Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и свойства малого белка теплового шока Hsp22 и его точечного мутанта, экспрессируемого при дистальной моторной нейропатии II типа

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структура и свойства малого белка теплового шока Hsp22 и его точечного мутанта, экспрессируемого при дистальной моторной нейропатии II типа"

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова Биологический факультет

На правах рукописи

Ким Мария Вячеславовна

СТРУКТУРА И СВОЙСТВА МАЛОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА №р22 И ЕГО ТОЧЕЧНОГО МУТАНТА, ЭКСПРЕССИРУЕМОГО ПРИ ДИСТАЛЬНОЙ МОТОРНОЙ НЕЙРОПАТИИ ВТОРОГО ТИПА

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005т.

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель-

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Гусев Н. Б.

доктор биологических наук профессор Левицкий Д. И.

доктор биологических наук профессор Добров Е. Н.

Ведущая организация' Институт экспериментальной

кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса.

Защита диссертации состоится 31 октября в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501 001 71 Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова по адресу 119992, Москва, Воробьевы горы, Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, аудитория ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 28 сентября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Медведева М.В.

ms'H. aw

imobh

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Малые белки теплового шока - обширное и разнородное по структуре и функциям семейство белков-шаперонов. Отличительной особенностью всех малых белков теплового шока является наличие а-кристаллинового домена - высоко консервативной последовательности, состоящей из 80 - 100 аминокислотных остатков [1]. Повышенная экспрессия некоторых малых белков тепловою шока приводит к увеличению устойчивости клеток к тепловому шоку, окислительному стрессу и различным химическим агентам [2]. В условиях in vitro малые белки теплового шока способны связывать частично денатурированные белки и предотвращать их необратимую агрегацию. В дальнейшем эти субстраты могут подвергаться АТФ-зависимому рефолдингу под действием других шаперонов [3] или протеолитической деградации. Помимо этого, малые белки теплового шока могут участвовать в регуляции пролиферации, апоптоза, функционировании цитоскелета и регуляции сократительной активности гладких мышц [1].

Малый белок теплового шока с молекулярной массой 22 кДа (Hsp22, другие обозначения HspB8, Hl 1 киназа) был впервые описан в 2000 году [4]. Накопленные к настоящему времени экспериментальные данные свидетельствуют о том, что Hsp22 может участвовать в регуляции пролиферации [5], ингибировании апоптоза [6] и в регуляции сократительной активности сердца [7]. Высказывается предположение, что столь разнообразное действие Hsp22 обусловлено тем, что этот белок обладает эндогенной протеинкиназной активностью [4], а также имеет в своем составе а-кристаллиновый домен [8] и в силу этого, вероятно, должен обладать шаперонными свойствами и предотвращать агрегацию частично денатурированных белков. К моменту начала наших исследований оба эти предположения не были строго доказаны.

Использование современных методов медицинской генетики позволило выявить в структуре малых белков теплового шока несколько так называемых горячих точек мутаций. Одна из таких горячих точек располагается в а-кристаллиновом домене, при этом мутация консервативного остатка Arg, расположенного в положении

Список сокращений: Hsp22 - малый белок теплового шока с молекулярной массой 22 кДа, К141Е-мутант - Hsp22 с заменой лизина 141 на глугаминовую кислоту, Hsp20-малый белок теплового шока с кажущейся молекулярной массой 20 кДа, Hsp27 -малый белок теплового шока с кажущейся молекулярной массой 27 кДа, SDS -додецилсульфат натрия, АДГ - дрожжевая алкогольдегидрогеназа, ПААГ -полиакриламидный гель, КД - круговой дихроизм, MAP КАР киназа - протеинкиназа, активируемая митоген-активируемой проте!

116 аА-кристаллина и гомологичном ему положении 120 аВ-кристаллина, коррелирует с развитием врожденной катаракты и связанной с десмином миопатии [9], а мутация гомологичного остатка Lys, расположенного в положении 141 Hsp22, коррелирует с развитием дисталъной моторной нейропатии или заболеванием Шарко-Мари-Тута [10]. Молекулярные механизмы, лежащие в основе возникновения этих заболеваний, недостаточно исследованы, однако нельзя исключить вероятности того, что мутации малых белков теплового шока играют важную роль в развитии этих патологий.

Целью данной работы было сравнение физико-химических свойств и шалеронной активности Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутаята. Для достижения этой цели следовало решить следующие задачи:

1. Разработать метод выделения рекомбинантного Hsp22 дикого типа и его точечного мутанта К141Е;

2. Проанализировать тканевое распределение Hsp22;

3. Исследовать структуру и олитомерное состояние рекомбинантного Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта;

4. Проанализировать возможность образования гетероолигомерных комплексов между Hsp22 и другими малыми белками теплового шока;

5 Исследовать протеинкиназную активность Hsp22 и сопоставить шаперонную активность белка дикого типа и его К141Е-мутанта.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Разработана процедура выделения рекомбинантного Hsp22 дикого типа и его К14IE-мутанта, экспрессия которого коррелирует с наследственной дисталъной моторной нейропатией человека.

По данным спектроскопии КД вторичная структура Hsp22 дикого типа и его К141Е-муганта практически не отличаются друг от друга и в основном представлены Р-складками и неупорядоченной структурой. В отличие от других малых белков теплового шока Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутант не образуют крупных олигомеров и существуют в виде димеров в широком диапазоне концентраций. В условиях in vitro изолированный Hsp22 не обладает аутопротеинкиназной активностью и не способен фосфорилировать казеин или гистон.

Hsp22 препятствует агрегации частично денатурированных белков-субстратов, при этом белок дикого типа более эффективно предотвращает агрегацию роданазы и алькогольдегидрогеназы, чем его К141Е-мутанг.

Результаты работы расширяют знания в области строения малых белков теплового шока и могут быть использованы при изучении механизмов развития нейродегенеративных заболеваний.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на 31-ой конференции Европейского общества по исследованию мышц (Люнтерен, 2002), на международной конференции «Biological Motility» (Пущино, 2004) и на 48-ой конференции биофизического общества США (Балтимор, 2004).

Публикации. По материалам исследования опубликовано 9 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 5 таблиц и 26 рисунков Список литературы включает 218 литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы получения белков. Экспрессию Hsp22 проводили в клетках E.coli штамма BL21(DE3) (Novagen). Автор глубоко благодарен к.б.н. А.С. Сейт-Неби за конструирование плазмиды рЕТ23Ь, содержащей полноразмерную копию кДНК Hsp22 человека и его К141Е-мутанта. Для очистки рекомбинантных белков использовали фракционирование сульфатом аммония, гидрофобную хроматографию на колонке Phenyl-Sepharose и гель-фильтрацию на Sephacryl S-100 (Amersham Biosciences). Разработанная методика позволяет получить из 2 л бактериальной суспензии 10 - 20 мг белка, гомогенного по данным SDS-электрофореза в ПААГ.

Рекомбинантный Hsp27 человека и его точечный мутант с заменами Serl5, 77 и 82 на остатки аспарагиновой кислоты (ЗП-мутант, имитирующий фосфорилирование Hsp27 под действием МАРКАР киназы) выделяли по ранее описанной методике [11]. Рекомбинантный Hsp20 человека и его мутант с заменой Serl6 на аспарагиновую кислоту (S16D-MyraHT, имитирующий фосфорилирование под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ), был любезно предоставлен м.н.с. кафедры биохимии О.В. Букач.

Определение содержания Hsp22 в тканях человека. Кусочки тканей человека замораживали в жидком азоте и растирали пестиком до порошкообразного состояния. Навеску растертой ткани (около 100 мг) экстрагировали однократным буфером для

образцов [12]. Полученные образцы подвергали SDS-электрофорезу в 12,5% ПААГ с последующим иммуноблоттингом. Автор глубоко благодарен д.б.н. А.Г Катрухе за любезно предоставленные монокпональные антитела на Hsp22.

Регистрация спектров кругового дихроизма Спектры КД в дальней (200 -240 нм) и ближней (240 - 340 нм) ультрафиолетовых областях регистрировали на дихрографе Mark V Jobin Yvon в кюветах с длиной оптического пути, равной 0,05 см или 1 см при комнатной температуре. Спектр снимали 3-5 раз и полученные данные усредняли. Автор глубоко благодарен к.физ-мат.н. A.M. Арутюняну за помощь в проведении опытов по спектроскопии КД.

Определение олигомерного состояния проводили методами гель-фильтрации, нативного электрофореза, химической модификации и неравновесного аналитического ультрацентрифугирования. Для проведения гель-фильтрации на колонку Superdex 75 наносили образцы Hsp22 или его К141Е-мутанта в концентрации от 1 до 4 мг/мл Нативный электрофорез проводили в градиентном (5-15%) ПААГ в присутствии 0,02% Кумасси G-250. Химическое «сшивание» диметилсуберимидатом проводили в пробах с концентрацией белка 0,5 - 2 мг/мл, и белковый состав исследовали с помощью SDS-электрофореза в ПААГ. Неравновесное аналитическое ультрацентрифугирование проводили на центрифуге «Весктап» (модель Е). Эксперимент проводили при 20°С, при скорости вращения ротора 56000 об/мин в течение 5-6 часов, при этом каждые 4 минуты регистрировали распределение белка в ячейке, измеряя оптическую плотность при 280 нм. Коэффициент седиментации рассчитывали с помощью программы SEDFIT

[13]. Автор глубоко благодарен к.б.н. Н.А.Чеботаревой за помощь в проведении экспериментов по ультрацентрифугированию.

Определение протеинкиназной активности Hsp22 дикого типа. Аутофосфорилирование Hsp22 дикого типа проводили в присутствии у-32Р АТФ (3000 Ci/ммоль). После инкубации при 37°С в течение различных интервалов времени отбирали пробы и определяли степень фосфорилирования по методу Райманна и соавт

[14]. Параллельные пробы подвергали SDS-электрофорезу в ПААГ [12], и после высушивания гелей проводили авторадиографию. Протеинкиназную активность Hsp22 определяли по его способности переносить радиоактивный фосфат у-мР АТФ на модельные белковые субстраты, гистон IIIS (Sigma) и а-казеин (Sigma). В качестве положительного контроля в параллельных пробах исследовали фосфорилирование гистона под действием каталитической субъединицы цАМФ-зависимой протеинкиназы или фосфорилирование казеина под действием казеинкиназы 2 типа.

Взаимодействие между Hsp22 и Hsp27 изучали методами гель-фильтрации при рН 7,0. На колонку Superdex 200 наносили изолированный Hsp22 (или его К14IE-мутант), Hsp27 дикого типа (или его ЗО-мутант), либо эквимолярную смесь исследуемых белков, проинкубированную в течение 12 часов при 37°С Аналогичным образом исследовали взаимодействие Hsp22 (и его К141Е-мутанта) с Hsp20 (и его S16Т5-мутаятом), при этом гель-фильтрацию проводили на колонке Superdex 75.

Определение шаперонной активности. О шалеронной активности Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта судили по их способности предотвращать агрегацию инсулина, вызванную восстановлением дисульфидных связей, или по способности исследуемых белков предотвращать термоагрегацию алкогольдегидрогеназы и роданазы За кинетикой агрегации следили, регистрируя оптическую плотность при 360 нм на спектрофотометре Ultrospec 3100 Pro (Amersham Biosciences)

Определение концентрации белка проводили спектрофотометрически, по методу Брэдфорд, или по методу Шаффнера и соавт. [15].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Тканевое распределение Hsp22. К началу наших исследований экспрессию Hsp22 в различных органах и тканях изучали юлько путем нозерн-блот гибридизации [8, 16, 17]. Данные о тканевом распределении мРНК Hsp22, опубликованные различными авторами, не всегда совпадали. В связи с этим нам представлялось целесообразным исследовать тканевое распределение Hsp22 с использованием иммунологических методов. Количество Hsp22, экстрагируемого из тканей, было очень

невысоким, и для иммунологической детекции приходилось использовать метод усиленной

хемилюминесценции. Этот метод обладает очень высокой чувствительностью, однако не может быть использован для строгого количественного определения исследуемого

Рис. 1. Вестерн-блот экстрактов тканей человека

На дорожки наносили одинаковое количество белка.

белка. Как видно из рис. 1, наибольшее количество Hsp22 было обнаружено в сердечной и скелетной мускулатуре, заметно меньшие количества в матке и мозге, в то время как в других органах человека содержание Hsp22 было крайне мало и его не удавалось детектировать. Таким образом, тканевое распределение Hsp22 сходно с тканевым распределением других малых белков теплового шока (аВ-кристаллина, Hsp27, Hsp20).

Структура Hsp22 и его К141Е-мутанта. В далекой ультрафиолетовой области спектры КД Hsp22 и его К141Е-мутанта практически не отличаются друг от друга и характеризуются широким максимумом при 205-208 им (рис. 2 А). В спектрах КД Hsp22 отсутствуют большие по амплитуде отрицательные максимумы при 208 и 222 нм, характерные для а-спиралей, а также положительный максимум при 200 нм и выраженный отрицательный максимум при 215 нм, характерные для модельных пептидов, обладающих Р-структурой, Форма спектров КД Hsp22 и его К141Е-мутанта свидетельствует в пользу того, что в составе этих белков практически отсутствуют а-спиральные участки, а преобладающими элементами являются неупорядоченная структура и, вероятно, Р-складки. В связи с тем, что как Р-складки, так и

неупорядоченные структуры не имеют четко выраженных, значительных по амплитуде максимумов или минимумов в далекой УФ области спектра (200220 нм), точное определение вторичной структуры Hsp22 крайне затруднено. Обсчет спектров КД Hsp22 в далекой ультрафиолетовой области с использованием программ CLUSTER и CONHNLL

(http://lamar.colostate.edu/~sr eeram/CDPro/1 позволяет оценить долю ¡3-складчатой

б

длина волны, нм

Рис. 2. Спектры кругового дихроизма Нзр22 (сплошные кривые) и его К141Е-мутанта (пунктирные кривые) в дальней (А) и ближней (Б) ультрафиолетовой области.

структуры в 35 - 50%, а долю неупорядоченной структуры в 28 - 40%. Эти ориентировочные значения согласуются с данными по предсказанию вторичной структуры Hsp22, выполненному с использованием программы Jpred, а также с данными рентгенострукгурного анализа двух малых белков теплового шока, Hspl6,5 из Methanococcus jannaschii [18] и Hspl6,9 из пшеницы [19].

Спектры КД Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта в длинноволновой области спектра абсолютно идентичны как по форме, так и по амплитуде (рис. 2 Б). Это говорит о том, что мутация, скорее всего, не влияет на окружение ароматических аминокислотных остатков. Таким образом, можно заключить, что замена Lysl41 на Glu не приводит к драматическим изменениям ни вторичной, ни третичной структуры Hsp22.

Для анализа четвертичной структуры исследуемых белков были использованы методы гель-фильтрации, нативного электрофореза, химической «сшивки» и ультрацентрифугирования. При гель-фильтрации на колонке Superdex 75 Hsp22 и его К141Е-мутант элюируются в виде пика с кажущейся молекулярной массой 32 кДа (рис. 3). Увеличение концентрации или количества наносимого на колонку белка сопровождается только очень незначительным изменением объема элюции.

158 68 43 25kDe

_t_i_I_l

94

43 - î ■гТ7.

