Исследование структурно-функциональных свойств молекул гемоглобина человека, модифицированных некоторыми производными декстрана и полиэтиленгликолем

Савостин, Владислав Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование структурно-функциональных свойств молекул гемоглобина человека, модифицированных некоторыми производными декстрана и полиэтиленгликолем
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование структурно-функциональных свойств молекул гемоглобина человека, модифицированных некоторыми производными декстрана и полиэтиленгликолем"

На правах рукописи

Савостин Владислав Сергеевич

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ МОЛЕКУЛ ГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА, МОДИФИЦИРОВАНПЫХ НЕКОТОРЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ДЕКСТРАНА И ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ

Специальность 03 00 02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж 2008

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель

доктор биологических наук,

профессор, заслуженный деятель науки РФ

Артюхов Валерий Григорьевич

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Бузлама Виталий Соломонович

кандидат биологических наук, доцент Рохас-Риоха Ирина Евгеньевна

Ведущая организация

Московский государственный университет им МВ Ломоносова

Защита состоится «18» апреля 2008 г в 1300 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212 038 03 при Воронежском государственном университете по адресу 394006, г. Воронеж, Университетская пл, 1, ауд 59

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета

Автореферат разослан « ¿5» марта 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Грабович М Ю

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Кровь является уникальной биологической средой, способной обеспечивать и поддерживать гомеостаз организма человека

В настоящее время в связи с увеличением частоты возникновения чрезвычайных ситуаций- природных катаклизмов (землетрясения, цунами), террористических актов, автомобильных катастроф, а также ростом числа операций по пересадке органов и тканей, постоянно возрастает потребность в трансфузии цельной крови и ее отдельных компонентов (Б А Барышев, 2005) Недостаток донорской крови и наличие ряда ограничений по ее использованию опасность передачи при переливании бактериальных и вирусных инфекций (SM Fakhry, GF Sheldon, 1995, GВ Schreiber et al, 1996), возможность несовместимости донорской крови и крови реципиента по антигенному составу, короткие сроки хранения, требуют создания искусственных кровезаменителей (М G Scott et al, 1997, R M Winslow, 2002)

Важнейшим компонентом крови является гемоглобин, который обеспечивает полноценное снабжение организма человека кислородом, что приобретает особую значимость при развитии различных латологичесхих состояний

В связи с этим весьма актуальным является разработка кислородпере-носящих растворов на основе гемоглобина, химически модифицированного некоторыми органическими молекулами, защищающими его от разного рода внешних воздействий (Н.П Кузнецова и соавт, 2002, С. Jm et al, 2004, Р W Buehler et al, 2006) Несмотря на определенные успехи в этой области, необходимо продолжать поиск химических соединений и способов модификации молекул гемоглобина с целью эффективной регуляции свойств гемопротеида и снижения степени отрицательных эффектов введения растворов гембелка в организм человека

В качестве таких веществ нами были выбраны представители высокомолекулярных полианионов, производные декстрана - реополиглюкин (РП) и диальдегидцекстран (ДАД), а также полиэтиленгликоль (ПЭГ), нашедшие применение в молекулярной биологии и медицине (И П Гладышева и соавт, 2001; AB Максименко и соавт, 2001, ИН Топчиева и соавт, 1998, AS Morar et al, 2006)

Таким образом, проведение экспериментов по поиску соединений, эффективно модулирующих функциональную активность гемоглобина, и изучение влияния данных веществ на структурно-функциональные свойства молекул гембелка имеют важное теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы явилось исследование структурно-функциональных свойств гемоглобина человека, модифицированного препаратами на основе нативного декстрана (реополиглюкин), его окисленного производного (диальдегидцекстран) и поли-этиленгликолем.

В связи с этим перед нами стояли следующие задачи

1 Исследовать физико-химические характеристики молекул гемоглобина человека, модифицированных ПЭГ и препаратами на основе декст-рана

2 Изучить механизмы взаимодействия молекул гемоглобина человека с реополиглюкином, диальдегидцекстраном и полиэтиленгликолем

3 Исследовать термостабильность и химическую устойчивость молекул модифицированного гемоглобина человека

4 Построить и проанализировать компьютерные модели диальде-гиддекстрана и его комплексов с гемоглобином человека

Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным анализу влияния реополиглюкина, диальдегиддекстрана и поли-этиленгликоля на структурно-функциональные свойства интактных, термостатированных и модифицированных гуанидин-гидрохлоридом (ГГХ) молекул гемоглобина человека

Выявлены оптимальные условия для связывания гемоглобина с ДАД, позволяющие получать модифицированные образцы гемоглобина с определенными размерами, молекулярными массами и физико-химическими свойствами Изучены механизмы взаимодействия молекул гемоглобина человека с реополиглюкином и ДАД

Установлена возможность формирования комплекса гемоглобина человека с ПЭГ при создании повышенного давления в реакционной среде

Обнаружено, что производные декстрана повышают устойчивость белковых молекул к денатурирующим факторам, что позволяет относить данные соединения к весьма перспективным агентам для модификации гемопротеида с целью создания искусственных кровезаменителей

Созданы пространственные модели молекулы ДАД, комплексов гемо-глобин-ДАД I и II типов. Установлены номера аминокислотных остатков глобина, с наибольшей вероятностью участвующих в формировании связей с полисахаридом Методом молекулярной динамики показано сохранение кон-формационной лабильности гемовой группы и отдельных субъединиц относительно друг друга, что свидетельствует о способности конъюгатов гемо-глобин-ДАД к обратимой оксигенации

Разработана схема процессов, протекающих в растворах интактных и модифицированных РП, ДАД и ПЭГ молекул гемоглобина человека при воздействии температуры и ГГХ, позволяющая проследить взаимосвязь между изменениями в структуре гемопротеида и проявлением его физико-химических свойств

Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления об особенностях структурно-функционального состояния гемоглобина человека в условиях различного микроокружения

Результаты изучения физико-химических свойств препаратов гемоглобина в присутствии РП, в комплексах с ПЭГ и химически модифицированного гембелка (различные комплексы гемоглобин-ДАД) необходимо принимать во внимание при рассмотрении вопросов, связанных с созданием искусст-

венных кровезаменителей

Экспериментальные данные по исследованию механизмов взаимодействия молекул гемоглобина человека с РП, ДАД и ПЭГ могут быть использованы специалистами, работающими в области молекулярной биологии и биофизики, а также лицами, занимающимися синтезом новых лекарственных средств и биологически активных молекул, что позволит более успешно решать проблемы стабилизации биологических свойств и функций изучаемых соединений

Материалы работы используются в учебном процессе кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского государственного университета при проведении практикумов, выполнении дипломных и магистерских работ студентами

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 8 Международной конференции по химии и физикохимии оли-гомеров «Олигомеры - 2002» (Черноголовка, 2002), VII Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), XIX Съезде физиологов России (Екатеринбург, 2004), Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004), VIII Международной научно-экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004), научно-практической конференции «Скорая медицинская помощь реальность и перспективы» (Воронеж, 2006), Научных сессиях сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2005,2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей и 6 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1 Диальдегиддекстран является эффективным модулятором структурно-функциональных свойств молекул гемоглобина человека и способен значительно повышать устойчивость гемопротеида к действию физических и химических денатурирующих факторов

2. Полиэтиленгликоль при высоком давлении в растворе образует комплексы с гемоглобином человека, увеличивает компактность белковой глобулы и понижает термочувствительность молекул гемопротеида

3. Компьютерные модели трехмерной пространственной структуры декстрана, диальдегиддекстрана, комплексов гемоглобин-диальдегиддекстран I и II типов

4. Схема процессов, протекающих в растворах интактных, термостатированных и модифицированных гуанидин-гидрохлоридом молекул гемоглобина человека в присутствии реополиглюкина, диальдегиддекстрана и полиэтиленгликоля

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 151 страницу машинописного текста, 9 таблиц, 45 рисунков. Состоит из «Введения», 6 глав, «Заключения» и «Выводов» В списке цитируемой литературы 155 работ, из них 78 отечественных и 77 зарубежных.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе представлен свод основных работ, посвященных структуре, физико-химическим и функциональным свойствам гемоглобина человека Проведен анализ проблемы создания искусственных кровезаменителей на основе растворов гемопротеида Дана краткая характеристика структуры, физико-химических свойств препаратов на основе растворов низкомолекулярного декстрана и полиэтиленгликоля и рассматриваются области их применения в биологии и медицине

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Гемоглобин выделяли из крови доноров по методу D L Drabkm (1946) с модификациями Л А Блюменфельда (1957), в основе которого лежит осмотический гемолиз эритроцитов

Гемоглобин инкубировали с растворами РП (ОАО "Красфарма", Россия) при температуре 37 °С в течение 3 ч Конечное молярное соотношение белок декстран составляло 1 1 и 1 4 Приготовление ДАД из РГ1 проводили с помощью реакции периодатного окисления (Методы химии углеводов, 1967) Степень окисления ДАД (у) определяли методом йодометрического титрования (В А Боландин, 1957) Отмывку конъюгата гемоглобин-ДАД от несвя-завшегося белка, определение его фракционного состава и величин кажущейся молекулярной массы фракций осуществляли методом гель-фильтрации (Г Детерман, 1970) Содержание полисахарида в конъюгатах гемоглобин-ДАД определяли по методу М Дюбуа (И П Гладышеваи соавт., 2001)

Гемоглобин модифицировали ПЭГ с молекулярной массой, равной 4 кДа Повышенное давление создавали путем центрифугирования в течение 1 ч при температуре 25 °С и 15 ООО g Молярное соотношение гемоглобин ПЭГ в растворе составляло 1.200 Очистку раствора гемоглобина от несвязавших-ся молекул ПЭГ проводили с помощью метода гель-хроматографии на колонке, заполненной сефадексом G-25 ("Pharmacia", Швеция).

Гель-фильтрацию растворов нативного и модифицированного гемопротеида проводили по методу Г Детермана (1970) на хроматографических колонках, упакованных сефадексом G-100 ("Pharmacia", Швеция) и уравновешенных натрий-фосфатным буфером, рН 7,4

Регистрацию электронных спектров поглощения (ЭСП) растворов гемоглобина осуществляли на спектрофотометре СФ-46 или СФ-56 (ЛОМО, Россия) в диапазоне длин волн 230-650 нм

Для вычисления процентного содержания основных лигандных форм гемоглобина использовалась эмпирическая система уравнений (A Zwart et al., 1984, Л К Стусь, Е Д. Розанова, 1992)

Количество реакционноспособных SH-групп в молекулах гемоглобина определяли спектрофотометрическим титрованием ПХМБ по методу Т W Thannhauser et al (1984)

Электрофоретические характеристики гемоглобина и его производных исследовали методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле (ГМаурер, 1971) Используя денситограммы образцов гембелка, рассчитывали электрофоретическую подвижность (ЭП) фракций, процентное содержание белка в них и ширину отдельных полос

Молекулярные массы электрофоретических фракций нативного гемо-протеида, а также его комплексов с ДАД определяли методом электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли (U К Laemmly, 1980)

Определение природы ионогенных групп, участвующих в образовании комплекса гемоглобин-ДАД, осуществляли методом протеолитического титрования, количество ионогенных групп в расчете на одну молекулу белка и величины буферной емкости растворов гемоглобина определяли по методике, описанной В Г. Артюховым и соавт (2001)

Химическую устойчивость гемоглобина в присутствии реополиглюки-на, ПЭГ и ДАД оценивали после модификации ГГХ в концентрациях 0,1-6 моль/л Время инкубирования исследуемых образцов равнялось 30 мин

Растворы нативного и модифицированного гемоглобина инкубировали в термостате UTU-4 в диапазоне температур 30 - 80 °С в течение 30 мин, а затем охлаждали до комнатной температуры не менее 20 мин, после чего исследовали их физико-химические свойства О термопревращениях гемопро-теида в присутствии модификаторов судили на основе анализа изменений интенсивности светорассеяния т (%) растворов гемоглобина, которую рассчитывали по величине коэффициента светопропускания (Т) образцов при Х= 490 нм

