Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура и свойства малого белка теплового шока с кажущейся молекулярной массой 20 кДа
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структура и свойства малого белка теплового шока с кажущейся молекулярной массой 20 кДа"

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова Биологический факультет

На правах рукописи

Букач Олеся Владимировна

Структура и свойства малого белка теплового шока с кажущейся молекулярной массой 20 кДа (Нвр20, НврВб).

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук профессор Н.Б.Гусев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Д.И. Левицкий

доктор биологических наук профессор Б.Н. Добров

Ведущая организация:

Институт экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса

Защита диссертации состоится 20 февраля 2006 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова по адресу 119992, Москва, Воробьевы горы, Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, аудитория ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 19 января 2006 г. Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

аообД

РЕШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Малые белки теплового шока (малые Шр) - широко распространенное в природе семейство белков-шаперонов, объединенных в одну группу благодаря наличию в их структуре высоко консервативной области, называемой кристаллиновым доменом. Этот домен располагается в С-концевой половине молекулы малых Шр и состоит из примерно 100 аминокислотных остатков. Большинство членов семейства малых Шр образуют крупные олигомерные комплексы, состоящие из 9-24 (и более) субъединиц. Считается, что основной функцией малых Шр является шаперонная активность, состоящая в защите клеток от накопления агрегатов поврежденных белков в условиях стресса. Связывая частично денатурированные белки-субстраты, малые Шр предотвращают их агрегацию, и могут передавать их шаперонам из других семейств, способным обеспечивать АТФ-зависимый рефолдинг [1].

В настоящее время в геноме человека обнаружено 10 генов, кодирующих малые Шр [2]. При этом только а-кристаллины и Шр27 охарактеризованы достаточно подробно, а структура и функции остальных представителей этого семейства остаются практически неизученными. Различные малые Шр являются субстратами для многочисленных протеинкиназ, активируемых в ответ на разнообразные гормональные сигналы или неблагоприятные условия. При этом фосфорилирование может влиять на шаперонную активность, олигомерное состояние и другие свойства малых Шр. Сходство первичных структур малых Шр делает возможным образование не только гомо-, но и гетероолигомерных комплексов, в состав которых входят субъединицы малых Шр, относящихся к разным типам. Тот факт, что в одной клетке может синтезироваться несколько типов малых Шр, а также то, что они фосфорилируются разными протеинкиназами, свидетельствует в пользу

Список сокращений: АДГ - алкогольдегидрогеназа; ДГТ - дитиотреитол; ДСН -додецилсульфат натрия; ПААГ - полиакриаламидный гель; ЭДТА этилендиаминтетраацетат; F-актин - фибриллярный актин; G-актин - глобулярный актин, Hsp20 - малый белок теплового шока с кажущейся молекулярной массой 20 кДа; Hsp20D, S16D мутант - Hsp20 с заменой Serió на Asp, имитирующей фосфорилирование Hsp20 под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ; Hsp27 - малый белок теплового шока с кажущейся молекулярной массой 27 кДа; Hsp27_3D - "т?7 с ущптящ SerlS. 78 и 82 на остатки Asp, имитирующими фосфорилирование Hsp27 MA НЮС/ЗЫДОИФНКЛЧДОДЯ }

БИБЛИОТЕКА. J Cflmi

О»

tgajg;

того, что помимо основной функции - шаперонной активности, малые Нвр могут выполнять и какие-то другие, специфические для каждого члена семейства, функции.

Объектом нашего исследования являлся малый белок теплового шока с кажущейся молекулярной массой 20 кДа (Няр20). Этот белок был обнаружен во многих тканях человека, при этом наибольшее содержание НБр20 характерно для мышц различных типов. На данный момент накоплено большое количество экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что Нвр20 способен регулировать расслабление гладкой мускулатуры [3,4], предотвращать апоптоз кардиомиоцитов [5], участвовать в инсулин-зависимом транспорте глюкозы в скелетные мышцы [6] и регулировать агрегацию тромбоцитов [7]. Было установлено, что Шр20 может подвергаться фосфорилированию под действием нескольких различных протеинкиназ [8-10]. Считается, что фосфорилирование Нэр20 циклонуклеотид-зависимыми протеинкиназами играет важную роль в регуляции расслабления гладких мышц [3,4]. В то же время, как это ни парадоксально, в литературе существовали только отрывочные данные о физико-химических свойствах и олигомерном состоянии Нвр20, а также о его способности к образованию гетероолигомерных комплексов с другими малыми Няр. Также малопонятным оставался вопрос о том, каким образом Няр20 взаимодействует с сократительным аппаратом и участвует в регуляции расслабления гладких мышц и какую роль играет фосфорилирование в этом процессе.

Целью данной работы был анализ структуры и свойств Шр20 и изучение его взаимодействия с актином и актин-связывающими белками. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод выделения немодифицированного рекомбинантного НБр20 человека без применения денатурирующих реагентов.

2. Определить шаперонную активность и олигомерное состояние Нвр20 и исследовать факторы, влияющие на эти свойства.

3. Проанализировать возможность образования гетероолигомерных комплексов между Нвр20 и Нзр27.

4. Проанализировать способность Нвр20 к взаимодействию с актином и некоторыми актин-связывающими белками.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Разработан метод выделения в нативных условиях рекомбинантного Hsp20 человека. Данный метод также позволяет получать высокоочшценные препараты мутанта Hsp20 с заменой Serió на аспарагиновую кислоту (S16D), имитирующей фосфорилирование Hsp20 под действием циклону клеотид-зависимых протеинкиназ. Установлено, что в отличие от большинства других малых белков теплового шока, Hsp20 и его S16D мутант преимущественно представлены малыми олигомерами с кажущимися молекулярными массами 54-58 кДа и коэффициентами седиментации 22,9 S.

Hsp20 дикого типа эффективно препятствует агрегации инсулина, вызванной восстановлением дисульфидных связей, и агрегации алкогольдегидрогеназы, вызванной повышением температуры. Мутация, имитирующая фосфорилирование Hsp20 по остатку Serió, приводит к значительному снижению шаперонной активности этого белка. Понижение рН от 7,0 до 6,0 сопровождается значительным уменьшением шаперонной активности Hsp20, что может быть связано с частичной диссоциацией и денатурацией этого белка.

Hsp20 и Hsp27 дикого типа образуют гетероолигомерные комплексы с кажущимися молекулярными массами 100 и 300 кДа. Стехиометрия Hsp20/Hsp27 в составе таких комплексов близка к единице. Мутант Hsp27 с заменами Serl5, 78 и 82 на остатки Asp, имитирующими фосфорилирование Hsp27 под действием МАРКАР2/3 киназы, образует с Hsp20 единственный тип гетероолигомерных комплексов с кажущейся молекулярной массой 100 кДа, в котором стехиометрия Hsp20/Hsp27 близка к единице.

Установлено, что Hsp20 не влияет на скорость и степень полимеризации актина и не способен взаимодействовать с полимерным актином или актином, содержащим тропомиозин, калыганин или а-актинин, а также F-актином, входящим в состав миофибрилл скелетной, сердечной и гладкой мускулатуры. Фосфорилирование Serió Hsp20 под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы или мутация, имитирующая фосфорилирование этого остатка, не влияют на способность Hsp20 к взаимодействию с изолированным F-актином или с F-актином в комплексе с некоторыми акгин-связывающими белками или актином в составе миофибрилл.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Ш Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на 31-ой конференции Европейского общества по исследованию мышц (Люнтерен, 2002), на международной конференции «Biological Motility» (Пущино, 2004) и на 48-ой конференции биофизического общества США (Балтимор, 2004).

Публикации. По материалам исследования опубликовано 9 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на_страницах и состоит из

введения, обзора литературы, описания использованных методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 4 таблицы и 30 рисунков. Список литературы включает 200 литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Методы выделения белков. Hsp20 дикого типа или его S16D мутант экспрессировали в клетках Е. coli штама BL21(DE3) (Novagen). Клетки разрушали в ультразвуковом дезинтеграторе. Очистку белков проводили при помощи фракционирования сульфатом аммония, ионообменной хроматографии на Q-Sepharose и гидрофобной хроматографии на Phenyl-Sepharose. Hsp27 и его 3D мутант (S15,78,82D) выделяли по методу, описанному ранее [И]. Автор глубоко благодарен к.б.н. А.С. Сейт-Неби за конструирование плазмид, несущих полноразмерные копии кДНК Hsp20, Hsp27 или их точечных мутантов. Актин выделяли из ацетонового порошка из мышц кролика [12].

Определение имперонной активности. О шаперонной активности Hsp20 дикого типа или его S16D мутанта судили по их способности предотвращать агрегацию инсулина, вызванную восстановлением дисульфидных связей [13, 14]. Для изучения влияния рН на шаперонную активность Hsp20 в качестве белка-субстрата использовали алкогольдегирогеназу (АДГ), агрегацию которой вызывали повышением температуры [15]. За ходом агрегации следили по увеличению оптической плотности при 360 нм на спектрофотометре UltroSpec 3100 Pro (Amersham), либо по осаждению агрегированных белков при низкоскоростном центрифугировании.

Определение олигомерного состояния Hsp20 проводили методом гель-фильтрации на колонке Superdex 200 и методом неравновесного аналитического ультрацентрифугирования.

Образование гетероолигомерных комплексов между Hsp20 и Hsp27 человека. Рекомбинантные Hsp20 и Hsp27 или их мутанты, с заменами, имитирующими фосфорилирование, смешивали в эквимолярных количествах, инкубировали различные промежутки времени (0-21 час) при различных температурах (18-37°С). Полученные пробы подвергали гель-фильтрации на колонке Superdex 200 и анализировали белковый состав полученных фракций методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН.

Влияние Hsp20 на полимеризацию актина определяли по увеличению флуоресценции, сопровождающему полимеризацию актина, меченого пиренил-иодацетамидом (автор благодарен к.б.н. М.В. Ким за помощь в проведении этих экспериментов) или методом ультрацентрифугирования.

Взамодействие Hsp20 с F-актином или комплексами F-актина с актин-связывающими белками изучали при помощи метода ультрацентрифугирования с последующим количественным определением белка методом электрофореза в ПААГ в присутсвии ДСН.

Взаимодействие Hsp20 с миофибриллами. Миофибриллы скелетной и сердечной мускулатуры человека и гладкой мускулатуры птиц выделяли по методу, описанному ранее [16]. Взаимодействие Hsp20 с миофибриллами изучали по соосаждению этого белка с миофибриллами при низкоскоростном центрифугировании.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Структура и свойства Hsp20.

Шаперонная активность и олигомерное состояние Hsp20. Как уже отмечалось, шаперонная активность, состоящая в способности предотвращать агрегацию денатурированных белков, считается основной функцией малых Hsp. Шаперонная активность Hsp20 in vitro была определена в единственной работе ван де Клундерта и соавт. [13]. Авторами этого исследования было установлено, что рекомбинантный Hsp20 крысы обладает значительно меньшей шаперонной активностью, чем а-

кристаллин и практически не способен предотвращать агрегацию денатурированных белков [13]. Следует заметить, что в ходе выделения рекомбинантного Нвр20 крысы были использованы довольно жесткие условия (применялись растворы с высокой концентрацией мочевины и детергентами), что могло сказаться на свойствах этого белка. В связи с этим нам представлялось целесообразным разработать новый метод получения Нзр20, в котором можно было бы избежать применения денатурирующих соединений.

Известно, что Нзр20 может подвергаться фосфорилированию под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ по остатку 8ег16 [9]. Для таких малых Нвр как а-кристаллины и Нвр27 установлено, что фосфорилирование этих белков

сопровождается изменениями олигомерного состояния и шаперонной активности [17,18]. Однако, для №р20 подобных исследований проведено не было.

В начале нашего исследования мы разработали простой и эффективный метод выделения рекомбинантного Нкр20 человека, состоящий в комбинации методов ионообменной и гидрофобной хроматографии. Данный метод также позволял получать высокоочшценные препараты Нвр20 с мутацией 816Б, имитирующей фосфорилирование этого белка под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ. При этом полученные белки не содержали каких-либо модификаций (полигистидиновых

«хвостов» или иных специальных меток) и в ходе выделения не использовались детергенты или денатурирующие соединения.