„-, Ч К*

30- ' ;

20-U-

0 1

2 С

0-123

Объем элюц ии

Рис. 3. Определение олигомерного состояния Нар22 методом гель-фильтрации на вирегйех 75. На колонку наносили 200 (кривые 1,2) или 600 мкг (кривые 3,4) Нвр22 (сплошные кривые) или его К141Е-мутанта (пунктирные кривые). Для наглядности кривые 3 и 4 смещены по оси ординат на 10 шАи.

Рис. 4. Химическая «сшивка» Шр22 диметилсуберимидатом.

Нвр22 дикого типа (левая панель) или его К141Е-мутант (правая панель) инкубировали в отсутствие (0) или в присутствии (1,2,3) диметилсуберимидата (20 мМ) при концентрации белка 0,5 (1), 1,0 (2) или 2,0 (3) мг/мл. На дорожки наносили одинаковое количество белка.

Представленные данные означают, что в отличие от большинства малых белков теплового шока (таких как Нвр27 или аВ-кристаллин), Нзр22 образует только малые олигомеры, и изменение концентрации белка в исследованном диапазоне не влияет на равновесие между мономерами и олигомерами Шр22 (или его К141Е-мутанта).

Для более детального исследования олигомерного состояния Шр22 и его К141Е-мутанта мы использовали метод нативного градиентного электрофореза в полиакриламидном геле. Оказалось, что в выбранных условиях Нзр22 и его К141Е-мутант мигрируют в виде одной полосы с кажущейся молекулярной массой 33-38 кДа, т.е. с молекулярной массой, сопоставимой с таковой, определенной методом гель-фильтрации. Кажущаяся молекулярная масса 32-38 кДа больше расчетной молекулярной массы мономера (21,6 кДа) и меньше расчетной молекулярной массы димера (43 кДа) Нэр22. Поэтому полученные результаты могут означать, что при гель-фильтрации и электрофорезе №р22 мигрирует либо в виде очень асимметричного мономера, либо в виде компактного димера. Для более подробной характеристики олигомерного состояния Нвр22 мы использовали методы химического «сшивания» и ультрацентрифугирования.

При ЗОв-электрофорезе как Нзр22 дикого типа, так и его К141Е-мутант мигрируют в виде полосы с кажущейся молекулярной массой 25 кДа, что согласуется с данными литературы [8] (рис. 4, дорожка 0). Химическое «сшивание» Нзр22 и его мутанта диметилсуберимидатом сопровождается появлением серии белковых полос с кажущимися молекулярными массами 47-50 кДа, которые, по всей видимости, соответствуют «сшитым» димерам Нзр22. Не слишком высокий выход «сшитых» димеров может быть обусловлен тем, что остатки лизина соседних мономеров Нэр22 могут находиться на неоптимальном для «сшивания» диметилсуберимидатом расстоянии или с тем, что диметилсуберимидат преимущественно образует внутри-, а не межмолекулярные «сшивки». Следует отметить, что изменение концентрации белка в интервале 0,5-2,0 мг/мл не сопровождалось существенным увеличением доли «сшитого» белка (рис. 4, дорожки 1 - 3). Это может свидетельствовать о том, что константа диссоциации димера лежит вне пределов исследуемых концентраций белка.

Нвр22 имеет в своем составе 3 остатка цистеина [8]. В отсутствие восстановителей становится возможным окисление свободных вН-групп, что сопровождается образованием «сшитых» дисульфидными связями олигомеров Нзр22 с кажущимися молекулярными массами 43-50, 70-90 и более 120 кДа. «Сшитые» дисульфидными связями димеры №р22 очень устойчивы и их восстановление с

образованием мономеров Hsp22 становится возможным только в присутствии высоких концентраций меркаптоэтанола или дитиотрейтола (рис. 5) Таким образом, данные по химическому «сшиванию» свидетельствуют о том, что в растворе возможно образование малых олигомеров Hsp22 (и его К141Е-мутанта), состоящих из 2 - 4 мономеров белка.

Одним из наиболее информативных методов, дающих сведения не только о молекулярной массе, но и о форме частицы, является метод аналитического ультрацентрифугирования Оказалось, что при фиксированной концентрации белка (0,8 мг/мл) большая часть Hsp22 и его К141Е-мутанта осаждаются в виде острого пика с коэффициентом седиментации 1,9-2,1 S (данные не представлены). При таком коэффициенте седиментации сферические частицы имели бы радиус 15 А. В то же время радиус Стокса, определенный методом гель-фильтрации для Hsp22 и его К141Е-мутанта, составляет 26,2 -26,7 Ä. В том случае, если данные, полученные методами ультрацентрифугирования и гель-фильтрации полностью сопоставимы, оказывается, что фрикционное отношение, равное частному от деления радиуса Стокса на радиус, определенный методом седиментации, оказывается равным 1,75. При таком фрикционном отношении Hsp22 и его К141Е-мутант должны быть представлены в виде эллипсоидов вращения с соотношением осей более чем 1:10. Столь асимметричная форма не характерна для ранее описанных малых белков теплового шока. Представленные данные означают, что либо Hsp22 имеет крайне асимметричную форму (что кажется нам мало вероятным), либо что данные, полученные методами гель-фильтрации и ультрацентрифугирования, несопоставимы между собой. Это возможно в том случае, если олигомерное состояние Hsp22 зависит от используемого

94 f^QPI^^S'»' ■ iSj-Tt

40- щ^тт^-зт::

30—' 25 —в»*

22 -«-'

0 0.5 1 2 345 10 20300 0.5 1 2 345 Ю 20 30

Рис. 5. Восстановление дисульфидных мостиков Hsp22 под действием ß-меркаптоэтанола (левая панель) или дитиотреитола (правая панель).

Концентрация восстановителей в мМ указана под гелем, положение белков-маркеров молекулярных масс указано слева от электрофоре! рам м.

метода. Опубликованные в последние года данные свидетельствуют о том, что при увеличении скорости ультрацентрифугирования кажущаяся молекулярная масса олигомеров Шр27 заметно уменьшается [20]. Кроме того, значительное повышение давления приводит к диссоциации олигомеров а-кристаллина [21] и малого белка теплового шока с кажущейся молекулярной массой 16,5 кДа (№р16,5) [22]. Эти данные означают, что в ходе ультрацентрифугирования становится возможной диссоциация олигомеров некоторых малых белков теплового шока. Если это заключение верно, то можно предположить, что в ходе ультрацентрифугирования димеры Н$р22 или его К141Е-мутанта диссоциируют до мономеров. В этом случае при гель-фильтрации, нативном электрофорезе и химическом «сшивании» Нзр22 и его К141Е-мутант будут представлены в основном в виде димеров (с кажущейся молекулярной массой 32-38 кДа и радиусом Стокса 26,2-26,7 А), а при ультрацентрифугировании - в виде мономеров с кажущейся молекулярной массой 19-23 кДа и радиусом Стокса около 15 А. Следует заметить, что недавно опубликованные данные Чоудари и соавт. [23] свидетельствуют о том, что при ультрацентрифугировании в градиенте плотности глицерина Н$р22 мигрирует в виде пика с кажущейся молекулярной массой 21,1 кДа. По-видимому, потребуются дополнительные исследования, направленные на исследование механизма диссоциации олигомеров малых белков теплового шока, происходящей при ультрацентрифугировании.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что в зависимости от условий Нвр22 может существовать в виде димеров или мономеров, при этом точечная мутация К141Е не оказывает существенного влияния на вторичную, третичную или четвертичную структуру этого белка.

Исследование протеинкиназной активное™ Шр22. Исходно №р22 был описан как белок, гомологичный протеиикиназному домену вирусной рибонуклеотвдредуктазы [4]. Считалось, что №р22 обладает аутопротеинкиназной активностью и способен фосфорилировать основной белок миелина. Во всех работах по изучению протеинкиназной активности Нвр22 [4, 5, 16] использовался не изолированный белок, а либо иммунопреципитат, полученный путем сорбции Н«р22 на иммобилизованных антителах, либо химерный Нзр22, содержащий в своей структуре последовательность глутион-8-трансферазы и сорбированный на глутатион-агарозе. Возникал вопрос, будет или изолированный ^модифицированный рекомбинантный белок обладать протеинкиназной активностью, или приписываемая №р22

протеинкиназная активность обусловлена примесью экзогенных протеинкиназ, сорбированных на иммобилизованном белке.

Как видно из рис. 6 А, длительная инкубация Hsp22 с АТР с очень высокой удельной радиоактивностью сопровождается включением незначительного количества радиоактивного фосфата в белок. Аналогичная зависимость наблюдалась и в случае а-кристаллина, однако при этом включение радиоактивности в белок было еще менее выраженным (данные не представлены). Количественная оценка степени фос формирования показала, что в данных условиях на моль Hsp22 включается не более 5*10"5 моля радиоактивного фосфата. Попытки повысить степень фосфорилирования путем изменения состава среды инкубации или добавления детергентов не привели к желаемым результатам. В связи с этим приходится заключить, что в условиях in vitro изолированный Hsp22 (как и а-кристаллин) обладают исчезающе малой протеинкиназной активностью. Полученные результаты не означали, что Hsp22 яе будет способен фосфорилировать экзогенные белки-субстраты. В отдельных экспериментах мы сравнили протеинкиназную активность Hsp22 с

А

О 1 2<ис»

элеюпроферм ' '.' Ч*!*' --

-Иг

Рис. 6. Изучение протеинкиназной активности №р22. А

самофосфорилирование Нвр22. Б -сравнение протеинкиназной

активности №р22 (кривая 1) с протеинкиназной активностью

казеинкиназы второго типа (кривая 2 на рис. а) и протеинкиназной активностью каталитической

субъединицы цАМФ-зависимой протеинкиназы (кривая 2 на рис. б). В качестве субстратов казеинкиназы и цАМФ-зависимой протеинкиназы использовали а-казеин и гистон, соответственно.

Б

активностью казеинкиназы второго типа и каталитической субъединицы цАМФ-зависимой протеинкиназы, используя казеин и гистон в качестве потенциальных белков-субстратов. Как видно из рис. б Б, обе протеинкиназы эффективно фосфорилировали соответствующие субстраты, в то время как изолированный Hsp22 не был способен фосфорилировать ни казеин, ни гистон.

Представленные данные означают, что в условиях In vitro изолированный немодифицированный Hsp22 обладает исчезающе малой эндогенной протеинкиназной активностью и не способен фосфорилировать гистон или казеин. Строго говоря, это не означает, что Hsp22 не окажется способным фосфорилировать какие-то иные белковые субстраты. Однако такое предположение представляется маловероятным и поэтому приходится заключить, что изолированный Hsp22 не обладает протеинкиназной активностью. Приписываемая Hsp22 в ранних работах протеинкиназная активность, по всей видимости, обусловлена загрязнением препаратов Hsp22 примесными протеинкиназами.

Взаимодействие Hsp22 с другими малыми белками теплового шока.

Согласно многочисленным данным литературы, многие малые белки теплового шока способны образовывать гетероолигомерные комплексы. Например, образование таких гетероолигомерных комплексов было описано для аВ-кристаллина и Hsp20 [24], аВ-кристаллина и Hsp27 [25, 26], а также для Hsp27 и Hsp20 [27]. В работах Сан и соавт. [28] было проведено предварительное исследование взаимодействия Hsp22 с другими малыми белками теплового шока и было высказано предположение, что Hsp22 способен взаимодействовать с Hsp27 и его ЗО-мутантом. Однако в этих работах использовались достаточно сложные методы (такие как метод дрожжевого двугибридного скрещивания и флуоресцентной миграции энергии между гибридными белками, полученными путем слияния малых белков теплового шока с разноцветными флуоресцирующими белками). В связи с тем, что однозначная интерпретация этих экспериментальных данных довольно затруднительна, нам представлялось целесообразным исследовать образование гетероолигомерных комплексов между изолированным рекомбинантным Hsp22 (и его К141Е-мутантом) и Hsp27 (и его 3D-мутантом) с помощью более простых подходов. В качестве такого экспериментального подхода мы выбрали метод гель-фильтрации.

При гель-фильтрации на Superdex 200 изолированный Hsp22 (или его К14IE-мутант) элюируются в виде симметричных пиков с кажущимися молекулярными

массами 36-39 кДа (кривая 1 на рис.7). Изолированный Нвр27 в этих условиях элюируется в виде пика с кажущейся молекулярной массой 560 кДа (данные не представлены), а ЗО-мутант Нвр27, имитирующий фосфорилирование этого белка под действием МАРКАР киназы, элюируется как белок с кажущейся молекулярной массой 100-120 кДа (рис. 7, кривая 2). В том случае, если на колонку наносили эквимолярную смесь Нвр22 (или его К141-мутанта) и Нзр27 (или его ЗБ-мутанта), предварительно проинкубированную в течение 12 часов при 37° С, то на профиле элюции удавалось выявить два отдельных пика, положение и амплитуда которых не отличались от положения и амплитуды пиков изолированных малых белков теплового шока (пример такого хроматографического разделения смеси №р22 и ЗО-мутанта Нэр27 показан кривой 3 на рис. 7). Метод гель-фильтрации был также использован для изучения взаимодействия Нвр22 (и его К141Е-мутанта) с №р20 (и его 8160-мутантом, имитирующим фосфорилирование Нвр20 под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы) Однако и в этом случае на профиле элюции смеси любых двух исследуемых белков удавалось выявить только пики, соответствующие изолированным

малым белкам теплового шока и не удавалось обнаружить появления нового пика, содержащего гетероолигомерные комплексы двух белков теплового шока (данные не представлены). Таким образом, используя метод гель-фильтрации, ни в одном из экспериментов нам не удалось обнаружить образования стабильных гетероолигомерных комплексов между №р22 (или его К141Е-мутантом) и другими малыми белками теплового шока. В этом отношении полученные нами результаты противоречат данным Сан и соавт. [28]. Это противоречие може! быть следствием нескольких причин. Во-первых, комплексы

Рис. 7. Исследование взаимодействия Hsp22 с ЗБ-мутаитом Hsp27 методом гель-фильтрации на колонке Superdex 200. Представлены профили элюции изолированного Hsp22 (кривая 1), изолированного зЬ-мутанта Hsp27 (кривая 2) или эквимолярной смеси Hsp22 и 3D-MyraHTa Hsp27, предварительно проинкубированой 12 часов при 37°С (кривая 3, для наглядности смещена по оси ординат на 10 mAu).

Нвр22 с другими малыми белками теплового шока могут быть неустойчивыми, и вследствие этого такие комплексы удается зарегистрировать с помощью метода флуоресцентного переноса энергии (или дрожжевого двугибрвдного скрещивания) и не удается выявить с помощью метода гель-фильтрации Во-вторых, опыты Сан и соавт. [28] проводились с использованием модифицированных малых белков теплового шока, и именно поэтому трудно полностью исключить возможность различных артефактов, в том числе и ложноположительных результатов. Следует заметить, что наши результаты согласуются с недавно опубликованными данными Чавез Зобель и соавт. [29], обнаруживших, что №р22 препятствует образованию агрегатов мутантного (Я12(Ю) аВ-кристаллина, не образуя при этом прочных комплексов с этим белком. Полученные нами отрицательные результаты не означают, что №р22 вообще не способен взаимодействовать с другими малыми белками теплового шока. Вероятно, в будущем имеет смысл провести подробное исследование такого рода взаимодействия с использованием иных методов или в иных условиях.

