Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие обратной транскриптазы ВИЧ-1 и ее мутантных форм с субстратами и ингибиторами

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие обратной транскриптазы ВИЧ-1 и ее мутантных форм с субстратами и ингибиторами"

РГ6 О А

2 В МАЙ 1395

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

ПОХОЛОК Дмитрии Константинович

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ ВИЧ-1 И ЕЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ С СУБСТРАТАМИ И ИНГИБИТОРАМИ

03.00.03. — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1995

Работа выполнена в лаборатории энэимологин транскрипции Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Научные руководители!

доктор химических наук, профессор С.Н. Кочетков, кандидат биологических наук В.О. Речинсюга.

Официальные оппоненты I

доктор химических наук А.Г. Габибов.

доктор химических наук В.И. Тишков.

Ведущая организация - Институт биоорганической химия им. М.М.Шемякина и ЮЛОвчаввякова РАН.

Защита состоится 'Хл- " „_....„.„... 1995 года в часов на заседания Диссертационного совета Д 002.79.01 прн Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу 117984, Москва, ул. Вавилова

дом 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

молекулярной биологии им. ВЛ Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан

и

1995 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Начиная со второй половины нынешнего столетия резко возрос удельный вес вирусных болезней в инфекционной патологии человека и животных. Вирусные инфекции представляют собой сложные взаимодействия вируса и клетки—хозяина, что затрудняет поиск мишеней для химиотерапевтических препаратов. Наиболее эффективным противовирусным барьером выступает иммунная система. В связи с этим одними из наиболее опасных семейств вирусов для человека и животных являются неонкогенные ретровирусы, поражающие клетки иммунной системы. Среди них особое место занимает вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), являющийся возбудителем синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) —опаснейшего и на сегонядшиий день неизлечимого заболевания, поразившего человечество в конце XX века. Характерной чертой вирусов вообще и ВИЧ —1, в частности, является быстрое развитие устойчивости к применяемым лекарственным препаратам, что существенно затрудняет лечепие вирусных инфекций. Это справедливо и для широко применяемых в медицинской практике ингибиторов обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ —1, к числу которых относится азидотимидин (ACT). Причиной устойчивости является появление характерных точечных мутаций в гене ОТ —фермента, осуществляющего репликацию вирусного генома (Larder et al., 1989). В связи с этим особую актуальность приобретают исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе феномена устойчивости. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось создание эффективного продуцента ОТ ВИЧ — 1 на основе E.coii, получение мутантных форм ОТ, несущих аминокислотные замены, придающие ВИЧ устойчивость к азидотимидингу (AZT) — наиболее часто применяемому лекарственному препарату, сравнение свойств мутантных форм и ОПГ дикого типа с точки зрения взаимодействия ' названных ферментов с субстратами и некоторыми ингибиторами.

В ходе исследования предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

1. Получение штамма —продуцента ОТ ВИЧ— 1.

2. Получение мутантных форм ОТ ВИЧ—1, содержащих аминокислотные замены, придающие вирусу устойчивость к азидотимидину (AZT)

(А5р67->А5П, Ьу570->Агд, Пи215-»РЬе, 1.уз219->С1п) в различных комбинациях.

3. Разработка методов выделения препаративных количеств ОТ дикого типа и ее мутанта ых форм из полученных продуцентов.

4. Изучение ингибирования активности ОТ ВИЧ —1 рядом соединений класса алкалоидов.

5. Изучение влияния "А2Т—устойчивых" мутаций на свойства ОТ.

Научная новизна: В настоящей работе получен штамм — продуцент, позволяющий нарабатывать значительные количества рекомбинантной ОТ ВИЧ —1 и разработаны процедуры выделения фермента. Получены мутантов гена ОТ, несущих замены устойчивости к А2Т, выделены и очищены до гомогенного состояния соответствующие мутантные формы ОТ. Изучено взаимодействие ряда алкалоидов с ферментом в комплексе с праймером — матрицей. Проведено сравнение свойств ОТ дикого типа и указанных мутантных форм. Показано изменение ряда свойств фермента в зависимости от положения аминокислотных замен и природы матрицы.

Структура и объем работы: Диссертация изложена на страницах

машинописного текста и включает следующие разделы: Введение, Обзор литературы. Материалы и методы, Результаты и их обсуждение. Выводы и Список литературы (155 ссылок). Диссертация содержит 22 рисунка и 9 таблиц.

Апробация: Основные результаты работы докладывались и обсуждались на Международной конференции "Ферментативный катализ" (Москва, 1993), Школе РЕВБ "Структура, функции и дизайн белков." (Греция, 1993), II —ой международной конференции "СПИД рак и ретровирусы человека" (С Петербург, 1993), Школе РЕВЭ "Детекция мутаций." (Швеция, 1995).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Конструирование векторов зкспресснв ОТ ВИЧ-1 в клетках E.coli.

Для получения значительных количеств ОТ ВИЧ — 1 было решено использовать принцип каскадной экспрессии в пггамме — продуценте BL21(DE3), лиэогенному по РНК полнмеразе бактериофага Т7 (Tabor et al„ 1985). Для этого нами были сконструированы две экспрессирующие ОТ плазмиды: pBRP —5 и pBRP—HR (Рис.1), содержащие ген ОТ под контролем промотора РНК — полимеразы бактериофага Т7. Плазмида pBRP —5 (Рис. 1А) была получена в результате клонирования Ясо RI—Hindi И — фрагмента плазмиды pRT—18, содержащего ген ОТ, в вектор pGEMEX — 1, линеаризованный по одноименным сайтам рестрикции. Полный гидролиз полученной на предыдущем этапе плазмиды pGEMEX —RT эцдонуклеазой рестрикции EcoRl и частичный гидролиз ресгриктазой NdeI, с последующей обработкой концов ДНК экзонуклеазой из проростков эолотисюй фасоли и лигироваяием приводили к клонированию гена ОТ непосредственно за последовательностью Т7 промотора.