О 0,4

5 10 15 20 25 Время, мин

Рис. 1. Сравнение шаперонной активности Шр20\УТ (А), №р2(Ш (Б) и а-кристяллина (В) с использованием инсулина (0.25 мг/мл) в качестве субстрата. Эксперименты проводили в отсутствие (1) или в присутствии 0,06 (2), 0,12 (3) или 0,25 мг/мл (4) малых Нзр.

Получив гомогенные препараты Hsp20 дикого типа (Hsp20WT) и его S16D мутанта (Hsp20D), мы приступили к исследованию их шаперонной активности. В качестве белка-субстрата нами был использован инсулин. Восстановление дисульфидных связей в этом белке приводит к агрегации его В-цепи [14]. Внесение ДТТ в пробу, содержащую инсулин, сопровождается увеличением светорассеяния раствора, о котором судили по увеличению оптической плотности при 360 нм (рис. 1А-В, кривые 1). Присутствие в пробах увеличивающихся количеств Hsp20WT приводило к уменьшению амплитуды светорассеяния и удлинению лаг-фазы агрегации инсулина (рис. 1А, кривые 2-4). При весовом соотношении Hsp20WT:imcy>niH, равном 1:1, агрегация белка-субстрата практически полностью предотвращалась (рис. 1А, кривая 4). Мутация, имитирующая фосфорилирование Serió Hsp20, приводила к значительному уменьшению шаперонной активности исследуемого белка (рис. 1Б, кривые 2-4). Коммерческий препарат а-кристаллина (Sigma) обладал шаперонной активностью, сравнимой с таковой для Hsp20D (рис. 1В, кривые 2-4). Таким образом, мы установили, что рекомбинантный Hsp20 человека в отличие от рекомбинантного Hsp20 крысы [13] обладает значительной шаперонной активностью. Мутация, имитирующая фосфорилирование Serió, приводит к заметному уменьшению этой активности, однако она остается сравнимой с шаперонной активностью а-кристаллина.

Различие в шаперонной активности могло быть следствием различного олигомерного состояния Hsp20. Для исследования олигомерного состояния Hsp20 и его S16D мутанта мы воспользовались методом гель-фильтрации. Оказалось что, и белок дикого типа, и его S16D мутант элюируются с колонки Superdex 200 в виде единственных симметричных пиков с кажущимися молекулярными массами 54 кДа (рис. 2). Этот результат оказался довольно неожиданным, поскольку кажущаяся молекулярная масса Hsp20,

Рис. 2. Влияние мутации, имитирующей фосфорилирование Serl6, на олигомерное состояние Hsp20. На колонку Superdex 200 наносили 150 мкл препаратов Hsp20WT (1) или Hsp20D (2) с концентрацией 0,6 мг/мл.

определенная методом гель-фильтрации, заметно больше молекулярной массы мономера, рассчитанной по аминокислотному составу (16,8 кДа), и в то же время заметно меньше молекулярной массы крупных олигомеров (300-1000 кДа), образование которых характерно для большинства малых Няр.

Для более подробного исследования олигомерного состояния Шр20 мы использовали метод ультрацентрифугирования. Учитывая тот факт, что для многих малых белков теплового шока характерно концентрационно-зависимое равновесие между различными олигомерными формами, мы проводили опыты по ультрацентрифугированию при двух концентрациях исследуемого белка (0,7 и 2,3 мг/мл). При низкой концентрации белка (0,7 мг/мл) как Hsp20WT (рис. ЗА, кривая 1), так и Н$р200 (рис. ЗА, кривая 2) седиментировались в виде достаточно симметричных пиков с константами седиментации 2,2 и 1,9 Э. Увеличение концентрации белка до 2,3 мг/мл сопровождалось некоторым увеличением коэффициента седиментации основного пика (до 2,9 в для Н8р20\^Т и до 2,5 Б для Н8р20й) (рис. ЗБ). Помимо этого, на седиментограмме белка дикого типа обнаруживались два новых, меньших по амплитуде пика с коэффициентами седиментации 6,0 и 8,8 в (рис. ЗБ, кривая 1).

Для сферических частиц коэффициент седиментации (в) связан с молекулярной массой (М) следующим эмпирическим уравнением:

Ь^(М)=1,5*к^(8)+3,82. Если это уравнение применимо для Нвр20, то оказывается, что при низкой концентрации Нзр20 дикого типа и его 816Б мутант мигрируют при ультрацентрифугировании как частицы с молекулярными массами 21 и 17 кДа. Таким образом, определенная в этих условиях кажущаяся молекулярная масса Нзр20 сопоставима с молекулярной массой, рассчитанной по

хл.

и

0,6

0,4

0,2

0,0

0,8 0,6 0,4 0,2 0,0-

0 2 4 6 8 10 12 Коэффициент седиментации (Я)

Рис. 3. Седиментация №р20 дикого типа (1) и его 8160 мутанта (2) при концентрации белка, равной 0,7 (А) или 2,3 (Б) мг/мл.

аминокислотному составу (16,8 кДа). При более высокой концентрации белка Нзр20 и его 8160 мутант седимвотируются в основном в виде частиц с кажущимися молекулярными массами 32,6 и 26,1 кДа, по всей видимости, являющихся димерами. Кроме того, при высокой концентрации белка только в препаратах Нвр20 дикого типа удается выявить крупные олигомеры с молекулярными массами 97 и 173 кДа.

Таким образом, Шр20 и его 8160 мутант могут быть представлены олигомерами различного размера, и повышение концентрации белка сопровождается увеличением размеров образующихся олигомеров. При этом точечная мутация Б160 уменьшает вероятность образования крупных олигомеров. Молекулярные массы, определенные методом ультрацентрифугирования, довольно заметно отличаются от молекулярных масс, определенных методом гель-фильтрации. Это несоответствие может быть связано с тем, что форма мономеров или олигомеров №р20 может довольно сильно отличаться от сферической. Другой возможной причиной различий данных, полученных двумя методами, может являться диссоциация олигомеров, которая, согласно данным последних лет, может происходить при ультрацентрифугировании и приводить образованию меньших олигомеров или даже мономеров малых Нвр [19]. Это предположение потребует дополнительных исследований, однако уже сейчас можно утверждать, что, в отличие от большинства малых белков теплового шока, Нвр20 представлен в основном небольшими по размеру олигомерами. Размер олигомеров Н«р20 зависит от концентрации белка при этом мутация, имитирующая фосфорилирование Нвр20 под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ, сдвигает равновесие между олигомерными формами белка в сторону меньших по размеру олигомеров.

Влияние рН на олигомерное состояние и шаперонную активность Н.чр20. Как уже отмечалось, малые белки теплового шока участвуют в защите клетки от различных неблагоприятных условий. Ишемия с последующей реперфузией сердца может сопровождаться значительным (до 1,5 единиц) уменьшением внутриклеточного рН [20], а оверэкспрессия Шр20 способствует защите кардиомиоцитов от последствий ацидоза [21]. Защитная роль других малых Нэр - а-кристаллина и НБр25 была обнаружена и при длительных сокращениях скелетной мышцы, которые также сопровождаются повреждениями клеток и снижением внутриклеточного рН [22,23]. Учитывая тот факт, что Нзр20 в больших количествах

синтезируется в сердечной и скелетной мускулатуре, нам казалось целесообразным исследовать влияние рН на шаперонную активность и олигомерное состояние этого белка.

В качестве белка-субстрата для измерения шаперонной активности при разных значениях рН нами была выбрана алкогольдегидрогеназа (АДГ) дрожжей. Выбор был обусловлен тем, что удаление ионов двухвалентных металлов и повышение температуры приводит к денатурации и агрегации этого белка и при нейтральных, и при кислых значениях рН. Прогревание изолированной АДГ при 42°С в присутствии ЭДТА и ДТТ и при рН 7,0, и при рН 6,0 сопровождалось ее агрегацией (рис. 4А и Б, кривые 1). При нейтральном значении рН добавление в пробы нарастающих количеств Hsp20WT приводило к удлинению лаг-фазы и уменьшению амплитуды светорассеяния (рис. 4А, кривые 2-5). При весовом отношении АДГ:Нзр20\ОТ, равном 1:1 (рис. 4А, кривая 5), агрегация АДГ предотвращалась полностью. Совершенно иная картина наблюдалась при уменьшении рН до 6,0 (рис. 4Б). В данном случае внесение в пробы увеличивающихся количеств Няр20\УТ (рис. 4Б, кривые 2-5) приводило не к уменьшению, а к увеличению амплитуды светорассеяния, хотя изолированный Hsp20WT не подвергался агрегации (рис. 4Б, кривая 6).

Для того чтобы объяснить эти данные, мы воспользовались методом низкоскоростного центрифугирования. Агрегацию АДГ инициировали добавлением ДТТ и ЭДТА, инкубировали пробы различные промежутки времени при 42°С, центрифугировали их при 14000 д в течение 10 минут, после чего оценивали

количество белка-субстрата и Шр20 в осадках и супернатантах при помощи электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН. При обоих значениях рН прогревание изолированной АДГ

сопровождается образованием довольно крупных агрегатов, и уже после 20 минут инкубации значительная часть

Рис. 4. Шапероннаа активность Шр20\УТ при рН 7,0 (А) ■ рН 6,0 (Б). 1 - агрегация изолированной АДГ при рН 7,0 (0,26 мг/мл) и рН 6,0 (0,15 мг/мл). 2-5 - агрегация АДГ в присутствии Нвр20 при весовом соотношении АДГ:Нвр20, равном 10:1 (2), 5:1 (3), 2:1 (4) и 1:1 (5). 6 - отсутствие агрегации изолированного Нвр20 при рН 6,0.

этого белка обнаруживается в осадке, а после 60 минут инкубации практически вся АДГ переходит в осадок (рис. 5А и Б, кривые 1). При рН 7,0 внесение в пробы Нзр20\¥Т при весовом отношении АДГ:Н8р20'\\ГГ, равном 1:1, приводило к значительному уменьшению количества АДГ в осадке (рис. 5А, кривая 2). При рН 6,0 Нвр20 не был способен предотвращать агрегацию денатурированного белка-субстрата, и количество АДГ в осадке в присутствии (рис. 5Б, кривая 2) и в отсутствие №р20 (рис. 5Б, кривая 1) практически не отличалось. Таким образом, результаты, полученные методами светорассеяния и низкоскоростного центрифугирования, хорошо согласуются между собой и свидетельствуют о том, что при уменьшении рН от 7,0 до 6,0 шаперонная активность Нвр20 значительно снижается.

Уменьшение шаперонной активности при переходе от рН 7,0 к рН 6,0 может быть связано с тем, что при уменьшении рН Нвр20 перестает связывать денатурированный белок-субстрат, или с тем, что при закислении среды он взаимодействует с АДГ, однако по каким-то причинам перестает препятствовать ее агрегации. Для того чтобы ответить на этот вопрос, мы определяли количество Нвр20 в осадках, образующихся в этих условиях. Как видно из данных, представленных на рис. 5В, изолированный Нвр20 практически полностью остается в супернатанте и при нейтральных и при кислых значениях рН (рис. 5В, кривые 3 и 4). Аналогичные результаты были получены при прогревании Нвр20 в присутствии АДГ при рН 7,0

(рис. 5В, кривая 2).

1 В то же время при

2

рН 6,0 в

0

20 40 60 Время, мин

0 20 40 60 Время, мин

присутствии белка-субстрата значительная часть

КО 20 40 60 Время, мин

Рис. 5. Влияние рН на шаперонную активность Н»р20. А.Б Агрегация изолированной АДГ (1) или АДГ в присутствии Нзр20 (2) (весовое отношении АДГ:Н8р20, равное 1:1) при рН 7,0 (А) или при рН 6,0 (Б). Концентрация АДГ составляла при 0,26 мг/мл рН 7,0 и 0,15 мг/мл при рН 6,0. В. Соосаждение Нзр20 с агрегированной АДГ (1) - при рН 7,0, (2) - при рН 6,0, Отсутствие агрегации изолированного Нзр20 при рН 7,0 (3) и при рН 6,0 (4).

