Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование ДНК полимераз хлопковой совки HELIOTHIS ARMIGERA Hb

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование ДНК полимераз хлопковой совки HELIOTHIS ARMIGERA Hb"

АКАДЕМИЯ НАУК УЗБЕКСКОЙ ССР ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

11а правах рукописи

ЯЛКАМЫШОВ Гамбаргулы Ходжакович

ИССЛЕДОВАНИЕ ДНК ПОЛИМЕРАЗ ХЛОПКОВОЙ СОВКИ ' НЕЫОТШв Л1Ш1С.ЕПА НЬ

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1991

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологик ордена Трудового Красного Знамени Института зоологии АН Туркменской ССР.

Научный руководитель: член-корреспондент АН ТССР,

доктор биологических наук КУЛЛЫЕВ П. К.

Официальные оппоненты: академик АМН СССР ЗБАРСКИЙ И. Б.

член-корреспондент АН Уз ССР, профессор доктор биологических наук, ИБРАГИМОВ А. П.

Ведущая организация: Институт молекулярной биология и генетики АН УССР

Защита диссертации состоится «? ъ 1991

-/ Ч часов на заседании специализированного совета Д.015.16-01 в Институте биохимии АН УзССР по адресу: 700(43, Ташкент, проспект М, Горького, 56.

С диссертацией можно ознакомиться в бибиотеке Института биохимии АН УзССР.

Автореферат разослан ««Д-/ » ■^С-гУСм.ЛЛ'^-^) 1991 г.

Ученый секретарь ' специализированного совета доктор биологических наук

С. А. Бурхаиоа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблэмы. Репликация ДНК вирусов, бактерий, эукариот является сдвоа из основных проблем современной биохимии и молекулярной биологии. Изучение репликации вирусных геномов, и в часшосаи вируса ядерного полиадроза, актуально как в практическом, ras и в теорегическом отношении. В se ope ая чес ком плане потому, что эю даех возможность моделировать озяельныэ этапы эукариот, и, следовательно, изучевие каждой вирусной системы вноси* определенный вклад в решение важной проблзмы. В практическом орошении nosouy, чю ядерный полиэдроз очень распространенное заболэванш среда насекомых. Ему подвержены полезные насекомые, такие как пчёлы, тутовый seлнопряд, и вредные насекомыэ, наносящие огромный ущерб сельскому хозяйству и лесным массивам ( хлопковая савка, плэдояоркэ, пилильщик, вощинная моль и др.).

В послзднее время интерес к изучению бавулоэирусов, к которым относится вирус ядерного, полиадроза, резко возрос, это объясняемся использованием их в качестве бйоивсекшцидов для борьбы с насекомыми-вредиззелями, а гакае в качаствэ вектора -для широкомасштабного синтеза инородных балков - биологически активных соединений, необходимых в медицине и биологии. Кроме ïoro, результаты исследований бакуловирусов используются для разработки мероприязяй, направленных на защиау полезных насекомых, в чвскозти тутового шелкопряда.

Хлопковая совка привлекав« н себе большое вниманиэ исслэ-довагелай, «ак как является серьёзным вредителем многих сельскохозяйственных. культур. Одваао, до настоящего времени многие вопросы , касающиеся биологических и молекулярных основ

репродукции вируса ядерного полиздроза у рода Héüothie и в частности вида Неliothia armígera ~ хлопковой совки, особенно распросжраненного на аеррижории СССР, осяаюгоя пока не явными. Фериенхы репликамшного коыпжкса вообще не изучались. Исследования энаимологии синааза ДНК очень важны *ак как репликация ДНК, осуществляемая с помощью ДНК полимераз и других белков репликааивного комплекса, обеспечивает эоспроизводс и о генеаи-ческого мааериалз. Процесс репарации, паддерживаюций цвлосг-носць сspyKtypu.генома, так же свяаан с аизявносхыв ДНК полимераз. В репродукции многих ДНК-ссдержащгес вирусов участвую г реплика тивные белки насекомого-хозяина. С помощью репликашив-ных сисхем вирусов можно определить их у.часше в репликации вирусной ДНК. Для выяснения эжх вопросов рациональным мелодическим подходом являемся сравнительное изучен® клеточных и вирусных ДНК полимераз. Ферменты репдинэгивногокомплзкса у насекомых исследованы ещё недостаточно. Что касае'ят сравнихольно-го изучения ДНК полимераз в различных органах и тканях насекомых в процессе развитиявирусной инфекции, хо до начала наших исследований имелась голько одна рабо*в Мамедова ( 1987),выпол-венная ва sytOBou шелиопряде..

Настоящая paöOia являвгся составной частью исследований, выполненных лабора®орией молекулярной биологии ИнсхажузА зоологии АН ТССР в рамках ¿сесоиэдой программы 0.74.05. по заданию ГК Iii СИ СССР: "Исследовать вирусный геном ядерного полиадро-за у «ужового шелкопряда * ( IS66-I990 гг.) регизтрадаонный номер 06160068563, раздел "Иаучихь вирус ядерного полиэдрозв хлопковой совки", звяхого да0(ф8хорвве молекулярной биологии iiicraayia зоологии 1Н ТССР дошдаихельио к теме в соответствии

г

с Постановлением ЦК КПСС и СМ СССР й 807 от 26 августа 3385 г. "О дальнейшем развиши новых направлений биологии и биотехнологии".

Цель работы. Исследовать чувствительность гусениц хлопковой совки различных возрастов в вирусу ядерного полйздроза. Определить сроки и дозы заражения вирусом ядерного полйздроза с целью получения большого выхода вирусной биомассы с высоким титром вируса. Изучить ДНК пблимеразы гусениц хлопковой совки и динамику их акиввости в процессе развития вирусной инфекции, а также исследовать ДНК полицеразы хлопковой совки в период метаморфоза и влияние на них аязибиошка брунеомици-на, индуцирующего резервы хромосомаой ДНК.

Научная новизна и практическое значение работы. Впервыз исследована динамика активности ДНК полимеразы и установлено появление вирусчвдуцируемой ДНК полицеразы в процессе развития вирусной инфекции в различных органах'гусениц хлопковой совки, зараненных перорально вирусом ядерного полйздроза. Впер-выз из куколок хлопковой созки вделены две,-формы ДНК полиме-разы <£■ и охарактеризованы некоторьй их свойства. '

Резулыа-гы исследований диссертации используются в лаборатории молекулярной биологаи Ижляаута зоологии АН ТССР для приготовления биомассы вируса ядерного полйздроза хлопковой совки. С целью приготовления вирусного препарата, и применения его в на чес'.шв биоинсектицида против хлопковой совки на томатах. Материалы диссертации могу! бы*ь использованы в НЮ "Век-гор" Минмедбиопрома СССР и в Среднеазиатском НИИЗР, а также могу 1' бы^ь включены в спецкурс по инфекционным болезням васе-номыхи защите растений в сельскохозяйственных ВУЗах и гехни-

кумах сараны, где чи^аюжся ээя спецкурсы.

Апробация работ Материалы диссертации докладывались на 1У ноафвренции биохимиков Средней Азии и Казахсаана (Ашхабад, 1966); Всесоюзной рабочей совещании "Молекулярная биология ДНК содержащих вирусов, имеющих практическое значение для сельского хозяйства и медицины (Киев, 1967); 17 научно-пракаичесной конференции молодых ученых и специалистов АН Туркм. ССР, посвященной 70-лаиш Взшкого Октября (Ашхабад, 1967); X съезде Всесоюзного эа юно логического общества (Лнинград, 1963); Отраслевом совещании "Биологические и тахнологические проблемы создания вирусных препаратов для интегрированной защиты растений (пос. Кольцово Новосибирской обл. 1989 ); Научво-пракшческом и координационном совещании по защиав и карантину сельскохозяйственных растений в республиках Средвей Ааии и Южного Казахе т-на ( Таыауз, 1991 ).

Публикации. Но теме диссоржации оаублививано б печашых

работ.

Структура и объем диссертации. Работа состой* из введения, обзора лиавразуры, ыэяиической чаезя, разулыштов исслэдова-ния, обсуждения, выводов и епчека цитируемой лизяра^ры. Маже-риал изложен на 155 страницах машинописного заяевв, включая 21 рисунок, I таблицу. Список цитированной лиавразуры состоит из 74 отечественных и 135 иностранных источников.

üatspmí е осношце нивды исслщоаша

Исследования проводила на впервые культивируемой в условиях Туркмении лабораторной линии хлопковой совниНвИо-ыав armígera нь , аырациваадвв вв искуссгвеваой пишгельной среде. Исходный материал для разведения хлопковой совки а лабора хор-

ных условиях получали пуяэм отлова бабочек сввхо ловушками .Разведение лабораторной линии насекомого проводили по методу Старец и др. ( 1979). 8 опытах юпользовались гусеницы всех возрастов и куколки, для заражения гусениц использовали вирус ядерного полиздроза хлопковой совки, зьделенный по методам Зе㧱ы (1947; 1963), Кок и др. (1980) в нашей модификации.

При исслздовании динамики гибели гусениц по возрасти в зависимости ок количества вируса ядерного полиздроза в эксперименте использовались гусеницы всех возрастов и дозы вируса 0,1 х ГО5- 1,0 х И6 полиэдров на гусеницу. Количество полиэдров определяли с помощью камеры Горлова' ( Симонова и др., 198 5). Заражение производили, нанося на нусочка искусственной питательной среды (5 мм3) суспензии вируса.

При исслздовании активности ДНК полимераа в различных органах гусениц хлопковой совки в процессе развития заболевания для заражения вирусом ядерного полиздроза в опыа брали гусениц только что полинявших на пятый возраст; количество полиэдров составляло 0,8хГО5 полиэдров на гусевицу.

Получение экстрактов из куколок и органов гусениц хлопковой совки, седиыентационный анализ ДЕК полдаерзз ультрацена;-рифугированием в градиент конценжрации глицерина и определенна их активности осуществляли по лендам Михайлова и Гулямо-ва (1981); милаПоу et а1. (1966); концентрацию белка при очисхке ДНК полимвраз определяли спектфоишетрически (Ьаупе , 1957), а к он цен-хра цию стандартных белков при седяментационном анализе ДНК полимзраз - по методу Брадфорда (вге.«ога .1976); активированную ДНК поадчали из фирменной . ДНК тимуса телёнка

посла обрабомш дкк-азой, I (Aposhan et Romberg , 1%г).

резулыа за тссщошш

I. Заражение гусениц хлопковой совки вирусом ядерного полиэдроза.

Изучение времена прюссвдевш корма через кишечник гусениц хлопковой совки пятого возрасга показало, что через 4 часа после корыдвния гусениц искуссшенной питательной средой с s 55-ue-simuHou шхка обнаруживаваля в зкскреыенхах, а основная масса корца проходи» через кишечник насеконого через 4-6 иасов. Следив! учихьшажь, что через шяроворсивки даечвика в организм насекомого проникав!" свободныз вириовы, а не полизжры, поэюиу при проведении исследований, где необходимо было проводить заражение гусениц хлопковой совки виру с он ядерного полиэдроза мы кормили их искуссзаевной пиютрльной средой с полиэдрами в ®ече-нкэ боте дательного времени и сутки не давали,им другого корка, чюо'и попавшие в кишечник полиэдры и не успевшие хаи еще "pactBOpHsbcn" не бы® исмргну*ы огауда новой порцией норма, но уже без полиэдров.

Для изучения восприимчив ос mi гусениц хлопвовой совки к вирусу ядерного полиэдроза а зависимоеш or их возрасха и количества вируса в onus брали гусениц i-tf возрастов и разнье дозы

с с с

вируса ядераого полнадроза - 1,0x33* 2,5x5) , 5,0xl(r и 1,Ох

полиэдров.не гусеницу. Первая дова оказалась мело эффекиш-ной. При заражении заусениц дозой 2,5 x D5 наблвдалась ШО % гибель гусениц в идвдших возрастах и определенный продана вдаи-ваеиосхи в i -У воэраешх. 8 первом а во в порой в oapaciax гибель гусениц даступада вскоре после их заражения - в первьй, вгорыз

сутки. При заражении гусениц 3-го возраста наблвдалзсь уже ЮО/з-вап гибель - 14 % от общего количества гусениц дошли до стадии имаго. Ври заражении хлопковой совки в болзэ поздние сроки этот процент возрастал. В пятом возрасте 76 % зараженных гусениц благополучно окуклились и из них вышли бабочки. При этом на стадии куколки погиб® всего сива хлопковая совка,тогда кзк в 3-ем возрасте 5 куколок не превратились в бабочек. Третья и чешершя дозы оказались летальными, хотя при заражении гусениц пятого возраста дозой 5,0 х 10^ полиэдров на гусеницу 3-4 гусеницы дохсиили до стадии куколки.

Рисунок I показывает как происходило зараяение гусениц по возрастам при дозе вируса 2,5 х 305 на гусеницу. У первого и второго возрастов выхса полиэдров был невелик, так как гусеницы погибали вскоре после заражения и масса их была мага.

*——- " рис л. Заражение ЫУ

возрастов гусениц хлопковой сов ки вирусомядерно-го полиэдроза: 1-гибеяь гусениц от вируса ядерного полиэдроза до возрастам

я о

ЕЯ-ч

« „

Хет язсз

ОРР

6?н о

(Э*

с? к « (Ч

зо £-< а

2-Степень зараженности гусениц вирус 01'

2 3 4 Возраст Гусениц

С возрастом гусеницы становились более устойчивы н этой дозе зеракения вирусом ядерного полиэдроза, проделайтельность

7

№ жизни увеличивалась, количество полиэдров в погибших гусеницах возрастало. При заражении гусениц чездертого и пятого возрастов количество полиэдров на погибшую от ядерного поли-эдроза гусеницу было наибольшим, и составляло 3,7-4,5 х Юб, .соответственно. Поэтому' для наработки широкомасштабной вирусной биомассы эаранали гусениц конца 4-го- начала 5-го возраста, увеличив дозу заражения до 5,0 х Ю5 полиэдров на гусеницу.

г. Исследование ДНК подимераз у гусениц хлопковой совки в норме и при вирусной инфекции

Сравнительное исследование обцей акзивносш ДНК полиме-раз в гиподерме, жировом теле и кишечнике здоровых гусениц хлопковой совки и при их заражении вирусом ядерного полиэдро-аа показало увеличение активности фермента в процессе развития вирусной инфекции у насекомого.

Для выявления закономерности в изменении активноеая ДНК полимеразы сС и установлении времени появления активности вирусиндуцируаное ДНК полимэразы мы исследовали экстракты жирового тела васекомого, инфицированного вирусом, ультрацентри-фугированиеи в градиенте концентрации глицерина. На рис. 2 лредстэвлевы результаты седиментационн'ого аналиаа экстрактов гирового тела гусевиц хлопковой совки через сутки ( 2.1 ), трое (2.гХ и шесть суток (2.5) после инфицирования перораль-нс.л> вирусом ядерного полиздроза; Как видно из этого рисунка, начиная с третьих суюн поело инфицирования гусениц хлопковой соаки вирусом ядерного полиздроза, в тканях кирового тела происходи г изменение активности ДНК полиыераа, что выявляется

о,*

I

Рис.г. Ультра центрифугирование в Ю-50 % градиенте

концентрации глицерива экстра в и» клеюк киро-вого тела гусениц хлопковой совки, полученных .через су гни (I), трое(г) и шесть суток (3) посла их зараненда вирусом ядерного полиэдроза.

ДНК пошшеразвую аквм-ностъ определяли на

активированной ДНК.

Стрелками показано поло-

жение стандартов по се-дшевтации БСА (4,> з ),

га га газа (п,з в").

г и го

Ноцер фракции

в профиле активности фермента в градиенте концентрации глицерина. На риз. 2.г показаны результаты оедвментационного анали-аа экстрактов жирового тела, полученных из гусениц через 3 дня посла заражения их вирусом ядервого полиэдроза. Наблвдаеася острый симиетричвый основной пик активности фериента по скорости седиментации совпадающий с коэффициентом седиментации ДНК лоли-меразы насеномьк.В отличие ог ранних сроков заболевания полиэдрозом в этот период начинает проявляйся еще одва фериеь-тативвая активность - вирусиндударуемой ДНК подимеразы. В градиенте концентрации глицерина она выявляется в виде небольшого плача с моле крирной. массой вами ого. меньше, чем ДНК полшераза

. Эта аитвносхь цермевта составляв® в градиенте незначительную часта от'общей активности ДНК пошшераз. В следующие сроки

развития вирусной инфекции (4-е ч б-е сухки) у насекомого в тканях жирового тела ДИК полимеразная активность в эюй зоне градиент начинаем возрастай, и появляться в виде отдельного пика.На рис. г.З. показано распределение активности ДНК полимераз в гра-диеаав кон цен грации глицерина экстрактов жирового гела гусениц, полученных через 6 суток послв их инфицирования вирусом ядерного полиэдроза. В течение 3-х последних суток активность клеточной ДНК полашразы несколько уменьшаемся и составляет примерно 3540 '¡о от общей ферментахиввой анаивносхи. 4*0 касаехся акшвности ДНК полимерааы с меньшей молекулярной массой, то она наоборот за этот период лозрасше* в несколько раз и составляет основную подавляющую часть суммарной акшвносзи ДНК полимераз ( рис.г.З).

Известно, что вирус ядерного полиэдроза насекомых проникает в организм через ворсинки среднего оздела кишечника. Как вше отмечено общая активность ДНК полимераз в катках кишечника зара-кенаьк вирусом гусениц намного превышает активность фермента контрольных гусеииц. При рааделввти экстрактов кишечника здоровых гусениц хлопковой совки ультрацентрифугированием в градиенте концентрации глицерина ( рис. 3.1.) обнаружен один пик ферментативной активности, которой по скорости седиментации совпадает с

« %

коэффициентом седиментации клеточной ДНК полимераэы <£ насекомых - тутового шелкопряда.

Исследование удьхрзцватрифугированиен в градиенте концентрации глицерина экстрактов кишчвика гусениц хлопковой совки через'о часов пос;а их заражения вирусом ядерного полиэдроза показало присутствие высокой активности клеточной ДНК полимера- ' зц-¿С . ¿роме того, в правой стороне пива активное ом ДНК поли' Ю

Рис.3. Улырацентрифуги-рование в Л)-зо% градиенте концентрации глицерива экстрактов клеток кишечника контрольных (здоровых) гусениц хлопковой совки

(1) и экстрактов опытных гусениц,полученных через б часов

(2), 12 (3) и сутки (4) после -заражения насекомого вирусом ядерного полиздоза.

меразы появляются в виде небольшого пика еще одна ферментативная активность (рис.3.2.) ДНК полимеразы. эта ферментативная активность по скорости седиментации в градйенте концентрации глицерива намного мевьые, чем екоросиь седиментации ДНК полиме-рэзы . В кишечника здоровых гусениц этот пик активности не обнаруживается. Мы предполагаем, что вновь появлиемая активность фермента связана с образованием новой ДНК полшеразы-вирусиндуци-руеиой ДНК полимеразой.

Через 12 часов после инфицирования гусениц хлопковой совки вирусом ядераого полиэдроза, как показываем; рис. 3.3. ферментативная активность в зоне предполагаемой вирусивдуцируемой ДНК полимеразы не только сохраняется, но и нарастает. Эти результаты говорят о том, что уне в начале исследования в возрастающей суммарной акаявкосзя ДНК лолимераз определенная доля приходится не на илзточную ДНК полимеразу , а на полимеразу, более низко-

Номер фракции

полимерную по сравнению с сС - полимеразой. Активность этой ДНК полшеразы обнаружена в экстракаах кишечника инфицированных гусениц и через сутки после их инфицирования вирусом (рис, ЗА,),

Изучевие активности ДНК полимераа в клетках кишечника гусениц в последующие сроки после инфицирования их вирусом ядерного полиэдроза в'градиента контракаации глицерина показало повышение доли новообразованной ДНК полимеразы в составе суммарной активности ДНК полимераз. Для примера приводим распределение активное ая ДНК полимеразы J- и низкополимерной ДНК полшеразы ?и~ схрактов кишечника гусениц в градиента концентрации глицерина через l'poe су юн после инфицирования гусениц вирусом ядерного • полиэдроза (рис.4.1). Как показывает это®, рисунок активнос*хь ДНК поли мера зы«?С составляет примерно 60 % о* общей ферментативной активное*» и около 40 % активное*» фермента принадлежит ДНК поли-меразе с более низким коэффициентом седилев тации.

Низкополимерная ДНК полимераза, судя во времени её появления в тканях хлопковой совии после их инфицирования вирусом, кивешки её накопления, а также по коэффициенту седиментации сходна о вирусиндуцируемой ДНК полимеразой «утиного шелкопряда. Поэтому, полагай, что обнаруживаемая в экездактах кишечника инфицированных гусениц виакополимервая ДНК полимераза является (ферментом, кодируемым вирусом ядерного полиэдроза хлопковой вовки, мы определили активность ДНК полимераз, используя в б ескле-хочноа сисзвме ве активированную ДНК в вачесае праймер-ма«рицы, а ДНК фага Ш. В о*дичие о* ДНК полимеразы «С в препаратах вирусивдвдуемой ДНК полимеразы присутствие* эндонуклеазная акшвность, благодаря чему она Moeses синтезировать ДНК не матрице одноннювоа Ковалевтаозаиаву коа кольцевой молекуле ДНК фага

1113« На рис, 4 представлена активность ДНК полимераз в'кишечнике инфицированных гусениц, где в качестве ыаирицы в инкубационной среде использованы активированная ДНК (рис.4.x) и ДНК фага М13 (рис.4,2). Как видно из этого рисунка, при использовании в качестве матрацы для синтеза ДНК в беснлетовной системе активированной ДНК, выделяются оба пика активностей ДНК полимераэ - и. влв- • точной ДНК полимерази«/ , и вирус индуцируемой ДНК полшеразы

со

I

S

я

3

--N.

к

а

•я

г,5 *

г,а

1,5 1,0.

I

. г,5

.2,0*

с 1

Г, 5 иГ 5 «у

о '

1.0 I

Я- ' 0>

о«5 I

Ю

да-

Р ис. 4. Ультра це н тр Ж11у-

гирование в ГО-30% град из н те концентрации глицерина экстрактов клехок кишечника гусениц хлопновой совки, полученных через трое суток пос:а их зараяения вирусом ядерного поли-

ЭДРОЕЭ..

В качестве матрицы для синтеза ДНК в бескзвточной системе использована активированная ДНК(1) и ДНК фэга а13(2).

Стрелками показано положение стандартов по седиментация -БСЛ (4,3 Б ), кагажаа(11,з й ).

номер фракции

( рис. 4,1), а при использовании в качестве ыегр. .:: дНК фага Uli, активное ni в дозе клеточной ДНК полимерази г.;'атичееш ко обнаружено - проявляется в виде хоропого сиьыетричного пина тзль-i!0 активность вирусиндуцируеиой ДНК полиуерази (р::с.4,г).

Танки образом из подученных даьнцх следует, что раньие всего при. пероральном ззракении гусениц хлопковой созяи вирусом ядерного полиздоза вирусиндущодеаэя ДНК полашраза. поязлпог-ся в клзт;ах кппачаика { через С, чассв), затеи в ткани еисоьэго

13

Рч

тела (3-й сутки) и в последнюю очередь в гиподерме (4-е сктки). На основании проведенных исслздовантй пшено прийш к заключению, что в начале поражаются вирусом ткани кишечника.

3. ДНК полимеразы куколки хлопковой совки в период метаморфоза

В настоящее время в литера ауре описано присутствие в клетках эукариот 4 ДьД полимеразы. У насекомых обнаружено присуасв-вие только трех ДНК полимераз .-с^,^ и Обнарукиваеиая гетерогенность ДНК полимераз, возможно, также связана с клзточным циклом при размножении клеток.

Нами проведены исследования ДНК полимераз в здоровых куколках хлопковой совки в период метаморфоза и при введении им противоопухолевого антибиотика брунеомицина, индуцирующего разрывы в молекуле хромосомной ДНК.

Седиментационный анализ экстрактов здоровой куколки хлопковой совки на 5-й день метаморфоаа улырацентрифугированием в градиенте концентрации глицерина показал присутствие двух пиков' активности ДНК полимеров (рис.5) при использовании в качестве прайм ер-матрицы для синтеза ДНК в бесклеточнои системе активированной ДНК. На рисунке хорошо ввден резкий подъем активноет фермента во фракциях 4-6 впереди первого пика и крутой спад активности ДНК полимераз по фракциях П-13 после второго пика, что указывает на отсутствие других примесей активноези ДНК полимераз в экездзакте здоровой куколки хлопковой совки.

Эти две ДНК полимерааы, которые мы обозначала как ДНК поли-иераза I ( фракции 4-7 градиента) и ДНК полимераза г( фракции И-13 Градиента) в градивнте концентрации глицерина седименти-рувт с коэффициентами седиментации 9,8 5 и 6,5 в , соответственно.

14

2,0

6,5 3

9 1,5

33

s а

аз 0

1,0

3

Рис. 5. Улътрацентпифугировз-виа в Ш-30 % градиенте концентрации дви-церива экстрактов здоровых куколок хлопковой совки (5-е сутки метаморфоза).

ДНК- полимеразную ая-тивность определяли на активированной ДНК.

Стрелками показано положен sfe Стандартов по вед имен жации-БСА

( 4,з3 ), наталаза

( 11,3 s ).

2 S

Номер фракции

20

» 1-й пик ферментативной активности по коэффициент седиментации сходен с ДНК- полные разой <£ тутового шелкопряда - 9,6 s (гшс -haiiov et el ,1986); 2-й пик активности фермента обладал меньшей молекулярной массой -6,58 .

Мы провели сравнительное исследование некоторых свойств этах ферментов после разделов® их в градиенте концентрации глицерина. Сравнительное исследование повышения ионной силы в инкубационной среде на активность ДНК полиавраэч I и 2 показало, что эти ферыенты имеюя^экую иблзсть маьсикуш акшвности а присутствии различной концентрации калий фосфата в среде (рис.6). Максимум активности дНК полимеразы I обааруниваетси при 50 мЛ фосфата в среде ( рис. 6.1). Уменьшение концентрации иоаов или повышение на & резко сникает ак*шшссть фермента, дальнейшее повьневш ионной силы среды до ЮО подавляет активность ДНК полимеразн I до '?0 % поюравнению с аавсииумои ей

15

Рис. 6.: Влияние ионной силы £ инкубационной среде на активность ДНК-полимеразы I (1)и ДНК-полимеразы 2(2) в фосфатном буфере К-Р04, рН 7, Г.

Инкуба ция п ров од и-лась при 7з«с в чание 60 мин.

50 юо 150 ■ аоо(ма)

Концентрация фосфата калия

8К2ИВН0СТИ.

ДНК полимерааа 2, в отличие от ДНК полиыеразы I» максимум активности проявляет при 25 мМ фосфа*9 в • реакционной среде (рис.6.2). Дальнейшее повышение ионной силы в реакционной, среде приводит я резному снижению активности ДНК полиыеразы.2. Повышение ионноС) силы до 75 мМ приводит к подавлений активное«! ферменя-а примерно ва 50 % Из этих результатов видно, что ДНК нолимеряза 2 значительно чувствительнее к повдаению концентрации фосфата в инкубационной среде.

Исследования влияния ионной силы в инкубационной среде, обусловланной концентрацией триса, KCl, а sarae результаты изучения влияв»& pH сроды и различных концентраций магния на активность ДНК полимеразы I и 2 показали, что они отличаются мек-ду собой. Так, ДНК полииераза I обладает максимумом активвости при 8 ull магния в реакционной смеси, в то время как для оптимума акмшносги ДНК полимеразы 2 нуано 2 Uli магния.

ДНК полимеразы «С У зукариог отличаются от ДНК полиыеразы

^ и $ высокой чувствительностью к сульфгвдрильным ядам ( н -этилыаллешиду). Добавление к инкубационной среде 2,5 «Ы N -этитаалвиыида привсаит к почта полному пскавлзиию активности ДНК полимеразы I и г хлопковой севки - на 93,15 % и 93,24 соответственно (рис,7). Зам свойства позволяют отнести их к ДНК полшеразам эукари&т.

Ю01

н

о о

а; §

<0

«350

я

яз сц ГС о га и о зз

о, яг

'О 5< к а? (нО

г,5

5,0 ГО,О'

Рис.7. Активность ДНК-полице-рззы I (I) иДНК-лоли-аеразы 2 (г) в прису-г-СхЗИИНнЕМ в инкубационной среде.

За ®0% принял ан-хив-нос-хь ДНК-полимер азы I (1823 ивп/шн) иДНК-полшераэы 2. (1939 ют/мин),определенные .в инкубационной

среде без добавлэния »

Инкубация проводи.-цсь при 37°С в течение 60 мин.

Концентрация^ - этилаале-иивда ( Ш)

4. Действие антибиотика брунеодацина на дНК полииеразвую активность куколки хлопков о» ссзяи.

Ранее в нашей лаборатории было показано, чг: брунсош-цин вызыаает аютвацию лаязвтното вируса у куколок тутового шелкопряда и в них дополнительно н- полим^зразе появилась вновь образованная вирусшздуцировааная ДНК нолимераза.

Исследование ультрацевтрифугированвен в град пен те концентрации глицерина экстрактов куколок хлопковой совке через 48 часов после впадения им брунеомпцииа, издуцирувдего рззрьз

в хромосомой ДНК, показало (рис.8.г), чи> в них, как и з контрольных куколках (рис.8.1), присутствуют две ДНК полшеразные активности. Отличительной чертой экстрактов опышых куколок является то,-что активность фермента в обоих пиках возрастает в несколько раз (рис.8.г.). Другое дело отличие экстраккга опыаяых куколок от контрольных в том, что активность ДНК полимеразы первого пика несколько больше, чем активность фермента второго пика.

п,з г

г

С

Рис.8. Ультрацентрифугиро-ваиие в ГО-ЗО^ь градиенте концентрации глицерина экстрактов контрольных куколок (Х)и экстрактов куколок, полученных через 48 часоз(г), 96 (3). 120 (4) и 144 чоса(5) после введения им брунеомицина в количестве Ю,0 миг на I г веса куколки.

о

н §

Рч

г ю

Номер'фракции

В течение 96-ти часов после введения антибиотика брунеомицина (из расчета 30 мкг/г веса куколки) куколкам хлопковой савки в градиенте концентрации глицерина, такае, как в. более ранние сроки, обнаруживается два пика ферменташвноа активности (рис. 8.3). Следует отметить, что коэффициенты, седиментации ДНК полимераз из контрольных и опытных куколок хлопковой ¿озки остаются веиамеввдои. В последующие сроки исследования экстрактов

ЗВ

опытных куколок хлопковой совки ( 13) часов после введения им антибиотика) акаявность обеих ДНК полшераз возрастав!* в несколько раз ( рис.8.4). больше, чем активность ферментов в предыдущие срони исследования (48 и % часов). При этом уровень активности ДНК полимераэы оС 1 намного превышает ферментазяв-ную активность ДНК полимераэы I.

выводы

1. Установлено, что гусеницы младших возрастов хлопковой совки более восприимчивы к вирусу ядерного полиэдроза, однако количество полиэдров в в их невелико, так как гибель гусениц наступает вскоре после заракевия. Максимальное количество полиэдров образуется в гусеницах пятого возраста.

2. Заражен® гусениц хлопковой соввн вирусов ядерного полиэдроза приводит к увеличению общей ДНК полшеразвой активности в кишечнике, жировом теле и гиподерме насекомого по сравнению с контролем.

3. Ультрацентрифугированке в градиенте концентрации глицерина экстрактов тканей, кишечника и жирового тела здоровых гусениц показало присутствие одной ДНК полимерази с£ . При заражении гусениц появляется вирусиндуцируемая ДНК пояиыераза, осуществляющая репликацию вирусвойДНК.

4. Ври пероральном заражении гусениц хлопковой совки вирусом ядерного полиэдроза вирусиндуцируемая ДНК полимераза появляется сначала в кжтках кишечвика- через 6 часов после инфицирования.

'5. В куколках хлопковой совки обнаружено две формы ДНК полиыеразы I и 2 и охарактеризованы веноторье их свойства.

6. Введение куколкам хлопковой совки антибиотика брувеоми-цина, индуцирующего разрывы в хромосомной дНК, вызь»ает увеличение активности ДНК полимеразы I и 2. ¡¿аксимум их активности обнаружен через 120 часов после введения куколкам антибиотикз брувеомицина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНИИ ПО ТЕ iE диссЕР.тацш

1. Ялкаыышов Г.Х. Изменение акзявности ДНК полимераз гусениц хлопковой совки, инфицированных вирусом ядерного полиздроза Jj TJ Конф. биохимиков республик Средней Азии и Казахстана: Тез. докл. Ашхабад, 1966.- с.45.

2. Ялкамышов ГЛ., Агалыков н. Изменение ДНК полимеразной активности в органах гусениц хлопковой совки при заражении вирусом ядерного полиздроза // Тезисы докл. X/ ваучво-практ. конф. молодых учёных и специалистов АН ТССР, посвящ. ?0-летию Великого Октября, Ашхабад, 1967, с. 148.

5. ялкамышов Г.Х., Агалыков H., Куллыев ПЛ., Исследование фериевтоа репликации вируса ядерного полиздроза у хлопковой совки. Ц Биологические и технологические проблэмы создания вирусных препаратов для интегрированной заидати растений: Материалы отраслевого совещания 26-29 сентября 19Ь9 г.- Новосибирск, 1969.-С.42-45.

4. Агалыков Н., ялкамышов Г.Х., Куллыев ПЛ. Модифицированный метод выделения полиэдров из гусениц хлопковой совки, зараженных вирусом ядерного полиздроза Ц Известия АН ТССР, серия биол. наук.- 1990.-й 6.-С.■

5. Ялкамышов Г.Х.. ^арлыав К.а\, Агалыков и, Кулльвв II.К. ДНК-полимераэы куколни хлопковой совки в период иетзиорфоза U Известия АН ТССР, сер.биол. наук.- 1991.-й I.-C. 55-57.

6. куллыев ПЛ., Агалыков Н., Ялкамышов Г.Х., Бирюкова Н.В. Использование вирусов ядерного полиздроза васеномьк в пракшке народного хозяйства /J Известия АН хССР, сер. биол. наук- 1991 .-,3.-С. 35-4,.