Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гомо- и гетероолигомерные комплексы малых белков теплового шока человека

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гомо- и гетероолигомерные комплексы малых белков теплового шока человека"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ГОМО- И ГЕТЕРООЛИГОМЕРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ МАЛЫХ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА ЧЕЛОВЕКА

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0 4 ОКТ 2012

Москва-2012

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Гусев Николай Борисович

Официальные оппоненты: Левицкий Дмитрий Иванович

доктор биологических наук, профессор, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, зав. лабораторией Муронец Владимир Израилевич доктор биологических наук, профессор, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, зав. отделом

Ведущая организация: Институт экспериментальной кардиологии Федерального государственного учреждения «Российский кардиологический производственный комплекс» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится 29 октября 2012 года в 15 часов 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан сентября 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Медведева Марина Валерьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Представители семейства малых белков теплового шока (small heat shock proteins, sHsp) обнаружены практически у всех живых организмов. Все представители этого семейства содержат в своей структуре так называемый а-кристаллиновый домен [1], состоящий из 6-8 антипараллельных Р-складок и играющий важную роль в формировании димеров. Характерными признаками малых белков теплового шока также являются небольшая молекулярная масса мономеров (от 12 до 43 кДа), склонность к формированию крупных олигомеров с молекулярной массой до 1 МДа [2, 3], динамичная четвертичная структура и шапероноподобная активность, проявляющаяся в способности sHsp предотвращать агрегацию частично денатурированных белков [3, 4]. Считается, что основной функцией sHsp является защита клеток от накопления агрегатов неправильно свернутых и денатурированных белков, образующихся под действием различных неблагоприятных факторов (тепловой шок, окислительный стресс, действие тяжелых металлов и других). Помимо этого, малые белки теплового шока принимают участие во многих других процессах, таких как апоптоз, пролиферация клеток, регуляция сократительной активности. Вероятно, именно из-за многофункциональности малых белков теплового шока точечные мутации этих белков зачастую сопровождаются развитием различных наследственных заболеваний [5].

В настоящее время в геноме человека обнаружено 10 генов, кодирующих малые белки теплового шока [5]. Некоторые sHsp человека экспрессируются повсеместно (HspBl, HspB5, HspB6 и HspB8), в то время как другие экспрессируются только в определенных тканях. Малые белки теплового шока человека склонны к образованию олигомеров различного размера и состава. Из-за сходства первичных структур они могут образовывать как гомо- так и гетероолигомеры. При этом по данным из лаборатории Бенндорфа оказалось, что HspB8 является универсальным белком-партнером, способным взаимодействовать практически со всеми малыми белками теплового шока человека [6, 7]. До последнего времени при исследовании взаимодействия и процессов формирования гетероолигомеров малых белков теплового шока использовались такие подходы, как коиммунопреципитация, двойная гибридизация в клетках дрожжей, или флуоресцентно-резонансный перенос энергии (FRET). Все эти методы предполагают использование модифицированных белков, содержащих дополнительные пептидные последовательности, или «химерных» белков, состоящих из соединенных между собой малых белков теплового шока и флуоресцентных белков. Прикрепление подобных «меток» может значительно изменять свойства небольших по размеру и склонных к олигомеризации малых белков теплового шока, приводя к получению

ложно положительных или ложно отрицательных результатов. В этой связи представлялось целесообразным исследовать взаимодействие различных sHsp с использованием белков дикого типа или точечных мутантов этих белков, структура которых минимально отличалась бы от структуры нативных белков. Помимо этого, представлялось важным исследовать механизм формирования гомо- и гетероолигомеров sHsp и картировать участки, вовлеченные во взаимодействие между мономерами внутри таких олигомеров.

Цель и задачи работы. Целью нашего исследования являлось изучение белок-белковых взаимодействий различных малых белков теплового шока при образовании гомо- и гетероолигомеров. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Получить малые белки теплового шока и их точечные «цистеиновые» мутанты в высокоочищенном виде.

2. Исследовать влияние точечных мутаций на структуру и шапероноподобную активность исследуемых sHsp.

3. С помощью различных методов исследовать образование гомо- и гетероолигомеров in vitro.

4. Исследовать взаимодействие малых белков теплового шока человека на клеточном уровне.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Седьмая р-складка а-кристаллинового домена играет важную роль в формировании гомо- и гетеродимеров sHsp человека.

2. HspBl, HspB5 и HspB6 эффективно взаимодействуют между собой с образованием гетероолигомерных комплексов, но при этом очень слабо взаимодействуют с HspB8.

3. При образовании гетероолигомерных комплексов малых белков теплового шока человека необходима диссоциация крупных олигомеров до мономеров. Ключевой стадией в этом процессе является взаимодействие мономеров различных sHsp и образование гетеродимеров.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе данной работы был разработан подход для анализа взаимодействия малых белков теплового шока человека, состоящий во введении остатка цистеина в участки, предположительно участвующие в образовании контактов, и были получены так называемые «цистеиновые» мутанты четырех sHsp. Установлено, что структура таких мутантных белков практически не отличается от структуры белков дикого типа. «Цистеиновые» мутанты sHsp эффективно образовывали дисульфидные связи в гомо- и гетеродимерах, что свидетельствует о том, что р7-складка, в которой расположен введенный остаток цистеина, принимает участие в образовании как

2

гомо-, так и гетеродимеров различных малых белков теплового шока человека. Эти результаты были подтверждены экспериментами, выполненными зарубежными учеными на изолированных а-кристаллиновых доменах ШрВ5 (аВ-кристаллина) и №рВ6 (НвргО) методами рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [8-10]. С использованием белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов различными методами было установлено, что №рВ1, Н$рВ5 и НврВб эффективно взаимодействуют между собой, в то же время они лишь очень слабо взаимодействуют с ШрВ8.

На основе полученных результатов предложена схема, описывающая предполагаемый механизм образования гетероолигомерных комплексов вНвр человека. В отличие от общепринятой точки зрения, постулирующей димер в качестве минимальной стабильной субъединицы малых белков теплового шока, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что для образования гетероолигомерных комплексов необходимо наличие свободных мономеров. Предположительно, такие мономеры могут образовываться как за счет диссоциации крупных олигомеров, так и за счет диссоциации гомодимеров. Взаимодействуя между собой, мономеры образуют гомо- или гетеродимеры, которые, ассоциируя, формируют различные по размеру и составу гомо- или гетероолигомеры.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ; на 35-м Международном Конгрессе Европейских Биохимических Обществ (РЕВЭ) в 2010 г. (Гетеборг, Швеция); на Форуме молодых ученых и 12-й конференции Международного Союза Биохимиков и Молекулярных Биологов (ШВМВ) в 2010 г. (Мельбурн, Австралия); на международной конференции «Биология Молекулярных Шаперонов» в 2011 г. (Грундлси, Австрия); на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» в 2008-2010 гг. (Москва).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, включая 5 статей и 6 тезисов сообщений.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 118 страницах печатного текста, иллюстрирована 40 рисунками и 9 таблицами. Список цитированной литературы содержит 171 наименование.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

В обзоре литературы приведены данные о структуре, свойствах и некоторых функциях малых белков теплового шока. Особое внимание уделено структуре олигомеров этих белков и данным, касающимся образования гетероолигомеров малых белков теплового шока человека.

Материалы и методы

Плазмиды. содержащие кодирующие последовательности белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов, для экспрессии в клетках Е. coli были любезно предоставлены к.б.н. A.C. Сейт-Неби и к.б.н. О.В. Букач. «Цистеиновые» мутанты HspB5, HspB6 и HspB8 представляют собой белки, в которых все эндогенные остатки цистеина (если таковые имеются в белках дикого типа) заменены на остатки серина, а аминокислотные остатки, расположенные в положениях, гомологичных Cysl37 HspBl, заменены на остаток цистеина. Для экспрессии sHsp в клетках эукариот кодирующие последовательности (CDS) исследуемых белков были переклонированы в вектора pcDNA3.1 Hygro(+) и pcDNA6 myc-His A (Invitrogen).

Рекомбинантные белки дикого типа (HspBl, HspB5, HspB6, HspB8), а также их «цистеиновые» мутанты экспрессировали в клетках Е. coli штамма BL21(DE3). Очистку проводили путем фракционирования экстракта клеток сульфатом аммония и комбинирования двух стадий хроматографической очистки: для HspB5 и HspBl -ионообменной хроматографии и гель-фильтрации, для HspB6 - ионообменной и гидрофобной хроматографий, а для HspB8 - гидрофобной хроматографии и гель-фильтрации. Полученные препараты белков хранили при -20°С в буфере В (20 мМ трис-ацетат, pH 7,6, 10 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ, 0,1 мМ ФМСФ). Такая процедура очистки позволила получить значительные количества высокоочищенных препаратов малых белков теплового шока дикого типа и их «цистеиновых» мутантов.