Нвр20 переходила в осадок (рис. 5В, кривая 1). Эти данные свидетельствуют о том, что при рН 6,0 Нзр20 взаимодействует с денатурированным белком-субстратом, однако утрачивает способность предотвращать его агрегацию.

Такой эффект может быть связан с изменением структуры или олигомерного состояния Нзр20 при уменьшении рН. Для проверки этого предположения мы проводили гель-фильтрацию образцов Няр20 при разных значениях рН (рис. 6). При рН 7,5 и 7,0 белок элюировался с колонки в виде достаточно симметричных пиков с кажущимися молекулярными массами 51-53 кДа. Уменьшение рН до 6,5 приводило к уменьшению кажущейся молекулярной массы Нэр20 до 46 кДа, при этом пик становился асимметричным и его амплитуда уменьшалась. Такие изменения могут свидетельствовать либо об изменении гидродинамических свойств белка, связанных с изменением его структуры (например, более плотной упаковкой), или с частичной диссоциацией, при которой олигомеры разного размера находятся в равновесии. При рН 6,0 на профиле элюции обнаруживались два пика с кажущимися молекулярными массами 47 и 30 кДа, что, по всей видимости, свидетельствует о диссоциации олигомеров Нэр20. При рН 5,5 пик более крупных олигомеров полностью исчезал, а кажущаяся молекулярная масса белков, элюирующихся во втором пике, уменьшалась до 22 кДа. Помимо этого, уменьшение рН от 7,5 до 5,5 сопровождалось уменьшением суммарной площади белковых пиков. Вероятно, это связано с тем, что малые олигомеры (или мономеры) Н8р20, образовавшиеся в результате диссоциации, вызванной закислением среды, обладают меньшей стабильностью и проявляют склонность к агрегации. Такие крупные агрегаты могут выпадать в осадок в верхней

0

1-1-1-.-1-.-1-,-г

части колонки, что и приводит к уменьшению суммарной площади белковых пиков. Сопоставляя эти результаты с данными о шаперонной активности при различных значениях рН, можно предположить, что меньшие по размеру олигомеры Нзр20,

12 13 14 15 16 17 18 Объем элюции, мл

образовавшиеся в результате диссоциации, вызванной уменьшением рН, хотя и взаимодействуют с

Рис. б. Влияние рН на олигомерное состояние Шр20\УТ.

денатурированным белком-субстратом, однако не способны препятствовать его агрегации.

Образование гетероолигомерных комплексов меяеду Няр20 и Н$р27.

Данные литературы свидетельствуют о том, что малые белки теплового шока способны к образованию гетероолигомерных комплексов, в состав которых входят субъединицы малых Нзр, принадлежащие различным группам этих белков. Для Нвр20 было показано, что этот белок способен взаимодействовать с Нзр27 и осВ-кристаллином. Эти данные были получены либо при помощи метода дигибридного скрещивания [24], либо при гель-фильтрации грубого тканевого экстракта [17,25]. К сожалению, первый метод не дает информации о свойствах и стехиометрии образующихся гетероолигомерных комплексов, а при использовании второго метода нельзя полностью исключить возможности взаимодействия с другими белками. Известно, что и НБр20, и Нэр27 могут подвергаться фосфорилированию, которое в свою очередь влияет на свойства этих белков. Однако данные о влиянии фосфорилирования на структуру гетероолигомерных комплексов в литературе отсутствовали. Поэтому нам представлялось целесообразным исследовать возможность взаимодействия между очищенными препаратами Нэр20 и Нзр27 дикого типа, а также их мутантов, с заменами, имитирующими

фосфорилирование. Для решения этой задачи мы смешивали эквимолярные количества Нэр20 и №р27 (дикого типа или их мутантов), инкубировали смесь различные промежутки времени при разных температурах, после чего проводили гель-фильтрацию на колонке Бирегбех 200. Изолированные Нзр20>¥Т и Нвр27А\гГ элюируются с колонки в виде одиночных пиков с кажущимися молекулярными массами 56 и 560

Объем элюции, мл

Рис. 7. Образование гетероолигомерных комплексов между Н>р27МТ и Н»р20\УТ. На

колонку 5ирегёех200 наносили эквимолярную смесь Нзр27\\Т и Нвр20\УТ без инкубации (1) или после инкубации в течение 15 ч. при 18°С (2), 3 ч. при 30°С (3) или 3 ч. при 37°С (4). Вертикальными линиями отмечено положение пиков изолированных Нвр27\УТ и Нвр2<т.

кДа, соответственно. При нанесении на колонку эквимолярной смеси этих белков без предварительной инкубации на хромагограмме обнаруживались два пика с объемами элюции, точно соответствующими таковым для изолированных белков (рис. 7, кривая 1). Длительная инкубация (15 часов) смеси Hsp20WT и Нвр27'\УТ при комнатной температуре не приводила к значительным изменениям профиля элюции (рис. 7, кривая 2). Если смесь этих белков инкубировали 3 часа при 30°С (рис. 7, кривая 3), то наблюдалось уменьшение амплитуды пика, соответствующего Н8р27\\НГ, и уменьшение его кажущейся молекулярной массы от 560 до 475 кДа. Положение и амплитуда пика Нвр20\УТ менялась в меньшей степени, однако на хроматограмме обнаруживался дополнительный пик с кажущейся молекулярной массой 90 кДа. После инкубации смеси 1Ьр20\УТ и Н$р27\УТ в течение 3 часов при 37°С обнаруживались еще большие изменения в профиле элюции (рис. 7, кривая 4). В этом случае полностью исчезали пики, соответствующие изолированным белкам, и появлялись новые пики с кажущимися молекулярными массами 295 и 100 кДа. По данным электрофореза оба этих пика содержали в своем составе примерно равное количество Н$р20^Г и Шр27^Г (данные не представлены). Полученные результаты свидетельствуют о том, что Нвр20\УТ и Н8р27\\НГ способны образовывать между

собой два типа олигомерных комплексов с кажущимися молекулярными массами около 100 и 300 кДа, в состав которых входит примерно равное количество мономеров этих белков. По всей видимости, данные гетероолигомеры достаточно стабильны, поскольку более длительная инкубация (до 21 часа) при 37°С не приводила к значительным изменениям в размерах и составе этих комплексов. Мутация, имитирующая фосфорилирование №р20 по остатку Бег 16, практически не влияла на скорость образования, размер и состав гетероолиго м ерных комплексов,

150-

100

а

1 11 \ \ Л ' \ \ » \ » \ » \ \ ч \ ; ^.......1

// / 1 -IV

10 12 14 16 18

Объем эопадш, мл

Рис.8. Образование гетероолигомерных комплексов между Шр27_30 и Шр20\\Т.

Профили элюции препаратов Нзр27_30 (1), Hsp20WT (2) и математическая сумма этих профилей (3). Гель-фильтрация эквимолярной смеси этих белков, нанесенной без инкубации (4) или инкубированной 3 ч. при 30°С (5). Вертикальными линиями отмечено положение пиков изолированных Нкр27 30 и Н«р20ЧУТ.

образуемых Hsp20 и Hsp27WT.

Из данных литературы известно, что Hsp27 может фосфорилироваться по остаткам Serl5, 78 и 81 под действием МАРКАР2/3-киназы. Фосфорилирование (или мутации его имитирующие) приводят к диссоциации крупных олигомерных комплексов Hsp27. Действительно, как видно из данных, представленных на рис. 8, Hsp27 с заменами Serl5, 78 и 82 на остатки аспарагиновой кислоты (Hsp27_3D), элюируется с колонки в виде единственного пика с кажущейся молекулярной массой 105 кДа (рис. 8, кривая 1). Если на колонку наносили эквимолярную смесь Hsp27_3D и Hsp20WT, не подвергавшуюся инкубации, то на профиле элюции обнаруживался единственный асимметричный пик с кажущейся молекулярной массой около 98 кДа (рис. 8, кривая 4). Небольшое плечо этого пика находилось в области молекулярных масс, близких к кажущейся молекулярной массе Hsp20. При сравнении полученного профиля с арифметической суммой профилей элюции изолированных Hsp20WT и Hsp27_3D (рис. 8, кривая 3), обнаруживаются некоторые отличия, которые могут свидетельствовать о том, что Hsp20 способен образовывать гетероолигомерные комплексы с Hsp27_3D даже без предварительной инкубации, т.е. быстрее, нежели с Hsp27 дикого типа. В том случае, если смесь Hsp20WT и Hsp27_3D подвергали инкубации в течение 3 часов при 30°С, то пик гетероолигомеров становился более симметричным, возрастала его амплитуда и уменьшалась ширина (рис. 8, кривая 5). По данным электрофореза в ПААГ, фракции этого пика содержали примерно равные количества Hsp20WT и Hsp27_3D. Аналогичные результаты были получены и в экспериментах с S16D мутантом Hsp20 (данные не представлены).

Суммируя результаты, представленные в этом разделе, можно заключить, что Hsp20 и Hsp27 способны образовывать гетероолигомерные комплексы двух типов с кажущимися молекулярными массами 100 и 300 кДа. Размер и скорость образования таких комплексов зависят от мутаций, имитирующих фосфорилирование Hsp27 по остаткам Serl5, 78 и 82, и практически не зависят от мутации, имитирующей фосфорилирование Hsp20 по остатку Serl6. Стехиометрия Hsp20/Hsp27 в составе таких комплексов близка к единице.

Взаимодействие №р20 и актива.

В настоящее время в литературе накоплен богатый фактический материал, свидетельствующий о том, что фосфорилирование НБр20 по остатку 8ег16 под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ коррелирует с расслаблением гладких мышц. Детальный механизм действия Нвр20 остается непонятным, при этом высказываются две противоречащих друг другу гипотезы. Согласно К. Брофи и соавт. [26,27], нефосфорилированный Нвр20 взаимодействует с Р-актином и стабилизирует его прикрепление к мембране и плотным тельцам, содержащим а-актинин. Фосфорилирование №р20 ослабляет его взаимодействие с фибриллярным актином и приводит к нарушению контактов с плотными тельцами и мембраной, следствием чего является расслабление гладких мышц. По предположению других авторов фосфорилирование приводит к переходу Н5р20 из цитозоля на актиновые филаменты, где фосфорилированный Нвр20, подобно тропонину I, ингибирует взаимодействие актина с миозином, вызывая расслабление [4]. Таким образом, эти две диаметрально противоположные гипотезы сходятся только в том, что Н8р20 является актин-связывающим белком и его фосфорилирование необходимо для изменения структуры актиновых фияаментов или их способности к участию в формировании цитоскелета клетки. Если это предположение является верным, то можно ожидать, что Нвр20 будет каким-то образом влиять на структуру и свойства актиновых филаментов.

Один из возможных механизмов может быть связан с влиянием Нзр20 на процесс полимеризации актина. Для проверки этого предположения мы исследовали влияние Няр20 на скорость полимеризации актина, меченого пиренил-иодацетамидом. Полимеризация модифицированного актина сопровождается изменением окружения флуоресцентной метки, следствием чего является значительное увеличение флуоресценции (рис. 9А, кривая 1). Добавление даже двукратного молярного избытка Нзр20 (рис. 9А, кривая 2) или его 816Б мутанта (рис. 9А, кривая 3) к в-актину до начала полимеризации не приводило к изменениям в кинетике полимеризации, длительности лаг-периода или максимальной амплитуды флуоресценции. Эти данные свидетельствуют о том, что в выбранных условиях Нвр20 и его мутант, с заменой, имитирующей фосфорилирование под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ, не влияют на скорость полимеризации актина.

Метод флуоресцентной спектроскопии не позволяет надежно оценить конечную степень полимеризации актина, поэтому для того чтобы проанализировать влияние ЙЬр20 и его мутанта (Нвр2(Ю) на степень полимеризации актина мы воспользовались методом ультрацентрифугирования. Для этого О-актин полимеризовали в присутствии увеличивающихся концентраций Нзр20\УТ или Нвр2(Ю. Полученные пробы подвергали ультрацентрифугированию, после чего оценивали количество актина в осадках и супернатантах (рис. 9Б). Как видно из представленных данных, даже при пятикратном молярном избытке Нвр20\УТ (или Нзр2(Ю) над актином, количество полимеризованного актина оставалось неизменным по сравнению с пробами, не содержащими Нвр20. Таким образом, можно заключить, что ни Нвр20 дикого типа, ни его 8160 мутант не влияют на скорость и степень полимеризации актина.

