Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рентгеноструктурный и сравнительный анализ мутантов гемоглобина человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Рентгеноструктурный и сравнительный анализ мутантов гемоглобина человека"

г-- На правах рукописи

Печик Игорь Владимирович

Рентгеноструктурный и сравнительный анализ мутантов гемоглобина человека.

03.00.03 - Молекулярная Биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -1997

Работа выполнена в группе рентгеноструктурного анализа Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН ( Москва, Россия ), и в Центре Перспективных Исследований в Биотехнологии при Национальном Институте Стандартов и Технологии ( Гейтерсбург, США).

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор Н.С. Андреева

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Ю.А. Шаронов доктор химических наук, профессор Э.Г. Арутюнян

Ведущая организация:

Институт Белка РАН (г. Пущино)

Л/. -

Защита состоится " уХ-^^т&А-Я1997 года в /г часов на заседании диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984 Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан

1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Общая Характеристика Работы.

Введение. Актуальность и Практическая Значимость Темы.

Значительные успехи, достигнутые в изучении структуры и механизма действия гемоглобина, вполне позволяют поставить задачу создания искусственного переносчика кислорода с эффективно контролируемыми физико-химическими и функциональными свойствами на основе модифицированного гемоглобина человека. Среди подходов к созданию такого переносчика кислорода наиболее перспективными и быстроразвивающимися являются на сегодняшний день методы, базирующиеся на использовании рекомбинантного гемоглобина, модифицированного методами генной инженерии. Прогресс в рекомбинантной технологии позволяет наладить производство больших объемов гемоглобина, используя для этой цели как микроорганизмы, так и трансгенных животных.

Важную роль в дизайне систем-переносчиков кислорода играет кристаллографический анализ трехмерных структур мутантов. Определение кристаллической структуры позволяет визуально оценить целесообразность произведенных замен аминокислотных остатков, их влияния на структуру и функцию белка, а также предложить возможные альтернативы. Таким способом осуществляется корреляция между химическими и генетическими манипуляциями с гемоглобином с одной стороны, и его физико-химическими и функциональными характеристиками с другой. Следует отметить, что данный подход является совершенно необходимым для формулирования реалистичных гипотез и выводов относительно взаимосвязи между структурой и функцией.

Цели и Задачи Работы.

Представляемая работа являлась частью проекта по созданию искусственных переносчиков кислорода на основе рекомбинантного гемоглобина человека.

Рентгеноструктурный анализ и молекулярное моделирование, исследующие структуру потенциальных систем-переносчиков и предлагающие варианты ее модификации являлись важной составной частью проекта. Одной из главных трудностей на пути использования свободного, не заключенного в эритроциты гемоглобина в качестве заменителя крови является его высокая кислородная аффинность. Непосредственная задача представляемой работы состояла в получении и анализе атомных структур мутантов гемоглобина человека, обладающих пониженной кислородной аффинностью.

Структура Работы.

Работа состоит из введения, трех глав, выводов, двух приложений и списка цитируемой литературы.

Апробация работы.

Полученные результаты были представлены на ежегодных симпозиумах Американской Кристаллографической Ассоциации ( США, 1393,1994; Канада, 1995 ).

Публикации.

По материалам диссертации было опубликовано три статьи в международных и одна в отечественном журнале.

Содержание Работы. Глава 1. Данные Литературного Обзора.

Литературный обзор содержит изложение известных работ по структуре и функционированию гемоглобинов. Рассмотрены особенности общей упаковки гемоглобинового тетрамера в окси- или И- и дезокси- или Т-состояниях. Описан кооперативный характер связывания кислорода и его модуляция посредством изменения четвертичной структуры молекулы. Приведен анализ стереохимических аспектов аллостерической регуляции кислородной аффинности. Рассмотрена роль отдельных аминокислотных остатков в связывании лиганда и генерации аллостерических переходов. Описаны структурные основы влияния аллостерических эффекторов на кислородную аффинность и эффект Бора.

Глава 2. Характеристика Объектов Исследования.

Полярная замена в дистальной части гемовых карманов р-глобул.

Среди исследований молекулярного механизма функционирования гемоглобина в качестве наиболее интенсивных можно выделить работы по изучению роли гистидина His Е7 и валина Val Е11 дистальной части гемового кармана, считающихся ключевыми остатками в регуляции связывания лиганда с гемом. Стенки гемовых карманов образуют эффективный барьер для защиты атомов железа гема от растворителя, находящегося на поверхности белка. Для попадания лиганда в дистальный гемовый карман необходима переориентация боковой цепи остатка His Е7, а в р-субъединицах также смещение Val Е11, Су атом которого стерически затрудняет доступ лиганда к участку связывания.