Сравнение шаперонной активности Шр22 дикого типа и его К141Е-мутанта. Предотвращение агрегации частично денатурированных белков является одной из основных функций малых белков теплового шока, и в литературе есть много данных о шаперонной активности Н8р27, аА- и аВ-кристаллина [1, 3, 11]. Более того, установлено, что точечные мутации малых белков теплового шока, сопровождающиеся изменением их шаперонной активности, зачастую коррелируют с развитием различных врожденных заболеваний, таких, как катаракта, связанная с десмином миопатия, дистальная моторная нейропатия или болезнь Шарко-Мари-Тута. При этом точечные мутации аА- и аВ-кристаллина в положениях, гомологичных остатку Ьуз141 №р22, коррелируют с возникновением наследственной катаракты и миопатии, связанной с десмином [9]. К началу наших исследований в литературе не было данных о шаперонной активности Шр22 и не было никаких сведений о влиянии мутации К141Е на шаперонную активность этого белка. В этой связи представлялось целесообразным сравнить шаперонную активность Шр22 и его К141Е-мутанта, используя в качестве субстратов несколько разных белков.

Восстановление дисульфидных связей в молекуле инсулина приводит к диссоциации А и В цепей и к агрегации В-цепи, сопровождающейся увеличением светорассеяния, которое наступает после 5-минутного лаг-периода (рис. 8 А, Б). Добавление возрастающих количеств Нзр22 дикого типа удлиняет лаг-период, снижает

скорость агрегации и амплитуду светорассеяния (рис. 8 А). Аналогичная зависимость наблюдается и при добавлении увеличивающихся количеств К141Е-мутанта Нвр22 (рис. 8 Б). №р22 и его К141Е-мутант были одинаково эффективны в предотвращении агрегации инсулина и полное ингибирование агрегации наблюдалось при одинаковых концентрациях белка дикого типа и его К141Е-мутанта. Ранее в нашей лаборатории было установлено, что шаперонная активность малых белков теплового шока может различаться в зависимости от субстрата [11]. Учитывая это обстоятельство, мы сравнили шаперонную активность №р22 и его К141Е-мутанта, используя другие модельные белки-субстраты.

Нагревание раствора дрожжевой алкогольдегидрогеназы (АДГ) до 43°С сопровождается быстрой термоденатурацией и агрегацией фермента, что приводит к значительному увеличению светорассеяния (рис. 9 кривые 1). Спустя 30-40 минут

агрегаты АДГ становятся очень крупными и выпадают в осадок, вследствие чего происходит заметное уменьшение светорассеяния (рис. 9, кривые 1). Изолированный №р22 или его К141Е-мутант достаточно термоустойчивы и не агрегируют в выбранных экспериментальных

условиях (данные не представлены). При добавлении к раствору АДГ небольших количеств Нзр22 или его К141Е-мутанта (весовое отношение АДГ:Н$р22, равное 5:1) малые белки теплового шока незначительно уменьшают амплитуду светорассеяния и практически полностью

предотвращают формирование

крупных агрегатов АДГ на поздних стадиях инкубации (рис. 9 А). В этих условиях не наблюдалось различий в эффективности белка дикого типа и его

оремя, минуты

Рис. 8. Влияние №р22 (А) н его К141Е-мутанта (Б) на агрегацию инсулина (0,2 мг/мл). Агрегация изолированного инсулина (кривая 1) или инсулина в присутствии Нвр22 или его К141Е-мутанта в концентрации, равной 0,02; 0,04; 0,1; 0,2; 0,4 мг/мл (кривые 2-6, соответственно).

К141Е-мутанта. Добавление к АДГ больших количеств НБр22 или его К141Е-мутанта (весовое отношение АДГ : №р22, равное 2:1 или 1:1) сопровождается уменьшением амплитуды светорассеяния, при этом белок дикого типа более эффективен, чем его К141Е-мутант в предотвращении агрегации АДГ (рис. 9 Б, В). Наконец, в присутствии избытка №р22 (весовое отношение АДГ : Нвр22, равное 1:2) как белок дикого типа, так и его К141Е-мутант полностью предотвращают агрегацию алкогольдегидрогеназы (рис. 9 Г)- Таким образом, оказалось, что при использовании алкогольдегидрогеназы в качестве модельного белка-субстрата при промежуточных концентрациях шаперона Н8р22 дикого типа более эффективен, чем его К141Е-мутант в предотвращении термоагрегации исследуемого фермента.

Различие в шаперонной активности между №р22 дикого типа и его К141Е-мутантом было еще более выраженным при использовании в качестве субстрата роданазы. При 43° С изолированная роданаза быстро денатурирует и агрегирует, что сопровождается довольно значительным увеличением светорассеяния (рис. 10, кривые 1). Добавление Нвр22 или его К141Е-мутанта сопровождается уменьшением амплитуды и скорости увеличения светорассеяния, при этом практически при всех весовых соотношениях роданаза : Нэр22 белок дикого типа (рис. 10, кривые 2) более эффективен, чем его К141Е-мутант (рис. 10, кривые 3) в предотвращении агрегации роданазы.

А 1

В Г

20 40 60 80

Рис. 9. Влияние Шр22 и его К141Е-мутанта на термоагрегацию дрожжевой алкогольдегидрогены (АДГ). Агрегацию

изолированной АДГ (0,15 мг/мл) (кривая 1) или АДГ в присутствии №р22 (кривая 2) или его К141Е-мутанта (кривая 3) регистрировали при концентрации малых белков теплового шока, равной 0,03 (А), 0,075 (Б), 0,15 (В) или 0,3 (Г) мг/мл.

20 40 60 80 100

время, минуты

В нашей работе впервые установлено, что in vitro Hsp22 способен предотвращать агрегацию частично денатурированных белков. Несколько позднее этот факт был подтвержден в работе Чоудари и соавт. [23]. При использовании инсулина в качестве модельного белка-субстрата шаперонные активности Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта мало отличаются друг от друга (рис. 8). В то же время, при использовании алкогольдегидрогеназы (рис. 9) и особенно роданазы (рис. 10) шаперонная активность Hsp22 заметно выше шаперонной активности К141Е-мутанта. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что развитие катаракты, миопатий и некоторых форм нейродегенеративных заболеваний связано с накоплением в клетках агрегатов частично денатурированных белков. Это может быть обусловлено точечными мутациями малых белков теплового шока, приводящими к дестабилизации их структуры и уменьшению их шаперонной активности. Например, экспрессия К14IE-мутанта Hsp22 в культуре фибробластов сопровождается накоплением белковых агрегатов, в состав которых входит мутантный белок [10]. Кроме того, оказалось, что К141Е-мутант Hsp22 менее эффективен, чем белок дикого типа в предотвращении агрегации обогащенного остатками глутамина фрагмента хантигтина в клетках CCL39 или НЕК293 [30]. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что мутация К141Е не влияет на вторичную, третичную или четвертичную структуру Hsp22, однако уменьшает шаперонную активность с некоторыми модельными белками-субстратами. Данные литературы и наши экспериментальные результаты позволяют предположить,

о*

концентрации малых бежов теплового шока равной 0,02 (А), 0,04 (Б), 0,1 (В) или ОД

регистрировали

агрегацию роданазы,

вызванную повышением температуры. Агрегацию изолированной роданазы (ОД мг/мл) (кривые 1) или роданазы в присутствии №р22 (кривые 2) или его К141Е-мутанта (кривые 3)

агрегацию

вызванную

температуры.

Рис. 10. Влияние Hsp22 и его

К141Е-мутанта

при

на

0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100 (Г) мг/мл.

время, минуты

что снижение шаперониой активности Hsp22, вызванное мутацией К141Е, может явиться одной из причин развития некоторых нейродегенеративных заболеваний человека.

ВЫВОДЫ

1 Исследовано тканевое распределение Hsp22 и установлено, что наиболее высокое содержание Hsp22 характерно для сердечной и скелетной мускулатуры.

2. В отличие от большинства малых белков теплового шока Hsp22 не образует крупных олигомеров и представлен в виде мономеров и/или димеров. Точечная мутация К141Е, характерная для Hsp22, экспрессируемого при некоторых видах нейродегенеративных заболеваний, не влияет на вторичную, третичную или четвертичную структуры Hsp22.

3. В условиях in vitro изолированный рекомбинантный Hsp22 не обладает протеинкиназной активностью.

4. При нейтральных значениях pH Hsp22 не способен образовывать прочных гетероолигомерных комплексов с двумя другими малыми белками теплового шока (Hsp20 или Hsp27).

5. Hsp22 обладает шаперонной активностью и предотвращает агрегацию различных денатурированных белков-субстратов. Мутация К141Е приводит к уменьшению шаперонной активности Hsp22 с некоторыми белками-субстратами

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. О.В. Букач, A.C. Сейт-Неби, О.О. Панасенко, М.В. Ким, Н.Б. Гусев. Выделение » тканевого и рекомбинантного малого белка теплового шока с молекулярной массой

25 кД (hsp25) из гладких мышц птиц. (2002) Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 1, стр. 50 - 57.

2. О.О. Панасенко, М.В. Ким, О.В. Букач, А. Сейт-Неби, Н.Б. Гусев. Структура и свойства малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа. Ш Съезд биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002, (Тезисы научных докладов, стр. 99, Санкт-Петербург).

3. О.О. Panaseoko, M.V. Kim, O.V. Bukach, O.S. Seit-Nebi, S.B. Marston, N.B. Gusev. Effect of heat shock protein with molecular weight 25 kDa (hsp25) on polymerization and aggregation of actin. 31я Annual Meeting of the European Society for Muscle Research,

Lunteren, The Netherlands, 2002. Journal of Muscle Research and Cell Motility, 2002, 23, p. 40

4. O.O. Панасенко, M.B. Ким, Н.Б. Гусев. Структура и свойства малых бежов теплового шока. (2003), Успехи биологической химии, стр. 57 - 98.

5. O.O. Panasenko, M.V. Kim, S. В. Marston, N.B. Gusev. Interaction of the small heat shock protein with molecular mass 25 kDa (hsp25) with actin. (2003) Eur. J. Biochem., 270, 892-901.

6. M, V. Kim, O.V. Bukach, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev. Some properties of human small heat shock proteins with molecular masses 22 (hsp22) and 20 kDa (hsp20). 48th Annual Meeting of Biophysical Society, Baltimore, Maryland, 2004, p.40

7. M.V.Kim, N.B.Gusev. Investigation of structure and properties of small heat shock protein with apparent molecular mass 22 kDa (HSP22) abundant in muscle tissues. International Symposium "Biological motility" Pushchino, 2004, p.84-85.

8. M.V.Kim, A.S. Seit-Nebi, S.B. Maiston, N.B. Gusev. Some properties of human small heat shock protein Hsp22 (Hll or HspB8) (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 315, 796-801.

9. M.V. Kim, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev. The problem of protein kinase activity of small heat shock protein Hsp22 (Hll or hspB8). (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 325,649-652.

Данное исследование проводилось при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Wellcome Trust (Великобритания).

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

[1] Т.Н. MacRae, Cell Mol Life Sei 57 (2000) 899-913.

[2] S.A. Loktionova, O.P. Ilyinskaya, V.L. Gabai and A.E. Kabakov, FEBS Lett 392 (1996) 100-4.

[3] M. Ehrnsperger, S. Graber, M. Gaestel and J. Buchner, Embo J 16 (1997) 221-9.

[4] C.C. Smith, Y.X. Yu, M. Kulka and L. Aurelian, J Biol Chem 275 (2000) 25690-9.

[5] A.H. Charpentier, A.K. Bednarek, R.L. Daniel, K.A. Hawkins, K.J. Laflin, S. Gaddis, M.C. MacLeod and C.M. Aldaz, Cancer Res 60 (2000) 5977-83.

[6] C. Depre, S.J. Kim, A.S. John, Y. Huang, O.E. Rimoldi, J.R. Pepper, G.D. Dreyfiis, V. Gaussin, DJ. Pennell, D.E. Vatner, P.G. Camici and S.F. Vatner, Circ Res 95 (2004) 433-40.

[7] M. Hase, C. Depre, S.F. Vatner and J. Sadoshima, Biochem J 388 (2005) 475-83.

[8] R. Benndorf, X. Sun, R.R. Gihnont, K.J. Biederman, M.P. Molloy, C.W. Goodmurphy, H. Cheng, P.C. Andrews and M.J. Welsh, J Biol Chem 276 (2001) 26753-61.

[9] Y. Sun and Т.Н. MacRae, Febs J 272 (2005) 2613-27.

[10] J. Irobi, K. Van Impe, P. Seeman, A. Jordanova, I. Dierick, N. Veipoorten, A. Michalik, E. De Vriendt, A. Jacobs, V. Van Gerwen, K. Vennekens, R. Mazanec, I. Tournev, D. Hilton-Jones, K. Talbot, I. Kremensky, L. Van Den Bosch, W. Robberecht, J. Van Vandekerckhove, C. Broeckhoven, J. Gettemans, P. De Jonghe and V. Timmerman, Nat Genet 36 (2004) 597-601.

[11] O.O. Panasenko, A. Seit Nebi, O.V. Bukach, S.B. Marston and N.B. Gusev, Biochim Bicphys Acta 1601 (2002) 64-74.

[12] UX LaemmU, Nature 227 (1970) 680-5.

[13] J. Lebowitz, M.S. Lewis and P. Schuck, Protein Sei 11 (2002) 2067-79.

[14] E.M. Reimann, D.A. Walsh and E.G. Krebs, J Biol Chem 246 (1971) 1986-95.

[15] W. Schaffner and C. Weissmann, Anal Biochem 56 (1973) 502-14.

[16] C. Depre, M. Hase, V. Gaussin, A. Zajac, L. Wang, L. Hittinger, B. Ghaleh, X. Yu, R.K. Kndej, T. Wagner, J. Sadoshima and S.F. Vatner, Circ Res 91 (2002) 1007-14.

[17] B.M. Bany and G.A. Schultz, Biol Reprod 64 (2001) 284-92.

[18] K.K. Kim, R. Kim and S.H. Kim, Nature 394 (1998) 595-9.

[19] R.L. van Montfort, E. Basha, KL. Friedrich, C. Slingsby and E. Vieritag, Nat Struct Biol 8 (2001) 1025-30.

[20] В. Lelj-Garolla and A.G. Mauk, J Mol Biol 345 (2005) 631 -42.

C. Bode, F.G. Tolgyesi, L. Smeller, K. Heremans, S.V. Avilov and J. Fidy, Biochem J 370 (2003) 859-66.

E. Tolgyesi, C.S. Bode, L Smelleri, D.R. Kim, K.K. Kim, K. Heremans and J. Fidy, Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 50 (2004) 361-9.

T.K. Chowdary, B. Raman, T. Ramakrishna and C.M. Rao, Biochem J 381 (2004) 379-87.

K. Kato, H. Shinohara, S. Goto, Y. Inaguma, R. Morishita and T. Asano, J Biol Chem 267 (1992) 7718-25.

M.P. Bova, H.S. McHaourab, Y. Han and B.K. Fung, J Biol Chem 275 (2000) 103542.

Y. Sugiyama, A. Suzuki, M. Kishikawa, R. Akutsu, T. Hirose, M.M. Waye, S.K. Tsui, S. Yoshida and S. Ohno, J Biol Chem 275 (2000) 1095-104. O.V. Bukach, A.S. Seit-Nebi, S.B. Marston and N.B. Gusev, Eur J Biochem 271 (2004) 291-302.

