Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Макромолекулярные основы направленной модификации гемоглобина для создания искусственного переносчика кислорода

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Макромолекулярные основы направленной модификации гемоглобина для создания искусственного переносчика кислорода"

РГ.Б Ой

2 В ЧОП 199^ гттожготЕския научный центр

Российская Академия медицинских наук

На правах рукописи

АЯЙГИРОМ Мария Алексеевна

МАКРОЙОЛЕКУЛЯРШЕ ОСИСШ НАПРАВЛШЮЙ ИОДЙФШЩИ ГЕМОГЛОБИНА да СОЗДАНИЯ ЖКУССТВЕНШГО ПЕРЕЮСЧЙКА КИСЛОРОДА

03.00.04. - СИОХИШИ

Диссертация

в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора биологическое наук

г

Шсква 1994

Работа выполнена в Гематологическом научном центре

Официальные оппоненты:

доктор химических наук И И. Шгильман доктор медицинских наук В. Н. Мигунов доктор медицинских наук ЕЫ. Русанов

Ведущее учревдение - Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Е В. Склифосовского

Защита диссертации, состоится увк'оС/,^ 1994 г.

в /у час. на заседании диссертационного совета Д 001.45.02 в Гематологическом научном центре (Москва, 125167, Новозыковский проезд,4а).

С диссертацией можно .ознакомиться в библиотеке Гематологичес-

кого научного центра

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Е Д. Реук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность пооблеш . .

Сузествушцэ в настоящее время кровезаменители обладает достаточно кирокик спектром лечебного действия и подразделяется по прншггой клзсс15фккацш! ка четыре основные группы: со девке гафузи-онкне растворы, препараты геьсодинзккческого.дезштогеижа'зазнкого действия, парентерального к болкового питания. Ни один кз утазап-ных типов кровезаменителей не способен осуществлять ваквейшую функцию переноса кислорода,в связи с чем в клинической' практике сохраняется прккенение-непосредственно эритроцитов донорской крс-ви. .Еимяткрозагашэ сроки хранения эротроцктнсй кассы.групповая специфичность и риск передачи вирусных инфэкшй (гепкгит.ШЧ) обусловливает необходимость создания искусственного переносчика -гаюлорода (ИПК), лишенного указанных ограничений.

Исследования по созданию 1ШК на основе гемоглобина (Нз) развивается по двум основшгк' направлениям: моделирование эрагроцитов путем >.мкрокалсулирования растворов Вв и химическая юднфикация непосредственно сашй молекулы этого белка с целью увеличения времени его циркуляции в кровеносном русле.

В теоретическом плане каддое из этих направлений выеет как свои преимущества,так и недостатки. Например, лилосокирозание Бв. позволяя достигать внутри шкрокапсулы концентрации белка,близкой' к эритроцитам,не моаэт преодолеть тагаге недостатки получаемых ге-!,;осом, как ограниченный период их циркуляция в кровеносном русле, аредполиительво зависящий от их размеров,состава и структуры син-гетических меибран. Дуть химической кодификации Вз, начатый в надей стране группой ученых под руководством проф. Г. Я. Розенбер-га, обеспечивал значительную вариабильность в решении проблемы, что 1рнвело к получение больного числа модельных соединений, обладавших юновныии необходимыми для ИШ свойствами.

Однако многочисленные исследования как в налей стране .так и ¡а рубедэм до настоящего времени не привели к создании препарата ШК.что связано,вероятно, с проявлением при введении некоторых со-¡дкнений Нз кесэлгтелышх побочных реакций, механизм которых оста- •

ется неясныц. Синтез того иди иного соединения,предназначенного в качестве осеовы препарата ИК по нзлзеку мнения должен базироваться на скрининге данных комплексных биохимических и биологических экспериментов, чеиу и посвящена данная работа.

Дель исследований

Цель исследований заключается в создании на основе химического производного Нв методом направленной модификации отюзльного по шлекулярно-иассэвоыу составу функционально полноценного универсального переносчика кислорода, свободного от ограничений, присущих донорсксй крови.

В связи с этяы представлялось целесообразным,установив закономерности в изменении фракционных ссс;а£оз хиимески модифицированных производных Бв в процессе их циркуляции в кровеносном русле, выявить оптимальную иакроюлекулярнус структуру, способную длительно и полноценно выполнять функции ИБК в организме. Такой подход к созданию ИПК потребовал в свою очередь разработать пути нгзравлеякоя модификации Нв, обеспечизахдае воспроизводимое получепие соединений с различным заданныыиы содержанием в них полимерной форш.а такке для последующей наработки производного Нв, выбразного в качестве, оптимального.

Для достижения этой цели были поставлены следупцие задачи:

1. Изучить us. основе анализа теоретических и экспериментальных данных шкргаолекулярные особенности химических производных lía, определяющие их поведение в кровеносном русле квотных.

2. Еиявить факторы, влияющие на направление реакции кодафисации Нв при использовании метода непрерывней полимеризации, к на их основе разработать условия получения производных Нв с зарахее затган-шаги на:дх)1«к2КугярЕ1ьи хараотеркстикаик.

3. Езучкгь сиЕтеэкровакниа црокзводавз Ев б акспар^шкте in vitro по кр1:герщщ, определяла их пригодность в качестве ШЕ.

4. Устакоглть закономерности изменений фракционных составов ке-следуеиых соединений в процессе их функционирования в кровеносном

русле яивотных на основе сравнительного анализа результатов изучения различные методами • накроструктурных особенностей длительно циркулирукцих фракций.

5. Выявить оптимальный ьюлекулярно-массовый состав химического соединения Нв, способный в процессе длительной циркуляции в организме сохранять своя функциональную полноценность.

6. Подтвердить в эксперименте in vivo перспективность выбранного соединения Нв для дальнейшего использования в качестве основы лекарственной формы искусственного переносчика кислорода.

. Научная новизна - ■

1. Теоретическое значение работы состоит в том, что впервые установлена взаимосвязь между макроюлекулярой структурой производ- -ных Нв,обладавших сродством к кислороду,близким к эритроцитам донорской крови, и их функционированием в качестве ИПК.

2. Установлено, что поведете и функционирование искусственного переносчика кислорода на основе химически модифицированного гемоглобина в кровеносном русле животных определяется его ыодекуляр-' но-кассовым составом,который не должен содержать фракций с молекулярной массой свыше 120 кД.

3. Еперые показана- возможность проведения направленной 'модификации Нв с использованием глутарового альдегида для получения соединений с заранее заданными функциональными свойствами и фракционным составом.

4. В опытах in vitro и in vivo экспериментально установлен оптимальный молекулярно-массовый состав производного гемоглобина, способный длительно циркулируя в кровеносном русле,сохранять функциональную полноценность,сравнимую с эритроцитами донорской крови.

Практическая значимость работы.

В результате разработки условий направленной модификации белка ний фракционных составов химически модифицированных Ев в процессе циркуляции в -кровеносном русле животных получено оптимальное по составу и функциональным характеристикам соединение.

Разработанный штод позволил провести серийную наработку данного типа соединения,обеспечивпую осуществление широкого биологического эксперимента. На экспериментальных животных продемонстрировано наличие лечебной эффективности полученного соединения в различных моделях массивной кровопотери. Результаты проведенных биологических исследований подтверадает наличие лечебной эффективности синтезированного производного Ев и могут быть использованы для составления ЮС.

Как показали эксперименты на собаках в моделях острой смертельной кровопотери и геморрагического шока,введение растворов этого соединения в дозах 4 г/кг веса оказывало гемодингшическое действие, обеспечивало 100% впаивание животных без дополнительного лечения и не вызывало грубых побочных эффектов. Излученные данные позволяют рассматривать данное соединение как оптимальное для создания на его основе кровезаменителя-переносчика кислорода.

Апробацпз работы. Основные положения диссертации долояэны ка научных сессиях ЦНИЕГПК (Мэсква 1984.1985) .Совзтско-Американском симпозиуме по клинической трансфузиодогии и про^аагжике пост-трансфузионсого гепатита (Шсква,1984), II Всесованом съезде гематологов и трансфувкологов (Львов,1985),II Укранском съезде гематологов и " траксфузг.ологов (Киев, 1986)", IX 'Всесоюзном научном' симпозиуме ео синтетическим полимерам медицинского назначения (Звенигород, 1891)

Внедрение в практику.

Результаты исследований изменений фра:ащоняых составов производных Нв позволили выявить оптимальное, длительно и полноценно функционируете в кровеносном русле соединение,а разработанные условия направленной модификации белка обеспечили воспроизводимое получение 10 серий раствора тачого типа соединения с концентрацией белка 8-10 2 в количестве 5-10 литров за серия,что является основанием для работ по созданию лекарственной формы искусственного переносчика кислорода с использованием разработанного автором производного гемоглобина.

Публикации. Основные результаты исследований опубликованы в 26 печатных работах,в том числе - 17 в изделиях, публикуемых за рубемэм. Получено 9 авторских'свидетельств на изобретения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Взаимосвязь мехду ыакромолекулярной структурой производных Нв и их функционированием при циркуляции в кровеносном русле экспериментальных ¡жвотных.

2. Получение производных Нв с заданными молекулярно-массовым составом и функциональными характеристиками методом направленной модификации при использовании глутарового альдегида.

3.Сравнительное исследование полученного ряда химических производных Ев in vitro в соответств1Ш с требованиями, предъявляемы)® к кровезаменителям ШШ.

4. Установление оптимального фракционного состава химически модифицированного Нв,обеспечивающего длительное пребывание в кровеносном русле и сохранение функциональной полноценности на уровне эритроцитов донорской крови.

5. Выявление лечебной эффективности синтезированных производных Нв на экспериментальных животных при экстремальных состояниях ни-вого организма.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований. В качестве исходного материала ¿ настоящей работе были использованы растворы очищенного гемоглобина, полученные в лаборатории гемодинамических и дезагрега-ционних гедокоррегсгоров (зав. лаборатоией А. А.Козлов). В работе применялись реактивы как импортного, так и отечественного производства : глсутаровый альдегид, 25% раствор "Serva",боргидрид натрия "Signa",пиридоксаль-5-фсс^ат натрия производства Краснодарского химкомбината, хроматографические носители, а такие специальные реактивы для проведения электрофореза и кзозлегсгрофэ-кусирования фирмы'"LKB" и "Sigma".

Химическая модификация гемоглобина осуи^етвлялась непрерывным методом (Ает.свид.N 189810),различия фракционных составов и функциональных характеристик достигались изменением параметров процесса, a такие использованием различных реагентов и их соотношений. Концентрации исходных растворов гемоглобина варьировали от 2 % до 19Z. В качестве среды использовали воду, физиологический раствор и 2М раствор NaCl. Пиридоксаль-5- фосфат.глиоксалевуп, пировиноградную и кетоглутарову» кислоты добавляли в виде их натриевых солей. Дезоксигенацию гемоглобина осуществляли с помощью мембранных оксигенатороз фирмы "Scibted"(C2A) в атмосфере азота при 37"С. Вселэ охлаздэния в теплообменнике до +4°С дезоксигекогло-бин смешивали с охлажденным дезоксигенированным раствором глута-рового альдегида в концентрации, обеспечквахщей определенное заданное мадыгае соотношение с белком (от 6:1 до 30:1). Реакционную смесь подвергали гидрированию боргидридом натрия в непрерывном режиме, поддерживая рН около 7,0 + 0;2 титрованием 1М раствором NaHpo^c использованием антипенной эмульсии фирмы "Serva". Продукт освобождали от частиц эмульсии фильтрацией,диализовали и концентрировали на диализаторах фирмы "Ami con" с использованием волокон или мембран с диаметром пор 10 тыс. Конечная концентрация гемоглобина е растворах составляла 8-12%.

В растворах ' наивного и модифицированного геыоглэбкнсв концентрацию определяли на приборе "COOxirceter 282" фирмы "IL" с погрешности измерения для гемоглобина +0.2Z и для .¿ет-форма - + 0,5%. Концентрацию гемоглобина в образцах плазмы устанавливали на снектрофоткйтре "Uitraspec " фирмы "LKB" по поглощении при 525 нм и 578 на.

Кислородно-диссоциационные кривые (КДК) в исследуемых образцах регистрзроваии на приборе "Ней-О-Scan" фирмы "Amineo" (США) в физиологических условиях при 37 С, рН 7,4, £40 ми рт. ст., 0,15 Ь! NaCL Количественную оценку КДК проводили по расчетной величине р.-а , , характеризующей сродство ксследуешх образцов к кислороду. Из- -меренга проведены Е. П. Вязовой к JL а Фетисовой.

Анализ фракционных составов образцов химически модифицированных гемоглобкнов до и з процессе циркуляции проводили методами ' жидкостной хроматографии на Сефарозе CL-бБ, а также высокозффек-

<

тквной жидкостной хро!латографиии с использованием оборудования фирмы "LKB" совместно с А. И. Зейналовым на колонках фярмн " LKB" и "Vaters". Детектирование проводили при 400 нм, процентное содержание фракций с -различной молекулярной массой определяли с использованием интегратора.2220 фирмы "LKB".

Средневесовую молекулярную мессу (iL) определяли методом седи-ментационного анализа на аналитической центрифуге фарш "Вескпгпп" средкёчиеленную (Я,) - методом мембранной осмометрии на мамбранном осмометре фирш "Knauer".

Электрофорез и изоэлектрофокусорование образцов осуществляли на приборе "Multiphor" фирш "LKB" с последующим денситометриро-ванием злектрофореграил и изофореграмм на денситометре "Ultroscan 2202" фирмы "LKB" совместно с 11 Г. Вашкевич. Онкотическое давление растворов измеряли с помощью мембранного ошшметра IL 186, используя мембрану для 30 кД. Относительную вязкость растворов оп- 1 ределяли в диапазоне 2-12% при 37 С на U-образном вискозиметре Освальда (ВПЖ -1) с диаметром капилляра 0,8 мм и водным временем 25,5 с.

. В экспериментах на лабораторных жвотных изучались: время цир- . куляции химически модифицированных гемоглобинов при плеторическом введении в различных дозах на кроликах и крысах (совместно с P. R Нэдошивиной, К BL Контугановым), гемодинамические и газотранспортные- свойства, а также выживаемость на собаках- на модели острой смертельной кровопотери (совместно с IL Р. Колониной и К1 А. Литвинен-ко) и геморрагического шока (совместно с К.А.Гербутом и ЕК.Коче-тыговым).

Результаты исследований статистически обрабатывались на компьютере НР-85 по программе НР-85 General Statistic Рас.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение Л1аажя изменений фракционного состава химически модифицированного гемоглобина в процессе циркуляции.

1.1. Обоснование выбора направления исследования.

Первые попытки создания кровезаменителя на основе Нв относятся к 30-ым годам (V. R. Amberson et al,1934), когда были предприняты

попытки непосредственного введения в кровеносное русло растворов внеэритроццтарного Нв. . Быстрое выведение,наблюдавшиеся побочные реакции при введении показали невозможность непосредственного применения ВЕеэритроцйтарного Нв и надолго приостановили попытки создания кровезаменителя на основе этого белка. Вернулись к этому направленна исследований в области создания новых кровезаменителей лишь в 70-х годах, когда, учитывая результаты предццудих экспериментов и отказавшись от попыток прямого применения Нв,начади поиск в нескольких направлениях - создание искусственного эритроцита и химическая модификация Нв.

Цель обоих этих направлений обп&я - обеспечить функционирование внеэрЕгроцитарногс Нв в кровеносном русле. Однако, если в первом направлении вставала проблема моделирования клетки, то во втором предполагалось методами химической модификации белка обеспечить его функционирование в кровеносном русле, что представлялось более простым решением. Видимо этим объясняется тот факт,что практически одновременно несколько групп ученых в нашей стране,а тгкке в США,ФРГ, Японии отдали предпочтение именно второму направленна. У нас эти исследования возглавил проф. Г. Я Розенберг.

На первых этапах исследований к соединениям Нв предъявлялось два основных требования: стабилизация тетрамерной структуры и обратимость присоединения кислорода (18). • ■

За два десятилетия было синтезировано большое количество производных На, в той или иной мере удовлетворяющих этим требованиям. Все они шгут быть условно разделены на три основных класса: производные баз изменяя молекулярной массы, конъюгаты и полимеры Нв.

К первой группе относятся производные Нв, представляющие собой большей частью модельные соединения, используемые для отработки путей регулирования функциональных свойств внеэритроцитарного Нв,которые представляют, главным образом, научный интерес (11. М.А.ЗЙГ1П1 еЬ а1,1989 ). .

Ко второй группе шгут быть отнесены соединения, подученные в результате присоединения Нв к различным биополимерам, которые саш являются кровезаменителями,например, такие, как альбумин (Авт. св.N 2217083, 1977), производные. декстрана (, Авт. св. N 103533,1975,3. Таи, 1976),полиэтиленгликоль (Е. 1Ы1асЬэг1е,1990).

Присоединение Из к высокомолекулярным носителям позволило увеличить его время удерживания в кровеносном русле, но привело к значительному снижению кислородной емкости в расчете на 1 г. получаемого соединения.

Третья группа производных Нв охватывает полимеры, получаемые с -поморю различных бифункциональных сшивающих агентов. Количество известных сживающих бифункциональных агентов весьма велико, и каждый исследователь делает собственный выбор, исходя из намечаемой схемы химической модификации Нв (К. а Утйе^1ГГ,К.М.Шгв1с*,1991). •При этом основными критериями являются доступность реагента, возможность контроля его качества и использования в производстве лекарственного препарата, избирательность взаимодействия с-белком и др. Наибольшее распространение подучили реагенты, имеющие в качестве реакционно способной карбонильную группу, в частности, раз-, личные диальдегиды. Объясняется это тем, что, как это было установлено целым рядом исследователей .реакции в этом случае протекает по е- аминогруппам лизина,которых в 10 раз больше на поверхности молекулы белка по сравнению с концевыми группами, модт^икация которых нежелательна.

Анализ известных дкальдегидов позволил установить, что наиболее предпочтительным, является глутаровый диальдегид, шроко известный в качестве стерилизующего агента, а такие•применяемый при фиксации меток.

С применением этого реагента различными группами ученых главны/ образом в США и нашей стране (1;И.К.В1еекег et а1.1991) были получены полигеьюглобины, различающиеся мевдг собой по фракционному составу и функциональным характеристикам. Однако, несмотря на интенсивность проводимых исследований, до сих пор отсутствует коммерческий препарат переносчик кислорода на основе химически модифицированного Нв. Причины заключаются в ряде выявленных нежелательных реакций, установленных в ходе широких 'биологических испытаний при разработке лекарственного препарата. По мнению целого ряда исследователей (М.Рео1а вЪ а1,1888) эти реакции.а также различия в поведении в кровеносйом русле связаны с гетерогенностью составов испытывавшася -полигемоглобинов. В связи с этим представлялось необходимым исследовать структурные особенности химически

модифицированных Нв, влияющих на их поведение в кровеносной русле, и с учетом полученных данных,используя методы направленной модификации, синтезировать оптимальное по фракционному составу соединение.

1.2. Динамика изменения фракционного состава полигемоглоОина в процессе циркуляции в кровеносном русле.

Выбор оптимального производного Нв в качестве основы для ИПК по нашему мнению должен базироваться на экспериментальном исследовании состава наиболее длительно функционирувярй фракции з процессе циркуляции, что возмогэю при изучении динамики изменения степени гетерогенности вводимого соединения Нв. Такая постанов-га задачи позволяла объеютвно установить оптимальную шкрохолекулярную структуру химического производного Нз, способную длительно функционировать б кровеносном русле.

В качестве модельного соединения Нз для детального исследования его поведения в кровеносном русле был выбран полхгемоглобин, содержащий в своем составе различные по молекулярной"массе фракции (рис. N 1) (Авт.св. N 189810) с общим содержанием полимерной формы около 50Х. Значительная гетерогенность данного соединения позволяла проследить "вбзма^ыб изменения фракционного состава в процессе } циркуляции в широком диапазоне молекулярных масс (13).

Качественный и количественный анализ изменений, фракционного состава изучаемого соединения проводился на основе данных исследования различными хроматографическнми методами образцов плазмы крови экспериментальных ливотных, взятых в определенные сроки наблюдения. Эксперименты проводились на пяти сериях. производного Нз с общим содержанием полимерной фракции 50-55% при введении кроликам . массой 1,5-2 1сг дозы 1 г/кг. Общее число животных составило 50.

При использовании гель-пронккаюцей хроштогра&га (рис.Н 1) установлено, что в процессе циркуляции изучаемого соединения Нз наб/

лэдаотся изменения кривой молекулярно-массового распределения в сторону "увеличения содержания высокомолекулярных компонентов и значительное снижение фракции, соответствующей нешдкфицированному Нв.что находит свое отражение и при количественной оценке происхо-

дявях изменений (табд-N 1) с использованием ВЖХ.

Рис.1. ИЗМЕНЕНИЯ МОАЕКУЛЯРНО-массоюго распределения полигемо-

_______глобина пг-пф-з в. процессе. циркуляции (зсриагобе-с!- б в).

Таблица К 1

Изменение фракционного состава производного Нв с обдан содержанием полимерной фракции 50Х в процессе циркуляции (%).

Время отбора . Молекулярная масса фракции (кД)

пробы -

300 100 60

0 7,5±1,2 39.4+6.2 54.3+10,6

10 мин 13,5+3.4 48,2+9,7 39,2+8,7

6 час 42,5+7,1 52,8+11,4 6.4+2.3

18 час 75.8+15.4 25,5+5,7 -

24 час 86,3+12,8 14.9+4,6 -

Анализ процентного содержания циркулирующие фракций позволяет предположить, что увеличение доли высокомолекулярных компонентов происходит не только вследствие перераспределения из-за выведения

низ ко молекулярных фракций, но и из-за возможного образования новых высокомолекулярных агрегатов в процессе циркуляции.

На справедливость этого предположения указывали результаты исследований методом ионообменной хроматографии образцов плазмы в те ж. сроки наблюдения, выявивших такае последовательные изменения, з распределении по поверхностному заряду в сторону более низких значений. ИзоэлектрофокусироЕание показало, что,среднее значение величины нзоэлекгрической точки (р1)производного Ев через 24 часа его циркуляции снизилось до значений 6,2 по сравнению с 6,8 для исходного соединения (13).

Субъединичный состав изучаемого соединения Нв через 24 часа его циркуляции изучали методом ЕВБ-элекгрофореза после "отделения от белгаз плазмы с помощью препаративного изоэлежгрофо^сирозанкя. Как следует из характерного денситометрического профиля полученных, электрофорегрзмм (рис 2), выделенная фракция значительно менее ге-терогенна по сравнению с исходным составом и Ее содержит субъединиц, соответствующих наиболее низкомолекулярным и высокомолекулярным компонентам, имевшим место до введения в кровеносное русло. Однако,в составе фракции обнаружены новые субъединицы с моле1суляр-ной массой 60 кд, отсутствовавшие в исследуемом производном Нв.

„ " 65 50 "30' 16 МОЛЕКУЛЯРНАЯ' МАССА, тыс. Б '

"аю I

60 1

Рис.2 . ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКИИ ПРОФИЛЬ ЭЛЕКТРОФОРЕГРАММЫ

ИСХОДНОГО ПОЛИГЕМОГЛОБИНА ПГ-ПСР-3 И ФРАКЦИИ, ЦИРКУЛИРУЮЩЕЙ В КРОВЕНОСНОМ РУСЛЕ ЧЕРЕЗ 24 ЧАСА

Проведенное изучение субъединичного состава производного Нв в процессе его циркуляции подтвердило установленный хронографическими методами механизм происходящих изменений, касзхгщся в основном низко- и высокомолекулярных компонентов.

Таким образом, исследования изменений гетерогенности соединения Нз с общим содержанием полимерной формы 50-Б5Х в процессе его циркуляции показали, что эти изменения носят закономерный характер и отражаются на далекулярно-массовом, субъединичном составе введенного соединения. При этом наибольшим изменениям подвержены крайние компоненты гетерогенной системы, ниболее легкие (соответствую-пс-ге немодифицированному Нв) и тяжелые с молекулярной массой 300 КД. К наиболее удерживаемым и сохраняющим свой первоначальный сос-. тав следует отнести фракции, молекулярная масса которых находится в интервале 60 - 300 кД. Это заключение позволяло предположить, что именно в зтом интервале находится оптимальная для ШЖ на основе модифицированного Нв молекулярная масса

Выявленные закономерности изменения ~нолекулярно-массовых составов фршщий производных Нв, а также установление наиболее стабильной молекулярной кассы в процессе циркуляции в кровеносном русле требовали своей экспериментальной проверки с использованием различных по составу производных Нв, молекулярно-массовый состав которых был бы достаточно узок и соответствовал выявленным значимым интервалам величия молекулярных масс, чему и посвядэн следующий раздел работы.

2. Направленная химическая модификация гемоглобина

2.1. Разработка условий направленной химической модификации гемоглобина

Экспериментальная проверка взаимосвязи между иэлекулярной массой химического производного Нв и характером его поведения в процессе функционирования в кровеносном русле была возможна лишь при наличии такого рода соединений Ев, которые бы обладали незначительной гетерогенностью и молекулярные массы фракций которых находились бы в определенном интервале величин. Кроме того эти соединения должны

были удовлетворять основным требованиям, предъявляемым к ШШ.

Описанные в литературе способы получения и свойства многочисленных соединений Нв,„ рассматриваемых их авторами как модели ИПК, исключают их непосредственное использование, так как из-за отличий в составах и характеристиках не поддается какой-либо унификации, а, значит,неприменимы для системного анализа-(К. Б. Уагйегг^ГГ , 1991;Р. Е. Ке1рег1:,1993). В связи с этим возникла необходимость разработать условия проведения направленной химической модификации Нв,позволяющие получать ряд соединений белка с заданным фракционным составам и,следовательно, с определенными физико-хкмическю.а и биохимическими свойствами.

Проводимая наш химическая модификация Ев с целью получения ИПК преследует выполнение двух задач: присоединение регулятора обратимой оксигенации к молекуле белка и стабилизация его тетрамер-ной структуры (16).

Необходимость присоединения регулятора обратимой оксигенации к молекуле вкезритроцитарного Нв связана с его повышенным по сравнению с белком, находящимся внутри эритроцита, сродством к кислороду, которое определяется наличием внутри клетки природных аллостери-ческих регуляторов-процесса обратимой оксигенации.

. В, то зке время одно из основных требований, предъявляемых к ИПК, состоит в приближении кислородно-транспортных свойств получаемых модельных соединений к таковым донорских эритроцитов.

Поиск соединений функциональных аналогов имеющегося в эритро-/цитах 2,3-дкфосфоглицерата, доступных и способных достаточно эффективно сюшать сродство гемоглобина к кислороду, а тага® необратимо и по возможности просто присоединяться к молекуле Селка представляет собой самостоятельную часть в проблеме создания ИПК на основе Нв.. В качестве таких веществ нами кспыгывался целый ряд соединений, отличительными особенностями которых были способность к аллостерической регуляции процесса оксигенации И' возможность необратимого присоединения к молекуле белка благодаря наличию в их составе альдегидных групп. Так были синтезированы и изучены производные Нв, модифицированные такими соединениями как пиридоксаль-5-фосфат (ГИ), а такзяе ранее не описанными кетокислотамк: шнокарбо-новыми - глиоксалевой и пировиноградной и дикарбоновой - кетоглу-

таровой (5, 8,9).

Шд контролем получаемых соединений методами ионообменной хроматографа и их функциональных характеристик были разработаны условия присоединения низкомолекулярных регуляторов обратимой окси-генации, обеспечивающих получение производных Нв с заданными значениями сродства к кислороду в широком интервале величин от 2535 мм. рт. ст.. фи этом необходимые для регуляции молярные избытки колебались от минимальных 4-х кратных в случае Ш до максимальных ЗО-ти кратных для пировиноградной кислоты, что проявилось в увеличении синтезированных соединений по величине поверхностного заряда (12).

Излученные результаты позволили расширить спектр функциональных возможностей ИШ на основе химически модифицированного Нз и вариабельность выбора низкомолекулярного аналога 2,3-Л®. Предпочтительным для дальнейших исследований соединением - регулятором обратимой оксигенации - представляется ПФ, который позволяет достигать величин сродства к кислороду, соответствухщих именно значениям свеяззаготовлеяной донорской крови (29-31 мм. рт. ст.), не требуя значительных молярных избытков,что позволяет избегать существенных изменений поверхностного заряда получаемого белкового производного.

Поэтому для дальнейших, экспериментальных исследований по поиску оптимальной макромолекулярной структуры в качестве регулятора оксигенацш был выбран 05, присоединение которого к производным Нв исключало дополнительные изменения в макроструктуре получаемых со' единений, которые могли бы оказать дополнительное влияние на поведение в кровеносном русле.

Выполнение второй задачи - стабилизация тетрамерной структуры - осуществлялось с использованием в' качестве сшивагярго агента глутарового альдегида, преимущества которого указывались выше.

Разработка условий проведения реакций основывалась на теоретических положниях кинетики химических реакций и особенностях строения и реакционной способности модифицируемого белка

Поиск условий направленной модификации Нв проводился с использованием непрерывного метода синтеза,позволявдего варьировать последовательность стадий реакции модификации, а также любой параметр

- 18 -

внутри каздой стадии (Авт. св. N 189810).

Применение данного метода кодификации обеспечивает непрерывность и последовательность протекания всех необходимых стадий химической модификации белка, возможность контроля и соблюдения расчетных параметров процесса, а также его воспроизводимость и значительная производительность,достигающая значений 5-10 литров за серию.

Критериями пригодности отрабатываемых условий реакции модификации служили содераание метформы, фунгацюнальные характеристики, а также фракционный состав получаемых продуктов реакции, анализ которых проводился с помощью методов, перечисленных в разделе "Материалы и метода исследования".

Было взучено влияние на фракционный состав получаемых производных гемоглобина следующих факторов: скорость подачи белка и сживающего агента, их исходные концентрации, соотношение вводимых реагентов, а также значения рН и ионной силы среды протекания реакции. Исследованные интервалы величин составили для стрости подачи реагентов 1000-2500 мл/час, исходной концентрации Ев 1-20 г/дл, соотношения реагентов (гяутаровьй альдегид: Нз)( в молях) 5:1-30:1,рН 6,0-8,5. В качестве реакционной среды были исслздозаны обессоленная вода, 0.15 М и 2,0 Ы растворы НаС1.

Эффективность воздействия того или иного фактора оценивали по фракционному составу получаемых образцов с помощью гель-хроматог7 рафических методов..

В результате проведенных исследований было установлено, что на направление реакции модификации Нв практически не оказывает влияния в избранном интервале такие параметры как ионная сила и рН реакционной среды. Применение более широкого интервала величин было ограничено всокой лабильностью Нв. Наиболее существенное значение для фракционного состава получаемых соединений ийоют скорость смешения реагентов, исходная концентрация бедка и соотношение реагентов. В качестве оптимальной для снесения реагентов была установлена скорость в 1200 мл/час, так как снижение этой величины влекло за собой возрастание гетерогенности по составу образующихся соединений, а увеличение приводило к снижения эффективности модификации за счет сокращения времени "реакции.

Варьированием двух параметров, исходной концентрации белка и соотноиением модифицирующих агентов, при соблюдении скорости смешения реагентов 1200 ыл/час был получен ряд соединений Нз, из которых было выбрано 4 типа,различных по общему содержании полимерной формы, фракционному составу, но близких по функциональным характеристикам к эритроцитам донорской крови (Авт. свкд. N 172203. 285643,321561;12).

Выбранные соединения представлены в табл. N 2.

Таким образом, проведенные исследования позволили, установив основные факторы, влияидне на направление реакция химической модификации Нв непрерывным методом, разработать такие условия проведения модификации,которые обеспечивали получение воспроизводимых по составу соединений Нв с различным заданным содержанием полимерной

Таблица N 2

Основные характеристики производных Нв,подученных методом направленной модификации.

шифр число доля сродство содержание

образца опытов полимерной к мет-формы, Ы„, М„

. . формы . кислороду (X от .....

(%) (мм-рт.ст.)общего Нв) * 10* * 103

ПГ-Ш-1 4 2-3

ПГ-ШЬ2 9 29-33

ПГ-1^-3 6 50-55

ПГ-ПФ-4 3 70-75 кровь

27,1+1,8 2,5±0,5

28,7+1,6 2,9+0,8

31.5+1,1 3,5+0,6

29,5+4,0 4,5+0,7 26-28

110+30 90+10 230+37 200+35 650+55 620+60

формы и не приводили к образованию мет-формы. Из ряда синтезирование соединений Нв были выбраны в качестве гомологического ряда 4 типа соединений с долей полимерной Форш от 2-32 до 70-75Z для проведения дальнейшее исследований по влиянию фракционного состава на функционирование в кровеносном русле и поиску оптимальной макромолекулярной структуры.

2.2. Изучение макромолекулярного состава и физико-химических свойств производных гемоглобина с различным содержанием полимерной формы.

2.2.1. Шкромолекулярный состав производных Не.

Разработанные условия направленной химической модификации Нв позволила получить,его производные, различные по содержании полимерной формы. Представлялось необходимый провести изучение мак-роструктурных различий синтезированных соединений с целью установления структурных особенностей, оказывающих влияние на их поведение в кровеносном русле.

Исследование макромолекулярной структуры состояло в изучении фракционных составов полученных производных Нв на двух уровнях -полимерном и субъединичном. Результаты таких исследований позволяли определить направление проводи 1Юй реакции модификации белка и степень гетерогенности получаемых продуктов на молекулярном и субъединшшом уровне (13,14).

Экспериментальное изучение проводились с применинэм различных типов хроматографии и электрофореза в присутствии ДСН, указанных в разделе "Наторкали и методы".

Приведенные в таблице 3 данные свидетельствуют, что увеличение общего содержания полимерной формы в продукте реакции модификации Нв заметно отражается на степени его гетерогенности, причем за счет увеличения- количества главным образом фракций с молекулярной массой свыше 200 кД. При этом следует отметить близость значений в процентной выраавшш во всех 4-х типах соединений содержания фракций с молекулярными кассами 70 кД и 120 кД, -соответствувдиыи величинам нативното Кз и дн-Кв.

Таблица N 3

Фракционный состав полигеыоглобинов, полученных направленной химической модификацией.

шифр образца кол. обр. общее содержание пслъкеркой формы содержание фракций (Z) массой в кД с молекулярной

С» свыше 200 120 70.

ПГ-Iffi-l 5 2-3 - 2,33+0,57

ПГ-Ш-2 10 29-33 13,33+4,15 18,69+0,91

ПГ-Ш-3 ' 6 50-55 17,25+2,17 20,17+1,18 17,04+0,82

ПГ-ПФ-4 3 70-75 32,43+5,19 22,18+3,41 19,44+1,12

Рис. Z. СУБЪЕДИНИЧНЫЙ СОСТАЬ ПРОИЗЪОДИЫХ НБ, ПОЛУЧЕННЫХ НАПРАЬЛЕННОй МОДИСРИКАЦЫЕЙ

Интересным представлялось рассмотрение субъедипичкого состава этих соединений. Дзнные, полученные с помощью электрофореза в присутствии ДОН и представленные на рис. N 3. свидетельствует, что доля свободных полипептидных цепей Нв достоверно снижается с увеличением общего содержания полимерной формы в составе белковых производных. При этом среди спитых цепей наблюдается достоверное увеличение содержания крупных конгломератов с молз^лярной массой 64 кД и выше, представляющих собой жестко сшитые полшпепдидные цепи. Видимо, образование именно таких конгломератов в процессе проводимой реакции модофжации обуславливает появление в составе полимерной формы фракций с молекулярной массой, превышавшей 200 кД.

Следует отметить, что сравнительный анализ данных, полученных при установлении фракционного и субъединичного составов, свидетельствуют, что в структуре полученных производных Нв наряда' с жесткими связями, создаваемыми с помощью сшивающего агента, глута-рового альдегида, сохраняется значительный вклад мексубъединичных взаимодействий, присущих этому белку в нативном состоянии.

Таким образом, проведенные исследования структурных особенностей изученных производных Нв в частности их фракционных составов и вклада отдельных фракций в степень их гетерогенности позволили выявить глубину и направление проводимой химической модификации белка. Приведенные Жданные дают возможность сделать заключение, что гетерогенность состава синтезируемых соединений определяется на субъединичном уровне, ответственном за образование тяжелых фракций, и что варьированием условий осуществления реакции модификации Нв можно управлять степенью гетерогенности образующихся продуктов реакции, а, значит, получать соединения с заранее заданным макро-молекулярккм составом. Кроме того, проведенный анализ составов выбранных типов производных Нв подтвердил наличие в них компонентов с молекулярными массами, представляющими наибольший интерес при изучении процессов выведения из кровеносного русла.

2.2.2. Зункциональные и физико-химические характеристики производных Нв.

Для рассмотрения синтезированных соединений Нв в качестве воз-

иных ИПК весьма важным является наличие у них соответствухадих рактеристик, определяющих их функциональную полноценность и не-ходкмке реологические свойства растворов.

Экспериментальная оценка функциональной полноценности произ-дных Нв на основе значений величин сродства к кислороду исследо-нных образцов, проведенные Е. П. Вазовой с сотр. (19). показали, что едичение содержания полимерной формы практически не оказывает ияния на эту характеристику, которая,будучи определена при физи-згических условиях, не отличается от таковой для свеяезаготов-нной донорской крови (26-28 мм. рт. ст), и значения ее колеблются пределах от 27,1+1,8 мм.рт.ст. до 31,5+1,1 мм.рт.ст.(п-20)(табл. 2 ).Из приведенных данных следует,что разработанные условия хи-зеской модификации Нв позволяют получить соединения, практически гнтичнке по функциональным свойствам донорским эритроцитам.

Однако рассмотрение того или иного соединения в качестве воз-кного кровезаменителя ИПК требует наличия наряду с необходимыми зотранспортными свойствами определенных реологических и колло-ю-онкотических характеристик растворов (21,26). Ба рясункэ • К 4 представлены кривые концентрационной завксимос-относитедьной вязкости растворов синтезнровнных соединений, из рорых следует,что относительная вязкость всех исследуемнх образ-5 закономерно возрастает- с увеличением содержания в них полимер-X форма Значения относительной еязкости крови (4,7-5", 7 спз) ?вышастся лишь 5-6Z растворами ■соединений типа ПГ-Ш-4, с общим держанием полимерной формы 70 Z. Величины относктельной вязкости яворов остальных типов соединений Вв при всех исследованных щентрациях остается ниже таковых для крови и,следовательно,они годны для введения в кровеносное русло.

Важной физиологической характеристикой исследуемых растворов ¡яется так¡se их коллоидно-онкотическое давление. Так, по мнению ta авторов (6. S. Kfoss, 1988) введение в кровеносное русло иатнвно-. онкотически активного Вв создает избыточное онкотическое давле-I, оказывание отрицательное воздействие на сердечно-сосудистую ¡тему. Как показали экспериментальны:! измерения онкстического яения 8-10% растворов исходного Нз и полученных из него прсиз-1ных (рис.К 5 ), оно снижается от значений 22-27 торр для исход- '

ного белка и вещества, типа ПГ -ПМ, содержащего 2-3Z полимерной форш, до 10- 12 торр для ПГ-ГЙ-З с 50%-ным содержанием полимерных фракций.

7 (СПЬ)

3 -

2 -

ПГ -

ПГ-ПФ-3 ПГ-ПФ-2

П.Г-ПФ- 1

1-■-.-.-г— Cut С/.)

1 2 3 45 6 7 3 3 10 и

puc..^. концентрационная заьмсммость относительной вязкости (?) растьороь модифицированных нь

торр СОР

1 13 45 6 7 & э юн

Рмс.5 КОНЦЕНТРАЦИОННАЯ ЗАВИСИМОСТЬ КОЛЛОИДНО" ОНКОТИЧЕСКОГО ДАЬЛЕНИЯ РАСТЬОРОЬ МОДИФИЦИРОВАННЫХ НЬ

Таким образом, изменение макромолекулярного состава по сравнению с исходным Нв позволяет существенно снизить нежелательное высокое онкотическое давление, присущее растворам исходного белка, и тем самым приблизить значения величин онкотического давления растворов полученных производных Нв к величинам, наблюдаемым при переливании эритроцитной массы.

Итак, результаты изучения in vitro растворов синтезированных соединений Нв подтвердили наличие у них необходимых для кровезаменителей ИШ сеойств как функциональных, так и реологических и кол-лоидко-онкотических. Так, все 4 типа химически модифицированных Нв имели значения величин сродства к кислороду, идентичные евежезаго-товленным донорским эритроцитам, а реологические и онкотические характеристики их 8-10%-ных растворов не превышали соответствующее значений для белков и клеток крови.

Исключение составило соединение ПГ-ПФ-4 с 707. содержанием полимерной формы, вязкостные характеристики которого имеют концент-„ рационные ограничения.

2.2.3. Изучение влияния состава производных гемоголобина на агрегацию эритроцитов.

Проведенные исследования in' vitro свойств растворов модифицированных Нв свидетельствует об их соответствии требованиям, предъявляемым к кровезаменителям, и близости ряда их характеристик к белкам плазмы. Тем не менее весьма важным представляется аспект возможного воздействия на эритроциты вводимых в кровеносное русло синтезируемых соединений, рассматриваемых как ИПК. Это направление исследования in vitro представлялось "весьма важным, так как при наличии гомологического ряда химических соединений Нв позволяло выявить их структурные особенности, влиякцие на агрегацию эритроцитов, а также способствовало выбору из них оптимального в качестве ИПК. Широко распространенный тест по оценке скорости оседания эритроцитов в данном случае был неприменим в силу своей недостаточной информативности.

ГЬэтому совместно с сотрудниками патофизиологической лаборатории ГКЦ (зав. проф. Н. А. Горбунова) были проведены эксперименты по

моделированию in vitro 50% кровопотери у собак, при которых исследуемые образцы химически модифицированных Нв смешивали с кровью животных в соотношении 1:1 и подсчитывали в камере Горяева клетки: свободные, вошедшие в состав агрегатов и общее количество (25). Результаты представлены в таблице N 4.

Как видно из таблицы, увеличение обпего содержания полимерной формы в составе производных Нв влечет за собой с нижние количества свободных эритроцитов и образование крупных агрегатов,. количество которых достигает максимума ЮОХ в случае ПГ-ПФ-4. Следует отметить, что крупные агрегаты эритроцитов ваблвдалгся в смесях с производными Нв, содержащими в своем составе фракции с молекулярной массой свыше 200 кД, причем в количествах, пропорциональных процентному содержанию этих фракций.

Таблица N 4

Влияние содержания полимерной формы на степень агрегации эритроцитов.

тип соединения Нв не вошедших в агрегаты Количество клеток в вошедших "в мелкие агрегаты (15-25 мк) % вошедших в крупные агрегаты (50-100 мк)

ПГ-ПФ-1 78 22 0

ПГ-Ш-2 53 47 0

ПГ-ПФ-З 63 18 19

• ПГ-Ш-4 0 0 100

Таким образом, проведенные эксперименты по моделированию in vitro 50% кровопотери позволили установить влияние фракционного состава производных Нв на агрегацию эритроцитов и выявить вклад "тяжелых"фракций в нежелательный эффект агрегирования эритроцитов.

Полученные результаты всей серии опытов in vitro,включая вязкостные характеристик, дали основания для исключения соединения Нв типа ПГ-Ш>-4 с "ОХ-ним содержанием полимерной формы ив дальнейших биологических экспериментов.

На основе данных сравнительного изучения в опытах in vitro ря- . да производные Нв с различным и фракционным составом, приведенных в разделе 2.2., был сделан вывод,что макромолекулярная структура химических производных Нв, приемлимая для рассмотрения в качестве модельного соединения ШК. не должна содержать в своем составе более 50% полимерной формы. Однако это заключение представляет собой лишь одно из экспериментально установленных ограничений для синтетических соединений Ев и не.является достаточным в качестве критерия оптимальности структура В связи с этим представлялось необходимым проведение исследований трех типов синтезированных соединений, ПГ-ШМ, ПГ-П5-2, БГ-ПФ-3, при введении в кровеносное русло животных.

3. Сравнительное изучение химически модифицированных Нв при введении в кровеносное русло экспериментальных животных.

3.1. Влияние содержания полимерной формы в составе производных Нв на длительность их пребывания в кровеносном русле ' при плеторическом введении.

Общепринятым исследованием производных Нв, претендующих на модель ШШ, является установление продолжительности их пребывания в кровеносном русле экспериментальных животных, характеризуемая величиной периода их полувыведения (Т^). Как следует из данных литература, эта величина варьирует в достаточно широких пределах, так-как на ее значения влияют такие факторы, как структура изучаемого производного Нз, вводимая доза а такие различия в экспериментальных моделях. В связи с этим мы провели собственные сравнительные исследования синтезированных соединений Нв, соблюдая в изучаемых образцах шкм&альную близость к физиологическим значениям таких характеристик, как солевой состав, величина рН и сродство к кислороду. Выполнение этих условий позволило нам наблюдать именно непосредственное влияние содержания полимерной формы в составе про-

- 28 -

изводных Нв на время удерживания в кровеносном русле.

Для осуществления биологического эксперимента была выбрана доза 1 г/кг массы тела животных, цримзнение которой позволило избежать возможного отрицательного воздействия гкперволемии и' при этом получать в отбираемых образцах плазмы концентрации вводимых соединений, достаточные для проведения необходимых измерений. Эксперименты проводились на двух; видах животных - 42 крысах- самках линии У1з1аг и 46 кроликах. На рисунке N 6 представлены данные, полученные при введении исследуемых образцов крысам (20).

ТУг час

и =12 п=24 ч п=2А П=24 п= 24

Рис. 6 , ПЕРИОДЫ ПОДУЬЫЬЕДЕНИЯ (Ту.) НЬ И ЕГО ПРОИ5ЬОДНЫХ ПРИ ПЛЕТОРИЧЕСКОМ ЬЬЕДЕНИИ КРЫСАМ Ь ДОЗЕ 1 г/кг

Следует отметить,что значения Ту, установленные в аналогичных экспериментах на кроликах, превышали приведенные на рисунке в 2-2. 5 раза для всех типов соединений, сохраняя ту яз закономерность.

Полученные результаты свидетельствуют о достоверных (р < 0,05) отличиях времени циркуляции изучаемых модифицированных Нв в зависимости от общэго содержания в них полимерной формы. Кроме того, приведенные данные благодаря наличию гомологического ряда соедине-

ний Нв позволили четко установить обсуждавшееся в литературе (j. r. Hess et al. 1989) видовое влияние на скорость выведения производных Нв. _

Результаты хроматографического анализа образцов плазмы крови, содержащих плеторически введенные производные Нз, аналогичные опи- ' санным з разделе 1.2., подтвердили.ранее установленную закономерность таиененкй исходных фракционных составов всех трех типов ПГ-Ш в сторону образования тяжлых фракций за время их пребывания в кровеносном русле животных. Проведенное сравнительное изучение происходящих изменений фракционных составов свидетельствует о наибольшей стабильности фракции с молекулярной массой 70 - 120 кД во всех исследованных типах химически модифицированных Нв. Этот результат доказал, что именно данная фракция, находясь в составе всех изучаемых производные Нв, вносит основной вклад в их удержи- . валик з кровеносном русле, о чем в качестве предположения указывалось ранее в разделе 1.2. лишь для соединения .типа ПГ-ПФ-З.

Сравнительный анализ изменений кривых молекуллрно-массового распределения в процессе циркуляции свидетельствует о высокой стабильности макромолекулярной структуры фракции, соответствующей молекулярной массе 70-120 кД, присутствующей во всех типах ПГ-Ш, что подтверждает правильность ранее высказанного- предположения о ■ ее наибольшей биосовместичости.

Таким образом, изучение длительности пребывания в кровеносном русле трех различных по составу синтезированных производных Нв показало, что все они удовлетворяет обпему требованию пролонгированного пребывания в кровеносном русле, и значения их Тув 3-5 раз превышают таковые для исходного белка. Однако для следующего этапа исследований были выбраны производные Нв ПГ-1Ф-2 и ПГ-Ш-3,как наиболее длительно циркулирующие в кровеносном русле в. условиях плеторического введения.

3.2. Сравнительное изучение химически иодифадарованных Нв на собаках в шдели острой смертельной кровопотери.

Дальнейшее экспериментальное изучение двух типов химически модифицированных гемоглобинов, ПГ-П5-2 и ПГ-П5-3, избранных на основе

данных, приведенных в разделах 2.2 и 3.1, проводили на собаках в дадели острой смертельной кровопотери совместно с сотрудниками патофизиологической лаборатории ГВД (зав.-проф. Е А.Горбунова) (21).

Цель этих экспериментов состояла в исследовании наличия лечебной эффективности этих типов соединений ,содержащих близкие по значению количества фракции с молекулярной массой 70-120 кД.. обладаний наибольшей способностью к удерживанию в кровеносном русле и отличающиеся лишь незначительным содержанием фракции с молекулярной массой свыше 200 кД. (см.табл.3). Причем окончательный выбор в пользу одного из них можно было сделать только на экспериментальной модели смертельной кровопотери,позволяющей провести сравнительные комплексные исследования поведения изучаемых соединений в процессе их функционирования в качестве плазмозаменителя и ИПК. .

Модель острой смертельной кровопотери до-остановки дыхания выполнена на 17 беспородных собаках с замещением 8-10 % растворами изучаемых производных гемоглобинов в дозе 4 г/кг массы животного при объеме кровопотери 51,8+3,5 мл/кг.

Результаты исследования динамики выведения образцов ПГ-ПФ-2 и ПГ-П&-3 из кровеносного русла собак представлено в табл. N 6.

Из представленных в таблице N 6 данных следует, что отсутствуют достоверные отличия (р > 0,1) в величинах концентраций двух производных Нв в процессе их циркуляции, несмотря на имевшееся различие между ними в обшэм содержании полимерной формы в исходном состоянии. Через сутки после введения содержание ПГ-1В&-2 и ПГ-Ш-З составили 55,1б+9,03Х и 58,16+8,62% от исходных значений соответственно. Близкие значения времени удерживания в кровеносном русле показали недостаточность критерия длительности циркуляции в данной экспериментальной модели и привели к более детальному изучению процессов, происходящих в циркуляторном русле при введении синтезированных соединений. Так было рассмотрено влияние изучаемых производных Нв на агрегационные свойства эритроцитов в кровеносном русле экспериментальных животных (25).

Таблица N 6

Содержание ПГ-ПФ-2 и ПГ-ПФ-З в образцах плазмы 1фови в процессе циркуляции в кровеносном русле собак.

срок Концентрация

циркуляции ПГ-1И-2 ПГ-ГО-З

г/дл % от в г/дл % от

исходного исходного

10 мин 5,62+0,44 100+7,83 5,65+0,50 100+6,52

1 час 4,90+0,46 87,19+9,39 5,05+0,38 89,62+7,23

2 часа 4,82+0,21 85,76±4,35 4,92+0,40 88,72+8,43 4 часа 4,34+0,24 77,22+5,53 4,75+0,11 79,63+4,48 24 часа 3,10±0,28 55,16+9,03 3,55+0,49- 58.16t8.62

Изучение микроциркудяторного русла бульбарной конъюктивы глаза, а -тага® брызжйки у собак при визуальном контроле показало, что введение образца ПГ-ЩЬЗ с общим содержанием полимерной формы 50-552 вызывает сильную агрегацию эритроцитов, йкфузии растворов ПГ-Ш-2 с 25-302 содержанием, полимерной формы не приводили к видимым изменениям агрегации эритроцитов в сравнении с исходным состоянием. Этот результат.позволил сделать окончательный выбор в пользу соединения Нв типа ПГ-ПФ-2 для дшшнейтего подробного исследования лечебной эффективности в биологическом эксперименте.

Таким образом в данной экспериментальной модели определяющим критерием выбора оптимального по фракционное составу производного Нз явилось воздействие на агрегационные свойства эритроцитов в кровеносном русле экспериментальных животных.

4. Изучение лечебной эффективности ПГ-Ш>-2 на модели острой смертельной кровопотери у собак.

Для осуществления исследований в необходимом объёме была проведена наработка 6 серий- ПГ-Ш-2 объемом 8-10 литров 9-102 раствора эа серию с последующей лиофшшзацией в разработанных ранее условиях (10,11,17), обеспечивающих длительность хранения химически ' модифицированных Вв до 2-х лет. Соблюдение этих условий позволило проводить изучение лечебной эффективности с использованием модели готовой лекарственной формы синтезированного соединения Нв.

Каждую серию ПГ-Ш-2 изучали на группе (3 - 5) животных.регистрируя физиологические показатели,позволяющие оценить гемодина-мические и газотранспортные свойства производного Кв, а также устанавливая его фракционный состав в различные сроки циркуляции методами ВЕХ.

Так при инфузии растворов избранного соединения Нв наблюдалось быстрое восстановление дыхания и всех основных параметров гемодинамики, остававшихся в пределах нормы в течение всего эксперимента, что свидетельствовало о наличии у растворов гемодинамических свойств. Кислороднотранспортные свойства ПГ-Ш-2 были подтверждены результатами раздельного анализа содержания кислорода в плазме крови,содержащей ПГ-Ю-2, и в эритроцитах,показавших, что 45-492 от общего количества кислорода "транспортируется введенным в русло производным Нв. Причем прирост мет-формы за 24 часа не превысил б-7Х, что свидетельствует о высокой стабильности данного типа соединения к внутрисосудистому аутоокислению, а, следовательно, и его функциональной полноценности в процессе циркуляции, что нашо подтверждение и при измерении КДК в различные сроки циркуляции. Снижение величины р произошло лишь на 24 часу наблюдения, составив 18,7 ± 0,5 мм рт. ст. (24).

Следует указать, что по данным литературы одной из острых проблем у зарубежных исследователей при создании ИПК на основе химически модифицированного Нв остается резкое падение величины сродства к кислороду при введении получаемых ими соединений в кровеносное русло,которое нам удалось преодолеть,применив разработанные условия модификации Ев. позволившие получить определенный моле-

кулярно-массовый состав..

Столь высокая сохранность функциональных свойств ПГ-1Ф-2 объясняется стабильность» его фракционного состава в процессе цирку-

с

ляции, о чем свидетельствуют данные хроматографического анализа, представленные в таблице N 7. Таблица N 7

Фракционный состав ВГ-Ш-2 в исходном состоянии и в процессе его циркуляции в кровеносном русле (в I).

Время кол -Ьлекулярная масса фракций (кД)

отбора опытов

пробы

35 70 120 200 300

исх. 5 67,31+3,66 18.69+0,91 13,33+4,15

10' 5 65,31+2,76 19.95+0,28 14,10+2,75

1 час 5 64,06+3,58 15,83+2,65 19,75+0,74

2 час 5 61,53+0,31 20,31±1.07 17,67+0,87

4 час 5 60,31+2,87 24,17+6.18 14,74+3,74

24 час 3 25,81+1,64 19,44+3,85 15,34+0,08 14,22+0,22 18,70+

+ 0.35

Как следует из приведенных данных, исходный фракционный состав ПГ-Ш>-2 обладает значительной стабильностью в процессе циркуляции в кровеносном русле. Существенные изменения отмечается к 24 часу наблюдения и касается главным образом фракции, соответствующей несшитому, способному к диссоциации на динеры Нв. Этому периоду наблвдения-соответствует появление новых фракций с молекулярной массой 200 кД. и 300 кД., отсутствующих в исходном составе ПГ-ПФ-2.

- 34 - '

Количественный прирост этих высокомолекулярных фракций незначителен по сравнению с наблюдавшимся для ПГ-ПФ-З при плеторическом введении. .....

Следует отметить, что исходное процентное содержание двух других фракций в составе ПГ-Ш-2 с молекулярными массами 70 кД и 120 кД практически не менялось за 24 часа. Этот результат подтвердил сделанное ранее заключение (раздел 2.), что длительность пребывания химически модифицированного Нв в кровеносном русле определяется наличием-в его составе именно фракций с молекулярными массами 70 кД. и 120 кД. Эти величины молекулярных мзсс соответствуют внут-римолекулярно сшитому Нв и его димеру, лишившимся в результате проведенной химической модификации способности к диссоциации-, что исключает возможность их выведения через почки, как это экспериментально установлено к описано в литературе в случае введения б кровеносное русло натйвного белка В то же время,видимо, размеры синтезированных биополимеров на основе Нв с молекулярной массой 70 -120 кД. совместимы с белками плазмы, так как образование в процессе циркуляции новых высокомолекулярных фракций не влечет за собой изменений в их процентном содержании,сохраняя значения на исходном уровне.

Оптимальность установленной макромодекулярной структуры ПГ-ПФ-2 цодтверздается такиг высокой степенью сохранности .функциональной полноценности данного типа соединений, что свидетельствует об отсутствии значительных структурных перестроек в процессе циркуляции, а, значит, и ее биосовместимости с белками плазмы..

Подученные результаты свидетельствуют, что применение растворов HF-D5-2 эффективно при лечении острой смертельной кровопотери.. Подтверждением этого является 100Z выживаемость экспериментальных животных, что объясняется гемодинамическими и газотранспортными свойствами синтезированного соединения.

Таким образом, проведенные сравнительные исследования на модели острой смертельной кровопотери структурных и функциональных характеристик ПГ-Ш-2 позволили заключить, что оптимальное производное Нв должно состоять из фракций с молекулярной кассой в пределах от 70. кД. до 120 кД. и общим .содержанием полимерной формы не выше 25-30Z. Оптимальность этого фракционного состава подтверждается

его стабильностью в количественном распределении, длительностью удерживания в кровеносном русле,а такгк сохранностью газотранспортных характеристик,что обеспечивает его функциональную полноценность.

5. Комплексное изучение химически модифицированного Нв на модели геморрагического лека у собак

Исследование гемодинамических и газотранспортных свойств избранного в качестве оптимального химически модифицированного Нв, ПГ -П&-2, было проведено з сравнении с полиглякином на модели геморрагического шока у собак в патофизиологической лаборатории Российского института переливания крови в Санкт-Петербурге под руко- „ годством проф. К ЛКочетыгова (22). На 12 беспородных собаках были поставлены две серки опытов, при которых массивную.кровопотери, 45' _-50 мл/кг, возмещали в одной группе животных введением полиглхки-на, в другой - 7,5% раствором ПГ-П5-2. Гемодинамические и газотранспортные свойства введенных растворов оценивали по целому ряду . как непосредственно измеряемых параметров: минутному объему кровообращения, артериальному давлению,содержанию Нв в крови, напряиэию кислорода,степени оксигенации в артериальной и венозной крови и плазме,так и расчетных величин,например, артерио-венозной разности, системному транспорту кислорода и потреблению кислорода организмом.

Полученные данные свидетельствуют, что раствор ПГ-П^-г обладает гекодинамическими свойствами, так как артериальное давление при его введении во вез сроки наблюдения было выше по сравнению с по-лигжином. Близ кики к исходным значениям были и остальные показатели системной гемодинамики через 24 часа наблюдения.

Положительные результаты были получены и при изучении газотранспортных свойств растворов- испытываемого соединения. Так было установлено, что кислородная емкость в артерии при инфузии растворов ПГ-Ш-2 на протяжении всего периода наблюдения была примерно в 1,5 раза большей, чем при введении полиглхкина, причем ее прирост [ происходил исключительно за счет циркулирующего в плазме введенно-

го производного Нв. Соответственно более высокими были артерио-ве-нозкая разность и системный транспорт кислорода к количество кислорода, причем происходило это за счет кислорода, транспортируемого ПГ-Ю-2, особенно в первые часы после инфузии. Это достигалось благодаря сохранении функциональных свойств находящегося в плазме ПГ-ПФ-2 практически в исходном состоянии,!, е. как у эритроцитов,о чем указывалось в разделе 3.2.

Результаты проведенной серии экспериментов позволили сделать заключение, что раствор на основе ПГ-Ю-2 может быть рассмотрен как щювезаыещающий, способный нормализовать системное кровообращение и за счет собственной высокой кислородной емкости обеспечи-. вать потребление кислорода, тканями.

Данное заключение нашло свое подтвержение и в результатах, полученных в патофизиологической лаборатории ГВЦ на модели предельной гемодидюции со снижением показателя гематокрита до 5% и обменным замещением крови на 10% раствор ПГ-0&-2 в сравнении с реополиглюкином (ЛР.Колонина с соавт, 1991).Так артериальное давление у животных- (8 собак) при введении ПГ-Ш-2 не выходило за пределы физиологической нормы. Благодаря газотранспортным свойствам раствора изучаемого производного Нв удалось сохранить потребление кислорода организмом на нормальном уровне. При этом большая часть потребляемого кислорода (75-80%)транспортировалась БГ-Ш-2, находившимся в плазме.

В результате все животные контрольной группы после тотального замещения крови на реополиглюкин погибли, а все животные опытной группы вьшли.

Доведенные многочисленные эксперименты на различных моделях кровопотери показали наличие лечебной эффективности у производного Нв с долей полимерной формы 25-30%, в составе которой отсутствуют фракции с молекулярной массой свыше 200 кД. и незначительной сте-. пенью гетерогенности. Причем данное соединение можно рассштривать как основу для препарата кровезаменителя ИПК, так как он обладает выраженными как гемодинамическими, так и газотранспортными свойствами, что обеспечивает высокую выживаемость животных в экстремальных условиях эксперимента.

В настоящем обзора представлены результаты наших исследований по создании ИПК на основе химически модифицированного Нв, проведенные за период с 1983 по 1992 г. г. • и- нашедшие отражение в 26 публикациях и 9 Авторских свидетельствах. Эти работы, направленные на поиск оптимальной для ЖЕ структуры химически модифицированного Нв, развивались двумя параллельными путями - изучение структурных изменений химически модифицированного Нв в процессе циркуляции в кровеносном русле и поиск путей направленной химической модификации белка, обеспечиваний получение соединений с заданным фракционным составом. Благодаря комплексным исследованиям структурных изменений на макромолекулярном и субъединичном уровнях в процеесе циркуляции производных Нз и полученному с помощью разработанных условий направленной модификации гомологическому ряду соединений Нв, была.установлена макромолекулярнач структура химически модифицированного Нв с содержанием полимерной формы до 30%,состоящей из фракций с шлекулярной массой 70 и 120 кД. Оптимальность данного гша соединений Нз в качестве ИПК подтверждена в биологических экспериментах на 3-х видах гивотных (крысы,кролики,собаки),показавших способность такого протаводного Нв длительно циркулировать в кровеносном русле, обеспечивая газотранспортные функции на уровне эрктрсцчтов, обладая- гэкодинамическими свойствами ■ и поддер.тавая кинь экспериментальных животных при экстремальных состояниях т- " зого организма.

Основные характеристики данного соединения следующие:

8-10 г/дл <5% 25-30% 110*30 * ю3 90*10 * 105 25-30 мм рт.ст. 7,3-7,5 0.15 М 22-24 торр. 1.5-1,7 сп. 30-32 час. более 2-х лет

Концентрация по Нз Содержание bfetHs (% от обвдго Нв) Доля полимерной формы Средневесовая молекулярная масса Среднечисленная молекулярная масса Р»

рН ' . -

На*

Озкотическое дазленке (10% р-р) Относительная вязкость (10% р-р) Период полувыведения при кровопотере,доза.4г/кг -Длительность хранения- в лиоф. состоянии

ВЫ В ОД Ы •

1. Установлена возможность направленной химической модификации Нв, позволяющая получать его производные с различным заданным фракционным составом.

2. Разработанные условия осуществления реакции модификации Нб непрерывным методом (Авт.св. N 189810 ) дают возможность получать соединения с общим содержанием полимерной формы от 2-5% до 70-75% (Авт.св. N 285643, N 321661) и функциональными характеристиками, идентичными донорским эритроцитам.

З-Бри комплексном изучении полученных соединений в экспериментах in vitro установлено влияние степени гетерогенности состава химически модифицированных Нв на реологические и онкотические свойства их растворов.

4. В процессе изучения изменений фракционных составов производных Нв; происходящих в процессе их циркуляции в кровеносном русле, выявлен интервал значений молекулярных масс фракций, составивший 70 -120 кД.,обеспечивающих длительное пребывание в сосудистом русле.

5. На основе скрининга результатов, полученных в опытах in vitro и in vivo', в" качестве оптимального избрано соединение с долей полимерной форш 25-30%, содержащей компоненты с молекулярной массой не выше 200 кД. и значениями 110±30 * 10* и Ц^ЭО+Ю л ю!

6. В опытах по моделированию смертельной кровопотери и геморрагического шока на собаках доказана способность данного типа соединений осуществлять снабжение организма кислородом на уровне эритроцитов и проявлять при этом выраженные гекодинамическке свойства, что позволяет рассматривать данное соединение Нв в качестве основы для кровезаменителя ИНК.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ И ИЗОБРЕТЕНИЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. А. А. Хачатурьян.Е М. Ейимак, М. А. Ахигирова и соавт.,Шделъ искусственного переносчика кислорода на основе полкгеыоглобкна с функциональными свойствами, близкими к крови, Еол. эксперим. биологик и медицины, 1981, 3, с. 311-313

2. А. А. Хачатурьян.Е. П. Вязова, Ы. А. Ажигирова и соавт. .Сравнительное изучение газотранспортных характеристик ¡юдолей внеэритроци-тарного переносщсса кислорода, Вял. эксперим. биологии и кедици-ны,1982.4,с. 28-32

3.. П. Вязова.М. А. Акигирова.Л. а Фетисова соавт.,Кислородно-дис-социационнне свойства и регуляция сродства к кислороду полимера гемоглобина быка, Еш. эксперим. биологии и медицины, 1983,2, с. 50-52

4.Л.А.Хачатурьпн,М. А.Акигирова,Е.П.Вязова и соавт., ПЬлимэры гемоглобина и крупного рогатого скота-функциональная основа ие-¡сусстзенного переносчика кислорода. Шт. 56-й научной сессии ЦНй-ЛГЕК,М. ,1984,с. 21-23

5. А. А. Лачатурьян.Е. II Вязова. Ы. А. Ажгирова.Г. Я. Розенберг, Изучения влияния карбоновых кислот на кислородтранепортные свойства гемоглобина, Гемат. и трансфузиол., 1984,3, с. 54-55

6. Г. Я. Розенберг, А. А. ;&чатурьян, 11 А. Ажгирова и соавт., Модифицированный Гемоглобин как 1фовезаменитель с функцией переноса кислорода, В сб. "Клиническая трансфузиология и профилактика посттранс-фузионного гепатита", М. ,1984,с. 113-125

7. У. А. Ажигирова, Е. П. Вязова, А. М. Зейналов и соавт., Изменение фракционного состава полимера гемоглобина в процессе циркуляции в кровеносном русле животных. Шт. 57-й научной сессии ЩШГПК, И. ,1985, с. 63-65

8. И. А. Ажигирова, Е. П. Вязова, А. А. Хачатурьян, Карбоновые кислоты так регуляторы сродства к кислороду полимера гемоглобина, В сб. Тезисы, докладов II Всесоюзного съезда гематологов и трансфузиологов, £ ,1985, с. 85

9.11 А. Ажигирова, Е. П. Вязова, 1£ Г. Ваккевич и соавт., Изучение ¡отяашональкых и изоэлегарических свойств гемоглобина. модифяциро-:ашюго глиоксалевой кислотой, В сб. Тезисы докладов II Украинского :ъезда гематологов и трансфузиологов,Киев,1986,с. 19

10. X В. Фетисова, Е.Е Вязова, Ы. А. Ажгкрова, A. А. Хачатурьяк, Изучение функциональной активности лиофильно высушенного переносчика кислорода - полимера гемоглобина,Хим.-фарм. журн. ,1986,2,с. 214-217

11.Е. IL Вязова,JLВ. Фетисова,Ы. А. Акигкрэва и соавт. .Изучение"возможности длительного хранения растворов полимера гемоглобина, Хим. -фарм.журн. ,1986, И,с. 1360-1363

12. IL А. Ажигирова, Е. П. Вязова, А. А. Хачатурьян, Кетокиелоты как регуляторы обратимой оксигенации гемоглобина, Бщ. зксперим. биологии и »медицины. 1986,3, с. 300-302

13. Ы. А. Ажигирова, Е. Е Вязова, Ы. Г. Вашкевич, Р. В. Недоиквина, А. А. Хачатурьян, Изучение полимеров гемоглобина в процессе их циркуляции в кровеносном русле животных, Бюл. э:сспери!£ биологии и медицины, 1986,10,с. 421-423

14. Ы. А. Ажигирова,Ы. Г. Вашкевич,Е. П. Вязова, А. А. Хачатурьян. Изучение состава полимера гемоглобина в процессе циркуляция в кровеносном русле швотних,Гематология и трансфузиоьогня,1988,?,с.2?-30

15. Ы. А. Ажигирова, Е. Е Вязова, Я Г. Вашкевич, и соавт., Биохимические свойства внутримоле1сулярно сшитого гемоглобина. Бал. зксперим. биологии и медицины,1988,9,е. 302-304 -

16.. Б. Вязова, IL А. Ажигирова, А. Л. Шувалова и соавт., Изучение структурной гетерогенности полимеризованного гемоглобина бкохимк-ческимии и иммунохимическими методами,Вол.зксперим.биологии и -медицины, 1988,10, с. 446-448 • .......*

17. Е. IL Вязова, JL В. Фетисова, \L А. Ажигирова, А. А. Хачатурьян, Изучение стабильности полимера гемоглобина,Хим.-ферм. журн.,1988,1, с. 8184.

18. Е. Е Вязова, Ж А. Ажигирова, йэдифвдированный гемоглобин как основа искусственного переносчика кислорода, Хим. -фарм. журк. ,1989, 6. с. 645-651

19. Е. LL Вязова, 11 А. Ажигирова, Л. В. Фетисова и соавт.. Структурно-функционалная гетерогенность искусственного переносчика кислорода на основе гемоглобина. Бш. зксперим. биологии и медицины, 1990, 3, с. 254-257

20. U. А. Ажигирова, Н. Г. Вашкевич, Е Е Контуганов и соавт., Влияние степени полимеризации гемоглобина на его взаимодействие с организмом. Бш. зксперим. биологии и медицины, 1990,3, с. 262-264

21. М. А. Ажкгирова.Е. П. Вязоза, Л. В. Фетисова и соавт,Сравнительное исследование полимеров гемоглобина в качестве основн кровезаменителя-переносчика кислорода В сб. Тезисы докладов IX Всесоюзного научного симпозиума "Синтетические полимеры ыедицикксого назначения" ,1991, Ы. ,с.24

22. Е. А. Селиванов, Е 31. Кочетыгов.К. А. Гербут.М. А. Адигирова и со-авт., Изучение хшжчесеж. модифицированного ге^глобнна в качестве искусственного переносчика кислорода на модели геморрагического шока у собак. Ьш. эксперт биологии и медицины, 1991,8, с. 142-144

£3: Е. П. йгзова, М. А. Лжитирова, Л. Е Фетисова и соавт.; Изучение функциональных характеристик химически шдифкцированяого гемоглобина в процессе циркуляции в кровеносном русле,Бал. эксперим. биологии и медицины, 1981,4,0.374-376

24. }£ Л. /лигирова, 2. П. Вязова, Н К ПЁшрова и соавт., Изучение , струетурньк I! фушгционалънш особенностей полигешглобина в процессе его циркуляции в кровеносном русле животных. Хим.-фарм. журн., 1991;10,с. 19-21

25. ¡0, А. Литвиненко, \1 А. Ажигирова, Е. П. Вязова и соэвт., Изучение влияния состава полигоюглобинов на агрегацию эритроцитов и длительность циркуляции в сосудистом русле,Вал. эксперим. биологии и медицины,1993,1,с. 27-29

26.1£ А. Ажиглрсва, Е. П. Вязова, А. Л. Шувалова, 11 Г. Васкевич, Сравнительное исследование хииячески ¡.юдифйцироваянкх гемоглобинов в качестве основы кровезш?енителя~переносчика кислорода. Бил. эксперт.!, биологии и медицины, 1993,4, с. 364-365

Список Авторских свидетельств на изобретения

1. Г. Я. Розенберг,А. А. Хачатурьян, 2. И Еязова.М. А. Ажигирова и др., Способ получения растворов нативного гемоглобина. Авт. свид. М 589984 от 16.02.76.

2. Г. Я. Розенберг, А. А. Хачатурьян, А. К Лившиц, У. А. Аетгирова и др. , Способ получения модели водорастворимого ЮПИ Авт. свид. N 103533 от 02.03.77.

3. А. А. Хачатурьян, 11 А. Ажигирова, Е. П. Вязова и др., Способ получения модифицированного полигемоглобина, Авт. свид. N . 133280 от 04.02.80.

4. Г. Я. Розенберг, Н. А. Федоров. Ы. А. Ажигирова и др., Способ получения сополимера гемоглобина с альбу>.ошои, способного к обратимому присоединению кислорода. Авт. свид. N 113704 от 03.03.76.

5. Г. Я. Розенберг, А. А. Хачатурьян, 1L А. Акигирова, Л. R Фетисова, Способ получения сополимера гемоглобина' с альбумином, Авт. свид. N 129374 от 07.05.79

6. А. А. Хачатурьян, И А. Ажигирова, Е. П. Вяэова к др., Способ получения полигемоглобина Авт. свид. N 189810 от 01.07.83

7. А. А. Хачатурьян.Е. П- Вязова,А. М. Зейналов.Ы. А. Ажигирова и др., Способ получения полимера гемоглобина, Авт. свид. N 172203 от 06.01.82 .

В. U. А. Ажигирова,Ы. Г. Ваакевич,Е К Афонин, Способ получения полимера гемоглобина. Авт. свид. N 285643 от 01.12.88.

9. М. А. Ажигирова, Е. ÍL Вязова, Ц. Г. Вашкевкч, Ю. А. Литвинэнко, Способ получения искусственного переносчика кислорода на основе химически модифицированного гемоглобина, Авт. свид. N 321551 от 02.01.30

Список цитируемой литературы

1. И. Р. Колонина, XI А. Литвиненко, А. В. Соколов, Экспериментальная оценка эффективности модифицированного полигемоглобина на модели предельной гемодилюции, Бш. зксперим. биологии и медицины, 1991, 5,с: 449-560 ' ' '

2. V. R. Airfaerson, J. Flexner, F. R. SteggercSa el • al., J. Cell Cor,-p. Physiol, 1934,5, p. 59-82

3. V. R. Bleeker,P. J. Boer, J, Agterberg et al. .Bionater. ,Artif. Cells, Imrob. Btotechn. ,1991, v. 19, N2, p. 358

4. E. Dellacherie.Clia Mater. ,1990, v. 6,N 3,p. 199-207

5. },L Feola.Y. Simoni.C. Canizaro et al,Surgery,Gynecol. Obstet. ,1988,166 p. 211-222

6: P. E. Ke ipert, AGonzales, C. L Gomes et

al. ,Transfusion,1993,V.33. N 9, p. 701-708

7.11 A. Marini.ü L. l&ore,R. M. Fishmn et al,Biopolyirers.i989,28, p. 2071-2083

8.S. Tam,J. Blunenstein, Proo. Natl. Acad, Sci USA,1976,v. 73, К 6,

p. 2128-2131

9. К. 0. Vandegriff.R. ii Wiaslow .Chern. Ind. ,1991.14, p. 497-501

Условные сокращения:

ВХХ-высокоэффективная жидкостная хроматография ВК -временная фармакопейная статья КПК -пскусстЕешнй переносчик кислорода КДК-гатсдородно-диссоциациокная кривая Hv -средненесовая молекулярная масса Й„ -средкечисленная молекулярная масса Нз .-гемоглобин Ш> -тфкдоксаль-5-фосфат

р - парциальное давление кислорода з мм рт. ст.,при котором 50%

50

• геютлобина насыщено кислородом 1ц-период полувыведения (час.).время, на протяжении которого исходная концентрация ведаства,введенного в кровеносное русло,снижается вдвое ЩШГПК-Центральний БЖ гематологии и переливания крови

1. Изучение динамики изменений фракционного состава химически модифицированного гемоглобина в процессе циркуляции ...................................... 9

1.1. Обоснование выбора направления исследования____9

1.2. Динамика изменения фракционного состава полигемоглобиЕа в процессе циркуляции з кровеносном русле.............................. 12

2. Направленная химическая модификация гемоглобина____ 15

2.1. Разработка условия направленной химической

модификации гемоглобина...................... . 15

СОДЕРЖАНИЕ

Обгзая характеристика работы ...........

)йтериалы и методы исследования........

Результаты исследования и их обсугденж

стр.

3 7 9

- 44 -

2.2. Изучение макромолекулярного состава к физико-химических свойств производных гемоглобина с различным содержанием полимерной форма...'.... 20

2.2.1. Макрошлекулярный состав

производных гемоглобина......................... 20

2.2.2. Функциональные и физико-химические характеристики производных гемоглобина.......... 22

2.2.3. Изучение влияния состава производных гемоглобина на агрегацию эритроцитов............ 25

3. Сравнительное изучение химически модифицированных гемоглобинов при введении в кровеносное русло

экспериментальных животных____...................• 27

3.1. Влияние содержания полимерной формы в составе производных гемоглобина на длительность пребывания в кровеносном русле при плеторическом введении.......................*................ 27

3.2. Сравнительное изучение химически модифицированных гемоглобинов на собаках в модели острой смертельной кровопотери.....................................29

4 Изучение лечебной эффективности ПГ-ПФ-2 на модели

острой смертельной кровопотери у собак................

5. Комплексное изучение химически модифицированного Нв

на модели геморрагического шока у собак................

Вывода............................................... 38

Список опубликованных работ и изобретений по теме

диссертации........................................... 39

Список цитируемой литература........................

Условные сокращения.................................. 43

Диссертант приносит слова глубокой благодарности основоположнику создания искусственного переносчика кислорода на основе химически модифицированного Нв в России, своему учителю проф. Г. Я. Розенбергу за внимание,проявленное к данному исследованию.