В настоящей работе исследовалось влияние полярности аминокислотного остатка, находящегося в позиции Е11, на регуляцию

кислородной аффинности. С этой целью в (5-субъединицах была произведена замена консервативного валина на изостерический треонин. Функциональные исследования показали, что по сравнению с нативным белком, мутант Val Е11(67)Р—>Thr демонстрирует двухкратное падение аффинности к Ог и СО. В то же время, возросшая полярность гемового кармана способствует ускоренному самоокислению с образованием met-формы. В природном гемоглобине скорость самоокисления сходна для а- и Р- субъединиц. В мутанте Val E11(67)P->Thr реакция двухфазна. Скорость протекания медленной фазы сравнима с таковой для нативного белка, быстрая же фаза превосходит последнюю в 90 раз. Медленная фаза может быть связана с природной а-субъединицей, a быстрая с мутированной р-субъединицей.

Модификация р-аминоконцевой последовательности.

Важным направлением поисков в разработке заменителей крови на основе свободного гемоглобина является создание мутанта, в котором регуляция кислородной аффинности не была бы связана с микросредой внутри эритроцита, в частности с 2,3-дифосфоглицератом ( ДФГ ). В связи с этим в качестве другого объекта исследования был взят мутант гемоглобина человека Hb-p(Val1->Met+His2deleted), в котором аминоконцевой валин р-субъединиц заменен на метионин, а гистидин в положении NA(2)2p делетирован. Данный мутант имеет р-аминоконцевую последовательность, аналогичную р-аминоконцевой последовательности гемоглобина быка, имеющего низкую кислородную аффинность и альтернативный механизм ее регуляции посредством повышенной чувствительности дезокси-формы к ионам СГ.

Функциональные исследования мутанта p(V1 М+Н2А) показали, что по сравнению с НЬА его Т-форма на самом деле демонстрирует некоторую дополнительную конформационную стабильность, приводящую к снижению кислородной аффинности, однако не до уровня аффиности гемоглобина быка. Основным же проявлением мутации является полное уничтожение зависимости щелочного эффекта Бора от содержания в растворе ионов СГ. В нативном гемоглобине связывание ионов СГ усиливает щелочной эффект Бора посредством увеличивая рК ионизируемых групп, с которыми они взаимодействуют. Однако, места локализации СГ на поверхности молекулы гемоглобина и величины их вклада в эффект Бора до сих пор остаются спорными. Исчезновение СГ-зависимости щелочного эффекта Бора в мутанте P(V1M+H2A) свидетельствуют в пользу существования в нативном гемоглобине локализованного сайта связывания СГ, в котором аминоконцевой Val NA1(1)P является ключевым остатком.

Нативный дезоксигемоглобин.

Для сравнения структур мутантов со структурой нативного дезоксигемоглобина ( НЬА ) была поставлена задача переопределения структуры дезокси-НЬА с целью минимизации конформационных различий между нативным белком и мутантами, обусловленных чисто техническими

факторами, как-то вариации условий экспериментов и протоколов уточнения, а также для оценки влияния механизма процессинга на укладку р-субъединиц. В этой связи кристаллизация, сбор и обработка рентгеновских данных, а также уточнение структуры дезокси-НЬА, проводились в тех же условиях и по тем же протоколам, что и для дезокси-РУ67Т и дезокси-р(\Л М+Н2Д).

Глава 3. Описание Проведенных Исследований.

Основные Результаты и их Обсуждение.

Молекулярное моделирование структуры дезокси-рУ67Т.

До проведения экспериментальных работ были осуществлены модельные исследования дистапьного гемового кармана р-субъединицы дезокси-рУ67Т с целью оценки возможных структурных изменений гемового кармана в результате замены валина на треонин в позиции Е11. Моделирование было выполнено на основе трехмерной структуры дезоксигемоглобина человека 2ННВ. В качестве инструментов были использованы программы QUANTA 2.3 на рабочей станции Silicon Graphics, Inc., IRIS-4D, и INSIGHT II 2.3.0 на рабочей станции Silicon Graphics, Inc., Iris Indigo XZ 4000.

Была оценена вероятность взаимодействия между Thr Е11(67)р и His Е7(63)р. Возможная конформация боковой группы Е11 позволяет разместить гидроксил треонина приблизительно в 3.0 Á от кислорода основной цепи остатка Е7, допуская таким образом формирование водородной связи между ними. В модельной структуре дезокси-р\/67Т гидроксильная группа треонина может взаимодействовать как с N5, так и с Ne His Е7(63)р, выступающими в качестве акцепторов водородной связи. Однако, без существенного сдвига в положении боковой цепи Е7 геометрия этих взаимодействий такова, что возможность образования двойной водородной связи, когда в дополнение к взаимодействию гидроксил -основная цепь будет иметь место также взаимодействие между N5 в качестве донора и гидроксильным кислородом треонина в качестве акцептора, представляется маловероятной. Исходя из этих соображений конформация боковой группы Thr Е11 (67) была выбрана по принципу наилучшей геометрии водородной связи между ее гидроксильной группой и карбонильным кислородом основной цепи His Е7(63).