Восстановление и окисление исследуемых sHsp проводили следующим образом. Для восстановления белки инкубировали 30 мин в буфере В, содержащем 15 мМ ДТТ. Окисление, ведущее к образованию дисульфидных связей, проводили путем диализа образцов против буфера А (50 мМ трис-HCl, pH 7,4, 50 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 0,1 мМ ФМСФ) в течение ночи при 15°С, 25°С или 37°С [11]. Получаемые белковые образцы анализировали методом электрофореза в системе Леммли [12] в градиентном (10-20%) или гомогенном (15%) полиакриламидном геле (ПААГ) в отсутствие ß-меркаптоэтанола (ß-МЭ).

Сравнение структуры белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов проводили методами спектроскопии кругового дихроизма (КД), флуоресцентной спектроскопии и гель-фильтрации.

Восстановленные образцы белков диализовали против буфера PBS (50 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ), и регистрировали спектры КД на приборе Chirascan Circular Dichroism Spectrometer (Applied Photophysics) в диапазоне длин волн 195-260 нм с последующим определением соотношения элементов вторичной структуры по методу Срирама и Вуди [13]. Автор глубоко благодарен к.б.н. А.В. Пивоваровой за помощь в проведении экспериментов по спектроскопии кругового дихроизма.

Собственную триптофановую флуоресценцию белков (0,06-0,08 мг/мл) в буфере В возбуждали светом с длиной волны 295 нм и регистрировали в диапазоне 300-400 нм. Для измерения параметров связывания гидрофобного зонда bis-ANS к образцу, содержащему 0,67-1,00 мкМ малого белка теплового шока (в расчете на мономер) в фосфатном буфере, добавляли bis-ANS до конечной концентрации 8-9 мкМ, регистрируя уровень флуоресценции при различном соотношении bis-ANS/белок. Флуоресценцию возбуждали светом с длиной волны 385 нм и регистрировали при 495 нм. Все измерения проводили на спектрофлуориметре Varían™ CaryEclipse при 25°С.

Для анализа четвертичной структуры белков проводили гель-фильтрацию на колонках Superdex 75 HR 10/30 и Superdex 200 HR 10/30, уравновешенных буфером В, содержащем 150 мМ NaCl. При анализе олигомерного состояния на колонку наносили от 10 до 170 мкг белка в 150 мкл буфера В. Метод гель-фильтрации также использовали при исследовании образования гетероолигомеров, при этом на колонку наносили 180 мкг белка в 200 мкл буфера В. Скорость элюции составляла 0,5 мл/мин. В ходе элюции собирали фракции объемом 0,4 мл и анализировали их белковый состав методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле [12]. В качестве белков-стандартов использовали тиреоглобулин (669 кДа), ферритин (440 кДа), каталазу (240 кДа), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу из мышц кролика (144 кДа), бычий сывороточный альбумин (68 кДа), овальбумин (43 кДа), химотрипсиноген (25 кДа) и рибонуклеазу (13,7 кДа).

Сравнение шапероноподобной активности белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов проводили, используя в качестве модельных субстратов инсулин или роданазу. В кювете спектрофотометра смешивали белок-субстрат (конечная концентрация 0,2 мг/мл) с исследуемым малым белком теплового шока в весовом соотношении sHsp/субстрат равном 0, 1/4, 1/2 или 1. В случае инсулина образцы преинкубировапи 2 мин в термостатируемой кювете спектрофотометра и инициировали агрегацию добавлением 0,ЗМ ДТТ до конечной

5

концентрации 24 мМ. В случае роданазы образцы преинкубировали 10 мин при 25°С и помещали в термостатируемую кювету спектрофотометра при 44°С. Агрегацию субстрата регистрировали в течение 40-60 мин по увеличению кажущейся оптической плотности при 360 нм на спектрофотометре ТЛШкрес 3100.

Формирование гетероолигомерных комплексов БНвр человека проводили по ранее описанной методике [14]. Для этого предварительно восстановленные белки смешивали попарно в концентрации 0,5 или 1,0 мг/мл и инкубировали 1 час при 42°С в буфере В. В качестве контроля использовали образцы, инкубированные при 4°С. Было проведено три разных серии экспериментов. В первом случае образцы, содержащие белки дикого типа или «цистеиновые» мутанты, подвергались анализу сразу после инкубации при 42°С. Во втором случае образцы, содержащие НэрВ 1 дикого типа и/или «цистеиновые» мутанты, предварительно инкубированные при 42°С для формирования гетероолигомеров, подвергали мягкому окислению и анализировали методами электрофореза и гель-фильтрации. Наконец, в третьем случае сначала проводили мягкое окисление НзрВ1 дикого типа или «цистеиновых» мутантов для образования ковалентно-«сшитых» гомодимеров, а затем окисленные гомоолигомеры смешивали и инкубировали при 42°С для обмена субъединиц. Белковый состав полученных проб анализировали методами гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования.

Аналитическое ультрацентрифугирование образцов изолированных вШр и их смесей проводили на центрифуге Весктап, модель Е (ротор Аг^-Тл) при 4°С. После достижения ротором скорости 48000 об/мин регистрировали распределение белка по ячейке каждые 1,5 мин. На основании полученных данных строили диаграммы распределения в координатах С(Б2о,ш) от Бголу с использованием программы 5ЕБР1Т [15]. Автор выражает признательность сотруднику НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского П.В. Калмыкову за проведение экспериментов по аналитическому ультрацентрифугированию.

В экспериментах по коиммунопреципитации использовали моноклональные антитела к ШрВ1, НврВб и №рВ8, полученные ранее в лаборатории иммунохимии и любезно предоставленные д.б.н. А.Г. Катруха. Моноклональные антитела к НврВ5 были получены при выполнении данной работы. Образцы изолированных вНвр или их смесей инкубировали 30 мин при 4°С с сефарозой с иммобилизованными моноклональными антителами к одному из исследуемых малых белков теплового шока человека. Сефарозу промывали четыре раза фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,1% Т\уееп-20 (после каждой промывки сефарозу осаждали центрифугированием). Элюцию связанных с сефарозой белков проводили 0,1М глициновым буфером (рН 2,0) в течение 15-20 мин при 20°С и постоянном перемешивании. По окончании элюции осадок сефарозы удаляли центрифугированием, супернатант

6

нейтрализовали 2М раствором трис и анализировали белковый состав методом SDS-электрофореза с последующим вестерн-блотгингом. Для анализа образования «сшитых» дисульфидными связями гетеродимеров, перед стадией элюции сефарозу, содержащую связанные белки, промывали буфером А и инкубировали ее 2 часа в этом же буфере при 37°С для окисления и образования дисульфидных связей. Полученные образцы анализировали методом электрофореза в градиентном (10-20%) ПААГ в отсутствие Р-меркаптоэтанола или вестерн-блоттингом.

Для исследования взаимодействия sHsp на клеточном уровне клетки линии HEK293F трансфицировали по стандартной методике с использование липосомного агента Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen). Через -72 ч после трансфекции клетки отмывали от среды инкубации, осаждали в буфере PBS и лизировали 10 мин при 37°С в буфере CLB (50 мМ трис-HCl, рН 7,8, 150 мМ NaCl, 1% Nonidet Р-40), содержащем 1 мМ ФМСФ, 1,75 мкМ лейпептина и 6,25 мкМ пепстатина. Для удаления ядер полученный лизат центрифугировали 10 мин при 10000g. Общую концентрацию белка в полученных образцах измеряли методом Бредфорд [16], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (БСА). Экспрессию исследуемых белков анализировали методом вестерн-блоттинга, нанося по 20 мкг тотального белка на дорожку, при этом окрашивание проводили антителами, специфичными к sHsp человека, и антителами 6С5, специфичными к глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе. Детекцию гетероолигомеров малых белков теплового шока человека в клеточных лизатах проводили методом коиммунопреципитации. Автор выражает глубокую признательность к.б.н. Ф.Н. Розову за всестороннюю помощь в проведение экспериментов на клеточных культурах.

Основные результаты и их обсуждение Получение и сравнение структуры и свойств рекомбинантных малых белков теплового шока человека и их «цистеиновых» мутантов

В работе Завьялова и соавторов [11] было установлено, что единственный остаток цистеина (Cysl41) Hsp25 мыши может участвовать в образовании дисульфидных связей между соседними мономерами. При этом подобная модификация не сопровождалась существенными изменениями в структуре и шапероноподобной активности исследуемого белка. Данное наблюдение свидетельствует о том, что указанный остаток находится в области контакта между соседними мономерами малых белков теплового шока. Мы предположили, что введение единственного остатка цистеина в структуру различных малых белков теплового шока человека в положение, гомологичное Cysl41 Hsp25 мыши, позволит получить так называемые «цистеиновые» мутанты, которые могут быть успешно

7

C46S

X

C10S *

C99S X

использованы для исследования структуры гомо- и гетероолигомерных комплексов. Для реализации этого проекта в трех исследуемых белках человека (НйрВ5, ШрВб, НзрВВ) все эндогенные остатки £ Н5рВз Су5 цистеина бьши заменены на серин, а остаток,

- HspB1WT HspBSCys HspB6 Cys

Рис. 1. Схема строения «цистеиновых» гомологичный Суз141 Н$р25 мыши (а также мутантов 8Н8р человека. Звездочками отмечены н человека) был заме„ен на

эндогенные остатки цистеина, замененные на '

серин, стрелкой - точечная мутация, цистеин (рис. 1). Очевидно, что сопровождающаяся введением единственного

остатка цистеина. использование «цистеиновых» мутантов для

исследования гомо- или гетероолигомерных комплексов возможно лишь в том случае, если введенные мутации не влияют на структуру и свойства исследуемых белков. В связи с этим белки дикого типа и их «цистеиновые» мутанты бьши получены в высокоочищенном состоянии [17, 18], и было проведено подробное сравнение их свойств.

