Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение ДНК-полимераз с использованием модифицированных нуклеотидных и олигонуклеотидных субстратов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение ДНК-полимераз с использованием модифицированных нуклеотидных и олигонуклеотидных субстратов"

Г6 од

О ^Д;] СЕМИЗАРОВ ДМИТРИЙ ГЕОРГИЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДИФИЦИРОВАННЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ И ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ СУБСТРАТОВ

03. 00. 03 молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Лаборатории химического и биологического анализе биополимеров и клеток Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Научный руководитель:

доктор хим. наук, проф., акад. РАН А. А. Краевский

Официальные оппоненты:

доктор хим. наук, проф. С. Н. Кочетков кандидат физ.-мат. наук Р. Ш. Бибилашвили

Ведущая организация - Институт физико-химической биологии им. А. Н.

Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В А Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, В-334, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В. А. Энгельгардта РАН.

заседании

1996 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Биосинтез ДНК. - один из важнейших процессов, текающих в клетке. Ключевыми ферментами биосинтеза ДНК являются К-полимеразы, которые в составе мультиэнзимных комплексов обеспечивают ность копирования генетического материала в процессе деления клетки и его эанность в остальных фазах клеточного цикла. В биосинтезе ДНК в ариотической клетке участвуют по крайней мере пять ДНК-полимераз; в псах, инфицированных ретровирусами, функционируют также обратные яскригтгазы этих вирусов. Очевидно, что для понимания процесса биосинтеза К в клетке необходимо изучить свойства индивидуальных ДНК-полимераз.

Особенностью реакции синтеза ДНК, катализируемой ДНК-полимеразами, яется то, что в каждом единичном акте включения нуклеотидного остатка в инуклеотидную цепь фермент утилизирует природные субстраты различной уктуры. При этом точность синтеза ДНК, катализируемого ДНК-имеразами, весьма высока. Все это обусловливает интерес исследователей к имологии синтеза ДНК.

Известно, что ДНК-полимеразы человека значительно отличаются друг от га по структуре, свойствам и специфичности. Еще более значительны личия в субстратной специфичности между ДНК-полимеразами человека и 1атными транскриптазами ретровирусов. Такие различия могут быть выявлены спользованием модифицированных субстратов реакции синтеза ДНК. Кроме о, селективное ингибирование различных ДНК-полимераз человека является »бходимым этапом в изучении биосинтеза ДНК на клеточном уровне.

Исследования в данном направлении представляют интерес и для решения всладных задач, т. к. ингибиторы вирусных ДНК-полимераз используются для явления репродукции вирусов.

Цель и задачи работы. Целью настоящего исследования являлось явление закономерностей связывания и утилизации субстратов различными [К-полимеразами.

В работе были поставлены следующие задачи: исследовать субстратную специфичность различных групп ДНК-полимери-зующих ферментов;

определить различия между этими группами;

выявить селективные субстратные ингибиторы отдельных ДНК-полимераз; сформулировать принципы дизайна стабильных в крови селективных субстратных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ.

Научная новизна работы. Впервые исследована стереоспецифичнос терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы по отношению к нуклеотндным олигонукпеотидным субстратам. Полученные результаты свидетельствуют, чт терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза не связывает специфически образом нуклеиновое основание нуклеотидного субстрата и олигонуклеотидног праймера. Впервые выявлены селективные субстратные ингибиторы этог фермента.

Показано, что модификация одного, двух или даже всех трех фосфатны остатков дезоксинуклеозид-5-трифосфата не лишает его субстратной активност по отношению к обратным транскршгпиам ретровирусов, но резко увеличивае стабильность соединения в сыворотке крови человека.

Показано, что уплощение структуры гликона значительно увеличивае сродство дезоксинуклеозид-5'-трифосфата к обратным транскриптазам ретрови русов и репаративной ДНК-полимеразе р человека.

Впервые выявлены селективные субстратные ингибиторы ДНК-полиме разы а человека.

Практическая ценность работы. Полученные данные позволили сформулировать принципы дизайна селективных ингибиторов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы на основе а-энантиомеров модифицированных дезок-синуклеозид-5'-трифосфатов. В перспективе это дает возможность исследовать функцию этого малоизученного фермента в пре-В-лимфоцитах. Создание ингибиторов этого фермента может иметь практическое значение в связи с тем, что его уровень значительно повышен при некоторых острых лейкемиях.

Сформулированы принципы создания стабильных в крови субстратных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ. Проведенные исследования являются важным этапом в создании препаратов, предотвращающих инфицирование клеток ВИЧ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 статей в международных журналах и 2 статьи в отечественном журнале.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на 11-м Международном круглом столе "Нуклеозиды, нуклеотиды и их практическое применение" (Левен, Бельгия, 1994 г.), и международных конференциях "СПИД, рак и репровирусы человека" (Санкт-Петербург, 1994 г.) и "Молекулярная биология на границе XXI века. Структура генома и функциональный анализ" (Москва, 1994 г.).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из пяти разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и их обсуждение и Выводы. Работа изложена на страницах и содержит рисунков и .......

таблиц. Список цитируемой литературы включает

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В рамках данной работы изучена субстратная специфичность ДНК-элимераз различных типов, а именно репликативных ДНК-полимераз а и б уювека, репаративной ДНК-полимеразы 0 человека, обратных транскриптаз фуса иммунодефицита человека (ВИЧ) и вируса миелобластоза птиц (ВМП) и атрично-независимого фермента терминальной дезоксинуклеотидилтранс-еразы (ТДТ) из тимуса теленка. Исследования проводили с использованием юдующих основных групп модифицированных дезоксинуклеозид-5'-трифос~ атов (dNTP).

