Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека СтРНК и олигонуклеотидными праймерами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека СтРНК и олигонуклеотидными праймерами"

Г б ОА

КПР $9бРОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ° ^ СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ

ХИМИИ

на правах рукописи УДК 577.152.2

ЗАХАРОВА ОЛЬГА ДМИТРИЕВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИП'ТА Ш ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА СтРНК И ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫМИ ПРАЙМЕРАМИ.

03.00.04 - Биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ па соискашн1 ученой сгспшш кандидат.» оно.ю! пческих наук

Новосибирск 19%

Работа выполнена в Новосибирском инстите ôiiuopi аническон химии СО РАН.

Научный руковолшель:

локтор химических наук, профессор Нсвинскин Г.А.

Официальные оппонен i ы:

локтор химических наук Карпова Г.Г. локгор Г)иоло1Нческих наук Дымпнщ Г.М.

Велущая организации: lliicniiyt молекулярной úiio.tot ни РАН

(i'.Москва).

Зашнга сосгоигсм " " 1996 гола

в У^часовна tace taniiii лиесеришпонжи о coBeta К 003.52.01 в Новосибирском шил и и ¡e óitoopt аннческой химии СО РАН по алрееу: 630090. Новоси0нрск-90, ироспекл ак.Лаврени.ева. N.

С лнссер1аннеи можно о такими п.ея в библтнеке Hobociióii|)ckoi о пне! н i\ ia бноорганическои химии.

Авюрефера! раюслан " хь •• .CíAfrT%~____1996 i о. ta.

Ученый секрсчарь uiccepi aiuioiiiioi о

volteta, Kaii tn tai химических нам*' О.С .Фелорова

Характеристика работы.

Актуальность проблемы. Обратная транскриптаза (ОТ) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) - ключевой фермент репликации ретровирусов, основной объект воздействия противовирусных средств, азидотимидина и др. Она осуществляет превращение одноцепочечной РНК генома вируса в двуцепочечную ДНК, которая затем интегрируется в геном клетки-хозяина. Поскольку синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), вызываемый ВИЧ, является одним из наиболее опасных заболеваний человека, ферменты вируса в настоящее время интенсивно исследуются как с точки зрения механизмов их функционирования, так и с целью поиска новых специфических ингибиторов- потенциальных мощных антивирусных средств. Проблема лекарственной устойчивости вируса, связанная с возникновением мутантных форм ОТ при длительном лечении ази-дотимидином, стимулирует дальнейший поиск специфических отличий ретрови-русных и эукариотических ДНК полимераз и новых эффективных лекарственных средств. Уникальной особенностью ОТ ВИЧ является использование клеточной тРНК1у5 для инициации вирусной репликации. В связи с этим изучение взаимодействия ОТ с тРНК представляется чрезвычайно своевременным и необходимым с целью более глубокого понимания механизмов узнавания обратной транскриптазой олигонуклеотидных и тРНК праймеров и конструирования ингибиторов ОТ на их основе.

Цель работы. Целью работы было изучение закономерностей взаимодействия ОТ с тРНК и олигонуклеотидными праймерами, в частности, оценка сродства тРНК к обеим субъединцам фермента с помощью методов флуоресцентного титрования и аффинной модификации производными тРНК, исследование влияния тРНК и ее аналогов, а также хаотропных агентов на скорость реакции полимеризации, катализируемой ОТ; исследование механизма узнавания производных тРНК-Тп/11п и частично некомплементарных праймеров обратной транскриптазой; сравнительный анализ взаимодействия мутантных форм обратной транскриптазы, устойчивых к азидотимидину, и ОТ дикого типа с олигонуклеотидными праймерами.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Работа представляет собой систематическое исследование количественных аспектов взаимодействия обратной транскриптазы ВИЧ-1 с тРНК и ее производными. Впервые показано, что гетеродимер р66/р51 имеет два сайта связывания молекул тРНК, при помощи таких методов, как флуоресцентное титрование и аффинная модификация производными тРНК . Впервые показана активация гетеродимерной формы ОТ под влиянием тРНК и ее производных, а также хаотропных агентов. Предложен механизм активации рбб каталитической

субъединицы, опосредованной конформационными изменениями фермента в результате связывания тРНКс р51 субъединицей. Впервые показано аномально высокое сродство частично некомплементарных праймеров к обратной тран-скриптазе по сравнению с другими полимеразами про- и эукариот. Впервые показано, что транскриптаза способна эффективно использовать в качестве праймеров аналоги тРНК и некомплементарные поли(А) матрице олигонукпеотиды, содержащие на З'-конце 1-10 с!Т-звеньев или даже полностью некомплементарные олигонукпеотиды, лишенные З'-концевого основания. Полученные данные свидетельствуют о том, что 5'-концевая часть (сЛ")„(с1С)(сП")т- праймеров образует дополнительные контакты, скорее всего, с тРНК узнающим центром фермента. Это приводит к значительному повышению их сродства к ОТ. Проанализировано влияние мутаций на взаимодействие ОТ, содержащей набор мутаций, связанных с А2Т-устойчивостью, с опигонуклеотидными праймерами. Показано, что в присутствии хаотропных агентов, способствующих конформа-ционным перестройкам белка, стадия инициации синтеза ДНК мутантами несколько замедлена по сравнению с ферментами дикого типа. Предполагается, что наблюдаемый эффект хаотропных агентов на мутантные формы ОТ отражает измененную способность к конформационным перестройкам ОТ под действием природных лигандов в присутствии клеточных или вирусных факторов, влияние которых имитируют хаотропные агенты.

Полученные результаты являются базой для конструирования нового класса селективных ингибиторов ОТ на основе частично некомплементарных праймеров, путем введения различных реакционноспособных групп по 5'- и 3'- концу таких олигонуклеотидов. Использование тРНК-аналогов, проявляющих прай-мерные свойства на поли(А)-матрице, перспективно в качестве модели для изучения фундаментальных аспектов белок-нуклеинового узнавания, а также для анализа механизма лекарственной устойчивости, связанной с ОТ. Объем работы. Диссертация изложена на 146 страницах, включая 29 рисунков и 8 таблиц. Список цитированной литературы включает 173 работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов работы и их обсуждения и выводов. Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Основное содержание работы.

1. Обратная транскриптаза р66/р51 связывает две молекулы тРНК.

Методом флуоресцентного титрования нами впервые показано, что гетеродимер связывает две молекулы тРНК (Рис.1).Сродство тРНК к одной из субъединиц выше, чем к другой (Кс11=23нМ, Кйг= 140нМ). Принимая во

1. Определение величины Кс1 комплекса между обратной транскриптазой и тРНК1"'*3 (данные по тушению флуоресценции представлены в координатах Скэтчарда)

2. Зависимость активации (А) обратной траискиптазы от

времени инкубации с тРНКиу*. ОТ (4 нМ) инкубировали с 20нМ (1), 50 нМ (2), 100 нМ (3) или 200 нМ (4) тРНК. Активность ОТ после инкубации с тРНК измеряли в реакции полимеризации, используя поли(А)-олиго(йТ) матрицу-

внимание литературные данные о более высоком сродстве матриц, прай-меров и нуклеотидов к каталитической рбб субъединице фермента и тот факт, что сшивка тРНК и ОТ платиной приводит к модификации рбб субъединицы при низких , а р51 при более высоких концентрациях тРНК, сделан вы^од о том, что меньшая константа характеризует взаимодействие тРНК с рбб. а большая константа - с р51 субъединицей.

2. Активация ОТ под действием тРНК и хаотропных агентов.

Ранее было показано, что взаимодействие ОТ с тРНК сопряжено с кон-формационными перестройками, которые приводят к активации гомодимерной рбб рбб формы ОТ в реакции полимеризации. Нами впервые исследована возможность активации гетеродимера ОТ с помощью тРНК.

Инкубация ОТ р66/р51 с тРНК также приводит к активации фермента в реакции полимеризации на поли(А) матрице. Активация зависит от концентрации гРНК и времени инкубации (Рис.2). Определена величина Кс! комплекса ОТ и тРНК в результате анализа активации как процесса необратимой модификации псевдопервого порядка с использованием метода Китса-Вильсона (1962), оказалось, что ее значение ближе к КЬ2 (Табл.1). Это свидетельствует о том, что активация фермента, скорее всего, происходит в результате взаимодействия тРНКср51 субъединицей белка.

Таблица 1.

Параметры, характеризующие взаимодействие ОТ ВИЧ р66/р51 с тРНК1у$3 и ее производными, определенные в экспериментах по активации.

Представлялось интересным понять, какие структурные элементы тРНК важны для активации фермента. Окисление З'-концевого нуклеотида перйода-том натрия, а также отщепление одного, двух и трех нуклеоти-довсЗ'-конца тРНК приводит к уменьшению уровня активации ОТ (Табл.1), что свидетельствует о важной роли ССА конца тРНК в ее активирующем действии. Инкубация ОТ с различными олигонуклеотидами, содержащими последовательности ТТТ : СТТ и CUU, имитирующими антикодоновый триплет петли TPHKLys также приводит к активации фермента в реакции

Активатор Kd ,нМ T-,/2 ,МИН Amax,%

тРНК 130+40 21 300

тРНК аналоги

тРНК0к 150±50 29 160

тРНК(.п 200±100 29 170

ТРНК(.2) 300+150 28 85

тРНК(.з) 300±100 10 86

Аналоги антикодоновой петли тРНК

d(CAGACT TTTAATCTG) 160±70 10 38

diGGGACT С7ТААССС) 250±50 22 37

(pCpUpUb 250+50 30 50

Рис.3. Зависимость начальных скоростей синтеза поли(с!Т) из [Н ]-dTTP (синтеза de novo), катализирумого обратной транскриптазой, от времени. Активация синтеза de novo в присутствии 0.0075% мочевины, 0.3% тритона, 0.6% ДМСО, и после прединкубации стРНК._

I •? •2- о

s А i х

О S

I!

ш 5.

дмсо

„очевин^а тритон

8 Время (час)

Рис.4. Зависимость начальных скоростей синтеза поли(йТ) из [H^-dTTP (синтеза de novo) в различных условиях, указанных в таблице.

о х

"х

S 2

с 5

S

Z

тз

0> S X о т 2

Ш

90

80

70

60

50

40

30 20

10

голиЩИАТР тРНК поли(С)

тРНК^ oonMfAl JJTP

ТРНК Ly* ^"(Q.lllCl.lUl.lG) / полч(А>

dCTP^ATP

J__

Различи lie условия инкубации:

тРНК +1 Матпииа dNTP

1 Lvs + поли(С1.

fdCUUUG) dTTP

1 Lvs поли(А) dATP/dCTP

2 Lvs + поли/dA) dTTP

3 Lvs поли(А) dTTP

4 Val + поли(А) dTTP

5 Tro + поли(А) dTTP

6 Lvs + поли(А) dTTP

Синтез de novo проводили "+" - в присутствии мочевины, тритона Х-100, ДМСО в их отсутствие

2 3 Время (час)

полимеризации, но уровень активации этими олигонуклеотидами ниже по сравнению с тРНК.

Совокупность данных свидетельствует в пользу взаимодействия тРНК и ее аналогов с р51 субъединицей, которое вызывает конформационные перестройки фермента, и приводят к активации рбб каталитической субъединицы. Очевидно, что ССА конец и антикодоновая петля тРНК необходимы для индукции конформационных изменений фермента, хотя нельзя исключить и участие в активации фермента других структурных элементов.

Данные об активации ОТ тРНК и ее аналогами свидетельствуют о кон-формационной активности ревертазы. Мы попытались исследовать закономерности конформационных изменений транскриптазы с использованием ряда хао-тропных реагентов, способных преобразовывать в белках гидрофобные контакты и водородные связи.

Как видно из рис.3, ДМСО, Тритон и мочевина по отдельности в низких, но оптимальных концентрациях, активируют синтез полимера из dTTP (синтез de novo) в 2-3 раза, а все вместе в 4-5 раз. Активирующий эффект тРНК в присутствии хаотропных реагентов возрастает с 3 раз до 10-15 раз. Хотя поли(А) явлется наилучшей матрицей, активация синтеза de novo происходит и при использовании других матриц и комплементарных им нуклеотидов. Активация фермента не влияет на специфичность синтеза, поскольку в некомплементарной системе синтез отсутствует.

Процессы активации фермента тРНК и хаотропными реагентами имеют различную природу. Активация под действием тРНК влияет только на Vmax, добавление же хаотропных реагентов приводит как к увеличению скорости, так и сродства фермента к праймерам и нуклеотидам. Очевидно, что при одновременном присутствии тРНК и хаотропных агентов изменение конформации белка происходит быстрее и на большую глубину, что, возможно, сходно с объединенным влиянием на транскриптазу тРНК и нуклеокапсидного белка. Изменения конформации и активация фермента в присутствии TPHKLys, скорее всего, происходят под специфическим контролем тРНК. Так тРНКТф, способная в меньшей степени к образованию комплекса с ОТ, активирует фермент, но уровень активации ниже по сравнению с TPHKLys. TPHKVal, не образующая с транс-криптазой комплекса, не способна активировать фермент.

З.Аффинная модификация ОТ реакционноспособными аналогами тРНК

Далее было проведено исследование взаимодействия транскриптазы с тРНК с помощью метода аффинной модификации. тРНК модифицировали статистически по А и G основаниям RCb реагентом. Получены производные, содержащие 3 и 7 остатков реагента на молекулу. Показано, что в отличие от

л ч о г

л I;

0 з

- г».

се.

1

ьг X о.

Рис.5. Кинетические кривые модификации обратной транскрилтазы с помощью тРИК-Яз (1, 2) и тРНК-(?7 (3, 4) при 30°С и кинетические кривые ковалентного связывания тРИК-Иг с ферментом (5, 6). Поли (А) (-) - 2, 4, 6; (+) -1,3,5.

Активность фермента в присутствии лигандов и в нулевое время инкубации принята за 100%. Концентрации тРИК-Иэ и тРИК-Я?: 80нМ.

1 2 3 4 5 [тРНК-[?7 ]"1.10гнМ"' Рис.6. Зависимость карр скорости инактивации обратной транскрилтазы от концентрации тРНК-(*7 в обратных координатах, определение величин К<1 комплекса между ОТ и тРНК-1*7

тРНК, аналоги тРНК являются ингибиторами ОТ, конкурентными по отношению к поли(А)-олиго(с1Т) матрице-праймеру, определены две Ю, сравнимые по величине с двумя Кб для тРНК.

Аффинную модификацию ОТ аналогами тРНК проводили, используя по отдельности способность альдегидных групп бифункционального реагента модифицировать амино-группы и его алкилирующую функцию. При этом получены сходные результаты.

В начальный период модификации в отсутствие матрицы происходила небольшая активация фермента, как в случае тРНК, но после завершения активации фермент инактивировался в результате ковалентного присоединения аналогов тРНК. В присутствии поли(А) инактивация протекала в соответствии с реакцией модификации псевдопервого порядка. Это позволило оценить величины Кс) комплексов фермента с аналогами из данных по инактивации. Они оказались близкими двум величинам Ю для аналогов и двум Кс) для тРНК.

Таблица 2.

Параметры, характеризующие взаимодействие ОТ р66/р51 с тРНК и ее производными.

I Лиганд Кс! или К[, нМ п(А), Метод

I (Т1/2 мин) п(А)- определения

I I рбб суб р51 суб (с!Т),о

| тРНК Кс), = 23 Кс)2=140 - Флуоресценц.

!трнк - Кс)2=130±40 - Активация *

(21 ) !

- ка2=250±30 + ¡Активация

(33)

Кс1,=70±30 Кс12=190±40 + Аф.м,защита **

трнк-р:3 Ки=20±5 «¡2= 120+40 ,(+) Ингибирование

ИМ, =25 ±5 Кс12= 130±30 | + Аф.м, инактив.

' тРНК-Ят Ки=13±5 Ю2= 100+30 (+) Ингибирование

! |ка, = 15±5 М2= 140±40 + Аф.м. инактив

Взаимодействие между тРНК и ОТ изучали в отсутствие поли(А). -. в присутствии поли(А) ' +, или в присутствии поли(А)-олиго(с1Т)' (+) * Из данных по активации можно определить только величину Кс) для комплекса р51 субъединицы с тРНК; "Значения Кс! были определены из защитного эффекта тРНК при модификации ОТ аналогом (5'-32Р)-тРНК-К-

С помощью защитных эффектов тРНК от модификации

фермента реагентами также были определены величины Кс). характеризующие связывание тРНК и ОТ в присутствии матрицы. Поли(А) несколько уменьшает сродство тРНК к обеим субъединицам фермента, уровень активации и глубину модификации. Стехиометрия модификции фермента равна 1,7-1,8 молям реагента на моль белка. Таким образом, с помощью различных методов показано, что обе субъединицы фермента взаимодействуют с тРНК. но с различным сродством.

4. Взаимодействие ОТ с тРНК- Tn/Un.

Существенным для понимания механизма узнавания ревертазой тРНК является вопрос о том, насколько ССА-конец тРНК удален от активного центра и сколько нуклеотидных звеньев с З'-конца тРНК должны взаимодействовать с матрицей. Для анализа этих вопросов нами синтезированы с помощью Т4 РНК-лигазы производные тРНК с присоединенными по З'-концу олиго(и) или олиго-(dT) различной длины. Данные Рис / свидетельствуют об эффективном удлинении таких праймеров на поли(А) матрице. Как видно из Табл.3, даже аналог,

содержащий одно дополнительное

Таблица 3.

Величины Км и Vmax для TPHK-d(pT)n звен0 на 3 "конЧе. яв™ется праиме-/(pl))n в реакции полимеризации, ката- ром. Удлинение этой части или замена Т на U мало влияют на их сродство, которое примерно на порядок выше, чем для тРНК Полученные данные согласуются со следующей моделью. З'-концевое звено тРНК расположено в непосредственной близости от участка узнавания ферментом З'-концевого звена тРНК (на расстоянии одного нуклеотида) Плавление тРНК под действием ОТ и нукпеокапсидного белка приводит к увеличению конформационной подвижности ССА-конца тРНК, благодаря чему она приобретает способность взаимодействовать с центром фермента, узнающим З'-концевой нуклеотид праймера, и вступать в комплементарные взаимодействия с матрицей В то же время добавление одного звена на З'-конец тРНК приводит к тому, что такая молекула тРНК. не подвергаясь плавлению, способна дотянуться до каталитического центра ОТ и выполнять роль эффективного праймера Эти данные указывают также на то. что, скорее всего, сама ОТ, даже без участия нуклеокапсидного белка, способна достаточно эффективно изменять пространственную структуру tPHKL/s3 и превращать ее в праймер. Роль нуклеокапсидного белка может заключаться в том, чтобы проверка тРНК на комплементарность PBS участку генома производилась на максимально протяженном участке РНК Иначе тРНК другой специфичности также смогут эффективно инициировать синтез ДНК

лизируемой ОТ, на поли(А) матрице

Км(нМ) Vmax(%)

TPHK-d(pT)6 2 4

TPHK-dfpT),, 2 5

TPHK-d(pT)13 2,5 37

TPHK-(pU)i 0,5-2 2-5

TPHK-(pU)2 3,5 4

TPHK-(pUb, 2-7 5

d(pT)n 1000 100

Рис.7. Субстратные свойства тРНК-[Р32И(рТ)8 в реакции полимеризации, катализируемой обратной транскриптазой, на поли(А) матрице с использованием [а-Р32]-ТТР.

В качестве праймеров использованы: тРНК-[Ри]-с1<рТ)а(1-3); [а-Ри]-ТТР (4); (¿рТ),, (5,6). Альквоты реакционной смеси отбирали после инкубации реакционной смеси в течение 0, 10, 20 мин (1-3), 40 мин (4), 5 и 10 мин (5,6). Авторадиоавтограф 10% денатурирующего геля, (содержащего 8М мочевину).

тРНК-[Р32Н(рТ)8„

Ч(Т)г

91

-ВР

1 2 3 4 5 6

Рис.8. Удлинение праймеров обратной транскриптазой. Шкала, соответствующая удлинению («¿Т)10 находится на правой ординате рисунка, для других праймеров шкала слева.

Скорость удлинения Ь(рТ),0 200 (имп/мин) хЮ'3

100

Т6(С)3А(С)4СССТ]

Время (час)

5..Взаимодействие ОТ с олигонуклеотидами.

Ранее было показано, что ОТ способна взаимодействовать с праймера-ми в отсутствие матрицы, но полимеризация протекает только при комплементарное™ матрицы и праймера. Мы предположили, что взаимодействие олиго-нуклеотидов с праймер-узнающим центром ревертазы в отсутствие матрицы происходит за счет их взаимодействия с участком узнавания ферментом ССА-концевой части тРНК. Чтобы проверить это предположение, был синтезирован ряд модельных частично-комплементарных матрице олигонуклеотидов. Как

видно из таблицы, частично

Табл.4. Величины К„ и \/тэ< для праймеров в реакции полимеризации на поли(А) матрице,

1 Км.мкМ V™, (одОУЭП

арт 460 30 3.185

с1(рТ)2 280 33 2.86

с1(рТ)5 40 80 1.69

й(рТ), 12 78 1.18

с1(рТ)10 1.0 100 0

сКрТ)14 0.5 105 -0.28

с1(рТ)9рС 2.0 96 0.32

с1(рТ)8рС(рТ) 40 79 1.7

сЗ(рТ)7рС(рТ)2 18 80 1.35

й(рТ)брС(рТ)з 13 85 1.18

с)(рТ)4рС(рТ)5 4.0 90 0.64

с1(рТ)2рС(рТ)7 6.0 57 1.02

с1{рС)з(рТ)7 4.0 60 0.82

а(рт)9рс(рт)5 1.0 56 0.24

¿(рС)8(рТ) 45 9 2.0

0(рС)8(рТ)2 35 14 2.39

с1[(рТ)2(рС)]4(рТ) 10 40 1.4

сЦрА)9(р пЬ*) 10 3.0 2.5

с!(рС)зрАрТрС(рС)з 2.0 1.0 2.3

рА(рС)4рСрСрСрТ

с1(рТ)4(рОрС)(рТ)4 12 37 1.5

с1(рТ)4(рСрС)2(рТ)4 3.2 17 1.27

с!(рТ)4(рСрС)3(рТ)4 0.8 4.4 1.25

с)(рТ)4(рСрС)4(рТ)4 0.3 1.0 1.4

с1(рТ)4(рСрС)5(рТ)4 1.0 24 0.64

комплементарные праиме-ры (с1Т)лсЮ(с1Т)т имеют высокое сродство к ферменту, существе 'но выше, чем полностью комплементарные олигонуклеотиды, содержащие т звеньев. Сродство олигонуклеотидов (с1Т)4(СС)к(с)Т)4, способных к образованию шпилечных структур также существенно выше по отношению к ОТ, чем у (сГГ)4 и (с1Т)8. Данные свидетельствуют о том, что в отличие от полимераз про-, и эукариот 5'-концевая часть таких олигонуклеотидов способна образовывать дополнительные контакты с ревертазой.

ошибка в определении величин Км и \/тах составляла 5-40%.

Различие во взаимодействии ревертазы и других полимераз с частично комплементарными праймерами особенно хорошо видно из анализа способности этих ферментов дискриминировать такие праймеры. Для наглядности сравнения мы использовали понятие относительного уменьшения эффективности полимеризации (ОУЭП), отражающего дискриминацию праймеров одновременно за счет понижения сродства и скорости полимеризации. Из рис.Э

1

Км(п) Утах(Ю)

АМУЮ ОУЭП = х

V Км(10) Утах(п)

ДПЧа

\\ ОУЭП-

АД коэффициент

ОТ вич\ \\ относительного

у уменьшения

\ эффективности

ФКЧ \\ \\ полимеризации

\ п\

Рис.9,

Зависимость 1одОУЭП для (сГГЬо и более коротких праймеров (йТ), от числа

мононуклеотидных звеньев.

АМУ-Я - ревертаза вируса миелобластоза птиц КФ - фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1 Е.соН ДПСА ■ ДНК-полимераза А из 8.ас1с)оса1с1агш£. ДПЧ - ДНК-полимераза а из плаценты человека

12 345678 910п длина праймера

Рис.10.

Зависимость 1одОУЭП для (ЦТ)ю и частично некомплементарных праймеров с1(рТ)прС(рТ)п, от положения некомплементарного основания С (т=0 соответствует номеру 1).

2 4 6 8 10 12 14 N позиции С-основания в праймере с1(рТ)прС(рТ)т

видно что ОТ дискриминирует полностью комплементарные праймеры практически так же, как и другие ДНК-полимеразы. Однако частично некомплементарные матрице праймеры дискриминируются ОТ в 10-15 раз хуже, чем другими полимеразами. В основном, это происходит за счет того, что 5'-концевая часть праймера после некомплементарного звена образует, как мы считаем на основании совокупности данных, дополнительные контакты с тРНК узнающим центром трзскриптазы. Причем мощным аргументом в пользу этого утверждения является отсутствие праймерных свойств у полностью некомплементарных праймеров и высокое сродство и скорость превращения праймеров, имеющих хотя бы одно комплементарное звено и олигоаденилата, лишенного З'-концевого основания.

Таким образом, данные согласуются со следующей моделью узнавания праймеров: З'-концевое звено узнается активным центром фермента, а высокое сродство обеспечивается контактами некомплементарной части праймера с ССА-узнающим центром белка.

Гипотетическая схема взаимодействия ОТ с тРНК, ее производными, тРНК-<1(рТ)п и частично некомплементарными праймерами.

поли(А)

полиШ

Взаимодействие ОТ с частично комплементарными матрице с1(рТ)п(С)(рТ)т праймерами

Взаимодействие ОТ с тРНК-с!(рТ)п, способными служить праймерами на поли(А) матрице

Квадратом обозначен центр связывания З'-ОН группы праймера. Овалом обозначен центр связывания ССА-концевой части молекулы тРНК.

6. Взаимодействие праймеров с мутантными формами ревертазы.

Лекарственная устойчивость ВИЧ связана с появлением мутантных форм ОТ. Слабое влияние мутаций на взаимодействие фермента с матрицей и отсутствие влияния на взаимодействия с трифосфатом не могут объяснить устойчивости вирусов к азидотимидину. В связи с этим проведен анализ влияния мутаций на взаимодействие ОТ, содержащей набор мутаций, связанных с А2Т-ус-тойчивостью, с праймерами различной структуры. Оказалось, что сродство различных мутантных форм по отношению к рибо- и дезоксирибопраймерам близко к дикому типу фермента. Небольшие отличия в сродстве праймеров выявляются в присутствии хаотропных агентов

Таблица.5. Величины Км для праймера с((Т)ц в реакции полимеризации, катализируемой ОТ дикого типа и мутантными формами.

Табл.6. Величины Км для рибо- и дезоксирибопрай-меров в реакции полимеризации, катализируемой ОТ дикого типа и некоторыми ее мутантными формами

Мутанты Км, мкМ

№ АК замен

215 0.1 0.2

67 215 0.09 0.4

67 70 215 0.17 0.26

215 219 0.4 1.3

67 219 0.4 0.8

рбб/рбб 0.13 0.8

р66/р5д.тип 0.14 1.5

Типы мутантов Одю I (и)ц Моъи М(Т)„

КмхЮ'7 М

+ - + +

215 1.8 1.0 3.9 9.0 1.6 ! 2.0 1.0 1.9

67 70 215 1.9 1.5 5.0 3.0 1.8 3.4 1.7 '2.6

р66/р51 1.0 4.5 6.0 8.0 2.0 '9.0 1.4 15.

* условия проведения реакции полимеризации "+" - в присутствии мочевины, тритона Х-100, ДМСО; в их отсутствие"-"

Анализ взаимодействия мутантных форм ОТ с праймерами различной длины представлен в табл.7.

Таблица.7. Величины термодинамических и кинетических параметров, характеризующих реакцию полимеризации, катализируемую диким типом ОТ и ее мутантными формами в случае олиго™мидилатов

! Мутант Усл. Км1 Км5 : АСз |1,х103

+/- мМ, кДж/ кДж/

АС хЮ3 1 моль моль

, 215 + ^2.6 295 3.4 -11 0 42.7

- 0.63 426 2.3 -18.6 -2.1 1.5

! 67 215 + "ю.о 313 ~ 3.2 ' -11.6 ' -2.9 ' 32 0

0.89 442 2.26 : -17.7 ; -2.06 2.015

' 67 70 5.0 330 3.03 '-13.3" -2.8 " ! 15.0

; 215 - 0.3 468 2.1 I -20 4 ■ -1.9 ! 0.675

' рбб/рбб + 1.26 422 2.4 ; -16.8 ' -2 2 Г2.99

дик.тип - 0.5 484 2.07 -19.1 : -1.8 1.03

' р66/р51 + Т99" 372 " 2 7 ' -15.7 ' -2.5 5.35

дик.тип - 1.0 468 2.1 -17.4 -1.9 2.14

ЛС=лС1+(п-1)ЛС3=КТ1пКм1+(п-1 )СТ1пКм51 где \С, характеризует связывание первого нуклеотида. а дСэ-последующих, т. е. стадию элонгации.

Км5=Кмп+1/Кмп= (Км1/Км,,)-1/10. р=Км1/Км8 - коэффициент нукпеации.

Зависимость -1дКт от длины олиготимидилатного праймера линейна для .всех использованных мутантов. В отсутствие хаотропных агентов мутанты ведут себя как ферменты дикого типа. В присутствии ДМСО, мочевины и Тритона Х-100 наблюдается отличие величины Км,, характеризующей связывание первого нуклеотида, величина Дв,- отражающего вклад первого нуклеотида в связывание с ферментом и коэффициента р, отражающего трудность образования первой пары нуклеотидов.

Таким образом, впервые показано, что нет сильного влияния мутаций и на взаимодействие фермента с праймерами. Принимая во внимание наши и литературные данные об отсутствии сильных влияний на взаимодействие со всеми специфическими лигандами можно предположить, что устойчивость является следствием совокупности слабых эффектов мутаций на термодинамические параметры взаимодействия фермента с отдельными лигандами и скорость реакции полимеризации

Нельзя исключить, что возникновение устойчивости мутантов ОТ к азидо-тимидину может быть следствием изменения конформации мутированных молекул фермента в результате образования комплекса с дополнительными регуляторами типа нуклеокапсидного белка и более выраженного влияния мутаций на такое взаимодействие.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые, с помощью методов флуоресцентного титрования, аффинной модификации, ингибиторного анализа и анализа процесса активации фермента тРНК и ее аналогами, показано, что обе субъединицы р66/р51 гетеродимера обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека (ОТ) взаимодействуют с тРНК. Сродство каталитической рбб субъединицы фермента к тРНК на порядок выше, чем р51-субъединицы, играющей, скорее всего, регуляторную роль.

2. Впервые показано, что ОТ может активироваться в реакции полимеризации под действием тРНК и ее аналогов, а также хаотропных соединений (ДМСО, Тритона Х-100, мочевины). Проведено исследование на количественном уровне роли структурных элементов тРНК и хаотропных агентов в активирующем действии. Показано, что результирующие аллостерические изменения структуры ОТ приводят к активации каталитической рбб субъединицы и изменению сродства лигандов к полимеразе.

3. Впервые показано, что транскриптаза, в отличие от других полимераз про- и эукариот, способна эффективно использовать в качестве праймеров аналоги тРНК и некомплементарные поли(А) матрице олигонуклеотиды, содержащие на

З'-конце 1-10 dT-звеньев или даже полностью некомплементарные олигонук-леотиды, лишенные З'-концевого основания. Проведен кинетический и термодинамический анализ взаимодействия фермента с рибо- и дезоксирибонуклео-тидными праймерами различной структуры и длины, включая олигонуклеотиды со шпилечной структурой, образующие дополнительные контакты, скорее всего, с тРНК узнающим центром фермента.

4. Впервые проведено сравнение взаимодействия ревертазы дикого типа и ее мутантных форм, содержащих аминокислотные замены, соответствующие ОТ из азидотимидин-устойчивых изолятов вируса, с праймерами различной структуры и длины. Показано, что хаотропные агенты, способствующие конформаци-онным перестройкам белка, замедляют стадию инициации синтеза ДНК мутантами ОТ, и заметно изменяют величины Км и Vmax для праймеров. Сделано предположение о важной роли структурных перестроек молекул ОТ в возникновении различий ОТ по сравнению с мутантными формами фермента.

Основные результаты диссертации содержатся в следующих публикациях

1. Zakharova O.D., Tarrago-Litvak L., Fournier M., Andreola M.-L., Repkova M.N., Venyaminova A G., Litvak S., Nevinsky G.A , Interaction of primer tRNA Lys 3 with the p51 subunit of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase: a possible role in enzyme activation. FEBS Lett ,1995, 361, 287-290.

2. Zakharova O.D., Tarrago-Litvak L., Fournier M., Litvak S , Nevinsky G.A., DNA synthesis primed by mononucleotides (de novo synthesis) catalyzed by HIV-1 reverse transcriptase: tRNA Lys'3 activation. FEBS Lett., 1995, 373, 255-258

3. Zakharova O.D., Tarrago-Litvak L., Maksakova G.A., Andreola M.-L., Litvak S., Nevinsky G A., High affinity interaction of HIV-1 RT with partially complementary primers. Eur J Biochem ,1995, 233, 856-863.

4.Захарова ОД.Сутурина O.A., Гудима С.О., Похолок Д.К., Ямковой В.Я., Кочетков С.Н., Невинский Г.А. Взаимодействие праймеров с мутантными формами обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека. Молекулярн биология, 1996, 30, 1, 231-240.