Метод спектроскопии кругового дихроизма (КД) был использован для анализа вторичной структуры белков. Спектры КД НзрВ5 и НврВб имеют широкий отрицательный

максимум между 208 и 215 нм, соответственно (рис. 2, А и Б), что характерно для белков, в структуре которых преобладают р-складчатые участки. Отрицательный максимум спектра КД НэрВ8 смещен в более коротковолновую область и приходится на 203-205 нм (рис. 2, В), что свидетельствует о наличии повышенного (относительно других эНвр) количества неупорядоченных участков в структуре белка. Спектры КД «цистеиновых» мутантов практически идентичны спектрам белков дикого типа, из чего следует, что введенные точечные мутации не влияют на вторичную структуру исследуемых белков (рис. 2).

Для сравнения третичной структуры исследуемых вНвр мы использовали метод собственной триптофановой флуоресценции. Этот метод позволяет оценить микроокружение остатков триптофана в белковой глобуле и получить

л с о 5 Ч

«

5 -«ооо

-2000 •4000 ■6000

200 210 220 230 240 250 260

Длина волны, нм

Рис. 2. Спектры кругового дихроизма sHsp дикого типа (сплошные линии) и их «цистеиновых» мутантов (пунктирные линии). А - HspB5, Б - HspB6, В -HspB8.

определенную информацию о третичной структуре белка, по крайней мере, в области, непосредственно примыкающей к остаткам триптофана. Оказалось, что спектры собственной триптофановой флуоресценции всех исследуемых белков имеют максимум при 345-346 нм, при этом форма и амплитуда спектров белков дикого типа и соответствующих «цистеиновых» мутантов практически не различаются (данные не представлены). Анализ полученных спектров показал, что большая часть остатков триптофана располагается на поверхности белковой глобулы, но не контактирует с молекулами воды [19]. Таким образом, метод флуоресцентной спектроскопии также не выявил значительных изменений структуры исследуемых вНэр при внесении точечных мутаций. Для сравнения гидрофобных свойств исследуемых белков мы анализировали связывание гидрофобного зонда Ыз-А^ с белками дикого типа и их «цистеиновыми» мутантами. Было установлено, что характер связывания Ыэ-АШ в значительной степени зависит от природы белка [20]. Так, НярВб (аВ-кристаллин) (в концентрации 0,67 мкМ) эффективно и с высоким сродством связывает гидрофобный зонд, при этом насыщение центров связывания происходило при концентрации Ыв-А^ около 5,0 мкМ. Это свидетельствует о том, что НзрВ5 имеет небольшое количество центров прочного связывания Ыэ-АКБ. Кривая титрования «цистеинового» мутанта НэрВ5 незначительно отличается от кривой титрования белка дикого типа, что свидетельствует о том, что введенная мутация не изменяет гидрофобных свойств этого белка. Титрование №рВ6 и ШрВ8 сопровождалось медленным увеличением флуоресценции, которое

не достигает насыщения даже при очень высоких концентрациях флуоресцентного зонда. Так, например, добавление даже 8-9-кратного избытка Ыз-АЫЭ к НврВб (или ШрВ8) не приводило к насыщению, а сопровождалось лишь линейным увеличением флуоресценции. Такая форма кривой характерна для белков, имеющих большое количество центров связывания с низким сродством к Ыз-А№. По этим причинам сравнение гидрофобных свойств ШрВб и №рВ8 и их «цистеиновых» мутантов оказалось довольно затруднительным. Тем не менее, анализ связывания Ыз-АК'Э не выявил существенных изменений гидрофобных свойств ШрВб и его «цистеинового» мутанта. «Цистеиновый» мутант НзрВ8 связывал Ыв-АЫЭ лучше, чем белок дикого типа, однако это различие было довольно незначительным.

Одним из отличительных свойств малых белков теплового шока является их способность образовывать крупные и динамичные олигомерные комплексы, поэтому важной характеристикой этих белков является их четвертичная структура. Метод гель-фильтрации был использован для сравнения олигомерного состояния ШрВ5, ШрВб и Н5рВ8 и их «цистеиновых» мутантов. В связи с тем, что олигомерное состояние может зависеть от концентрации белка, мы наносили на гель-фильтрационную колонку различные количества исследуемых вНвр и анализировали зависимость объема элюции от количества наносимого

9

11,0

10,8

10,6

10,4

10,2

с; ю.о 2

£ 10,8 s

10,6

2

5 10,4

0

1 10,2

Ю 10,0 О

11,8 11,6 11,4 11,2 11,0

А

•

20 40 60 80 100 120 140 160

Б

10 20 30 40 50 60

В

___

ч. .

0 10 20 30 40 50 60 70

Количество белка, мкг

Рис. 3. Зависимость объема элюции вШр дикого типа (сплошные линии) и их «цистеиновых» мутантов (штриховые линии) от количества наносимого на колонку белка. А -НЬрВ5 (гель-фильтрация на Эирегйех-200), Б - НврВб и В - №рВ8 (гель-фильтрация на 8ирег(1ех-75).

белка (рис. 3). НврВб формирует крупные олигомеры с кажущейся молекулярной массой около 660 кДа (максимум пика элюции с колонки Эирегёех 200 приходится на 10,6 мл), при этом положение максимума не зависит от количества наносимого белка (рис. 3, А). Кажущаяся молекулярная масса олигомеров «цистеинового» мутанта НврВ5 близка к таковой белка дикого типа (различие в положении максимума не превышает 0,2 мл). НврВб при гель-фильтрации на колонке Зирегёех 75 элюируется в виде симметричного пика с объемом элюции ~10,6 мл, что соответствует белку с кажущейся молекулярной массой около 52 кДа. Положение максимума пика на профиле элюции не зависит от количества наносимого белка, и при этом при всех исследованных концентрациях хроматографическое поведение «цистеинового» мутанта НврВб не отличается от поведения белка дикого типа (рис. 3, Б). В отличие от первых двух белков НБрВ8, по всей видимости, не образует стабильных олигомеров, а существует в виде

равновесной смеси мономеров и димеров. Следствием этого является уменьшение объема элюции при увеличении количества наносимого на колонку белка (рис. 3, В). «Цистеиновый» мутант HspB8 при гель-фильтрации ведет себя подобным образом, однако его объемы элюции незначительно (менее 0,1 мл) меньше объема элюции белка дикого типа. Таким образом, приведенные выше данные свидетельствуют о том, что точечные мутации, введенные в «цистеиновых» мутантах HspB5 и HspB8, лишь незначительно влияют на размер или форму этих белков, а олигомерное состояние HspB6 не изменяется вовсе.

Предотвращение агрегации частично денатурированных белков (шапероноподобная активность) является одним из наиболее важных свойств малых белков теплового шока. В этой связи представлялось важным сравнить шапероноподобную активность белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов. В качестве субстратов были выбраны инсулин и роданаза, являющиеся классическими модельными субстратами для измерения шапероноподобной активности в условиях in vitro. Агрегацию инсулина индуцировали

10

добавлением избытка ДТТ, а агрегацию роданазы -повышением температуры. За процессом агрегации следили по увеличению кажущейся оптической плотности при 360 нм при различном весовом соотношении БНвр/субстрат (0, 1/1, 1/2 и 1/4). Оказалось, что №рВ5 и НярВ8 полностью предотвращают агрегацию роданазы при соотношении 1/2 (рис. 4, А и В). Шаперонная активность ШрВб при использовании роданазы оказалась ниже, чем у двух других белков, и в выбранных условиях он лишь частично предотвращал агрегацию данного субстрата (рис. 4, Б). При этом шапероноподобная активность «цистеиновых» мутантов НзрВб, ШрВб и №рВ8 оказалась сравнимой с активностью соответствующих белков дикого типа (рис. 4, штриховые линии). При использовании инсулина в качестве субстрата было выявлено значительное различие в шапероноподобной активности ШрВб дикого типа и его «цистеинового» мутанта. В выбранных условиях и фиксированном соотношении НврВв/инсулин белок дикого типа полностью предотвращал агрегацию данного субстрата, в то время как «цистеиновый» мутант лишь замедлял ее на начальном этапе. Мы связываем такое поведение «цистеинового» мутанта ШрВб с наличием в нем точечной мутации в >Г-концевой части (С46Б). По данным литературы [21] остатки 11-18 и 33-40 в НхрВ5 (аВ-кристаллине), гомологичные остаткам 13-23 и 38-46 в НврВб, напрямую вовлечены в связывание инсулина. Возможно, точечная замена во втором участке связывания приводит к определенному изменению шапероноподобной активности «цистеинового» мутанта при использовании инсулина в качестве модельного субстрата. В случае двух других малых белков теплового шока (НврВб и НярВ8) шапероноподобная активность белков дикого типа была практически не отличимой от щапероноподобной активности соответствующих «цистеиновых» мутантов. При этом следует заметить, что при использовании инсулина в качестве субстрата НкрВ5 (и его «цистеиновый» мутант) обладали наибольшей, а НврВ8 (и его «цистеиновый» мутант) -наименьшей шапероноподобной активностью.