X. Sun, J.M. Fontaine, J.S. Rest, E.A. Shelden, M.J. Welsh and R. Benndorf, J Biol Chem 279 (2004) 2394-402.

A.T. Chavez Zobel, A. Loranger, N. Marceau, J.R. Theriault, H. Lambert and J. Landry, Hum Mol Genet 12 (2003) 1609-20.

S. Carra, M. Sivilotti, A.T. Chavez Zobel, H. Lambert and J. Landry, Hum Mol Genet 14(2005) 1659-69.

»20142

РПБ Русский фонд

2006-4 18841

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИДМ 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 21.09.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 557. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ким, Мария Вячеславовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика семейства малых белков теплового шока

1.2. Строение малых белков теплового шока

1.3. Функции малых белков теплового шока

1.3.1. Шаперонная активность sHsp

1.3.2. Влияние sHsp на полимеризацию актина и регуляция динамики цитоскелета

1.3.3. Участие si Isp в регуляции апоптоза

1.3.4. Роль si Isp в развитии нейродегенеративных заболеваний и катаракты

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Препаративные методы

2.1.1. Экспрессия и выделение Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта

2.1.2. Выделение актина

2.2. Определение тканевого распределения Hsp

2.3. Методы, использованные для исследования структуры Hsp

2.3.1. Измерение кругового дихроизма

2.3.2. Гель-фильтрация

2.3.3. Нативный электрофорез

2.3.4. Использование методов химической модификации для изучения четвертичной структуры

2.3.4.1 Модификация диметилсуберимидатом (ДМС)

2.3.4.2. Образование дисульфидных связей

2.3.5.11еравновеспое аналитическое ультрацентрифугирование

2.4. Определение протеинкиназной активности

2.5. Методы, использованные при изучении взаимодействия Hsp22 с нативным актином

2.5.1. Метод флуоресцентной спектроскопии

2.5.2 Метод ультрацентрифугирования

2.6. Методы, использованные при изучении взаимодействия Hsp22 с Hsp27 и Hsp

2.6.1. Гель-фильтрация

2.6.2. Светорассеяние

2.7. Определение шаперонной активности

2.7.1. Определение шаперонной активности с инсулином

2.7.2. Определение шаперонной активности с алкогольдегидрогеназой

2.7.3. Определение шаперонной активности с роданазой

2.7.4. Влияние Hsp22 на агрегацию денатурированного актина 52 2.8.11екоторые аналитические методы

2.8.1. Определение концентрации белка

2.8.1.1. Спектрофотометрический метод

2.8.1.2. Метод Брэдфорд

2.8.2. SDS-Электрофорез в ПААГ

2.8.3. Иммуноблотгинг

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка метода выделения рекомбинантного Hsp человека из E.Coli

3.2. Тканевое распределение Hsp

3.3. Структура и некоторые физико-химические свойства Hsp

3.3.1 &мричная и третичная структура

3.3.2 Четвертичная структура

3.3.3 Влияние рН на стабильность и структуру Hsp22 и его К141Е-мутанта

3.4. Определение протеинкиназной активности Hsp

3.5. Hsp22 не ингибирует полимеризацию актина

3.6. Взаимодействие Hsp22 с другими малыми белками теплового шока

3.7. Сравнение шаперонной активности I Isp22 дикого типа и его К141 Е-мутанта

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Выделение и характеристика некоторых физико-химических свойств I Isp

4.2. Протеинкиназная активность I Isp

4.3. Взаимодействие Hsp22 с другими малыми белками теплового шока и возможное участие Hsp22 в регуляции полимеризации актина

4.4. Шаперонная активность Hsp22 111 V. ВЫВОДЫ 114 СПИСОК J1ИТЕРАТУ РЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДГ алкогольдегидрогеназа

АТФ аденозинтрифосфат бис-трис бис(2-гидроксиэтил)-амино-трис-(гидроксиметил)метан

ДМС диметилсуберимидат

К141 Е-мутант Hsp22 точечный мутант Hsp22 с заменой Lys 141 на Glu кд круговой дихроизм

МАРКАР-киназа протеинкиназа, активируемая митоген-активируемой протеинкиназой (mitogen-activated protein kinase activated protein kinase) мРНК матричная PI IK

МЭ меркаптоэтанол

ИАДФИ никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный

ПААГ полиакриламидный гель

Г1СА персульфат аммония

РНК рибонуклеиновая кислота

ТЕМЕД М,1М,>Г,>Г-тетраметилэтилендиамин трис Трис-гидроксиметил амино метан

ФМСФ фенилметилсульфонилфторид цАМФ циклический аденозинмонофсфат

ЭДТА этилендиаминтетраацетат bis-ANS 4,4'-дианилин-1,Г-динафталин-5,5'-дисульфоновая кислота

СМГ2 амиотрофия Шарко-Мари-Туга второго типа (Charcot-Marie-Thooth desease type И) cvllsp сердечно-сосудистый белок теплового шока (cardiovascular heat shock protein) dllMN наследственная дистальная моторная нейропатия второго типа (distal hereditary motor neuropathy type II)

DRM миопатия, связанная с десмином (desmin-related myopathy)

ECL метод усиленной хемилюминесценции (enchanced chemiluminiscence)

FRET флуоресцентный резонансный перенос энергии (fluorescence resonance energy transfer)

F-актин фибриллярный актин

GST глутатион-5-трансфераза (glutathione-S-transferase)

G-актин глобулярный актин

HI£PI£S Ы-[2-гидроксиэтил]пиперазин-ЬГ-[2-этансульфоновая кислота] lisp белок теплового шока (heat shock protein)

LB среда Луриа-Бертани

MKBP белки-активаторы протеинкиназы, характерной для скелетных мышц с миотонической дистрофией (myosin-kinase binding protein)

ODFP Белок-1 наружных плотных фибрилл сперматозоидов (outer dense fiber protein-1)

SDS додецилсульфат натрия si Isp малый белок теплового шока (small heat shock protein)

TBST трис-солевой буфер (tris-buffer saline) wt белок дикого типа (wild type)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура и свойства малого белка теплового шока Hsp22 и его точечного мутанта, экспрессируемого при дистальной моторной нейропатии II типа"

Молекулярные шапсроны являются важнейшим компонентом универсальной системы, позволяющей клетке выжить в условиях стресса. Эти белки взаимодействуют с полипептидными цепями, находящимися в ненативной конформации, препятствуют их спонтанной агрегации и способствуют ренатурации. Классификация белков теплового шока основана на их молекулярных массах. Наиболее изученными являются белки классов I Isp60 и I Isp70. При гидролизе АТФ эти белки теплового шока переходят из конформации с высоким сродством к субстрату в конформацию с низким сродством. Рефолдинг субстратов достигается путем осуществления нескольких циклов их ассоциации-диссоциации с белком теплового шока. Другие шапероны, такие как HsplOO и Hsp90 также взаимодействуют с денатурированными белками, однако до сих пор не доказано, обладают ли они АТФ-азной активностью, необходимой для рефолдинга. Малые белки теплового шока (sHsp), одному из которых посвящена эта работа, связываются с частично денатурированными белками АТФ-независимым способом и препятствуют их агрегации. 11есмотря на то, что эти белки не способны осуществлять фолдинг своих субстратов, они играют в клетке чрезвычайно важную роль, осуществляя функциональную интеграцию между отдельными компонентами шаперонной системы. sHsp привлекают все большее внимание исследователей благодаря растущему перечню разнообразных функций, которые они выполняют в клетке. Можно выделить три направления, по которым ведутся наиболее интенсивные исследования. Во-первых, это участие sHsp в модуляции и защите цитоскелета. Во-вторых, некоторые sHsp, а именно Hsp27 и Hsp20 неким, пока неустановленным образом участвуют в регуляции сокращения гладких мышц. Наконец, в-третих, sHsp являются ингибиторами программируемой клеточной смерти. Благодаря этому они вовлечены в процессы клеточной пролиферации, дифференциации и злокачественной трансформации. Несмотря на значительные усилия, предпринимаемые по всем этим и другим направлениям, механизмы действия малых белков теплового шока пока остаются неясными.

Объектами наиболее интенсивного исследования пока являются не все sHsp, а лишь отдельные представители семейства: а-кристаллины, Hsp27 и Hsp20. В области изучения структуры и функций этих белков был достигнут значительный прогресс. В то же время, буквально в последние годы у млекопитающих было открыто еще несколько sllsp, сведения о которых пока ограничиваются лишь несколькими публикациями. Одним из таких белков является Hsp22. Существует две основные точки зрения о роли этого белка в клетке. Согласно первой, Hsp22 является протеинкиназой, фосфорилирующей белки по остаткам ссрина и треонина. Согласно второй точке зрения Hsp22 является типичным представителем семейства малых белков теплового шока. Однако отсутствие данных о строении этого белка и его шаперонной активности не позволяли сделать однозначные выводы о функциях Hsp22 в клетке.

Возникший в последние годы повышенный интерес к исследованию структуры и свойств малых sllsp в значительной степни связан с достижениями в области молекулярной генетики человека. Было идентифицировано несколько точечных мутаций разных sHsp, в том числе мутация Hsp22 с заменой лизина 141 на остаток глутаминовой кислоты (К141Е-мутант), кореллирующая с развитием наследственной дистальной моторной нейропатии II типа. Некоторые данные литературы свидетельствуют в пользу того, что одна из возможных причин развития этого и других заболеваний - нарушение структуры и свойств sHsp, вызванное заменой консервативного положительно заряженного остатка.

В связи со всем вышесказанным, целью нашей работы было сравнение физико-химических свойств и шаперонной активности Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта. Для осуществления этой цели мы поставили перед собой следующие задачи:

1. Разработать метод выделения рекомбинантного Hsp22 дикого типа и его точечного мутанта К141Е;

2. Проанализировать тканевое распределение Hsp22;

3. Исследовать структуру и олигомерное состояние рекомбинантного Hsp22 дикого типа и его точечного К141Е-мутанта;

4. Проанализировать возможность образования гетероолигомерных комплексов между Hsp22 и другими малыми белками теплового шока;

5. Изучить влияние Hsp22 на процесс полимеризации актина;

6. Исследовать протеинкиназную активность Hsp22 и сопоставить шаперонную активность белка дикого типа и его К141Е-мутанта с использованием различных модельных белков-субстратов.

Научная новизна и практическая значимость

Разработана процедура выделения рекомбинантного Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта, экспрессия которого коррелирует с наследственной дистальной моторной нейропатией человека.

По данным спектроскопии КД вторичная структура Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта практически не отличаются друг от друга и в основном представлены р-складками и неупорядоченной структурой. В отличие от других малых белков теплового шока Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутант не образуют крупных олигомеров и существуют в виде димеров в широком диапазоне концентраций. В условиях in vitro изолированный Hsp22 не обладает аутопротеинкиназной активностью и не способен фосфорилировать казеин или гистон.

Hsp22 препятствует агрегации частично денатурированных белков-субстратов, при этом белок дикого типа более эффективно предотвращает агрегацию роданазы и алкогольдегидрогеназы, чем его К141Е-мутант.

Результаты работы расширяют знания в области строения малых белков теплового шока и могут быть использованы при изучении механизмов развития нейродегенеративных заболеваний.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ким, Мария Вячеславовна

V. выводы

Исследовано тканевое распределение IIsp22 и установлено, что наиболее высокое содержание I Isp22 характерно для сердечной и скелетной мускулатуры. В отличие от большинства малых белков теплового шока Hsp22 не образует крупных олигомеров и представлен в виде мономеров и/или димеров и тетрамеров. Точечная мутация К141Е, характерная для Hsp22, экспрессируемого при некоторых видах нейродегенеративных заболеваний, не влияет на вторичную, третичную или четвертичную структуры Hsp22.

В условиях in vitro изолированный рекомбинантный Hsp22 не обладает протеинкиназной активностью.

При нейтральных значениях pll IIsp22 не способен образовывать прочных гетероолигомерных комплексов с двумя другими малыми белками теплового шока (Hsp20 или Hsp27).

Hsp22 обладает шаперонной активностью и предотвращает агрегацию различных денатурированных белков-субстратов. Мутация К141Е приводит к уменьшению шаперонной активности Hsp22 с некоторыми белками-субстратами.

в отсутствие восстановителей. Учитывая склонность Hsp22 к окислению и его способность образовывать «сшитые» дисульфидными связями олигомеры (см. рис. 15), выводы, сделанные Сан и соавт., вызывают определенные сомнения. В этой же работе был проведен анализ олигомерного состояния Hsp22 в клетке с использованием глутарового диальдегида в качестве бифункционального сшивающего реагента. При этом в клетке индуцировался синтез FLAG-модифицированного Hsp22. Оказалось, что при низких концентрациях глутарового диальдегида удается выявить димеры и тетрамеры Hsp22, в то время как при высоких концентрациях глутарового диальдегида выявлялись олигомеры с молекулярными массами более 250 кДа. На основе этих данных был сделан вывод о том, что в клетке Hsp22 преимущественно представлен в виде димеров и тетрамеров. Это заключение согласуется с данными, литературы [32]. Используя метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности глицерина, эти авторы установили, что в клетках РТК2 Мус-модифицированный Hsp22 образует преимущественно димеры и тетрамеры.

При исследовании четвертичной структуры немодифицированного рекомбинантного Hsp22 крысы Чоудари и соавт. [34] установили, что при гель-фильтрации изолированный белок элюируется в виде пика с кажущейся молекулярной массой 36 кДа. В то же время при ультрацентрифугировании в градиенте плотности глицерина Hsp22 мигрировал как белок с молекулярной массой 22,1 кДа. На основе этих результатов исследователи сделали вывод, что Hsp22 представлен в основном в виде асимметричного мономера. Наши экспериментальные данные хорошо согласуются с результатами Чоудари и соавт., и при этом кажущаяся молекулярная масса, определенная методом гель-фильтрации, составляет 32-40 кДа, а коэффициент седиментации близок к 2 S (см. рис. 13 и 16). В то же время, если принять точку зрения индийских авторов, то оказывается, что фрикционное отношения для Hsp22 составит более 1,7. Это означает, что, если Hsp22, действительно, представлен в виде мономеров, то соотношение осей такого эллипсоида вращения будет более 1:10. Такая асимметричная структура в высшей степени нехарактерна для малых белков теплового шока. Нам кажется более вероятным, что в ходе ультрацентрифугирования происходит диссоциация малых олигомеров Hsp22 и образуются мономеры с кажущимися молекулярными массами около 22 кДа и коэффициентами седиментации около 2 S.

Суммируя наши экспериментальные результаты и данные литературы, можно заключить, что Hsp22 и его К141Е-мутант склонны к образованию димеров и тетрамеров, а при мягком окислении возможно образование очень крупных, «сшитых» дисульфидными связями олигомеров Hsp22.