Молекулы воды не были включены в дистальный гемовый карман модельной структуры pV67T, хотя и были обнаружены в аналогичном мутанте дезоксимиоглобина свиньи Thr Е11 (68). В нативном гемоглобине человека молекула воды также отсутствует, в то время как она была идентифицирована в структуре нативного дезоксимиоглобина кашалота. В обоих миоглобинах, мутанте и нативном белке, положения боковых цепей остатков Е11 (Val или Thr) и Е7 ( His) по отношению к гему отличаются от таковых в дезоксигемогпобине человека в достаточной степени для того, чтобы повлиять на энергетику и структурную упорядоченность молекулы

воды. Вектор, описывающий этот относительный структурный сдвиг, приблизительно параллелен плоскости тема, перпендикулярен линии, соединяющей две боковые цепи ( Е7 и Е11 ), и по модулю составляет порядка 1А. Таким образом, экстраполяция того, что имеет место в миоглобине на гемоглобин, требует осторожности.

Как выяснилось впоследствии, модельная структура ТИг Е11(67)(3 достаточно хорошо согласуется со структурой кристаллической ( Рис. 1 ). Наблюдаемые отклонения конформаций боковых цепей остатка Е11 составляют 31° и 24° по углу % Для субъединиц [Ь и Рг соответственно.

Рис. Наложение фрагментов кристаллической ( толстые линии ) и.модельной ( тонкие линии ) структур dei0Kcu-ßV67T. Показаны г ем, дистальиые Tlir El 1(67) и His Е7 (63), а также проксимальный His F8(92j.

Экспериментальная часть.

Кристаллизация белка, сбор и обработка рентгеновских дифракционных данных.

Для кристаллизации нативного дезоксигемоглобина и обоих мутантов была применена процедура, разработанная Перутцем. Раствор гемоглобина концентрацией 10 мг/мл содержал 2.3 М сульфата аммония и 0.3 М фосфата аммония при рН 6.8. Для предотвращения окисления кристаллизация проводилась в атмосфере азота. Кристаллы размером более 0.7мм в наибольшем измерении вырастали в течение нескольких недель.

Рентгеновские дифракционные данные были набраны с использованием электронного двумерного детектора Siemens. Детектор был установлен на четырехкружном гониостате, управляемом

His 92

His 92

микрокомпьютером Cadmus 9000. В качестве источника рентгеновского излучения был использован генератор Siemens М18Х с вращающимся анодом. Рабочий режим генератора, при котором проводился сбор дифракционных данных, составлял 40кВ и 80мА.

Обработка дифракционных данных проводилась на графической рабочей станции IBM RISC/6000 320Н при помощи пакета программ XENGEN. Пространственные группы были определены как P2i с параметрами ячеек о=62.5А, ¿=82.1 Ä, r=53.8Ä, /}=98.9" для дезокси-НЬА, о=63.5А, ¿=83.2А, с=54.0А, /9=99.1° fle30KCH-ßV67T, и a=62.7Ä, 6=82.4Ä, c=53.6Ä, /3=99.2° для дезокси-р(\/1 М+Н2Д) соответственно. Дифракционные данные, набранные с кристалла дезокси-НЬА составили 82971 отражений, в том числе 25442 независимых отражения до разрешения 2.2А, что соответствует полноте набора данных 93%. Для кристалла дезокси-рУ67Т было зарегистрировано 78526, из них 22816 независимых, составляющих 84% от максимально возможного количества до разрешения 2.2Ä. Обработка дифракционных данных для дезокси-р(У1 М+Н2Д) выявила 88944 отражений, из них 22159 независимых, что соответствует 81% до разрешения 2.2Ä.

Определение и уточнение кристаллических структур.

В качестве исходной модели для решения структур была взята структура дезоксигемоглобина высокого разрешения 2ННВ. Уточнение проводилось при помощи программного пакета X-PLOR 3.1 на рабочей станции IBM RISC/6000 550. Первоначально было проведено уточнение положения молекулы в целом как твердого тела, а затем и отдельных субъединиц для корректировки их относительного положения в элементарной ячейке. Применение этой процедуры привело к существенному снижению кристаллографического R-фактора с исходных 0.37 для дезокси-НЬА до 0.27, 0.38 до 0.27 для дезокси-рУ67Т, и 0.39 до 0.28 для дезокси-р(У1 М+Н2Д).

Для дальнейшего уточнения был использован подход, реализующий метод молекулярной динамики ( процедура simulated annealing с протоколом медленного охлаждения ). В качестве энергетических и геометрических параметров аминокислотных остатков использовались параметры Энга и Хубера. Набор параметров для тема был разработан Кирияном. Эмпирические энергетические параметры молекул воды были взяты из модели TIP3p программы CHARMM. Перед молекулярной динамикой обе структуры были подвергнуты процедуре энергетической минимизации для устранения "плохих" контактов. Далее эти минимизированные системы были нагреты до температуры 4000К в течение 5пс используя шкалирование скоростей. Затем структуры были охлаждены до 300К с интервалом 25К через каждые 50 шагов, которые были установлены по 0.5фс каждый. Вслед за молекулярной динамикой была проведена еще одна энергетическая минимизация для оптимизации геометрии и стереохимии модели. После описанных процедур R-фактор опустился до 0.21 для дезокси-НЬА, 0.22 для дезокси-р\/67Т и 0.24 для дезокси-р(\/1 М+Н2Д).