11

Время, мин

Рис. 4. Кинетика агрегации роданазы в отсутствие 5№р (штрих-пунктирные линии) и в присутствии белка дикого типа (сплошные) или «цистеиновых» мутантов

(пунктирные). Весовое отношение роданаза/вШр 2/1. А - Н5рВ5, Б -ШрВб, В - НзрВ8.

Суммируя представленные результаты, можно заключить, что введение точечных мутаций не приводит к существенным изменениям во вторичной, третичной или четвертичной структуре исследуемых белков. Шапероноподобная активность «цистеиновых» мутантов исследуемых sHsp (за исключением «цистеинового» мутанта HspB6 при использовании инсулина в качестве модельного субстрата) существенно не отличается от шапероноподобной активности белков дикого типа. Таким образом, полученные нами «цистеиновые» мутанты малых белков теплового шока человека могут быть использованы в качестве инструмента для анализа образования гомо- и гетероолигомерных комплексов sHsp.

Образование гомо- и гетеродимеров различными малыми белками теплового шока

человека

В исследованиях последних трех лет, было установлено, что ß7-c кладка а-кристаллинового домена непосредственно вовлечена в образование межмолекулярных связей в димерах малых белков теплового шока [8-10, 22]. При этом остаток цистеина, расположенный в р7-складке Hsp25 и его ортологов, может участвовать в образовании дисульфидных мостиков между соседними мономерами [11]. Получив «цистеиновые» мутанты HspB5, HspB6 и HspB8 и имея в руках HspBl дикого типа с единственным остатком цистеина, расположенным в середине Р7-складки, мы могли проанализировать эффективность образования дисульфидных связей и формирование гомодимеров различными малыми белками теплового шока. Учитывая тот факт, что многие малые белки теплового шока способны образовывать гетероолигомерные комплексы, мы могли исследовать образование таких гетероолигомеров, используя «цистеиновые» мутанты. Для того чтобы исключить неспецифическое окисление SH-групп при хранении белка, перед каждым экспериментом исследуемые белки подвергались восстановлению. Для анализа образования гомодимеров сразу после восстановления sHsp диализовали против буфера А (50 мМ трис-HCl, pH 7,4, 50 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 0,1 мМ ФМСФ) при 25°С в течение ночи. Такая обработка обеспечивала мягкое окисление и формирование дисульфидных мостиков между остатками цистеина. Для анализа образования гетероолигомерных комплексов предварительно восстановленные белки смешивали попарно и инкубировали 1 час при 42°С. Как было установлено ранее, такая обработка обеспечивала полный обмен субъединиц и формирование гетероолигомерных комплексов. Полученные смеси малых белков теплового шока подвергали мягкому окислению при 25°С в течение ночи. Образование димеров, «сшитых» дисульфидными связями, детектировали методом электрофореза в градиентном 10-20% ПААГ в отсутствие ß-МЭ. К сожалению, оказалось, что этот метод не позволяет

12

66— 42 —

31 — 2166" 423121-

HspBl+HspB6 1 2 3

HspB5+llspB6 1 2 3

HspBl+HspB5 1 2 3

HspB8+HspBS 1 2 3

HspB8+llspB6 1 2 3

664231-

HspBl+HspB8 HspBl 1 2 3

3 «

разделить гомо- и гетеродимеры HspBl и HspB8, поэтому разделение димеров этих белков проводили методом SDS-электрофореза в 10% ПААГ в присутствии 6 М мочевины.

Данные, представленные на рис. 5, свидетельствуют о том, что дикого типа и все «цистеиновые» мутанты в выбранных условиях с высокой эффективностью образуют

гомодимеры, «сшитые»

дисульфидными связями.

Подробное изучение этого процесса показало, что эффективность образования дисульфидных связей увеличивается при повышении температуры, и при проведении диализа при 37°С более 80% белков оказывается вовлеченными в формирование «сшитых» гомодимеров.

Окисление смесей двух «цистеиновых» мутантов sHsp или «цистеинового» мутанта с HspBl дикого типа во всех случаях приводило к появлению на электрофореграмме дополнительной полосы, отмеченной стрелкой на дорожках 2 рис. 5. Эта полоса, имеющая кажущуюся молекулярную массу промежуточную между молекулярными массами гомодимеров sHsp, входящих в состав образца, соответствует гетеродимерам исследуемых белков. Наиболее эффективно образование гетеродимеров происходило в образцах, содержащих HspBl, HspB5 и HspB6 (рис. 5, верхний ряд). В парах указанных белков доля гетеродимеров составляла более 35% от всех образующихся димеров, «сшитых» дисульфидными связями. Наибольшая доля гетеродимеров была обнаружена в случае HspBl и HspB6 (рис. 5, вверху слева).

Напротив, если одним из двух малых белков теплового шока был HspB8, доля образующихся гетеродимеров была значительно меньше. В этом случае HspB8 и любой из его партнеров эффективно образовывали гомодимеры, но доля гетеродимеров не превышала 15-20% от всех «сшитых» дисульфидными связями димеров (рис. 5, нижний ряд). Таким образом, HspB 1, HspB5 и HspB6 эффективно обмениваются субъединицами (мономерами). В

13

Рис. 5. Химическое «сшивание» «цистеиновых» мутантов и №рВ1 дикого типа в ходе мягкого окисления вН-групп. Дорожки 1 и 3 - изолированные окисленные белки, дорожка 2 - смесь двух белков, инкубировавшаяся при 42°С перед окислением. Электрофорез в градиентном ПААГ (10-20%) в отсутствие Р-МЭ. Маленькой стрелкой обозначено положение гетеродимеров.

то же время эффективность образования гетеродимеров всех перечисленных малых белков теплового шока с «цистеиновым» мутантом HspB8 значительно ниже. Представленные результаты в некоторой степени противоречат данным, полученным в лаборатории Бенндорфа, согласно которым HspB8 является универсальным малым белком теплового шока, способным взаимодействовать практически со всеми другими sHsp человека [6, 7]. Нам кажется, что это противоречие может быть связано с тем, что использованные в работах Бенндорфа и соавт. методы не позволяют достаточно точно оценить прочность взаимодействия различных малых белков теплового шока. К тому же в работах Бенндорфа и соавт. использовались малые белки теплового шока «слитые» с флуоресцентными белками или пептидами-метками. Это могло приводить к значительному изменению свойств исследуемых белков и к получению ложноположительных результатов.

Представленные данные свидетельствуют о том, что р7-складка а-кристаллинового домена играет важную роль во взаимодействии соседних субъединиц различных малых белков теплового шока человека. Cysl37 HspBl или остатки цистеина, введенные в гомологичные позиции других sHsp, располагаются в непосредственной близости (на расстоянии не более 8 Â [23]) в структуре как гомо-, так и гетеродимеров и могут легко подвергаться окислению с образованием дисульфидных связей. Межсубъединичное взаимодействие, по всей видимости, осуществляется не только посредством контактов, образуемых двумя антипараллельно направленными р7-складками, но и за счет других участков в структуре малых белков теплового шока. Возможно, взаимодействие по этим участкам влияет на стабильность димеров тех или иных sHsp и может либо увеличивать (как в случае пары HspBl/HspB6), либо уменьшать (как в случае пары любого из изученных sHsp и HspB8) эффективность образования «сшитых» дисульфидными связями гетеродимеров малых белков теплового шока.

Формирование гетероолигомеров малых белков теплового шока человека в условиях in

vitro и in vivo

В начале 90-х годов было обнаружено, что HspBó (Hsp20, р20) и HspBl (Hsp27) соочищаются с аВ-кристаллином (HspB5) при выделении из скелетных мышц [24, 25]. Позднее эти исследования были расширены. При этом, как правило, использовались методы дигибридного скрещивания, коиммунопреципитации модифицированных малых белков теплового шока или метод флуоресцентного переноса энергии (FRET) с использованием sHsp, «слитых» с флуоресцентными белками [6, 7, 26], Все перечисленные методы не лишены недостатков. Кроме того, до последнего времени не проводилось систематических исследований механизма формирования гетероолигомерных комплексов, и не были изучены

14

свойства образующихся гетероолигомеров. В этой связи мы предприняли попытку исследовать процесс формирования

гетероолигомеров малых белков теплового шока, используя методы химического «сшивания» «цистеиновых» мутантов, а также методов гель-фильтрации, аналитического ультрацентрифугирования и

коиммунопреципитации sHsp дикого типа в условиях in vitro и in vivo.