Проанализируем влияние мутации К.141Е на структуру Hsp22. Данные спектроскопии КД свидетельствуют о том, что эта точечная мутация не оказывает существенного влияния ни на вторичную, ни на третичную структуру белка (рис.12). Кроме того, данные гель-фильтрации (рис. 13), нативного электрофореза (рис.14), ультрацентрифугирования (рис. 16) и химического «сшивания» (рис. 15) свидетельствуют о том, что мутация К141Е практически не влияет на четвертичную структуру Hsp22. Эти результаты оказались во многом неожиданными. Действительно, мутации гомологичного участка аА- (R116С) или осВ-кристаллина (R121G) приводят к заметным изменениям вторичной и третичной структуры белка [14, 104, 105, 160]. Помимо этого указанные мутации приводят к существенному изменению четвертичной структуры белка, и, как правило, к увеличению молекулярной массы образующихся олигомеров [104]. Более того, точечная мутация R120G в аВ-кристаллине приводит к тому, что в клетке начинают накапливаться нерастворимые агрегаты (агресомы) этого белка [32]. Мутация гомологичного остатка (R148G) в Hsp27 китайского хомячка также приводит к образованию нерастворимых агрегатов внутри клетки, при этом, как это ни парадоксально, в отличие от белка дикого типа, мутантный белок не способен образовывать высокомолекулярные олигомеры и в основном представлен в виде димеров [31]. Возникает вопрос, каким образом можно объединить все эти противоречивые данные.

Как уже отмечалось, в настоящее время известны трехмерные структуры только двух малых белков теплового шока - Hspl6,5 Methanococcus jannaschii и Hspl6,9 пшеницы (рис. 2). Были предприняты попытки совместить первичные структуры указанных sHsp, с первичной структурой малых белков теплового шока высших животных [49, 61, 201]. Моделирование такого рода позволило высказать предположение, что положительно заряженные остатки Arg или Lys, расположенные в участке, гомологичном положению 141 Hsp22, локализованы вблизи гидрофобных контактов, образованных остатками, принадлежащими второй и седьмой Р-складками а-кристаллинового домена малых белков теплового шока. Это предположение согласуется с экспериментальными данными, согласно которым Argl21 аВ-кристаллина может быть ковалентно пришит к Lysll аА-кристаллина в структуре интактного кристаллинового комплекса [162]. В Hspl6,5 М. jannaschii Argl07 гомологичный Lys 141 Hsp22) образует водородные связи с первой и второй Р-складками двух Р-листов одного и того же мономера [96]. В Hspl6,9 пшеницы первая Р-складка отсутствует и Argl08 (гомологичный Lys 141 Hsp22) образует солевую связь с Glu 100, расположенным в петле между пятой и седьмой Р-складками соседнего мономера [207].

Первичная структура малых белков теплового шока высших животных довольно существенно отличается от первичной структуры малых белков теплового шока архей и растений. Одним из таких существенных различий является укорочение (или полное отсутствие) шестой Р-складки и сильное укорочение петли, соединяющей пятую и седьмую (или пятую и слившуюся в одну шестую и седьмую) Р-складки [49, 201]. Анализируемый остаток Lys 141 (или гомологичный ему остаток Arg) располагаются именно в этой укороченной петле, соединяющей пятую и седьмую Р-складки малых белков теплового шока животных [61]. Из-за того, что эта петля слишком коротка, указанные остатки Arg или Lys, по всей видимости, не могут напрямую участвовать в образовании контактов между соседними мономерами (как это происходит в Hspl6,9 пшеницы). Тем не менее, эти участки, судя по всему, играют важную роль в фиксации подвижного N-концевого домена данного мономера [31, 201].

Мутации остатка, гомологичного Lys 141 Hsp22, приводят к повышению подвижности N-концевого домена малых белков теплового шока. Этот домен играет исключительно важную роль в образовании крупных олигомеров, сформированных из димеров или тетрамеров. Поэтому точечные мутации K148G Hsp27 китайского хомячка (остатка гомологичного Lys 141 Hsp22) делают невозможным образование крупных олигомеров и Hsp27 диссоциирует до димеров [31]. Одновременно с этим изменение ориентации N-концевого домена приводит к изменению структуры димера. Структура таких димеров с подвижным N- концом становится нестабильной и они приобретают склонность к неупорядоченной агрегации. По-видимому, вследствие этого малые белки теплового шока с заменой положительно заряженных остатков в положении, гомологичном Lys 141 Hsp22 (или вблизи этого положения) имеют нестабильную структуру [204] и склонны к образованию агрегатов внутри клетки [51].

Первичная структура Hsp22 имеет ряд особенностей. В С-концевом подвижном домене этого белка отсутствует консервативная последовательность IXI(V), а в N-концевом домене достаточно консервативная последовательность SRLFDQF сильно изменена. Указанные последовательности в N- и С-концевых доменах малых белков теплового шока играют важную роль во взаимодействии димеров и в формировании крупных олигомеров [155]. Вероятно, именно потому, что эти участки отсутствуют (или сильно модифицированы) Н.чр22 не способен образовывать крупных олигомеров и представлен в основном в виде димеров. По всей видимости, мутация К141Е так же как и в случае других малых белков теплового шока сопровождается переориентацией N-концевого домена. Однако, как до, так и после мутации Hsp22 остается в основном представленным в виде димеров. Именно поэтому с помощью использованных методов мы не можем зарегистрировать сколько-нибудь заметных изменений в четвертичной структуре белка. Более того, внесение точечной мутации сопровождается даже некоторым увеличением стабильности I Isp22 при кислых значениях рН (например, в отличие от белка дикого типа, его К141Е-мутант не выпадает в осадок при рН 6.0, см. рис. 17). В то же время в условиях клетки К141Е-мутант, судя по всему, оказывается достаточно нестабильным и образует нерастворимые агрегаты [82].

4.2. Протеинкиназная активность Hsp22.

Как уже отмечалось, I Isp22 был впервые описан как гомолог протеинкиназного домена большой субъединицы рибонуклеотидредуктазы вируса герпеса [188]. По данным Смита и соавт. гомология между Hsp22 (названного на тот момент НИ киназой) и протеинкиназным доменом вирусного белка составляет 30%. В исследованиях, выполненных на химерном белке, состоящем из глутатион-S-трансферазы и I Isp22, или на иммунопреципитате Hsp22, было установлено, что Hsp22 обладает аутопротенкиназной активностью [188], а также способностью фосфорилировать основной белок миелина [40]. В более поздних работах были представлены данные о том, что протеинкиназная активность Hsp22 может играть роль в регуляции апоптоза [62,68], а также в гипертрофии сердца [40,41].

Проанализировав данные литературы, мы пришли к выводу, что результаты, свидетельствующие в пользу наличия протеинкиназной активности у Hsp22, далеко не однозначны. На момент опубликования первой работы о гомологии Hsp22 вирусной рибонкулеотидредуктазе (обозначаемой как 1СР10), в литературе уже имелись данные, ставящие под сомнение протеинкиназную активность вирусного белка. Было показано, что протеинкиназная активность ICP10 исчезает после ее очистки до гомогенного состояния с помощью афинной хроматографии и центрифугирования в градиенте глицерина. При этом рибонуклеотидредуктазная активность фермента полностью сохранялась [111]. На основании серии экспериментов авторы пришли к выводу, что протеиикиназная активность, приписываемая ICP10, обусловлена наличием в препарате рибонуклеотидредуктазы следовых количеств протеинкиназ. Кроме того, как уже отмечалось, аутопротеипкиназная активность и фосфорилирование основного белка миелина были зарегистрированы не на очищенном и изолированном Hsp22, а на иммунокомплексах, полученных из клеточных экстрактов, или на химерной глутатион-8-трансферазе-Н8р22, сорбированной на глутатион-сефарозе. Во всех этих случаях никак нельзя исключить вероятности того, что препараты Hsp22 были загрязнены следовыми количествами протеинкиназ.

Сильным аргументом в пользу наличия протеинкиназной активности Hsp22 некоторые исследователи считали тот факт, что мутация Lysl 13, расположенного в предполагаемом АТФ-связывающем мотиве Hsp22, вызывала полную потерю протеинкиназной активности, тогда как мутация Lysl 15, расположенного вне этого мотива, не сказывалась на протеинкиназной активности [188]. Однако с нашей точки зрения и этот довод не очень убедителен. Действительно, Lysl 13 является высоко консервативным остатком, сохраняющимся в структуре практически всех малых белков теплового шока. В то же время остаток Lysl 15 мало консервативен. Из этого следует, что точечная мутация Lysl 13 может приводить к драматическим изменениям структуры малых белков теплового шока, в то время как мутация Lysl 15 не оказывает существенного влияния на структуру белка. Известно, что Hsp22 взаимодействует и может фосфорилироваться под действием нескольких протеинкиназ [12, 68]. Нельзя исключить вероятности того, что мутация Lysl 13, которая может оказывать сильное влияние на структуру Hsp22, повлияла и на его взаимодействие с протеинкиназами, в то время как мутация Lysl 15, не сказавшаяся на структуре белка, не влияет на взаимодействие Hsp22 с различными протеинкиназами. Используя рекомбинантный немодифицированный Hsp22 человека мы установили, что длительная инкубация в присутствии АТР с очень высокой удельной радиоактивностью сопровождается включением радиоактивного фосфата в исследуемый белок (рис. 18 А). Эти данные согласуются с результатами, полученными индийскими авторами при исследовании изолированного Hsp22 крысы [34]. В то же время следует отметить, что процесс самофосфорилирования крайне медленен (в исследованиях индийских авторов заметное включение фосфата наблюдалось только после 12 часовой инкубации) и при этом наблюдается исключительно малое включение радиоактивного фосфата в белок. В нашем случае степень фосфорилирования не превышала 5*10"5 моль фосфата на моль белка. Следует отметить, что в определенных довольно специфических условиях акристаллин также может подвергаться самофосфорилированию (см. рис. 18 А). Эти результаты согласуются с данными литературы [89]. Уместно при этом заметить, что степень фосфорилирования а-кристаллина была также крайне мала и не превышала 0,02-0,03 моля фосфора на моль белка. При такой низкой степени фосфорилирования крайне трудно исключить вероятность того, что в описываемых опытах наблюдается не процесс самофосфорилирования, а происходит фосфорилирование небольшой части Hsp22 под действием примесных протеинкиназ.

Наши попытки зарегистрировать протеинкиназную активность Hsp22 с использованием казеина и гистона в качестве модельных субстратов (рис. 18 Б) также дали отрицательный результат. В то время как указанные субстраты эффективно фосфорилировались под действием казеинкиназы второго типа и каталитической субъединицы цАМФ-зависмой протеинкиназы, Hsp22 не был способен фосфорилировать указанные белки-субстраты.

Полученные нами результаты свидетельствуют против высказанной ранее гипотезы о том, что Hsp22 обладает протеинкиназной активностью. Конечно, в настоящий момент трудно полностью исключить возможность того, что в очень специфических условиях Hsp22 не окажется способным фосфорилировать другие белки-субстраты. Однако до тех пор, пока такого рода субстраты не охарактеризованы, нам кажется преждевременным постулировать наличие протеикиназной активности у Hsp22.

4.3. Взаимодействие Hsp22 с другими малыми белками теплового шока и возможное участие IIsp22 в регуляции полимеризации актина.

Как уже отмечалось в обзоре литературы, некоторые sHsp могут образовывать гетероолигомерные комплексы. На основании ранних работ было высказано предположение, что гетероолигомерные комплексы образуются между малыми белками теплового шока, имеющими сходную первичную структуру. Например, Hsp27 (HspBl) взаимодействует с Hsp20 (HspB6) и аВ-кристаллином (HspB5), а МКВР (HspB2) - только с HspB3 [194]. В последнее время в литературе появились данные, свидетельствующие о возможности образования комплексов Hsp22 с другими малыми белками теплового шока. Удивительно, но партнерами Hsp22 в образовании гетероолигомерных комплексов оказались такие различные между собой белки как cvllsp (HspB7), Hsp27 (HspBl), МКВР (HspB2) [196]. Авторы использовали несколько довольно сложных подходов для изучения взаимодействия Hsp22 с другими sHsp. В исследованиях Бенндорфа и соавт. [12] и Сан и соавт. [196] использовалась дрожжевая дигибридная система. При этом в первой работе авторам не удалось обнаружить взаимодействия Hsp22 с Hsp27 дикого типа, а во втором случае такого рода взаимодействие было установлено. В целом же данный метод отличается большим количеством ложноположительных результатов, и полученные с его помощью данные не могут являться достаточным критерием взаимодействия между белками.

Помимо этого Сан и соавт. [196] использовали метод гель-фильтрации, однако постановка эксперимента и интерпретация полученных результатов вызывает определенные сомнения. Экстракт сердечной мышцы был нанесен на колонку, после чего распределение sHsp во фракциях исследовали с помощью антител. Hsp22 присутствовал во фракциях белков с кажущимися молекулярными массами в интервале от 25 до более чем 670 кДа, т.е. практически во всех фракциях, полученных при гель-фильтрации. Неудивительно, что хотя бы в одной части профиля пик Hsp22 совпадал с пиками Hsp27, MKBP (HspB2) и cvHsp (HspB7). Более того, экстракция белков и гель-фильтрация проводились в буферах, не содержащих восстановителей. В этих условиях становится возможным окисление сульф гидр ильных групп Hsp22 и образование «сшитых» олигомеров этого белка.

Третий подход, который был использован для анализа взаимодействия Hsp22 с другими малыми белками теплового шока, состоял в коиммунопреципитации рекомбинантных малых белков теплового шока, коэкспрессируемых в клетках 293Т или COS. При этом в клетках экспрессировались малые белки теплового шока, содержащие в своей последовательности специальные дополнительные последовательности - FLAG и Мус, которые позволяли использовать антитела, специфичные к таким последовательностям. Не вызывает сомнения, что включение этих последовательностей может влиять на структуру белка. Кроме того, по данным этих же авторов, N-конец Hsp22, подвергаемый модификации, играет очень важную роль во взаимодействии Hsp22 с MKBP (HspB2).

Наконец, метод флуоресцентной резонансной миграции энергии, также использовавшийся при исследовании взаимодействия Hsp22 с другими малыми белками теплового шока, предполагает получение химерных белков, в единой полипептидной цепи которых последовательность, характерная для малого белка теплового шока, слита с последовательностью флуоресцирующего белка. Учитывая тот факт, что размер флуоресцирующих белков сопоставим с размеров малых белков теплового шока, трудно ожидать, что структура полученного конструкта будет абсолютно неотличимой от структуры изолированного немодифицированного малого белка теплового тока.

Используя метод гель-фильтрации, мы исследовали прямое взаимодействие между изолированными ^модифицированными Hsp27 и Hsp22, а также между Hsp22 и Hsp20 (см. рис. 20). Ни в одном из экспериментов нам не удалось обнаружить образования стабильных гетероолигомерных комплексов между Hsp22 и другими малыми белками теплового тока. В этом отношении наши результаты хорошо согласуются с данными Чавез Зобель с соавт. [32]. Этими авторами было установлено, что повышенная экспрессия Hsp22 может снижать количество агрегатов мутанта R120G ссВ-кристаллина, при этом Hsp22 не образует прочных комплексов с мутированным кристаллином.

Полученные нами отрицательные результаты не означают, что Hsp22 вовсе не способен взаимодействовать с другими малыми белками теплового шока. Нет сомнения, что имеет смысл провести подробное исследование такого рода взаимодействия с использованием иных методов или в иных условиях. В этом отношении следует упомянуть о том, что при рН 6,0 I Isp22 может соосаждаться и даже «зашиваться» дисульфидными связями с Hsp27 (рис. 21 и 22). Мы не беремся утверждать, что такое взаимодействие происходит in vivo и имеет физиологическое значение, однако эти данные демонстрируют, насколько небольшое изменение условий может сказаться на взаимодействии малых белков теплового шока друг с другом.