Отсутствие влияния Нзр20 на полимеризацию актина не означает, что Няр20 не способен взаимодействовать с актином. К тому же большая часть актина в клетке находится в составе актиновых филаментов, которые помимо актина включают в себя разнообразные акгин-связывающие белки. Можно предположить, что влияние Нвр20 на расслабление гладкой мускулатуры может быть опосредовано одним или несколькими из них. Для проверки этого предположения мы воспользовались методом ультрацентрифугирования и исследовали возможность взаимодействия

Рис. 9. Влияние Н>р20 на скорость и степень полимеризации актина. (А) Влияние Шр20 и его 51№ мутанта на скорость полимеризации актина оценивали методом флуоресценции. Актин (4 цМ), меченый >Ц1-ииренил)йодацетамидом (10% меченого актина) полимеризовали в отсутствие (кривая 1) Нзр20 или в присутствии Нзр2(ЖТ (8 цМ) (кривая 2) или Нзр2(Ю (8 цМ) (кривая 3). (Б) Влияние Шр20 на степень полимеризации оценивали методом ультрацентрифугирования. Актин (5 цМ) полимеризовали в присутствии увеличивающихся концентраций Н5р20)\Т (кривые 1 и 2) или Нвр2(Ф (кривые 3 и 4). После ультрацентрифугирования определяли количество актина в осадках (кривые 2 и 4) и супернатантах (кривые 1 и 3) при помоши вО&злектрофореза.

Hsp20WT и НБр2(Ю с изолированным Р-актином и комплексами Р-актина с некоторыми актин-связываюгцими белками, играющими важную роль в регуляции гладкомышечного сокращения (тропомиозин и кальпонин) и прикреплении актиновых филаментов к плотным тельцам и мембране клеток (а-актинин).

После ультрацентрифугирования большая часть полимеризованного актина оказывается в осадке. В тех же условиях изолированный Нвр20\УТ практически целиком остается в супернатанте (рис. 10А). Если ультрацентрифугированито подвергали пробы, содержащие Е-актин и Hsp20WT, то распределение и актина и Hsp20WT между осадком и супернатантом не изменялось. Аналогичные результаты были получены в опытах с 8160 мутантом Нзр20. Определение содержания Нэр20 и актина в осадке при помощи количественного электрофореза в присутствии ДСН показало, что молярное соотношение этих белков составляет 0,03-0,04 моль Нвр20/моль актина.

Для исследования взаимодействия Нвр20 с комплексами актина с различными актин-связывающими белками мы полимеризовали актин в присутствии насыщающей концентрации актин-связывающего белка (тропомиозина, кальпонина или а-актинина), а затем в пробу вносили Шр20. Как видно из данных, представленных на рис. 10Б, присутствие в пробе тропомиозина гладких мышц не приводило к

изменению распределения

супернатант

А

Акт-*-

осадок

Акт Аю Акт В ОТ И ШЮ

ТМ-^

Акт Акт Акт ТМ ТМ ТМ

ШТ О ОТ О

Н8р20\\ИГ между осадком

и супернатантом.

Аналогичные результаты

м»«и»«*»<-Нвр20 были получены и для Акт Лет Акт

ВДТ Р ОТО

I». _- *-Нзр20

Акт Акт Акт ТМ ТМ ТМ

ОТ О ОТ И

Рис. 10. Взаимодействие Н>р20 дикого типа (\¥Т) и его в160 мутанта (О) (10 цМ) с Р-актином (Акт) (10 цМ) (А) и Р-актином в комплексе с тропомиозином (ТМ) (3 цМ) (Б). На гель наносили равные количества осадков и супернатантов. Состав проб указан под дорожками.

8160 мутанта Нвр20. Такие же данные были получены в опытах, в которых в качестве актин-связывающих белков были использованы а-актинин или кальпонин. Вне зависимости от природы исследуемого

актин-связывающего белка (тропомиозин, кальпонин или а-актинин) и мутации, имитирующей фосфорилирование ЯеНб Нвр20, количество Нзр20, соосаждавшегося с актином, было крайне низким и составляло 0,03±0,02 моль Нзр20/моль актина. При этом надо отметить, что мы также не обнаружили изменений в стехиометрии связывания актин-связывающих белков с актином в присутствии Нвр20 как дикого типа, так и его 8160 мутанта. Таким образом, Нвр20 дикого типа и его 816Б мутант не способны взаимодействовать с изолированным Р-актином и не влияют на взаимодействие актина с тропомиозином, кальпонином или а-актинином.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что НБр20 слабо взаимодействует (или не взаимодействует) с Р-актином или Р-актином в комплексе с некоторыми актин-связывающими белками. В то же время согласно данным литературы в определенных условиях наблюдается совместная локализация Нвр20 и белков сократительного аппарата. Поэтому можно предположить, что Нзр20 способен связываться с миофибриллами, в состав которых помимо актина и актин-связывающих белков входят и миозиновые филаменты. Миофибриллы скелетной и сердечной мышц человека и гладких мышц птиц были получены путем многократной гомогенизации мышечных тканей в буфере с высокой концентрацией Тритона Х-100 [16]. Препараты миофибрилл инкубировали в присутствии Нзр20\УТ, Нвр20В или Шр20\УТ, фосфорилированного цАМФ-зависимой протеинкиназой. Затем пробы подвергали низкоскоростному центрифугированию и анализировали распределение Нвр20 между осадками и супернатантами.

В первой серии опытов мы исследовали взаимодействие Нвр20 и его 816Б мутанта с миофибриллами скелетных и сердечных мышц человека. Суспензию миофибрилл смешивали с раствором Hsp20WT или Нвр20В таким образом, что концентрация актина миофибрилл и концентрация №р20 составляла 10 дМ. После инкубации и центрифугирования оценивали количество Нвр20 в осадках и супернатантах методом вестерн-блоттинга (моноклональные антитела на Нвр20 были любезно предоставлены ведущим научным сотрудником кафедры биохимии биологического факультета МГУ, д.б.н. А.Г. Катрухой). Оказалось, что в выбранных условиях количество Нзр20\УТ и его 8160 мутанта в осадках миофибрилл составляло менее 0,05 моль/моль актина миофибрилл.

Поскольку большинство исследований, касающихся №р20, было выполнено на гладких мышцах, мы провели более подробное исследование взаимодействия Няр20 с миофибриллами мышц этого типа. В этих экспериментах мы использовали Нзр20, фосфорилированный цАМФ-зависимой протеинкиназой. В пробы, содержащие фиксированную концентрацию Нар20 (9,4 цМ) со степенью фосфорилирования 0,7 моль фосфата на моль белка, вносили увеличивающиеся количества миофибрилл. После инкубации и низкоскоростного центрифугирования оценивали общее содержание Нвр20 в супернгатантах и осадках методом вестерн-блотгинга. Распределение радиоактивного (фосфорилированного) Нзр20 определяли на жидкостном сцингилляционом счетчике. Как видно из данных, представленных на рис. 11, внесение в пробы увеличивающихся количеств миофибрилл приводит к незначительному увеличению количества Шр20 в осадке по сравнению с контролем, не содержащим миофибрилл. По всей видимости, это связано с увеличением объема осадка, поскольку вне зависимости от количества добавленных миофибрилл соотношение Нзр20/актин миофибрилл в осадке оставалось примерно одинаковым и составляло 0,04±0,01 моль/моль. Кроме того, оказалось, что фосфорилирование Нвр20 не влияло на соосаждение Нвр20 с миофибриллами (рис. 11, кривые 3 и 4).

Таким образом, можно заключить, что Нзр20\УТ и его 8160 мутант не влияют на скорость и степень полимеризации актина и практически не взаимодействуют с Б-актином или Б-актином, содержащим тропомиозин, кальпонин или а-актинин. Нвр20 слабо взаимодействуют с миофибриллами скелетных, сердечных или гладких мышц. Фосфорилирование или мутация, имитирующая фосфорилирование, не влияют на взаимодействие Нвр20 с актином в изолированном состоянии или в составе миофибрилл. Во всех условиях количество НБр20, обнаруженного в осадке с

Рис. 11. Взаимодействие Нар20 и миофибрилл гладких мышц. Нзр20 (9,4 цМ), фосфорилированный цАМФ-зависимой протеинкиназой (степень фосфорилирования 0,7) инкубировали в присутствии различного количества миофибрилл и после центрифугирования определяли количество нефосфорилированного (кривые 1 и 2) и фосфорилированного (кривые 3 и 4) Нвр20 в осадках (кривые 2 и 4) и супернатантах (кривые 1 и 3).

Актин миофибрилл, цМ

актином, не превышало 0,04-0,05 моля №р20/моль актина. По всей видимости, описанная в литературе корреляция между фосфорилированием Шр20 и расслаблением гладких мышц обусловлена не изменением взаимодействия Нвр20 с актиновыми филаментами, как это считалось до последнего времени, а связана с влиянием этого белка на какие-то иные процессы, протекающие в гладкомышечных клетках.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан метод выделения рекомбинантного Няр20 человека, а также мутанта этого белка с заменой, имитирующей фосфорилирование БеИб (816Ц) под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ.

2. Установлено, что Нвр20 дикого типа и его 816И мутант преимущественно образуют малые олигомеры с кажущимися молекулярными массами 54-58 кДа и коэффициентами седиментации 2 - 2,9 в.

3. №р20 дикого типа обладает более высокой шаперонной активностью, чем его 8160 мутант при использовании инсулина и алкогольдегидрогеназы в качестве белков-субстратов.

4. Уменьшение рН сопровождается значительным уменьшением шаперонной активности Нзр20. Это может быть связано с частичной диссоциацией и денатурацией олигомерных комплексов, образованных Нвр20.

5. Нзр20 и Шр27 образуют гетероолигомерные комплексы, размер которых зависит от мутаций, имитирующих фосфорилирование Нвр27 по остаткам Бег! 5,78,82. Стехиометрия Нзр20/Н8р27 в составе таких комплексов близка к единице.

6. Нвр20 не влияет на полимеризацию актина и не способен взаимодействовать с полимерным актином или актином, содержащим тропомиозин, кальпонин или а-актинин. Фосфорилирование Нвр20 цАМФ-зависимой протеинкиназой или мутация, имитирующая такое фосфорилирование, не влияют на способность Нзр20 к взаимодействию с изолированным актином или с актином в составе миофибрилл.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. О.В. Букач, А.С. Сейт-Неби, О.О. Панасенко, М.В. Ким, Н.Б. Гусев. Выделение тканевого и рекомбинантного малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кД (hsp25) из гладких мышц птиц. (2002) Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 1, стр. 50 - 57.

2. О О. Панасенко, М.В. Ким, О.В. Букач, А. Сейт-Неби, Н.Б. Гусев. Структура и свойства малого белка теплового шока с молекулярной массой 25 кДа. ПТ Съезд биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002, (Тезисы научных докладов, стр. 99, Санкт-Петербург).

3. О.О. Panasenko, A.S. Seit Nebi, O.V. Bukach, S.B. Marston, N.B. Gusev. Structure and properties of avian small heat shock protein with molecular weight 25 kDa. (2002) Biochem. Biophys. Acta, 1601,64 - 74.

4. O.O. Panasenko, M.V. Kim, O.V. Bukach, O.S. Seit-Nebi, S.B. Marston, N.B. Gusev. Effect of heat shock protein with molecular weight 25 kDa (hsp25) on polymerization and aggregation of actin. 31st Annual Meeting of the European Society for Muscle Research, Lunteren, The Netherlands, 2002. (2002) J. Muscle Res. Cell Motil., 23, p. 40

5. O.V. Bukach, AS. Seit-Nebi, S.B. Marston, N.B. Gusev. Some properties of human small heat shock protein Hsp20 (HspB6). (2004) Eur. J. Biochem. 271(2), 291-302.