Вследствие того, что ранее в нашей лаборатории были подробно исследованы свойства гетероолигомеров, формируемых HspBl и HspB6 [14], мы сконцентрировали свое внимание на гетероолигомерных комплексах, образуемых HspB5 и HspB6. аВ-кристаллин (HspB5) дикого типа образует крупные гомоолигомеры с молекулярной массой около 600-700 кДа, a HspB6, по всей видимости, представлен в виде димеров. При гель-фильтрации изолированные HspB5 и HspB6 элюировапись в виде симметричных пиков с кажущимися молекулярными массами около 660 кДа (HspB5) и 52 кДа (HspB6) (рис. 6, А). Однако, если перед нанесением на колонку смесь HspB5/HspB6 преинкубировали 1 час при 42°С, то на профиле элюции появлялся новый пик с промежуточной молекулярной массой около 350 кДа, в котором обнаруживались оба белка (рис. 6, А). Как было описано выше, «цистеиновые» мутанты HspB5 и HspB6 не отличаются по олигомерному состоянию от белков дикого типа, и поэтому мы могли использовать их для изучения состава гетероолигомерных комплексов. Смесь «цистеиновых» мутантов HspB5 и HspB6 инкубировали 1 час при 42°С, тем самым обеспечивая возможность обмена субъединиц. Полученный образец диализовали против буфера А при 15°С. В этих условиях обмен субъединиц незначителен, но происходит мягкое окисление сульфгидрильных групп и образование дисульфидных связей в димерах. При гель-фильтрации полученного таким образом образца оказалось, что окисление практически

15

Объем элюции, мл

Рис. 6. Гель-фильтрация изолированных №рВ5, НэрВб и их гетероолигомерных комплексов. А - белки дикого типа, Б -«цистеиновые» мутанты Н5рВ5/НэрВ6, после окисления, проведенного после обмена субъединиц. Штрих-пунктирными линиями (1 и 2) представлены профили элюции изолированных белков,

штриховыми линиями (3) - смеси, инкубированные при 4°С, сплошными линиями (4) - смеси двух белков, инкубированные при 42°. На врезках представлены электрофореграммы

соответствующих фракций. 505-электрофорез проводили в присутствии (А) или в отсутствие (Б) Р-МЭ. Стрелкой на Б обозначено положение гетеродимеров.

не влияло на форму и положение пика, соответствующего гетероолигомерам №рВ5/Н5рВ6 (ср. рис. 6, А и Б). В пике, соответствующем «сшитым» гетероолигомерам мы обнаруживали гомодимеры №рВ5 и гетеродимеры НБрВб/ШрВб, однако в нем не было обнаружено «сшитых» гомодимеров НэрВб, которые элюировались в отдельном пике (рис. 6, Б). Таким образом, мономеры ШрВб могут встраиваться в крупные олигомеры НврВ5 только через образование гетеродимеров с НврВб.

В хорошем соответствии с данными, ранее полученными в нашей лаборатории [14], мы наблюдали образование гетероолигомеров двух типов между ШрВ1 и ШрВб. Анализ состава этих олигомеров с использованием «цистеинового» мутанта №рВ6 показал, что комплексы с кажущимися молекулярными массами 120-150 и 300 кДа содержат в своем составе преимущественно гетеродимеры. Это наблюдение впоследствии было подтверждено с использованием метода коиммунопреципитации (данные не представлены). Анализ взаимодействия между НэрВ1 дикого типа и НзрВ5 методом гель-фильтрации оказался затруднен вследствие того, что оба этих белка образуют крупные олигомерные комплексы. По этой причине мы исследовали взаимодействие НврВЗ с точечным мутантом 1 [эрВ 1, имитирующим фосфорилирование по трем остаткам серина (3180/3780/5820). Этот мутантный белок, обозначаемый как Н5рВ1_30 образует небольшие олигомеры (димеры или тетрамеры), что облегчает исследование его взаимодействия с Н5рВ5. Оказалось, что НврВ5 дикого типа и ШрВ1_30 способны образовывать гетероолигомерные комплексы с кажущейся молекулярной массой, близкой к массе гомоолигомеров №рВ5.

Результаты, полученные при гель-фильтрации, были подтверждены с использованием метода аналитического ультрацентрифугирования. В выбранных условиях НэрВб седиментировался в виде острого пика с коэффициентом седиментации 2,68 (рис. 7, линии 1). В то же время образующие крупные гетерогенные олигомерные комплексы ШрВ1 и НврВб седиментировались в виде широких пиков с коэффициентами седиментации 10-158 и 13-178, соответственно (рис. 7, линии 2). Если аналитическому ультрацентрифугированию подвергали смеси Н8рВ1/Н.?рВ6 или ШрВб/НврВб, преинкубированные при 4°С, то на седиментограммах выявлялись пики, соответствующие изолированным белкам (рис. 7, линии 3). Напротив, если перед ультрацентрифугированием смеси Н$рВ1/НврВв или ШРВЗ/НэрВб преинкубировали при 42°С, то пики, соответствующие изолированным белкам, исчезали и вместо них на седиментограммах выявлялись комплексы с промежуточными коэффициентами седиментации (рис. 7, линии 4). В случае пары Н5рВ1/ШрВ6 были обнаружены пики с коэффициентами седиментации 3,98 и 7,08, а в случае пары НврВЗ/ШрВб - пики с коэффициентами 7,98 и 10,48.

10 12 14 16 18 20 22 24

10 12 14 16 18 20 22 24

Рис. 7. Исследование взаимодействия в парах HspBl/HspB6 (А) и HspB5/HspB6 (Б) методом аналитического ультрацентрифугирования. Представлены седиментограммы изолированных белков (штрих-пунктирные линии 1 и 2) и их смесей, преинкубированных при 4°С (штриховые линии 3) или 42°С (сплошные линии 4). Врезка на Б представляет собой увеличенную часть седиментограммы в области 6-22S.

В связи с тем, что при использовании «цистеиновых» мутантов нам не удалось

выявить взаимодействие HspB8 с другими малыми белками теплового шока человека, мы

попытались исследовать взаимодействие HspB8 дикого типа с HspBl и HspB5 методом гель-

фильтрации. В отличие от ранее исследованных малых белков теплового шока HspB8

оказался не способным образовывать гетероолигомеры ни с HspBl, ни с HspB5. Таким

образом, в полном согласии с данными, полученными методами химического «сшивания»,

HspBl, HspB5 и HspB6 эффективно взаимодействуют между собой и образуют устойчивые

гетероолигомерные комплексы, в то время как HspB8 не способен образовывать прочных

комплексов ни с одним из перечисленных sHsp. Все приведенные выше данные были

получены в условиях in vitro. Поэтому возникает вопрос, способны ли анализируемые белки

образовывать гетероолигомерные комплексы in vivo. Для ответа на этот вопрос необходимо

было использовать метод, который позволил бы выявить гетероолигомерные комплексы

малых белков теплового шока в сложной белковой смеси клеточных лизатов. В качестве

такого метода мы выбрали метод коиммунопреципитации. Прежде чем приступить к работе

с клеточными лизатами, было необходимо получить моноклональные антитела к каждому из

исследуемых малых белков теплового шока, иммобилизовать эти антитела на BrCN-

активированной сефарозе и провести предварительные эксперименты на изолированных

белках in vitro. Полученный аффинный носитель инкубировали с четырьмя пробами,

отличающимися по белковому составу. Первая проба содержала изолированный малый

белок теплового шока, являющийся антигеном для иммобилизованных антител. Вторая

проба содержала второй малый белок теплового шока, взаимодействие с которым

предполагалось исследовать. Третья проба содержала смесь двух анализируемых sHsp,

преинкубированную при 4°С. Наконец, четвертая проба содержала смесь двух указанных

белков, преинкубированную при 42°С. После инкубации сефарозу с иммобилизованными

17

антителами отмывали от несвязавшихся белков буфером PBS, содержащим 0,1% Tween-20, а связавшиеся белки элюировали глициновым буфером с рН 2,0. Белковый состав проб, сорбированных на аффинном носителе, анализировали методом SDS-электрофореза с

Если с носителем были связаны антитела на HspB6, то на сефарозе сорбировался только изолированный HspB6 (дорожка 1 на рис. 8, А) и не сорбировался HspB5 (дорожка 2 на рис. 8, А). Если смесь HspB5/HspB6 инкубировалась при низкой температуре (когда обмен субъединиц не возможен), то на носителе сорбировался только HspB6 (дорожка 3 на рис. 8, А). В то же время после инкубации смеси HspB5/HspB6 при 42°С, т.е. после образования гетероолигомеров, с аффинным сорбентом связывались оба белка (дорожка 4 на рис. 8, А). Аналогичные данные были получены при использовании сефарозы с иммобилизованными антителами на HspB5 (рис. 8, Б).