При исследовании тканевого распределения Hsp22 мы обнаружили, что в наибольших количествах этот белок экспрессируется в различных типах мышц (рис. 10). Данные литературы свидетельствуют о том, что Hsp20, Hsp27 и, возможно, схВ-кристаллин тем или иным способом влияют на структуру и динамику цитоскелета [11, 25, 140, 141, 218]. Учитывая сходство первичных структур Hsp22 и Hsp27 (Hsp20), можно было предположить, что Hsp22 также каким-то образом окажется способным влиять на структуру цитоскелета. Для проверки этого предположения мы исследовали влияние Hsp22 на кинетику и степень полимеризации актина (рис. 19). Оказалось, что Hsp22, будучи добавленным даже в очень большом избытке, не оказывал существенного влияния на процессы полимеризации актина. Таким образом, мы можем исключить вероятность прямого взаимодействия Hsp22 с актином. Этот факт однако не исключает возможности того, что Hsp22 может влиять на полимеризацию актина каким-то опосредованным образом (например, через какие-то до сих пор неизвестные адаптерные белки) или участвует в регуляции других элементов цитоскелета (таких как промежуточные филаменты или микротрубочки).

4.4. Шаперонная активность Hsp22

Предотвращение агрегации частично поврежденных белков является одной из главнейших функций малых белков теплового шока. При этом до последнего времени нет ясного представления о том, каким образом малые белки теплового шока могут предотвращать афегацию частично денатурированных белков. Как уже отмечалось, мутации в положении, гомологичном Lys 141 Hsp22, характерны для многих малых белков теплового шока и сопровождаются возникновением ряда врожденных заболеваний, таких как катаракта, миопатия, связанная с десмином, болезнь Шарко-Мари-Тута и дистальная наследственная моторная нейропатия второго типа [13]. Оказалось, что мутации R116C аА-кристаллина и R120G схВ-кристаллина, т.е. остатков, гомологичных Lys 141 Hsp22, приводят к заметному уменьшению шаперонной активности а-кристаллинов [104]. В то же время мутация R148G Hsp27 китайского хомячка (этот остаток также гомологичен Lys 141 Hsp22) не приводит к заметному изменению шаперонной активности этого белка [31]. Таким образом, остается не совсем понятным, связано ли развитие врожденных заболеваний с уменьшением шаперонной активности малых белков теплового шока или с какими-то иными причинами.

К моменту начала наших исследований шаперонная активность Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта не была исследована. Единственная опубликованная работа Ироби и соавт. [82] свидетельствовала о том, что в клетках, экспрессирующих К14IE-мутант Hsp22, наблюдалось образование агрегатов, в составе которых с помощью иммунологических методов были обнаружены как мутированный Hsp22, так и интактный Hsp27. Для понимания молекулярных основ возникновения различных врожденных нейродегенеративных заболеваний представлялось целесообразным сравнить шаперонную активность Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта.

В своей работе мы обнаружили, что Hsp22 дикого типа обладает шаперонной активностью и способен предотвращать агрегацию нескольких различных белков-субстратов, таких как инсулин, алькогольдегидрогеназа или роданаза (см. рис. 23-25). Позднее этот вывод был подтвержден в исследованиях индийских авторов, выполненных на Hsp22 крысы [34]. Следует сразу оговориться, что измерение шаперонной активности сопряжено с большими техническими сложностями. В нашем случае (так же как, впрочем, и в литературе) мы измеряли шаперонную активность по способности исследуемого белка теплового шока уменьшать светорассеяние пробы, в которой происходила агрегация исследуемого белка-субстрата.

Светорассеяние, вызванное агрегацией белка, зависит от очень большого количества факторов: количество частиц, их формы, коэффициентов преломления и др. Поэтому количественный анализ кривых светорассеяния очень сложен и большинство авторов анализируют результаты только на качественном уровне. По-видимому, пока это - единственный способ оценки шаперонной активности. Очень заманчивым представлялось качественное сравнение шаперонной активности Hsp22 с шаперонной активностью других малых белков теплового шока. Для оценки эффективности шаперонного действия Hsp22 и сравнения ее с эффективностью других sHsp мы сравнивали весовое соотношение субстрат:шаперон, необходимое для полного подавления агрегации данного белка. Различные sllsp проявляют неодинаковую эффективность в подавлении агрегации тех или иных субстратов. Так, в случае алкогольдегидрогеназы, Hsp22 дикого типа полностью подавлял агрегацию при двукратном весовом избытке над субстратом, в то время как Hsp27 и Hsp20 - при равном весовом соотношении субстрат:шаперон [24, 152]. Что же касается агрегации актина, то Hsp22 дикого типа менее эффективен в ее предотвращении, чем Hsp27, но более эффективен, чем Hsp20. Следует сразу оговориться, что на самом деле такого рода сравнение не совсем справедливо. Дело в том, что размер олигомеров сравниваемых малых белков теплового шока довольно сильно различается. Например, кажущиеся молекулярные массы олигомеров Hsp27 дикого типа превышают 500 кДа, в то время как кажущиеся молекулярные массы олигомеров Hsp22 - около 38 кДа. Однако, как бы то ни было, полученные нами данные свидетельствуют о том, что малые по размеру олигомеры Hsp22 обладают шаперонной активностью, сопоставимой с шаперонной активностью крупных олигомеров Hsp27.

Как уже отмечалось, мутация К141Е не оказывает существенно влияния на вторичную, третичную или четвертичную структуру Hsp22. Поэтому, проводя измерение шаперонной активности Hsp22 и его К141 Е-мутанта в идентичных условиях, мы могли провести корректное сравнение их способности предотвращать агрегацию различных денатурированных белков-субстратов. Оказалось, что при использовании алкогольдегидрогеназы и роданазы в качестве субстратов К141Е-мутант Hsp22 обладает меньшей шаперонной активностью, чем белок дикого типа (см. рис. 24 и 25). В то же время при использовании инсулина в качестве субстрата шаперонная активность К14IE-мутанта была сопоставимой с активностью белка дикого типа (см. рис. 23). Эти данные свидетельствуют в пользу того, что уменьшение шаперонной активности, вызванное мутацией К141Е может быть одной из причин возникновения дисталыюй моторной нейропатии. Совсем недавно были опубликованы результаты исследования шаперонных свойств IIsp22 in vivo, согласующиеся с нашими данными [27]. В данной работе культуры клеток CCL39 и НЕК293 трансформировали плазмидой, кодирующей нуклеотидную последовательность фрагмента белка хантигтина, включающую в свой состав 43 остатка глутамина (IItt43Q). Экспрессия этого продукта приводит к накоплению в клетках амилоидных фибрилл, аналогичных таковым, обнаруживаемых в нейронах больных болезнью Хантигтона. Экспрессия в этих клетках Hsp27 или аВ-кристаллина не спасала клетки от накопления агрегатов фрагмента хантигтина. В то же время, экспрессия в этих клетках Hsp22 дикого типа заметно уменьшала количество накапливающихся в клетках агрегатов. Важно отметить, что К141Е- и К14Ш-мутанты Hsp22 также были способны защищать клетки от накопления агрегатов фрагментов хантигтина, однако их эффективность была заметно меньше, чем эффективность белка дикого типа. Приведенные данные свидетельствуют о том, что Hsp22 может защищать клетки от накопления агрегатов белков, содержащих полиглутаминовые последовательности и что мутация К141Е заметно уменьшает шаперонную активность Hsp22 с белками-субстратами такого типа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ким, Мария Вячеславовна, Москва

1. Болотина А.И. (1973) Изучение структуры белков методом кругового дихроизма. Молекулярная биология. ВИНИТИ, Москва 1:61-104

2. Букач О.В. Сейт-Неби А.С., Панасенко О.О., Ким М.В., Гусев Н.Б. (2002) Выделение тканевого и рекомбинантного малого белка теплового шока из гладких мышц птиц. Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии 1:50-57

3. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. Москва, Мир, 1984

4. Agius MA, Kirvan СА, Schafer AL, Gudipati E, Zhu S (1999) High prevalence of anti-alpha-crystallin antibodies in multiple sclerosis: correlation with severity and activity of disease. Acta Neurol Scand 100:139-147

5. Agro AF, Cannella C, Graziani MT, Cavallini D (1971) A possible role for rhodanese: The formation of'labile' sulfur from thiosulfate. FEBS Lett 16:172-174

6. Allen SP, Polazzi JO, Gierse JK, Easton AM (1992) Two novel heat shock genes encoding proteins produced in response to heterologous protein expression in Escherichia coli. J Bacteriol 174:6938-6947

7. An SS, Fabry B, Mellema M, Bursac P, GerthofTer WT, Kayyali US, Gaestel M, Shore SA, Fredberg JJ (2004) Role of heat shock protein 27 in cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell. J Appl Physiol 96:1701-1713

8. Arrigo AP, Welch WJ (1987) Characterization and purification of the small 28,000-dalton mammalian heat shock protein. J Biol Chem 262:15359-15369

9. Валу BM, Schultz GA (2001) Increased expression of a novel heat shock protein transcript in the mouse uterus during decidualization and in response to progesterone. Biol Reprod 64:284-292

10. Beall A, Bagwell D, Woodrum D, Stoming ТА, Kato K, Suzuki A, Rasmussen H, Brophy CM (1999) The small heat shock-related protein, HSP20, is phosphoiylated on serine 16 during cyclic nueleotide-dependent relaxation. J Biol Chem 274:1134411351

11. Benndorf R, Hayess K, Ryazantsev S, Wieske M, Behlke J, Lutsch G (1994) Phosphorylation and supramolecular organization of murine small heat shock protein HSP25 abolish its actin polymerization-inhibiting activity. J Biol Chem 269:2078020784

12. Benndorf R, Welsh MJ (2004) Shocking degeneration. Nat Genet 36:547-548

13. Bera S, Thampi P, Cho WJ, Abraham EC (2002) A positive charge preservation at position 116 of alpha A-crystallin is critical for its structural and functional integrity. Biochemistry 41:12421-12426

14. Berengian AR, Bova MP, McIIaourab US (1997) Structure and function of the conserved domain in alphaA-crystallin. Site-directed spin labeling identifies a beta-strand located near a subunit interface. Biochemistry 36:9951-9957

15. Bhattachaiyya AM, Horowitz PM (2002) Isolation and characterization of rhodanese intermediates during thermal inactivation and their implications for the mechanism of protein aggregation. Biochemistry 41:422-429

16. Biswas A, Das KP (2004) Role of ATP on the interaction of alpha-ciystallin with its substrates and its implications for the molecular chaperone function. J Biol Chem 279:42648-42657

17. Bode C, Tolgyesi FG, Smeller L, I leremans K, Avilov SV, Fidy J (2003) Chaperone-like activity of alpha-crystallin is enhanced by high-pressure treatment. Biochem J 370:859-866

18. Boros S, Kamps B, Wunderink L, de Bruijn W, de Jong WW, Boelens WC (2004) Transglutaminase catalyzes differential crosslinking of small heat shock proteins and amyloid-beta. FEBS Lett 576:57-62

19. Bova MP, McHaourab HS, Han Y, Fung BK (2000) Subunit exchange of small heat shock proteins. Analysis of oligomer formation of alphaA-ciystallin and Hsp27 by fluorescence resonance energy transfer and site-directed truncations. J Biol Chem 275:1035-1042

20. Bruey JM, Ducasse C, Bonniaud P, Ravagnan L, Susin SA, Diaz-Latoud C, Gurbuxani S, Arrigo AP, Kroemer G, Solary E, Garrido С (2000) Hsp27 negatively regulates cell death by interacting with cytochrome c. Nat Cell Biol 2:645-652

21. Bukach OV, Seit-Ncbi AS, Marston SB, Gusev NB (2004) Some properties of human small heat shock protein Hsp20 (HspB6). Eur J Biochem 271:291-302

22. Candido EP (2002) The small heat shock proteins of the nematode Caenorhabditis elegans: structure, regulation and biology. Prog Mol Subcell Biol 28:61-78

23. Carra S, Sivilotti M, Chavez Zobel AT, Lambert H, Landiy J (2005) HspB8, a small heat shock protein mutated in human neuromuscular disorders, has in vivo chaperone activity in cultured cells. Hum Mol Genet 14:1659-1669

24. Charette SJ, Lavoie JN, Lambert H, Landry J (2000) Inhibition of Daxx-mediated apoptosis by heat shock protein 27. Mol Cell Biol 20:7602-7612

25. Charpentier AH, Bednarek AK, Daniel RL, Hawkins KA, Laflin KJ, Gaddis S, MacLeod MC, Aldaz CM (2000) Effects of estrogen on global gene expression: identification of novel targets of estrogen action. Cancer Res 60:5977-5983

26. Chavez Zobel AT, Lambert H, Theriault JR, Landry J (2005) Structural instability caused by a mutation at a conserved arginine in the alpha-crystallin domain of Chinese hamster heat shock protein 27. Cell Stress Chaperones 10:157-166

27. Chavez Zobel AT, Loranger A, Marceau N, Theriault JR, Lambert H, Landry J (2003) Distinct chaperone mechanisms can delay the formation of aggresomes by the myopathy-causing R120G alphaB-crystallin mutant. Hum Mol Genet 12:1609-1620

28. Chernik IS, Panasenko OO, Li Y, Marston SB, Gusev NB (2004) pH-induced changes of the structure of small heat shock proteins with molecular mass 24/27kDa (HspBl). Biochem Biophys Res Commun 324:1199-1203

29. Chowdary TK, Raman В, Ramakrishna T, Rao CM (2004) Mammalian I lsp22 is a heat-inducible small heat-shock protein with chaperone-like activity. Biochem J 381:379-387

30. Conroy SE, Sasieni PD, Amin V, Wang DY, Smith P, Fentiman IS, Latchman DS (1998) Antibodies to heat-shock protein 27 are associated with improved survival in patients with breast cancer. Br J Cancer 77:1875-1879

31. Cooper J, Conner J, Clements JB (1995) Characterization of the novel protein kinase activity present in the R1 subunit of herpes simplex virus ribonucleotide reductase. J Virol 69:4979-4985

32. Cornford PA, Dodson AR, Parsons KF, Desmond AD, Woolfenden A, Fordham M, Neoptolemos JP, Ke Y, Foster CS (2000) Heat shock protein expression independently predicts clinical outcome in prostate cancer. Cancer Res 60:7099-7105

33. Depre C, Hase M, Gaussin V, Zajac A, Wang L, Hittinger L, Ghaleh B, Yu X, Kudej RK, Wagner T, Sadoshima J, Vatner SF (2002) НИ kinase is a novel mediator of myocardial hypertrophy in vivo. Circ Res 91:1007-1014

34. Depre C, Kim SJ, John AS, Huang Y, Rimoldi OE, Pepper JR, Dreyfus GD, Gaussin V, Pennell DJ, Vatner DE, Camici PG, Vatner SF (2004) Program of cell survival underlying human and experimental hibernating myocardium. Circ Res 95:433-440

35. Devaja O, King RJ, Papadopoulos A, Raju KS (1997) Heat-shock protein 27 (11SP27) and its role in female reproductive organs. Eur J Gynaecol Oncol 18:16-22