Для создания трехмерных пространственных моделей гема, гемоглобина человека, декстрана, ДАД, а также комплексов гемоглобин-ДАД I и II типов использовали программный пакет HyperChem 7 0 Professional. С целью поиска наиболее вероятной конформации исследуемых молекул производили оптимизацию их геометрии методом молекулярной механики (J -Н Ln, N.L Allmger, 1991) с силовым полем OPLS (WL. Jorgensen, J Tirado-Rives, 1988) с использованием алгоритма сопряженных градиентов Полака-Рибери (S J Weiner et al., 1986). Расчет состояния электронных оболочек атомных групп боковых радикалов аминокислот Hb осуществляли полуэмпирическим кван-тово-химическим методом РМЗ (J J Р Stewart, 2000) Динамику атомного остова молекулы гемоглобина изучали с помощью метода молекулярной динамики (МД), который рассчитывает непрерывную фазовую траекторию движения каждой частицы во времени (М.Р. Allen, D J Tidesley, 1989) Расчеты методом МД проводили при температуре 310 К Длительность расчета составляла 1 пс с шагом 0,001 пс

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакета прикладных программ "Stadia", контрольные и опытные показатели сравнивали по t-критерию Стьюдента при 95%-ном уровне значимости

ГЛАВА 3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И СТРУКТУРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МОЛЕКУЛ ГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА, МОДИФИЦИРОВАННОГО РЕОПОЛИГЛЮКИНОМ И ДИ-АЛЬДЕГИДДЕКСТРАНОМ

Целью первого этапа исследований явилось изучение механизмов взаимодействия молекул гемоглобина человека с РП и ДАД, знание которых позволит проследить, как отражается модификация определенных участков молекулы гемопротеида на его физико-химических и функциональных свойствах

Инкубирование гемоглобина с РП (молярное соотношение белок полисахарид = 1 4) в течение 3 ч при 37 °С не влияло на фракционный состав гембелка, но вызывало возрастание его кажущейся молекулярной массы от 63,2+1,3 до 67,4+1,5 кДа, что свидетельствует об изменении расположения полипептидных цепей в белковых глобулах, сопровождающихся частичным разворачиванием и увеличением их объема При этом гемоглобин и полисахарид элюировали из хроматографической колонки в разных фракциях, следовательно, между ними не образуются прочные (ковалентные) связи

Нами было установлено, что наилучшими условиями для связывания гемоглобина с ДАД являются величина pH среды, равная 7,4, температура инкубации - 37 °С; время инкубации - 3 ч, степень окисления полисахарида-

10 %, а структура образующихся комплексов гемоглобин-ДАД зависит от исходного соотношения белок полисахарид в реакционной среде

Конъюгат гемоглобин-ДАД I типа, полученный при молярном соотношении белок-декстран, равном 1:1, элюировал из хроматографической колонки одной фракцией с молекулярной массой 103,4±4,3 кДа, что свидетельствует о полном связывании гемоглобина с ДАД и об однородности его состава. Весовая доля гемоглобина в конъюгате достигала 62 %

Коньюгат гемоглобин-ДАД П типа, полученный при молярном соотношении белок декстран, равном 5:1, при гель-фильтрации разделялся на две гемсодержащие белковые фракции Молекулярная масса гембелка 1-ой фракции составляла 225,4±3,3 кДа, весовая доля гемоглобина - 82,7%, а молярное соотношение белок-декстран - 3-1 По-видимому, в данном виде конъюгата три молекулы гемоглобина связываются с одной молекулой ДАД Молекулярная масса белка в составе 2-ой фракции имела значение, характерное для нативного гемоглобина - 63,2±2,1 кДа.

Электрофоретические характеристики смесей гемоглобин-РП не отличались от таковых нативного гемопротеида (рис 1), которые в условиях эксперимента разделяются на три фракции с процентным соотношением белка, равным 95,30 2,87:1,83 и соответствуют гемоглобинам А, F и А2 (J W. Drys-daleetal., 1971)

Электрофоретические характеристики конъюгатов гемоглобин-ДАД I и

11 типов в неденатурирующих условиях были очень близки наблюдалось образование только одной фракции, ЭП которой несколько возросла по сравне-

нию с основной фракцией нативного белка. Это можно объяснить блокированием положительно заряженных аминогрупп аминокислотных остатков гемоглобина, участвующих во взаимодействии с альдегидными группами ДАД, что приводит к увеличению суммарного отрицательного заряда молекул гемопротеида.

тами декстрана гемоглобина человека в не-

Ш ер 1Ш плекс гемоглобин-ДАД I типа; 4 - комплекс

\ ШЯ гемоглобин-ДАД II типа; БФС - бромфено-

: ".'"'Г! ловый синий

'; ;||' - Ц

;; vj j i i Таким образом, выявленная нами од-

¿Д ' t mi •' /i.-^Й породность конъюгатов гемоглобин-ДАД Ba>L Щщ. ¿У : Ц~. ;позволит упростить процесс создания искус-

Ж& '' -¿43 ственных кровезамещающих растворов и

более тонко управлять кислородтранспортными свойствами модифицированного гемопротеида.

При электрофорезе в присутствии ДСН нативный и инкубированный с РП гемоглобин человека давал одну фракцию (рис. 2), молекулярная масса которой (16,7+0,4 и 16,3±0,5 кДа) соответствовала отдельной субъединице гембелка.

На электрофореграммах гемоглобин-ДАД I типа в присутствии ДСН были обнаружены две фракции: минорная (2,4±0,8 %), быстро мигрирующая фракция с молекулярной массой 16,8+0,6 кДа и основная (97,6±1,2 %), медленная фракция (106,2±5,6 кДа). Можно констатировать, что этот вид комплекса формируется при многоточечном взаимодействии молекулы декстрана со всеми четырьмя субъединицами гембелка.

Конъюгат гемоглобин-ДАД II типа при электрофорезе в ПААГ в присутствии ДСН также разделялся на две фракции: мономерную (17,3+0,5 кДа) и высокомолекулярную (163,2+15,8 кДа). 1-я фракция содержала 44,6±0,5 %, а 2-я - 55,4±0,7 % от общего количества белка. По-видимому, 44,6 % субъединиц тетрамерных молекул исходного гемоглобина не вступает во взаимодействие с ДАД и легко распадается на отдельные субъединицы под действием ДСН. Однако другая часть (55,4 %) полипептидных цепей гембелка оказалась прочно связанной с ДАД, и молекулы детергента не могут разорвать связи, установившиеся между такими субъединицами и ДАД, что приводит к формированию высокомолекулярных комплексов, в которых, по нашему мнению, одна молекула декстрана образует контакты в среднем с двумя субъединицами каждой из трёх молекул гемоглобина.

Рис. 2. Электрофореграммы нативно-го и модифицированного различными препаратами декстрана гемоглобина человека в присутствии ДСН

Обозначения: 1 - белки-маркеры: А-лизоцим (14,4 кДа); В - ингибитор трипсина (21,5 кДа); С - карбоангидраза (31,0 кДа); Б - яичный альбумин (45 кДа); Е -бычий сывороточный альбумин (67 кДа); Б - целлюлаза (94 кДа); в - ферритин (220 кДа); 2 - нативный гемоглобин; 3 - гемоглобин, инкубированный с РП; 4 - комплекс гемоглобин-ДАД I типа; 5 - комплекс гемоглобин-ДАДII типа

Для выявления природы и количества групп, участвующих в образовании комплексов гемоглобин-ДАД, использовали метод протеолитического титрования (рис. 3). Было установлено уменьшение кислотной буферной емкости конъюгата гемоглобин-ДАД I типа по сравнению с таковой интактного гемоглобина на величину, соответствующую 8 аминокислотным остаткам на одну молекулу гембелка, 6 из которых, вероятно, принадлежат лизину и 2 — гистидину. Одна молекула гемоглобина, входящая в комплекс II типа, содержала на 5 титруемых аминокислотных остатков меньше, чем нативный гемо-протеид. При этом 1 аминокислотный остаток, по-видимому, принадлежит гистидину, а 4 - лизину.

Возможные химические реакции при взаимодействии гемоглобина с ДАД можно представить следующей схемой:

ОАО-

-НЬ

РАО-

= Ы—НЬ

ОАО-

+ Ч

-сн,—НЬ

ОАР-

Н--СН-

ОН

снг—нь

н н

Введение РП в раствор гемоглобина человека не приводило к появлению новых пиков, изменению положения максимумов его ЭСП и процентного соотношения основных лигандных форм, что свидетельствует о сохранении гемоглобина преимущественно в оксиформе.

Отмечались существенные изменения формы ЭСП растворов комплексов гемоглобин-ДАД I типа, указывающие на окисление железопорфирина в молекулах гемоглобина и образование метформы белка: доля НЪОг в растворе снижалась до 51,5%, а количество НЬ и МШЬ увеличивалось соответственно до 43,0% и 5,5%. Следовательно, связывание гемоглобина с ДАД при-

водило к повышению степени диссоциации молекул НЬОг на НЪ и кислород, а более высокая подверженность молекул дезоксигемоглобина процессам ау-тоокисления по сравнению с оксиформой (Л.И. Иржак, 1975) способствовала накоплению МШЪ в растворе.

Число титруемых ионогенных групп

Рис. 3. Количество титруемых ионогенных групп в растворах нативного и модифицированного гемоглобина человека

Обозначения:

а - нативный гемоглобин; б - гемоглобин, инкубированный с РП; в - комплекс гемоглобин-ДАД I типа; г - комплекс гемоглобин-ДАДII типа

Формирование комплекса гемоглобин-ДАД II типа не влияет заметным образом на электронную структуру же-лезопорфириновой группы (гембелок сохранялся преимущественно в окси-форме).

Таким образом, применение комплекса вышеописанных биофизических методов позволило детально изучить механизм взаимодействия молекул гемоглобина человека с реополиглюки-ном и ДАД, а также выявить особенности изменений в структуре молекул

-11

Диапазон рН

модифицированного гемопротеида.

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ РЕОПОЛИГЛЮКИНА И ДИАЛЬДБГИД-ДЕКСТРАНА НА УСТОЙЧИВОСТЬ МОЛЕКУЛ ГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА К ДЕЙСТВИЮ ДЕНАТУРИРУЮЩИХ ФАКТОРОВ

Целью второго этапа исследований явилось изучение влияния модификации структуры молекул гемоглобина человека РП и ДАД на стабильность белковой глобулы. В качестве денатурирующих агентов бьши выбраны как физический фактор - воздействие температуры, так и химический - гуани-дин-гидрохлорид.

Нагревание растворов нативного и модифицированного гемоглобина человека в диапазоне температур 37 — 80 °С приводит к однонаправленным изменениям структуры молекул гемопротеида, которые заключаются в переходе низкоспиновой формы (НЬ02) в высокоспиновые (НЬ, МШЪ).

Для растворов интактного гемоглобина и комплексов гемоглобин-ДАД II типа было характерно возрастание интенсивности светорассеяния (т) после инкубации при 45 -55 °С, что свидетельствует об увеличении размеров молекул белка в результате ослабления множества нековалентных связей, под-

держивакнцих его нативную конформацию При 60 °С вследствие денатурации гемопротеидов величину светорассеяния их растворов зарегистрировать не удалось

Инкубирование смесей гемоглобин-РП при 42-50 °С не вызывало изменения интенсивности их светорассеяния По-видимому, введение реополиг-люкина затрудняет разворачивание белковой глобулы при вышеуказанных температурах

Нагревание конъюгатов гемоглобин-ДАД I типа приводит к плавному возрастанию величины т по сравнению с уровнем нативного гембелка во всем изучаемом диапазоне температур (37 - 75 °С) от 28,15±0,24 % до 41,34±1,54 % Это указывает на существенную лабильность субъединиц в составе тетрамерной молекулы модифицированного гемопротеида при данных температурах, но не наблюдаются процессы агрегации молекул белка, а температура денатурационного перехода смещается к 80 °С Следовательно, связывание гемоглобина человека с ДАД (комплекс I типа) значительно повышает термостабильность белковых молекул

Выявлено, что ГГХ в концентрации 0,1 моль/л не влияет на положение максимумов ЭСП всех изучаемых растворов гемоглобина Повышение содержания ГГХ до 1 моль/л приводит к конформационным изменениям, затрагивающим глобиновый и гемовый компоненты гемопротеида Более высокие концентрации гуанидин-гидрохлорида (4 и 6 моль/л) вызывают структурные перестройки денатурационного характера