Используя метод коиммунопреципитации, мы также смогли выявить взаимодействие в парах HspBl/HspB6 и HspBl/HspB5. Следует заметить, что эффективность связывания HspBl с носителем была, как правило, ниже эффективности связывания других малых белков теплового шока. Используя «цистеиновые» мутанты и немного модифицировав методику иммунопреципитации (введя дополнительную стадию окисления перед элюцией с аффинного сорбента), мы смогли детектировать образование «сшитых» дисульфидными связями гетероолигомерных комплексов HspBl/HspB6 и HspB5/HspB6. Мы попытались использовать метод коиммунопреципитации и для выявления образования гететроолигомеров между HspB6 и HspB8. Однако, также как во всех предыдущих экспериментах, нам не удалось выявить взаимодействие между этими белками. В этом случае на аффинном сорбенте на HspB8 мы могли обнаружить только следовые количества HspB6.

После проведения экспериментов с изолированными белками in vitro, мы могли приступить к анализу взаимодействия малых белков теплового шока на клеточной модели. Мы транфицировали клетки линии НЕК293 плазмидами, содержащими CDS двух разных малых белков теплового шока и попытались методом коиммунопреципитации детектировать взаимодействие между этими белками. При выполнении этой задачи мы столкнулись с рядом

18

последующим вестерн-блоттингом.

12 3 4

Рис. 8. Коиммунопреципитация изолированных НврВб (1) и Н$рВ5 (2), смеси этих белков, инкубировавшейся при 4°С (3) или при 42°С (4). А - сефароза с иммобилизованными антителами к ШрВб, Б — сефароза с иммобилизованными антителами к НэрВ5.

трудностей. Во-первых, уровень экспрессии ШрВ5 оказался ниже, чем уровень экспрессии других исследуемых эНвр, вследствие чего при котрансфекции не удавалось добиться одинакового уровня экспрессии двух эНвр. Во-вторых, Н5рВ1 при экспрессии в эукариотических клетках слабо связывался с антителами, специфичными к этому белку. Вследствие этого мы не могли использовать сефарозу с иммобилизованными антителами на НзрВ1 для выявления гетероолигомерных комплексов. Тем не менее, нам удалось

детектировать взаимодействие в парах ШрВШврВб и ШрВ5/Н8рВ6. На рис. 9 представлены результаты

коиммунопреципитации лизатов клеток, трансфицированных плазмидой, содержащей кодирующую последовательность одного из анализируемых белков (НэрВ5 или ШрВб), либо котрансфицированных обеими плазмидами. Как и следовало ожидать, если клетки были трансфицированы одной плазмидой, на аффинном носителе сорбировался только один из малых белков теплового шока, т.е. тот белок, антитела к которому были иммобилизованы на носителе (дорожки 1 и 2 на рис. 9). При котрансфекции двумя плазмидами с носителем оказываются связанными оба исследуемых белка, способных образовывать гетероолигомерные комплексы (дорожка 3 на рис. 9). В связи с тем, что нам не удалось получить одинакового уровня экспрессии обоих белков, а также в связи с тем, что аффинные сорбенты обладают разным сродством, метод коиммунопреципитации не позволяет определить эффективность образования гетероолигомерных комплексов и их стехиометрию.

Таким образом, изучив взаимодействие четырех вНэр человека с применением широкого набора методов, мы можем заключить, что малые белки теплового шока склонны к образованию не только крупных гомоолигомеров, но и различного типа гетероолигомеров. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что НэрВ1, НэрВ5 и ШрВб способны образовывать гетероолигомерные комплексы, в то время как НэрВ8 лишь очень слабо взаимодействует с другими малыми белками теплового шока и не способен образовывать с ними гетероолигомеров. Такое поведение НврВБ может быть следствием нескольких причин. Во-первых, в отличие от других малых белков теплового шока в структуре НврВ8 отсутствуют р2-складка в а-кристаллиновом домене и консервативный 1-Х-1/У мотив в С-концевой области. Оба этих участка играют важную роль в

19

-НзрВ5 "НэрВб

-НзрВ5 -НэрВб

Рис. 9. Коиммунопреципитации лизатов клеток НЕК293, трасфицированных плазмидами ШрВ5 (1), №рВ6 (2) или обеими плазмидами (3). А — сефароза с иммобилизованными антителами к ШрВб, Б - сефароза с иммобилизованными антителами к НэрВЗ.

межсубъединичных контактах в олигомерах вНвр. Во-вторых, НзрВ8 относится к группе внутренне разупорядоченных белков и в отличие от всех других эШр человека не образует крупных олигомеров, а существует в виде равновесной смеси мономеров и димеров. Наконец, в-третьих, данные последних лет свидетельствуют о том, что о том, что в клетке у НврВв есть иные белковые партнеры, чем малые белки теплового шока. Так, например, установлено, что НзрВ8 взаимодействует с белком Ва§3, принимая участие в деградации белков путем автофагии [27, 28].

Возможный механизм образования гетероолигомеров малых белков теплового шока

человека

Механизм образования гетероолигомерных комплексов ранее подробно не изучался. В то же время, данные, полученные методом химического «сшивания», свидетельствуют о том, что мономеры могут участвовать в формировании гетероолигомеров. Вопрос о том, участвуют ли гомодимеры, считающиеся стабильными структурными единицами вНвр, в обмене субъединиц и формировании гетероолигомеров оставался открытым. Для ответа на этот вопрос мы исследовали взаимодействие между окисленными НврВ1 дикого типа и «цистеиновыми» мутантами Н$рВ5 и НврВб. Как было показано ранее, указанные белки эффективно образовывали гомодимеры, «сшитые» дисульфидной связью, причем если диализ проводился при 37°С, то доля таких димеров составляла более 80%. Мы смешивали

полученные таким образом гомодимеры попарно и инкубировали в условиях, оптимальных для образования

гетероолигомеров (1 час при 42°С), а затем анализировали полученные образцы методом гель-фильтрации (рис. 10). На профиле элюции смеси,

преинкубированной при 42°С,

отсутствовал пик с кажущейся молекулярной массой 350 кДа, соответствующий гетероолигомерам

НзрВ5/НэрВ6 (рис. 10, сплошная линия), и мы наблюдали лишь небольшое уменьшение размера гомоолигомеров №рВ5. Представленные данные

Объем элюции, мл

Рис. 10. Гель-фильтрация окисленных «цистеиновых» мутантов ШрВ5 и НврВб.

Штрих-пунктирными линиями (1 и 2) показаны профили элюции изолированных белков, штриховой линией (3) — сумма этих двух профилей, сплошной линией (4) - профиль элюции смеси предварительно окисленных белков, инкубированные при 42°С. На врезке представлена электрофореграмма

соответствующих фракций. БОБ-электрофорез проводили в отсутствие р-МЭ.

свидетельствуют о том, что окисленные гомодимеры «цистеиновых» мутантов НэрВ5 и ШрВб слабо взаимодействуют между собой, но не способны формировать стабильные гетероолигомеры. Аналогичные результаты были получены при исследовании взаимодействия между окисленными гомодимерами НзрВ1 дикого типа и «цистеинового» мутанта НзрВб. В этом случае положение обоих пиков в образце, преинкубированном при 42°С, точно соответствовало положению пиков изолированных белков. Представленные результаты были подтверждены в независимых экспериментах, проведенных с использованием метода аналитического ультрацентрифугирования.

На основе полученных в ходе нашей работы результатов мы предложили схему, описывающую механизм формирования

гетероолигомеров малых белков теплового шока человека (рис. 11). Мы предполагаем, что для формирования гетероолигомерных комплексов обязательно наличие свободно обменивающихся

мономеров. Свободные мономеры могут образовываться либо путем прямой диссоциации из крупных олигомеров, либо в ходе двухстадийного процесса, когда сначала из олигомеров освобождаются димеры, которые позднее диссоциируют до мономеров. По всей видимости, время жизни свободных мономеров в растворе очень незначительно, и они быстро реассоциируют с образованием гомо- или гетеродимеров. Как уже отмечалось, долгое время считалось, что олигомеры малых белков теплового шока диссоциируют только до димеров, которые являются наименьшей структурной единицей олигомеров. Однако в последнее время появились данные, подтверждающие нашу точку зрения и свидетельствующие о том, что в ходе диссоциации могут образовываться как димеры, так и мономеры малых белков теплового шока [29, 30]. Образующиеся при ассоциации двух различных мономеров гетеродимеры необходимы для формирования более крупных гетероолигомерных комплексов. Если мы предотвращаем образование свободных мономеров путем химического «сшивания» гомодимеров, то формирование гетероолигомеров становится невозможным (см. рис. 10). В то же время «сшитые» гомодимеры могут участвовать в формировании крупных гомоолигомеров. С этим предположением хорошо согласуются данные, полученные при анализе пар НБрВ1/Н5рВ6 и НэрВЗ/НэрВб. В первом случае гетероолигомеры состоят

21

^^ Окисление

(£>—го-

Рис. 11. Предполагаемый механизм образования гетероолигомеров различных малых белков теплового шока человека.