36. Ding D, Moskowitz SI, Li R, Lee SB, Esteban M, Tomaselli K, Chan J, Bergold PJ (2000) Acidosis induces necrosis and apoptosis of cultured hippocampal neurons. Exp Neurol 162:1-12

37. Djabali K, de Nechaud B, Landon F, Portier MM (1997) AlphaB-ciystallin interacts with intermediate filaments in response to stress. J Cell Sci 110 ( Pt 21):2759-2769

38. Dudich IV, Zav'yalov VP, Pfeil W, Gaestel M, Zav'yalova GA, Denesyuk AI, Korpela T (1995) Dimer structure as a minimum cooperative subunit of small heat-shock proteins. Biochim Biophys Acta 1253:163-168

39. Eaton P, Fuller W, Shattoek MJ (2002) S-thiolation of HSP27 regulates its multimeric aggregate size independently of phosphorylation. J Biol Chem 277:21189-21196

40. Ehrnsperger M, Graber S, Gaestel M, Buchner J (1997) Binding of non-native protein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation. EmboJ 16:221-229

41. Ehrnsperger M, Lilie H, Gaestel M, Buchner J (1999) The dynamics of Hsp25 quaternary structure. Structure and function of different oligomeric species. J Biol Chem 274:14867-14874

42. Eifert C, Burgio MR, Bennett PM, Salerno JC, Koretz JF (2005) N-terminal control of small heat shock protein oligomerization: changes in aggregate size and chaperone-like function. Biochim Biophys Acta 1748:146-156

43. Ellis RJ (2003) Protein folding: importance of the Anfinsen cage. Curr Biol 13:R881-883

44. Farnsworth PN, Singh К (2000) Self-complementary motifs (SCM) in alpha-ciystallin small heat shock proteins. FEBS Lett 482:175-179

45. Feil IK, Malfois M, Hendle J, van Der Zandt H, Svergun DI (2001) A novel quaternary structure of the dimeric alpha-crystallin domain with chaperone-like activity. J Biol Chem 276:12024-12029

46. Fontaine JM, Rest JS, Welsh MJ, Benndorf R (2003) The sperm outer dense fiber protein is the 10th member of the superfamily of mammalian small stress proteins. Cell Stress Chaperones 8:62-69

47. Fonte V, Kapulkin V, Taft A, Fluet A, Friedman D, Link CD (2002) Interaction of intracellular beta amyloid peptide with chaperone proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 99:9439-9444

48. Franck E, Madsen O, van Rheede T, Ricard G, Huynen MA, de Jong WW (2004) Evolutionary diversity of vertebrate small heat shock proteins. J Mol Evol 59:792-805

49. Garrido С, Bruey JM, Fromentin A, Hammann A, Arrigo AP, Solary E (1999) 11SP27 inhibits cytochrome c-dependent activation of procaspase-9. Faseb J 13:2061-2070

50. Garrido C, Fromentin A, Bonnotte B, Favre N, Moutet M, Arrigo AP, Mehlen P, Solaiy E (1998) Heat shock protein 27 enhances the tumorigenicity of immunogenic rat colon carcinoma cell clones. Cancer Res 58:5495-5499

51. Garrido C, Ottavi P, Fromentin A, Hammann A, Arrigo AP, Chauffert B, Mehlen P1997) I1SP27 as a mediator of confluence-dependent resistance to cell death induced by anticancer drugs. Cancer Res 57:2661-2667

52. Ghosh JG, Clark JI (2005) Insights into the domains required for dimerization and assembly of human alphaB crystallin. Protein Sci 14:684-695

53. Gober MD, Smith CC, Ueda K, Toretsky JA, Aurelian L (2003) Forced expression of the HI 1 heat shock protein can be regulated by DNA methylation and trigger apoptosis in human cells. J Biol Chem 278:37600-37609

54. Golenhofen N, Perng MD, Quinlan RA, Drenckhahn D (2004) Comparison of the small heat shock proteins alphaB-crystallin, MK.BP, HSP25, HSP20, and cvHSP in heart and skeletal muscle. Histochem Cell Biol 122:415-425

55. Guagliardi A, Cerchia L, Rossi M (1995) Prevention of in vitro protein thermal aggregation by the Sulfolobus solfataricus chaperonin. Evidence for nonequivalent binding surfaces on the chaperonin molecule. J Biol Chem 270:28126-28132

56. Guo C, Yu S, Davis AT, Wang H, Green JE, Ahmed К (2001) A potential role of nuclear matrix-associated protein kinase CK2 in protection against drug-induced apoptosis in cancer cells. J Biol Chem 276:5992-5999

57. Guo Z, Cooper LF (2000) An N-terminal 33-amino-acid-deIetion variant of hsp25 retains oligomerization and functional properties. Biochem Biophys Res Commun 270:183-189

58. Halaby DM, Mornon JP (1998) The immunoglobulin superfamily: an insight on its tissular, species, and functional diversity. J Mol Evol 46:389-400

59. Hase M, Depre C, Vatner SF, Sadoshima J (2005) HI 1 has dose-dependent and dual hypertrophic and proapoptotic functions in cardiac myocytes. Biochem J 388:475-483

60. Haslbeck M, Ignatiou A, Saibil H, Hclmich S, Frenzl E, Stromer T, Buchner J (2004) A domain in the N-terminal part of Hsp26 is essential for chaperone function and oligomerization. J Mol Biol 343:445-455

61. Haslbeck M, Walke S, Stromer T, Ehrnsperger M, White HE, Chen S, Saibil HR, Buchner J (1999) Hsp26: a temperature-regulated chaperone. Embo J 18:6744-6751

62. Hauge JG (1971) Pressure-induced dissociation of ribosomes during ultracentrifugation. FEBS Lett 17:168-172

63. Head MW, Corbin E, Goldman JE (1993) Overexpression and abnormal modification of the stress proteins alpha B-crystallin and 11SP27 in Alexander disease. Am J Pathol 143:1743-1753

64. Hino M, Kurogi K, Okubo MA, Murata-Hori M, Hosoya H (2000) Small heat shock protein 27 (HSP27) associates with tubulin/microtubules in HeLa cells. Biochem Biophys Res Commun 271:164-169

65. Horwitz J, Bova MP, Ding LL, Haley DA, Stewart PL (1999) Lens alpha-crystallin: function and structure. Eye 13 ( Pt 3b):403-408

66. Horwitz J, Huang QL, Ding L, Bova MP (1998) Lens alpha-crystallin: chaperone-like properties. Methods Enzymol 290:365-383

67. Houk TW, Jr., Ue К (1974) The measurement of actin concentration in solution: a comparison of methods. Anal Biochem 62:66-74

68. Houry WA (2001) Chaperone-assisted protein folding in the cell cytoplasm. Curr Protein Pept Sci 2:227-244

69. Huot J, Houle F, Spitz DR, Landry J (1996) HSP27 phosphorylation-mediated resistance against actin fragmentation and cell death induced by oxidative stress. Cancer Res 56:273-279

70. Inaguma Y, Ito H, Iwamoto I, Saga S, Kato К (2001) AlphaB-crystallin phosphorylated at Ser-59 is localized in centrosomes and midbodies during mitosis. Eur J Cell Biol 80:741-748

71. Ito H, Kamei K, Iwamoto I, Inaguma Y, Nohara D, Kato К (2001) Phosphorylation-induced change of the oligomerization state of alpha B-crystallin. J Biol Chem 276:5346-5352

72. Josephs R, Harrington WF (1967) An unusual pressure dependence for a reversibly associating protein system; sedimentation studies on myosin. Proc Natl Acad Sci U S A 58:1587-1594

73. Kamradt MC, Chen F, Cryns VL (2001) The small heat shock protein alpha B-crystallin negatively regulates cytochrome c- and caspase-8-dependent activation of caspase-3 by inhibiting its autoproteolytic maturation. J Biol Chem 276:16059-16063

74. Kamradt MC, Chen F, Sam S, Cryns VL (2002) The small heat shock protein alpha B-crystallin negatively regulates apoptosis during myogenic differentiation by inhibiting caspase-3 activation. J Biol Chem 277:38731-38736

75. Kantorow M, Piatigorsky J (1994) Alpha-crystallin/small heat shock protein has autokinase activity. Proc Natl Acad Sci U S A 91:3112-3116

76. Kappe G, Franck E, Verschuure P, Boelens WC, Leunissen JA, de Jong WW (2003) The human genome encodes 10 alpha-crystallin-related small heat shock proteins: HspBl-10. Cell Stress Chaperones 8:53-61

77. Kappe G, Verschuure P, Philipsen RL, Staalduinen AA, Van de Boogaart P, Boelens WC, De Jong WW (2001) Characterization of two novel human small heat shock proteins: protein kinase-related HspB8 and testis-specific IIspB9. Biochim Biophys Acta 1520:1-6

78. Kato K, Goto S, Inaguma Y, Hasegawa K, Morishita R, Asano T (1994) Purification and characterization of a 20-kDa protein that is highly homologous to alpha В crystallin. J Biol Chem 269:15302-15309

79. Kato K, Hasegawa K, Goto S, Inaguma Y (1994) Dissociation as a result of phosphorylation of an aggregated form of the small stress protein, hsp27. J Biol Chem 269:11274-11278

80. Kato K, Shinohara II, Goto S, Inaguma Y, Morishita R, Asano T (1992) Copurification of small heat shock protein with alpha В crystallin from human skeletal muscle. J Biol Chem 267:7718-7725

81. Kim KK, Kim R, Kim SH (1998) Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature 394:595-599

82. Kim MV, Seit-Nebi AS, Marston SB, Gusev NB (2004) Some properties of human small heat shock protein Hsp22 (HI 1 or HspB8). Biochem Biophys Res Commun 315:796-801

83. Klemenz R, Frohli E, Steiger RH, Schafer R, Aoyama A (1991) Alpha B-crystallin is a small heat shock protein. Proc Natl Acad Sci U S A 88:3652-3656

84. Kokke BP, Leroux MR, Candido EP, Boelens WC, de Jong WW (1998) Caenorhabditis elegans small heat-shock proteins Hspl2.2 and Hspl2.3 form tetramers and have no chaperone-like activity. FEBS Lett 433:228-232

85. Konishi H, Matsuzaki H, Tanaka M, Takemura Y, Kuroda S, Ono Y, Kikkawa U (1997) Activation of protein kinase В (Akt/RAC-protein kinase) by cellular stress and its association with heat shock protein Hsp27. FEBS Lett 410:493-498

86. Kouyama T, Mihashi К (1981) Fluorimetry study of N-(l-pyrenyl)iodoacetamide-labelled F-actin. Local structural change of actin protomer both on polymerization and on binding of heavy meromyosin. Eur J Biochem 114:33-38

87. Koyama Y, Goldman JE (1999) Formation of GFAP cytoplasmic inclusions in astrocytes and their disaggregation by alphaB-crystallin. Am J Pathol 154:1563-1572

88. Kumar LV, Ramakrishna T, Rao CM (1999) Structural and functional consequences of the mutation of a conserved arginine residue in alphaA and alphaB crystallins. J Biol Chem 274:24137-24141

89. Kumarapeli AR, Wang X (2004) Genetic modification of the heart: chaperones and the cytoskeleton. J Mol Cell Cardiol 37:1097-1109

90. Kuszak JR, Peterson KL, Sivak JG, Herbert KL (1994) The interrelationship of lens anatomy and optical quality. II. Primate lenses. Exp Eye Res 59:521-535

91. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685

92. Lambert H, Charette SJ, Bernier AF, Guimond A, Landiy J (1999) HSP27 multimerization mediated by phosphorylation-sensitive intermolecular interactions at the amino terminus. J Biol Chem 274:9378-9385

93. Lavoie JN, Hickey E, Weber LA, Landry J (1993) Modulation of actin microfilament dynamics and fluid phase pinocytosis by phosphorylation of heat shock protein 27. J Biol Chem 268:24210-24214

94. Lavoie JN, Lambert II, Iliekey E, Weber LA, Landry J (1995) Modulation of cellular thcrmoresistance and actin filament stability accompanies phosphorylation-induced changes in the oligomeric structure of heat shock protein 27. Mol Cell Biol 15:505516

95. Lebowitz J, Lewis MS, Schuck P (2002) Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci 11:2067-2079

96. Lelj-Garolla B, Mauk AG (2005) Self-association of a small heat shock protein. J Mol Biol 345:631-642

97. Leroux MR, Ma BJ, Batelier G, Melki R, Candido EP (1997) Unique structural features of a novel class of small heat shock proteins. J Biol Chem 272:12847-12853

98. Leroux MR, Melki R, Gordon B, Batelier G, Candido EP (1997) Structure-function studies on small heat shock protein oligomeric assembly and interaction with unfolded polypeptides. J Biol Chem 272:24646-24656

99. Leskovac V, Trivic S, Pericin D (2002) The three zinc-containing alcohol dehydrogenases from baker's yeast, Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res 2:481-494

100. Li PF, Li J, Muller EC, Otto A, Dietz R, von Harsdorf R (2002) Phosphorylation by protein kinase CK2: a signaling switch for the caspase-inhibiting protein ARC. Mol Cell 10:247-258

101. Liang JJ (2000) Interaction between beta-amyloid and lens alphaB-crystallin. FEBS Lett 484:98-101

102. Litt M, Kramer P, LaMorticella DM, Murphey W, Lovrien EW, Weleber RG (1998) Autosomal dominant congenital cataract associated with a missense mutation in the human alpha ciystallin gene CRYAA. Hum Mol Genet 7:471-474

103. Loktionova S A, llyinskaya OP, Gabai VL, Kabakov AE (1996) Distinct effects of heat shock and ATP depletion on distribution and isoform patterns of human Hsp27 in endothelial cells. FEBS Lett 392:100-104

104. Loktionova SA, llyinskaya OP, Kabakov AE (1998) Early and delayed tolerance to simulated ischemia in heat-preconditioned endothelial cells: a role for IISP27. Am J Physiol 275:H2147-2158

105. Loktionova SA, Kabakov AE (2001) Phosphatase inhibitors prevent HSP27 dephosphorylation, destruction of stress fibrils, and morphological changes in endothelial cells during ATP depletion. Bull Exp Biol Med 132:914-917

106. Loktionova SA, Kabakov AE (1998) Protein phosphatase inhibitors and heat preconditioning prevent Ilsp27 dephosphorylation, F-actin disruption and deterioration of morphology in ATP-depleted endothelial cells. FEBS Lett 433:294300

107. Mackay DS, Andley UP, Shiels A (2003) Cell death triggered by a novel mutation in the alphaA-crystallin gene underlies autosomal dominant cataract linked to chromosome 21q. Eur J I lum Genet 11:784-793

108. MacRae TH (2000) Structure and function of small heat shock/alpha-ciystallin proteins: established concepts and emerging ideas. Cell Mol Life Sci 57:899-913

109. Mao YW, Liu JP, Xiang H, Li DW (2004) Human alphaA- and alphaB-crystallins bind to Bax and Bcl-X(S) to sequester their translocation during staurosporine-induced apoptosis. Cell Death Differ 11:512-526

110. Mao YW, Xiang H, Wang J, Korsmeyer S, Reddan J, Li DW (2001) Human bcl-2 gene attenuates the ability of rabbit lens epithelial cells against H202-induced apoptosis through down-regulation of the alpha B-ciystallin gene. J Biol Chem 276:43435-43445

111. Marcum JM, Borisy GG (1978) Sedimentation velocity analyses of the effect of hydrostatic pressure on the 30 S microtubule protein oligomer. J Biol Chem 253:28522857