Анализ процентного изменения оптической плотности при 275 нм и в полосе Соре изучаемых форм гембелка (рис 4) показал, что наиболее чувствительным к действию малых концентраций ГГХ (0,1 и 1 моль/л) оказался глобиновый компонент комплекса гемоглобин-ДАД I типа и нативного гемоглобина При действии 4 и 6 моль/л раствора ГГХ наиболее глубокие изменения происходят в гемовой части исследуемых белков, при этом степень стабильности молекул возрастала в ряду: комплекс гемоглобин-ДАД П типа -гемоглобин, модифицированный РП - нативный гемоглобин - комплекс гемо-глобин-ДАД I типа Следовательно, стабилизирующее действие реоподиглю-кина и ДАД в комплексе II типа наблюдается при сравнительно малых концентрациях денатурирующего агента, а ДАД в комплексе 1 типа повышает устойчивость гембелка к более высоким концентрациям ГГХ

Таким образом, производные декстрана являются не только эффективными регуляторами функциональных свойств гемоглобина человека (Е. Ве1-1ас11епе е1 а!, 1983, У .Па еХ а!, 2004Ь), но и повышают устойчивость белковых молекул к денатурирующим факторам, что позволяет относить данные соединения к весьма перспективным агентам для модификации гемопротеида с целью создания искусственных кровезаменителей Наряду с этим, ДАД может быть использован в экспериментах по синтезу биоактивных веществ и лекарственных средств для сохранения их биологически важных свойств и способности выполнять физиологическую роль в организме при изменении условий среды

Рис. 4. Процентное изменение оптической плотности при 275 нм (А) и в полосе Соре (Б) растворов нативного и модифицированного гемоглобина человека в присутствии различных концентраций ГТХ

Обозначения:

1 - нативный гемоглобин;

2 - гемоглобин, инкубированный с рео-полиглюкином;

3 - комплекс гемоглобин-ДАДI типа;

4 - комплекс гемоглобин-ДАД II типа

ГЛАВА 5. СОЗДАНИЕ И АНАЛИЗ КОМПЬЮТЕРНЫХ МОДЕЛЕЙ КОМПЛЕКСОВ ГЕМОГЛОБИН-ДИАтДЕГИДДЕКСТР АН

Для уточнения характера взаимодействия молекул гемоглобина и ДАД при формировании комплексов I и II типов, а также для расчета некоторых параметров как самого процесса взаимодействия, так и свойств образующихся конъюгатов нами был использован метод компьютерного моделирования.

С помощью программного пакета HyperChem 7.0 Professional нами была построена трехмерная модель молекулы декстрана, состоящей из 200 мономерных остатков, и рассчитана её оптимальная конформация.

Для нахождения номеров а-1,6-В-глюкопиранозных остатков декстрана, окисление которых периодатом натрия наиболее вероятно, нами была определена длина связей между атомами С2 -С3 и Сз - Сд для каждого (из 200) углеводного остатка. Исходя из предположения, что легче окисляются связи, обладающие большей длиной, а, следовательно, меньшей энергией (Л.В. Гурвич и соавт., 1974), мы выделили именно те глюкопиранозные остатки, которые имели максимальные значения длин связей и для пары Сг -Сз, и для пары Сз - С4.

Таким образом, с помощью программы HyperChem 7,0 была создана трехмерная модель молекулы ДАД (рис. 5) и определены места нахождения в ней альдегидных групп.

Для построения трехмерной пространственной модели молекулы гемоглобина использовали базу данных структуры белков, полученную с помощью метода рентгеноструктурного анализа (РСА), а именно данные М. Paoli et al. (1996), размещенные на сайте www.expasy.org. Нами с помощью метода молекулярной механики с силовым полем OPLS рассчитана оптимальная

конформация молекулы гемоглобина, для которой характерен минимум потенциальной энергии.

гемоглобина с ДАД.

При определении номеров аминокислотных остатков лизина и гисти-дина, с наибольшей вероятностью участвующих в образовании связей с ДАД, мы исходили из двух критериев: стерического и энергетического. Для оценки энергетического критерия боковых радикалов аминокислот было исследовано электронное состояние их функциональных групп. Реакционную способность этих групп определяли по величине энергетической щели (рис. 6), которая равнялась разнице энергии между верхней заполненной молекулярной орбиталью (ВЗМО) и нижней вакантной молекулярной орбиталью (НВМО). Размер энергетической щели показывает, какое количество энергии необходимо сообщить системе для перевода ее в возбужденное (активное) состояние. Чем меньше эта величина, тем выше реакционная способность молекулы.

Стерический критерий учитывали визуально по положению аминокислотного остатка в белковой глобуле. Сопоставление вышеуказанных двух критериев позволило определить аминокислотные остатки лизина и гистиди-на, участвующих в образовании связей с ДАД. Ими оказались 60а, 90а, 59Р аминокислотные остатки лизина и 45а, 77(5 - гистидина.

Рис. 5. Пространственная модель молекулы диальдегиддекстра-на

Основываясь на экспериментальных данных, полученных ранее с использованием современных биофизических методов, мы попытались создать модели комплексов

эВ

7 6 5 4 3 2

Номер остатка гистиднна

номер остатка лиаина

Рис. 6. Величина энергетической щели функциональных групп лизина и гистидина в молекуле гемоглобина человека

Итак, на основании совокупности экспериментальных данных и эмпирических расчетов нами были созданы компьютерные трехмерные модели комплексов гемоглобин-ДАД I и II типа (рис. 7 и 8).

Рис. 7. Пространственная структура комплекса гемоглобин-ДАД I типа

Рис. 8. Пространственная структура комплекса гемоглобин-ДАД II типа

Методом поиска корреляционных зависимостей между структурой и свойствами соединений (Quantitative Structure-Activity Relationships - QSAR) эмпирически рассчитаны объём и степень гидрофобности молекулы гемоглобина.

Выявлено уменьшение объёма молекулы гемопротеида в составе комплексов с ДАД I и П типа на 7,8 % и 4,0-10,0 % соответственно.

Показано увеличение полярности белковой глобулы при образовании комплексов гемоглобин-ДАД I и II типов. Следствием этого является увеличение гидрофобных взаимодействий, поддерживающих стабильность молекул гемоглобина. Данный факт позволяет объяснить (установленную нами) большую стабильность конъюгированного с ДАД гемоглобина по отношению к действию ГТХ, вызывающего денатурацию белка, в основном, за счет ослабления гидрофобных взаимодействий.

Методом МД показано, что при взаимодействии гемопротеида с ДАД сохраняется конформационная лабильность гемовой группы и отдельных субъединиц относительно друг друга, что свидетельствует о способности комплексов гемоглобин-ДАД к обратимой оксигенации, а, следовательно, к эффективной транспортировке кислорода.

ГЛАВА 6. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПОЛИЭТИЛЕНГЛЖОЛЯ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И СТАБИЛЬНОСТЬ МОЛЕКУЛ ГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА

Нами исследована возможность формирования комплексов гемоглобин-ПЭГ при повышенном давлении (16 МПа). После центрифугирования гемопротеида с ПЭГ (в течение 1 ч при температуре 25 °С и 15 ООО g) гембе-лок элюировал из хроматографической колонки одной фракцией с кажущейся молекулярной массой 71,6±1Д кДа (рис. 9), что свидетельствует об однородности состава модифицированных молекул гемопротеида. О

Рис. 9. Профиль элюции на-тивного и модифицированного ПЭГ гемоглобина человека

Обозначения: 1 - нативный гемоглобин; 2 - гемоглобин, модифицированный ПЭГ; оптическая плотность элюата при 414 нм (а) и 275 нм (б)

При модификации гемоглобина ПЭГ сохраняется форма ЭСП его растворов. Зарегистрировано снижение оптической плотности при 275 нм, что может быть связано с экранированием молекулами ПЭГ ароматических аминокислотных остатков гем-белка. Наряду с этим, отмечается повышение интенсивности поглощения гембелка в полосе Соре на 7 %, а также незначительное увеличение а- и (3-максимумов. Однако статистически достоверных отличий содержания основных лигандных форм гемопротеида после его модификации ПЭГ обнаружено не было.

При титровании раствора модифицированного ПЭГ гембелка наблюдалось снижение кислотной буферной емкости в области значений рН 3-5 и 5-8 на 14,3 и 7,5 % соответственно. Учитывая низкую химическую активность ПЭГ, можно заключить, что уменьшение количества доступных для титрования диссоциирующих групп в молекуле гемоглобина, наиболее вероятно, связано с частичным экранированием ПЭГ поверхности гембелка и процессами компактизации белковой глобулы.

Анализ электрофореграмм аддуктов гемоглобин-ПЭГ позволил выявить, как и в случае нативного гемоглобина, три электрофоретические фракции (рис. 10). Снижение электрофоретической подвижности фракций согласуется с данными, полученными с помощью кислотно-основного титрования, и также свидетельствует об уменьшении суммарного поверхностного заряда молекул модифицированного гемоглобина.

Рис. 10. Электрофореграммы нативного и модифицированного полиэтиленгликолем гемоглобина человека в неденатурирующих условиях

Обозначения: 1 — нативный гемоглобин; 2 - гемоглобин, модифицированный полиэтиленгликолем; БФС -бромфеноловый синий

Таким образом, образование комплекса гемоглобин-ПЭГ приводит к конформационным изменениям белковой глобулы гемопротеида, затрагивающим ге-мовый компонент, но валентное состояние атома железа в геме и степень насыщения гемоглобина кислородом при этом не изменяются. Это соответствует данным, согласно которым при химическом связывании ПЭГ с гемоглобином последний сохраняет свои функциональные свойства и способен к эффективному транспорту кислорода (Т. Ни е1 а1., 2007; Ы. МеНсе е! а1., 2007).

Для изучения влияния ПЭГ на устойчивость молекулы гемопротеида к действию температуры и ГГХ регистрировали изменение интенсивности светорассеяния его растворов и динамику соотношения лигандных форм гемоглобина.

Направление изменения соотношения основных лигандных форм гемоглобина, модифицированного ПЭГ, при нагревании полностью совпадает с таковым, характерным для термостатированных растворов интактного гем-белка. Следовательно, ПЭГ не влияет на термостабильность гемовой группировки гемоглобина.

Формирование комплекса гемоглобин-ПЭГ сопровождалось снижением величины т при температуре 25 °С от 24,28±0,17 % (нативный гемоглобин) до 23,87±0,18 %, что ещё раз подтверждает процесс компактизации белковой молекулы. Нагревание растворов модифицированного гембелка до 37 °С не вызывало статистически достоверного изменения интенсивности светорассеяния. Инкубирование при более высоких температурах (45 - 55 °С) приводило к повышению значения тдо 25,89±0,18 %. Выявлено, что процесс разворачивания молекул гемоглобина в составе комплекса с ПЭГ при увеличении температуры в диапазоне 25 — 55 °С происходит менее интенсивно, чем в случае нативного гемопротеида. При температуре раствора 60 °С регистрируется необратимая денатурация модифицированного гемопротеида.

Добавление к раствору комплекса гемоглобин-ПЭГ ГГХ в концентрации 0,1 моль/л не влияло на интенсивность светорассеяния при температурах 25 и 37 °С. Последующее повышение температуры приводило к росту величины х до 29,68±0,24 % (55 °С). При 60 °С регистрируется помутнение растворов гембелка вследствие агрегации белковых глобул. Увеличение количества денатуранта в растворе до концентраций 1-гб моль/л и нагревание в диапазоне 25-^60 °С индуцировало значительное увеличение объема молекул ге-

моглобина, модифицированных ПЭГ Температура необратимого денатура-ционного перехода при концентрации ГГХ 4 и 6 моль/л составляет 55 и 50 °С соответственно. Изменения величины т растворов комплекса гемоглобин-ПЭГ по сравнению с таковыми растворов нативного гемоглобина при тех же условиях носят сложный характер и не превышают ± 3%

Таким образом, установлено, что ПЭГ при высоком давлении в растворе способен формировать комплексы с молекулами гемоглобина человека ПЭГ оказывает некоторое защитное действие на макромолекулу гемоглобина при на1ревании за счет дополнительной гидратации белка (Е М Сорокина и соавт, 1999), но при добавлении в раствор ГГХ последний разрушает гид-ратную оболочку гемопротеида и нивелирует стабилизирующий эффект ПЭГ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью методов гель-хроматографии, диск-электрофореза, протео-литического титрования, абсорбционной спектрофотометрии, определения количества БН-групп, соотношения основных лигандных форм гембелка и интенсивности светорассеяния в растворах гемоглобина, а также компьютерного моделирования исследовано влияние препаратов на основе нативного декстрана (реополиглюкин), его окисленного производного (диальдегидцек-стран) и полиэтиленгликоля на структурно-функциональные свойства гемоглобина человека.