исключительно из гетеродимеров, а во втором случае в составе героолигомеров выявляются гомодимеры HspB5 и «сшитые» гетеродимеры HspB5/HspB6. Однако в этом комплексе не удается выявить гомодимеров HspB6 (см. рис. 6, Б).

Предложенная схема объясняет механизм формирования гетероолигомерных комплексов малых белков теплового шока человека. Кроме того, с помощью этой схемы можно описать пути образования гетероолигомеров HspB2/HspB3, имеющих стехиометрию 3:1 [31], а также гетероолигомеров HspB4 (аА-кристаллин) и HspB5 (аВ-кристаллин), стехиометрия которых варьирует в интервале от 3:1 до 1:1 [32]. Такие комплексы могут образовываться только в том случае, если в формировании гетероолигомеров принимают участие именно мономеры малых белков теплового шока.

ВЫВОДЫ

1. Получены так называемые «цистеиновые» мутанты трех малых белков теплового шока человека, в которых все эндогенные остатки цистеина заменены на остатки серина, а в положение, гомологичное Cysl37 HspBl, введен остаток цистеина.

2. Установлено, что структура и шапероноподобная активность «цистеиновых» мутантов HspB5, HspB6 и HspB8 существенно не отличаются от соответствующих свойств белков дикого типа.

3. Опыты, проведенные с использованием белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов, свидетельствуют о том, что HspBl, HspB5 и HspB6 взаимодействуют между собой и способны образовывать прочные гетероолигомерные комплексы.

4. Ни HspB8 дикого типа, ни его «цистеиновый» мутант не способны образовывать прочных гетероолигомерых комплексов с HspBl, HspB5 или HspB6.

5. Предложена модель, согласно которой свободные мономеры малых белков теплового шока человека необходимы для формирования гетероолигомерных комплексов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах

1. E.V. Mvmrikov. O.V. Bukach, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2010) The pivotal role of the ß7 strand in the intersubunit contacts of different human small heat shock proteins, Cell Stress and Chaperones, 15, pp. 365-377.

2. E.V. Mvmrikov. A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2011) Large potentials of small heat shock proteins, Physiological Reviews, 91(4), pp. 1123-1159.

3. E.V. Mvmrikov. A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2012) Heterooligomeric complexes of human small heat shock proteins, Cell Stress and Chaperones, 17(2), pp. 157-169.

4. M.V. Sudnitsyna, E.V. Mvmrikov. A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2012) The Role Of Intrinsically Disordered Regions In The structure and functioning of small heat shock proteins, Curr. Protein Pept. Sci., 13, pp. 76-85. Статья в коллективной монографии

1. А.А. Shemetov, E.V. Mvmrikov. A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2010) Structure, properties and multiple functions of human small heat shock protein HspB8 (Hsp22, Hll protein kinase or E2IG1) in P. Durante and L. Colucci (eds), Handbook of Molecular Chaperones: Roles, Structure and Mechanisms, Nova Science Publishers Inc., pp. 333-352. Тезисы докладов

1. A.E. Глухова, E.B. Мымриков. O.B. Букач (2008) Свойства гетероолигомерных комплексов Hsp20 и Hsp27 человека, МАКС-Пресс, Тезисы докладов Международной конференции «Ломоносов-2008», стр. 33-34, Москва.

2. Е.В. Мымриков (2009) Белок-белковые взаимодействия в гомоолигомерах малых белков теплового шока человека, МАКС-Пресс, Тезисы докладов Международной конференции «Ломоносов-2009», стр. 57-58, Москва.

3. Е.В. Мымриков (2010) Мономеры участвуют в образовании гетероолигомеров малых белков теплового шока человека, МАКС-Пресс, Тезисы докладов Международной конференции «Ломоносов-2010», стр. 59-60, Москва.

4. E.V. Mvmrikov. O.V. Bukach, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2010) P7-Strand of a-crystallin domain is important for monomer-monomer interaction in homo- and heterooligomers of human small heat shock protein, FEBS J., 277 (Suppl. 1), p. 171, Abstracts of «35th FEBS Congress - Molecules of Life», Gothenburg, Sweden.

5. E.V. Mvmrikov. O.V. Bukach, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2010) p7-strand is essential for monomer interaction in homo- and heterooligomers of human small heat shock proteins, Proceedings of the Australian Society for Biochemistry and Molecular Biology, 42, p. 245, Abstracts of «OzBio2010 Combined Conference - Molecules of life: from discovery to biotechnology», Melbourne, Australia.

6. E.V. Mvmrikov. A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2011) Formation of heterooligomeric complexes of human small heat shock proteins, Abstracts of conference «The Biology of Molecular Chaperones: From Basic Mechanisms To Intervention Strategies in Disease and Aging», p. 131, Grundlsee, Austria.

Данное исследование проводилось при поддержке Российского фонда фундаментальных исследовании (проекты 07-04-00115а и 10-04-00026а).

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Карре G, et al. (2010) Cell Stress Chaperones, 15: 457-61.

2. Horwitz J. (2009) Exp. Eye Res., 88: 190-4.

3. Narberhaus F. (2002) Microbiol. Mol. Biol. Rev., 66: 64-93.

4. Haslbeck M, et al. (2005) Nat .Struct. Mol. Biol., 12: 842-6.

5. Mymrikov EV, et al. (2011) Physiol. Rev., 91: 1123-59.

6. Fontaine JM, et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun., 337: 1006-11.

7. Sun X, et al. (2004) J. Biol. Chem., 279: 2394-402.

8. Bagneris C, et al. (2009) J. Mol. Biol., 392: 1242-52.

9. Baranova EV, et al. (2011) J. Mol. Biol., 411: 110-22.

10. Jehle S, et al. (2009) J. Mol. Biol., 385: 1481-97.

11. Zavialov A, et al. (1998) Int. J. Biol. Macromol., 22: 163-73.

12. Laemmli UK. (1970) Nature, 227: 680-5.

13. Sreerama N, Woody RW. (2000) Anal. Biochem., 287: 252-60.

14. Bukach OV, et al. (2009) Biochim. Biophys. Acta, 1794: 486-95.

15. Schuck P. (2000) Biophys. J., 78: 1606-19.

16. Kruger NJ. (2002). In The Protein Protocols Handbook: Second Edition, 15-21.

17. Kasakov AS, et al. (2007) FEBSJ., 274: 5628-42.

18. Bukach OV, et al. (2004) Eur. J. Biochem., 271: 291-302.

19. Пермяков EA. 2003. Метод собственной люминесценции белка. М.: Наука

20. Slavik J. (1982) Biochim. Biophys. Acta, 694: 1-25.

21. Ghosh JG, et al. (2007) Biochemistry, 46: 6308-17.

22. Laganowsky A, et al. (2010) Protein Sci., 19: 1031-43.

23. Berengian AR, et al. (1999) J. Biol. Chem., 274: 6305-14.

24. Kato K, et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 15302-9.

25. Kato K, et al. (1992) J. Biol. Chem., 267: 7718-25.

26. Sugiyama Y, et al. (2000) J. Biol. Chem., 275: 1095-104.

27. Vos MJ, et al. (2011) Autophagy, 7: 101-3.

28. Carra S, et al. (2008) Autophagy, 4: 237-9.

29. Baldwin AJ, et al. (2011) J. Mol. Biol., 413: 310-20.

30. Benesch JL, et al. (2008) J. Biol. Chem., 283: 28513-7.

31. den Engelsman J, et al. (2009) J. Mol. Biol., 393: 1022-32.

32. Horwitz J. (2003) Exp. Eye Res., 76: 145-53.

Заказ № 405-1/09/2012 Подписано в печать 14.09.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

4' ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

и^Г у www.cfr.ru ; е-таИ:2ак@с/г.га

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мымриков, Евгений Викторович

Список сокращений.

1. Обзор литературы.

1.1. Семейство малых белков теплового шока.

1.2. Структура малых белков теплового шока.

1.3. Малые белки теплового шока человека.

1.4. Некоторые функции малых белков теплового шока человека.

1.4.1. Предотвращение агрегации денатурированных белков.

1.4.2. Роль малых белков теплового шока в предотвращении апоптоза.

1.4.3. Возможное влияние малых белков теплового шока на актиновый цитоскелет

1.5. Мутации малых белков теплового шока, коррелирующие с развитием наследственных заболеваний. Роль Р7-складки в структуре sHsp.

1.6. Взаимодействие малых белков теплового шока человека.

2. Цель и задачи исследования.

3. Материалы и методы.

3.1. Получение плазмид, содержащих кодирующие последовательности исследуемых белков.

3.2. Тестовая и препаративная экспрессия рекомбинантных белков.

3.3. Получение компетентных клеток Е. coli.

3.4. Выделение и очистка рекомбинантных белков.

3.4.1. Выделение и очистка HspB 1 дикого типа (HspBl WT).

3.4.2. Выделение и очистка HspB6 дикого типа (HspB6WT) и HspB6 с заменами C46S/E116С (HspB6Cys).