1. Стереоизомеры природных dNTP и их аналогов, принадлежащие к (5-L-, -D- и a-L- рядам. Предполагалось изучить стереоспецифичность различных шов ДНК-полимераз и ответить на вопрос, какие части молекулы dNTP [ецифически связываются в активных центрах ДНК-полимераз.

2. Модифицированные dNTP с уплощенным строением гликона. Эти единения представляли интерес в связи с высказанной гипотезой об [лощении структуры гликона при образовании продуктивного комплекса [НК-полимераза + праймер-матрица + dNTP] (Krayevsky and Watanabe, 1993). 1Ким образом, предполагалось, что соединения этой группы моделируют :реходное состояние нуклеотидного субстрата в комплексе с ДНК-полимеразой.

3. dNTP, модифицированные по а-, р- и у-фосфатным остаткам (по дельности и всем трем одновременно). Предполагалось изучить специфичность язывания каждого из фосфатов в соответствующем участке сайгга связывания iTP в активном центре ДНК-полимераз. Другой задачей на этом этапе работы 1Л поиск селективных субстратных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ, тойчивых к действию дефосфорилирующих ферментов крови и, возможно, [особных проникать через клеточную мембрану.

Изучалась также стереоспецифичность ТДТ по отношению к олигонук-отидным праймерам. При этом использовали олигодезоксирибонуклеотиды с конфигурацией нуклеотидных остатков, а также олигодезоксирибонуклеотиды межнуклеозидными P=S связями различной конфигурации (R, S и смешанная

5).

1. ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ ПО ОТНОШЕНИЮ К МОДИФИЦИРОВАННЫМ dNTP

Субстратные свойства модифицированных dNTP исследовали с использованием системы, содержащей одноцепочечную ДНК фага М13лгр10, синтетический олигонуклеотидный праймер, очищенный фермент, исследуемое соединение и набор dNTPx необходимый для достройки праймера перед включением модифицированного dNTP. Продукты синтеза ДНК разделяли электрофорезом в ПААГ, полученные гели радиоавтографировали. Для определения кинетических параметров включения нуклеотидных остатков в цепь ДНК проводили реакцию синтеза ДНК в присутствии исследуемого соединения в различных концентрациях, а полученные радиоавтографы сканировали. Продолжительность реакции находилась в пределах линейного участка кривой скорость реакции versus время. Полученные результаты представляли в виде графиков Лайнуивера-Бэрка, после чего определяли величины Км и V^ реакции.

Таким образом, выбранная нами система позволяет определить молекулярный механизм взаимодействия модифицированных dNTP и олигонуклеотидов с ДНК-полимеразами и оценить их сродство к ДНК-синтезирующему комплексу.

1.1 Стереоизомеры природных dNTP и их аналогов

Была изучена способность обратной транскршттазы ВИЧ и ТДТ из тимуса теленка включать a-D-dNTP (I) и a-L-dNTP (И) в цепь ДНК.

I В = Ade (а) II В = Ade (а)

Thy (б) Thy (б)

Cyt(B)

Ни одно из исследованных соединений не проявило субстратных свойств по отношению к обратной транскриптазе ВИЧ - одному из наименее специфичных матрично-зависимых ДНК-псшимеризующих ферментов. ТДТ включала в праймер два остатка a-D-dNMP, причем образующийся олигонуклеотвд эффективно удлинялся ферментом в присутствии природных dNTP (Рис. 1). Следовательно, олигонуклеотиды, содержащие на З'-конце 1-2 нуклеотидных

статка с а-Э-конфигурацией, способны праймировать синтез ДНК, катали-ируемый ТДТ. Стереоизомеры с ос-Ь-конфигурацией (И) не проявили суб-тратных свойств по отношению к ТДТ.

Были исследованы субстратные свойства ряда карбоциклических аналогов )- и 1*-<1АТР с различной взаимной ориентацией нуклеинового основания и рифосфатного фрагмента (Ш-У1).

Из рис. 2 видно, что соединения III и ГУ эффективно включаются в цепь (НК обратной транскриптазой ВИЧ, тогда как V и VI не узнаются ферментом, кроме того, ß-D- и ß-L-стереоизомеры (III и IV) терминировали синтез ДНК, атализируемый обратной транскриптазой ВИЧ в присутствии природных dNTP рис. 3). В то же время, все четыре карбоциклических аналога (III-VI) оказались ерминирующими субстратами ТДТ (рис. 4). Таким образом, матрично-ависимая обратная транскриптаза эффективно утилизировала лишь соединения диоподобной ориентацией нуклеинового основания и трифосфатного »рагмента, тогда как матрично-независимый фермент ТДТ узнавал как цис-одобные так и транс-подобные изомеры. Полученные количественные данные, именно кинетические параметры включения нуклестщных остатков III-VI в ;епь ДНК (табл. 1, 2), свидетельствуют о том, что все четыре исследованных оединения проявляют близкую субстратную активность по отношению к ТДТ, а акже говорят о высоком сродстве IiyW к обратной транскриптазе ВМП.