В ходе выполнения работы были подобраны условия для наилучшего взаимодействия гемоглобина и изучаемых модификаторов

Показано, что инкубирование гемоглобина с реополиглюкином в молярном соотношении 1.4 индуцирует конформационные перестройки белковых молекул, но не приводит к образованию прочных ковалентных связей между гемопротеидом и полисахаридом Следовательно, связывание физиологически активных веществ с декстранами требует предварительного перевода полисахарида в химически активную форму, например, путем получения диальдегиддекстрана

В связи с этим нами были установлены оптимальные условия химического синтеза комплексов гемоглобин-ДАД, которые позволили получить конъюгаты с различным соотношением исходных компонентов и различной молекулярной массой Комплекс с молекулярной массой 103,4 кДа мы обозначили как комплекс I типа, а более высокомолекулярный (225,4 кДа) - как конъюгат II типа.

Помимо представителей полигидроксисоединений, мы использовали для модификации молекулы гемоглобина полимер окиси этилена - полиэти-ленгликоль

Сравнительный анализ физико-химических свойств молекул гемоглобина в присутствии реополиглюкина, ПЭГ и в составе комплексов гембелок-ДАДI и II типа позволил установить следующее

Реополиглюкин при внесении в раствор гемопротеида изменяет физи-

ческие свойства воды как растворителя и приводит к увеличению объема гидратной оболочки белка, что опосредовано влияет на структурное состояние его глобулы

Механизм действия ПЭГ на молекулу гемоглобина, в какой-то степени, подобен таковому реополиглюкина и реализуется путем модификации водного микроокружения гембелка При давлении порядка 16 МПа ПЭГ замещает часть молекул воды, связанной с поверхностными группами гемопротеида, и за счет нековалентных взаимодействий образует комплекс с гемоглобином Аргументом в пользу образования аддуктов гемоглобина с ПЭГ служит выявленное нами увеличение кажущейся молекулярной массы гембелка (метод гель-хроматографии) При этом возможность разворачивания белковой глобулы под действием ПЭГ не подтверждается результатами спектрофотомет-рии, протеолитического титрования, регистрации интенсивности светорассеяния, которые свидетельствуют о компактизации гемопротеида

ДАД, в отличие от реополиглюкина и ПЭГ, наряду с повышением степени гидратации гемоглобина, проявляет и прямое действие на стабильность его молекул Происходит это за счет появления дополнительных ковалент-ных связей между альдегидными группами полисахарида и аминокислотными остатками лизина и гистидина глобина, что приводит к усилению гидрофобных взаимодействий внутри белковой глобулы

Изменения структуры молекул гемоглобина под воздействием реополиглюкина, ПЭГ и ДАД нашли отражение на устойчивости гемопротеида к действию денатурирующих агентов Было установлено, что все изучаемые модификаторы в разной степени повышают термостабильность молекул гемоглобина Обнаружено защитное действие реополиглюкина, ПЭГ и ДАД на молекулу гембелка по отношению к воздействию низких концентраций (0,1 моль/л) гуанидин-гидрохлорида. Однако денатурант в более высокой концентрации (1 моль/л) разрушает дополнительный гидратационный слой вокруг белка, появившийся под влиянием реополиглюкина и ПЭГ, и приводит к разворачиванию и агрегации его полипептидных цепей Что касается комплексов гемоглобин-ДАД I типа, то образование дополнительных ковалентных связей белка с полисахаридом препятствует денатурационным изменениям в присутствии ГГХ даже в его концентрации 1 моль/л

На основании литературных и собственных экспериментальных данных нами была предложена схема процессов, протекающих в растворах ин-тактных и модифицированных РП, ДАД и ПЭГ молекул гемоглобина человека при воздействии температуры и ГГХ (рис 11)

Особый интерес представляет анализ содержания отдельных лиганд-ных форм в растворах модифицированного гемоглобина, динамика изменения которых непосредственно отражает его функциональные характеристики

Рис 11 Схема процессов, протекающих в растворах интактных и модифицированных реополиглюкином, диальдегиддекстраном и полиэтиленгликолем молекул гемоглобина человека при воздействии температуры и гуанидин-гидрохлорида

Примечание в схеме указаны данные по действию гуанидин-гидрохлорида (ГГХ) при температуре 25 "С

но уменьшение доли НЬОг и увеличение количества дезоксиформы гемопро-теида, что обусловлено снижением его сродства к кислороду в исследуемых комплексах Учитывая, что процесс выделения гембелка из эритроцитов сопровождается снижением величины Р5о, по-видимому, ДАД может быть использован для коррекции кислородсвязывающей способности гемоглобина

Используя методы компьютерного моделирования, нами была создана пространственная модель молекулы ДАД, состоящей из 200 мономерных остатков, и определены места нахождения в ней альдегидных групп Анализ энергетического и стерического критериев боковых радикалов аминокислотных остатков гемопротеида, позволил выявить положение аминокислотных остатков лизина и гистидина, с наибольшей вероятностью участвующих в образовании связей с ДАД Ими оказались 60а, 92а, 59|3 аминокислотные остатки лизина и 45а, 770 - гистидина На основании совокупности экспериментальных данных и эмпирических расчетов построены компьютерные трехмерные модели комплексов гемоглобин-ДАД I и II типа

С помощью программного пакета HyperChem 7 0 Professional методом молекулярной динамики установлено, что при модификации гембелка диаль-дещддекстраном сохраняется конформационная лабильность гемовой группы и отдельных субъединиц относительно друг друга Это свидетельствует о способности комплексов гемоглобин-ДАД к обратимой оксигенации, а, следовательно, к эффективной транспортировке кислорода

Таким образом, производные декстрана и ПЭГ повышают устойчивость белковых молекул к денатурирующим факторам, а ДАД, кроме того, является эффективным регулятором функциональных свойств гемоглобина человека, что позволяет отнести данные соединения к весьма перспективным агентам для модификации гемопротеида с целью создания искусственных кровезаменителей. Наряду с этим, ДАД и ПЭГ могут быть использованы в экспериментах по синтезу биоактивных веществ и лекарственных средств для сохранения их биологически важных свойств и способности выполнять физиологическую роль в организме при изменении условий среды

ВЫВОДЫ

1. Показано, что инкубирование гемоглобина с реополиглюкином в молярном соотношении 1 '4 индуцирует конформационные перестройки белковых молекул, но не приводит к образованию прочных ковалентных связей между гемопротеидом и полисахаридом.

2. Установлено, что оптимальными условиями для связывания гемоглобина с ДАД являются: величина рН среды, равная 7,4; температура инкубации - 37 °С, время инкубации - 3 ч, степень окисления полисахарида -10 % Структура образующихся комплексов гемоглобин-ДАД зависит от исходного соотношения белок: полисахарид в реакционной среде

3 При формировании комплекса гемоглобин-ДАД I типа с молекулярной массой 103,4 кДа полисахарид образует многоточечные ковалентные связи со всеми 4 субъединицами молекулы гемопротеида, в которых участ-

вуют 8 аминокислотных остатков (6 лизина и 2 гистидина)

4 Образование высокомолекулярных комплексов гемоглобин-ДАД II типа (225,4 кДа) происходит с участием 5 аминокислотных остатков (4 лизина и 1 гистидина), что приводит к жесткому пространственному фиксированию 2 субъединиц в тетрамерной молекуле гемоглобина относительно друг друга, в то время как две другие субъединицы оказываются не связанными с декстраном

5 Инкубирование гемоглобина человека с реополиглюкином не вызывает изменения процентного соотношения лигандных форм гембелка Формирование комлексов гемоглобин-ДАД I и II типов приводит к снижению сродства гемопротеида к кислороду и увеличению содержания дезокси-формы гембелка в растворе на 12,7 и 6,8 % соответственно

6 Обнаружено, что все препараты декстрана (реополиглюкин и ДАД) увеличивают термостабильность молекул гемоглобина человека Наибольший защитный эффект на белковую глобулу при высоких температурах оказывает ДАД, особенно в комплексе I типа, повышая температуру необратимого денатурационного перехода гемопротеида от 60 до 80 °С.

7 Выявлено, что стабилизирующее действие реополиглюкина и ДАД в комплексе II типа наблюдается при сравнительно малых концентрациях гуанидин-гидрохлорида (0,1 моль/л), а ДАД в комплексе I типа повышает устойчивость гембелка к более высоким концентрациям денатурирующего агента (1 моль/л)

8 Созданы пространственные модели молекулы ДАД, комплексов гемоглобин-ДАД I и II типов. Установлены номера аминокислотных остатков глобина, с наибольшей вероятностью участвующих в формировании связей с полисахаридом.

9 С помощью компьютерного моделирования комплексов гемоглобин-ДАД I и II типов показано, что при модификации гембелка диальдегид-декстраном сохраняется конформационная лабильность гемовой группы и отдельных субъединиц относительно друг друга. Это свидетельствует о способности комплексов гемоглобин-ДАД к обратимой оксигенации, а, следовательно, к эффективной транспортировке кислорода

10. Показано, что при повышенном давлении в реакционной среде ПЭГ способен образовывать комплексы с гемоглобином человека, что приводит к конформационным изменениям белковой глобулы гемопротеида, затрагивающим гемовый компонент, но валентное состояние атома железа в геме и степень насыщения гемоглобина кислородом при этом не изменяются.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Артюхов В Г, Путинцева О В , Савостин В С. Функциональные свойства оксигемоглобина человека в присутствии реополиглюкина // VIII Междунар конф. по химии и физико-химии олигомеров «0лигомеры-2002» тез. докл -Черноголовка, 9-14 сентября 2002. - С 333

2 Савостин В С. Влияние реополиглюкина на термостабильность молекул

оксигемоглобина человека // 7-ая Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21-го века» тез докл. - Пущино, 14-18 апреля 2003 -С 73-74

3 Калаева Е А , Савостин В С Влияние оксида азота и препаратов декст-рана на кислородсвязывающую способность гемоглобина человека // Труды молодых ученых ВГУ -2003 -Вып 1 -С 77-82

4 Артюхов В Г, Путинцева О В , Савостин В С, Лунева В В Хроматогра-фические свойства конъюгатов гемоглобин-диальдегиддекстран в различных условиях эксперимента // Всерос симп «Хроматография и хроматографиче-скиеприборы» Сб тез -М, 15-19марта2004 -С 265

5 Путинцева О В , Савостин В С Физико-химические характеристики конъюгатов гемоглобин-диальдегиддекстран // III съезд биофизиков России тез. докл -Воронеж, 24-29 июня 2004 - С 90-91

6 Путинцева О В , Артюхов В Г , Савостин В С , Боровлева Т.С Сравнительный анализ устойчивости молекул нативного и конъюгированного с ди-альдегиддекстраном гемоглобина человека к действию гуанидин-гидрохлорида // Материалы VIII Международ науч эколог конф «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» - Белгород, 27-29 сентября 2004 - С 177-178

7 * Путинцева О В , Савостин В С, Артюхов В Г. Влияние нативного и окисленного декстрана на физико-химические свойства гемоглобина человека Ü Рос. Физиол. журн им. И М Сеченова - 2004 - Т 90, № 8 (Приложение). - С. 145.

8 Артюхов В.Г., Путинцева О В, Савостин В С Влияние реополиглюкина и диапьдегиддекстрана на термостабильность молекул гемоглобина человека //Укр биохим журнал -2005 -Т 77,№5 -С 70-79

9 Савостин В С , Артюхов В Г., Путинцева О В , Корнева С С , Ситар JIВ Исследование влияния полиэтиленгликоля на спектральные и гель-хроматографические свойства молекул гемоглобина человека // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов — Воронеж, 2006 - Вып 8.-С 167-170.