/

Amp

Рис.1. Карта плазмид рВЯР-5 (А), рВЯР-НЯ (Б).

Для облегчения выделения ОТ, было решено использовать принцип аффинной хроматографии на основе N11—ЫТА—агарозы(№ — Ы —тетраацетапг — агарозы). Для этого в вектор для экспрессии необходимо перед терминаторным триплетом гена ОТ ввести последовательность нуклеотидов, кодирующую шесть остатков гисгидина. Вероятность затрагивания при такой модификации полимеразного центра ОТ, расположенного в N — концевой части молекулы (Кое^сИ е1 а1., 1992) мала. Плазмида pBRP— НЯ (рис. 1Б) была получена пере клонированием ХШ — НМШ фрагмента плазмиды рВИР—5, содержащего последовательность связывания рибосомы с мРНК и ген ОТ, в вектор рЕТ— 23(а). Методом олигонуклеотид — направленного мутагенеза уничтожали стоп — кодон гена ОТ и сайт рестрикции ШпсШ! и вводили сайт рестрикции ЛЛо1.

Гидролиз полученной плазм иды эндонуклеазой рестрикции Xhoi по двум сайтам и последующее лигирование концов плазмиды, укороченной на ХЛо1 — фрагмент (10 пар оснований), приводило к удлинению 3'—конца гена ОТ на последовательность, кодирующую шесть остатков гистидина. Затем фрагмент ДНК, содержащий модифицированный ген ОТ, для удобства последующих манипуляций переносили обратно в вектор pBRP—5 по сайтам рестрикции Xbal и Styl.

2. Получение мутавтных форм ОТ.

Как указано выше, одной из основных задач данной работы было исследование мутантных форм ОТ, несущих аминокислотные замены, обуславливающие устойчивость ВИЧ — 1 к AZT. В качестве объекта нами были выбраны формы, содержащие мутации, описанные Лардером и др. (Larder et al., 1989), а именно Asp67-*Asn, Lys70->Axg, Thr215-»Phe и Lys219-»Gln. Мутантные формы гена ОТ, несущие замены, были получены методом олигонуклеотид— направленного мутагенеза в упоминавшейся выше плазмнде pRT — 18. Всего было получено 15 мутантов гена ОТ, в которых замены были представлены во всех возможных комбинациях (Табл. 1).

Для последующей экспрессии мутантные формы гена ОТ переносили в экспрессирующие векторы pBRP —5 и pBRP— HR.

Таблица 1. Мутантные формы ОТ, несущие аминокислотные замены, обуславливающие устойчивость ВИЧ—1 к AZT.

N Мутантная форма Аминокислотная замена

1 67 D67-»N

2 70 K70->R

3 215 T215->F

4 219 K219-+Q

5 67,70 D67-»N, K70-»R

6 67,215 D67-»N, T215-+F

7 67,219 D67—>N, K219-»Q

8 70,215 K70-*R, T215->F

9 70,219 K70-»R, K219-VO

10 215,219 T215-+F, K219-»Q

11 67,70,215 D67->N, K70-»R, T215->F

12 67,70,219 D67->N, K70-+R, K219-»Q

13 67,215,219 D67->N, T215-»F, K219-*Q

14 70,215,219 K70->R, T215-»F, К219-Ю

15 ПМ D67-»N, K70-+R, T215-*F, K219-»Q

("полный мутант")

3. Получение специфических матриц—праямеров для реакции обратной транскрипции.

В большинстве кинетических исследований ОТ в качестве матриц — праймеров используются гомополимерные дуплексы ро1у(гА) —оМдо((1Т) и ро1у(ЛЛ) —оНдо((1Т) (Апс1гео1а е1 а1., 1993). Однако для корректного сравнения свойств ОТ и ее мутантных форм необходимо использовать также гетерополимерные РНК— и ДНК —матрицы, причем их нуклеотидная последовательность должна по возможности быть идентичной. Для получения таких матриц нами были сконструированы плазм иды рРУ—18 и рРУ—19, являющиеся производными векторов рТ2.~ 18 и 19, соответственно, содержащие 5рЛ1 — 5о/СЛ фрагмент пллзмиды рВИ322.

ДНК —содержащая матрица — праймер (ДМП) была получена посредством гибридизации однонитевой ДНК, выделенной иэ клеток Е.соИ, трансформированных нлазмидой рРУ—18 и инфицированных хелпериым бактериофагом М13К07 (Уек:га е( а1., 1987), с 20—членным синтетическим олигонуклеотидом 5'ССГСТСССТТЛТСССЛСТССЗ'.

Для получения РНК —содержащей матрицы —праймера (РМП), тот же олигонуклеотид отжигали на РНК, полученную при транскрипции на линеаризованной по сайту рестрикции ¿¡а/СП плазм ид е рРУ— 19 (Рокгоуякауа е1 а!., 1994).

В результате были получены специфические РНК— и ДНК — содержащие матрицы — праймеры, содержащие идентичные 100 —членные нуклеотидные считываемые последовательности, причем первым включающимся нуклеотидом являлся сГГМР, что было особенно удобно при определении ферментативной активности мутантных форм ОТ, в первую очередь в присутствии аэидотимидина 5' — трифосфата (АСТТР).

4. Разработка методов выделения ОТ ВИЧ-1 я мутаятиых форм.

Упомянутые выше плазм иды рВЯР—5 и рРКР — ПК были использованы для получения препаративных количеств ферментов. В первую очередь были подобраны оптимальные условия индукции и время накопления активной формы фермента в клетках штамма — продуцента. Эти условия состояли в индукции культуры клеток Е.соИ ВЬ — 21(ОВЗ), трансформированных нлазмидой рВКР — 5 раствором изопропилтиогалактозида в конечной концентрации 0.1 мМ. Наиболее высокий выход активной ОТ достигался в результате инкубации культуры клеток после индукции в течение 2.5 часов. Хотя конструкция рВКР —5 предусматривала

образование ОТ в виде гомодимера рбб/рбб, основной продукт был получен в виде гетеродкмера рб6/р51. Подобный эффект описан в литературе для ряда других продуцентов ОТ (Restle et al., 1990) и обуславливается частичным протеолизом ОТ в посттрансляционный период, а -также во время выделения и при хранении. Это обстоятельство приводило к образованию малой субъединицы р51 и сборке гетеродимера фермента. Однако наиболее эффективной оказалась процедура выделения фермента, модифицированного добавлением к С — концу белка шести остатков гистидина методом аффинной хроматографии на Ni — NTA —агарозе. Максимальный выход активного фермента достигался в тех же условиях, что и для немодифицированного. Выделенная данным методом ОТ представляла собой гомодимер рбб/рбб. Этот эффект может объясняться тем, что при аффинной хроматографии существенно сокращается время выделения, а также достигается лучшая очистка фермента от клеточных протеиназ, осуществляющих отщепление С —концевого участка. Подтверждением последнего предположения является тот факт, что через 3 месяца хранения белки остаются в форме гомодимера.

На рисунке 2 представлены результаты электрофоретического разделения белков лизата клеток штамма—продуцента, и ряда стадий очистки как для как как для модифицированной, так и для немодифицированной ОТ. А. 1 2 Б. 12 3 4 5 6

Г

аь

i ч

i

. ее

: f^rs»

t i yCi»-

,66

l [''- «-'51 t I Ь f

♦ -

H i Ii It

t < & ) < >

f%? « i ь - »

fv

Рис 2. Электрофоретическое разделение в 12% ПААГ в присутствии ДД.С — N3 (А) —лизата клеток штамма —продуцента ОТ через 2.5 часа после индукции (дор. 1) и очищенного, немодифицированного фермента (дор.2) , и (В) —фракции элюции с колонки с N1 — ЫТА—агарозой; дор.2 — проскок с колонки, дор.З—50 мМ имидазола дор.4 — 100 мМ имидазола, дор.5 200 мМ имидазола. дор.6 —250 мМ имидазола.

Результаты иммуноблоттинга полученных препаратов фермента при использовании специфических моноклональных антител к ОТ, подтвердили, что

выделенный белок представляет собой ОТ и доказали его гомодимеригую организацию (данные не приводятся).

5, Кинетический авализ механизма взаимодействия ОТ ВИЧ—1 с алкалоидами.

Среди ингибиторов ОТ ненуклеозидпой природы особое место занимают алкалоиды разных типов В ряде работ (Davidson et al., 1977, Wilson et al., 1976) было продемонстрировано ингибировахне ОТ алкалоидами, однако характер такого взаимодействия все еще недостаточно ясен. Так, имеются данные, что ингибярующий эффект некоторых алкалоидов является результатом связывания последних с матрицей — праймером (Sethi et al.,19?5), в то время как по другим данным имеет место непосредственное ингибиро вание фермента (Tan et al., 1991). В связи с этим определенный интерес представляло исследование взаимодействия полученной рекомбинантной ОТ с некоторыми алкалоидами.

Для тестирования в качестве ингибиторов было отобрано девять соединений. При этом два алкалоида близкой структуры — пальматин и берберин — подавляли активность ОТ как в РНК — , так и в ДНК —зависимом синтезе ДНК, в то время как сангвиритрин проявлял ингибирующую способность только на ДНК —матрице. Остальные соединения не влияли на активность ОТ в концентрациях до 5 мМ. В связи с этим нами было подробно исследовано взаимодействие с тремя алкалоидами — пальматином, берберином и сангвиритрином.

Графики двойных обратных величин (в координатах Лайнуивера — Берка) реакции ОТ в присутствии нескольких концентраций берберина и пальматина при насыщающих концентрациях матрицы — праймера (независимо от ее природы) были характерны для неконкурентного типа ингибирования по отношению к dNTP в пределах концентраций последних 0,8—100 шМ (данные не приводятся).

Кинетика ингибиро вания реакции в условиях насыщающих концентраций dNTP и варьируемых концентраций матрицы—праймера носила более сложный характер и демонстрировала явную зависимость от природы используемой матрицы. В случае ДМП графики двойных обратных величин и графики Диксона (Рис. 3) были линейны во всем диапазоне концентраций матрицы (0,6 —45 нМ). Результаты ингибирования в виде графика двойных обратных величин представлены на рисунке ЗА только для берберина.

Рис.ЗА График двойных обратных Рис.ЗБ. Графики Диксона

величин ингибирования ОТ ингибирования ОТ на ДМП берберином на ДМП. в отсуствие берберином(1), пальматином (2), и берберина (1); 0,139 мМ (2); 0,278 мМ сангвиритрином (3). (3).

Значения констант ингибирования на ДМП составили 0,29±0.03 мМ; 0,37 ±0,03 мМ и 0,002 ±0.0001 мМ для берберина, пальма-тина и сангвиритрина, соответственно.

В случае ингибирования ОТ на ро!у(гА) — о11до(с!Т) и РМП на графиках двойных обратных величин для берберина и пальматина наблюдались отклонения от линейности в области низких концентраций (данные не приводятся). Аппроксимация линейных участков графиков указывала на смешанный тип ингибирования. Графики Диксона для ро1у(сА) —оНдо(йТ) (Рис. 4А) и РМП (Рис. 4Б) были также нелинейны.

Рис.4 А. График Диксона ингибирования

пальматином (2).

Тот факт, что характер ингибирования зависел от природы матрицы, позволил предположить, что действие алкалоида каким-то образом связано со взаимодействием фермента с матрицей — прайме ром

Наиболее приемлкмым объяснением наблюдающейся нелинейности графиков Диксона является предположение о том, что во взаимодействии с ферментом принимают участие две или более молекул ингибитора. Анализ графиков Диксона в соответствии с уравнением Хилла дал значения коэффициента Хилла для ингибирования ОТ берберином и пальматином 2.88±0.02 и 3.02Ю.04, соответственно. Этот результат показывает, что во взаимодействии с ферментом принимает участие не более трех молекул алкалоида, причем процесс связывания показывает явно выраженную положительную кооперативноегь. Поскольку прямое определение констант ингибирования из нелинейных графиков Диксона не представлялось возможным, для их оценки было проведено компьютерное симулирование кинетики ингибирования. Поскольку ингибирующий эффект берберина и пальмаггина был обусловлен скорее всего взаимодействием ОТ с матрицей — праймером, а не с с!МТР, то в качестве простейшей модели было выбрано ингибирование алкалоидом, конкурентное в отношении ро!у(гА)—оЦдо(с1Т). Полученные в эксперименте значения скорости реакции при возрастающей концентрации ингибитора приводились в соответствие с теоретическими кривыми, полученными для кинетических уравнений, описывающих взаимодействие с ферментом одной, двух или трех молекул ингибитора Хорошее соответствие между теоретической кривой, полученной для взаимодействия с тремя молекулами ингибитора в экспериментальными точками являлось, таким образом, критерием достоверности предложенной модели.

На рисунке 5 приведены результаты компьютерного симулирования. Как видно из рисунка, экспериментальные данные наилучшим образом соответствовали модели, согласно которой во взаимодействии с ОТ принимает участие три молекулы алкалоида.

Рис.5 Компьютерное симулирование ингибирования ОТ берберияом на

ро1у(гА)-о1]до(с1Т).

" — экспериментальные значения.

1,2,3—симулированные компьютером кривые ингибирования, соответствующие связыванию с ОТ одной, двух и трех молекул алкалоида.

Рассчитанные значения констант ингибирования: К' = (1830±580) мкМ; К" = (690±240) мкМ; К"' = (3±1) мкМ явились также доказательством положительной кооперативное™ взаимодействия ингибитора с ферментом. Как известно, связывание ингибитора с субстратом, приводящее к неспособности последнего к трансформации в процессе ферментативной реакции кинетически неотличимо от случая простого конкурентного ингибирования, послужившего основой для моделирования теоретических кривых.

Одной из моделей возможного взаимодействия алкалоида с полинуклеотидной матрицей является их связывание посредством интеркалации. Мы сочли необходимым проверить возможность непосредственного связывания алкалоидов с полинуклеотидяыми матрицами путем прямых измерений спектров кругового дихроизма (КД) тотальной ДНК из тимуса теленка и ро)у(гА) — оЦдо(сГГ). Результаты определения спектров КД представлены на рисунке 6.

Следует отметить, что свободные алкалоиды (пальматин, берберин и салгвиритрин) не имели собственных спектров КД (данные не приводятся). При добавлении к раствору ДНК берберина и пальматина, изменений в спектрах обнаружено не было, в то время как в случае сангвиритрина наблюдались гиперхромный эффект при 275 нм и появление новой полосы с 340 нм (Рис.6А).

Рис.6 А. Взаимодействие алкалоидов Рис.6 Б. Взаимодействие алкалоидов с тотальной ДНК из тимуса теленка: с ро!у(гА) — оПдо(с!Т): в отсутствие п отсутствие лигандон (1), сангви — лигандов (1), берберин (2) (спектр рктрин (2), берберин (3) (спектр пальматина аналогичен), сангви — пальматина аналогичен спектру ритрин (3). 2А/Р — амплитуда КД, берберину). 2А/Р — амплитуда КД, рассчитанная на 1см оптического рассчитанная на 1см оптического пути и 1 моль пар оснований пути и 1моль пар оснований полимер«, полимера.

В случае ро1у(гА) — оИдо(с1Т) наблюдалась другая картина. В присутствии пальматина, берберина и сангвиритрина регистрировались изменения в спектрах КД, причем для пальматина и берберина эти изменения были одинаковыми — гиперхромизм при 265 нм и появление отрицательной и положительной полос с Х^ 340 и 375 нм, соответственно. В случае сангвиритрина изменения спектральных характеристик были несколько иными — гиперхромизм при 265 нм, отрицательная и положительная полосы с 315 и 350 нм (Рис. 6 Б).

Полученные данные позволяют утверждать, что из тестируемых алкалоидов в реакцию комплексообразования с ДНК вступает только сангвирнтрин, в то время как с ро1у(гА) — оИдо(с1Т) связываются пальматин, берберин и сангвирнтрин. Спектры КД свидетельствуют также о том, что связывание сопровождается существенными изменениями в структуре полннуклеотидов, однако характер таких изменений остается пока неизвестным.

Результаты, полученные с помощью метода КД показывают, что, хотя эффект ингибирования активности ОТ и связан со взаимодействием алкалоидов с матрицей — нраймером, он не определяется целиком этим взаимодействием. Берберин и пальматин практически не взаимодействуют с ДНК —матрицей, но ингибируют об[хатную транскрипцию. Сангвирнтрин, помимо связывания с ДМП

и ингмбироваиия активности ОТ в ДНК—направленном синтезе, связывается также с ро1у(гА) — оПдо(сГГ), однако в последнем случае ннгибирования фермента не происходит.

Графики двойных обратных величин и Диксона в случае ДМП линейны (в отличие от графиков с обеими РНК —матрицами). В связи с этим можно предположить, что ингибирование бербернном и пальматином включает как "истинное" ингибирование ОТ алкалоидом посредством связывания последнего с ферментом, так и ингибирование в результате взаимодействия с РНК — матрицей. Вполне вероятно, что линейный график Диксона в случае ДМП отражает "истинное" ингибирование фермента, в то время как взаимодействие последнего с РНК —матрицей приводит к наложению эффектов и, как следствие, к нелинейности графика.

В пользу последнего предположения свидетельствуют также результаты экспериментов по преинкубации берберина с компонентами реакционной смеси (данные не приводятся). Преинкубация алкалоида с ОТ приводила к достоверному увеличению степени ннгибирования реакции по сравнению с одновременным добавлением фермента и берберина при сохранении линейного характера графика. В то же время преинкубация последнего с ро!у(гА) — оНдо(с1Т) вызывала гораздо более значительный эффект и приводила к нелинейности графика двойных обратных величин. Таким образом, эти данные свидетельствуют в пользу сложного характера взаимодействия берберина с ОТ, включающего, по —видимому, связывание алкалоида как с матрицей — праймером, так и непосредственно с ферментом.

6. Исследования реакции удлиненна праймера мутантными формами ОТ, несущими замены, обуславливающие устойчивость вируса к А2ПГ.

Одним из тестов, характеризующих свойства ДНК — полимераз, в частности ОТ, является реакция удлинения праймера. Нами были проведены соответствующие эксперименты для полученных мутантов, -однако ниже приводятся результаты только для некоторых из них, поскольку все тестированные мутантные формы проявляли одинаковые свойства. На рисунке 7 представлены результаты реакций удлинения праймера при использовании двух типов матриц (РМП и ДМП) в присутствии изменяющихся концентраций А2ГГТР . и постоянной концентрации дезоксинуклеозид—трифосфатов. Также реакции терминации проводили и в отсутствие смеси с1Г\ГГР.

«-♦ 3

'TT

=4

I 2 3 « 5 0 1 В 9 10 II 12 13 |

«-♦ 1

• - «-«»-Т»I 1 ■"Ч*-* 1 .

Ь. . 411 rt № *11 J«..> — f j I шряя

1 2 3 « 5 6 7 в 9 10 11 12

1

1 2 3 < 5 в 7 в 9 10 11 12

1 ; 1 '5 6 ! 8 ЯО 1112 13 1(15

Рис 7. Результаты электрофоретического разделения продуктов реакции удлинения праймера тремя формами ОТ: диким типом (ОТ), полным мутантом (ПМ) и 67.70.215 в 15% ПААГ, содержащем 7 М мочевину А. Удлинение праймера на ДМП в присутствии 15 мкМ каждого dNTP. Дорожки 1—5 — 67.70.215, 6—10 — ПМ, 11-15- ДТ. Концентрация AZTTP: 100 мкМ Дорожки 5,10,15; 10 мкМ дорожки 4,9,14; 1 мкМ дорожки 3,8,13; 0.1 мк_М дорожки 2,7,12; дорожки 1,6,11 — без AZTTP. Б. Удлинение праймера на РМП в присутствии 15 мкМ каждого dNTP. Дорожки 1 -4~ 67.70.215, 5 -8-ПМ, 9-12- ДТ. Концентрация AZTTP 50 мкМ дорожки 4,8,12; 5 мкМ дорожки 3,7,11; 0.5 мкМ дорожки 2,6,10; дорожки 1,5,9 —без AZTTP. В. Удлинение праймера на ДМП в отсутствие смеси dNTP. Дорожки 1-4-67.70.215, 5-8-ПМ, 9—12-ДТ. Концентрация AZTTP 50 мкМ дорожки 4,8,12; 5 мкМ дорожки 3,7,11; 0.5 мкМ дорожки 2,6,10; дорожки 1,5,9—без AZTTP. Г. Удлинение праймера на РМП в отсутствие смеси dNTP. Дорожки 1-5-67.70.215, 6—10 —ПМ, 11 —15—ДТ. Конце1гтрация AZTTP 100 мкМ дорожки 5,10,15; 10 мкМ дорожки 4,9,14; 1 мкМ дорожки 3,8,12; 0.1 мкМ дорожки 2,7,11; дорожки 1,6,10-без AZTTP.

Как видно из результатов, представленных на рисунке 7, реакция удлинения праймера протекает достаточно эффективно при использовании всех ферментов. Полосы в позиции +1 свидетельствуют о накоплении праймера.

удлиненного на один нуклеотид. Отсутствие данной полосы в дорожках, не содержащих AZTTP, свидетельствует о том, что происходит включение AZTMP в растущую цепь ДНК. Наиболее эффективно включение азидотимидина 5' — монофосфата (AZTMP) происходит в случае отсутствия смеси деэоксинуклеозидтрифосфатов (В и Г). Интенсивность полосы в положении + 1 зависит от концентрации AZTTP в пробе. При постановке эксперимента в присутствии смеси dNTP накопление продукта терминации происходит более эффективно в положениях 5 и 6, что также соответствует местам включения в растущую цепь dTMP. Последнее наблюдение указывает на то, что при инициации синтеза ДНК ОТ отдает большее предпочтение dTTP, в то время как при элонгации более эффективно включается AZTMP. Последнее справедливо как для ОТ дикого типа, так и для ее мутантов. Таким образом, внесение мутаций в ген ОТ не приводит к кардинальному изменению утилизации ферментом AZTTP.

7. Исследования кинетических характеристик мутантных форм ОТ, несущих замены, обуславливающие устойчивость ВИЧ-1 к Л27Г.

Как отмечалось выше, при выделении ОТ нами было отдано предпочтение выделению белка методом аффинной хроматографии. В связи с тем, что в этом случае ОТ выделяется в виде гомодимера, возник вопрос об идентичности кинетических характеристик, гомо— и гетеродимерной форм. Мы провели серию экспериментов, в которой была продемонстрирована практически полное совпадение основных кинетических характеристик гомо— и гетеродимерных форм как для "дикого типа" ОТ, так и для целого ряда мутантов (данные не приводятся). Подобный результат был также получен другими авторами (Diani — Diab et al, 1992; Bordier et al, 1990; Lacey et al, 1993). В связи с этим дальнейшие эксперименты были выполнены главным образом с гомодимерами ОТ.

Основной задачей при выполнении этой части работы было сравнение характеристик ОТ дикого типа и ОТ, несущих "мутации устойчивости к AZT", с целью оценки влияния той или иной замены на ряд свойств фермента. Сравнительный анализ мутантах форм ОТ проводили на трех типах матриц — праймеров: poly(rA) —oligo(dT), ДМП и РМП. При этом на всех типах матриц — праймеров определяли сродство к матрицам, сГГТР и константы иигибирования . AZTTP.

Результаты определения Км и V„„ для трех типов матриц суммированы в таблице 2.

Тип ОТ" Матрица-праймер

poly(rA)-(dT) ДМП, РМП,

Км, нМ Км, нМ Км, нМ

дикий тип 7 100 15 100 2030 100

ПМ 9.41 110 16 53 2026 95

07.215.219 7.3 105 29 84 1750 75

67.70.210 10.6 100 27 09 1370 70

07.70.215 7.54 95 25.2 20 850 30

67.70 7 91 15 67 1400 65

215.219 6.54 100 23.8 52 2300 75

67.215 10.6 85 9.6 16 670 15

67.219 5.15 88 120 93 2085 110

67 13.9 102 51 13 445 21

213 5.5G Ж) 02 33 915 26

219 5 78 53 98 1650 97

* Величины V„„ выражены в процентах. За 100 % принято значение для ОТ дикого типа на каждом из типов матриц —праймеров. Приведены средние значения для трех независимых экспериментов. Ошибка измерений не 4 превышала 25%.

" Обозначение мутантов см. Табл. 1.

Как видно из данных, предстдаленных в таблице 2, значения Км для ДМП и РМП, несмотря на идентичность их структуры, различаются на один—два порядка, как для ОТ дикого типа, так и для мутантов, что указывает на существенную разницу в сродстве фермента к РНК— и ДНК —матрицам в данных условиях эксперимента. Введение мутаций наиболее ярко отражается на снижении величин V„„ при синтезе на ДМП и РМП для мутантов 67.70.215; 67.215; 215 и 67. Для перечисленных мутантов также характерно уменьшение величины Км при синтезе на РМП.

По данным рентгеноструктурного анализа (KohLstaedt et al, 1992.) "мутации устойчивости к AZT" расположены в области связывания матрицы. В связи с этим незначительные изменения в величинах константы, отражающей сродство ОТ к матрице для большинства мутантов были несколько неожиданными. Следует отметить, однако, что участие мутировавших аминокислотных остатков в связывании матрицы строго не показано. Можно предположить, что только некоторые замены и их комбинации оказывают влияние на изменение параметров связывания матрицы, и способствуют приобретению образующимся комплексом фермент —матрица, конформации (или других свойств), препятствующих правильному (эффективному) связыванию AZTTP.

На рисунках 8,9,10 представлены диаграммы, суммирующие результаты экспериментов по определению величин Км для субстрата ((1ТТР) и и К, для конкурентного ингибитора (А¿. 11Р) на трех типах матриц —праймеров. Сопоставление этих величин является наиболее наглядным, поскольку позволяет отнести наблюдаемые изменения либо за счет изменений в сродстве к субстрату, либо за счет эффектов, связанных со специфическими взаимодействиями с АГГГР. Константы ингибировапия для АгТТР вычисляли из среднего значения 150, полученного в трех независимых сериях экспериментов по формуле:

1»= К.и+БукО (1)

где: 1зо — концентрация ингибитора, при которой происходит 50% ингибирование активности фермента, К| —константа ипгибирования, Б0 — концентрация субстрата. К,—константа Михаэлиса для субстрата.

311 211 211

Величины 1з} и К] для АСТТР (мкМ) и Км для <ГГТР (мкМхЮ-1) для мутант»ых форм и дикого типа ОТ при синтезе на ро1у(гА)—оНдо(сГГ). \ЛЛГ — дикий тип, СМ —полный мутант, остальные мутанты отмечены цифрами, соответствующими позициям аминокислотных замен в гене ОТ.

1.2

»50 лгттр акт аттр ню дгттр

п

0.1

67 67 67 67 215 67 67 67 215 219 \ЯТ СМ 215 7« 7» 70 21» 215 21» ' 219 21» 215

Рис. 9. Величины ^ и К, для А2ТТР (мкМ) и Км для сПТР (мкМ) для мутантных форм и дикого типа ОТ при синтезе на ДМП. \ЛТ — дикий тип, СМ —полный мутант, остальные мутанты отмечены цифрами, соответствующими позициям аминокислотных замен в гене ОТ.

Анализ изменения величин на всех типах матриц показал, что увеличение данного параметра происходит максимум в 3 раза на ро1у(гА) — оНдо((1Т) и РМП н в 4 раза на ДМП. Повышение 1» для АгТТР на всех типах матрицы присуще только для ПМ. Для ряда мутантных форм наблюдается повышение величины в зависимости от используемой матрицы. Наибольшими величинами на ро!у(гА) — оИдо(сГГ) и ДМП, наравне с ПМ, обладают мутанты, несущие замены в положениях G7.70.215 (1.1 мкМ на ро]у(гА) — о11до(<1Т) и 0.5 мкМ на ДМП) и 67.215 (приблизительно такие же величины). Однако величины 1М для этих двух мутантов на РМП только незначительно превышают 1», для дикого типа.

Для мутанта 215 характерно несколько другое поведение. Он проявляет повышенную устойчивость к АСТТР на ро1у(гА) — оИдо(сГГ) и РМП (1.2 мкМ и 0.51 мкМ соответственно), что соизмеримо с результатами, полученными для ПМ, в то время как величина 1М на ДМП превышает величину 1М для ДТ в 2.5 раза. Таким образом, хотя величина \ж для данного мутанта на ДМП ниже по сравнению с вышеупомянутыми ферментами, общая картина его поведения аналогична таковой для ПМ. Определение 1Ж для мутанта 67 не представлялось возможным из-за относительно низкой активности фермента.

1.6 1.4 1.2

Н150А2ТТР □ Кт «ЛГТР ВК1А2ГТР

1

0.8 0.6 0.4 0.2 0

У/Т СМ 67 67 67 67 215 67 67 67 215 219

215 70 70 70 219 215 21Э 21Э 219 215

Рис. 10. Величины и К, для АГГТР (мкМ) и Км (мкМхЮ-1) для (1ТТР для мутаитных форм и дикого типа ОТ при синтезе на РПМ. \ЛЛГ— дикий тип. СМ — полный мутант, остальные мутанты отмечены цифрами, соответствующими позициям аминокислотных замен в гене ОТ.

В тоже время, анализ величин К], расчитанных по формуле (1), выявил существенное увеличение данного параметра для ряда мутаитных форм на ро1у(гА) —оПдо(с1Т) и ДМП. На ро!у(гА) — оНдо((1Т) для всех мутантов в большей или меньшей степени происходит увеличение К!( причем наибольшие значения констант были обнаружены для ПМ (О.ЗбмкМ) и для 215 (0.4 мкМ), что превышало значения К| для дикого типа более чем 6 раз.

Наиболее ярко увеличение К1 для ряда мутантов было продемонстрировано на ДМП. Наибольшими величинами констант, превышающими К| для ДТ (0.003 мкМ) в четыре раза и больше, обладали ПМ (0.033 мкМ), 67,70,215 и 67.215 (0.02 мкМ), и 215 (0.013 мкМ).

Неожиданным оказалось увеличение 1М и К, на РМП для мутантов 219; 67.219, 67,215,219 и 67.70.219. Однако следует отметить, что значения К| для трех из них 67.219, 67,215,219 и 67.70.219 были достаточно высокими и при использовании в качестве матрицы ро1у(тА) — оИдо(с1Т). Любопытно, что значения и К, для мутантов 67.70 и 215.219 остаются на одном уровне с параметрами ОТ дикого типа. Не менее интересным оказалось уменьшение К, на РМП для мутантов 67,70,215 и 67.215 до величины 0.02 мкМ, что даже несколько ниже значения константы ингибирования для ОТ дикого типа.

Однако, как отмечалось выше, наиболее полную информацию об устойчивости фермента к конкурентному ингибитору можно получить при сравнительном анализе К) для ингибитора и Км для субстрата, с которым ингибитор конкурирует при связывании и утилизации ферментом. При этом наибольшей устойчивостью будет обладать та мутантная форма фермента, для которой отношение К,/Км (коэффициент устойчивости) будет максимальным. Па рисунке 11 в виде диаграммы приведены величины коэффициентов устойчивости для тестированных мутантов.

219 215 215

Рис. 11. Величины отношения К| (мкМ) для А2ЛТР к Км (мкМ) для <ЯГТР (К,/Км — коэффициент устойчивости) для мутантных форм и дикого типа ОТ при синтезе на ро1у(гА) —оНдо(<1Т), ДПМ и РПМ. \\Т— дикий тип, СМ —полный мутант, остальные мутанты отмечены цифрами, соответствующими позициям аминокислотных замен в гене ОТ.