Табл. I. Основные кристаллографические параметры и статистика

результатов уточнения структур дезокси-НЬА, дезокси-/ЗУ67Т и дезокси-р( V1M+H2A).

HbA Hb-PV67T Hb-fS(V1M+H2A)

Пространственная группа P2i Р2, Р2,

Параметры кристаллической

ячейки:

«(А) 62.45 63.54 62.71

Ы А) 82.13 83.19 82.37

с(А) 53.76 54.02 53.58

А град) 98.87 99.15 99.21

Число молекул в независимой

части элементарной ячейки 1 1 1

Содержание растворителя в

кристаллической ячейке (%) 39 39 39

Общее число зарегистрированных

отражений 82971 78526 88944

Число независимых отражений

до разрешения 2.2А [ 1 > ст(/) ] 25442 22816 22159

Полнота набора данных

до разрешения 2.2А (%) 93 84 81

Rsym 0.08 0.07 0.10

Диапазон разрешения,

использованный при уточнении

структуры (А) 6.0-2.2 6.0-2.2 6.0-2.2

Число отражений, участвовавших

в уточнении 21076 21699 18766

Критерий отбора отражений 2 а 2а 2а

Число неводородных белковых

атомов (включая темы ) 4566 4566 4558

Число молекул воды 474 434 434

Кристаллографический R-фактор 0.137 0.149 0.174

Средние отклонения:

длин связей (А) 0.016 0.017 0.019

расстояний 1-3 (А) 0.038 0.038 0.035

Окончательное уточнение атомных координат и В-факторов проводилось посредством традиционной минимизации по методу наименьших квадратов с помощью программы PROL.SC). Каждый цикл уточнения сопровождался периодической правкой модели на компьютерной

графике с использованием программ FRODO и О. Работа велась с двумя типами карт электронной плотности: 2F0-FC и F0-Fc. Уровни оконтуривания карт варьировались от 0.75а до 1 .Оа и от 2.0ст до 3.0а соответственно. Для структур дезокси-НЬА и дезокси-р\/67Т было проведено по 26, а для дезокси-р(\/1М+Н2Д) 28 циклов уточнения, включающих ручную правку модели в каждом цикле, с целью устранения разностных пиков на карте F0-Fc выше уровня За, а также корректной идентификации всей электронной плотности 2F0-FC.

Уточненные структуры дезокси-НЬА, дезокси-р\/67Т и дезокси-P(V1M+H2A) состоят из полных а- и р-цепей, ассоциированных с ними гемов, а также 474, 434 и 434 молекул воды соответственно. Каждая р-субъединица дезокси-НЬА и дезокси-Ь\/67Т содержит ион сульфата. Средние отклонения линейных и угловых расстояний от идеальных значений составляют 0.016А и 0.038А для дезокси-НЬА, 0.017А и 0.038А для дезокси-р\Л57Т и 0.019А и 0.035А для дезокси-р(\/1М+Н2Д). Окончательные значения кристаллографического R-фактора равны соответственно 0.137, 0.149 и 0.174.

Основные кристаллографические характеристики наборов рентгеновских дифракционных данных, а также статистика результатов уточнения трехмерных структур, приведены в Таблице 1. Структуры дезокси-НЬА, дезокси-рУ67Т и дезокси-Р(У1 М+Н2Д) были приняты в Международный Белковый Банк Данных под идентификаторами 2HHD, 1HDB и 2ННЕ соответственно.

Сравнение и анализ полученных структур.

Общее сравнение кристаллических структур нативного гемоглобина и мутантов с целью описания глобального сходства между молекулами было проведено стандартным методом оптимизации суперпозиции положений соответствующих Са-атомов при помощи программы ALIGN. Для выявления конкретных структурных различий в сайтах мутации, был использован оригинальный комплекс программ, реализующий более чувствительный метод построения внутримолекулярных систем координат ( см. описание приложения А ). Визуализация совмещенных структур и измерение расстояний между атомами проводились при помощи программ QUANTA 2.3, О и FRODO. Для сравнения температурных факторов было проведено их предварительное шкалирование с использованием программы, написанной автором настоящей диссертационной работы ( см. описание приложения Б).

Результаты.

Структуры дезокси-НЬА, дезокси-/}У67Ти дезокси-Р(У1М+Н2Д).

Сходство структур нативного дезокси-НЬА и мутантов отчетливо видно из их непосредственного сравнения ( Табл. 2). Общая разница r.m.s., вычисленная по всем Са атомам составляет 0.38А для пары дезокси-НЬА -дезокси-р\/67Т, и 0.27 А для пары дезокси-НЬА - дезокси-р(\/1М+Н2Д).

Сравнительный анализ температурных факторов, как по всему тетрамеру, так и по отдельным димерам и мономерам ( Табл. 3 ), также иллюстрирует соответствие нативной и рекомбинантных структур.