Таким образом, впервые найдены высокоспецифичные субстратные нгибиторы ТДТ (V и VI). При определенных обстоятельствах модифици-ованные нуклеозиды с а-хонфигурацией могут быть использованы для изучения акционирования ТДТ в клетке.

аблица 1. Значения Км и Vmax для IV-VII в реакции элонгации праймера на дин нуклеотидный остаток, катализируемой ТДТ

III

IV

V

VI

Соединение__Ш__IV__V__VI

Км, мкМ 3,1 ±0,3 5,0 ±0.2 10,1 ±0,4 5,2 ± _____0,2

1,00 0,88 0,45 0,76

Таблица 2. Значения К„ и Утах для Ш-УИ в реакции элонгации праймера на один нуклеотид, катализируемой обратными транскриптазами ВМП и ВИЧ*

Соединение Обратная транскриптаза и матрица

ВМП, ДНК ВМП, РНК ВМП, РНК ВИЧ, РНК

мкМ ^щах У^^(аАТР) Км, мкМ утах у^алт Км. мкМ V *тах Км. мкМ ^шах УтЯу(а,АТР)

ГО 0,03± 0,004 0,72 0,028± 0,003 0,63 0,069± 0,05 1,38 0,021± 0,002 1,26

IV 0,019± 0,002 0,77 0,0076± 0,0004 0,77 0,014± 0,001 1,51 0,0034± 0,001 1,52

<ЮАТР - - 0,21± 0,05 0,83 0,19± 0,03 1,00 0,20± 0,04 1,00

ЙАТР 1,72± +0,14 1,00 0,034± 0,003 1,00 - - -

*Было использовано несколько РНК-матриц, различающихся по первичной структуре. Эксперименты с РНК-матрицами были проведены Л. С. Викторовой.

1 23456 789 Ю 1112 13 Рис. 1

'ис. I. Элонгация праймера ТДТ. 1) Праймер + фермент; 2) как 1 + 0,2 мкМ ТТР; 3) как 1 + 2 мкМ <ПТР; 4) как 1 + 0,2 мкМ а-Б-сПТР; 5-8) как 1 + 2 [КМ а-О-сГГТР; 9) как 1 + 0,2 мкМ а-0-(1АТР; 10-13) как 1 + 2 мкМ а-0-с1АТР. [осле инкубации проб 6-8 и 11-13 в течение 20 мин добавляли смесь смесь 0,2 :кМ (6, 11), 2 мкМ (7, 12) или 10 мкм (8, 13) природных (ЮТР и инкубировали робы еще 20 мин.

ис. 2. Элонгация праймера обратной транскриптазой ВИЧ. 1) Праймер-матрица ■ фермент; 2) как 1 + 2 мкМ <1ТТР; 3) как 1 + 0,2 мкМ III; 4) хак 1 + 2 мкМ [I; 5) как 1 + 2 мкМ IV; 6) как 1 + 2 мкМ V; 7) как 1 + 2 мкМ VI; 8) как 1 + 0 мкМ V; 9) как 1 + 50 мкМ VI.

1 2 3 45 678 910 11 12 13 14

Рис. 3

Рис. 3. Терминация синтеза ДНК, катализируемого обратной транскриптазой ВИЧ в присутствии 1 мкМ (3) и 2 мкМ (4) ddATP, 1 мкМ (5) и 2 мкМ (6) ddGTP; 1 мкМ (7) и 2 мкМ (8) ddCTP; 1 мкМ (9) и 2 мкМ (10) ddTTP, 5 мкМ (11), 15 мкМ (12), 20 мкМ (13) и 30 мкМ (14) III. 1, 2) Синтез ДНК в отсутствие терминаторов.

Рис. 4. Элонгация праймера ТДТ. 1) Праймер +■ фермент; 2) как 1 + 10 мкМ dATP; 3) как 1 + 10 икМ Ш; 4) как 1 + 10 мкМ IV; 5) как 1 + 10 мкМ V; 6) как 1 + 10 мкМ VI.

Были также исследованы субстратные свойства карбоциклических аналогов

Ш-Х.

ООО

¿Н ¿Н ОН \ }

ООО

¿н ¿н ¿н

idc

VII

VIII

о

HO-f'-CH

IX

X

Было обнаружено, что эти соединения являются субстратами ТДТ, но не (ключаются в цепь ДНК обратными транскриптазами. Их сродство к ферменту ¡ыло несколько ниже, чем сродство III-VI.

Результаты, представленные в данном разделе, свидетельствуют, что обратные транскриптазы наряду с модифицированными (З-D-dNTP утилизируют акже аналоги dNTP p-L-ряда. Способность этих ферментов узнавать различные юдифицированные p-L-dNTP была установлена ранее (Roberts et al., 1992, 1994; iait et al., 1992; Cheng et aL, 1992; Skalski et al., 1993). Это свойство обратных ранскриптаз может быть объяснено на основании данных компьютерного юделирования (Краевский и Чернов, 1996).

Совокупность данных, полученных для стереоизомеров различных :арбоциклических аналогов dNTP, позволяет утверждать, что для матрично-(езависимого фермента ТДТ взаимная ориентация нуклеинового основания и рифосфатного фрагмента не имеет решающего значения, тогда как матрично-ависимые ДНК-полимеризующие ферменты утилизируют лишь аналоги dNTP с »»-подобной ориентацией этих структурных элементов.