6 M. V. Kim, O.V. Bukach, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev. Some properties of human small heat shock proteins with molecular masses 22 (hsp22) and 20 kDa (hsp20). 48th Annual Meeting of Biophysical Society, Baltimore, Maryland, 2004, p.40

7. O.V. Bukach, N.B. Gusev. Interaction of small heat shock protein with molecular mass 20 kDa (HSP20) with actin and actin-binding proteins. International Symposium "Biological motility" Pushchino, 2004, p. 84-85.

8. Н.Б. Гусев, O.B. Букач, С.Б. Марстон. Структура, свойства и возможная физиологическая роль малого белка теплового шока с кажущейся молекулярной массой 20 кДа (Hsp20, HspB6). (2005) Биохимия/Biochemistry (Moscow), 70(6), 762-772.

9. О V Bukach, S.B. Marston, N.B. Gusev. Small heat shock protein with apparent molecular mass 20 kDa (Hsp20, HspB6) is not a genuine actin-binding protein. (2005) J. Muscle Res. Cell Motil., 26(4-5), 175-81.

Данное исследование проводилось при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Wellcome Trust (Великобритания).

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

[1] F. Narberhaus. Microbiol (2002) Mol Biol Rev 66, 64-93.

[2] G. Kappe, E. Franck, P. Verschuure, W. C. Boelens, J. A. Leunissen, and W. W. de Jong. (2003) Cell Stress Chaperones 8,53-61.

[3] A. C. Beall, K. Kato, J. R. Goldenring, H. Rasmussen, and С. M. Brophy. (1997) J Biol Chem272,11283-11287.

[4] С. M. Rembold, D. B. Foster, J. D. Strauss, C. J. Wingard, and J. E. Eyk. J Physiol (2000) 524, 865-878.

[5] G. C. Fan, G. Chu, B. Mitton, Q. Song, Q. Yuan, and E. G. Kranias. (2004) Circ Res 94, 1474-1482.

[6] Y. Wang, A. Xu, R. B. Pearson, and G. J. Cooper. (1999) FEBS Lett 462,25-30.

[7] H. Matsuno, O. Kozawa, M. Niwa, A. Usui, H. Ito, T. Uematsu, and K. Kato. (1998) FEBS Lett 429,327-329.

[8] С. M. Rembold, M. O'Connor, M. Clarkson, R. L. Wardle, and R. A. Murphy. (2001) J Appl Physiol 91,1460-1466.

[9] A. Beall, D. Bagwell, D. Woodrum, T. A. Stoming, K. Kato, A. Suzuki, H. Rasmussen, and С. M. Brophy. (1999) J Biol Chem 274,11344-11351.

[10] Y. Wang, A. Xu, J. Ye, E. W. Kraegen, C. A. Tse, and G. J. Cooper. (2001) Diabetes 50, 1821-1827.

[11] O.B. Букач, A.C. Сейт-Неби, O.O. Панасенко, M.B. Ким, Н.Б. Гусев.(2002) Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии 1, 50-57.

[12] J. D. Pardee, and J. A. Spudich. (1982) Methods Enzymol 85,164-181.

[13] F. A. van de Klundert, R. H. Smulders, M. L. Gijsen, R. A. Lindner, R. Jaenicke, J. A. Carver, and W. W. de Jong. (1998) Eur J Biochem 258,1014-1021.

[14] Z. T. Farahbakhsh, Q. L. Huang, L. L. Ding, C. Altenbach, H. J. Steinhoff, J. Horwitz, and W. L. Hubbell. (1995) Biochemistry 34, 509-516.

[15] J. I. Clark, and Q. L. (1996) Proc Natl Acad Sei U S A 93,15185-15189.

[16] P. Lin, K. Luby-Phelps, and J. T. Stull. (1997) J Biol Chem 272,7412-7420.

[17] K. Kato, K. Hasegawa, S. Goto, and Y. Inaguma. (1994) J Biol Chem 269,11274-11278.

[18] T. Rogalla, M. Ehrnsperger, X. Preville, A. Kotlyarov, G. Lutsch, С. Ducasse, С. Paul, M. Wieske, A. P. Arrigo, J. Büchner, and M. Gaestel. (1999) J Biol Chem 274,18947-18956.

[19] B. Lelj-Garolla, and A. G. Mauk. (2005) J Mol Biol 345,631-642.

[20] С. O. Park, X. H. Xiao, and D. G. Allen. (1999) Am J Physiol 276, H1581-1590.

[21] G. C. Fan, X. Ren, J. Qian, Q. Yuan, P. Nicolaou, Y. Wang, W. K. Jones, G. Chu, and E. G. Kranias. (2005) Circulation 111, 1792-1799.

[22] T. J. Koh, and J. Escobedo. (2004) Am J Physiol Cell Physiol 286, C713-722.

[23] L. Feasson, D. Stockholm, D. Freyssenet, I. Richard, S. Duguez, J. S. Beckmann, and C. Denis. (2002) J Physiol 543,297-306.

[24] Y. Sugiyama, A. Suzuki, M. Kishikawa, R. Akutsu, T. Hirose, M. M. Waye, S. K. Tsui, S. Yoshida, and S. Ohno. (2000) J Biol Chem 275, 1095-1104.

[25] С. M. Brophy, J. R. Molinaro, and M. Dickinson. (2000) Surgery 128, 320-326.

[26] С. M. Brophy, S. Lamb, and A. Graham. (1999) J Vase Surg 29, 326-333.

[27] D. J. Tessier, P. Komalavilas, A. Panitch, L. Joshi, and С. M. Brophy. (2003) J Surg Res 111,152-157.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N OOS 10 от 01.12.99 г. Подписано к печати 16.01.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 020. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

/ !

i

1

í

)

i

i

i

11 • t

i - 5 4 2 8

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Букач, Олеся Владимировна

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Структура и свойства малых Hsp.

1.1. Общие сведения о малых Hsp.

1.2. Структура малых Hsp.

1.3. Образование гетероолигомерных комплексов.

1.4. Фосфорилирование малых Hsp.

1.5. Шаперонная активность.

2. Возможная функциональная роль Hsp20.

2.1. Участие Hsp20 в предотвращении агрегации тромбоцитов.

2.2. Возможное участие Hsp20 в регуляции метаболизма глюкозы под действием инсулина.

2.3. Регуляция сократительной активности гладких мышц и возможное участие Hsp20 в этом процессе.

2.4. Возможное участие Hsp20 в регуляции сократительной активности и апоптозе кардиомиоцитов.

Материалы и методы.

1. Препаративные методы.

1.1. Получение высокоочищенных препаратов рекомбинантных Hsp20 и Hsp27 человека и их точечных мутантов с заменами, имитирующими фосфорилирование (Hsp20D и Hsp273D).

1.1.1 Получение препарата рекомбинантного Hsp20 дикого типа (Hsp20WT).

1.1.2. Получение высокоочищенного препарата рекомбинантного Hsp20 с заменой остатка Serl6 на остаток аспарагиновой кислоты (Hsp20D).

1.1.3. Получение высокоочищенных препаратов рекомбинантного Hsp27 дикого типа (Hsp27WT) и его мутанта с заменами остатков Serl5, Ser78, Ser82 на остатки аспарагиновой кислоты (Hsp273D).

1.2. Выделение актина из ацетонового порошка скелетных мышц кролика.

1.3. Выделение миофибрилл из скелетной и сердечной мышц человека или гладких мышц птиц.

2. Методы, использованные для изучения свойств Hsp20.

2.1. Определение олигомерного состояния Hsp20 методом гель-фильтрации.

2.2. Определение молекулярной массы Hsp20 методом нативного электрофореза в градиенте пористости геля.

2.3. Определение олигомерного состояния Hsp20 методом неравновесного аналитического ультрацентрифугирования.

2.4. Изучение влияния рН на вторичную структуру Hsp20 методом кругового дихроизма (КД).

2.5. Изучение олигомерного состояния Hsp20 методом химического «сшивания».

3. Определение шаперонной активности малых Hsp.

3.1. Влияние малых Hsp на агрегацию инсулина.

3.2. Влияние малых Hsp на агрегацию алкогольдегидрогеназы.

3.3. Влияние малых Hsp на агрегацию термически денатурированного актина.

4. Методы, использованные для изучения взаимодействия Hsp20 с другими белками.

4.1. Изучение взаимодействия Hsp20 и Hsp27 методом гель-фильтрации.

4.2. Влияние sHsp на полимеризацию актина.

4.2.1 Метод ультрацентрифугирования.

4.2.2 Метод флуоресцентной спектроскопии.

4.3. Изучение взаимодействия Hsp20 с комплексами актин-связывающих белков с F-актином.

4.3.1 Взаимодействие Hsp20 с комплексом F-актин-тропомиозин.

4.3.2 Взаимодействие Hsp20 с комплексом F-актин-а-актинин.

4.3.3 Взаимодействие Hsp20 с комплексом F-актин-кальпонин.

4.3.4 Взаимодействие Hsp20 и миофибрилл.

5. Некоторые аналитические методы.

5.1. Электрофорез в ПААГ в присутствии SDS.

5.2. Изоэлектрофокусирование в денатурирующих условиях.

5.3. Вестерн-блотгинг.

5.4. Определение концентрации белка.

5.4.1 Спектрофотометрический метод.

5.4.2 Метод Брэдфорд.

6. Состав и обозначение буферных растворов, использованных в работе.

Результаты исследования.

1. Выделение Hsp20 и его S16D мутанта и определение их шаперонной активности.

1.1. Выделение Hsp20.

1.2. Определение шаперонной активности Hsp20.

2. Изучение свойств Hsp20.

2.1. Определение олигомерного состояния Hsp20.

2.1.1 Влияние концентрации на олигомерное состояние Hsp20WT.

2.1.2 Влияние мутации, имитирующей фосфорилирование Serl6, на олигомерное состояние Hsp20.

2.2. Влияние рН на структуру и свойства Hsp20.

2.2.1 Влияние рН на шаперонную активность Hsp20.

2.2.2 Влияние рН на олигомерное состояние Hsp20.

2.2.3 Влияние рН на вторичную структуру Hsp20.

2.3. Влияние Hsp20 на агрегацию термически денатурированного актина.

3. Взаимодействие Hsp20 с другими белками.

3.1. Образование гетероолигомерных комплексов с Hsp27.

3.2. Взаимодействие Hsp20 и актина.

3.2.1 Влияние Hsp20 на скорость и степень полимеризации G-актина.

3.2.2 Анализ взаимодействия Hsp20 с F-актином и комплексами F-актин-акгин-связывающий белок.

3.2.3 Взаимодействие Hsp20 и миофибрилл.

Обсуждение результатов.

1. Некоторые физико-химические свойства Hsp20.

1.1. Олигомерное состояние и шаперонная активность Hsp20.

1.2. Влияние рН на олигомерное состояние и шаперонную активность Hsp20.

2. Образование гетероолигомерных комплексов Hsp20 и Hsp27.

3. Взаимодействие Hsp20 и актина.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура и свойства малого белка теплового шока с кажущейся молекулярной массой 20 кДа"

Белки теплового шока (heat shock proteins, Hsp) - общее название для нескольких семейств белков-шаперонов. Это название возникло вследствие того, что повышение температуры и другие типы клеточного стресса приводят к значительному усилению синтеза этих белков. Однако и в нормальных, не стрессовых условиях содержание Hsp в клетке достаточно высоко, поскольку белки теплового шока выполняют в клетке чрезвычайно важные функции, такие как котрансляционное сворачивание новообразованных полипептидных цепей, рефолдинг частично денатурированных или элиминация неправильно свернутых белков. В зависимости от функций Hsp делятся на несколько основных семейств, названия которых основаны на молекулярных массах их основных представителей. Наиболее хорошо изученными являются Hsp60 и Hsp70, основной функцией которых является АТФ-зависимый фолдинг (или рефолдинг) белков-субстратов. Малые белки теплового шока (малые Hsp) не способны осуществлять АТФ-зависимый рефолдинг белков-субстратов, но, несмотря на это, играют важную роль в защите клетки от неблагоприятных условий. Связывая частично денатурированные белки-субстраты, малые Hsp предотвращают накопление агрегатов поврежденных белков, облегчая тем самым их последующую ренатурацию шаперонами других семейств.

В последнее время появилось большое количество данных, свидетельствующих о том, что, помимо шаперонной активности, малые Hsp обладают и другими, не менее значимыми функциями. Чрезвычайный интерес исследователей вызывают такие функции малых Hsp, как модуляция динамики актинового цитоскелета, возможная роль в регуляции клеточного цикла и апоптоза, а также возможная вовлеченность мутантов малых Hsp в развитие различных наследственных заболеваний.

В настоящее время в геноме человека обнаружено 10 генов, кодирующих малые белки теплового шока. При этом только а-кристаллины и Hsp27 охарактеризованы достаточно подробно, а структура и функции остальных представителей этого семейства остаются практически неизученными. Hsp20, являющийся объектом нашего исследования, был открыт сравнительно недавно, однако привлекает большой интерес разнообразием своих функций. Считается, что Hsp20 способен регулировать расслабление гладкой мускулатуры, предотвращать апоптоз кардиомиоцитов, участвовать в инсулин-зависимом транспорте глюкозы в скелетные мышцы и в регуляции агрегации тромбоцитов. К сожалению, при всем богатстве фактического материала, механизмы лежащие в основе большинства функций Hsp20, остаются не до конца понятными.

Целью данной работы был анализ структуры и свойств Hsp20 и изучение его взаимодействия с актином и актин-связывающими белками. Дня чего были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод выделения немодифицированного рекомбинантного Hsp20 без применения денатурирующих реагентов.

2. Определить шаперонную активность и олигомерное состояние Hsp20 и исследовать факторы, влияющие на эти свойства.

3. Проанализировать возможность образования гетероолигомерных комплексов между Hsp20 и Hsp27.

4. Проанализировать способность Hsp20 к взаимодействию с актином и некоторыми актин-связывающими белками.

Научная новизна и практическая значимость работы. Разработан метод выделения в нативных условиях рекомбинантного Hsp20 человека, а также мутанта этого белка, с заменой S16D, имитирующей фосфорилирование Hsp20 под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ. Установлено, что в отличие от большинства других малых белков теплового шока, Hsp20 и его S16D мутант преимущественно представлены малыми олигомерами с кажущимися молекулярными массами 54-58 кДа и коэффициентами седиментации 2-2,9 S.

Hsp20 дикого типа эффективно препятствует агрегации инсулина, вызванной восстановлением дисульфидных связей, и агрегации алкогольдегидрогеназы, вызванной повышением температуры. Мутация, имитирующая фосфорилирование Hsp20, приводит к значительному снижению шаперонной активности этого белка. Понижение рН от 7,0 до 6,0 сопровождается значительным уменьшением шаперонной активности Hsp20, что может быть связано с частичной диссоциацией и денатурацией Hsp20.

Hsp20 и Hsp27 дикого типа образуют гетероолигомерные комплексы с кажущимися молекулярными массами 300 и 100 кДа. Стехиометрия Hsp20/Hsp27 в составе таких комплексов близка к единице. Мутант Hsp27 с заменами Serl5, 78 и 82 на остатки Asp, имитирующими фосфорилирование Hsp27 под действием МАРКАР2/3 киназы, образует с Hsp20 единственный тип гетероолигомерных комплексов с кажущейся молекулярной массой 100 кДа, в котором стехиометрия Hsp20/Hsp27 близка к единице.

Установлено, что Hsp20 не влияет на скорость и степень полимеризации актина и не способен взаимодействовать с полимерным актином или актином, содержащим тропомиозин, кальпонин или а-актинин, а также F-актином, входящим в состав миофибрилл скелетной, сердечной и гладкой мускулатуры. Фосфорилирование Serl6 Hsp20 под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы или мутация, имитирующая фосфорилирование, не влияют на способность Hsp20 взаимодействовать с изолированным F-актином или с F-актином в комплексе с некоторыми актин-связывающими белками или актином в составе миофибрилл.

Обзор литературы

1. Структура и свойства малых Hsp.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Букач, Олеся Владимировна

выводы

1. Разработан метод выделения рекомбинантного Hsp20 человека и мутанта этого белка с заменой, имитирующей фосфорилирование (S16D) под действием ци клону клеотид-зависимых протеинкиназ.

2. Установлено, что Hsp20 и его S16D мутант преимущественно образуют малые олигомеры с кажущимися молекулярными массами 54-58 кДа и коэффициентами седиментации 2 - 2,9 S.

3. Hsp20 дикого типа обладает более высокой шаперонной активностью, чем его S16D мутант при использовании в алкогольдегидрогеназы, термически денатурированного актина и инсулина в качестве белков-субстратов.

4. Уменьшение рН сопровождается значительным уменьшением шаперонной активности Hsp20. Это может быть связано с частичной диссоциацией и денатурацией олигомерных комплексов, образованных Hsp20.

5. Hsp20 и Hsp27 образуют гетероолигомерные комплексы, размер которых зависит от мутаций, имитирующих фосфорилирование Hsp27 по остаткам Serl5, 78,82. Стехиометрия Hsp20/Hsp27 в составе таких комплексов близка к единице.

6. Hsp20 не влияет на полимеризацию актина и не способен взаимодействовать с полимерным актином или актином, содержащим тропомиозин, кальпонин или а-актинин. Фосфорилирование Hsp20 или мутация, имитирующая фосфорилирование, не влияют на способность Hsp20 к взаимодействию с изолированным актином или с актином в составе миофибрилл.

Сердечно благодарю своего научного руководителя, Николая Борисовича Гусева за знания и опыт, полученные мной за время работы, а также за его бесконечное терпение. Выражаю благодарность всем сотрудникам лаборатории за помощь в работе и создание теплой дружеской атмосферы. Благодарю своих коллег, особенно к.б.н. А.С. Сейт-Неби, к.б.н. Н.А. Чеботареву, к.ф.-м.н. A.M. Арутюняна, к.б.н. М.В. Ким, д.б.н. А.Г. Катруху за помощь в проведении экспериментов и интерпретации полученных данных.

Хочу поблагодарить своих родителей и брата за любовь и поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Букач, Олеся Владимировна, Москва

1. Болотина И.А. (1973). Изучение структуры белков методом кругового дихроизма. Молекулярная биология. ВИНИТИ, Москва 1, 61-104

2. Кантор, Ч., Шиммел, П. (1984). Биофизическая химия. Москва, Мир.

3. Abulimiti, A. and Chang, Z. (2003). Alpha-crystallin promotes assembly of a trimeric form of Mycobacterium tuberculosis Hspl6.3 in a cell free system. Biochemistry (Mosc) 68,269-74.

4. Abulimiti, A., Fu, X., Gu, L., Feng, X. and Chang, Z. (2003). Mycobacterium tuberculosis Hsp 16.3 nonamers are assembled and re-assembled via trimer and hexamer intermediates. / Mol Biol 326,1013-23.

5. Allen, S. P., Polazzi, J. O., Gierse, J. K. and Easton, A. M. (1992). Two novel heat shock genes encoding proteins produced in response to heterologous protein expression in Escherichia coli. J Bacteriol 174,6938-47.

6. Andley, U. P., Mathur, S., Griest, T. A. and Petrash, J. M. (1996). Cloning, expression, and chaperone-like activity of human alphaA-crystallin. J Biol Chem 271, 3197380.

7. Aquilina, J. A., Benesch, J. L., Ding, L. L., Yaron, O., Horwitz, J. and Robinson, С. V. (2004). Phosphorylation of alphaB-crystallin alters chaperone function through loss of dimeric substructure. J Biol Chem 279,28675-80.

8. Arrigo, A. P. and Welch, W. J. (1987). Characterization and purification of the small 28,000-dalton mammalian heat shock protein. / Biol Chem 262,15359-69.

9. Augusteyn, R. C. (2004). alpha-crystallin: a review of its structure and function. Clin Exp Optom 87,356-66.

10. Augusteyn, R. C. (2004). Dissociation is not required for alpha-crystallin's chaperone function. Exp Eye Res 79,781-4.

11. Avruch, J. (1998). Insulin signal transduction through protein kinase cascades. Mol Cell Biochem 182,31-48.

12. Beall, A. C., Kato, K., Goldenring, J. R., Rasmussen, H. and Brophy, С. M. (1997). Cyclic nucleotide-dependent vasorelaxation is associated with the phosphorylation of a small heat shock-related protein. / Biol Chem 272,11283-7.

13. Benndorf, R., Hayess, K., Stahl, J. and Bielka, H. (1992). Cell-free phosphorylation of the murine small heat-shock protein hsp25 by an endogenous kinase from Ehrlich ascites tumor cells. Biochim Biophys Acta 1136,203-7.

14. Berengian, A. R., Bova, M. P. and McHaourab, H. S. (1997). Structure and function of the conserved domain in alphaA-crystallin. Site-directed spin labeling identifies a beta-strand located near a subunit interface. Biochemistry 36,9951-7.

15. Boelens, W. C., Croes, Y., de Ruwe, M., de Reu, L. and de Jong, W. W. (1998). Negative charges in the C-terminal domain stabilize the alphaB-crystallin complex. } Biol Chem 273,28085-90.

16. Bova, M. P., Huang, Q., Ding, L. and Horwitz, J. (2002). Subunit exchange, conformational stability, and chaperone-like function of the small heat shock protein 16.5 from Methanococcus jannaschii. J Biol Chem 277,38468-75.

17. Brophy, С. M., Dickinson, M. and Woodrum, D. (1999). Phosphorylation of the small heat shock-related protein, HSP20, in vascular smooth muscles is associated with changes in the macromolecular associations of HSP20. J Biol Chem 274, 6324-9.

18. Brophy, С. M., Lamb, S. and Graham, A. (1999). The small heat shock-related protein-20 is an actin-associated protein, f Vase Surg 29,326-33.

19. Brophy, С. M., Molinaro, J. R. and Dickinson, M. (2000). The macromolecular associations of heat shock protein-27 in vascular smooth muscle. Surgery 128, 320-6.

20. Brunner, F., Maier, R., Andrew, P., Wolkart, G., Zechner, R. and Mayer, B. (2003). Attenuation of myocardial ischemia/reperfusion injury in mice with myocyte-specific overexpression of endothelial nitric oxide synthase. Cardiovasc Res 37, 5562.

21. Buchner, J., Grallert, H. and Jakob, U. (1998). Analysis of chaperone function using citrate synthase as normative substrate protein. Methods Enzymol 290,323-38.

22. Burgio, M. R., Bennett, P. M. and Koretz, J. F. (2001). Heat-induced quaternary transitions in hetero- and homo-polymers of alpha-crystallin. Mol Vis 7,228-33.

23. Carver, J. A., Esposito, G., Schwedersky, G. and Gaestel, M. (1995). 1H NMR spectroscopy reveals that mouse Hsp25 has a flexible C-terminal extension of 18 amino acids. FEBS Lett 369,305-10.

24. Chavez Zobel, А. Т., Loranger, A., Marceau, N., Theriault, J. R., Lambert, H. and Landry, J. (2003). Distinct chaperone mechanisms can delay the formation of aggresomes by the myopathy-causing R120G alphaB-crystallin mutant. Hum Mol Genet 12,1609-20.

25. Chernik, I. S., Panasenko, О. O., Li, Y., Marston, S. B. and Gusev, N. B. (2004). pH-induced changes of the structure of small heat shock proteins with molecular mass 24/27kDa (HspBl). Biochem Biophys Res Commun 324,1199-203.

26. Chowdary, Т. K., Raman, В., Ramakrishna, T. and Rao, С. M. (2004). Mammalian Hsp22 is a heat-inducible small heat-shock protein with chaperone-like activity. Biochem } 381,379-87.

27. Clark, J. I. and Huang, Q. L. (1996). Modulation of the chaperone-like activity of bovine alpha-crystallin. Proc Natl Acad Sci USA93,15185-9.

28. Das, K. P., Petrash, J. M. and Surewicz, W. K. (1996). Conformational properties of substrate proteins bound to a molecular chaperone alpha-crystallin. } Biol Chem 271,10449-52.

29. Devlin, G. L., Carver, J. A. and Bottomley, S. P. (2003). The selective inhibition of serpin aggregation by the molecular chaperone, alpha-crystallin, indicates a nucleation-dependent specificity.} Biol Chem 278,48644-50.

30. Ding, D., Moskowitz, S. I., Li, R., Lee, S. В., Esteban, M., Tomaselli, K., Chan, J. and Bergold, P. J. (2000). Acidosis induces necrosis and apoptosis of cultured hippocampal neurons. Exp Neurol 162,1-12.

31. Ding, L. and Candido, E. P. (2000). HSP25, a small heat shock protein associated with dense bodies and M-lines of body wall muscle in Caenorhabditis elegans. / Biol Chem 275,9510-7.

32. Eefting, F., Rensing, В., Wigman, J., Pannekoek, W. J., Liu, W. M., Cramer, M. J., Lips, D. J. and Doevendans, P. A. (2004). Role of apoptosis in reperfusion injury. Cardiovasc Res 61,414-26.

33. Ehrnsperger, M., Graber, S., Gaestel, M. and Buchner, J. (1997). Binding of non-native protein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation. Embo J16,221-9.

34. Ehrnsperger, M., Lilie, H., Gaestel, M. and Buchner, J. (1999). The dynamics of Hsp25 quaternary structure. Structure and function of different oligomeric species. / Biol Chem 274,14867-74.

35. Fan, G. C., Chu, G., Mitton, В., Song, Q., Yuan, Q. and Kranias, E. G. (2004). Small heat-shock protein Hsp20 phosphorylation inhibits beta-agonist-induced cardiac apoptosis. Circ Res 94,1474-82.

36. Fan, G. C., Ren, X., Qian, J., Yuan, Q., Nicolaou, P., Wang, Y., Jones, W. K., Chu, G. and Kranias, E. G. (2005). Novel cardioprotective role of a small heat-shock protein, Hsp20, against ischemia/reperfusion injury. Circulation 111, 1792-9.

37. Farahbakhsh, Z. Т., Huang, Q. L., Ding, L. L., Altenbach, C., Steinhoff, H. J., Horwitz, J. and Hubbell, W. L. (1995). Interaction of alpha-crystallin with spin-labeled peptides. Biochemistry 34,509-16.

38. Farnsworth, P. N., Frauwirth, H., Groth-Vasselli, B. and Singh, K. (1998). Refinement of 3D structure of bovine lens alpha A-crystallin. Int J Biol Macromol 22,175-85.

39. Farnsworth, P. N. and Singh, K. (2000). Self-complementary motifs (SCM) in alpha-crystallin small heat shock proteins. FEBS Lett 482,175-9.

40. Feil, I. K., Malfois, M., Hendle, J., van Der Zandt, H. and Svergun, D. I. (2001). A novel quaternary structure of the dimeric alpha-crystallin domain with chaperone-like activity. / Biol Chem 276,12024-9.

41. Feng, X., Huang, S., Fu, X., Abulimiti, A. and Chang, Z. (2002). The reassembling process of the nonameric Mycobacterium tuberculosis small heat-shock protein Hspl6.3 occurs via a stepwise mechanism. Biochem J 363,329-34.

42. Fontaine, J. M., Rest, J. S., Welsh, M. J. and Benndorf, R. (2003). The sperm outer dense fiber protein is the 10th member of the superfamily of mammalian small stress proteins. Cell Stress Chaperones 8,62-9.

43. Fontaine, J. M., Sun, X., Benndorf, R. and Welsh, M. J. (2005). Interactions of HSP22 (HSPB8) with HSP20, alphaB-crystallin, and HSPB3. Biochem Biophys Res Commun 337,1006-11.

44. Franck, E., Madsen, O., van Rheede, Т., Ricard, G., Huynen, M. A. and de Jong, W. W. (2004). Evolutionary diversity of vertebrate small heat shock proteins. / Mol Evol 59,792-805.

45. Franzmann, Т. M., Wuhr, M., Richter, K., Walter, S. and Buchner, J. (2005). The activation mechanism of Hsp26 does not require dissociation of the oligomer. J Mol Biol 350,1083-93.

46. Frobert, O., Buus, C. L. and Rembold, С. M. (2005). HSP20 phosphorylation and interstitial metabolites in hypoxia-induced dilation of swine coronary arteries. Acta Physiol Scand 184,37-44.

47. Ganea, E. (2001). Chaperone-like activity of alpha-crystallin and other small heat shock proteins. Curr Protein Pept Sci 2,205-25.

48. Golenhofen, N., Ness, W., Koob, R., Htun, P., Schaper, W. and Drenckhahn, D. (1998). Ischemia-induced phosphorylation and translocation of stress protein alpha B-crystallin to Z lines of myocardium. Am f Physiol 274, H1457-64.

49. Guo, Z. and Cooper, L. F. (2000). An N-terminal 33-amino-acid-deletion variant of hsp25 retains oligomerization and functional properties. Biochem Biophys Res Commun 270,183-9.

50. Haley, D. A., Horwitz, J. and Stewart, P. L. (1998). The small heat-shock protein, alphaB-crystallin, has a variable quaternary structure. / Mol Biol 277,27-35.

51. Hartl, F. U. (1996). Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature 381,571-9.

52. Haslbeck, M., Ignatiou, A., Saibil, H., Helmich, S., Frenzl, E., Stromer, T. and Buchner, J. (2004). A domain in the N-terminal part of Hsp26 is essential for chaperone function and oligomerization. f Mol Biol 343,445-55.

53. Haslbeck, M., Walke, S., Stromer, Т., Ehrnsperger, M., White, H. E., Chen, S., Saibil, H. R. and Buchner, J. (1999). Hsp26: a temperature-regulated chaperone. Embo J 18, 6744-51.

54. Hedges, J. С., Dechert, M. A., Yamboliev, I. A., Martin, J. L., Hickey, E., Weber, L. A. and Gerthoffer, W. T. (1999). A role for p38(MAPK)/HSP27 pathway in smooth muscle cell migration. / Biol Chem 274, 24211-9.

55. Horwitz, J., Bova, M. P., Ding, L. L., Haley, D. A. and Stewart, P. L. (1999). Lens alpha-crystallin: function and structure. Eye 13,403-8.

56. Horwitz, J., Huang, Q. and Ding, L. (2004). The native oligomeric organization of alpha-crystallin, is it necessary for its chaperone function? Exp Eye Res 79,817-21.

57. Horwitz, J., Huang, Q. L., Ding, L. and Bova, M. P. (1998). Lens alpha-crystallin: chaperone-like properties. Methods Enzymol 290,365-83.

58. Huey, К. A., Thresher, J. S., Brophy, С. M. and Roy, R. R. (2004). Inactivity-induced modulation of Hsp20 and Hsp25 content in rat hindlimb muscles. Muscle Nerve 30,95-101.

59. Kappe, G., Franck, E., Verschuure, P., Boelens, W. C., Leunissen, J. A. and de Jong, W. W. (2003). The human genome encodes 10 alpha-crystallin-related small heat shock proteins: HspBl-10. Cell Stress Chaperones 8,53-61.

60. Kato, K., Goto, S., Inaguma, Y., Hasegawa, K., Morishita, R. and Asano, T. (1994). Purification and characterization of a 20-kDa protein that is highly homologous to alpha В crystallin. / Biol Chem 269,15302-9.

61. Kato, K., Hasegawa, K., Goto, S. and Inaguma, Y. (1994). Dissociation as a result of phosphorylation of an aggregated form of the small stress protein, hsp27. / Biol Chem 269,11274-8.

62. Kato, K., Ito, H., Kamei, K., Inaguma, Y., Iwamoto, I. and Saga, S. (1998). Phosphorylation of alphaB-crystallin in mitotic cells and identification of enzymatic activities responsible for phosphorylation. / Biol Chem 273,28346-54.

63. Kato, К., Shinohara, H., Goto, S., Inaguma, Y., Morishita, R. and Asano, T. (1992). Copurification of small heat shock protein with alpha В crystallin from human skeletal muscle. / Biol Chem 267, 7718-25.

64. Kim, К. K., Kim, R. and Kim, S. H. (1998). Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature 394,595-9.

65. Kim, M. V., Seit-Nebi, A. S., Marston, S. B. and Gusev, N. B. (2004). Some properties of human small heat shock protein Hsp22 (Hll or HspB8). Biochem Biophys Res Commun 315,796-801.

66. Kim, N. K., Joh, J. H., Park, H. R., Kim, О. H., Park, B. Y. and Lee, C. S. (2004). Differential expression profiling of the proteomes and their mRNAs in porcine white and red skeletal muscles. Proteomics 4,3422-8.

67. Kim, R., Kim, К. K., Yokota, H. and Kim, S. H. (1998). Small heat shock protein of Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile. Proc Natl Acad Sci USA 95, 9129-33.

68. Klemenz, R., Frohli, E., Steiger, R. H., Schafer, R. and Aoyama, A. (1991). Alpha B-crystallin is a small heat shock protein. Proc Natl Acad Sci US A 88,3652-6.

69. Knauf, U., Bielka, H. and Gaestel, M. (1992). Over-expression of the small heat-shock protein, hsp25, inhibits growth of Ehrlich ascites tumor cells. FEBS Lett 309, 297302.

70. Koh, T. J. and Escobedo, J. (2004). Cytoskeletal disruption and small heat shock protein translocation immediately after lengthening contractions. Am J Physiol Cell Physiol 286, C713-22.

71. Кокке, B. P., Leroux, M. R., Candido, E. P., Boelens, W. C. and de Jong, W. W. (1998). Caenorhabditis elegans small heat-shock proteins Hspl2.2 and Hspl2.3 form tetramers and have no chaperone-like activity. FEBS Lett 433,228-32.

72. Koteiche, H. A. and McHaourab, H. S. (2003). Mechanism of chaperone function in small heat-shock proteins. Phosphorylation-induced activation of two-mode binding in alphaB-crystallin. / Biol Chem 278,10361-7.

73. MacRae, Т. H. (2000). Structure and function of small heat shock/alpha-crystallin proteins: established concepts and emerging ideas. Cell Mol Life Sci 57,899-913.

74. Martin, J. L., Mestril, R., Hilal-Dandan, R., Brunton, L. L. and Dillmann, W. H. (1997). Small heat shock proteins and protection against ischemic injury in cardiac myocytes. Circulation 96,4343-8.

75. Matsuno, H., Ishisaki, A., Nakajima, K., Kato, K. and Kozawa, O. (2003). A peptide isolated from alpha B-crystallin is a novel and potent inhibitor of platelet aggregation via dual prevention of PAR-1 and GPIb/V/IX. f Thromb Haemost 1, 2636-42.

76. Matsuno, H., Kozawa, O., Niwa, M., Usui, A., Ito, H., Uematsu, T. and Kato, K. (1998). A heat shock-related protein, p20, plays an inhibitory role in platelet activation. FEBS Lett 429,327-9.

77. McLemore, E. G, Tessier, D. J., Thresher, J., Komalavilas, P. and Brophy, С. M. (2005). Role of the small heat shock proteins in regulating vascular smooth muscle tone. J Am Coll Surg 201,30-6.

78. Merck, К. В., De Haard-Hoekman, W. A., Oude Essink, В. В., Bloemendal, H. and De Jong, W. W. (1992). Expression and aggregation of recombinant alpha A-crystallin and its two domains. Biochim Biophys Acta 1130,267-76.

79. Michaud, S., Marin, R. and Tanguay, R. M. (1997). Regulation of heat shock gene induction and expression during Drosophila development. Cell Mol Life Sci 53, 104-13.

80. Miron, Т., Wilchek, M. and Geiger, B. (1988). Characterization of an inhibitor of actin polymerization in vinculin-rich fraction of turkey gizzard smooth muscle. Eur J Biochem 178,543-53.

81. Mogk, A., Deuerling, E., Vorderwulbecke, S., Vierling, E. and Bukau, B. (2003). Small heat shock proteins, ClpB and the DnaK system form a functional triade in reversing protein aggregation. Mol Microbiol 50,585-95.

82. Munchbach, M., Nocker, A. and Narberhaus, F. (1999). Multiple small heat shock proteins in rhizobia. J Bacteriol 181,83-90.

83. Nakamoto, H., Suzuki, N. and Roy, S. K. (2000). Constitutive expression of a small heat-shock protein confers cellular thermotolerance and thermal protection to the photosynthetic apparatus in cyanobacteria. FEBS Lett 483,169-74.

84. Narberhaus, F. (2002). Alpha-crystallin-type heat shock proteins: socializing minichaperones in the context of a multichaperone network. Microbiol Mol Biol Rev 66,64-93; table of contents.

85. Niwa, M., Kozawa, O., Matsuno, H., Kato, K. and Uematsu, T. (2000). Small molecular weight heat shock-related protein, HSP20, exhibits an anti-platelet activity by inhibiting receptor-mediated calcium influx. Life Sci 66, PL7-12.

86. O'Connor, M. J. and Rembold, С. M. (2002). Heat-induced force suppression and HSP20 phosphorylation in swine carotid media. } Appl Physiol 93,484-8.

87. Panasenko, О. O. and Gusev, N. B. (2001). Mutual effects of alpha-actinin, calponin and filamin on actin binding. Biochim Biophys Acta 1544,393-405.

88. Panasenko, О. O., Kim, M. V., Marston, S. B. and Gusev, N. B. (2003). Interaction of the small heat shock protein with molecular mass 25 kDa (hsp25) with actin. Eur } Biochem 270,892-901.

89. Panasenko, О. O., Seit Nebi, A., Bukach, О. V., Marston, S. B. and Gusev, N. B. (2002). Structure and properties of avian small heat shock protein with molecular weight 25 kDa. Biochim Biophys Acta 1601, 64-74.

90. Pardee, J. D. and Spudich, J. A. (1982). Purification of muscle actin. Methods Enzymol 85 Pt B, 164-81.

91. Park, С. O., Xiao, X. H. and Allen, D. G. (1999). Changes in intracellular Na+ and pH in rat heart during ischemia: role of Na+/H+ exchanger. Am J Physiol 276, H1581-90.

92. Pasta, S. Y., Raman, В., Ramakrishna, T. and Rao Ch, M. (2003). Role of the conserved SRLFDQFFG region of alpha-crystallin, a small heat shock protein. Effect on oligomeric size, subunit exchange, and chaperone-like activity. } Biol Chem 278, 51159-66.

93. Pasta, S. Y., Raman, В., Ramakrishna, T. and Rao Ch, M. (2004). The IXI/V motif in the C-terminal extension of alpha-crystallins: alternative interactions and oligomeric assemblies. Mol Vis 10,655-62.

94. Pipkin, W., Johnson, J. A., Creazzo, T. L., Burch, J., Komalavilas, P. and Brophy, C. (2003). Localization, macromolecular associations, and function of the small heat shock-related protein HSP20 in rat heart. Circulation 107,469-76.

95. Plater, M. L., Goode, D. and Crabbe, M. J. (1996). Effects of site-directed mutations on the chaperone-like activity of alphaB-crystallin. J Biol Chem 271,28558-66.

96. Pollard, T. D. (1983). Measurement of rate constants for actin filament elongation in solution. Anal Biochem 134,406-12.

97. Port, J. D. and Bristow, M. R. (2001). Altered beta-adrenergic receptor gene regulation and signaling in chronic heart failure. } Mol Cell Cardiol 33,887-905.

98. Rajaraman, K., Raman, В., Ramakrishna, T. and Rao, С. M. (1998). The chaperone-like alpha-crystallin forms a complex only with the aggregation-prone molten globule state of alpha-lactalbumin. Biochem Biophys Res Commun 249,917-21.

99. Raman, В., Ramakrishna, T. and Rao, С. M. (1995). Temperature dependent chaperone-like activity of alpha-crystallin. FEBS Lett 365,133-6.

100. Raman, B. and Rao, С. M. (1994). Chaperone-like activity and quaternary structure of alpha-crystallin. J Biol Chem 269,27264-8.

101. Rao, С. M., Raman, В., Ramakrishna, Т., Rajaraman, K., Ghosh, D., Datta, S., Trivedi, V. D. and Sukhaswami, M. B. (1998). Structural perturbation of alpha-crystallin and its chaperone-like activity. Int J Biol Macromol 22,271-81.

102. Rembold, С. M. and Kaufman, E. (2003). Heat induced HSP20 phosphorylation without increased cyclic nucleotide levels in swine carotid media. BMC Physiol 3,3.

103. Rembold, С. M., O'Connor, M., Clarkson, M., Wardle, R. L. and Murphy, R. A. (2001). Selected contribution: HSP20 phosphorylation in nitroglycerin- and forskolin-induced sustained reductions in swine carotid media tone. / Appl Physiol 91, 1460-6.

104. Rembold, С. M. and Zhang, E. (2001). Localization of heat shock protein 20 in swine carotid artery. BMC Physiol 1,10.

105. Sharma, К. K., Kaur, H. and Kester, K. (1997). Functional elements in molecular chaperone alpha-crystallin: identification of binding sites in alpha B-crystallin. Biochem Biophys Res Commun 239,217-22.

106. Sharma, К. K., Kaur, H., Kumar, G. S. and Kester, K. (1998). Interaction of l,l'-bi(4-anilino)naphthalene-5,5'-disulfonic acid with alpha-crystallin. / Biol Chem 273, 8965-70.

107. Sharma, К. K., Kumar, G. S., Murphy, A. S. and Kester, K. (1998). Identification of 1,1'-bi(4-anilino)naphthalene-5,5'-disulfonic acid binding sequences in alpha-crystallin. / Biol Chem 273,15474-8.

108. Sharma, К. K., Kumar, R. S., Kumar, G. S. and Quinn, P. T. (2000). Synthesis and characterization of a peptide identified as a functional element in alphaA-crystallin. / Biol Chem 275,3767-71.

109. Smulders, R., Carver, J. A., Lindner, R. A., van Boekel, M. A., Bloemendal, H. and de Jong, W. W. (1996). Immobilization of the C-terminal extension of bovine alphaA-crystallin reduces chaperone-like activity. / Biol Chem 271,29060-6.

110. Smulders, R. H. and de Jong, W. W. (1997). The hydrophobic probe 4,4'-bis(l-anilino-8-naphthalene sulfonic acid) is specifically photoincorporated into the N-terminal domain of alpha B-crystallin. FEBS Lett 409,101-4.

111. Stamler, R., Kappe, G., Boelens, W. and Slingsby, C. (2005). Wrapping the alpha-crystallin domain fold in a chaperone assembly. JMol Biol 353,68-79.

112. Stromer, Т., Ehrnsperger, M., Gaestel, M. and Buchner, J. (2003). Analysis of the interaction of small heat shock proteins with unfolding proteins. / Biol Chem 278, 18015-21.

113. Studer, S. and Narberhaus, F. (2000). Chaperone activity and homo- and hetero-oligomer formation of bacterial small heat shock proteins. / Biol Chem 275, 372128.

114. Studer, S., Obrist, M., Lentze, N. and Narberhaus, F. (2002). A critical motif for oligomerization and chaperone activity of bacterial alpha-heat shock proteins. Eur J Biochem 269,3578-86.

115. Sun, Т. X., Das, В. К. and Liang, J. J. (1997). Conformational and functional differences between recombinant human lens alphaA- and alphaB-crystallin. / Biol Chem 272, 6220-5.

116. Sun, Т. X. and Liang, J. J. (1998). Intermolecular exchange and stabilization of recombinant human alphaA- and alphaB-crystallin. } Biol Chem 273,286-90.

117. Sun, W., Van Montagu, M. and Verbruggen, N. (2002). Small heat shock proteins and stress tolerance in plants. Biochim Biophys Acta 1577,1-9.

118. Sun, X., Fontaine, J. M., Rest, J. S., Shelden, E. A., Welsh, M. J. and Benndorf, R. (2004). Interaction of human HSP22 (HSPB8) with other small heat shock proteins. } Biol Chem 279,2394-402.

119. Taylor, R. P. and Benjamin, I. J. (2005). Small heat shock proteins: a new classification scheme in mammals. } Mol Cell Cardiol 38,433-44.

120. Tessier, D. J., Komalavilas, P., McLemore, E., Thresher, J. and Brophy, С. M. (2004). Sildenafil-induced vasorelaxation is associated with increases in the phosphorylation of the heat shock-related protein 20 (HSP20). / Surg Res 118,215.

121. Tessier, D. J., Komalavilas, P., Panitch, A., Joshi, L. and Brophy, С. M. (2003). The small heat shock protein (HSP) 20 is dynamically associated with the actin cross-linking protein actinin. } Surg Res 111, 152-7.

122. Theriault, J. R., Lambert, H., Chavez-Zobel, А. Т., Charest, G., Lavigne, P. and Landry, J. (2004). Essential role of the NH2-terminal WD/EPF motif in the phosphorylation-activated protective function of mammalian Hsp27. / Biol Chem 279,23463-71.

123. Vander Heide, R. S. (2002). Increased expression of HSP27 protects canine myocytes from simulated ischemia-reperfusion injury. Am } Physiol Heart Circ Physiol 282, H935-41.

124. Veinger, L., Diamant, S., Buchner, J. and Goloubinoff, P. (1998). The small heat-shock protein IbpB from Escherichia coli stabilizes stress-denatured proteins for subsequent refolding by a multichaperone network. / Biol Chem 273,11032-7.

125. Verschuure, P., Tatard, C., Boelens, W. C., Grongnet, J. F. and David, J. C. (2003). Expression of small heat shock proteins HspB2, HspB8, Hsp20 and cvHsp in different tissues of the perinatal developing pig. Eur J Cell Biol 82,523-30.

126. Vischer, U. M. (1998). Insulin resistance and the regulation of vascular tone: is insulin a vasodilator? Eur } Endocrinol 138,262-3.

127. Wang, Y., Xu, A. and Cooper, G. J. (1999). Amylin evokes phosphorylation of P20 in rat skeletal muscle. FEBS Lett 457,149-52.

128. Wang, Y., Xu, A. and Cooper, G. J. (1999). Phosphorylation of P20 is associated with the actions of insulin in rat skeletal and smooth muscle. Biochem J 344 Pt 3,971-6.

129. Wang, Y., Xu, A., Pearson, R. B. and Cooper, G. J. (1999). Insulin and insulin antagonists evoke phosphorylation of P20 at serine 157 and serine 16 respectively in rat skeletal muscle. FEBS Lett 462,25-30.

130. Wang, Y., Xu, A., Ye, J., Kraegen, E. W., Tse, C. A. and Cooper, G. J. (2001). Alteration in phosphorylation of P20 is associated with insulin resistance. Diabetes 50,1821-7.

131. Woodrum, D. A., Brophy, С. M., Wingard, C. J., Beall, A. and Rasmussen, H. (1999). Phosphorylation events associated with cyclic nucleotide-dependent inhibition of smooth muscle contraction. Am } Physiol T77, H931-9.

132. Yamboliev, I. A., Hedges, J. C., Mutnick, J. L., Adam, L. P. and Gerthoffer, W. T. (2000). Evidence for modulation of smooth muscle force by the p38 MAP kinase/HSP27 pathway. Am } Physiol Heart Circ Physiol 278, H1899-907.

133. Zantema, A., Verlaan-De Vries, M., Maasdam, D., Bol, S. and van der Eb, A. (1992). Heat shock protein 27 and alpha B-crystallin can form a complex, which dissociates by heat shock. } Biol Chem 267,12936-41.

134. Zhu, Y. H., Ma, Т. M. and Wang, X. (2005). Gene transfer of heat-shock protein 20 protects against ischemia/reperfusion injury in rat hearts. Acta Pharmacol Sin 26, 1193-200.

135. Zhu, Y. H. and Wang, X. (2005). Overexpression of heat-shock protein 20 in rat heart myogenic cells confers protection against simulated ischemia/reperfusion injury. Acta Pharmacol Sin 26,1076-80.