Табл. 2. Среднеквадратичные отклонения между соответствующими парами

Са-атомов, вычисленные на основе суперпозиции структур дезокси-НЬА, дезокси-рУ67Тидезокси-Р(УШ+Н2А).

НЬА- НЬ-РУ67Т НЬА-НЬ-Р0/1М+Н2Д)

Субъединицы Число пар Сг, г.т.г. (А) Число пар С0 г.гл.з. (А)

сиагР^ 570 0.38 564 0.26

сир, 285 0.28 285 0.25

а2Рг 285 0.28 280 0.26

си 140 0.24 141 0.24

Р1 145 0.25 144 0.25

0.2 140 0.24 141 0.23

Р2 145 0.26 140 0.27

Табл. 3. Средние значения температурных факторов (А2) структур дезокси-НЬА, дезокси-рУ67Ти дезокси-/3(У1М+Н2Л).

Субъединицы НЬА НЬ-рУ67Т НЬ-р(\/1М+Н2Д)

СИ012р1р2 15.2 15.2 (20.7)* 15.2 (19.0)

а,01 15.5 15.8 (21.4) 15.3(19.2)

агРг 14.8 14.6 (20.1) 15.0 (18.8)

си 15.3 14.8 (20.3) 14.9 (18.6)

Р1 15.6 16.8(22.3) 15.9(19.7)

0.2 13.5 13.4(18.9) 13.8(17.8)

р2 16.0 15.7 (21.2) 16.0 (19.9)

Значения в скобках показывают величины температурных факторов, полученных в результате усреднения по нешкалированным данным.

Рекомбинантные р-субъединицы экспрессируются как часть химерного белка, который в дальнейшем подвергается протеолитическому

расщеплению, высвобождающему Ы-концы. Наложение Ы-концевых фрагментов р-субъединиц дезокси-НЬА и дезокси-р\/67Т демонстрирует сходство конформаций данных участков структуры, подтверждая таким образом, что имеющий место механизм процессинга не оказывает влияния на корректность упаковки р-субъединиц в области Ы-концов ( Рис. 2).

Рис. 2. Наложение структур И-концевых областей ргсу6ъединиц дезокси-{¡У67Т ( толстые линии ) и дезокси-НЬА ( тонкие линии ).

Дистальиый гемовый карман дезокси-/ЗУ67Т.

Карта электронной плотности дезокси-рУ67Т в областях мутаций, т.е. в дистальных гемовых карманах р-субъединиц, не содержит неопределенностей ( Рис. За ). Величины температурных факторов атомов аминокислотных остатков, непосредственно образующих карманы, оказались на уровне, полученном усреднением по всем атомам молекулы (15Á2). Это свидетельствует о том, что позиции атомов данного участка структуры хорошо определены.

Изостерическая замена Val Е11(67) на треонин в дистальном гемовом кармане не сопровождается значительными конформационными изменениями. Наблюдаемые структурные сдвиги имеют локальный характер и затрагивают непосредственно сайт мутации (Рис. 36).

рржфн» 63

ТЬг 67

___

РЬв 42

РЬа АО

I Ж Ш

I ш. рРШ щ ..А

ТЬг 67

N¡5 63

РЬв 42 1

Н|3 63

------ \ ТЬг 67 : I №е42 I

^Г д

(б)

Рис. 3. (а) Атомная структура дисталыюго ге.мового кармана субъединицы с соответствующим фрагментом карты электронной плотности 2Р0-ГС, оконтуренной по уровню 1а; (б) Наложение структур дистальных гемовых карманов 0гсубъедшшц деюксч-/]У67Т ( толстые линии ) и дезокси-НЬА ( топкие линии ). Пунктиром показана возможная водородная связь.

Сохраняется неизменной конформация боковой цепи дистального гистидина His Е7(63), отсутствуют также видимые изменения в ориентации тема. Атом Or Thr E11(67)Pi ориентирован таким образом, что играет роль донора в образовании водородной связи с карбонильным кислородом основной цепи остатка His Е7(63). Расстояние между этими двумя атомами составляет 2.9Â. Кроме того, на расстояниях 3.5Â и 3.9À от атома О, находится атомы азота боковой цепи His Е7(63), N5 и Nc соответственно, однако геометрия их взаимного расположения не позволяет предполагать наличие сильной водородной связи. Удаление О, от атома железа тема составляет 4.7Â, что является слишком большим расстоянием для непосредственного взаимодействия.

Остаток Thr Е11(67) р2-субъединицы имеет практически такую же конформацию как и в субъединице Pi. Атом Or Thr Е11(67), удаленный на 2.8А от карбонильного кислорода His Е7{63), является донором водородной связи. Как и в р,, ориентация атома Ог по отношению к азотам N¿ и Ne остатка His Е7(63), удаленных, соответственно, на 4.4Á и 3.7к, не допускает образования сильных водородных связей. Расстояние от Or Thr Е11(67) до атома железа тема составляет 4.8Â. Таким образом, окружения дистальных гемовых карманов обеих р-субъединиц являются практически идентичными.

N-концевые участки р-субъединиц deiOKcu-fif V1M+H2A).

Непосредственно на N-конце р-цепи дезокси-НЬА локализованы важные взаимодействия, которые обуславливают наблюдаемые различия в поведении дезокси-НЬА и дезокси-р(\/1 М+Н2Д) при связывании кислорода. Особенно существенным является наличие в N-концевой области иона сульфата ( Рис. 46 ). В дезокси-НЬА ион сульфата образует разветвленную сетку водородных связей и электростатических взаимодействий, за счет которой он достаточно прочно крепится к структуре р-цепи между углом EF и N-концом. Атом 0-1 сульфата находится между аминоконцевым атомом азота (3.5А) и атомом Nr боковой цепи Lys EF6(82)P (5.0А). Атом 0-2 взаимодействует только с N-концевым атомом азота Val NA1(1)p (3.1А). Атом 0-3, как и 0-1, взаимодействует с атомом азота боковой цепи Lys EF6(82)p с образованием водородной связи (3.5Â). Атом 0-4 также взаимодействует с N-концевым азотом остатка Val NA1(1)P (2.6Â), и плюс к этому образует водородную связь с атомом азота основной цепи Leu EF5(81)P, расстояние до которого составляет 2.0Â.

В качестве одной из гипотез при создании мутанта p(V1M+H2A) было предположение, что следующая за N-концевым фрагментом спираль А должна быть плотнее придвинута к центру глобулы. Подобный сдвиг спирали А в структуре мутанта по сравнению с нативным гемоглобином действительно имеет место, однако составляет всего 0.29Â ( за исключением первого витка спирали, который смещен на 0.36À ). Наоборот, N-концевой фрагмент, ставший на один аминокислотный остаток короче, сместился ближе к спирали А. N-концевой атом азота оказался удаленным на 5.0Â от того положения, которое он занимал в структуре дезокси-НЬА, и образовал водородную связь с атомом кислорода основной цепи Leu EF2(78)p (3.2Â), а также с ближайшим кислородом боковой группы Asp

/.уз 82

^яЪЪя'ч

¡Ж

/ ' ,. 'л, ^'^гШР^^

Н2°Ш

».Мег 2

№

132'

аШш

ч&р

С! и 7

Ш 4Ж г

ШШ\ т.

Аэр 79

1„уз8 ^гзгШ

«о '•у;г8

вШ7

ш

Йъ^

Авр 79

Рис. 4. Атомные структуры Л'-концевых областей (1Гсубъединиц дезокси-р( VIМ+Н2А) (а) и дезокси-НЬА (б) с соответствующими фрагментами карт электронной нютноспш оконтуренной по уровню 1а.

EF3(79)ß (2.5Á). Изменение положения N-концевого атома азота в ß(V1M+H2A) исключает возможность его прямого взаимодействия с сульфатом, как это имеет место в структуре дезокси-НЬА. Таким образом, не является неожиданностью, что в кристаллической структуре мутанта ß(V1M+H2A) ион сульфата отсутствует (Рис. 4а).

Различия аминокислотных последовательностей НЬА и ß(V1M+H2A) обуславливают различия упаковки N-концевых остатков на поверхности ß-глобул. В структуре ß(V1M+H2A), атомы основной цепи этих остатков плотнее прилегают к поверхности глобул, чем соответствующие им атомы в структуре НЬА ( Рис. 5 ). Боковая цепь N-концевого метионина благодаря своей длине расположена очень близко к тому месту, где в структуре дезокси-НЬА находится боковая цепь Val NA1(1)ß, однако глубже проникает в гидрофобный карман связывания, образованный боковыми цепями остатков Leu NA3(3)ß3, Leu EF9(79)ß, Leu EF5(81)ß и Val H11{133)ß.

Рис. 5. Наложение структур N-концевых областей ргсубъединиц дезокси-Р(У1 М+Н2А) ( толстые линии ) и дезокси-НЬА ( топкие линии ). Названия атомных групп, относящихся только к дезокси-Р(У1М+Н2А), обозначены звездочками, а относящихся только к дезокси-НЬА -апострофами.

Обсуждение.

Влияние мутации Val (EíI)67¡3->Thr на структуру дистального гемового кармана дезокси-Р-субъединиц.

Трехмерная структура мутанта гемоглобина человека дезокси-р\/67Т показала, что изостерическая замена валина на треонин оказала весьма незначительный эффект на структуру дистального гемового кармана. Атом Оу Thr Е(11)67р оказался вовлеченным в качестве донора в образование водородной связи с кислородом основной цепи His Е7(63)р.

В дистальных гемовых карманах дезокси-р\/67Т не обнаружено электронной плотности, соответствующей молекулам воды, несмотря на то, что объем полости кармана позволяет разместить такую молекулу, а анализ возможных путей доступа не выявляет препятствий для ее проникновения внутрь. В структуре аналогичного мутанта дезоксимиоглобина свиньи V68T, имеющего два мономера в независимой части кристаллической ячейки, молекулы воды ассоциированы с каждым из дистальных карманов. Отсутствие в дезокси-р\/67Т электронной плотности для молекул воды может свидетельствовать либо об отсутствии самих молекул, либо об их позиционной разупорядоченности.