В рамках данной работы Д. Н. Черновым были проведены компьютерные »асчеты молекул монофосфатных аналогов соединений III-VI. На рис 5 федставлены их конформации, отвечающие локальному минимуму свободной 1нергии. Молекулы изображены таким образом, что атомы Р-СН2-0-С4', юдержащие реакционный центр (а-фосфат), а также гликоны совмещены для >сех четырех изомеров. Видно, что при такой суперпозиции положение 1уклеиновых оснований совпадает для ш/с-подобных изомеров, но значительно ггличается для транс-подобных изомеров между собой и по сравнению с цис-юдобными изомерами.

1.2 Модифицированные dNTP с уплощенной структурой гликона

Особенностью соединений,- составляющих данную группу, является ограниченная конформационная подвижность гликона и высокая степень копланарности атомов С Г, С2', СЗ' и С4'. Придать планарность гликону dNTP и ограничить его конформационную подвижность можно либо введением дополнительного цикла, сопряженного с углеводным фрагментом по связи С2'-С3\ либо созданием двойной связи С2-СЗ'. В частности, это было показано рентгеноструктурным анализом для 2',3,-дидезокси-2',3'-дидегвдронуклеознаов (Hutcheon и Janus, 1974; Birnbaum et al., 1989; Gurskaya et al., 1991; Hart et al., 1991) и для 2',3-ликсоангидротимидина и 2',3'-рибоангидротимидина (Guiskaya et al., 1990; Гурская и соавт. 1991). Известно, что в комплексе [ДНК-полимераза I Е. coli + матрица-праймер+dNTP], гликон нуклеотида имеет уплощенную структуру (Ferrin и Mildvan, 1985, 1986).

Соединения XI-XIII были изучены в качестве субстратов обратных транскриптаз ВИЧ и ВМП, а также ДНК-полимераз а, ß и е человека.

Было обнаружено, что Х1-ХШ включаются в З'-конец цепи ДНК обратными транскриптазами ВИЧ и ВМП и ДНК-полимеразой р, но не являются субстратами ДНК-полимераз а и е. Исследованные соединения также терминировали синтез ДНК, катализируемый обратными транскриптазами в условиях конкуренции с dTTP. Типичная терминационная картина представлена на рис. 6. Были определены кинетические параметры включения единичного нуклеогидного остатка соединений Х1-ХШ в цепь ДНК обратной транскриптазой ВМП (табл. 3). Видно, что все три модифицированных ¿ЫТР имеют величины К,,, близкие к таковым для <ГГТР; отношение л/тах/Кт для них отличалось в 1,5-2 раза от такового для dTГP.

XI

XII

хш

ЩГ

Рис. 5

1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 6

Рис. 5. Структуры монофосфатных аналогов соединений Ш-У1 (виды спереди и :верху). Гликоны и фосфатные фрагменты различных молекул наложены друг на 1руга.

Рис 6. Терминация синтеза ДНК, катализируемого обратной транскриптазой ВИЧ в присутствии 2 мкМ <1с1АТР (1), ddGTP (2), сЫСТР (3) и сМТТР (4) и 2 икМ (5), 5 мкМ (6), 20 мкМ (7) и 100 мкМ (8) XI.

Таблица 3. Значения Км и для Х1-ХШ в реакции элонгации праймера на один нуклеотидный остаток, катализируемой обратной транскриптазой ВМП

Субстрат К„ У^Л^ЛТР)

аттр 1,25 1 0,8

XI 2,7 0,3 0,11

XII 2,2 0,38 0,17

XIII 3,1 0,47 0,15

Таблица 4. Отношения мольных концентраций [модифицированный субстрат]/|с!ТТР], при которых наблюдается 50%-ное ингибирование синтеза ДНК

Ингибитор Обратные транскриптазы ДНК-полимераза а

ВМП ВИЧ

XI 3,0 100

XII 20 1.4 20

XIII 20 1Д 20

Из табл. 4 видно, что соединения Х1-ХШ ингибируют на 50% синтез ДНК, катализируемый обратной транскриптазой ВИЧ, при отношении концентраций [аналог]/[<ПТР], равном 1,4-3,0. В то же время, они ингибируют синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой а, лишь в концентрациях на 1-2 порядка величины более высоких.

Были также изучены субстратные свойства ряда ациклических аналогов <ЮТР с уплощенной структурой псевдогликона (XIV-XV).

НАРзСН20^ В ЩУзО^ Мс Н4О9Р3О—^ Ъ

XIV В ■» АЛе (а) XV XVI В = Аёо (а)

виа (6) Су1 (б)

Су1 (в) ТЬу (в) ТЪу (г)

Из рис. 7 видно, что соединения XIV являются терминирующими субстратами обратной транскриптазы ВИЧ; XV также утилизировался этим ферментом. Ациклические аналоги сЩТР Х1Уа-г эффективно терминировали синтез ДНК обратной транскриптазой ВИЧ в присутствии <НЧТР;

ерминационная картина наблюдалась уже в присутствии 2 мкМ Х1Уа-г (рис. 8). 1 табл. 5 представлены кинетические параметры для Х1Уа и XV в реакции лонгации праймера на одно звено, катализируемой обратной транскриптазой 1ИЧ. Показано также, что соединения XIV ингибируют на 50% синтез ДНК, атализируемый обратной транскриптазой ВИЧ, при отношении концентраций Х1У]/|(ИЧТР1 равном 1,2-1,3, т. е. проявляют такую же ингибиторную ктивность, как и XVI, изученные ранее (Кгауеуяку е1 а!., 1993). При этом XIV, в тличие от XVI, не утилизировались ДНК-полимеразами а, (3 и е человека, а акже ТДТ из тимуса теленка. Таким образом, "перестановка" метиленовой руппы и атома кислорода в соединениях XVI привела к образованию елективных субстратных ингибиторов обратной транскриггтазы ВИЧ.

аблица 5. Значения К„ и для XIV» и XV1 в реакции элонгации праймера а один нуклеотидный остаток, катализируемой обратной транскриптазой ВИЧ

Соединение ХГ/л XV «ЗАТР

К, 3,1 ±0,1 9,8 + 0,3 0,72 ± 0,03

Ч^/У^ЛЛАТР) 0,78 0,28 1

Следует отмстить, что карбоциклические аналоги с11ЧТР Ш-Х также могут ыть отнесены к рассматриваемой группе, т. к. их гликоны имеют уплощенную груктуру благодаря наличию двойной связи С2'-С3' (III-VI) или трехчленного арбоцикла, сопряженного с гликоном по связи С2'-С3' С^Н-Х). Как следует из анных, приведенных в разделе 1.1, аналоги (З-О-сЗЫТР и (З-Ь-сЮТР (III и IV, эответственно) являются субстратами обратных транскриптаз и проявляют ысокое сродство к этим ферментам.

Итак, полученные результаты показывают, что, несмотря на значительную одификацию гликона по сравнению с природными <ЙЧТР, исследованные одифицированные <ЮТР с уплощенной структурой гликона являются :рминирующими субстратами ретровирусных обратных транскригпаз и ДНК-олимеразы (3 человека. Сродство этих соединений к перечисленным ферментам глико и превышает сродство других известных модифицированных сНЧТР. (олученные данные представляются весомым аргументом в пользу гипотезы об площении структуры гликона сПЧТР при образовании продуктивного комплекса 1НК-полимераза + праймер-матрица + (ЮТР].

12 3 4

Л

тг

1 2 3

ТПТ

1 2 3 4 5

ТТ1 I

1 2 3 4 5

Рис.7

■о*.

шаг

*6Ш1

Рис. 7. Элонгация праймера обратной транскриптазой ВИЧ. 1) Праймер-матрица + фермент. А) как 1 + 10 мкМ (1ТТР (2); как 1 + 10 мкМ ХР/г (3); как 1 + 100 мкМ ХГУг (4). Б) как 1 + 10 мкМ dTTP + 10 мкМ ХР/б (2); как 1 + 10 мкМ <1ТТР + 100 мкМ ХГ/б (3). В) как 1 + 10 мкМ <1ТТР + 10 мкМ сЮТР (2); как 1 + 10 мкМ <ПТР + 10 мкМ сЮТР + 10 мкМ ёёАТР (3); как 1 + 10 мкМ <ПТР + 10 мкМ <ЮТР + 10 мкМ ХГУа (4)- как 1 + 10 мкМ <ГГТР + 10 мкМ сЮТР + 100 мкМ ХГУа (5). Г) как 1 + смсй^ТО мкМ^ШТР (2); как 1 + 10 мкМ с1ТТР + 10 мкМ сЮТР + 10 мхМ йАТР + ЮтаЯу^ как 1 + 10 мкМ <ЛТР + 10 мкМ сЮТР + Ю мкМ с!АТР + ю мкМ ХП/в (4); как 1 + 10 мкМ сПТР + 10 мкМ сЮТР + 10 мкМ <!АТР + 100 мкМ ХП/в (5).

Рис. 8. Терминация синтеза ДНК, катализируемого обратной транскриптазой ВИЧ в присутствии ХГУа (А), ХР/б (Б), Х1Ув (В) и ХР/г (Г)- Концешрации терминаторов: 5 мкМ (1), 10 мкМ (2), 20 мкМ (3) и 50 мкМ (4).

3 (1ЫТР, модифицированные по трифосфатному остатку

Изученные сИЧТР, модифицированные по трифосфатному остатку, могут »ггь разделены на несколько групп. Первую группу составляют соединения, щержащие заместители в у-фосфате.

" 11 » л -г, .

Р11-Р-0-Р-0-Р-0—1 ^ ТЬу

¿н

он

он

х>

XVII 11 =

ОН (а) N3 (6)

О

¿н

О ТЬу

РИ—О—Р-О—Р-О—Р-О—| {

¿н ¿н V N

XVIII Я=ОН (а) N3 (б)

О О

о

РЬ-М-Р-О-Р-О-Р-О Н ОН ¿Н ОН

О^ Т11У

XIX

Я = ОН (а) N3(6)

ООО

II II II /-, т

Ме—Р-О—Р-О-Р-О—| Х

ОН ОН ОН ^ ^

ТЬу

V/

XX

Я = ОН (а) N3(6)

Соединения ХУИ-ХХ были изучены в качестве субстратов обратных 1анскриптаз ВИЧ и ВМП, ДНК-полимераз аир человека, а также ТДТ из [Муса теленка. Из рис. 9 видно, что соединения, содержащие З'-гидроксил, ногократно включались в цепь ДНК обратной транскриптазой ВИЧ. [одифицированные нуклеотиды ХУШа и Х1Ха также утилизировались ДНК-элимеразами а человека и ТДТ из тимуса теленка, тогда как ХУНа и ХХб не апоча-лись в цепь ДНК этими ферментами. ДНК-полимераза (3 утилизировала шько соединения Х1Ха и ХХа. Результаты экспериментов с ДНК-полимеразой и ТДТ представлены на рис. 10 и 11, соответственно. Эксперименты с ДНК-злимеразой (3 были проведены Л. С. Викторовой. Из табл. 6 видно, что шетические параметры для соединений, содержащих З'-гидроксил, близки к жовым для <ПТР, а К,,, и для производных сПТР(3'К3) на порядок больше, ;м таковые для сГГТР и сЛТР(3'Н3). Показано, что соединения, содержащие 3'-1Идо группу, селективно ингибируют обратную транскриптазу ВИЧ, причем :лективность йнгибирования для них выше, чем для сПТР(3'Ы3) (табл. 7).

Была изучена стабильность соединений ХУИб, ХУШб, Х1Х6 и ХХб в >шоротке крови человека. Для у-фенилфосфоната XVIIб и у-метилфосфоната Хб время 50%-ного дефосфорилирования было в 8 и И раз, соответственно, эльше, чем для <ПТР(3'Ы3). Следует отметить, что ХУПб и ХХб весьма гидро-обны для соединений такого типа: время их удерживания при ВЭЖХ на обра-

щенно-фазовой колонке даже больше времени удерживания сГГМР(ЗТ^3) (данньк А. А. Арзуманова).

Таблица 6. Значения Км и У^ для XV! [-XX в реакции элонгации праймера не один нуклеотидный остаток, катализируемой обратной транскриптазой ВМП

Соединение Кт, мкМ

ХУНа 3 ±0,2 0,78

ХУИб 10 ± 0,4 0,68

ХУШа 2,8 ± 0,1 0,86

ХУ111б 18 ± 1 0,71

Х1Ха 3,1 ±0,8 0,82

Х1ХЬ 21,4 ±0,8 0,76

ХХа 4,4 ± 0,3 0,74

ХХб 20 ± 0,6 0,68

ЛТРО'М,) 0,96 ± 0,08 0,92

(1ТТР 1,3 ±0,1 1

Таблица 7. Отношения мольных концегараций [модифицированный субс1рат]/[(1ТТР], при которых наблюдается 50%-ное ингибирование синтеза ДНК

Соединение ДНК-полимераза а ТДТ Обратная транскриптаза ВИЧ

ХУ116 967 130 2,8

ХУШб 800 173 3,2

Х1Х6 1066 170 3,7

ХХб 307 106 2,9

сЛТР(ЗЧЧ3) 186 117 2,1

Ко второй группе относятся аналоги ёМТР, модифицированные по а-фосфату. Соединения Х^П'а.б были изучены в качестве субстратов ряда ДНК-полимеризующих ферментов.

Рис. 10

ГП I 1'ТГ I I I I I I 1

13С2 123412341 234 Рис. 9

[с. 9. Элонгация праймера обратной транскриптазой ВИЧ в присутствии XVI 1а ), XVIIIa (А) и Х1Ха (В). 1) Праймер-матрица + фермент + 2 мкМ дифицированный (1ТТР; 2) как 1 + 2 мкМ <ЮТР; 3) как 1 + 2 мкМ сЮТР + 2 :М аАТР; 4) как 1 + 2 мкМ dGTP + 2 мкМ с!АТР + 2 мкМ dCTP. к1) >аймер-матрица + фермент; к2) праймер-матрица + фермент + 2 мкМ ЛТР. с. 10. Элонгация праймера ДНК-полимеразой ои 1) Праймер-матрица + рмент; 2) как 1 + 2 мкМ dTTP; 3) как 1 + 2 мкМ ХМ1а; 4) как 1 + 20 мкМ 'На; 5) как 1 + 2 мкМ ХМНа; 6) как 1 + 20 мкМ ХУШа; 7) как 1 + 2 мкМ Ха; 8) как 1 + 20 мкМ Х1Ха; 9) как 1 + 2 мкМ ХХа; 10) как 1 + 20 мкМ ХХа.

ООО

II II II

HO—P-O—Р-О-Р-СН,—о

III-'

OH OH OH

R

XXI В = Thy (a) Ad? (6)

Было обнаружено, что они включаются в цепь ДНК только ДНК полимеразой а человека (рис. 12) и не утилизируются ДНК-полимеразами р и человека и обратными транскриптазами ВИЧ и ВМП. Это уникальное свойств' XXI было использовано аия дискриминации ДНК-полимераз е и а при к совместном выделении из плаценты человека. Следует отметить, что ДНК полимераза а включала в цепь ДНК только два остатка ХХ1а или ХХ16, поел чего синтез прекращался даже в присутствии сЮТР. Очевидно, включение дву: остатков XXI в растущую цепь ДНК. приводит к значительным искаженияк структуры праймер-матричного комплекса.

Третья группа аналогов сНЧТР, модифицированных по трифосфатном; остатку, включает карбоциклические соединения типа XXII, у которых все тр! фосфата модифицированы. Их особенность заключается в том, что они содержат лишь одну связь, гидролизуемую дефосфорилируюшими ферментами (Ра-Рр).

Карбоциклические аналоги XXII включались в цепь ДНК обратными транскриптазами ВИЧ и ВМП и ТДТ, правда, в несколько раз менее эффективно, чем контрольное соединение XXIII.

Результаты, представленные в этом разделе, а также данные, полученные для соединений III и IV, иллюстрируют возможность модификации любого из трех фосфатов dNTP (и даже всех трех одновременно) с сохранением и> субстратных свойств по отношению к обратным транскриптазам. Проведенные исследования указывают на возможность создания нового поколения ингибиторов репродукции ВИЧ, для которых внутриклеточное фосфорилирование не является необходимым. Возможно, такие соединения могут быть использованы для предохранения клеток от инфицирования ВИЧ.

О

О О

ООО

XXII

XXIII

I I I 1 2 3

I U l

4 5 6 "

I -г Г

7 8 9 10

о

л-

'Л'э'Л'Л'еЧШ

Рис. 11

Рис. 12

le. 11. Элонгация праймсра ТДТ. 1) Праймер + фермент; 2) как 1 + 2 мкМ ТР; 3, 4) как 1 + 2 мкМ (3) и 20 мкМ (4) XVIIa; 5, 6) как 1 + 2 мкМ (5) и 20 :М (6) XVIIIa; 7, 8) как 1 + 2 мкМ (7) и 20 мкМ (8) Х1Ха; 9, 10) как 1 + 2 :М (9) и 20 мкМ (10) ХХа.

1С. 12. Элонгация праймера ДНК-полимеразой а. 1) Праймер-матрица + рмент. 2) как 1 + dTTP; 3) как 1 + XXIa; 4) как 1 + dTTP + dGTP; 5) как 1 + Cía + dGTP; 6) как 1 + dTTP + dGTP + dATP; 7) как 1 + XXIa + dGTP + TP; 8) как 1 + dTTP + dGTP + dATP + dCTP; 9) как 1 + XXIa + dGTP + ,TP + dCTP; 10) как 1 + dTTP + dGTP + XXI6; 11) как 1 + XXIa + dGTP + (16 + dCTP. Концентрация субстратов - 10 мкМ.

2. ИЗУЧЕНИЕ ПРАЙМИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В СИНТЕЗЕ ДНК, КАТАЛИЗИРУЕМОМ ТДТ

Была изучена зависимость эффективности праймирования от конфигу рации! ¡^»"cOvimii.^ ¡1 фосфатных остатков, составляющих олиглчук^этил.

Для этого были исследованы праймирующие свойства двух олигодезокси рибонуклеотидов, состоящих из остатков dTMP с а-конфигурацией [a-(dT)12 и a (dT)4J. В контрольных опытах использовали (dT)w и (dT)4. Из рис. 13 видно, то a-(dT)12 и a-(dT)4 элонгировались ТДТ в присутствии dGTP. В присутствш dCTP фермент удлинял лишь a-(dT)n. Также была изучена праймирующа! активность декадезоксиаденилатов, содержащих фосфотионатные группы. От различались конфигурацией при атомах фосфора (полностью Rp, полностью Sp i смешанная RpSp). Было показано, что только олигонуклеотвд с Rp конфигурацией эффективно праймирует синтез ДНК, катализируемый ТДТ, тогда как S олигонуклеотид не элонгируется ферментом, а RpSp олигоаденилат весьм: неэффективен в качестве праймера (рис. 14). Вероятно, существенными дго праймирования являются по крайней мере три З'-концевых остаткг олигонуклеотида и поэтому незначительный синтез ДНК в присутствие олигодезоксиаденилата со смешанной конфигурацией может бьггь объяснер присутствием в смеси молекул с Rp конфигурацией трех З'-концевьл нуклеотидных остатков.

Автор выражает глубокую благодарность Н. Б. Дяткиной, Е. А. Широковой, А. А. Арзуманову, А. В. Шипицыну, и М. В. Ясько (ИМБ им. В. А Энгельгардта РАН), G. Gosselin и В. Reyner (Université de Montpellier II, Science: et Techniques du Languedoc) и M. Koziolkewicz и W. Stec (Centrum Badar Molekularnych i Makromolekulamych, Polska Akademia Nauk, Làdt) за предостав ление модифицированных нуклеотидов и олигонуклеотидов, использованных i данной работе.

«1 •

«1 -

о . а - •

да ^гь * о

•

* -- о

% т •

* •

» « _

о

©

1 1 1 I I I * -< I п I П

1 234 12 34 123 4 1 234

Рис. 14

В

Б

Рис. 13

с. 13. Элонгация (<1Т)10 (А), а-(<1Т)12 (Б), (<1Т)4 (В) и а-(<1Т)4 (Г) ТДТ в ясутствии 0,2 мкМ (2), 2 мкМ (3) и 20 мкМ (4) сЮТР. 1) Праймер + фермент, с. 14. Элонгация ТДТ декадезоксиаденилата с фосфотионатными меж-слеозидными группами в присутствии 2 мкМ с!АТР (1), сЮТР (2), dCTP (3) и ТР (4). 1) Праймер + фермент. А) ^-конфигурация; Б) ^-конфигурация; В) гшанная Л^-конфигурация.

выводы

1. Исследованы субстратные свойства нескольких групп модифицирован ных сЮТР по отношению к репликативным ДНК-полимеразам а и £ человскг репаративной ДН К-полимеразе р человека, ТДТ из тимуса теленка и обратны)

_________________ тл! — Гц 1ГТ г_________________________

I п и 1*111. иоиш нимиапи и^д^щ^у..