Было обнаружено, что наивысшими коэффициентами устойчивости на всех типах матриц обладает полный мутант. Мугалты 67.70.215 и 67.215 проявляют аналогичную устойчивость на всех типах матриц. Для мутанта 215 также характерна высокая устойчивость па всех типах матриц по сравнению с ДТ и рядом мутантов. Однако его устойчивость на ДМП несколько ниже, чем у наиболее устойчивых мутантных форм. Что касается устойчивости ферментов на РМП, то в ряд наиболее устойчивых форм, наравне с ПМ и 215 попадают мутанты 219; 67,219 и 67,215,219. Характерно, что ПМ обладает большим значением величины коэффициента устойчивости на РМП по сравнению с остальными мутантами.

Таким образом, результаты кинетических экспериментов показали, что существует корреляция между положением замен в гене ОТ и типом матрицы, на которой данные замены обуславливают устойчивость фермента к AZTTP. Было продемонстрировано, что мутанты 219; 67,219 и 67,70,219 обладают высокой устойчивостью на РНК матрицах, в то время как мутанты 67,215 и 67,70,215 превосходят все мугантные формы кроме ПМ по устойчивости на ДМП. Однако не стоит забывать, что упомянутые последними мутанты проявляют относительно высокую устойчивость и на остальных матрицах. Для полного мутанта характерна высокая устойчивость к AZTTP как иа РНК — , так и на ДНК-матрицах. Свойства фермента, несущего аминокислотную замену в положении 215, характеризуются также устойчивостью на всех типах матрицы, что дает основания рассматривать эту замену в качестве ключевой. Остается неясным, каким образом комбинация аминокислотных замен приводит к снижению устойчивости до уровня ДТ у мутанта 215,219, и снижению устойчивости на РМП для мутантов 67,215 и 67,70,215.

Из полученных данных можно сделать вывод, что взаимосвязь между проявляемой /л vivo устойчивостью ВИЧ —1 к AZT и мутациями в гене ОТ несомненно более сложна, чем представляется на первый взгляд. Хотя в ряде работ предполагается, что наблюдаемая устойчивость связана с действием каких—то иных, не связанных с обратной транскрипцией факторов, по нашему мнению, все же именно мутации в ОТ являются основополагающими в данном феномене. Однако не стоит отказываться от возможности влияния клеточного микроокружения "транскрипционного комплекса" на свойства мутантных форм ОТ.

Возникает вопрос, почему подходы, использованные в данной работе не дали возможности выявить четкие корреляции между мутациями и изменением характера катализируемой ОТ реакции. По нашему мнению, причиной этого может являться несовершенство системы тестирования. Несмотря на то, что при определении кинетических параметров были использованы гетерополимерные матрицы, более близкие к природным, чем обычно применяемая ро1у(гА) — oligo(dT), система все же весьма далека от той, что имеет место при репликации вируса в клетке. Достаточно сказать, что в начале репликации комлекс матрица — праймер представляет собой РНК —РНК дуплекс (вирусная РНК — tRNA1**). Не следует также забывать об участии в репликации белка р7/р9, компактиэующего матрицу, и стало быть, существенно меняющего ее

пространственную структуру. Последнее обстоятельство может самым существенным образом сказываться на взаимодействии матрицы с ОТ. Создал не и использование системы тестирования, включающей указанные выше компоненты, и, тем самым, являющейся более адекватной природным условиям, может существенно приблизить к пониманию механизмов устойчивости.

ВЫВОДЫ.

1. Получен ряд векторов, обеспечивающих высокоэффективную экспрессию гена ОТ ВИЧ - I в Е.соН.

2. Методом олигонуклеотид — направленного мутагенеза получены 15 мутантных форм гена ОТ ВИЧ—1, обуславливающих в белке аминокислотные замены, придающие вирусу устойчивость к аэидотимидину (А2Т) (Л_чр67->А5П, 1.уз70->Агд, ТЫ215->РЬе, 1.уз219->С1п) в различных комбинациях.

3. Разработаны методы выделения препаративных количеств ОТ дикого типа и мутантных форм из созданных штаммов — продуцентов.

4. Изучено взаимодействие ОТ с рядом соединений класса алкалоидов. Показано, что три соединения — берберин, пальматин и сангвиритрин являются ингибиторами ОТ, подавляющими активность фермента по сложному механизму, включающему взаимодействие как с ОТ, так и с матрицей — праймером.

5. Изучены свойства "А2Х —устойчивых" мутантных форм ОТ. Показано изменение ряда свойств фермента в зависимости от положения аминокислотных замен и природы матрицы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ;

1. Pokholok D.K., Gudima S.O., Yesipov D.S., Dobrynin V.N., Rechinsky V.O., Kochelkov S.N. Interactions of HIV—1 RT "AZT —resistant" mutant with substrates and AZT-TP. 1993, FEBS Letters 325: 237-241.

2. Похолок Д.К., Гуляма C.O., Есипов Д.С., Добрынин В.Н., Мемелова A.B., Речинский В.О., Кочетков С.Н., Исследование устойчивости вируса иммунодефицита человека к азидотимидину. I. Кинетические исследования взаимодействия обратной транскриптазы и ряда ее мутантных форм с субстратами и азидотимидин — 5'— трифосфатом. 1994, Биохимия (Москва) 59: 739-746.

3. Гудима С.О., Мемелова A.B. мл., Бородулин В.Б., Похолок Д.К., Медников Б.М., Толкачев О.Н., Кочетков С.Н. Кинетический анализ взамодействия обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека с алкалоидами. 1994, Мол. Биология (Москва) 2В: 1308-1314.