10. Артюхов В.Г, Путинцева О В , Савостин В С , Корнева С С , Ситар JI В. Исследование некоторых физико-химических свойств комплексов гемогло-бин-полиэтиленгликоль // Научно-практическая конф. «Скорая медицинская помощь: реальность и перспективы» • сб науч -практ работ. - Воронеж, 1011 апреля2006 -С.253

II * Артюхов В Г, Путинцева О.В , Савостин В С Физико-химические свойства и термостабильность молекул гемоглобина человека, модифицированного реополиглюкином и диальдегиддекстраном//Биофизика -2006 -Т 51, вып 3 -С 430-439

* Статьи № 7, 11 опубликованы в изданиях, соответствующих списку ВАК РФ

Подписано в печать 06 03 08 Формат 60x84 '/16 Уел печ л 1,2 Тираж 100 экз Заказ 516

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета 394000, Воронеж, ул Пушкинская, 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Савостин, Владислав Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура и! некоторые физико-химические свойства молекул ге- 11 моглобина человека

1.2. Проблема создания искусственных кровезаменителей на основе 20 растворов гемоглобина человека

1.3. Структура, физико-химические свойства низкомолекулярного 26 декстрана и применение препаратов на его основе в биологии и медицине

1.4. Структура, физико-химические свойства полиэтиленгликоля и его использование в биологии и медицине

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования

2.1. Объект исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Получение растворов гемоглобина человека

2.2.2. Модификация гемоглобина нативным декстраном

2.2.3. Получение диальдегиддекстрана из реополиглюкина

2.2.4. Синтез конъюгата диальдегиддекстран-гемоглобин

2.2.5. Модификация гемоглобина полиэтиленгликолем

2.2.6. Гель-хроматография растворов гемоглобина человека

2.2.7. Определение количества полисахарида в конъюгате гемоглобин- 37 диальдегиддекстран

2.2.8. Определение количества белка в конъюгате гемоглобин- 38 диальдегиддекстран

2.2.9. Регистрация электронных спектров поглощения растворов на- 38 тивного и модифицированного гемоглобина человека

2.2.10. Определение содержания основных лигандных форм гемогло- 38 бина в растворе

2.2.11. Определение количественного содержания сульфгидрильных 39 групп в растворе нативного и модифицированного гемоглобина методом спектрофотометрического титрования

2.2.12. Диск-электрофорез гемоглобина в полиакриламидном геле

2.2.13. Определение количества ионогенных групп методом кислотно- 41 основного титрования

2.2.14. Модификация гемоглобина гуанидин-гидрохлоридом

2.2.15. Термостатирование растворов гемоглобина

2.2.16. Определение интенсивности светорассеяния растворов гемо- 43 глобина

2.2.17. Создание компьютерных моделей комплексов гемоглобин- 43 диальдегиддекстран и расчет некоторых параметров структуры моле- -кул нативного и модифицированного гемопротеида

2.2.18. Статистическая обработка экспериментальных данных 45'

ГЛАВА 3. Физико-химические свойства и структурные характеристи- 46 ки молекул гемоглобина человека, модифицированного реополиглю-кином и диальдегидцекстраном

3.1. Гель-хроматографические свойства молекул гемоглобина, моди- 46 фицированного реополиглюкином и диальдегидцекстраном

3.2. Влияние реополиглюкина и> диальдегидцекстрана на содержание 53 сульфгидрильных групп в растворе гемоглобина человека

3.3. Влияние различных препаратов декстрана на электрофоретиче- 54 ские свойства,гемоглобина человека

3.4. Кислотно-основные свойства молекул гемоглобина человека, мо- 61 дифицированного реополиглюкином и диальдегидцекстраном

3.5. Спектральные характеристики растворов нативного и модифици- 66 рованного гемопротеида

ГЛАВА 4. Влияние реополиглюкина и диальдегидцекстрана на устойчивость молекул гемоглобина человека к действию денатурирующих факторов

4.1. Влияние реополиглюкина и диальдегиддекстрана на термоста- 73 бильность молекул гемоглобина человека

4.2. Электронные спектры поглощения растворов нативного и моди- 80 фицированного соединениями декстрана гемоглобина человека в присутствии гуанидин-гидрохлорида

4.3. Исследование влияния гуанидин-гидрохлорида и температуры на 90 интенсивность светорассеяния растворов нативного и конъюгирован-ного с диальдегиддекстраном гемоглобина человека

ГЛАВА 5. Создание и анализ компьютерных моделей комплексов ге- 98 моглобин-диальдегиддекстран

5.1. Построение пространственных моделей молекул диальдегиддек- 98 страна и гемоглобина

5.2. Создание компьютерных моделей комплексов гемоглобин- 102 диальдеги ддекстран

5.3. Изучение влияния диальдегиддекстрана на структуру и свойства 107 молекул гемоглобина человека с использованием компьютерных моделей их комплексов

ГЛАВА 6. Исследование влияния полиэтиленгликоля на физикохимические свойства и стабильность молекул гемоглобина человека

6.1. Влияние полиэтиленгликоля на структурные характеристики и 119 физико-химические свойства молекул гемоглобина

6.2. Влияние полиэтиленгликоля на стабильность молекул гемоглоби- 126 на человека

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование структурно-функциональных свойств молекул гемоглобина человека, модифицированных некоторыми производными декстрана и полиэтиленгликолем"

Кровь является уникальной биологической средой, способной обеспечивать и поддерживать гомеостаз организма человека.

В настоящее время в связи с увеличением частоты возникновения чрезвычайных ситуаций: природных катаклизмов (землетрясения, цунами), террористических актов, автомобильных катастроф, а также ростом числа операций по пересадке органов и тканей, постоянно возрастает потребность в трансфузии цельной крови- и её отдельных компонентов (Б.А. Барышев, 2005). Недостаток донорской крови и наличие ряда ограничений по её использованию: опасность передачи при переливании бактериальных и вирусных инфекций (S.M. Fakhry, G.F. Sheldon, 1995; G.B. Schreiber et al., 1996), возможность-несовместимости донорской крови и крови реципиента по антигенному составу, короткие сроки хранения, требуют создания искусственных кровезаменителей (M.G. Scott et al., 1997; R.M. Winslow, 2002).

В связи с этим весьма актуальным является разработка кислородпере-носящих растворов на основе гемоглобина, химически модифицированного некоторыми органическими молекулами, защищающими его от разного рода внешних воздействий (Н.П. Кузнецова и соавт., 2002; С. Jin et al., 2004; P.W. Buehler et al., 2006). Несмотря на определенные успехи в этой области, необходимо продолжать поиск химических соединений и способов-модификации молекул гемоглобина с целью эффективной регуляции свойств гемопротеида и снижения степени отрицательных эффектов введения растворов гембелка в организм человека (Б.А. Барышев, 2005).

В качестве таких веществ нами были выбраны представители высокомолекулярных полианионов, производные декстрана - реополиглюкин (РП) и диальдегиддекстран (ДАД), а также полиэтиленгликоль (ПЭГ), нашедшие применение в молекулярной биологии и медицине (И.П. Гладышева и соавт., 2001; A.B. Максименко и соавт., 2001; И.Н. Топчиева и соавт., 1998; A.S. Morar et al., 2006).

Таким рбразом, проведение экспериментов по поиску соединений, эффективно модулирующих функциональную активность гемоглобина, и изучение влияния данных веществ на структурно-функциональные свойства молекул гембелка имеют важное теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы явилось исследование структурно-функциональных свойств гемоглобина человека, модифицированного препаратами на основе нативного декстрана (рео-полиглюкин), его окисленного производного (диальдегиддекстран) и поли-этиленгликолем.

В связи» с этим перед нами стояли следующие задачи:

1. Исследовать физико-химические характеристики молекул гемоглобина человека, модифицированных полиэтиленгликолем и препаратами на основе декстрана.

2. Изучить механизмы взаимодействия молекул гемоглобина человека с реополиглюкином, диальдегиддекстраном и полиэтиленгликолем.

3. Исследовать термостабильность и химическую устойчивость молекул модифицированного гемоглобина человека.

4. Построить и проанализировать компьютерные модели диальде-гиддекстрана и его комплексов с гемоглобином человека.

Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным анализу влияния реополиглюкина, диальдегиддекстрана. и поли-этиленгликоля на структурно-функциональные свойства интактных, термостатированных и модифицированных гуанидин-гидрохлоридом молекул гемоглобина человека.

Выявлены оптимальные условия для связывания гемоглобина с ДАД, позволяющие получать модифицированные образцы гемоглобина с определенными размерами, молекулярными массами и физико-химическими свойствами. Изучены механизмы взаимодействия молекул гемоглобина человека с реополиглюкином и ДАД.

Установлена возможность формирования комплекса гемоглобина человека с полиэтиленгликолем при создании повышенного давления в реакционной среде.

Созданы пространственные модели молекулы ДАД, комплексов гемо-глобин-ДАД I и II типов. Установлены номера аминокислотных остатков глобина, с наибольшей вероятностью участвующих в формировании связей с полисахаридом. Методом молекулярной динамики показано сохранение конформационной лабильности гемовой группы и отдельных субъединиц относительно друг друга, что свидетельствует о способности конъюгатов гемоглобин-ДАД к обратимой оксигенации.

Разработана схема процессов, протекающих в растворах интактных, термостатированных и модифицированных гуанидин-гидрохлоридом молекул гемоглобина человека при воздействии реополиглюкина, диальдегиддек-страна и полиэтиленгликоля, позволяющая проследить взаимосвязь между изменениями в структуре гемопротеида и проявлением его физико-химических свойств.

Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления» об особенностях структурно-функционального состояния гемоглобина человека1 в условиях различного микроокружения.

Результаты изучения физико-химических свойств препаратов гемоглобина в присутствии реополиглюкина, в комплексах с ПЭГ и химически модифицированного гембелка (различные комплексы гемоглобин-ДАД) необходимо принимать во внимание при рассмотрении вопросов, связанных с созданием искусственных кровезаменителей.

Экспериментальные данные по исследованию механизмов взаимодействия молекул гемоглобина человека с реополиглюкином, ДАД и ПЭГ могут быть использованы специалистами, работающими в области молекулярной биологии и биофизики, а также лицами, занимающимися синтезом новых лекарственных средств и биологически активных молекул, что позволит более успешно решать проблемы стабилизации биологических свойств и функций изучаемых соединений.

Материалы работы используются в учебном процессе кафедры, биофизики и биотехнологии Воронежского государственного университета при проведении практикумов, выполнении дипломных и магистерских работ студентами.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 8 Международной конференции по химии и физикохимии оли-гомеров «Олигомеры - 2002» (Черноголовка, 2002); VII Пущинской-школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2003); III- Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); XIX Съезде физиологов России (Екатеринбург, 2004); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004); VIII Международной научно-экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004); научно-практической конференции «Скорая медицинская помощь: реальность и перспективы» (Воронеж, 2006); Научных сессиях сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2005, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей и 6 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Диальдегиддекстран является эффективным модулятором структурно-функциональных свойств молекул гемоглобина человека и способен значительно повышать устойчивость гемопротеида к действию физических и химических денатурирующих факторов.

3. Компьютерные модели трехмерной пространственной структуры декстрана, диальдегиддекстрана, комплексов гемоглобин-диальдегиддекстран I и II типов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 151 страницу машинописного текста, 9 таблиц, 45 рисунков. Состоит из «Введения», 6 глав, «Заключения» и «Выводов». В списке цитируемой литературы 155 работ, из них 78 отечественных и 77 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Савостин, Владислав Сергеевич

ВЫВОДЫ

1. Показано, что инкубирование гемоглобина с реополиглюкином в молярном соотношении 1:4 индуцирует конформационные перестройки белковых молекул, но не приводит к образованию прочных ковалентных связей между гемопротеидом и полисахаридом.

2. Установлено, что оптимальными условиями для связывания гемоглобина с, ДАД являются: величина рН среды, равная 7,4; температура инкубации - 37 °С; время инкубации - 3 ч;. степень окисления полисахарида — 10 %. Структура образующихся комплексов; гемоглобин-ДАД зависит от исходного соотношения белок : полисахарид в реакционной среде.

3: При формировании комплекса гемоглобин-ДАД I типа с молекулярной массой 103,4 кДа полисахарид образует многоточечные ковалентные связи со всеми 4 субъединицами: молекулы гемопротеида, в: которых участвуют 8 аминокислотных остатков (6 лизина и 2 гистидина).

4. Образование высокомолекулярных комплексов гемоглобин-ДАД' IIтипа (225;4 кДа) происходит с участием 5 аминокислотных остатков (4 лизина и 1 гистидина), что приводит к жесткому пространственному фиксированию 2 субъединиц в тетрамерной молекуле гемоглобина относительно друг друга, в то время как две другие субъединицы оказываются не связанными с декст-раном.

5. Инкубирование гемоглобина человека с реополиглюкином не вызывает изменения процентного соотношения лигандных форм гембелка. Формирование комлексов^гемоглобин-ДАДЕ и II типов приводит к снижению сродства ; гемопротеида: к кислороду и увеличению содержания дезоксиформы гембелка в растворе на12,7 и 6,8 % соответственно.

6. Обнаружено^ что все препараты декстрана (реополиглюкин и ДАД) увеличивают термостабильность молекул гемоглобина человека. Наибольший защитный эффект на белковую глобулу при высоких температурах оказывает ДАД, особенно в комплексе I типа, повышая температуру необратимого денатурационного перехода гемопротеида от 60 до 80 °С.

7. Выявлено, что стабилизирующее действие реополиглюкина и ДАД в комплексе II типа наблюдается при сравнительно малых концентрациях гуа-нидин-гидрохлорида (0,1 моль/л), а ДАД в комплексе I типа повышает устойчивость гембелка к более высоким концентрациям денатурирующего агента (1 моль/л).

8. Созданы пространственные модели молекулы ДАД, комплексов гемо-глобин-ДАД I и II типов. Установлены номера аминокислотных остатков глобина, с наибольшей вероятностью участвующих в формировании связей с полисахаридом.

9. С помощью компьютерного моделирования комплексов гемоглобин-ДАДI и II типов показано, что при модификации гембелка диальдегидцекст-раном сохраняется конформационная лабильность гемовой группы и отдельных субъединиц относительно друг друга. Это свидетельствует о способности комплексов гемоглобин-ДАД к обратимой оксигенации, а, следовательно, к эффективной транспортировке кислорода.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью методов гель-хроматографии, диск-электрофореза, протео-литического титрования, абсорбционной спектрофотометрии, определения количества 8Н-групп, соотношения основных лигандных форм гембелка и интенсивности светорассеяния в растворах гемоглобина, а также компьютерного моделирования исследовано влияние препаратов на основе нативного декстрана (реополиглюкин), его окисленного производного (диальдегиддек-стран) и полиэтиленгликоля на структурно-функциональные свойства гемоглобина человека.

В ходе выполнения работы были подобраны условия для наилучшего взаимодействия гемоглобина и изучаемых модификаторов.

Показано, что инкубирование гемоглобина с реополиглюкином в молярном соотношении 1:4 индуцирует конформационные перестройки белковых молекул, но не приводит к образованию прочных ковалентных связей между гемопротеидом и полисахаридом. Следовательно, связывание физиологически активных веществ с декстранами требует предварительного перевода полисахарида в химически активную форму, например, путем получения диальдегиддекстрана.

В связи с этим нами были установлены оптимальные условия химического синтеза комплексов гемоглобин-ДАД, которые позволили получить конъюгаты с различным соотношением исходных компонентов и различной молекулярной массой. Комплекс с молекулярной массой 103,4 кДа мы обозначили как комплекс I типа, а более высокомолекулярный (225,4 кДа) - как конъюгат II типа.

Помимо представителей полигидроксисоединений, мы использовали для модификации молекулы гемоглобина полимер окиси этилена - полиэти-ленгликоль.

Реополиглюкин при внесении в раствор гемопротеида изменяет физические свойства воды как растворителя и приводит к увеличению объема гидратной оболочки белка, что опосредовано влияет на структурное состояние его глобулы.

Механизм действия ПЭГ на молекулу гемоглобина, в какой-то степени, подобен таковому реополиглюкина и реализуется путем модификации водного микроокружения гембелка. При давлении порядка 16 МПа ПЭГ замещает часть молекул воды, связанной с поверхностными группами гемопротеида, и за счет нековалентных взаимодействий образует комплекс с гемоглобином. Аргументом в пользу образования аддуктов гемоглобина с ПЭГ служит выявленное нами увеличение кажущейся молекулярной массы гембелка (метод гель-хроматографии). При этом возможность разворачивания белковой глобулы под действием ПЭГ не подтверждается результатами спектрофотомет-рии, протеолитического титрования, регистрации интенсивности светорассеяния, которые свидетельствуют о компактизации гемопротеида.

ДАД, в отличие от реополиглюкина и ПЭГ, наряду с повышением степени гидратации гемоглобина, проявляет и прямое действие на стабильность его молекул. Происходит это за счет появления дополнительных ковалент-ных связей между альдегидными группами полисахарида и аминокислотными остатками лизина и гистидина глобина, что приводит к усилению гидрофобных взаимодействий внутри белковой глобулы.

Изменения структуры молекул гемоглобина под воздействием реополиглюкина, ПЭГ и ДАД нашли отражение на устойчивости гемопротеида к действию денатурирующих агентов. Было установлено, что все изучаемые модификаторы в разной степени повышают термостабильность молекул гемоглобина. Обнаружено защитное действие реополиглюкина, ПЭГ и ДАД на молекулу гембелка по отношению к воздействию низких концентраций (0,1 моль/л) гуанидин-гидрохлорида (И Х). Однако денатурант в более высокой концентрации (1 моль/л) разрушает дополнительный гидратационный слой вокруг белка, появившийся под влиянием реополиглюкина и ПЭГ, и приводит к разворачиванию и агрегации его полипептидных цепей. Что касается комплексов гемоглобин-ДАД I типа, то образование дополнительных кова-лентных связей белка с полисахаридом препятствует денатурационным изменениям в присутствии ГГХ даже в его концентрации 1 моль/л.

На основании литературных и собственных экспериментальных данных нами была предложена схема процессов, протекающих в растворах ин-тактных и модифицированных реополиглюкином, ДАД и ПЭГ молекул гемоглобина человека при воздействии температуры и ГГХ (рис. 45).

Расчеты показали, что реополиглюкин и ПЭГ не оказывают влияния на соотношение лигандных форм в растворах гемопротеида, и, по-видимому, не способны изменять и эффективно регулировать функциональные свойства гемоглобина. В растворах конъюгатов гембелка с ДАД I и II типа установлено уменьшение доли НЬОг и увеличение количества дезоксиформы гемопротеида, что обусловлено снижением его сродства к кислороду в исследуемых комплексах. Учитывая, что процесс выделения гембелка из эритроцитов сопровождается снижением величины Р50, по-видимому, ДАД может быть использован для коррекции кислородсвязывающей способности гемоглобина.

Рис. 45. Схема процессов, протекающих в растворах интактных и модифицированных реополиглюкином, диальдегиддекстраном и полиэтиленгликолем молекул гемоглобина человека при воздействии температуры и гуанидин-гидрохлорида

Примечание: в схеме указаны данные по действию гуанидин-гидрохлорида (ГГХ) при температуре 25 °С остатков лизина и гистидина, с наибольшей вероятностью участвующих в образовании связей с ДАД. Ими оказались 60а, 92а, 59ß аминокислотные остатки лизина и 45а, 77ß — гистидина. На основании совокупности экспериментальных данных и эмпирических расчетов построены компьютерные трехмерные модели комплексов гемоглобин-ДАД I и II типа.

С помощью программного пакета HyperChem 7.0 Professional методом молекулярной динамики установлено, что при модификации гембелка диаль-дегиддекстраном сохраняется конформационная лабильность гемовой группы и отдельных субъединиц относительно друг друга. Это свидетельствует о способности комплексов гемоглобин-ДАД к обратимой оксигенации, а, следовательно, к эффективной транспортировке кислорода.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савостин, Владислав Сергеевич, Воронеж

1. Абдель Басит М. Сайд Исследование структурных изменений оксиге-моглобина, индуцированных УФ-облучением и гуанидин-хлоридом : Дисс. . канд. биол. наук / М. Сайд Абдель Басит. Воронеж, 1979. — 279 с.

2. Артюхов В.Г. Гемопротеиды: закономерности фотохимических превращений в условиях различного микроокружения / В.Г. Артюхов. — Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 1995. 280 с.

3. Артюхов В.Г. Кислородсвязывающие свойства гемоглобина, модифицированного воздействием температуры и додецилсульфата натрия / В.Г. Артюхов, Г.А. Вашанов // Физиол. журн. СССР им. Сеченова. 1990. - Т. 76, № 1.-С. 1361-1367.

4. Артюхов В.Г. Оптические методы анализа интактных и модифицированных биологических систем / В.Г. Артюхов, О.В. Путинцева. Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 1996. - 240 с.

5. Барышев Б.А. Кровезаменители. Компоненты крови. / Б.А. Барышев. -СПб. : Человек, 2005. 160 с.

6. Блюменфельд Л.А. Гемоглобин и обратимое присоединение кислорода / Л.А. Блюменфельд. М. : Сов. Наука, 1957. - 139 с.

7. Боландин В.А. Справочник по аналитическому контролю в производстве искусственных и синтетических волокон / В.А. Боландин. М. : Гиз-легпром, 1957. - С. 42.

8. Вашанов Г.А. Роль субъединичных контактов в проявлении гемоглобином структурно-функциональных свойств в условиях различного микроокружения : Дисс. . д-ра биол. наук / Г.А. Вашанов. Воронеж, 2004. — 347 с.

9. Вашанов Г.А. Физико-химические и функциональные свойства гибридных макромолекул гемоглобина человека / Г.А. Вашанов, В.Г. Артюхов

10. Вестн. Воронеж, гос. ун-та. Сер. Химия. Биология. 2000. - № 2. - С. 9499.

11. Верболович П.А. Железо в животном организме / П.А. Верболович, A.B. Утешев. Алма - Ата : Наука, 1967. - 266 с.V

12. Влияние осмолитов на денатурацию синтазы жирных кислот из печени цыпленка / И.-Д. Парк и др. // Биохимия. 2002. - Т.67. вып. 8. - С. 11011108.

13. Воробьёв С.И. Инфузионные растворы с кислородтранспортными свойствами / С.И. Воробьёв // Российский журнал анастезиологии и интенсивной терапии. 1996. - вып. 2. - С. 25-31.

14. Воробьёв, Ю.Н. Методы компьютерного моделирования и конформа-ционная подвижность ДНК-дуплексов / Ю.Н. Воробьёв // Молекулярная биология. 2003. - Т. 37,№ 2. - С. 240-254.

15. Вязова Е.П. Модифицированный гемоглобин как основа искусственного переносчика кислорода / Е.П. Вязова, М.А. Ажигирова // Химико-фармацевтический журнал. 1989. - № 6. - С. 645-649.

16. Грибов JI.A. Квантовая химия / Л.А. Грибов, С.П. Муштакова — М. : Гардарики, 1999. с. 390.

17. Двойлацкая-Барышева K.M. Биологический синтез нативного декстра-на-основы отечественного плазмозаменителя полиглюкина / K.M. Двойлацкая-Барышева, Т.С. Сельцовская // Пробл. гематол. и перелив, крови. -1956.-№ l.-C: 47-48.

18. Демченко А.П. Ультрафиолетовая спектрофотометрия и структура белков / А.П. Демченко. Киев : Наукова думка, 1981. - 208 с.

19. Детерман Г. Гель-хроматография / Г. Детерман. М: : Наука, 1970. -252 с.

20. Дифосфанатные декстрановые производные, взаимодействие с гемоглобином/ Г.Н. Кольцова и др. // Гематология и трансфузиология. 1985. -Т. 30,№9:-С. 53-56.

21. Ефремова Н.В. Термическая стабильность конъюгатов а-химотрипсина с водорастворимыми полиалкиленоксидами / Н.В. Ефремова, В.В. Можаев, И.Н. Топчиева // Биохимия. 1992. - Т. 57, вып. 3. - С. 342-347.

22. Иваницкий Г.Р. Переливание крови: против, за и альтернатива / Г.Р. Иваницкий // Наука и жизнь. 1999. - Т. 2. - С. 14-19.

23. Иванов К.П. Современное развитие проблемы искусственной крови / К.П. Иванов // Гематология'и трансфузиология. 1992. - № 2. - С. 26-29.

24. Иванов К.П. Современные проблемы дыхательной функции крови и газообмена в легких / К.П. Иванов // Физиол. журн. СССР им. Сеченова. -1992-Т. 78, №. 11.- С. 11-26.

25. Иммобилизация а-химотрипсина на растворимых декстранах / В.П. Торчилин и др. // Биоорганическая химия. 1976. - Т. 2, № 9. - С. 1252-1257.

26. Иржак Л.И. Гемоглобины и их свойства / Л.И. Иржак. М. : Наука, 1975.-240 с.

27. Искусственная кровь: от Флюозола-ДА до искусственных эритроцитов / К. Хонда и др. // Биосовместимость. 1993. - Т.1, № 2. - С. 81-94;

28. Использование метода термоденатурации для изучения аддуктов а-химотрипсина с полиалкиленоксидами / Н.В. Ефремова и др. // Биохимия. -Т. 63, вып. 4.-С. 524-531.

29. Использование системы гидратированных обращенных мицелл для оценки- размеров полимер-белковых аддуктов / Е.М. Сорокина и др. // Биохимия. 1999. - Т. 64, вып. 6. - С. 799-804.

30. Кантор Ч. Биофизическая химия / Ч. Кантор, П. Шиммел : В 3 т.; Под ред. А.А. Богданова, Ю.С. Лазуркина, М.Д. Франк-Каменецкого. М. : Мир. - Т. 1 : Конформация биологических макромолекул. - 1984. - 336 с.

31. Кинетика* денатурации гликогенфосфорилазы Ь из скелетных мышц кролика гуанидингидрохлоридом / Т.Б. Еронина др. // Биохимия. 2001. - Т. 66, вып. 4. - с. 555-562.

32. Козинер В.Б. Механизм действия полиглюкина / В.Б. Козинер, H.A. Федоров. М. : Медицина, 1974. - 157 с.

33. Козинец Г.И. Практическая трансфузиология / Г.И. Козинец. — М. : Практическая медицина, 2005. 544с.

34. Козлова И.Е. УФ-чувствительность молекул гемоглобина с различным субъединичным, составом : Дисс. . канд. биол. наук / И.Е. Козлова. Воронеж, 2000. —152 с.

35. Комплексы полиэтиленгликоля с белками / И.Н. Топчиева и др. // Биохимия.- 1998.-Т. 63, вып. 11.-С. 1543-1540.

36. Конъюгаты соевого ингибитора типа Баумана-Бирк с клиническим дек-страном. Синтез и антипротеолитическая активность / И.П. Гладышева и др. // Биохимия. 2001. - Т. 66, № 4. - С. 474-480.

37. Коржуев П.А. Гемоглобин. Сравнительная физиология и биохимия / П.А. Коржуев. М.: Мир, 1964. - 287 с.

38. Кузнецова Н.П. Повышение кислородтранспортной эффективности гемоглобина при его химической модификации / Н.П. Кузнецова, JI.P. Гудкин, Р.Н. Мишаева // Биохимия. 1996. - Т. 61, № 4. - С. 680-689.

39. Кутышенко В.П. Разворачивание расплавленной глобулы карбоангид-разы гуанидингидрохлоридом / В.П. Кутышенко, Д.А. Прохоров // Молекулярная биология. 2003. -Т. 37, № 6. - С. 1055-1060.

40. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М. : Высшая школа, 1990. -351 с.

41. Ленинджер А. Биохимия / А. Ленинджер. М.: Мир, 1976. - 953 с.

42. Линдебаум Г.М. Химическая модификация водорастворимых декстра-нов / Г.М. Линдебаум, O.A. Миргородская, Б.В. Москвичев // Хим. фарм. журн. 1977. - № 6. - С. 80-83.

43. Лушников Л.А. Денситометрия / Л.А. Лушников, И.К. Стромгин // Лаб. дело. 1980. - № 6. - С. 336-338.

44. Максименко A.B. Модифицированная декстраном гиалуронидаза резистентна к ингибированию гепарином / A.B. Максименко, Ю.В. Щечилина, Е.Г. Тищенко //Биохимия. 2001. - Т. 66, № 4. - С. 563-572.

45. Маслаков Д.А. Биологическая активность некоторых полисахаридов и их клиническое применение / Д.А. Маслаков. Минск : Беларусь, 1977. -128 с.

46. Маслаков Д.А. Влияние полиглюкина на антимикробную активность сыворотки крови собак / Д.А. Маслаков, И.А. Эйсмонт. Матер. 2 респ. съезда гематол. и трансфузиолог. Белоруссии. - Минск, 1973. - С. 251-253.

47. Машковский М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. — М: : Медицина. Т. 2. - 1984. - С. 59-60, 64-65.

48. Методы химии углеводов / Под ред. Н.К. Кочеткова. М. : Мир, 1967. -512 с.

49. Минкин В.И. Теория строения молекул // В.И. Минкин, Б.Я. Симкин, P.M. Миняев. Ростов-на-Дону : «Феникс», 1997. — 560 с.

50. Олигомерные белки: структурно-функциональные модификации и роль субъединичных контактов / В.Г. Артюхов и др. Воронеж : Изд-во ВГУ, 1997.-264 с.

51. Показания к переливанию крови при острой кровопотери / С.И. Емельянов и др. // Российский журнал анастезиологии и интенсивной терапии. -1999.-вып. 4.-С. 12-15.

52. Рашиди Ш. Денатурация гликозилированного и дегликозилированного бромелайна в присутствии гуанидин-гидрохлорида / Ш. Рашиди, С.К. Хак, Р.Х. Хан // Биохимия. 2003. -Т. 68, вып. 10. - С. 1365-1369.

53. Резван С.Г. Анализ молекулярных механизмов взаимодействия синтетических гомологов ретинола с компонентами эритроцитарной мембраны и свободным гемоглобином : Дисс. . канд. биол. наук / С.Г. Резван. Воронеж, 1996. — 241с.

54. Рифкинд Д.М. Гемоглобин и миоглобин / Д.М. Рифкинд // Неорганическая биохимия. -М.: Мир, 1978. -Т. 2. С. 256-338.

55. Розенберг Г.Я. Проблемы создания искусственной крови / Г.Я. Розен-берг, К.Н. Макаров // Журнал ВХО им. Д.И. Менделеева 1985. - Т. 30, № 4.-С. 387-394.

56. Романова Т.А. Изменение электронной структуры гема при образовании комплекса с оксидом азота и динамика атомного остова при физиологической температуре / Т.А. Романова, П.О. Краснов, П.В. Аврамов // Доклады РАН 2001а. - Т. 380, № 2. - С. 319-322.

57. Романова Т.А. Электронная структура комплекса гема гемоглобина с оксидом азота и динамика атомного остова при физиологической температуре / Т.А. Романова, П.О. Краснов, П.В. Аврамов // Вопросы медицинской химии. -20016. Т. 47, вып. 3. - С. 308-315.

58. Софронов Г.А. Стратегия поиска искусственных заменителей крови / Г.А. Софронов, Е.А. Селиванов, М.Д. Ханевич // Рос. мед. вестн. 1998. -Т. 4, вып. 2. - С. 51-54.

59. Софронов Г.А. Новые кровезаменители полифункционального действия / Г.А. Софронов, Е.А. Селиванов // Вестник РАМН. 2003. - № 10. - С. 48-51.

60. Соколов А.В. Замещение острой смертельной кровопотери раствором фракции модифицированного полигемоглобина : Дисс. . канд. мед. наук / А.В. Соколов. М., 1992. - 112 с.

61. Соловьев М. Е. Компьютерная химия / М.Е. Соловьев, М.М. Соловьев. -М. : СОЛОН-Пресс, 2005. 536 с.

62. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России М. : Астра-ФармСервис, 2005. - 1536 с.

63. Стародуб Н.Ф. Гетерогенная система гемоглобина / Н.Ф. Стародуб, В.И. Назаренко. Киев : Наукова думка, 1987. - 199 с.

64. Стародуб Н.Ф. Радиационное поражение гемоглобина / Н.Ф. Стародуб, Г.М. Рекун, И.М. Шурьян. Киев : Наукова думка, 1976. — 130 с.

65. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функция белков / В.М. Степанов. -М. : Высш. школа, 1996. 336 с.

66. Страйер Л. Биохимия / Л. Страйер. М. : Мир, 1984. - 532 с.

67. Структура и связь / М. Вейсблут и др. М. : Наука, 1969. - С. 11 -74.

68. Структура и электронные свойства комплексов гема с различными ли-гандами / Т.А. Романова и др. // Биофизика. 2003. - Т. 48, № 4 - С. 618627.

69. Стусь Л.К. Осцилляция некоторых лигандированных форм гемоглобина при хранении крови / Л.К. Стусь, Е.Д. Розанова // Биофизика. 1992. - Т. 37, вып. 2. - С. 387-388.

70. Теория и практика компьютерного моделирования нанообъектов / Т.А. Романова и др. Красноярск : ИПЦ КГТУ, 2002. - 223 с.

71. Троицкий Г.В. Постсинтетическая модификация белков / Г.В. Троицкий // Укр. биохим. журн. 1985. - Т. 57, № 3. - С. 81-98.

72. Тяги Р. Использование химической модификации и химического сшивания для стабилизации белков (ферментов) / Р. Тяги, М.Н. Гупта // Биохимия. 1998. - Т. 63, № 3. - С. 395-407.

73. Физиология человека / Под ред. Г.И. Косицкого. — М. : Медицина, 1985. —559 с.

74. Хан Р.Х. Влияние Сахаров на стабильность и вторичную структуру альбумина сыворотки кролика / Р.Х. Хан, М.С. Шабнум // Биохимия. -2001. — Т.66, № 9. С. 1280-1285.

75. Чанг Р. Физическая химия с приложениями к биологическим системам / Р. Чанг. М.: Мир, 1980. - 664 с.

76. Энергия разрыва химических связей. Потенциалы ионизации и сродство к электрону / Л.В. Гурвич и др. М. : Наука, 1974. - 351 с.

77. Якубке Х.-Д. Аминокислоты. Пептиды. Белки / Х.-Д. Якубке, X. Эш-кайт. М. : Мир, 1985. - 456 с.

78. A clinical safety trial of stroma-free hemoglobin / J.P. Savitsky et al. // Clin. Pharmaco. Ther. 1978. -V. 23. -P. 73-80.

79. A human recombinant haemoglobin designed for use as a blood substitute / D. Looker et al. // Nature. 1992. - V. 356. - P. 258-260.

80. Allen M.P. Computer simulation of liquids / M.P. Allen, D J. Tidesley Oxford : Oxford University Press, 1989. - 254 p.

81. Alta D.H. Mechanism of precipitation of proteins by polyethylene glycols. Analysis in terms of excluded volume / D.H. Alta, K.C. Ingham // J. Biol. Chem. 1981. - V. 256. - P. 12108-12117.

82. An All Atom Force Field for Simulations of Proteins and Nucleic Acids / S.J. Weiner et al. // J. Comput. Chem. 1986. - V. 7. - P. 230-252.

83. Arakawa T. Mechanism of poly(ethylene glycol) interaction with proteins / T. Arakawa S. N Timasheff// Biochemistry. 1985. - V. 24. - P. 6756-6762.

84. Blood substitutes: evolution and future applications / M.G. Scott et al. // Clinical Chemistry. 1997. -V. 43, № 9. -P. 1724-1731.

85. Bloom W. Coating of Vascular Surfaces and Cells. A new Concept in Prevention of Intravascular Thrombosis / W. Bloom, D. Harmer // Proc. Soc. Exp. Biol. 1964.-V. 115, №2.-P. 384-386.

86. Bodor N. A new method for the estimation of partition coefficient / N. Bodor, Z Gabanyi, C. Wong // J. Am. Chem. Soc. -1989. V. 111. - P. 37833786.

87. Bolton W. Three dimensional fourier synthesis of horse deoxyhaemoglobin at 2.8 Angstrom units resolution / W. Bolton, M.F. Perutz // Nature. 1970. - V. 228, №5271.-P. 551-552.

88. Bruce A. Clinical considerations in pegylated protein therapy / A. Bruce // From Reserch to Practice. 2001. - V. 3. - P. 3-9.

89. Caliceti P. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates / P. Caliceti, F.M. Veronese // Adv. Drug Deliv. Rev. -2003.-V. 55.-P. 1261-1277.

90. Characterization of a pyridoxalated hemoglobin-polyoxyethylene conjugate as a physiologic oxygen carrier / A. Yabuki et al. // Transfusion. 1990. - V. 30, № 6.-P. 516-522.

91. Chemical Characterization of Diaspirin Cross-Linked Hemoglobin Polymerized with Polyethylene glycol / Buehler P.W. et al. // Anal. Chem. 2006. - V. 78, № 13.-P. 4634 - 4641.

92. Chemically modified porcine hemoglobins and their biological properties / C. Jin et al. // Protein Pept. Lett. 2004. - V. 11. - P. 353 - 360.

93. Cristal structure of T state haemoglobin with oxygen bound at all four haems /M. Paoli at al. // J.Mol. Biol. 1996. -V. 256. - P. 775-781.

94. Cross-linking with O-raffinose lowers oxygen affinity and stabilizes haemoglobin in a non-cooperative T-state conformation / Y. Jia et al. // J. Biochem — 2004a. V. 384. - P. 367 - 375.

95. Delgado C. The uses and properties of PEG-linked proteins // C. Delgado, G.E. Francis, D. Fisher // Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier. Syst. 1992. - V. 9. -P. 249-304.

96. Drabkin D.L. The chromatographic and optical properties of hemoglobin of man in comparison with those of other species / D.L. Drabkin // J. Biol. Chem. -1946.-V. 164.-P. 703-723.

97. Drysdale J.W. The separation of human and animal hemoglobin's by isoelectric separation focusing in polyacrylamide gel / W.J. Drysdale, P. Righetti, H.F. Bunn // Biochim. biophys. acta. 1971. - V. 229, № 1. - P. 4250.

98. Effect of covalent attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase / A. Abuchowski et al. // J. Biol. Chem. 1977. -V. 252. - P. 3582-3586.

99. Fakhry S.M. Blood administration; risks and substitutes / S.M. Fakhry, G.F. Sheldon // Adv. Surgery. 1995. - V. 28. - P. 71-92.

100. Fee C.J. PEG-proteins: Reaction engineering and separation issues / C.J. Fee, J.M. Van Alstine // Chemical Engineering Science. 2006. - V. 61. - P. 924-939.

101. Fee C.J. Size-exclusion reaction chromatography (SERC): A new technique for protein PEGylation / C.J. Fee // Biotechnol. and Bioengin. 2003. - V. 82. -P. 200-206.

102. Functional change of polyethlene glycol modified serine protease from Aspergillus sojae and interaction with alpha2-macroglobulin / K. Takoi et al. // Agric. Biol. Chem. - 1989. -V. 63, № 8. - P. 2063-2071.

103. Greenburg A.G. Hemoglobin-based oxygen carriers / A.G. Greenburg, H.W. Kim // Crit. Care. 2004. - V. 8. - P. 61 - 64.

104. Gulati A. Effect of stroma-free hemoglobin and diaspirin cross-linked hemoglobin on the regional circulation and systemic hemodynamics /A. Gulati, A.C. Sharma, K.E. Burhop // Life Sci. 1994. - V. 55. - P. 827-837.

105. Hansch C. ae-oe Analysis. A method for the correlation of biological activity and chemical structure / C. Hansch, T. Fujita // J. Ann. Chem. Soc. - 1964. -V. 86.-P 1616-1626.

106. Identification of the sites of deoxyhaemoglobin PEGylation / R. Iafelice et al. // J. Biochem. 2007. - V. 403. - P. 189-196.

107. Influence of intramolecular cross-links on the molecular, structural and functional properties of PEGylated haemoglobin / T. Hu et al. // J. Biochem. -2007.-V. 402.-P. 143-151.

108. Ingham K.C. Polyethylene glycol in aqueous solution: solvent perturbation and gel filtration studies / K.C. Ingham // Arch. Biochem. Biophys. 1977. - V. 184.-P. 59-68.

109. Jorgensen W.L. Aromatic-Aromatic Interactions: Free Energy Profiles for the Benzene Dimer in Water, Chloroform and Liquid Benzene / W.L. Jorgensen, D.L. Severance // J. Am. Chem. Soc. 1990. - V. 112. - P. 4768-4774.

110. Jorgensen W.L. The OPLS optimized potentials for liquid simulations. potential functions for proteins, energy minimizations for crystals of cyclic peptides and crambin / W.L. Jorgensen, J. Tirado-Rives // J. Am. Chem. Soc. -1988.-V. 110.-P. 1657-1666.

111. Kendrew J.C. Myoglobin and the structure of proteins / J.C. Kendrew // Science. 1963 - V. 139. - P. 1259-1266.

112. Knoll D.A. Effect of poly(ethylene glycol) on protein denaturation and model compound pKa // D.A. Knoll, J. Hermans // Biopolymers. 1982. — V. 20.-P. 1747-1750.

113. Kodera Y. Pegylation of proteins and bioactive substances for medical and technical applications / Y. Kodera // Progress in Polymer Science. 1998. - V. 23-P. 1233-1271.

114. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - V. 227, № 5259. -P.'680-685.

115. Lee L.L.-Y. Thermal stability of proteins in the presence of poly(ethylene glycols) / L.L.-Y. Lee, J.C. Lee // Biochemistry. 1987. - V. 26. - P. 7813 -7819.

116. Lii J.-H. The MM3 Force Field for Amides, Polypeptides and Proteins / J.-H. Lii, N. L. Allinger // J. Comput. Chem. 1991. - V. 12. - P. 186-199.

117. McDade W.A. On the formation and crystallization of sickle hemoglobin macrofibers / W.A. McDade, R. Josephs //J Struct. Biol. 1993. - V. 110, № 1. -P.-90-97.

118. Modification of human hemoglobin by covalent association with soluble dextran / E. Dellacherie et al. // Bioch. et Bioph. Acta. 1983. - V. 749. - P. 106-114.

119. Moffat J.K. Structure and functional properties of chemically modified horse hemoglobin. II. X-ray studies / J.K. Moffat // J. Mol. Biol. 1971. - V. 58, № 1. -P. 79-88.

120. Molecular aspects of the high oxygen affinity of non-hypertensive hexa pe-gylated hemoglobin, (SP-PEG5K)(6)-Hb. / D. Li [et al.] // Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 2007. - V. 35. - P. 19-29.

121. Morar A.S. PEGylation of Proteins: A Structural Approach / A.S. Morar, J.L. Schrimsher, M.D. Chavez // Biopharm. International. 2006. - V. 19. - P. 34-41.

122. Morpurgo M. Conjugates of peptides and proteins to polyethylene glycols / M. Morpurgo, F.M. Veronese // Methods Mol. Biol. 2004. - V. 283. - P. 4570.

123. Muirhead H. Three-dimensional Fourier synthesis of human deoxyhaemo-globin at 3.5 Angstrom units / H. Muirhead, J. Greer // Nature. 1970. - V. 228, №5271.-P. 516-519.

124. Multicomponent analysis of hemoglobin derivatives with reversed-optics spectrophotometer / A. Zwart et al. // Clin. Chem. 1984. - V. 30, № 3. - P. 373-379.

125. Murugan R. Competitive model on denaturant-mediated protein unfolding / R. Murugan // J. Biophys. 2003. - V. 84. - P. 770-774.

126. Optically active absorption bands of haemoglobin and its subunits / S. Bey-chok et al. // J. Biol. Chem. 1967. - V. 242, № 10. - P. 2460-2462.

127. Otamiri M. A differential scanning calorimetric study of chymotrypsin in the presence of added poly / M. Otamiri, P. Adlercreutz, B. Mattiasson // Biotechnol. Bioengin. 1994. - V. 44, № 1. - P. 73-78.

128. Oxygen binding and oxidation reactions of human hemoglobin conjugated to carboxylate dextran / Y. Jia et al. // Bioch. Bioph. Acta. 2004b. - V. 1672. -P. 164-173.

129. Pace C.N. Determinazion and analysis of urea and guanidine hydrochloride denaturation curves / C.N. Pace // Meth. Enzimol. 1986. - V. 131. - P. 266280.

130. Perutz M.F. Regulation of oxygen affinity of haemoglobin: influence of structure of the globin on the haem-iron / M.F. Perutz // Ann. Rev. Biochem: — 1979.-V. 48.-P. 327-386.

131. Perutz M.F. Structure and mechanism of haemoglobin / M.F. Perutz // Brit. Med. Bull. 1976. - V. 32, № 3. - P. 195-208.

132. Perutz M.F. X-ray analysis structure and function of enzymes / M.F. Perutz // Europ. J. Biochem. 1969. - V. 8, № 8. - P. 455-466.

133. Polyethylene Glycol Conjugation at Cys232 Prolongs the Half-Life of al Proteinase Inhibitor / A.M. Cantin et al. // American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 2002. - V. 27. - P. 659-665.

134. Preparation, Physico-Chemical and Pharmacokinetic Characterization of Monomethoxypoly(ethyleneglycol)-Derivatized Superoxide Dismutase / F. M. Veronese et al. // J. Controlled Release. 1989. - V. 10. - P. 145-154.

135. Production of PEG-modified bovine hemoglobin: economics and feasibility / R. Bradley et al. // Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 1994. -V. 22.-P. 657-667. .

136. Ripoll D. On the multiple-minima problem in the conformational analysis of polypeptides. An electrostatically driven Monte carlo method / D. Ripoll, H.A. Scheraga // Biopolymers. 1988. - V. 27. - P. 1283-1303.

137. Roberts M.J. Chemistry for peptide and protein PEGylation / M.J. Roberts, M.D. Bentley, J.M. Harris // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2002. - V. 54. - P. 459476.

138. Rossi-Fanelli M.R. Properties of human haemoglobinimmobilized on sepharose 4B / M.R. Rossi-Fanelli, Gino Amiconi // Eur. J. Biochem. 1978. -V. 92, №1,-p. 253-256.

139. Sacco D. Interaction of a macromolecular polyanion, dextran sulfate, with human hemoglobin / D. Sacco, E. Dellacherie // Febs Letters. 1986. -V. 199. -P. 254-258.

140. Shibayama N. Fixation of the quaternary structures of human adult haemoglobin by encapsulation in transparent porous silica gels / N. Shibayama; S. Saigo // J. Mol. Biol. 1995. - V. 251. - P. 203-209.

141. Site-specific cross-linking of human and bovine hemoglobins differentially alters oxygen binding and redox side reactions producing rhombic heme and heme degradation«/ E. Nagababu et al. // Biochemistry 2002. - V. 41. - P. 7407-7415.

142. Stan Tsai C. An Introduction to Computational Biochemistry / C. Stan Tsai. New York : Wiley-Liss, 2002. - 368 p.

143. Stewart J.J.P. A practical: method for modeling solids using semiempirical methods / J:J.P. Steward // Journal of Molecular Structure. 2000. - V. 556. -P. 59-67.

144. The effect of organic phosphates from the human erythrocyte on the allosteric properties of hemoglobin / R. Benesch, R.E. Benesch // Biochem. Bioph; Res. Comm. 1967. -V. 26. -P! 162-167.

145. The Recombination of a and p Chains of Human Hemoglobin. Effect of Sulfhydryl Group modification//E.J. Neer, G. Guidotti // J; Biol. Chem. 1970. -V. 245, №3.-P. 570-573:

146. The risk of transfusion-transmitted vira! infections / G.B. Schreiber et al. // N. Engl. J. Med. 1996. -V. 334. -P. 1685-1690.

147. Three-dimensional Fourier synthesis of horse oxyhaemoglobin at 2,8: A resolution: The atomic model / M.F. Perutz et al. // Nature. 1968. - V. 219, №5150.-P. 131-139.

148. Tsuchida E. Synthesis and characterization of artificial red cell (ARC) / E. Tsuchida // Biomater. Artif. Cells Immobilization Biotechnol. 1992. - V. 20. -P. 337-344.

149. Viswanadhan V.N. Mapping the binding site of the nucleoside transporter • protein: a 3D-QSAR study / V.N. Viswanadhan, A.K. Ghose, J.N. Weinstein //

150. Biochim. Biophys. Acta. 1990. - V. 1039. - P. 356-366.

151. Wang J.H. Synthetic biochemical models / J.H. Wang // Account Chem. Res. 1970. - V. 3. - P. 90-95.

152. Weber K. The reliability of molecular weigt determinations by dodecyl sulfate polyacril amide gel electrophoresis / K. Weber, M. Osborn // J. Biol. Chem. - 1969. -V. 244, № 16. - P. 4406-4412.

153. Winslow R.M. Blood substitutes / R.M. Winslow // Curr. Opin. Hematol. -2002. -№ 9.-P. 146-151.

Информация о работе

Савостин, Владислав Сергеевич
кандидата биологических наук
Воронеж, 2008
ВАК 03.00.02

Диссертация

Исследование структурно-функциональных свойств молекул гемоглобина человека, модифицированных некоторыми производными декстрана и полиэтиленгликолем - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы