 5-ю фракции (табл 2)

Таблица 2

Содержание белка ( %) в электрофоретических фракциях оксигемоглобина человека, модифицированного воздействием глутатиона и УФ-света

Доза облучения, Дж/м2 1-я фракция 1а-фракция 2-я фракция 3-я фракция 4-я фракция

0 8,7 ±0,8 4,1 ±0,2 83,7 ±1,0 2,3 ±0,2 1,2 ±0,1

151 11,6 ±0,8* 4,9 ±0,2* 79,5 ±0,6* 2,6 ± 0,5 1,4 ±0,1

453 10,5 ± 0,7* 2,3 ±0,4* 83,2 ±0,8 2,6 ±0,3 1,4 ±0,4

755 11,2 ±0,7* - 85,2 ± 1,2 2,3 ±0,4 1,3 ±0,2

1359 11,9 ±0,2* - 84,3 ±0,5 2,4 ±0,3 1,4 ±0,2

2265 24,2 ± 1,4* - 70,8 ±0,9* 3,3 ±0,4* 1,7 ±0,1*

4530 37,8 ± 1,4* - 56,7 ± 0,9* 3,6 ±0,3* 1,9 ±0,3*

Воздействие терапевтических доз (151 и 453 Дж/м2) УФ-света на растворы оксигемоглобина в присутствии ОБН (5-Ю 3 моль/л) не приводит к изменению фракционного состава образцов: количество фракций оставалось равным пяти и не отличалось от необлученных препаратов. Большие дозы УФ-излучения (755т4530 Дж/м2) индуцируют исчезновение 1-а фракции, что свидетельствует о её фотолабильности. Вероятно, воздействие вышеуказанных доз

способствует распаду части комплексов Hb-S-S-G, и освободившиеся молекулы гемопротеида переходят в 1-ю быстромигрирующую фракцию. Фотолабильной оказалась и 2-я основная фракция, содержание белка в которой уменьшалось с ростом дозы облучения, при этом большая часть её молекул перешла в 1-ю фракцию, меньшая - в 3-ю и 4-ю фракции 1-я фракция гембелка из минорной (8,7 %) под сочетанным воздействием глутатиона и больших доз УФ-света постепенно превращается в основную фракцию (37,7 %) По-видимому, облученные молекулы гемоглобина лучше контактируют с молекулами восстановленного глутатиона и более активно образуют с ним комплексы, что приводит к росту количества белка в 1-й электрофоретической фракции

Таким образом, выявлены глубокие нарушения в структуре молекул ок-сигемоглобина человека в присутствии различных концентраций восстановленного глутатиона, степень которых зависит от соотношения в исследуемом образце молекул гемопротеида и модификатора

ГЛАВА 10. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МОЛЕКУЛ ГЕМОГЛОБИНА ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ХРАНЕНИИ КОНСЕРВИРОВАННОЙ КРОВИ ДОНОРОВ ПРИ ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ

Оксигемоглобин человека, выделенный из свежезабранной крови доноров, был представлен тетрамерами (63,6±0,5 кДа). В процессе хранения консервированной крови доноров (1-25 суток) не было обнаружено появления новых хроматографических фракций гемопротеида, но после 21 дня отмечалось статистически достоверное возрастание его молекулярной массы до 70,7±0,3 кДа. Сохранение числа фракций с одновременным перераспределением количества белка в них было установлено ранее рядом исследователей при проведении модельных экспериментов по изучению кратковременного (О.В. Путинцева, 1982; В Г. Артюхов и сотр., 2004) и длительного воздействия низких температур (2- 4 °С) на растворы гемоглобина человека и животных (H M. Ranney et, 1960; M.Z.F. Atassi, 1964; В.Г. Костенко, 1968;, Н.Ф. Стародуб, В.И. Назаренко, 1987). Таким образом, термостатирование крови доноров при 4°С в течение 125 суток не влияет на хроматографическое поведение и фракционный состав гемоглобина. В условиях проведенных экспериментов этот белок в эритроцитах консервированной крови на протяжении исследуемого периода инкубации сохраняет тетрамерную форму, процессы ассоциации или диссоциации гембелка не были обнаружены Увеличение кажущейся молекулярной массы гемопротеида при хранении крови, вероятно, обусловлено ослаблением меж-субъединичных контактов и частичным разворачиванием его молекул

В процессе электрофореза в ПААГ оксигемоглобин, полученный из эритроцитов крови доноров в день её забора, разделялся на 2 фракции, с ЭП, равной

0,89+0,02 и 0,62±0,02, содержащие 14,2±0,1 и 85,8±0,1 % белка (рис. 10). В течение 5 суток число фракций НЬОг и их процентное соотношение остаются постоянными. Увеличение сроков инкубации крови до 11-17дней приводит к росту гетерогенности гембелка- на электрофореграммах обнаруживается дополнительная фракция, перемещающаяся к аноду между ранее выявленными (рис 106). Процентное соотношение трех электрофоретических фракций в растворе гембелка после 11 суток хранения крови составило 9,6:4,0:86,4, а после 17 суток - 0,4:3,7:95,9. Хранение крови в течение 22 и 25 суток приводило к дальнейшему возрастанию гетерогенности молекул оксигемоглобина. На электрофореграммах гемоглобина появляется еще одна - 4-я, медленно мигрирующая фракция с ЭП, равной 0,30±0,01 и 0,38±0,02 соответственно. Белок распределяется между фракциями в следующих соотношениях: 0,4:10,2:80,5:8,9 и 0,5:8,8:85,3.5,4.

Молекулы гемопротеида, входящие в состав новых фракций, отличаются по своему заряду и молекулярной массе от таковых исходных фракций гемо-глобина. В эритроцитах уменьшается содержание оксиформы гембелка и нарас-тает количество форм гемоглобина, неспособных обратимо присоединять и от-давать кислород. В связи с этим нами были изучены изменения кислородсвязывающих

свойств гемоглобина в процессе хранения консервированной крови доноров.

о о

0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05

0,4

0,3

0,2

0,1

10 п ' о

см

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 О

М.

10 12 см

Рис 10. Денситограммы оксигемоглобина, выделенного из крови доноров в день забора (а), через 11 суток (б) и 22 суток (в).

В качестве контроля использовали сатурационные кривые, зарегистрированные в день взятия крови. Они имеют 8-образную форму, величину 19,б±1,0 мм рт.ст. и констату Хилла = 2,36. Данные показатели остаются неизменными в течение 2 суток. Начиная с 4-х суток хранения крови, происходит сдвиг КДО в область меньших значений парциального давления кислорода, величина Р50 снижается до 17,7±0,4 мм рт. ст. (90,3 % от исходного уровня), что свидетельствует о повышении сродства гемопротеида к кислороду. Форма КДО эритроцитов после хранения крови в течение 10-22 сут. приближается к гиперболической. После 22 дня инкубации крови показатель полунасыщения молекул гемоглобина кислородом резко падает (Р30=10,5±0,4 мм рт. ст.) и составляет только 53,6% от исходной величины, а гем-гемовое взаимодействие между субъединицами внутри макромолекулы ослабляется и константа Хилла принимает значение 1,71 (72,4 % от уровня контроля).

Полученные нами данные необходимо принимать во внимание при исследованиях продолжительного воздействия на важнейшие системы организма экстремальных для него температур, а также при разработке научно-обоснованных рекомендаций по использованию консервированной донорской крови в клинической практике.

ГЛАВА 11. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ МОЛЕКУЛ ГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА, МОДИФИЦИРОВАННОГО РЕОПОЛИГЛЮКИНОМ И ДИАЛЬДЕГИД-ДЕКСТРАНОМ

Введение РП в раствор НЮ2 человека не приводило к появлению новых пиков, изменению положения максимумов его ЭСП и процентного соотношения основных лигандных форм, что свидетельствует о сохранении гемоглобина преимущественно в оксиформе. Инкубирование гемоглобина с РП (молярное соотношение белок . полисахарид = 1:4) в течение 3 ч при 37°С не влияло на фракционный состав гембелка, но вызывало возрастание его молекулярной массы до 67,4 кДа, что свидетельствует о конформационных перестройках белковых молекул. Хроматографический анализ смесей НЬ02-РП и определение содержания полисахарида в элюате показали, что молекулы НЮ2 и РП из хро-матографической колонки элюируют в разных фракциях, т.е. между ними не происходит образования прочных ковалентных связей Электрофоретические характеристики смесей НЬОг-РП не отличались от таковых НЬ02, которые в условиях эксперимента разделялись на 3 фракции с процентным соотношением белка, равным 95,30:2,87:1,83. При электрофорезе в присутствии ДСН натив-ный и инкубированный с РП оксигемоглобин человека давал одну фракцию, молекулярная масса которой соответствовала отдельной субъединице гембелка (16,7 и 16,3 кДа).

Нами было установлено, что наилучшими условиями для связывания гемоглобина с ДАД являются: величина рН среды, равная 7,4; температура инкубации - 37 °С; время инкубации - 3 ч; степень окисления полисахарида - 10%, а структура образующихся комплексов гемоглобин-ДАД зависит от исходного соотношения белок : полисахарид " реакционной среде.

Рис. 11- Электрофореграм мы натив-ного и модифицированного различными препаратами дек стран а гемоглобина человека в не денатурирующих условиях

Обозначения: 1 - нативный гемоглобин; 2 - гемоглобин, инкубированный с РП;

3 — комплекс гемоглобик-ДАД I типа; 4 - комплекс гемоглобин-ДАД II типа;

БФС - бромфеноловый синий.

- 31 *

ш ЯР

эк

Коныогат гемоглобин-ДАД I типа, полученный при молярном соотношении б елок: декстран, равном 1элюировал из хро м ато] рафич еско й колонки одной фракцией с молекулярной массой 103,4 ± 4,3 кДа, что свидетельствует о полном связывании гемоглобина с ДАД и об однородности его состава. Весовая доля гемоглобина п конъюгате достигала 62%. Отмечались существенные изменения формы ЭСП его растворов, указывающие на окисление железо! юрф ирина в молекулах гемоглобина и образование метформы белка: доля НЮ; в растворе снижалась до 51,5%, а количество НЬ и МШЬ увеличивалось соответственно до 43,0% и 5,5%. Таким образом, связывание гемоглобина с ДАД приводило к повышению степени диссоциации молекул НЬОг ад НЬ и кислород, а более высокая подверженность молекул дезокс и гемоглобина процессам аутоокнелення по сравнению с оксиформой (Л.И. Иржак, 1975) способствовала накоплению МШЬ в растворе.

Рис. 12 . Электрофореграммы нативного и моди-^ фицированного различными препаратам» декст-

рана гемоглобина человека в присутствии ДСП Обозначения: 1 - белки-маркеры; 2 - нативный гемоглобин; 3 - гемоглобин, инкубированный с РП; 4 - комплекс гемоглобин-ДАД I типа; 5 — комплекс гемоглобин-ДАД II тина. А- лизоцим (14,4 кДа); В - ингибитор трипсина (21,5 кДа); С - карбоангидраза (31,0 кДа); О -яичный альбумин (45 кДа); Е - бычий сывороточный альбумин (67 кДа); И - целлюлаза (94 кДа); в I Ц - ферритип (220 кДа).

Коньюгат гемоглобин -ДАД II типа, полученный при молярном соотношении белок:декстран, равном 5:1, при гель-фильтрации разделялся на две гемсодержащие белковые фракции. Молекулярная масса гембелка 1-ой фракции составляла 225,4±3,3 кДа, весовая доля гемоглобина 82,7%, а молярное соотношение белок:декстран = 3:1. По-видимому, в данном виде коньюгата три молекулы гемоглобина связываются с одной молекулой ДАД. Молекулярная масса белка в составе 2-ой фракции имела значение, характерное для нативного гемоглобина 63,212,1 кДа. Связывание гемоглобина с ДАД при образовании комплекса II типа не влияет заметным образом на электронную структуру же-лезопорфириновой группы (гембелок сохранялся преимущественно в окси-форме).

Для выявления природы и количества групп, участвующих в образовании комплексов гемоглобин-ДАД, использовали метод протеолитического титрования. Было установлено уменьшение кислотной буферной емкости конъюгата гемоглобин-ДАД I типа по сравнению с таковой интактного гемоглобина на величину, соответствующую 8 аминокислотным остаткам на одну молекулу гембелка, 6 из которых, вероятно, принадлежат лизину и 2 - гистидину Одна молекула гемоглобина, входящая в комплекс II типа, содержала на 5 титруемых аминокислотных остатков меньше, чем нативный гемопротеид. При этом 1 аминокислотный остаток, по-видимому, принадлежит гистидину, а 4 - лизину

Возможные химические реакции при взаимодействии гемоглобина с ДАД можно представить следующей схемой

ЭДР—с' + нгы—нь -- 0А0-С=М—нь

Электрофоретические характеристики конъюгатов гемоглобин-ДАД I и II типов в неденатурирующих условиях были очень близки- наблюдалось образование только одной фракции, ЭП которой (0,67± 0,02 и 0,63±0,02) несколько возросла по сравнению с основной фракцией нативного белка (0,59±0,04). Следовательно, химическое связывание полисахарида с белком нивелирует различия между фракциями нативного гемоглобина и уменьшает его гетерогенность.

На электрофореграммах гемоглобин-ДАД I типа (103,4 кДа) в присутствии ДСН были обнаружены две фракции: минорная (2,4%), быстро мигрирующая фракция с молекулярной массой 16,8 кДа и основная (97,6%), медленная фракция (106,2 кДа). Можно предположить, что этот ввд комплекса формиру-

ОАР-С

Н Н

ется при многоточечном взаимодействии молекулы декстрана со всеми четырьмя субъединицами гембелка. Конъюгат гемоглобин-ДАД II типа (225,4 кДа) при электрофорезе в ПААГ в присутствии ДСН также разделялся на две фракции: мономерную (17,3 кДа) и высокомолекулярную (163,2 кДа). 1-я фракция содержала 44,6 %, а 2-я - 55,4 % от общего количества белка. По-видимому, 44,6 % субъединиц тетрамерных молекул исходного гемоглобина не вступает во взаимодействие с ДАД и легко распадается на отдельные субъединицы под действием ДСН. Однако другая часть (55,4 %) полипептидных цепей гембелка оказалась прочно связанной с ДАД, и молекулы детергента не могут разорвать связи, установившиеся между такими субъединицами и ДАД, что приводит к формированию высокомолекулярных комплексов, в которых, по нашему предположению, одна молекула декстрана образует контакты в среднем с двумя оставшимися субъединицами каждой из трёх молекул гемоглобина

С помощью программного пакета HyperChem 7.0 Professional мы создали трехмерные модели молекул декстрана, диальдегиддекстрана и гемоглобина человека. Кроме того, был осуществлен расчет ряда характеристик исследуемых нами молекул, которые весьма сложно определить в условиях лабораторного эксперимента, местонахождение альдегидных групп в молекуле ДАД, пространственное расположение аминокислотных остатков лизина в молекуле гемоглобина, величина энергетической щели боковых аминогрупп лизина и их реакционная способность, номера аминокислотных остатков лизина, принимающих участие в процессе образования связей гемоглобина с ДАД. На основании экспериментальных и полученных с помощью компьютерного моделирования данных предложена схема процессов образования комплексов гемоглобин-ДАД различного состава и созданы пространственные модели конъюгатов гемоглобин-ДАД I и П типов (рис.13 и 14).

Рис. 13. Пространственная структура комплекса гемоглобин - ДАД I типа

Для изучения влияния модификации структуры молекул гемоглобина на-тивным и окисленным декстраном на стабильность белковой глобулы в качестве денатурирующего фактора было выбрано воздействие температуры на растворы белка. О термопревращениях гемопротеидов после инкубации при температуре 37-80 °С судили по величине светорассеяния т.

Рис. 14. Пространственная структура комплекса гемоглобин - ДАДII типа

Для растворов интакгного гемоглобина и комплексов гемоглобин-ДАД П типа было характерно возрастание интенсивности светорассеяния после инкубации при 45 - 55 °С, что свидетельствует об увеличении размеров молекул белка в результате ослабления множества нековалентных связей, поддерживающих его нативную конформацию. При 60 °С вследствие денатурации гемопротеидов величину светорассеяния их растворов зарегистрировать не удалось.

Инкубирование смесей НЬОг-РП при 42-50°С не вызывало изменения интенсивности их светорассеяния. По-видимому, введение реополиглюкина затрудняет разворачивание белковой глобулы при вышеуказанных температурах

Нагревание конъюгатов гемоглобин-ДАД I типа приводит к плавному возрастанию величины т по сравнению с уровнем нативного гембелка во всем изучаемом диапазоне температур (37 - 75 °С) от 28,15 ± 0,24% до 41,34 ± 1,54%. Это указывает на существенную лабильность субъединиц в составе тет-рамерной молекулы модифицированного гемопротеида при данных температурах, но при этом не наблюдаются процессы агрегации молекул белка, а температура денатурационного перехода смещается к 80 °С. Одновременно резко снижается доля оксиформы гемопротеида (до 1,51 %) и возрастает содержания метформ в растворе до 23,67 %. Следовательно, связывание гемоглобина человека с ДАД (комплекс I типа) значительно повышает термостабильность белковых молекул.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В диссертационной работе при помощи комплекса методов (спектрофо-тометрии в УФ- и видимой области, гель-хроматографии, электрофореза в ПА-АГ в присутствии и в отсутствие ДСН, светорассеяния, регистрации кривых

диссоциации оксигемоглобииа, кислотно-основного титрования, математического и компьютерного моделирования) изучены структурно-функциональные модификации гемоглобина человека в условиях воздействия эндогенных низкомолекулярных биорегуляторов - малых неионных лигандов (оксидов азота и углерода) и серосодержащих соединений (восстановленного глу-татиона и Б-нитрозоглутатиона), лекарственных препаратов - источников оксида азота (нитроглицерина, МОНОЧИНКВЕ®), высокомолекулярных полианионов на основе декстрана (реополиглюкина и диальдегиддекстрана), УФ-излучения и температурного фактора

К наиболее заметным структурным последствиям замены аксиального лиганда Ог на N0 можно отнести ослабление и последующую диссоциацию междимерных контактов (о^Рг, а^, Р1Р2) гемоглобина, что приводит к образованию 4 электрофоретических фракций, а также локальное усиление спи-рализации образующихся димерных форм, молекулярные массы которых колеблются от 27,1 до 30,6 кДа

Серия экспериментов по изучению влияния лекарственных препаратов нитроглицерина и МОНОЧИНКВЕ® на струюуру оксигемоглобииа, который служит своеобразным «депо» для молекул N0 и может участвовать в их транспортировке, выявила, что оба препарата в достаточно большом диапазоне концентраций индуцируют только локальные изменения в молекулах оксигемоглобииа: нитроглицерин - в глобиновой части (не затрагивающие его фракционный состав), а МОНОЧИНКВЕ®- в гемовой, при этом процессы окисления гембелка не наблюдаются. Однако следует избегать передозировки этих препаратов, особенно нитроглицерина, которые могут привести к более глубоким изменениям в структуре гемопро-теида к росту гетерогенности и метгемоглобинобразованию

В отличие от НЬЫО в молекулах НЬСО формируются достаточно стабильные межсубъединичные и междимерные связи* они не разрушаются в процессе электрофореза и НЬСО мигрирует одной фракцией Однако повторное воздействие щелочной среды (трис-глициновый буфер, рН 8,3) приводит к разрыву некоторых междимерных связей и во время гель-фильтрации 30 % тетра-меров электрофоретической фракции НЬСО распадается на димеры с молекулярной массой 39,4 кДа.

Связывание различных по своей природе аксиальных лигандов атомом железа может приводить к изменению электронного состояния и геометрии же-лезопорфирина, которые индуцируют распространяющиеся по структуре гло-бинового компонента конформационные перестройки, позволяющие, по-видимому, данной лигандной форме гемоглобина более эффективно выполнять свои специфические функции.

Малые неионные лиганды, различные по своей природе, оказывают существенное влияние на физико-химические свойства гемопротеида, особенно-

сти протекания ответных реакций при воздействии на биомолекулы экзогенных факторов, в том числе и УФ-излучения.

При исследовании изменений структуры молекул гемоглобина человека и его производных после облучения интегральным потоком УФ-излучения (151 -f 4530 Дж/м2) установлено, что хроматографическое поведение исследуемых гемопротеидов оказалось однонаправленным- не выявлено образования межмолекулярных сшивок гембелков, не обнаружено разрывов пептидных связей и связей между отдельными субъединицами гемопротеидов. Незначительное увеличение или уменьшение величин кажущихся молекулярных масс фотомодифицированных образцов свидетельствует не о процессах ассоциации или диссоциации гембелка, а о частичном разворачивании или сворачивании полипептидных цепей его макромолекул вследствие ослабления или усиления межсубъединичных контактов

На основании собственных результатов и литературных данных предложена схема возможных процессов УФ-превращений молекул НЬСО и HbNO человека (рис.15).

Модификации структуры молекул оксигемоглобина человека наблюдаются не только после смены лиганда в координационной сфере атома железа гема, но и при изменении ближайшего микроокружения железопорфирина, например, в присутствии восстановленного глутатиона, способного вступать во взаимодействие с Cys 93р Ближайшим соседом Cys 93 (i в спиральном сегменте F является проксимальный His 92$, имидазольная группа которого ковалентно связана с атомом железа гема Эта связь обладает высокой лабильностью и ей принадлежит особенно важная роль в соединении порфирина с глобином Кроме того, сульфгидрильные группы вносят значительный вклад в поддержание целостности и устойчивости структуры молекул гемоглобина Серосодержащие аминокислотные остатки Cys 104(a) и Cys 112ф) участвуют во взаимодействии цепей типа OCiPi гемоглобина и регулируют равновесие реакции диссоциации тетрамеров белка в сторону димеров ctifb Было установлено, что присоединение молекул GSH к тетрамеру НЬ02 приводит к частичному разрыву связей между отдельными субъединицами гемопротеида, образованию димеров (48,8 кДа) и появлению в растворе новых конформационных форм белка (84,7 кДа), нехарактерных для его нативного состояния Использование метода электрофореза также подтвердило рост гетерогенности гемопротеида и перераспределение белка между его отдельными фракциями после воздействия GSH. С ростом концентрации GSH в смеси незначительные конформационные перестройки гембелка (1:10) постепенно заменяются процессами образования MtHb (1-100 -1:500) и разрывом связей между гемином и глобином (1 1000)

МООнм МЭООнм СО^е^ЙЬ-АН

мигра(шзнергии

<Ре*)Н!>+СО

90б»1359Дж/м1|*-

(ре")НЬО, (Рв")НЬСО (Ре")НЬ

2265-4530 Дж/мг

продукта фотомодификации (Ре*)НЬС0,(Ке14)НЬО, и (Ре'*)НЬ

пение

Частичнадфотоди« ослабление субьеди щищвдйигайда, ничныхюнталх®,

ЛОйфные мм! лереетройю «впобетй -■ '

ог;нго

.N•■¿>1' ".-К

'■> . (Рв'^.+'^О -

^"жьо,: г

(Рв")НЬ

1359-4330

Дж/м4'.. л

г. " "

(ре^йь+^о,

(Реа')ИЬ+2ЙС>р5<0 , рСРе^НЬО,

■н ш ' (-гсре*»«»

структуры белка, изменение размеров молехуд, накопление метгемотобина в образца' ' ■

Рис 15. Схема процессов УФ-превращений молекул карбокси- и нитрозогемог-лобина человека

Таким образом, эксперименты с участием восстановленного глутатиона доказали, что изменения в ближайшем микроокружении гема, возникающие вследствие модификации связи порфирина с глобином, оказывают влияние не только на состояние железопорфирина, но и на апобелковый компонент, т.е. на структуру всей молекулы гемоглобина в целом, что нашло отражение и на её УФ-чувствительности. В присутствии восстановленного глутатиона возрастает фоторезистентность ароматических аминокислотных остатков белка к действию УФ-света в дозах 151-953 Дж/м2. Однако их ответная реакция на воздействие больших доз (1359-4530 Дж/м2) аналогична таковой оксиформы гембелка без модификатора. Процессы, обеспечивающие фотопротекторное действие вЗН, реализуются по двум основным путям: за счет дезактивации активных форм кислорода, образующихся при УФ-облучении водных растворов гемопро-

теида, и за счет формирования смешанного дисульфида О-Э-в-НЬ, что снижает подвижность его полипептидных цепей и тем самым тормозит процессы фотоокисления хромофоров под действием УФ-света. Только большие дозы УФ-излучения могут разорвать прочные дисульфидные мостики в-Б-З-ЯЬ, лабили-зировать молекулу белка и нивелировать защитное действие глутатиона.

Особый интерес представляют исследования по изучению структуры оксигемоглобина, модифицированного 8-нитрозоглутатионом, который, с одной стороны, является поставщиком N0, а, о другой, - способен после процесса диссоциации взаимодействовать с вН-группами Су$ 93 р гембелка, т.е. непосредственно влиять на ближайшее микроокружение гема. Оказалось, что из всех исследуемых нами лекарственных средств, ОЭЫО наиболее сильно влияет на молекулы гемопротеида: он индуцирует образование его окисленных форм и рост гетерогенности. В то же время воздействие терапевтических доз УФ-света (151 Дж/см2) на смеси оксигемоглобина с ввЛО приводит к обратному эффекту: процессам перехода атома железа гема из трехвалентного в двухвалентное состояние и фотопревращению окисленной формы гембелка в низкоспиновую. Следовательно, процедуру облучения крови малыми дозами УФ-излучения можно использовать для нивелирования отрицательных последствий воздействия низкомолекулярных тиолсодержащих соединений на гембелки.

Было установлено, что наиболее фотоустойчивыми оказались оксиге-нированные и нитрозилированные молекулы гемоглобина человека, фракции онный состав которых после облучения УФ-светом оставался неизменным, при одновременном перераспределении белка между фракциями. УФ-облучение карбокси- и метформы гемоглобина приводило к появлению новых фракций с электрофоретическими показателями, значительно отличающимися от необлу-ченных образцов, что характеризует их большую фотолабильность и неустойчивость по сравнению с окси- и нитрозоформой.

Таким образом, согласно данным гель-хроматографии и электрофореза ответной реакцией разнообразных форм гемоглобина на изменения внешней среды (ионного состава и рН ближайшего микроокружения, действия электродвижущих сил и квантов УФ-света) являются ослабление и разрыв или усиление и образование новых дополнительных межсубъединичных контактов, приводящих или к изменению фракционного состава, или к перераспределению белка между отдельными фракциями гемопротеида.

Следовательно, основная роль в приспособлении гемоглобина к меняющимся условиям окружающей среды принадлежит процессам ассоциации или диссоциации белковых глобул, которые можно рассматривать как тонкий и удобный механизм саморегуляции и адаптации биологических систем к воздействию физико-химических факторов, сложившийся в процессе биоэволюции.

Степень фотомодификации исследуемых гемопротеидов зависит от входящих в их состав малых лигандов, от электронного состояния атома железа гема, конформационного состояния полипептидных цепей глобинового компонента и прочности контактов гем - глобин, а также от диапазона и дозы применяемого УФ-свега

Высокую способность гемопротеидов и других сложных олигомерных белков к процессам ассоциации-диссоциации составляющих их субъединиц следует учитывать при изучении проблем самоорганизации биологических макромолекул (О. В. Путинцева, В.Г. Артюхов, 1995), механизмов регуляции гомеостаза организма человека и животных, установлении взаимозависимых переходов отдельных форм гемоглобина вследствие УФ-облучения его изолированных растворов или цельной крови в условиях проведения АУФОК-терапии, а также изучении функциональных свойств нативных белковых глобул и их составных компонентов или комплексов с другими органическими и неорганическими веществами.

Нами было проанализировано влияние на структуру гемоглобина другого физического фактора - температуры. Так, применение совокупности выше перечисленных методов исследования позволило нам определить наиболее оптимальные сроки сохранения отдельных физико-химических характеристик молекул гемоглобина (размеры, гетерогенность, кислородсвязывающую способность) в процессе длительного термостатирования консервированной крови доноров, а, следовательно, и наиболее приемлемые сроки использования последней для переливания реципиентам. Сравнительный анализ кинетики термоинактивации синтезируемых de novo гемопротеидов (комплексы Hb-ДАД разного типа) с таковой нативного гемоглобина дал дополнительную информацию о природе и прочности связей, возникающих между модификатором и белком, выявил повышенную степень устойчивости химически измененного гембелка к действию денатурирующего фактора. Это позволяет рассматривать диаль-дегиддекстран как эффективный модификатор и перспективный стабилизатор структурно-функционального состояния белковых макромолекул, сохраняющий их биологически важные свойства и способность выполнять физиологическую роль в организме при изменении условий среды.

ВЫВОДЫ

1. Природа аксиального лиганда (02, Н20, СО и NO) в координационной сфере атома железа молекул гемоглобина человека оказывает влияние на состояние третичной и четвертичной структур гемопротеида. Изменение прочности связи гем-проксимальный гиетидин и конформации ближайшего белкового окружения железопорфирина отражается на физико-химических характеристиках гембелков и их УФ-чувствительности.

2. Облучение окси-, карбокси- и нитрозогемоглобина человека УФ-светом (240-390 нм) в малых дозах (151 - 453 Дж/м1) приводит к фотодиссоциации лигандов, локальным конформациоиным перестройкам в области гема и его непосредственного окружения и нарушению междимерных и межсубъ-единичных контактов. Большие дозы (1359 - 4530 Дж/м2) ицпуцируют окисление железа гема молекул окси-, карбокси- и нитрозогемоглобина и накопление метгемоглобина в облученных растворах этих гемопротеидов.

3. ДУФ-излучение (320-390 нм) обладает по отношению к гемопротеидам фотохимически активным действием, эффект которого зависит от электронного состояния атома Бе гема, конформационного состояния глобинового компонента и прочности контактов гем-глобин. ДУФ-излучение затрагивает не только железопорфириновую часть молекул МШЬ, но и их субъединичные контакты, что впечет за собой (в зависимости от дозы) процессы ассоциации или диссоциации белковых глобул.

4. Одним из основных механизмов ответной реакции лигандных форм тетрамерной молекулы гемоглобина на воздействие различных диапазонов и доз УФ-света является ослабление и разрыв междимерных и межсубъединич-ных контактов и, как следствие, накопление минорных димерных и мономерных форм. Однако фотомодификации гемопротеидов могут приводить и к образованию окгамерных ассоциатов.

5. Воздействие карбокси- и нитрозогемоглобина в концентрациях, превышающих их нормальный физиологический уровень в крови (10% для НЬСО и 0,01% для НЫМО), индуцирует уменьшение степени гем-гемового взаимодействия и изменение сродства гемоглобина к кислороду (в присутствии НЬСО оно повышается, а в присутствии НЬЫО - снижается).

6. Зависимость основных показателей кислородтранспортной активности смесей НЬОг+НЬСО и НЬ02+НЬЫ0 от дозы УФ-света определяется количеством карбокси- и нитрозоформы гемоглобина в смеси. Повышение содержания №N0 в растворах (>1%) гемопротеида и УФ-излучение, вероятно, вызывают сочетанное нитрит- и фотоокисление {№N0 до МШЬ.

7. Выявлено, что лекарственные препараты - нитроглицерин и МОНО-ЧИНКВЕ® в области концентраций (10"в - 10'3 моль/л) индуцируют только локальные изменения в молекулах оксигемоглобина: нитроглицерин - в глобино-вой части (не затрагивающие его фракционный состав), а МОНОЧИНКВЕ®- в гемовой, при этом процессы окисления гембелка не наблюдаются.

8. Б-нитрозоглутатион индуцирует образование окисленных форм гемоглобина и способствует росту его гетерогенности. УФ-облучение терапевтической дозой (151 Дж/м2) растворов гемоглобина, предварительно модифицированного в-нитрозоглутатионом (10'3 моль/л), способствует фотопревращению исходной окисленной формы гембелка в низкоспиновую.

9. Выявлены глубокие нарушения в структуре молекул оксигемоглобина человека в присутствии различных концентраций восстановленного глутатиона. С ростом концентрации ОБН незначительные конформационные перестройки

гембелка постепенно заменяются процессами образования МШЬ, разрывом связей между гемином и глобином, возрастанием гетерогенности гемопротеида и перераспределением белка между его отдельными фракциями

10. Процессы, обеспечивающие фотопротекторное действие вБН, реализуются по двум основным путям за счет дезактивации активных форм кислорода, образующихся в процессе УФ-облучения водных растворов гемопротеида, и за счет формирования смешанного дисульфида О-Б-Б-НЬ.

11. Установлено, что в эритроцитах основная масса молекул гемоглобина в процессе хранения (1-25 суток) консервированной крови доноров при

4 °С находится в тетрамерной форме, после 5 суток хранения гетерогенность молекул гемопротеида возрастает, достигая максимума через 22 дня. Кислород-связывающая способность гемоглобина остается неизменной 2 суток с момента взятия крови, после чего наблюдается необратимое уменьшение значений величины Р50 и константы Хилла.

12. При формировании комплексов гемоглобин-ДАД I типа с молекулярной массой 103,4 кДа полисахарид образует многоточечные ковалентные связи со всеми 4 субьединицами молекулы гемопротеида, в которых участвует 8 аминокислотных остатков (6 лизинов и 2 гистидина). Доля НЬОг в растворах конъюгата снижается до 51,5314,94%, а количество НЬ и М(НЬ увеличивается соответственно до 42,99±6,43% и 5,48±0,74%.

13. Образование высокомолекулярных комплексов гемоглобин-ДАД II типа (225,4 кДа) происходит с участием 5 аминокислотных остатков (4 лизинов и 1 гистидина), что приводит к жесткому пространственному фиксированию двух субъединиц в тетрамерной молекуле гемоглобина относительно друг друга, в то время как две другие субъединицы оказываются не связанными с декст-раном и под влиянием додецилсульфата натрия диссоциируют в раствор

14 Установлено, что ДАД может значительно повышать термостабильность гемоглобина, эффект зависит от соотношения молекул гембелка и полисахарида в конъюгатах' температура необратимого денатурационного перехода для интактного и модифицированного реополиглюкином оксигемоглобина человека, комплексов НЬ-ДАД II типа (соотношение 5:1) составляет 60 °С, а для конъюгатов НЬ-ДАД I типа (соотношение 1:1) - 80 °С.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Арпохов В Г, Путинцева О В Оптические методы анализа интактных и модифицированных биологических систем. - Воронеж- Изд-во Воронежского ун-та, 1996 - 240 с (учебное пособие с грифом Минобразования РФ).

2 Артюхов В Г, Башарина О В, Вашанов Г А , Наквасина М А, Путинцева О.В. Олшхшерные белки: структурно-функциональные модификации и роль субъединичных контактов - Воронеж Изд-во Воронежского ун-та, 1997. - 264 с. (монография).

Статьи

3 Путинцева О В, Артюхов В Г, Столярова ОН О гетерогенности гемоглобина эритроцитов человека при длительном термостатирования консер-

вированной крови доноров // Кислотно-основной и температурный гомеостаз. физиология, биохимия и клиника - Сыктывкар, 1994 - С 151-156

4 * Путинцева О.В., Столярова О Н, Влияние инкубации крови доноров при низких температурах на электрофоретические характеристики гемоглобина эритроцитов // Успехи физиологических наук. -1994. -Т. 25, №4. - С. 30-31

5.* Путинцева О. В., Артюхов В Г., Юрина Е.А. Индуцированные ультрафиолетом превращения молекул карбоксигемоглобина человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1998 - № 8. - С. 167-171

6. Путинцева О В. Артюхов В.Г., Калаева Е А., Косматых Н.А Влияние нитроглицерина на спектральные характеристики оксигемоглобина человека // Физиология и психофизиология мотиваций Межрегион, сб научных работ - Воронеж, 1999-Вып. 3 -С. 43-45.

7 * Путинцева О.В., Артюхов В.Г., Вашанов Г.А Структурно-функциональные характеристики молекул гемоглобина при длительном хранении консервированной крови доноров // Рос Физиол журн. им И М Сеченова, - 2000 - Т. 8.

- № 4. -С 432-439.

8 * Путинцева О В., Артюхов В Г, Калаева Е А Оценка степени фотоповреждения хромофоров гемового и глобинового компонентов УФ-облученных молекул и электрофоретических фракций карбоксигемоглобина человека // Радиационная биология. Радиоэкология - 2000 - Т. 40.- № 4.- С. 447-453.

9. * Калаева Е А, Путинцева О В, Артюхов В Г. Электрофоретические свойства нативного и УФ-облученного нитрозогемоглобина человека // Вестник Воронежского гос. ун-та. Серия: Химия. Биология. - 2000. - № 6. - С. 78-81.

10 Путинцева О В . Артюхов В Г, Калаева Е.А. Влияние «терапевтических» доз УФ-радиации на спектральные характеристики нитрозогемоглобина человека // Межрегион науч сб «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов»-Воронеж Центрально-Черноземное книжное изд-во, 2000 -С 109-114

11. Путинцева О В., Артюхов В.Г, Калаева ЕА., Верховых И.Ю Электрофоретические свойства препаратов гемоглобина человека с различным соотношением окси- и карбоксиформ // Межрегион, науч сб „Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" - Воронеж. Центрально-Черноземное книжное изд-во, 2000 - С 103-105

12 * Путинцева О.В, Артюхов В Г , Калаева Е А Изменения спектральных свойств растворов нитрозогемоглобина, индуцированные УФ-светом // Биофизика. -2003-Т 48 -Вып 3 - С 411-416

13.* Артюхов В.Г, Калаева Е А, Путинцева О В Динамика оксигенации нативного и УФ-модифицированного гемоглобина человека в присутствии оксида азота.

- Физиология человека - 2004 - Т 30 - № 2 - С. 110-116.

14 * Путинцева О.В , Савостин В С., Артюхов В.Г. Влияние нативного и окисленного декстрана на физико-химические свойства гемоглобина человека // Рос Физиол. журн им ИМ Сеченова.-2004 -Т 90.-№8 -С 145

15.* Калаева Е.А., Артюхов В Г., Путинцева О В Исследование природы электрофоретических фракций нативного и УФ-облученного нитрозогемоглобина человека методом гель-хроматографии // Вестник ВГУ Серия Химия Биология Фармация. -2004. -ЛИ -С 129-133.

16 * Артюхов В Г, Башарина О В, Вашанов Г А, Наквасина М А, Путинцева О.В. Тепловая денатурация олигомерных белков структурно-функциональные изменения, последовательность стадий//Биофизика.-2004 -Т 49 -Вып 4 - С. 617-630

17 Артюхов В.Г, Путинцева О В, Савостин В С Влияние реополиглкжина и диальдегиддексграна на термостабильность молекул гемоглобина человека // Укр, биохим журнал.-2005 -Т. 77,№5 -С 70-79.

18 * Артюхов В Г, Путинцева О В, Савостин В С. Физико-химические свойства и термостабильность молекул гемоглобина человека, модифицированного рео-полиглюкином и диальдегиддекстраном // Биофизика. - 2006 - Т. 51 - Вып 3 - С. 430-439.

19 * Артюхов В Г, Калаева Е А, Путинцева О.В , Преображенский А П Математические модели кислородтранспортной функции интактного и модифицированного УФ-облучением гемоглобина человека в присутствии оксида углерода// Биофизика.-2007 -Т. 52 -Вып. 1 -С 24-32

Тезисы, материалы конференций

20 Путинцева О В, Артюхов В Г Особенности самоорганизации олиго-мерных белков // Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах Тез докл междунар, конф - M, - Суздаль, 1995. - С.80.

21. Вашанов В Г, Артюхов В.Г, Путинцева О В. Саморегуляция процессов ассоциации-диссоциации молекул гемоглобина модификация физико-химичес-кими агентами // Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах Труды междунар конф - M,-Суздаль, 1995 -С 39-45

22 Путинцева О В, Артюхов В.Г, Зубарева Т В, Столярова О.Н. Сравнительный анализ электрофоретических свойств окси- и метформ гемоглобина человека // Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов : Материалы междунар. симп -Воронеж, 1995. - С. 107-109

23 Artyhov V G , Vashanov G A., Nakvasina M A, Putintseva О V Realisation pathways of absorbed energy of oligomer proteins / Second Int. Conf on development directions of the radio communication systems and means - Voronezh, 1995. - P. 43 -49.

24. Путинцева О В , Артюхов В Г, Вашанов Г А, Сычев А В Исследование функциональных свойств гемоглобина эритроцитов при различных сроках хранения консервированной крови доноров // Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов Материалы междунар симп - Воронеж, 1995 - С. 105-107,

25 Путинцева О В, Артюхов В Г, Хатунцева Т В О динамике структурных изменений молекул метгемоглобина человека, индуцированных УФ-светом // Mathematical models of non-linear excitation, transport,dynamics, control in condenced system and other mediums Abstr oflnt Sci conf -Tver, 1996 -P 82

26 Putintseva О V Structural modifications of human methaemoglobin molecules induced by the long wave ultraviolet light / 12 Int. Congress on photobiology. Congr Abstracts -Viena, 1996 -P. 130

27 Artyhov V G, Vashanov G A, Basharina J V , Nakvasina M A., Putintseva O.V. Associative - dissociative proceses of subunited proteins molecules as a main reason of cyange of their thermostability // 2nd Internat Symposium „Molecular order and mobility m polimer systems" - Saints-Petersburg. - 1996 - P 157

28. Путинцева О В , Артюхов В Г, Юрина Е А Электрофоретические характеристики УФ-облученных молекул карбоксигемоглобина человека // Первичные фотофизические и фотохимические процессы в биосистемах различных уровней организации Материалы совещания-семинара Воронеж, 1996 - С 109-111

29 Путинцева ОВ, Арпохов ВГ, Маклакова В H Гель-хроматографические свойства оксигемоглобина человека в присутствии антиоксиданта глугатиона II Кислород и свободные радикалы Материалы Междунар Симпозиума Гродно, 1996-С 115-116.

30. Путинцева О В., Артюхов В Г, Зубарева Т А., Хатунцева Т В УФ-ин-дуцированные структурные перестройки молекул метгемоглобина человека // 1 Всероссийская конф. фотобиологов • Тез докл -Пущино, 1996 - С 86-87

31 Путинцева О В, Артюхов В Г, Хатунцева Т В. О динамике структурных изменений молекул метгемоглобина человека, индуцированных УФ-светом // Математические модели нелинейных возбуждений, переноса, динамики, управления в конденсированных системах и других средах . Труды Междунар научной конф -Тверь, 1997.-С. 215-218

32. Путинцева О В., Артюхов В.Г, Юрина ЕА Хроматографические характеристики электрофоретических фракций интактнош и УФ-облученного карбок-сигемоглобина человека // Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов Материалы 2 Междунар симпозиума.-Воронеж, 1998 -С 186-190.

33. Путинцева О.В., Артюхов В Г, Юрина Е.А О динамике накопления различных форм гемоглобина в электрофоретических фракциях его УФ-облученной кар-боксиформы Н Математические модели нелинейных возбуждений, динамики, переноса, управления в конденсированных системах и других средах Тез докл 3 Междунар. научн. конф. - М, 1998. - С. 116

34 Путинцева О.В, Калаева Е.А Анализ УФ-превращений карбокси-гемоглобина человека // 2 съезд биофизиков России Тез. докл - М, 1999. - С. 10671068.

35 Путинцева О.В, Артюхов В Г., Калаева Е.А. Динамика изменений структуры УФ-облученных молекул нитрозогемоглобина человека // 7 Междунар. конф по химии физико-химии олигомеров «Олигомеры -7» • Тез докл - Пермь, 2000 - С 147.

36 Путинцева О.В., Артюхов В.Г., Калаева Е А. Влияние терапевтических доз УФ-света на физико-химические свойства молекул нитрозогемоглобина человека // П Междунар. конгресс «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» Тез докл -СПб,2000 -С 170.

37. Путинцева О В., Артюхов В.Г., Калаева Е.А. Динамика накопления метгемоглобина в УФ-облученных растворах нитрозогемоглобина человека // Математические модели нелинейных возбуждений, динамики, переноса, управления в конденсированных системах и других средах- Тез докл. 5 Междунар. научн конф - М, 2000 -С 125

38 Калаева Е.А, Путинцева О В, Артюхов В.Г Нитрозогемоглобин влияние УФ-излучения на его структурные характеристики Н П1 Съезд фотобиологов России . Тез. докл. - Воронеж, 2001. - С. 84-85

39 Путинцева О В., Артюхов В Г., Калаева Е.А Некоторые физико-химические свойства нативного и УФ-облученного нитрозогемоглобина человека и его электрофоретических фракций // IV Съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология и радиационная безопасность) Тез докл - М, 2001 - С 121.

40 Путинцева О В, Калаева Е А Влияние УФ-излучения и оксида углерода на функциональную активность гемоглобина человека // Механизмы действия сверхмалых доз Тез докл Ш Междунар симпозиума. - М., 2002 - С 200

41 Артюхов В Г, Путинцева ОВ, Калаева Е.А, Косматых Н.А Спектральные свойства оксигемоглобина человека в присутствии оксида азота П VIII Междунар. конф по химии и физико-химии олигомеров «Олигомеры - 2002». Тез докл - М, Черноголовка, 2002. - С 331

42. Артюхов В.Г., Путинцева О.В., Савостин В С. Функциональные свойства

оксигемоглобина человека в присутствии реополиглюкина // VIII Междунар. конф. по химии и физико-химии олигомеров «Олигомеры - 2002» : Тез. докл. - М., Черноголовка, 2002. - С. 333.

43 Путинцева О В, Калаева Е,А Влияние оксида азота на динамику ок-сигенации нативного и УФ-модифицированного оксигемоглобина человека // III Междунар. конгресс «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» : Труды конгресса. - СПб, 2003. - С 58

44 Kalaeva Е A., Artykhov V G , Putintseva О V. Chromatographic properties of electroforetic fraction of native and UV-irradiated human nitrosohaemoglobin // 3 Int. Symposium on Separation in BioSciencies SBS'03 „100 years of chromatography". Abstracts. -M, 2003. -P. 31.

45. Калаева E А., Аргюхов В.Г, Путинцева О В , Ермолаева О С. Влияние УФ-излучения и S-нитрозоглутатиона на физико-химические свойства оксигемоглобина человека // „НБИТТ-21" Материалы междисциплинарной конф. с междунар. участием. - Петрозаводск, 2003 - С. 48-49

46. Артюхов В.Г, Путинцева О В , Савостин В С , Лунева В В Хромагго-графические свойства конъюгатов гемоглобин-декстран в различных условиях эксперимента И Хроматография и хроматографические приборы: Всерос Симпозиум- Сб. тез.-М.,2004.-С. 265.

47 Путинцева О В, Савостин В С Физико-химические характеристики конъюгатов гемоглобин-диальдегиддекстран // III съезд биофизиков России1 Тез. докл. - Воронеж, 2004. - Т. 1. - С. 90-91.

48 Артюхов В.Г, Калаева Е А, Путинцева О В., Преображенский А.П Математические модели процессов сатурации гемоглобина человека в присутствии оксида азота // Матер. 7-й Междунар. науч.-метод. конф. «Информатика: проблемы, методология, технологии» - Воронеж, 2007. - С 9-11

12 работ (отмеченные знаком *) опубликовано в изданиях, соответствующих списку ВАК РФ (4,5,7, 8,9,12,13,14,15,16,18,19)

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии ИПЦ ВГУ Формат 60x84 1/16. Уел п.л 2,79 Тираж 100 экз Заказ 1047

Издательско-полиграфическиЙ центр Воронежского государственного университета 394000, г Воронеж, пл им Ленина» 10 Тел (факс) +7(4732) 598-026 Ыф./Ду\уу/ ррс у&и ги, е-тш1 рр_сепеег@1ур vsu.ru

Отпечатано в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета 394000, г Воронеж» ул Пушкинская, 3

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Путинцева, Ольга Васильевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Эндогенные низкомолекулярные биорегуляторы: роль в биосис- 21 темах

1.1.1. Малые неионные лиганды

1.1.1.1. Оксид азота

1.1.1.2. Оксид углерода

1.1.2. Низкомолекулярные серосодержащие тиолы

1.1.2.1. В остановленный глутатион

1.1.2.2. Нитрозоглутатион

1.2. Структура, физико-химические и функциональные свойства раз- 46 личных лигандных форм гемоглобина

1.2.1. Оксигемоглобин

1.2.2. Нитрозогемоглобин

1.2.3. Карбоксигемоглобин

1.2.4. Метгемоглобин

1.3. Влияние УФ-излучения на структуру и функциональные харак- 72 теристики сложных белков

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Получение растворов оксигемоглобина человека

2.2. Получение растворов карбоксигемоглобина человека

2.3. Получение растворов метгемоглобина человека

2.4. Получение растворов нитрозогемоглобина человека

2.5. Модификация оксигемоглобина человека различными низкомо- 88 лекулярными биорегуляторами

2.5.1. Модифицирование оксигемоглобина человека растворами вое- 88 становленного глутатиона

2.5.2. Получение Б-нитрозоглутатиона и его инкубация с оксигемог- 88 лобином

2.5.3. Модификация оксигемоглобина нитроглицерином и 89 МОНОЧИНКВЕ®

2.6. Модификация оксигемоглобина человека препаратом природного полисахарида - реополиглюкином

2.7. Химическая модификация оксигемоглобина диальдегиддекстра- 89 ном

2.7.1. Получение диальдегиддекстрана из реополиглюкина, очистка и 90 определение степени его окисления

2.7.2. Синтез конъюгатов гемоглобин-диальдегиддекстран

2.7.3. Определение содержания полисахарида в конъюгатах гемогло- 91 бин-диальдегиддекстран

2.7.4. Определение природы ионогенных групп, участвующих в об- 92 разование комплекса гемоглобин-диальдегиддекстран, методом протеолитического титрования

2.8. Облучение растворов гемоглобина

2.9. Термостатирование исследуемых растворов гемоглобина

2.10. Регистрация электронных спектров поглощения растворов на- 94 тивного и модифицированного гемоглобина

2.11. Гель-хроматография нативных и модифицированных растворов 94 гемоглобина

2.12. Диск-электрофорез различных лигандных форм гемоглобина в 95 полиакриламидном геле

2.13. Регистрация кривых диссоциации оксигемоглобина и его сме- 97 сей с различным содержанием нитрозо- и карбоксигемоглобина

2.14. Спектрофотометрическое определение количества БН-групп в 98 различных лигандных формах нативного и модифицированного гемоглобина

2.15. Определение соотношения основных лигандных форм в на- 98 тивных и модифицированных образцах гемоглобина

2.16. Определение интенсивности светорассеяния растворов гемо- 99 глобина

2.17. Расчет некоторых кинетико-термодинамических характеристик 99 нативных и УФ-облученных молекул гемоглобина

2.18. Создание компьютерных моделей гема, гемоглобина человека, 101 декстрана, диальдегиддекстрана, комплексов гемоглобин-диальдегиддекстран I и II типов

2.19. Статистическая обработка экспериментальных данных

ГЛАВА 3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И

УФ-ОБЛУЧЕННОГО ОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА

3.1. Хроматографические и спектральные характеристики нативного 103 и УФ-облученного оксигемоглобина человека

3.2. Электрофоретические характеристики нативного и УФ- 108 облученного оксигемоглобина человека

ГЛАВА 4. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И

УФ-ОБЛУЧЕННОГО МЕТГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА

4.1. Спектральные и хроматографические характеристики нативного 117 и УФ-облученного метгемоглобина человека

4.2. Электрофоретические характеристики нативного и УФ- облу- 122 ченного метгемоглобина человека

ГЛАВА 5. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И

УФ-ОБЛУЧЕННОГО КАРБОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА И

ЕГО ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ

5.1. Спектральные характеристики растворов нативного и УФ- 128 облученного карбоксигемоглобина человека

5.2. Хроматографические характеристики нативного и УФ- облученного карбоксигемоглобина человека

5.3. Электрофоретические характеристики нативного и УФ-об- 137 лученного карбоксигемоглобина человека

5.4. Исследование природы электрофоретических фракций нативного и фотомодифицированного карбоксигемоглобина человека 5.4.1. Спектральные характеристики электрофоретических фракций нативного и УФ-облученного карбоксигемоглобина человека 5.4^у^роматографические характеристики электрофоретических 152 фракций нативного и УФ-облученного карбоксигемоглобина человека

ГЛАВА 6. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА 158 РАСТВОРОВ ГЕМОГЛОБИНА С РАЗЛИЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ОКСИ- И КАРБОКСИФОРМ

6.1. Спектральные характеристики растворов гемоглобина с различным содержанием окси- и карбоксиформ

6.2. Хроматографические свойства растворов гемоглобина с различным содержанием окси- и карбоксиформ

6.3. Электрофоретические свойства растворов гемоглобина с различным содержанием окси- и карбоксиформ 6.3.1. Хроматографические характеристики электрофоретических 170 фракций растворов гемоглобина с различным содержанием окси- и карбоксиформ

6.4. Функциональные характеристики нативных и УФ-облученных смесей окси- и карбоксигемоглобина человека

ГЛАВА 7. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И 186 УФ-ОБЛУЧЕННОГО НИТРОЗОГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА И ЕГО ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ

7.1. Спектральные свойства нативных и УФ-облученных растворов 186 нитрозогемоглобина человека

7.2. Хроматографические характеристики нативного и УФоблученного нитрозогемоглобина человека

7.3. Электрофоретические свойства нативного и УФ-облученного нитрозогемоглобина человека

7.4. Исследование природы электрофоретических фракций нативного и фотомодифицированного нитрозогемоглобина человека

7.4.1. Спектральные характеристики электрофоретических фракций 199 нативного и УФ-облученного нитрозогемоглобина человека

7.4.2. Хроматографические свойства электрофоретических фракций 209 нативного и У1Ф-облученного нитрозогемоглобина человека

7.5. Функциональные характеристики нативных и УФ-облученных смесей окси- и нитрозогемоглобина человека

ГЛАВА 8. НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА 223 ОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА В ПРИСУТСТВИИ ИСТОЧНИКОВ ОКСИДА АЗОТА - НИТРОГЛИЦЕРИНА, МОНОЧИНКВЕ® и Б-НИТРОЗОГЛУТАТИОНА

8.1. Некоторые физико-химические свойства оксигемоглобина человека в присутствии различных концентраций нитроглицерина

8.1.1. Спектральные характеристики растворов нативного и модифи- 226 цированного нитроглицерином оксигемоглобина человека

8.1.2. Электрофоретические свойства оксигемоглобина человека, мо- 228 дифицированного нитроглицерином в различных концентрациях

8.2. Спектральные характеристики растворов оксигемоглобина в присутствии лекарственного препарата МОНОЧИНКВЕ®

8.3. Физико-химические свойства оксигемоглобина человека, модифицированного воздействием Б-нитрозоглутатиона и УФ-излучения

8.3.1 .Спектральные характеристики оксигемоглобина человека, мо- 233 дифицированного различными концентрациями 8-нитрозоглутатиона

8.3.2. Спектральные свойства оксигемоглобина человека, модифици- 236 рованного сочетанным действием 8-нитрозоглутатиона и УФ-излучения

8.3.3. Хроматографические характеристики оксигемоглобина чело- 240 века в присутствии 8-нитрозоглутатиона различных концентраций

8.3.4. Хроматографические свойства оксигемоглобина человека, мо- 242 дифицированного совместным воздействием Б-нитрозоглутатиона и УФ-излучения

8.3.5. Электрофоретические характеристики оксигемоглобина чело- 245 века в присутствии Б-нитрозоглутатиона различных концентраций

ГЛАВА 9. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И

УФ-ОБЛУЧЕННОГО ОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА В

ПРИСУТСТВИИ ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА

9.1. Гель-хроматографические свойства оксигемоглобина человека в 254 присутствии глутатиона в условиях различного микроокружения

9.2. Электронные спектры поглощения растворов нативного и УФ- 256 облученного оксигемоглобина человека в присутствии глутатиона

9.3. Электрофоретические характеристики нативного и УФ- облу- 264 ченного оксигемоглобина человека, модифицированного восстановленным глутатионом

ГЛАВА 10. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ

ХАРАКТЕРИСТИКИ МОЛЕКУЛ ГЕМОГЛОБИНА ПРИ

ДЛИТЕЛЬНОМ ХРАНЕНИИ КОНСЕРВИРОВАННОЙ КРОВИ

ДОНОРОВ ПРИ ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ

10.1. Хроматографические свойства гемоглобина, выделенного из 273 крови доноров с различными сроками хранения

10.2. Электрофоретические характеристики гемоглобина, выделен- 275 ного из крови доноров с различными сроками её хранения

10.3. Функциональные свойства гемоглобина, выделенного из крови 280 доноров с различными сроками её хранения

ГЛАВА 11. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И

ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ МОЛЕКУЛ ГЕМОГЛОБИНА

ЧЕЛОВЕКА, МОДИФИЦИРОВАННОГО РЕОПОЛИГЛЮКИНОМ И ДИАЛЬДЕГИДДЕКСТРАНОМ

11.1. Физико-химические свойства и термостабильность гемоглобина 285 человека в присутствии реополиглюкина

11.1.1. Спектральные характеристики молекул гемоглобина челове- 285 ка в присутствии реополиглюкина

11.1.2. Хроматографические свойства гемоглобина человека в при- 287 сутствии реополиглюкина

11.1.3. Электрофоретические характеристики гемоглобина человека 288 в присутствии реополиглюкина

11.1.4. Определение природы ионогенных групп молекул гемогло- 291 бина человека в присутствии реополиглюкина методом про-теолитического титрования

11.1.5. Термостабильность молекул гемоглобина человека в присут- 293 ствии реополиглюкина

11.2. Физико-химические свойства и термостабильность молекул гемоглобина человека в комплексах с диальдегиддекстраном

11.2.1. Исследование процессов образования комплексов гемогло- 295 бин-диальдегидцекстран с помощью метода гель-фильтрации на сефадексах

11.2.2. Спектральные характеристики комплексов гемоглобин- 300 диал ьдегиддекстран

11.2.3. Электрофоретические характеристики комплексов гемогло- 303 бин-диальдегидцекстран

11.2.4. Определение природы ионогенных групп, участвующих в об- 305 разовании комплекса гемоглобин-диальдегиддекстран, с помощью метода протеолитического титрования

11.2.5. Термостабильность комплексов гемоглобин- 3 09 диальдегиддекстран

11.2.6. Создание и анализ компьютерных моделей комплексов гемо- 314 глобин- диальдегиддекстран

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные свойства некоторых лигандных форм гемоглобина человека в условиях УФ-облучения и различного микроокружения"

Актуальность темы. УФ-свет и температура - два важнейших экологических фактора, под воздействием которых возникала жизнь на Земле Понять сложные механизмы резистентности и адаптации живых систем по отношению к УФ-излучению и температурного фактора можно, только изучив их влияние на клеточно-молекулярном уровне отдельных индивидуумов. В качестве модельных объектов для изучения фото- и термостабильности белков очень удобно использовать компоненты крови, и в частности, гемоглобин эритроцитов. Последний относится к гетерогенным белкам (Н.Ф. Стародуб, В.И. Назаренко, 1978). В организме человека и животных он существует в комплексе с целым рядом малых лигандов (Ог, СО, N0, Н2О и др.) в виде молекул окси-, карбокси-, нитрозо-, метгемоглобина и др., физико-химические свойства и функциональная активность которых резко отличаются в зависимости от формы их существования: тетрамерной, димерной или мономерной (Л.И. Иржак, 1975; Г.А. Вашанов, 2004). Исследований, посвященных изучению вклада отдельных компонентов гембелков в процессы фотоповреждения различных структурных форм гемоглобина в условиях различного микроокружения (В.Г. Артюхов и др., 1997), крайне недостаточно. Основные фотохимические исследования гемопротеидов проведены в основном без учета их структурной неоднородности и лигандного состава.

В норме соотношение отдельных лигандных форм гемоглобина поддерживается на определенном уровне. Однако оно может значительно изменяться за счет поступления оксидов азота и углерода извне. Во многом этому способствует обострение экологической обстановки вследствие техногенного воздействия на окружающую среду (В.П. Подольский и др., 1999; М.Х.-Г. Ибрагимов, 2005; С.А. Куролап и др., 2006). Нередкими являются и бытовые случаи отравления оксидом углерода, летальные исходы которых составляют 17.5 % всех смертельных отравлений (Е.А. Лужников, Л.Г. Костомарова, 1989). Сродство N0 и СО к дезоксигемоглобину намного выше, чем кислорода. Присоединив эти лиганды, гемоглобин теряет способность транспортировать кислород к тканям и органам, что приводит к острым и хроническим отравлениям, способствуют развитию заболеваний дыхательной, сердечнососудистой, нервной и др. систем, особенно у лиц, постоянно подвергающихся воздействию указанных веществ (водители автотранспорта, работники автостоянок, инспектора ГИБДД). Возникновение патологических эффектов может сопровождаться заметным увеличение содержания карбокси- (НЬСО) или нитрозогемоглобина (№>N0) в крови. В связи с этим всё большую актуальность приобретают исследования, посвященные изучению физико-химических и функциональных свойств препаратов гемоглобина с различным соотношением окси- и карбоксиформ, окси- и нитрозоформ.

Процессы с участием оксидов азота и углерода в биосистемах, подвергнутых воздействию физических факторов внешней среды, в том числе УФ-света от естественных и искусственных источников, остаются практически неизученными; недостаточно полно определены пути превращения комплексов белок-лиганд при этих воздействиях. Принимая во внимание усиливающуюся роль коротко- и средневолнового УФ-излучения в формировании антропогенной нагрузки на окружающую среду, а также широкое использование в клинической практике метода аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК) и других видов фототерапии, становится понятной необходимость проведения подобного рода исследований.

Функционирование молекул оксида азота в клетках организма человека тесно связано с низкомолекулярными серосодержащими пептидами, и в частности, с восстановленным глутатионом (ОБН), молекулы которого входят в состав антиоксидантной системы, контролирующей разрушающее действие активных форм кислорода (АФК) при пероксидном стрессе. Соединяясь с оксидом азота, в8Н образует Б-нитрозоглутатион (08>Ю), который защищает N0 от различных воздействий при внутри- и межклеточном переносе. Важная роль глутатиона и его производных в нормальном функционировании клеток, тканей и организма человека и животных, а также недостаточная изученность влияния этих молекул на эритроцитарные белки крови стимулировали нас к проведению исследований третичной и четвертичной структуры нативного и УФ-облученного оксигемоглобина человека в присутствии восстановленного глутатиона и S-нитрозоглутатиона.

Весьма перспективным является разработка кислородпереносящих А кровезаменителей на основе гемоглобина (Т.-Н. Jessen, R. Hilgenfeld, 1992; М.А. Ажигирова, Е.А. Селиванов, 1999), химически модифицированного некоторыми органическими молекулами, защищающими его от разного рода внешних воздействий. В связи с вышеизложенным нами было постулировано использование в качестве стабилизирующего агента гемоглобина окисленного производного клинического декстрана (реополиглюкина) - диальдегид-декстрана (ДАЦ), разработаны методы получения конъюгатов оксигемоглобина человека с данным полисахаридом, выяснены условия их образования, исследованы физико-химические характеристики и стабильность полученных комплексов.

Изучению действия температуры на белковые молекулы посвящено значительное количество работ (М. Жоли, 1968; В.Я. Александров, 1975, 1985; П. Хочачка, Дж. Сомеро, 1988; Е.Г. Франк и др., 1994). Вместе с тем мало внимания уделено исследованию природы конформационных превращений сложных (олигомерных) белков, приводящих к их термоинактивации. Недостаточно изучены вопросы, касающиеся выявления физико-химических основ тепловой денатурации этих биополимеров. Всё это убеждало нас в необходимости проведения подобного рода исследований. В качестве объектов исследования в данной серии экспериментов выступили оксигемоглобин человека в растворе, в присутствии реополиглюкина, в комплексах с диаль-дегиддекстраном и в составе эритроцитов, что позволило провести сравнительный анализ термоустойчивости оксиформы гемопротеида в зависимости от условий микроокружения и исходной конформации белка.

Цель и задачи диссертационной работы.

Целью настоящей работы явилось определение степени УФ-чувствительности и термостабильности ряда структурных (лигандных) форм гемоглобина человека в условиях различного микроокружения.

Задачи работы предусматривали:

1. Оценку физико-химических характеристик гемоглобина человека с различными аксиальными лигандами (О2, СО, N0, Н20) в координационной сфере атома железа порфиринового кольца.

2. Изучение влияния различных диапазонов и доз УФ-света на спек: тральные, хроматографические и электрофоретические характеристики различных лигандных форм (окси-, карбокси-, нитрозо- и метформы) гемоглобина человека.

3. Выявление влияния сочетанного воздействия «терапевтических» доз УФ-света и различных концентраций НЬСО и №>N0 на функциональные свойства оксигемоглобина человека.

4. Сравнительный анализ фоточувствительности различных лигандных форм гемоглобина человека (НЮ2, НЬСО, №N0, МШЬ).

5. Изучение структурного состояния молекул оксигемоглобина человека, модифицированного воздействием восстановленного глутатиона (10"4 10"2 моль/л) и УФ-излучения в дозах 151 ^ 4530 Дж/м .

6. Исследование изменений физико-химических свойств оксигемоглобина человека, индуцированных Б-нитрозоглутатионом в концентрациях 10"5 -И О"3 моль/л, а также сочетанным воздействием этого модификатора и УФ-света (240-390 нм) в дозе 151 Дж/м2.

7. Изучение влияния длительного хранения крови доноров при пониженной температуре на структурно-функциональные характеристики гемоглобина эритроцитов. Определение оптимальных сроков использования донорской крови для её трансфузии.

8. Подбор оптимальных условий химического синтеза комплексов окси-гемоглобин человека-диальдегиддекстран и определение некоторых физико-химических характеристик их молекул.

9. Изучение термостабильности молекул оксигемоглобина человека в растворе, в присутствии реополиглюкина и в комплексах с ДАД.

Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным анализу влияния эндогенных низкомолекулярных биорегуляторов - малых неионных лигандов (оксидов азота и углерода) и тиолсодержа-щих соединений (восстановленного глутатиона и Б-нитрозоглутатиона), лекарственных препаратов - источников оксида азота (нитроглицерина, МО-НОЧИНКВЕ®), высокомолекулярных полианионов на основе декстрана (реополиглюкина и диальдегиддекстрана), УФ-излучения и температурного фактора на структурно-функциональное состояние молекул гемоглобина человека. Выявлено, что от природы аксиального лиганда (Ог, СО, N0) в координационной сфере атома железа молекулы гемоглобина, прочности связи гем-проксимальный гистидин и конформации ближайшего белкового окружения гема зависят состояние высших типов пространственной организации молекул гемоглобина, его физико-химические свойства и фоточувствительность.

Получены доказательства, что одним из основных механизмов ответной реакции лигандных форм тетрамерной молекулы гемоглобина на воздействие различных диапазонов и доз УФ-света является ослабление и разрыв междимерных и межсубъединичных контактов и, как следствие, накопление минорных димерных и мономерных форм гембелка. Кроме того, фотомодификации гемопротеидов могут приводить к декомпактизации их частично спирализованных молекул и ассоциации гембелков вплоть до размеров окта-меров.

Впервые исследовано влияние №N0 в диапазоне концентраций 0,110% на функциональные свойства нативного и УФ-облученного в дозах 151 и 453 Дж/м2 оксигемоглобина человека. Изучение динамики связывания кислорода гемопротеидом показало, что присутствие №N0 интенсифицирует начальные этапы процесса оксигенации и ослабляет кооперативные взаимодействия в тетрамерах, вследствие чего сродство гемоглобина к кислороду в области физиологически важных парциальных давлений (40-100 мм рт. ст.) снижается.

Показано, что направленность УФ-индуцированных изменений функциональных свойств (снижение или возрастание величин Г50 и константы Хилла) оксигемоглобина и его смесей с НЬСО и №>N0 определяется соотношением вкладов фотохимических превращений отдельных лигандных форм гембелка и процессами образования минорных компонентов системы гемоглобина. Выявлены предельные концентрации НЬСО (менее 10 %), при которых возможна корректировка и восстановление исходных характеристик кислородсвязывающей способности гемопротеида УФ-светом. На основе метода кусочно линейной аппроксимации созданы математические модели процессов оксигенации гемоглобина человека, модифицированного воздействием некоторых агентов физической и химической природы.

Исследована возможность использования производных декстрана (рео-полиглюкина и диальдегиддекстрана) в качестве стабилизаторов молекул гемоглобина. Впервые подобраны оптимальные условия химического синтеза комплексов гемоглобина с ДАД, позволяющие получать модифицированные образцы гемоглобина с определенными размерами, молекулярными массами и физико-химическими свойствами. Определены а-1, б-Б-глюкопиранозные остатки декстрана, подвергающиеся окислению и участвующие в образовании альдегидных групп при получении ДАД, выявлены участки (аминокислотные остатки) глобина, ответственные за комплексообразование с указанным полисахаридным производным. Созданы компьютерные модели трехмерной пространственной структуры молекул декстрана, ДАД, комплексов

Hb-ДАД I и II типа с различным соотношением белок: модификатор.

Проанализированы термоиндуцированные изменения молекул гемоглобина человека в растворе (в свободном состоянии), в составе эритроцитов крови, в присутствии реополиглюкина и в комплексах с ДАД. Выявлены оптимальные сроки хранения донорской крови при пониженной температуре, при которых структурные и функциональные характеристики гемоглобина остаются близкими к нативному состоянию. Показано, что термостабильность молекул гемоглобина можно значительно повышать путем присоединения к ним определенного количества молекул окисленного декстрана.

Практическая значимость. Результаты проведенных модельных экспериментов по исследованию динамики фотоиндуцированных превращений молекул НЬ02, HbCO, HbNO и MtHb и выяснению структуры стабильных фотопродуктов, образующихся при воздействии различных диапазонов длин волн УФ-света на гемопротеиды, можно использовать для подбора оптимальных доз УФ-облучения и длительности курса процедур при лечении заболеваний различной этиологии методом АУФОК. :

Данные, полученные при изучении влияния различных концентраций карбоксигемоглобина (10 - 80%) и нитрозогемоглобина (0,1 - 10 %) на функциональную активность гемоглобина до и после воздействия УФ-света могут быть использованы в клинической практике для диагностики интоксикаций организма СО или N0 и разработки методов регулирования кислородтранс-портной функции гемоглобина.

Разработанные программы для ЭВМ типа IBM «Анализ кривых диссоциации оксигемоглобина человека, модифицированного воздействием факторов физической и химической природы», «Расчет точки полного насыщения кислородом оксигемоглобина человека, модифицированного воздействием факторов физической и химической природы», «Прогноз функциональной активности нативного и УФ-облученного оксигемоглобина человека в зависимости от концентрации оксида азота и углерода» (Свидетельства об официальной регистрации программ для ЭВМ № 2006614279, № 2006614280 и № 2006614281 Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам РФ, зарегистрированные в Реестре программ для ЭВМ 13 дкабря 2006 г.) позволяют быстро и точно, не прибегая к использованию графической модели процесса, рассчитать наиболее важные параметры процессов оксигенации гемоглобина в условиях различного микроокружения.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской конференции «Кислотно-основной и температурный гомеостаз» (Сыктывкар, 1994, 1997); Международной конференции «Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах (Суздаль, 1995); I и II Международном симпозиуме «Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов» (Воронеж, 1995, 1998); Second Int. Conf.on development directions of the radio communication systems and means (Voronezh, 1995); научно-практической конференции «Актуальные вопросы скорой медицинской помощи - реальность и перспективы» (Воронеж, 1996); 4-й региональной конференции «Проблемы химии и химической технологии» (Тамбов, 1996); Int. Sci. Conf. "Mathematical models of non-linear excitation, transport, dynamics, control in condensed system and tb other médiums" (Tver, 1996); 12 Int. Congress on photobiology (Viena, 1996); 2nd Internat. Symposium "Molecular order and mobility in polimer systems" (Saints-Petersburg, 1996); I и II Всероссийской конференции фотобиологов (Пущино, 1996, 1998); совещании-семинаре «Первичные фотофизические и фотохимические процессы в биосистемах различных уровней организации» (Воронеж, 1996); Международном симпозиуме «Кислород и свободные радикалы» (Гродно, 1996); V Международной конференции «Циклы природы и общества» (Ставрополь, 1997); 2-й Всероссийской научной конференции «Светоизлучательные системы. Эффективность и применение» (Саранск, 1997); 11-й межреспубликанской научно-практической конференции «Актуальные вопросы экологии и охраны природных экосистем южных регионов России и сопредельных территорий» (Краснодар, 1998); 2-й Международной научно-технической конференции «Решение экологических проблем в автотранспортном комплексе» (Москва, 1998); 3-й и 5-й Международных научных конференциях «Математические модели нелинейных возбуждений, динамики, переноса, управления в конденсированных системах и других средах» (Тверь, 1998; Москва, 2000); II и III съезде биофизиков России (Москва, 1999; Воронеж, 2004); II и III Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2000, 2003); 2-й Российской конференции «Физика в биологии и медицине» (Екатеринбург, 2001); IV съезде по радиационным исследованиям (радио-биология, радиоэкология и радиационная безопасность) (Москва, 2001); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004); 7-й и 8-й Международной конференции по химии и физико-хи-мии олигомеров «0лигомеры-2000, 2002» (Пермь, 2000, Москва-Черноголовка, 2002); III съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); IV съезде по проблемам радиационной биологии (Москва,2001); 3 Int. Symposium on Separation in BioSciencies SBS'03 "100 yeares of chromatography" (Moskau, 2003); междисциплинарной конференции с международным участием «НБИТТ-21» (Петрозаводск, 2003); VIII Международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-графические приборы» (Москва, 2004); Международной научно-практической конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных» (Воронеж, 2004); «Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2001, 2006); IX Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (Пенза, 2006); 6-й и 7-й международной научно-методической конференции «Информатика: проблемы, методология, технология» (Воронеж, 2006,2007).

На защиту выносятся следующие положения.

1. Состояние третичной и четвертичной структуры молекул гемоглобина и его УФ-чувствительность определяются природой аксиального ли-ганда и зависят от ближайшего микроокружения гемовой группы белковой макромолекулы. Фотомодификации различных лигандных форм тетрамерной молекулы гемоглобина (Hb02, HbCO, HbNO, MtHb) затрагивают области контактов димеров и отдельных субъединиц, что приводит к накоплению минорных димерных и мономерных форм, или к декомпактизации тетрамер-ных молекул и образованию октамерных форм.

2. Схемы возможных физико-химических процессов, приводящих к УФ-модификации молекул карбокси-, нитрозо- и метгемоглобина человека.

3. Математические модели процессов оксигенации интактного и модифицированного УФ-излучением гемоглобина человека в присутствии оксидов углерода и азота.

4. Диальдегиддекстран - эффективный стабилизатор и модификатор структурно-функционального состояния молекул гемоглобина человека.

5. Компьютерные модели трехмерной пространственной структуры декстрана, диальдегиддекстрана, комплексов гемоглобин-диальдегиддекст-ран I и II типов.

6. Схема процессов, протекающих в растворах интактных и термостатированных молекул гемоглобина человека в присутствии реополиглюкина и диальдегиддекстрана.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 385 страниц машинописного текста, 80 таблиц, 82 рисунка. Состоит из "Введения", 11 глав, "Заключения", "Выводов", "Приложения". Список цитируемой литературы содержит 362 работы, из них 211 отечественных и 151 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Путинцева, Ольга Васильевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В диссертационной работе при помощи комплекса методов (спектрофо-тометрии в УФ- и видимой области, гель-хроматографии, электрофореза в ПААГ в присутствии и в отсутствие ДСН, светорассеяния, регистрации кривых диссоциации оксигемоглобина, кислотно-основного титрования, математического и компьютерного моделирования) изучены структурно-функциональные модификации гемоглобина человека в условиях воздействия эндогенных низкомолекулярных биорегуляторов - малых неионных лигандов (оксидов азота и углерода) и серосодержащих соединений (восстановленного глутатиона и Б-нитрозоглутатиона), лекарственных препаратов - источников оксида азота (нитроглицерина, МОНОЧИНКВЕ®), высокомолекулярных полианионов на основе декстрана (реополиглюкина и диальдегиддекстрана), УФ-излучения и температурного фактора.

К наиболее заметным структурным последствиям замены аксиального лиганда 02 на N0 можно отнести ослабление и последующую диссоциацию междимерных контактов (а^, о.\а2, Р1Р2) гемоглобина, что приводит к образованию 4 электрофоретических фракций, а также локальное усиление спи-рализации образующихся димерных форм, молекулярные массы которых колеблются от 27,1 до 30,6 кДа.

Серия экспериментов по изучению влияния лекарственных препаратов нитроглицерина и МОНОЧИНКВЕ® на структуру оксигемоглобина, который служит своеобразным «депо» для молекул N0 и может участвовать в их транспортировке выявила, что оба препарата в достаточно большом диапазоне концентраций индуцируют только локальные изменения в молекулах оксигемоглобина: нитроглицерин - в глобиновой части (не затрагивающие его фракционный состав), а МОНОЧИНКВЕ®- в гемовой, при этом процессы окисления гембелка не наблюдаются. Однако следует избегать передозировки этих препаратов, особенно нитроглицерина, которые могут привести к более глубоким изменениям в структуре гемопротеида: к росту гетерогенности и метгемоглобинобразованию.

В отличие от №N0 в молекулах НЬСО формируются достаточно стабильные межсубъединичные и междимерные связи: они не разрушаются в процессе электрофореза и НЬСО мигрирует одной фракцией. Однако повторное воздействие щелочной среды (трис-глициновый буфер, рН 8,3) приводит к разрыву некоторых междимерных связей и во время гель-фильтрации 30 % тетрамеров электрофоретической фракции НЬСО распадается на ди-меры с молекулярной массой 39,4 кДа.

Связывание различных по своей природе аксиальных лигандов атомом железа может приводить к изменению электронного состояния и геометрии железопорфирина, которые индуцируют распространяющиеся по структуре глобинового компонента конформационные перестройки, позволяющие, по-видимому, данной лигандной форме гемоглобина более эффективно выполнять свои специфические функции.

Малые неионные лиганды, различные по своей природе, оказывают существенное влияние на физико-химические свойства гемопротеида, особенности протекания ответных реакций при воздействии на биомолекулы экзогенных факторов, в том числе и УФ-излучения.

При исследовании изменений структуры молекул гемоглобина человека и его производных после облучения интегральным потоком УФ-излуче-ния (151 +4530 Дж/м ) установлено, что хроматографическое поведение исследуемых гемопротеидов оказалось однонаправленным: не выявлено образования межмолекулярных сшивок гембелков, не обнаружено разрывов пептидных связей и связей между отдельными субъединицами гемопротеидов. Незначительное увеличение или уменьшение величин кажущихся молекулярных масс фотомодифицированных образцов свидетельствует не о процессах ассоциации или диссоциации гембелка, а о частичном разворачивании или сворачивании полипептидных цепей его макромолекул вследствие ослабления или усиления межсубъединичных контактов.

На основании собственных результатов и литературных данных предложена схема возможных процессов УФ-превращений молекул НЬСО и

HbNO человека (рис. 82).

УФ-облучение

Х>300нм Х<300нм

Ч. i

CO-Fe2 Hb-AH tI миграцм энергии (Fe2,)Hb + CO

906-1359 Дж/м5

Fe2+)Hb02 (FeJ+)HbCO (Fe3+)Hb частичная фотодиссоциация лиганда, ослабление субъединичных контатов, локальные конформационные перестройки апобелка

02;Н20 генерация активных форм кислорода

2265-4530

Дж/м2 продукты фотомодификации (Fe2+)HbC0,(Fe2t)Hb02 и (Fe3t)Hb

Х>300нм Я,<300нм

Ч 1

NO-Fe НЬ-АН t1 миграция энергии

Fe2+)Hb + NO

906-1359 Дж/м2

Fe2t)Hb02 (Fe2+)Hb; NO; NO; (Fe3t)Hb

1359-4530 Дж/м2

Fe3+)Hb + H2Oj (Fe3+)Hb |H202] + 2NOj

Fe3t)Hb + 2HOONO (Fe2+)Hb02 или -2(Fe2t)Hb

-2(Fe3+)Hb

1—9 ha]+2no; фотомодификация третичной и четвертичной структуры белка, изменение размеров молекул, накопление метгемоглобина в образце

Рис. 82. Схема процессов УФ-превращений молекул карбокси- и нитро-зогемоглобина человека

Модификации структуры молекул оксигемоглобина человека наблюдаются не только после смены лиганда в координационной сфере атома железа гема, но и при изменении ближайшего микроокружения железопорфи-рина, например, в присутствии восстановленного глутатиона, способного вступать во взаимодействие с Cys 93(3. Ближайшим соседом Cys 93 Р в спиральном сегменте F является проксимальный His 92р, имидазольная группа которого ковалентно связана с атомом железа гема. Эта связь обладает высокой лабильностью и ей принадлежит особенно важная роль в соединении порфирина с глобином. Кроме того, сульфгидрильные группы вносят значительный вклад в поддержание целостности и устойчивости структуры молекул гемоглобина. Серосодержащие аминокислотные остатки Сув 104(а) и Суэ 112(Р) участвуют во взаимодействии цепей типа а^ гемоглобина и регулируют равновесие реакции диссоциации тетрамеров белка в сторону ди-меров аф2. Было установлено, что присоединение молекул вБН к тетрамеру НЬ02 приводит к частичному разрыву связей между отдельными субъединицами гемопротеида, образованию димеров (48,8 кДа) и появлению в растворе новых конформационных форм белка (84,7 кДа), нехарактерных для его на-тивного состояния. Использование метода электрофореза также подтвердило рост гетерогенности гемопротеида и перераспределение белка между его отдельными фракциями после воздействия вБН. Степень изменений структуры оксигемоглобина зависит от соотношения в исследуемом образце молекул гемопротеида и тиолсодержащего трипептида. С ростом концентрации в8Н в смеси незначительные конформационные перестройки гембелка (1:10) постепенно заменяются процессами образования МШЬ (1:100 - 1:500) и разрывом связей между гемином и глобином (1:1000).

Таким образом, эксперименты с участием восстановленного глутатиона доказали, что изменения в ближайшем микроокружении гема, возникающие вследствие модификации связи порфирина с глобином, оказывают влияние не только на состояние железопорфирина, но и на апобелковый компонент, т.е. на структуру всей молекулы гемоглобина в целом, что нашло отражение и на её УФ-чувствительности. В присутствии восстановленного глутатиона возрастает фоторезистентность ароматических аминокислотных остатков белка к действию УФ-света в дозах 151-953 Дж/м . Однако их ответная реак О ция на воздействие больших доз (1359-4530 Дж/м ) аналогична таковой ок-сиформы гембелка без модификатора. Процессы, обеспечивающие фотопротекторное действие ОБН, реализуются по двум основным путям: за счет дезактивации активных форм кислорода, образующихся при УФ-облучении водных растворов гемопротеида, и за счет формирования смешанного дисульфида 0-8-8-НЬ, что снижает подвижность его полипептидных цепей и тем самым тормозит процессы фотоокисления хромофоров под действием УФ-света. Только большие дозы УФ-излучения могут разорвать прочные ди-сульфидные мостики 0-8-8-НЬ, лабилизировать молекулу белка и нивелировать защитное действие глутатиона.

151 Дж/см ) на смеси оксигемоглобина с вЗМ) приводит к обратному эффекту: процессам перехода атома железа гема из трехвалентного в двухвалентное состояние и фотопревращению окисленной формы гембелка в низкоспиновую. Следовательно, процедуру облучения крови малыми дозами УФ-излучения можно использовать для нивелирования отрицательных последствий воздействия низкомолекулярных тиолсодержа-щих соединений на гембелки.

Было установлено, что наиболее фотоустойчивыми оказались оксиге-нированные и нитрозилированные молекулы гемоглобина человека, фракционный состав которых после облучения УФ-светом оставался неизменным, при одновременном перераспределении белка между фракциями. УФ-облу-чение карбокси- и метформы гемоглобина приводило к появлению новых фракций с электрофоретическими показателями, значительно отличающимися от необлученных образцов, что характеризует их большую фотолабильность и неустойчивость по сравнению с окси- и нитрозоформой.

Таким образом, согласно данным гель-хроматографии и электрофореза

I ответной реакцией разнообразных форм гемоглобина на изменения внешней среды (ионного состава и рН ближайшего микроокружения, действия электродвижущих сил и квантов УФ-света) являются ослабление и разрыв или усиление и образование новых дополнительных межсубъединичных контактов, приводящих или к изменению фракционного состава, или к перераспределению белка между отдельными фракциями гемопротеида.

Высокую способность гемопротеидов и других сложных олигомерных ^ белков к процессам ассоциации-диссоциации составляющих их субъединиц следует учитывать при изучении проблем самоорганизации биологических макромолекул (О. В. Путинцева, В.Г. Артюхов, 1995), механизмов регуляции гомеостаза организма человека и животных, установлении взаимозависимых переходов отдельных форм гемоглобина вследствие УФ-облучения его изолированных растворов или цельной крови в условиях проведения АУФОК-терапии, а также изучении функциональных свойств нативных белковых глобул и их составных компонентов или комплексов с другими органическими и неорганическими веществам. ) Нами было проанализировано влияние на структуру гемоглобина другого физического фактора - температуры. Так, применение совокупности выше перечисленных методов исследования позволило нам определить наи более оптимальные сроки сохранения отдельных физико-химических характеристик молекул гемоглобина (размеры, гетерогенность, кислородсвязы-вающую способность) в процессе длительного термостатирования консервированной крови доноров, а, следовательно, и наиболее приемлемые сроки использования последней для переливания реципиентам. Сравнительный анализ кинетики термоинактивации синтезируемых de novo гемопротеидов (комплексы Hb-ДАД разного типа) с таковой нативного гемоглобина дал дополнительную информацию о природе и прочности связей, возникающих между модификатором и белком, выявил повышенную степень устойчивости химически измененного гембелка к действию денатурирующего фактора. Это позволяет рассматривать диальдегиддекстран как эффективный модификатор и перспективный стабилизатор структурно-функционального состояния белковых макромолекул, сохраняющий их биологически важные свойства и способность выполнять физиологическую роль в организме при изменении условий среды.

331

Информация о работе

Путинцева, Ольга Васильевна
доктора биологических наук
Воронеж, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Структурно-функциональные свойства некоторых лигандных форм гемоглобина человека в условиях УФ-облучения и различного микроокружения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы