Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Энзиматические свойства комплекса ДНК-полимераза альфа-праймаза из куколок тутового шелкопряда, инфицированных вирусом ядерного полиэдроза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Энзиматические свойства комплекса ДНК-полимераза альфа-праймаза из куколок тутового шелкопряда, инфицированных вирусом ядерного полиэдроза"

Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени педагогический государственный университет им.В.И.Ленина

Специализированный Совет К 053.01.01

на правах рукописи

воронова светлана николаевна

энзиматические свойства комплекса днк-полимераза^-праймаза из куколок тутового 'шелкопряда, инфицированных вирусом ядерного п0лиэдр03а

03.00.04 - биохимия

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1992

Работа выполнена в лаборатории биохимии Института биологии развития им. Н.К.Кольцова АН СССР

Научные руководители: доктор биологических наук ЫИХАМОВ B.C. доктор биологических наук . КУЛЛЫЕВ П.К.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук , ст. н. с.

М.К.КУХАНОВА

кандидат биологических наук , доцент Г.А.СЕВАСТЬЯНОВА

Ведуцая организация - Институт биохимии им.А.Н.Баха

Залдата диссертации состоится/Зсы^йДЦ 1992г. часов на заседании Специализированного совета К 053.01.01 по защите диссертаций ка соискание ученой степени кандидата биологических наук в Московском педагогическом государственном университете им.В.И.Ленина по адресу:ул.Кибальчича, д.б.кор. ¿~,ауд. ¿ГО&

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке университета по адресу: ул.Малая-Пироговская, д.1.

Автореферат разослан 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного

совета диктор биологических наук,

профессор /СЬлллл/Ожигова А.П.

Актуальность проблемы. ДНК-полимеразы участвуют в репликации и репарации ДНК и играют ключевую . роль в энзиматических системах воспроизведения и поддержания интактной структура генетического материала. Вирусные репликоны являются удобной моделью для изучения репликации ДНК в клетках эукариат. Для репликации ДНК вируса ЭУ 40 требуется лишь один вирусный продукт - большой Т антиген, тогда как остальные репликативные ферменты поставляются клеткой хозяина. Для репликации более сложных вирусов требуется, как правило, большее число вирусных продуктов. Так для репликации Еируса герпеса простого требуется уже ? вирусных полипептидов. Однако и в этом случав в репликации Еирусной ДНК участвуют хозяйские репликативные факторы.

В ходе исследования репликации ДНК вируса ядерного полиэдроза (ВЯЛ) тутового шелкопряда, проводимого в течение ряда лет в лаборатории биохимии МЕР АН СССР, было обнаружено, что инфицирование ВЯЛ клеток шелкопряда, вызывает индукцию не только специфичной вирусной ДНК-полшеразы, но и увеличение примерно на порядок активности хозяйской ДНК-полимеразы а (МШгаНот et а1.,198б). Это наблюдение косвенным образом свидетельствовало, что в репликации ВЯЛ может участвовать хозяйский репликативный комплекс шелкопряда, содержащий ДНК-полимеразу а. В этой связи представляло значительный интерес выделить репликативный комплекс шелкопряда и провести его энзиматическую характеристику.

Целью данной работы являлось получение в высокоочященной форме препарата хозяйской ДНК-полимеразы а-праймазы из куколок тутового шелкопряда, инфицированных ВЯЛ, и исследование энзиматических свойств этого фермента в модельных системах синтеза на кольцевых однонитевых и двунитевых ДНК.

• Научная новизна и практическая ценность работы. Из инфицированных ВЯЛ куколок тутового шелкопряда выделен репликативный комплекс, содержащий ДНК-полимеразу а и праймазу и проведена характеристика ° этого комплекса. Показано, что в зависимости от природы матрицы, а также от концентрации добавленных в реакционную смесь солей, комплекс ДНК-полимераза а с праймазой шелкопряда осуществляет элонгацию предсущегтвующих затравок в прпймер-мвтричных комплексах или<ведет ОТР-зависимый

синтез, при котором используются РНК-затравки, синтезируемые собственно праймазой.

Впервые был определен размер РНК-затравок, синтезируемых праймазой решшкативного комплекса шелкопряда на однонитевой ДНК фага М13 в случав NTP-зависимого синтеза, а также исследован характер полимеризации на этой матрице при элонгации предсуществующих затравок. Было показано, что репликативный комплекс осуществляет умеренно процессивную элонгацию затравок. Двунитевые участки являются физическим препятствием для движения комплекса по матрице и вызывают паузы в элонгации. Комплекс обладает способностью закрывать однонитевые бреши полностью и осуществлять относительно медленный синтез со смещением .одной из родительских нитей.

Комплекс способен осуществлять NTP-зависишй синтез ДНК на кольцевых двунитевых ДНК плазмид pBR322 и pUC19. В препаратах ДНК pUC19 была обнаружена топологическая форма, которая является эффективным субстратом для NTP-зависимого синтеза.

Полученные результаты имеют теоретическое значение для понимания закономерностей регуляции синтеза ДНК в клетках эукариот. Методы и выводы работы могут быть использованы в фундаментальных и прикладных исследованиях.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованзшх ' материалов и методов, описания результатов исследования, их обсуждения и выводов. Работа изложена на 123 страницах, экспериментальные данные представлены 16 рисунками и 3' таблицами. Список цитируемой литературы включает 165 работы.

Публикация и апробация. По материалам диссертации опубликовано 5 работ. Результаты работ докладывались на "11 Nuclear workshop" (Суздаль,1989), на "International symposium on molecular Insect science" (Tucson, USA, 1989).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводились на куколках туторого гаплкопряда Bombyx Ш"П (гибрид бялококотюй порода ТГхШ). T'-i -yn ядерного

полиэдроза наделяли по методу Онодеры и соавторов (Onodera et al.,1965). Инфицирование куколок проводили на третий день после окукливания. Инфицированные и контрольные куколки инкубировали при 26°С.

Активированную ДНК получали из нативной ДНК тимуса теленка после обратотки ДНК-азой I (Apoahiarr and Romberg, 19о2). Плазмидную ДНК выделяли из клеток E.coll путем лизиса клеток додецилсулъфатом Na (Godson and Vapnek,1973) в случае плазмиды pBR322 и с помощью .щелочного лизиса клеток (Blrnboim and Doly,19T9) в случае плазмиды pUC19.

Для очистки ДНК-полимеразы а-праймэзы использовали методы кидкостной хроматографии, в частности ионнообменную, аффинную и адсорбционную. • ДНК-полимеразную активность определяли по включению радиоактивных dNMP в ДНК. За единицу активности принимали включение 1 нмоля dNMP за 60 мин. Электрофорез нуклеиновых кислот и белков- в полиакриламидном геле проводили по описанным методам (Maxam, Gilbert,1980; Laemmli,1970). Белки в геле окрашивали серебром (Oakley et al.,1980). Определение первичной последовательности ДНК проводили по Sanger et al (1977).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ-

I Выделение комплекса ДНК-полимераза а-праймаза из инфицированных куколок тутового шелкопряда и характеристика фермента

Куколки тутового шелкопряда Bombyx morí, инфицированные вирусом ядерного полиэдроза, собирали через трое суток после заражения, когда активности ВЯЛ ДНК-полимеразы и хозяйской ДНК-полимеразы а достигают максимума (Mlkhallov et al.,1986). Очистка включала фракционирование экстракта сульфатом аммония, хроматографию нз фосфоцеллюлозе, DEAE-Toyoperl 650М, ДНК-целлюлозе и ультрацентрифугирование в градиенте концентрации глицерина (таОл.1). Очистка комплекса составляла 14000 раз с выходом 8% от исходной активности в гомогенате, ДНК-полимерозная активность 5000 ед/мг белка.

SO 100

Рис Л. Влияние калий-Лосйата • (1,3) и KCl (2,4) на синтез ДНК, катализируемый комплексом ДКК-полимераза.^ -праймаза на активированной ДНК (1,2) и на /vTP-зависимый синтез на однони-тевой ДНК Фага MI3 (3,4). Ja 100% принято включение РНрТМР в ДНК, равное II 260 имп/ыин (1,2) и 2940 имп/мин (3,4).

[соль] , мМ

•а

ь 100-

о

о

ж

II)

К «О-

о)

' 5 Ю-

<0 к

3 40 -

о.

а)

S

к

ч зо*

о

а 1

§ 0-

20 0

[соль] ,"мМ ¡соль] , мМ

Рис.2,3. Влияние калий-фосфата (1,3,5) и KCl (2,4,6) на синтез ДНК, катализируемый комплексом ДЖ-полимеразаоб-праймаза шелкопряда: а - на poIy(aT>c/AjQ (1,2) и на poIy(dA).dTI0 (3,4),

б " '' включение! (i

Таблица I

Выделение комплекса ДНК-полимераза а-праймаза из. куколок шелкопряда, инфицированных вирусом ядерного полиэдроза

Стадия Белок ДНК-полимеразная Выход Степень

мг активность % очистки

Ед Ед/мг

1.Гомогенат 52690 18440 0,35 100

2. (Ш4)2304-ф)ракция 3828 12860 3,36 69,7 9,6

3.Фосфоцеллюлоза 67,2 10400 155 56,4 442

4.DEAE-Toyoperl 3,70 5535 1496 30,0 4270

5.ДНК-целлюлоза 1,04 3182 3060 17,3 8740

6.Градиент глицерина 0,306 1466 4790 8,0 13700

Исходное количество материала - 70 куколок

На последней стадии очистки при ультрацентрифугировании в градиенте глицерина с ЫТР-зависимой ДНК-полимеразной активностью комплекса коррелирует группа высокомолекулярных .полипептидов (3-4 полипептида) с молекулярными массами от 150 до 115 кДа.

2.Матричные свойства комплекса ДНК-полимераза а-праймаза из ВЯП-инФицированных куколок тутового шелкопряда. Влияние полиаминов на активность комплекса.

Уровень синтеза, катализируемого комплексом на различных матрицах, определяется ионной силой (рис. 1,2,3). В условиях, оптимальных для элонгации- гетерогенных праймеров в составе активированной ДНК (75 мМ калий-фосфата), практически не осуществляется NTP-зависимый синтез. А в условиях, оптимальных для NTP-зависимого синтеза, не утилизируется активированная ДНК.

Уровень синтеза зависит также от природа ' используемого аниона. Так для синтеза на активированной ДНК является предпочтительным присутстйие иона РОд , а для NTP-зависимых синтезов на ДНК М13 и poly(dT)- присутствие ионе С1".Элонгация dA10 -на матрице poly(dT) проходит эффективно в присутствии Р04~3, но не идет вовсе в присутствии С1~. м

Комплекс способен инициировать №ЕР-зависимый синтез на природных однонитевых ДНК и полипиримидинах ро1у(йТ) и ро1у(йС), но не на полипуринах ро1у (сЮ) и ро1у(<1А). Данные по эффективности синтеза ДНК на различных праймер-матрицах в реакционных смесях, оптимальных для элонгации затравок в активированной ДНК (смесь I) и для ЫТР-зависимого синтеза на ДНК М13 (смесьИ) представлены в табл.2.

Таблица 2

Матричные свойства комплекса ДНК-полимераза а-праймаза

шелкопряда

Праймер-матричный комплекс ДНК-полимеразная

и добавки активность

(пкмоль ЙИМР/ЗО мин) в смеси I II

Poly(A) dl10 0,04 0,03

Poly(A) + UTP 0,01 0,00

Poly(dA) dl10 0,10 22,4

Poly(dA) + UTP 0,00 0,00

Poly(dl) dA10 2,10 (И, ,5») 0,03

poly(dl) rA10 0,32 0,17

Poly(dl) + АТР 0,02 1,8.

Poly(dT) + ATP + фермент Кленова (0,5 ед) 0,02 3,02

Poly(dC) dG10 1,65

Poly(dC) + GTP /0,21 13,1

Poly(dG) dG10 0,00 0,00

Foly(dG) + СТР 0,00 0,00

Активированная ДНК 70,4 0,47

Активированная ДНК + NTP 57,1 0,50

Однонитевая ДНК фага М13 0,32 0,29

Однонитевая ДНК фага М13 « + NTP 0,44 3,73

Матрицы использовали в концентрации 25-50 «КГ/МЛ,

олигонуклеотидные затравки - в концентрации 10 мкг/мл, активированную ДНК фага М13 - в концентрации 50 мкг/мл. Отдельные №ГР добавляли в концентрации 1 мМ, смесь НТР - по 0,5 мМ АТР, СТР, СТР и 1ЯР.

«Уровень синтеза в реакционной смеси, содяржвщой 50 мМ К--фосфата.

1 234567 8

ИСТ1

9 10 II

1-ЯЮ

1714Л

6

гг" "> с*

■ 14

г1

(«ма,

_4

- — ...... ' 1—СГ

Рис.4. Радиоавтограф 20%-ного полиакриламидного геля с 8 М мочевиной продуктов №ГР-зависимого синтеза иа ДНК фага М13, катализируемого комплексом ДНК-полимеразы а с праймазой шелкопряда. Реакция в условиях, оптимальных для №ГР-зависимого синтеза (20,мМ буфер Трис-НС1, рН 7,5) в присутствии 10 мкМ, 0,5 мКи/мл [а- Р1АТР.

Олигонуклеотидные затравки: I- продукт элонгации репликативным комплексом шелкопряда 14-звенной затравки на ДНК М13тр10. 2 -продукт гидролиза 17-звекного олигонуклеотида

5'-СТСАТАССТСТТТССГС-З * ДНК-полимэразой вируса ядерного полиэдроза шелкопряда; 11 - смесь продуктов 1 и 8. 3,4 - реакция при низкой концентрации сШТР в течение 30 мин и 60 мин соответственно. 5,6 - в присутствии 50 мкМ (ЗОТР в течение 30 и 60 мин. 7,10 - то же, что и 5 после обработки ДНКазой I и соответственно ДНКазой I и ДНК-полимеразой фага Т4. 9 - то же, что и 3 после обработки ДНКазой I.

Добавление в реакционную смесь полиаминов приводит к значительному увеличению синтеза на активированной ДНК. Напротив, №И?-зависимый синтез на однонитевой ДНК фага М13 ингибируется при добавлении полиаминов.

Возможность двух способов функционирования комплекса в зависимости от ионного окружения показывает, что он может являться каталитическим ядром димерного репликативного ансамбля, осуществляющего синтез лидирующей и запаздывающей нитей в репликативной вилке.

3.Синтез РНК и ДНК. катализируемый комплексом ДНК-полимераза а-праймаза из клеток шелкопряда на однонитевой ДНК

В присутствии ИГР и сШ'Р репликативный комплекс шелкопряда синтезирует на однонитевой ДНК короткий олигорибонуклеотид, со средней длиной 9-11 нуклеотидов, который используется как затравка для последующей элонгации ДНК (рис. 4,дор.10). На эффективность тершшации синтеза РНК-затравки влияет концентрация сИТР. РНК-затравки, синтезируемые при низкой концентрации сЮТР (~0,01-0,1 мкМ) длиннее в среднем на 2-3 рибонуклеотида, чем те, которые синтезированы при высокой концентрации (ЭДТР (~50 мкМ) (рис.4,дор 9). При низкой концентрации сДОГР синтезируются смешанные дезокси-рибо-олигонуклеотиды. Включение

дезокси-предшественников в продукт, синтезируемый при низкой концентрации сДОТР, не ингибируется афидиколином и, следовательно, осуществляется самой праймазой .Афидиколин не влияет и на длину РНК-затравок, синтезируемых комплексом.

Опыты по элонгации затравок проводили, используя в качестве матриц однонитевые ДНК фагов М13тр2 и М13тр10, с которыми была гибридизована 14-звенная олигонуклеотидная затравка, меченная по 5*-концу (рис.6). В условиях, оптимальных для элонгации предсуществующих затравок в праймер-матричных комплексах (в присутствии 60 мМ К-фосфата), репликативный комплекс осуществляет умеренно процессивную элонгацию, полимеризуя, в среднем, несколько десятков нуклеотидных остатков за один цикл связывания с матрицей (рис.5,а, дор.1-3; рис.5,б, дор. 4-6).

I 2 3.4b 6 7 0

s б

I 2 3 4 5 6.7 8 9 10 II 12

tu f

- 90

- 86 83

_ ВО м- 77

!_ 74

70

to

52

45 ' — 43

_ 36

_ 32

_ 26

- 18

„ * J*

... .... I

o., 1

S

ьз _ы

U49

_J-44 ...«-42

' „_J-3&

„.--35 >32

¿£[-22 i

—4-ie

2 3 :__4

Рис.5. Радиоавтограф 7%-ного полиакриламидног о геля с 8 M мочевиной продуктов элонгации 14-эвенной затравки С 5' Р]-CCCAGTCACGACGT-3' на ДНК фага М13, катализируемый комплексом ДНК-полимаразы а с праймазой шелкопряда. Реакция в условиях, оптимальных для элонгации предсуществунцих затравок (60 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,5) в присутствии 5 мкг/мл ДНК фага М13. а - ДНК фага М13тр10. 1-3 - реакцию запускали добавлением 50 мкМ dNTP и 200 мкг/мл активированной ДНК. Инкубация 40 с (1), 2 мин (2) и 10 мин (3). 4 - реакция без добавления активированной ДНК в течение 60 мин. 5-7 - как 4, но реакция в присутствии белка SSB E.coli в концентрации 30 мкг/мл (5), 60 мкг/мл (6) и белка р32 фага Т4 в концентрации 200 мкг/мл (7). 8 - положение адениловых остатков в матрице. О - матрица ДНК М13тр2. 1-3 -пробы по 40 нг праймер-матричного комплекса предынкубировали 30 мин при 60 С в присутствии 65 пг 17-звенного олигснуклеотида 5'-GTCATAGCTGTÎTCCTG-3*(2,3) или в присутствии (1) и постепенно охлаждали. Реакцию запускали добавлением репликативного комплекса. 3 - как 2, но реакция в присутствии 50 мкг/мл белка SSB E.coli. Инкубация 60 мин. 4-6 - реакцию запускали добавлением 50 мкМ dNTP и 200 мкг/мл активированной ДНК. Инкубация 40 с (4), 2 мин (5) и 10 мин (6). 7-9 - реакция без добавления активированной ДНК в течение 10 мин (7), 30 мин (8) и 60 мин (9). 11 - как 9, но в присутствии соответственно 50 мкг/мл бежа SSB E.coli и 250 мкг/мл белка р32 фага Т4. 12 - положение адениловых остатков в матрице, в - паузы в положениях 47-49 ДНК М13тр2 при большом увеличении. Дорожки 1-4 соответсвуют дорожкам 6-9 рисунка 3,6.

Неодинаковая радиоактивность полос, соответствующих новообразованным фрагментам различной длины, свидетельствует о том, что вероятность термииации на различных нуклеотидных остатках матрицы неодинакова. Однако терминация синтеза возможна практически после любого нуклеотидного остатка независимо от конкретного контекста первичной структуры матрицы. На исследуемых участках матриц М13тр2 и М13тр10 не выявляются специфические нуклеотидные мотивы (стоп-сигналы), вызывающие паузы в процессе элонгации. Единственная сильная пауза, обнаруженная на исследованных участках ДНК фага М13, приходится на основание стабильной двунитевой шпильки 1ас-промотора, которая играет роль физического барьера для движения комплекса. Группы пауз расположены в положениях 93-97 на ДНК фага М13шр10 и положениях 45-49 на ДНК фага М13тр2. Обе эти области прилегают к основанию стабильной двунитевой шпильки 1ас-промотора (рис.6).

Белок SSB из клеток E.coli и белок р32 фага Т4 обладают способностью кооперативно связываться с однонитевой ДНК и

6

с 6 6 а

а т 8 Д—1ЛО - т-р. б-с 1-й,. т-а а-т а-т 5 Т 6-с Т-А

6-с—юо тз«р»

7-а

6-с 90 69 70 . 40 50 40 30 20 10

у-т6т Ш1лс1встлт елее! iбаттае6 а^тебаестс^ссебббат^стстдбдб гесйб^ссадбст ге1сйс г66сс61с6г т т ГЙСЙЙС6ТС6 т6йс Т6Б6-3 ■

(•р!0чр2р М»р10чр2)

i т6са6саст6ассс

П13.р2

50 40 30 20 10

Ш| | i i i i i т6са6сасг6ассс

ййСЯБСТАТейССйгеАТГАСейй1ТСАСТбеСС6ТСБТТТТАСАЛС6ТС6Т5йСТ6Б6-1' 6тссш5тсшаст6 ,

Рис.6. Первичная структура (фрагментов ДНК фагов М13тр10 и М13тр2 (плюс-цепей), используемых в качестве матриц при элонгации 14-звенной затравки. Нуклео'тидные остатки в матрицах пронумерованы от 3*-конца звтравки. Область 1ас-промотора в ДНК М13шрЮ представлена в еидэ двунитевой "шпильки*. Аналогичная двунитевая структура в ДНК М13шр2 не показана. Нуклеотидные остатки, которым соответствуют элонгационные паузы, указаны прямоугольниками.

дестабилизировать двунитевые структуры (рис.5,а,дор.5-7; рис.5,б,дор. 10-11). Добавление этих белков в реакционную смесь в концентрациях, насыщающих ДНК фага М13, приводит к исчезновению пауз в области у основания двунитевой шпильки 1ас-промотора в ДНК фага М13 (рис.6). В то же время добавка этих белков не сказывается на радиоактивности полос, предшествующих шпильке. Это позволяет сделать следующие вывода: 1) терминация элонгации в участках, предшествующих шпильке 1ас-промотора, не

связана с особенностями вторичной структуры матрицы; 2)"сильные", паузы в положениях 45-49 на ДНК фага М13тр2 и в положениях 93-97 на ДНК фага М13тр10 обусловлены наличием на матрице стабильных двунитевых структур.

Локализация сильных пауз при элонгации на ДНК М13 у самого основания двунитевой шпильки 1ас-промоторэ косвенным образом свидетельствует о том, что комплекс ДНК-полимераза а-праймаза может заполнять однонитевые бреши полностью. Чтобы проверить это предположение с ДНК фага М13гар2, связанной с 14-звенной радиоактивной затравкой, дополнительно гибридизовали 17-звенный олигонуклеотид, комплементарный к участку 34-50, прилегающему к шпильке 1ас-промотора (рис.6). Введение этого препятствия в праймер-матричный комплекс приводило к появлению новой паузы, соответствующей терминации элонгации в положении 33, которое совпадает с 5'-концом 17-звенного олигонуклеотида (рис. 5,б,дор.2). Кроме этого появлялась пауза в положении 35, т.е. внутри двунитевого участка, ооразуемого 17-звенным олигонуклеотидом с матрицей, на расстоянии двух остатков от 5'-конца олигонуклеотида. Таким образом, репликативный комплекс заполняет полностью однонитевые бреши в ДНК и способен осуществлять относительно медленный синтез со смещением одной из нитей дуплекса, вероятно в результате повторных циклов связывания с матрицей, ограниченной элонгации и диссоциации.

4.Исследование функционирования комплекса ДНК-полимераза а-праймаза на кольцевых молекулах ДНК

Репликативный комплекр шелкопряда, содержащий ДНК-полимеразу а и праймазу, способен к КТР-зависимому синтезу на кольцевых суперспирализованных ДНК плазмид рВЮ22 и р1]С19. Синтез инициируется образованием праймазой олигорибонуклеотида длиной ~ 10 нуклеотидных остатков, который используется как затравка ДНК-полимеразой а.

Одним из • факторов, определяющих существование денатурированных' участков в кольцевых двунитевых молекулах ДНК, является суперспирализация молекул. Поэтому мы исследовали в качестве матриц набор топоизомеров шгазмидной ДНК. При электрофорезе продуктов синтеза в агарозных гелях обнаружена

г 1

iia-f

I (яимер^

JT 4

s

Рис. 7 . Электрофорез в I^-ном агарозном геле продукта ИГР -зависимого синтеза на ДНК pUOi9 , катализиоуемого комплексом ДКК-полимеразы,?б и ггоаймазы шелкопряда. 1,2 -флуоресценция гелей после окраски бромистым этидием. 3-о - радиоавтографы гелей. I - ДНК pUClQ . 2 - ДДК Рис19 Т0П0(ДНК P&C19 после частичной релаксации топоизо-

меразой I). 3 - продукт синтеза на ДНК pUC19 в присутствии I шШ-31 PJ АТР (0,5 мКи/мл) и низкой концентрации diiTP . 4,5 - продукт синтеза на ДИКрис „„_,, в присутствии I мкгш-мшр (50 мкКи/мл). о - ка5°?° но после электрофореза в первом направлении проводили электрофорез во втором направлении в 2%-ной агарозе в денатурирующих услогиях. В качестве стандарта использовали продукт элонгации 14-звенной затравки на ДНК ШЗ шрт I и 'II -соответственно с^госпирализ осадная (форма I) и релаксированная

топологическая форма ДНК pUC19, которая мигрирует быстрее отрицательно суперспирализованных топоизомеров (формы I) и служит эффективным субстратом для NTP-зависимого синтеза, катализируемого комплексом ДНК-полимеразы а и праймазы шелкопряда- (рис.7,дор.3; рис.7,дор.4). Быстромигрирующий компонент не наблюдается в препаратах. ДНК плазмиды pBR322. При электрофорезе во втором направлении в денатурирующих условиях, (при щелочном значении рН) ДНК-продукт высвобождается из различных топоизомеров ДНК pUC19 в виде отдельных тяжей, размер которых варьирует от нескольких десятков до несколько сотен нуклеотидных остатков (рис.7,дор.5).

Таким образом, комплекс ДНК-полимераза а-праймаза способен инициировать синтез на кольцевых двунитевых ДНК, который сопровождается синтезом короткой РНК-затравкой. и протяженных экстратяжей ДНК.

ВЫВОДЫ

'1.Из куколок тутового шелкопряда Bombyx mori инфицированных ВЯЛ выделен репликативный комплекс, содержащий ДНК-полимеразу а-праймазу, обладающий удельной активностью 4790 ед/мг и проведена энзимологическая характеристика этого комплекса.

2. В зависимости от ионного микроокружения (концентрации и природы • солей) и- нуклеотидной последовательности матриц репликативный комплекс может осуществлять либо элонгацию прздсуществующих. затравок на ДНК-матрицах, либо НГР-зависимый синтез, при котором полимераза использует в качестве затравок олигорибонуклеотиды, синтезируемые праймазой комплекса.

3. В присутствии NTP и dNTP репликативный комплекс шежопряда синтезирует на однонитевой ДНК РНК-затравки со средней длиной 9-11 нуклеотидных остатков, а в отсутствии dNTP -длиной 11-13 нуклеотидных остатков.

4. Исследован характер полимеризации на однонитевой ДНК фага М13 при элонгации предсуществующих затравок. Показано, что репликативный комплекс осуществляет умеренно процессивную элонгацию затравок, иолимеризуя за один цикл связывания с матрицей, в среднем, несколько десятков нуклеотидных остатков.

5. Двунитевые участки матричной ДНК типа "шпилек" являютя физическим препятствием для движения комплекса по матрице и . вызывают паузы в элонгации.

6. Комплекс обладает способностью закрывать однонитевые бреши полностью и осуществлять относительно медленный синтез со смещением одной из родительских нитей.

7. Комплекс способен осуществлять NTP-зависимый синтез ДНК на кольцевых двунитевых ДНК плазмид. pBR322 и pUC19. Как и в случае однонитевых ДНК инициация синтеза на двунитевых ДНК сопряжена с образованием коротких РНК-затравок. В препаратах ДНК pUC19 обнаружена топологическая форма, которая. является эффективным субстратом для NTF-зависимого синтоза.

СЛИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Voronova S.H., Marlyev К.A., Mikhailov V.S. DNA-polymerase oí silkworm nuclear polyidrosis virus as a tool ior atudyng fine structure oX DNA- Abstracta oí "Nuclear workshop"-1989-p.205.

2.Voronova S.N., Marlyev K.A., Kullyev P.K., Mikhailov V.S.- Studies on DNA polymerase of silkworm nuclear polyhedrosls virus - Abstracts of International symposium on molecular Insect science- Arizona USA.-1989-p.119-120

3.Воронова С.H., Акопов С.Б., Куллыев П.К., Михайлов В.С.-Комплекс ДНК-полимеразы а с праймазой из клеток шелкопряда: матричные свойства - Биохимия.-1991.-Т.56.-№ 3.-С.521-528

4.Михайлов B.C., Воронова С.Н., Акопов С.В., Куллыев П.К., Атражев A.M. - Синтез РНК и ДНК, катализируемый комплексом ДНК-полимеразы а с праймазой из клеток шелкопряда на однонитевой ДНК - Мол.биология.-1991.-Т.25.-Jí 1.-С.240-248

5.Михайлов B.C., Атаева Д.О., Воронова' С.Н., Бронштейн И.Б.-Синтез на двунитевых кольцевых ДНК,катализируемый комплексом ДНК-полимеразы а и праймазы из клеток шелкопряда-Мол, биология.- 1991,- Т.25.-Jí 2.-С.531-540