3.4.3. HspB5 дикого типа (HspB5WT), выделение и очистка HspB5 с точечной мутацией El 17С (HspB5Cys).

3.4.4. Выделение и очистка HspB8 дикого типа (HspB8WT) и HspB8 с заменами С10S/C99S/N138С/С195S (HspB8Cys).

3.5. Сравнение структуры и шапероноподобой активности sHsp дикого типа и их «цистеиновых» мутантов.

3.5.1. Получение восстановленных и окисленных белков.

3.5.2. Сравнение вторичной структуры методом кругового дихроизма.

3.5.3. Исследование третичной структуры методом собственной триптофановой флуоресценции.

3.5.4. Исследование гидрофобных свойств с помощью зонда bis-ANS.

3.5.5. Сравнение олигомерного состояния методом гель-фильтрации.

3.5.6. Измерение шапероноподобой активности малых белков теплового шока

3.6. Формирование гетероолигомерных комплексов и анализ взаимодействия sHsp in vitro

3.6.1. Анализ взаимодействия различных малых белков теплового шока методом гель-фильтрации.

3.6.2. Детекция гетероолигомеров методом аналитического ультрацентрифугирования.

3.7. Анализ взаимодействия малых белков теплового шока с помощью метода коиммунопреципитации in vitro и in vivo.

3.7.1. Исследование взаимодействия sHsp человека на клеточном уровне.

3.7.2. Метод вестерн-блоттинга.

3.7.3. Получение моноклональных антител к HspB5 (аВ-кристаллину).

3.8. Аналитические методы.

3.8.1. Электрофоретические методы.

3.8.2. Определения концентрации белка.

3.8.3. Окрашивание гелей серебром.

4. Результаты и их обсуждение.

4.1. Выделение и очистка рекомбинантных малых белков теплового шока человека

4.1.1. Выделение и очистка HspB 1 дикого типа.

4.1.2. Выделение и очистка «цистеинового» мутанта HspB5.

4.1.3. Выделение и очистка HspB6 дикого типа и его «цистеинового» мутанта

4.1.4. Выделение и очистка HspB8 дикого типа и его «цистеинового» мутанта

4.2. Сравнение структуры и шапероноподобной активности sHsp дикого типа и их «цистеиновых» мутантов.

4.2.1. Сравнение вторичной структуры sHsp дикого типа и их «цистеиновых» мутантов

4.2.2. Исследование третичной структуры белков методом собственной триптофановой флуоресценции.

4.2.3. Исследование гидрофобных свойств малых белков теплового шока с помощью флуоресцентного зонда bis-ANS.

4.2.4. Исследование олигомерного состояния методом гель-фильтрации.

4.2.5. Измерение шапероподобной активности малых белков теплового шока.

4.3. Исследование белок-белковых взаимодействий в гомоолигомерах sHsp человека

4.3.1. Сравнение структуры «цистеиновых» мутантов sHsp человека в восстановленном и окисленном состоянии.

4.3.2. Сравнение шапероноподобной активности «цистеиновых» мутантов sHsp человека в восстановленном и окисленном состоянии.

4.4. Формирование гетероолигомеров малых белков теплового шока человека

4.4.1. Образование гетсродимеров малыми белками теплового шока человека

4.4.2. Формирование гетероолигомерных комплексов малых белков теплового шока дикого типа и их «цистеиновых» мутантов в условиях in vitro.

4.5. Использование метода коиммунопреципитации для анализа взаимодействия малых белков теплового шока в условиях in vitro и in vivo.

4.6. Исследование механизма взаимодействия малых белков теплового шока

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мымриков, Евгений Викторович

Выводы

1. Получены так называемые «цистеиновые» мутанты трех малых белков теплового шока человека, в которых все эндогенные остатки цистеина были заменены на остатки серина, а в положение, гомологичное Суз137 НврВЬ введен остаток цистеина.

2. Установлено, что структура и шапероноподобная активность «цистеиновых» мутантов НврВб, ШрВб и НэрВ8 существенно не отличаются от соответствующих свойств белков дикого типа.

3. Опыты, проведенные с использованием белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов, свидетельствуют о том, что Н8рВ1, НзрВ5 и НярВб взаимодействуют между собой и способны образовывать прочные гетероолигомерные комплексы.

4. Ни НзрВ8 дикого типа, ни его «цистеиновый» мутант не способны образовывать прочных гетероолигомерых комплексов с НзрВ1, НзрВ5 или НврВб.

5. Предложена модель, согласно которой свободные мономеры малых белков теплового шока человека необходимы для формирования гетероолигомерных комплексов.

4.7. Заключение

Таким образом, в ходе данной работы мы разработали новый подход для анализа взаимодействия малых белков теплового шока человека. Предложенный нами метод состоит во введении дополнительного остатка цистеина в участок, предположительно вовлеченный во взаимодействие соседних мономеров в составе димеров, образующих крупные олигомеры малых белков теплового шока человека. Получены так называемые «цистеиновые» мутанты четырех эНэр и установлено, что структура таких мутантных белков практически не отличается от структуры белков дикого типа. «Цистеиновые» мутанты эНвр эффективно образовывали дисульфидные связи как в составе гомо-, так и в составе гетеродимеров, что свидетельствует о том, что р7-складка, в которой расположен введенный остаток цистеина, принимает участие во взаимодействии мономеров различных эНэр человека. Эти результаты были подтверждены экспериментами, выполненными зарубежными учеными на изолированных а-кристаллиновых доменах Н$рВ5 (аВ-кристаллина) человека и Нэр20 крысы методами рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [11-13]. С использованием белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов установлено, что НзрВ1, НзрВ5 и ШрВб эффективно взаимодействуют между собой, в то же время они лишь очень слабо взаимодействуют с НзрВ8.

На основе полученных результатов предложена схема, описывающая предполагаемый механизм образования гетероолигомерных комплексов эНэр человека. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что для образования гетероолигомерных комплексов необходима диссоциация олигомеров до свободных мономеров. Взаимодействуя между собой, мономеры образуют гомо- или гетеродимеры, которые, ассоциируя, формируют различные по размеру и составу гетероолигомеры.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мымриков, Евгений Викторович, Москва

1. Mymrikov, E.V., A.S. Seit-Nebi, and N.B. Gusev, Large potentials of small heat shock proteins Physiol. Rev., 2011. 91(4): p. 1123-1159.

2. Narberhaus, T., Alpha-crystallin-type heat shock proteins socializing mimchaperones in the context of a multichapei one network Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2002. 66(1): p. 64-93.

3. Vos, M.J., et al., Sti uctural and functional diversities between members of the human IISPB, HSPH, HSPA, and DNAJ chaperone families Biochemistry, 2008. 47(27): p. 7001-7011.

4. Kappe, G., W.C. Boelens, and W.W. de Jong, Why proteins without an alpha-crystallin domain should not be included in the human small heat shock protein family IISPB. Cell Stress Chaperones, 2010. 15(4): p. 457-461.

5. Kriehuber, T., et al., Independent evolution of the core domain and its flanking sequences in small heat shock proteins FASEB J., 2010. 24(10): p. 3633-3642.

6. Kim, K.K., R. Kim, and S.H. Kim, Crystal structure of a small heat-shock protein Nature, 1998. 394(6693): p. 595-599.

7. Hilario, E , et al, Crystal structures of Xanthomonas small heat shock protein provide a structural basis for an active molecular chaperone oligomer J. Mol. Biol., 2011. 408(1): p. 74-86.

8. Stamler, R , et al., Wrapping the alpha-crystallin domain fold in a chaperone assembly J. Mol. Biol., 2005. 353(1): p. 68-79.

9. Bagneris, C, et al., Crystal structures of alpha-crystallin domain dimers of alphaB-crystallm and Hsp20 J. Mol. Biol., 2009. 392(5). p. 1242-1252.

10. Baranova, E V., et al., Three-dimensional structwe of alpha-crystallin domain dimers of human small heat shock proteins HSPB1 and HSPB6 J. Mol. Biol., 2011. 411(1): p. 110122.

11. Jehle, S., et al., alphaB-crystallm a hybrid sohd-state/solution-state NMR investigation reveals structural aspects of the heterogeneous oligomer J. Mol. Biol., 2009. 385(5): p. 1481-1497

12. Laganovvsky, A., et al., Crystal structures of ti uncated alphaA and alphaB crystallins reveal structural mechanisms of polydispersity important for eye lens function Protein Sci., 2010. 19(5): p 1031-1043.

13. Zavialov, A., et al., I he effect of the inter subunit disulfide bond on the structural and functional properties of the small heat shock piotem IIsp25 Int. J. Biol. Macromol., 1998. 22(3-4): p. 163-173.

14. Jehle, S., et al., Solid-state NMR and SAXS studies pi ovule a structural basis for the activation of alphaB-crystallm oligomers Nat. Struct. Mol. Biol., 2010. 17(9): p. 1037-42.

15. Jehle, S., et al., N-termmal domain of alphaB-aystallin provides a conformational switch for multimerization and structural heterogeneity Proc. Natl. Acad. Sci. U S.A., 2011. 108(16): p. 6409-6414.