Влияние мутации Val NA(l)lp->Met+His NA (2)2¡l-xlcletcdна структуру A-концевых участков р-субъединиц.

Из сравнительного анализа кристаллических структур дезокси-НЬА и дезокси-р(\/1М+Н2А) следует, что наблюдаемые между ними функциональные различия являются результатом структурных изменений, локализованных на N-концах р-цепей. В обеих структурах спираль А сохраняет практически одинаковое положение по отношению к остальной глобуле. Таким образом, N-концевые фрагменты р-цепей, которые в мутанте Р(У1М+Н2Д) на один аминокислотный остаток короче, чем в нативном белке, оказывается смещенным по направлению к спирали А, а также более плотно упакованными на поверхности глобул. Ввиду отсутствия заметных структурных различий в других частях молекул, можно предположить, что именно упаковка N-концевых фрагментов р-глобул является ответственной за увеличение конформационной стабильности Т-формы P(V1M+H2A).

Структура дезокси-Р(\/1М+Н2Д) выявила также отсутствие иона сульфата, который имеет место в р-цепях дезокси-НЬА и контактирует и аминоконцевым атомом азота и атомом азота боковой цепи Lys EF6(82). Укорачивание N-концевого фрагмента на один остаток разрушает механизм связывания сульфата, и сайт, в котором в НЬА находится SOA занимают в структуре P(V1M+H2A) две молекулы воды. Учитывая данные функционального анализа, показывающие отсутствие у мутанта Р(\/1М+Н2Д) СГ-зависимого щелочного эффекта Бора, можно сделать вывод, что СГ в структуре НЬА может занимать сайт связывания сульфата.

Описание Приложения А.

Внутримолекулярная система координат и ее использование для сравнения пространственных структур.

Каждая белковая структура может быть описана в терминах структурно-консервативных и структурно-вариабельных областей. При сравнительных исследованиях степень структурного сходства определяется как среднеквадратичное отклонение между соответствующими атомными позициями, вычисленными для совпадающих участков консервативных областей.

Обычно белковые структуры представляют собой наборы трехмерных атомных координат в координатных системах, связанных с осями кристаллической ячейки. С точки зрения сравнения структур, основное неудобство такого описания следует из факта, что вследствие небольших различий в размерах ячейки, даже на уровне малых изменений, имеющих место в изоморфных кристаллических формах, все эти координатные системы являются уникальными. Уникальность систем координат приводит к невозможности сравнения атомных координат для анализа структурных сдвигов без дополнительного применения суперпозиции.

В связи с этим был разработан альтернативный подход к сравнению трехмерных структур гомологичных белковых молекул. Подход основан на использовании внутримолекулярных систем координат, которые связаны с определенными атомными позициями, идентичными в сравниваемых структурах. Преимуществом внутримолекулярных систем координат является их независимость от параметров кристаллической ячейки и относительной ориентации молекул, т.е. оценка атомных сдвигов в гомологичных структурах может быть осуществлена непосредственным сравнением их атомных координат.

Внутримолекулярная система координат представляет собой правовинтовую ортогональную систему, построенную с использованием процедуры векторного произведения на основе РОВ-координат трех реперных точек >,,;,), р2(,х1,у1,:г) и р](х},у],:1). Изначальные координаты точек транслируются на Т = (х1г у„ г,) так что точка р, попадает в начало координат. После трансляционного сдвига определяются направляющие косинусы осей координат внутримолекулярной системы. Первая координатная ось ориентирована вдоль вектора, соединяющего реперные точки р, и р3. Вторая ось идет вдоль нормали к плоскости, содержащей все три реперные точки. Третья координатная ось определяется как векторное произведение первых двух осей и направлена вдоль вектора, перпендикулярного плоскости, содержащей эти оси.

После того, как вычислены направляющие косинусы, РОВ-координаты атомов могут быть трансформированы во внутримолекулярную

систему. Матрица вращения имеет вид:

'cosa, cosa2 cosa,^ R = cos P| cosP¡ cosPj ,cosy, cosy2 cosy)J Новые атомные координаты во внутримолекулярной системе могут быть вычислены по следующим формулам:

.v" = ( л - .y, )cosa, +(у-у, )cosp, +(г-:, )cosy, )cosa2 +(у-)\ )cosP2+(j-r, )cosy2 г"=(.т-.Г| )cosa3 +(y-y, )cosP3+(2-r, )cosy3 Наиболее важным условием эффективного использования внутримолекулярной системы координат при сравнительных исследованиях является рациональный выбор реперных точек. Чтобы получить корректную информацию об атомных смещениях, необходимо соблюдение ряда требований:

♦ Позиционная точность реперных точек должна быть максимально высокой. Это означает, что сравниваемые структуры должны быть уточнены с высоким разрешением, а реперные точки взяты из областей структуры с низким значением температурного фактора.

♦ Реперные точки должны соответствовать идентичным или эквивалентным атомным позициям в сравниваемых молекулах.

♦ Реперные точки должны быть неподвижными по отношению одна к другой. Для минимизации рассогласования систем координат до уровня ошибок эксперимента, когда системы можно считать идентичными, позиционные отклонения реперных атомов должны находиться в пределах ошибок, ожидаемых для их атомных координат.

Использование внутримолекулярных систем координат в сравнении с традиционной суперпозицией не ухудшает общей картины структурного сходства исследуемых объектов, позволяя в то же время отчетливее представить имеющиеся конформационные различия. Основным преимуществом применения внутримолекулярных систем является их чувствительность при детектировании малых атомных смещений, а также удобство работы с большим числом гомологичных белков.

Описание Приложения Б.

Шкалирование температурных факторов.

Абсолютные значения температурных факторов могут зависеть от целого набора случайных обстоятельств, не связанных напрямую с тепловыми колебаниями атомов, таких, например, как условия проведения рентгеновского эксперимента, полнота набора данных, используемые программы и протоколы уточнения, и т.д. При сравнении температурных факторов гомологичных структур или комплексов это может приводить к появлению систематических отклонений, не имеющих реального научного смысла. Поскольку для сравнительных исследований интерес представляют не абсолютные, а относительные значения температурных

факторов, для обеспечения корректности сравнения, необходимо произвести шкалирование температурных факторов друг к другу. Обычно для этой цели вычисляют разницу между средними значениями температурных факторов и транслируют один набор к другому. Данный подход не учитывает возможного влияния больших локальных флуктуаций температурного фактора на его усредненную величину. Такие флуктуации как правило соответствуют наиболее недостоверно определенным атомным позициям, косвенно свидетельствуя о имеющемся дефиците дифракционных данных. Предлагаемый метод сравнения температурных факторов гомологичных структур исходит из следующих утверждений:

♦ Структура обладает достаточно большим запасом стабильности в том смысле, что посадка субстрата или локальные конформационные изменения, вызванные точечными мутациями, не могут принципиальным образом изменить температурный статус молекулы в целом.

♦ В гомологичных структурах идентичные или эквивалентные атомные позиции должны иметь близкие значения температурного фактора (за исключением непосредственно сайтов мутации или связывания субстрата).

Исходя из этого, в процедуру усреднения не включаются атомные пары, для которых отклонения температурного фактора превышают некую заданную величину.

Практическая реализация метода выглядит следующим образом. Один из наборов принимается за реперный, и его температурные факторы фиксируются, второй шкалируется к первому. На первом этапе определяются пары структурно эквивалентных атомов. Далее в цикле для каждого из наборов вычисляются средние значения температурных факторов и определяется их рассогласование:

Температурные факторы шкалируемого набора транслируются на величину А{5):

после чего для каждой пары температурных факторов вычисляется фактор рассогласования д, :

fixfd ^ tcw/i'i.'

л/""*

и сравнивается с заданной величиной срезки в"""''!. Если |Л;| > В"4'1,

соответствующая пара температурных факторов исключается из процедуры усреднения. По окончании проверки происходит возврат к началу цикла. Процедура повторяется до наступления сходимости, когда рассогласование для каждой пары не превысит величины срезки.

По сути разработанный подход реализует шкалирование на базе уточненных средних значений температурных факторов, что в итоге позволяет проводить более корректное сравнение их индивидуальных профилей.

Выводы.

1. Были выращены кристаллы двух мутантов гемоглобина человека: с модифицированным дистальным гемовым карманом НЬ-Р(\/а167-»ТЬг) и с модифицированным 1Ч-концевым фрагментом НЬ-[3(Уа11->Ме(+Н/з2Л).

2. С каждого из полученных кристаллов были набраны рентгеновские дифракционные данные до разрешения 2.2А.

3. По набранным дифракционным данным были определены и уточнены трехмерные структуры. Окончательные значения кристаллографического Я-фактора составляют 0.149 и 0.174 соответственно для НЬ-рО/а167н>ТЫ) и НЬ-Р(Уа!1->Ме(+Н|з2л). Уточненные структуры содержат по 434 молекулы воды каждая.

4. С целью минимизации структурных различий между мутантами и нативным белком, вызванными неоднородностью условий роста кристаллов, набора рентгеновских данных, а также использованием различных программ и протоколов уточнения, была переопределена структура нативного гемоглобина НЬА.

5. Было проведено детальное сравнение структур мутантов и нативного белка с целью выяснения взаимосвязи структуры и функции. Был применен новый подход к сравнению структур, использующий внутримолекулярные системы координат, а также написан пакет программ для практической реализации этого подхода. Кроме того, была написана программа шкалирования температурных факторов, что необходимо для их корректного сравнения.

6. Уточненные структуры были сданы в Международный Белковый Банк Данных под следующими идентификаторами: 2ННЮ для нативного дезоксигемоглобина, 1ЬЮВ для дезокси-рУа!67—>ТЬг и 2ННЕ для дезокси-Р(Уа11->Ме1+1-Н52Д).