112. Marvin KW, George MD, Fujimoto W, Saunders NA, Bernacki SH, Jetten AM (1992) Cornifin, a cross-linked envelope precursor in keratinocytes that is down-regulated by retinoids. Proc Natl Acad Sci U S A 89:11026-11030

113. Mehlen P, Coronas V, Ljubic-Thibal V, Ducasse C, Granger L, Jourdan F, Arrigo AP (1999) Small stress protein Hsp27 accumulation during dopamine-mediated differentiation of rat olfactory neurons counteracts apoptosis. Cell Death Differ 6:227233

114. Mehlen P, Schulze-Osthoff K, Arrigo AP (1996) Small stress proteins as novel regulators of apoptosis. Heat shock protein 27 blocks Fas/APO-1- and staurosporine-induced cell death. J Biol Chem 271:16510-16514

115. Mcrck KB, De Haard-Hoekman WA, Oude Essink BB, Bloemendal H, De Jong WW (1992) Expression and aggregation of recombinant alpha A-crystallin and its two domains. Biochim Biophys Acta 1130:267-276

116. Michaud S, Marin R, Tanguay RM (1997) Regulation of heat shock gene induction and expression during Drosophila development. Cell Mol Life Sci 53:104-113

117. Miron T, Vancompemolle K, Vandekerckhove J, Wilchek M, Geiger В (1991) A 25-kD inhibitor of actin polymerization is a low molecular mass heat shock protein. J Cell Biol 114:255-261

118. Miron T, Wilchek M, Geiger В (1988) Characterization of an inhibitor of actin polymerization in vinculin-rich fraction of turkey gizzard smooth muscle. Eur J Biochem 178:543-553

119. Mogk A, Deuerling E, Vorderwulbecke S, Vierling E, Bukau В (2003) Small heat shock proteins, ClpB and the DnaK system form a functional triade in reversing protein aggregation. Mol Microbiol 50:585-595

120. Momon JP, Halaby D, Malfois M, Durand P, Callebaut I, Tardieu A (1998) alpha-Crystallin C-terminal domain: on the track of an Ig fold. Int J Biol Macromol 22:219227

121. Muchowski PJ, Bassuk JA, Lubsen NH, Clark JI (1997) Human alphaB-crystallin. Small heat shock protein and molecular chaperone. J Biol Chem 272:2578-2582

122. Muchowski PJ, Clark JI (1998) ATP-enhanced molecular chaperone functions of the small heat shock protein human alphaB crystallin. Proc Nad Acad Sci U S A 95:10041009

123. Muchowski PJ, Hays LG, Yates JR, 3rd, Clark JI (1999) ATP and the core "alpha-Crystallin" domain of the small heat-shock protein alphaB-crystallin. J Biol Chem 274:30190-30195

124. Muchowski PJ, Valdez MM, Clark Jl (1999) AlphaB-crystallin selectively targets intermediate filament proteins during thermal stress. Invest Ophthalmol Vis Sei 40:951-958

125. Narberhaus F (2002) Alpha-crystallin-type heat shock proteins: socializing minichaperones in the context of a multichaperone network. Microbiol Mol Biol Rev 66:64-93; table of contents

126. Nath D, Rawat U, Anish R, Rao M (2002) Alpha-crystal 1 in and ATP facilitate the in vitro renaturation of xylanase: enhancement of refolding by metal ions. Protein Sci 11:2727-2734

127. Oesterreich S, Weng CN, Qiu M, Hilsenbeck SG, Osborne CK, Fuqua SA (1993) The small heat shock protein hsp27 is correlated with growth and drug resistance in human breast cancer cell lines. Cancer Res 53:4443-4448

128. Panasenko OO, Kim MV, Marston SB, Gusev NB (2003) Interaction ofthe small heat shock protein with molecular mass 25 kDa (hsp25) with actin. Eur J Biochem 270:892-901

129. Panasenko OO, Seit Nebi A, Bukach OV, Marston SB, Gusev NB (2002) Structure and properties of avian small heat shock protein with molecular weight 25 kDa. Biochim Biophys Acta 1601:64-74

130. Pardee JD, Spudich JA (1982) Purification of muscle actin. Methods Enzymol 85 Pt B:164-181

131. Park CO, Xiao XII, Allen DG (1999) Changes in intracellular Na+ and pH in rat heart during ischemia: role ofNa+/H+ exchanger. Am J Physiol 276:H1581-1590

132. Pasta SY, Raman B, Ramakrishna T, Rao Ch M (2003) Role of the conserved SRLFDQFFG region of alpha-crystal 1 in, a small heat shock protein. Effect on oligomeric size, subunit exchange, and chaperone-like activity. J Biol Chem 278:51159-51166

133. Paul C, Arrigo AP (2000) Comparison of the protective activities generated by two survival proteins: Bcl-2 and Hsp27 in L929 murine fibroblasts exposed to menadione or staurosporine. Exp Gerontol 35:757-766

134. Paul C, Manero F, Gonin S, Kretz-Remy C, Virot S, Arrigo AP (2002) Hsp27 as a negative regulator of cytochrome С release. Mol Cell Biol 22:816-834158.159.160161162163.164165166167168169170

135. Perng MD, Wen SF, van den IP, Prescott AR, Quinlan RA (2004) Desmin aggregateformation by R120G alphaB-crystallin is caused by altered filament interactions and isdependent upon network status in cells. Mol Biol Cell 15:2335-2346

136. Peterson JJ, Young MM, Takemoto LJ (2004) Probing alpha-crystallin structure usingchemical cross-linkers and mass spectrometry. Mol Vis 10:857-866

137. Pichon S, Bryckaert M, Berrou E (2004) Control of actin dynamics by p38 MAPkinase Hsp27 distribution in the lamellipodium of smooth muscle cells. J Cell Sci117:2569-2577

138. Reimann EM, Walsh DA, Krebs EG (1971) Purification and properties of rabbit skeletal muscle adenosine 3',5'-monophosphate-dependent protein kinases. J Biol Chem 246:1986-1995

139. Renkawek K, de Jong WW, Merck KB, Frenken CW, van Workum FP, Bosman GJ (1992) alpha B-ciystallin is present in reactive glia in Creutzfeldt-Jakob disease. Acta Neuropathol (Berl) 83:324-327

140. Renkawek K, Stege GJ, Bosman GJ (1999) Dementia, gliosis and expression of the small heat shock proteins hsp27 and alpha B-ciystallin in Parkinson's disease. Neuroreport 10:2273-2276

141. Renkawek K, Voorter CE, Bosman GJ, van Workum FP, de Jong WW (1994) Expression of alpha B-crystallin in Alzheimer's disease. Acta Neuropathol (Berl) 87:155-160

142. Richards EH, Hickey E, Weber L, Master JR (1996) Effect of overexpression of the small heat shock protein HSP27 on the heat and drug sensitivities of human testis tumor cells. Cancer Res 56:2446-2451

143. Ross CA, Poirier MA (2004) Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nat Med 10 Suppl:S10-17

144. Roy D, Spector A (1976) Absence of low-molecular-weight alpha ciystallin in nuclear region of old human lenses. Proc Natl Acad Sci U S A 73:3484-3487

145. Sakamoto H, Mashima T, Yamamoto K, Tsuruo T (2002) Modulation of heat-shock protein 27 (Hsp27) anti-apoptotic activity by methylglyoxal modification. J Biol Chem 277:45770-45775

146. Salvador-Silva M, Ricard CS, Agapova OA, Yang P, Hernandez MR (2001) Expression of small heat shock proteins and intermediate filaments in the human optic nerve head astrocytes exposed to elevated hydrostatic pressure in vitro. J Neurosci Res 66:59-73

147. Sanger F (1953) A disulphide interchange reaction. Nature 171:1025-1026

148. Schafer C, Clapp P, Welsh MJ, Benndorf R, Williams JA (1999) HSP27 expression regulates CCK-induced changes of the actin cytoskeleton in CHO-CCK-A cells. Am J Physiol 277:C1032-1043

149. Schiene-Fischer C, Habazettl J, Schmid FX, Fischer G (2002) The hsp70 chaperone DnaK is a secondary amide peptide bond cis-trans isomerase. Nat Struct Biol 9:419424

150. Sehulze-OsthofT K, Krammer PI I, Droge W (1994) Divergent signalling via APO-1/Fas and the TNF receptor, two homologous molecules involved in physiological cell death. EmboJ 13:4587-4596

151. Shashidharamurthy R, Koteiehe HA, Dong J, McHaourab HS (2004) Mechanism of chaperone function in small heat-shock proteins. Dissociation of the Hsp27 oligomer is required for recognition and binding of destabilized T4 lysozyme. J Biol Chem

152. Shi Y (2002) Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis. Mol Cell 9:459-470

153. Spector NL, Ryan C, Samson W, Levine H, Nadler LM, Arrigo AP (1993) Heat shock protein is a unique marker of growth arrest during macrophage differentiation of HL-60 cells. J Cell Physiol 156:619-625

154. Stahl J, Wobus AM, Ihrig S, Lutsch G, Bielka H (1992) The small heat shock protein hsp25 is accumulated in PI9 embryonal carcinoma cells and embryonic stem cells of line BLC6 during differentiation. Differentiation 51:33-37

155. Stromer T, Ehrnsperger M, Gaestel M, Buchner J (2003) Analysis of the interaction of small heat shock proteins with unfolding proteins. J Biol Chem 278:18015-18021

156. Studer S, Narberhaus F (2000) Chaperone activity and homo- and hetero-oligomer formation of bacterial small heat shock proteins. J Biol Chem 275:37212-37218

157. Sun W, Van Montagu M, Verbruggen N (2002) Small heat shock proteins and stress tolerance in plants. Biochim Biophys Acta 1577:1-9

158. Sun X, Fontaine JM, Rest JS, Sheldcn EA, Welsh MJ, Benndorf R (2004) Interaction of human HSP22 (HSPB8) with other small heat shock proteins. J Biol Chem 279:2394-2402

159. Tang BS, Zhao GH, Luo W, Xia K, Cai F, Pan Q, Zhang RX, Zhang FF, Liu XM, Chen B, Zhang C, Shen L, Jiang H, Long ZG, Dai HP (2005) Small heat-shock protein 22 mutated in autosomal dominant Charcot-Marie-Tooth disease type 2L. Hum Genet 116:222-224

160. Taylor RP, Benjamin IJ (2005) Small heat shock proteins: a new classification scheme in mammals. J Mol Cell Cardiol 38:433-444

161. Tetu B, Lacasse B, Bouchard HL, Lagace R, Huot J, Landry J (1992) Prognostic influence of HSP-27 expression in malignant fibrous histiocytoma: a clinicopathological and immunohistochemical study. Cancer Res 52:2325-2328

162. Tezel G, Wax MB (2000) The mechanisms of hsp27 antibody-mediated apoptosis in retinal neuronal cells. J Neurosci 20:3552-3562

163. Theriault JR, Lambert H, Chavez-Zobel AT, Charest G, Lavigne P, Landry J (2004) Essential role of the NH2-terminal WD/EPF motif in the phosphorylation-activated protective function of mammalian Hsp27. J Biol Chem 279:23463-23471

164. Thomson JA, Augusteyn RC (1984) On the structure of alpha m-ciystallin. The reversibility of urea dissociation. J Biol Chem 259:4339-4345

165. Tolgyesi E, Bode CS, Smelleri L, Kim DR, Kim KK, Heremans K, Fidy J (2004) Pressure activation of the chaperone function of small heat shock proteins. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 50:361-369

166. Treweek TM, Rekas A, Lindner RA, Walker MJ, Aquilina JA, Robinson CV, Horwitz J, Der Perng M, Quinlan RA, Carver JA (2005) R120G alphaB-ciystallin promotes the unfolding of reduced alpha-lactalbumin and is inherently unstable. Febs J 272:711-724

167. Van Why SK, Mann AS, Ardito T, Thulin G, Ferris S, Macleod MA, Kashgarian M, Siegel NJ (2003) Hsp27 associates with actin and limits injury in energy depleted renal epithelia. J Am Soc Nephrol 14:98-106

168. Verschuure P, Tatard C, Boelens WC, Grongnct JF, David JC (2003) Expression of small heat shock proteins HspB2, HspB8, Hsp20 and cvllsp in different tissues of the perinatal developing pig. Eur J Cell Biol 82:523-530

169. Vicart P, Caron A, Guichcncy P, Li Z, Prevost MC, Faure A, Chateau D, Chapon F, Tome F, Dupret JM, Paulin D, Fardeau M (1998) A missense mutation in the alphaB-crystallin chaperone gene causes a desmin-related myopathy. Nat Genet 20:92-95

170. Vorotnikov AV, Shirinsky VP, Gusev NB (1988) Phosphorylation of smooth muscle caldesmon by three protein kinases: implication for domain mapping. FEBS Lett 236:321-324

171. WagstafT MJ, Collaco-Moraes Y, Smith J, de Belleroche JS, Coffin RS, Latchman DS (1999) Protection of neuronal cells from apoptosis by Hsp27 delivered with a herpes simplex virus-based vector. J Biol Chem 274:5061-5069

172. Wang К (2001) alpha-B- and alpha-A-crystallin prevent irreversible acidification-induced protein denaturation. Biochem Biophys Res Commun 287:642-647

173. Wang K, Spector A (2001) ATP causes small heat shock proteins to release denatured protein. Eur J Biochem 268:6335-6345

174. Wang K, Spector A (1994) The chaperone activity of bovine alpha crystallin. Interaction with other lens crystallins in native and denatured states. J Biol Chem 269:13601-13608

175. Wang L, Zajac A, Hedhli N, Depre С (2004) Increased expression of Hll kinase stimulates glycogen synthesis in the heart. Mol Cell Biochem 265:71-78

176. Wang X, Osinska H, Klevitsky R, Gerdes AM, Nieman M, Lorenz J, Hewett T, Robbins J (2001) Expression of R120G-alphaB-crystallin causes aberrant desmin and alphaB-ciystallin aggregation and cardiomyopathy in mice. Circ Res 89:84-91

177. Wieske M, Benndorf R, Behlke J, Dolling R, Grelle G, Bielka H, Lutsch G (2001) Defined sequence segments of the small heat shock proteins HSP25 and alphaB-crystallin inhibit actin polymerization. Eur J Biochem 268:2083-2090

178. Williams KL, Rahimtula M, Mearow KM (2005) Hsp27 and axonal growth in adult sensory neurons in vitro. BMC Neurosci 6:24

179. Yang X, Khosravi-Far R, Chang IIY, Baltimore D (1997) Daxx, a novel Fas-binding protein that activates JNK and apoptosis. Cell 89:1067-1076

180. Yang Y, Chen R, Zhou HM (1998) Comparison of inactivation and conformational changes of native and apo yeast alcohol dehydrogenase during thermal denaturation. Biochem Mol Biol Int 45:475-487

181. Yoshida K, Aki T, Harada K, Shama KM, Kamoda Y, Suzuki A, Ohno S (1999) Translocation of IISP27 and MKBP in ischemic heart. Cell Struct Funct 24:181-185

182. Zantema A, Verlaan-De Vries M, Maasdam D, Bol S, van der Eb A (1992) Heat shock protein 27 and alpha B-crystallin can form a complex, which dissociates by heat shock. J Biol Chem 267:12936-12941