- Диастереомеры природных субстратов ДНК-полимераз (р-Э-дИТР), именно а-0-<ЮТР, а также различные карбоциклические аналоги ёЫТР с а-Б 1 а-Ь конфигурацией являются субстратами матрично-независимого фермент ТДТ, но не утилизируются ни одним из изученных матрично-зависимых ДНК полимеризующих ферментов. Полученные данные позволяют предположить, чт ТДТ не связывает нуклеиновое основание «НЧТР специфическим образом.

- Несколько групп модифицированных (ЮТР с уплощенной структурой 1 ограниченной конформационной подвижностью гликона являются эффективными терминаторными субстратами обратных транскрипта ретровирусов, ДНК-полимеразы р и ТДТ. Все соединения проявили высокун субстратную активность. Некоторые из них имеют сродство к активному центр; ферментов, превышающее на 1-2 порядка величины сродство природных <ЮТР Эти данные подтверждают гипотезу об уплощении структуры гликона пр! образовании продуктивного комплекса [ДНК-полимераза + матрица-праймер н ¿ГИЛ-

- Некоторые виды модификаций трифосфатного остатка не лишают ёЬГП субстратных свойств по отношению к обратным транскриптазам. При эток повышается селективность ингибирования синтеза ДНК, катализируемоп обратными транскриптазами. Кроме того, «ШТР, определенным образок модифицированные по трифосфатному остатку, обладают повышенное стабильностью в крови и весьма высокой гидрофобностью, что определяв" возможность их проникновения в клетку с последующим ингибированиеь обратной транскриптазы ВИЧ.

2. Впервые выявлены некоторые закономерности, связанные сс стереоспецифичностью синтеза ДНК, катализируемого ТДТ. Показано, что

- а-О-Олигодезоксирибонуклеотиды элонгируются ТДТ в присутствии как природных р-0-<ЗЮ"Р, так и а-О-сЮТР;

- олигонуклеогиды с фосфотионовыми межнуклеозидными группами прайми-руют синтез ДНК, катализируемый ТДТ, только при Ир-конфигурации фосфорных фрагментов. Олигонуклеогиды с 5р-конфигурацией при атоме фосфора не могут служить праймерами для ТДТ.

3. Впервые обнаружены высокоспецифичные субстратные ингибиторы ДНК-полимеразы а человека и ТДТ.

сновное содержание диссертации изложено в следующих работах:

D. G. Semizarov, L. S. Victorova, A. A. Krayevsky, M. К. Kukhanova. Modified Nucleoside 5'-Triphosphates Containing 2',3'-Fused Three-Membered Rings as Substrates for Different DNA Polymerases. FEBS Lett., 1993, Ш, 45-48.

E. A. Shirokova, N. B. Tarussova, A. V. Sliipitsin, D. G. Semizarov, A. A. Krayevsky. A Novel Series of Acyclic Nucleotides and Nucleoside 5'-Triphospliates Imitating 2,,3'-Dideoxy-2',3'-Didehydronucleotides: Synthesis and Biological Activity. / Med. Chem., 1994, Д7, 3739-3748.

D. G. Semizarov, L. S. Victorova, N. B. Dyatkina, M. von Janta-Lipinski, and A. A. Krayevsky, Selectivity of DNA Polymerases toward a and 0 Nucleotide Substrates of D and L Series, FEBS Lett., 1994, 254, 187-190. M. V. Jasko, D. G. Semizarov, L. S. Victorova, D. Yu. Mozzherin, A. A. Krayevsky, M. K. Kukhanova, New Modified Substrates for Discriminating between DNA Polymerases a and e, FEBS Lett., 1995,157, 23-26. A. Shutalev, I. Mikerin, B. Arshava, Yu. Raifeld, G. Gurskaya, M. Jasko,

D. Semizarov, L. Victorova, V. Lee. Synthesis and Crystal Structure of 3'-Fluoro-3'-methyl-2',3'-dideoxythymidine. Inhibitory Effect of 3'-Fluoro-3'-methyl-2',3'-dideoxythymidine 5'-Triphosphate on DNA Synthesis, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 761-768.

E. A. Shirokova, N. B. Tarussova, A. V. Sliipitsin, D. G. Semizarov, M. Hieber, and A. A. Krayevsky, Novel Open-Chain Nucleotides Imitating 2',3'-Dideoxy-2',3'-Didehydronucleotides: Synthesis and Substrate Properties toward DNA Polymerases, Nucleosides and Nucleotides, 1995,14, 749-751. N. Dyatkina, D. Semizarov, L. Victorova, A. Krayevsky, F. Theil, M. von Janta-Lipinski, Synthesis of Four Stereoisomers of Carbocyclic 5-NOR D4A and Evaluation of Their Triphosphates as Substrates for DNA Polymerases, Nucleosides and Nucleotides, 1995,14,723-726.

Д. Г. Семизаров, JI. С. Викторова, А. А. Краевский, М. К. Куханова, Модифицированные нуклеозид-5'-трифосфаты с дополнительным сопряженным по 2',3'-связи циклом как субстраты ДНК-полимераз, Молекулярная биология, 1994, 28, 113-126.

Д. Г. Семизаров, М. В. Ясько, М. К. Куханова, А. А. Краевский, Новые нуклеотидные ингибиторы ДНК-полимеразы а человека, Молекулярная биология, 1995, 22, 689-701.