Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модифицированные нуклеозид-5'-моно-и трифосфаты: синтез, противовирусная активность и использование для сравнительного изучения ДНК-полимераз

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Модифицированные нуклеозид-5'-моно-и трифосфаты: синтез, противовирусная активность и использование для сравнительного изучения ДНК-полимераз"

V Л

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В-АЭНГЕЛЬГАРДГА

На правах рукописи

ДЯХШНА НАТАЛЬЯ БОРИСОВНА

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ НУКЛЕОЗИД-5'-МОНО-И ТРИФОСФАТЫ: СИНТЕЗ, ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ СРАВНИТЕЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ

03.00.03 - молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора химических наук

МОСКВА 1995

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

профессор, академик РАН Богданов АА.

доктор химических наук,

профессор Готгих Е.П.

доктор химических наук,

профессор ЮркеЕич А.М.

Ведущая организация - Институт биоорганической химии

им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита состоится " О ¡Я 1995 г. в /О часов на

заседании диссертационного совета Д 002. 79. 01. по защите докторских диссертаций при Институте молекулярной биологии им. ВА.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, 32

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. ВАЭнгельгардта РАН.

Диссертация в виде научного доклада разослана "3 рС<л 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета канд. хим. наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биосинтез ДНК является одним из ключевых процессов, протекающих в клетке. Среди подходов к изучению функционирования ферментов, синтезирующих ДНК, важное место занимает ингибиторный анализ. В настоящей работе рассмотрен синтез аналогов 2'-дезохсинуклеозид-5'-трифосфатов - субстратов ДНК-полимераз к использование этих соединений для изучения ДНК-полимераз различного происхождения. В зависимости от молекулярного механизма действия модифицированные 2'-дезоксинуклеозид-5,-трифосфаты Уюжно разделить на три группы. Одну из них составляют соединения, которые, не встраиваясь в цепь ДНК, конкурируют с субстратом за связывание с ДНК-синтезирующим комплексом. Ко второй группе относятся терминаторные субстраты, которые, конкурируя с природными 2'-дезоксинуклеознд-5'-трифосфатами, включаются в цепь ДНК и прекращают дальнейшую элонгацию цепи праймера (например, из-за отсутствия в молекуле терминатерного субстрата З'-гидроксильной группы). Наконец, третья группа - соединения, которые также включаются в цепь ДНК, но не обрывают ее, а лишь замедляют дальнейшую элонгацию.

Большое значение имеет сравнительное изучение ДНК-полимераз различного происхождения, в первую очередь ферментов млекопитающих и вирусов млекопитающих. Различия в свойствах этих ферментов дают возможность избирательно блокировать репродукцию вирусного генома в клетках млекопитающих и человека. Особая актуальность этой задачи связана с распространением в последнее ■ десятилетие вируса иммунодефицита человека (НГУ), вызывающего синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). В настоящее время все разргшеннные для лечения больных СПИД лекарственные препараты являются нуклеозидами. Действие этих веществ основано на их внутриклеточном превращении в соответствующие 5-трифосфаты - терминаторные субстраты обратной транскриптазы НГ/.

В клетках человека имеется несколько ДНК-полимераз: а, р, у, 5, е, концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза и, возможно, некоторые другие, различающиеся по функциям и свойствам. Субстратами всех ДНК-полимераз являются 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфаты. Поэтому поиск селективных ингибиторов репродукции НГУ целесообразно начинать с изучения свойств 5-зрифосфатов модифицированных нуклеозидов в ДНК-

синтезирующих системах с широким набором ДНК-полимераз, включая обратную траксхриптазу НГУ. Ключевым критерне;.; при отбор.: потенциальных противовирусных препаратов на молекулярном уровне является различие их действия на ферменты млекопитающих и вируса. Эффективность в - модельной ферментной системе определяется способностью модифицированного нуклеозид-5'-трифосфата под^вллгь синтез ДНК, катализируемый обратной транскрилтазой НГУ, а селективность - в минимальном подавлении функци:" го6сте"нных ДНК-полимераз клетки-хозяина. Сравнительный скрклшг аналогов 2'-дезоксинуклеозкд-5'-трифосфатов в модельных системах биосинтеза ДНК позволяет сразу исключить из дальнейшего рассмотргния нуклеозущные производные, 5-трифосфаты которых не являются субстратами оо.,^гной транскриптазы НГУ.

На следующем уровне отбора противовирусного соединения при исследовании в культуре клеток изучается способность модифицированного .нуклеозида фосфорилироваться в клетке, подвергаться другим внутриклеточным превращениям, влиять на общий метаболизм клетки. Следует отметить, что фосфорилирование модифицированных нуклеозидов клеточными ферментами происходит значительно ¿гаке эффективно, чем природных 2'-дезоксинуклеозидов. Чтобы достичь в клетках эффективной концентрации 5'-трифосфатов модифицированных нуклеозидов, приходится создавать высокие концентрации последних. Это влияет на весь баланс нуклеозидов в клетке и приводит к нарушению нормальных метаболических процессов. Наиболее часто лимитирующей стадией в процессе превращения нуклеозида в соответствующий 5'-трифосфат является введение первого фосфатного остатка. С этой точки зрения перспективным может оказаться введение в клетку фосфорсодержащих аналогов модифицированных нуклеозидов, которые могут быть или предшественниками нуклеозидов в клетке, или подвергаться дальнейшим превращениям, имитируя природные нуюкотвды. В настоящей работе рассмотрены новые группы нуклестгидных аналогов, обладающих антирегровирусной активностью.

Цель и гздачы исследования. Настоящая работа имела целью сравнительное изучение субстратной специфичности различных ДНК-полимераз - прохариотических, зукариотичсских и вирусных с помощью аналогов нуклеозид-5'-трифосфатов. В ходе исследования были поставлены следующие задачи:

1. Разработка принципов конструирования и синтез нуклеозид-5'-трифосфатов, обладающих высоким сродством к ДНК-полимеразам из

раЗи'1!!ЧНЫХ ¡г'-точников.

2. Выяснение способности ДНК-полимераз катаяизирозать синтез ДНК с модифицированными межнуклеотидными фрагментами, используя соответствующие трифосфатные производные. Разработка быстрого и эффективного метода получения аР-модифицированных трифосфатных аналогов.

3. Разработка принципов создания и синтез куклеотидных производных -эффективных блохаторов репродукции вируса иммунодефицита человека в клеточных культурах.

4. Разработка метода получения индивидуальных стереолзомеров. модифицированных нукпеозид-5'-трифосфатов и их использование как инструментов для изучения стереоселективности различных ДНК-полимераз.

Предполагалось, что в результате работы будут найдены соединения, обладающие высокой антиретровирусной активностью. Научная новизна работы

- Выдвинуто и экспериментально подтверждено предположение о высоком сродстве к ДНК-полимеразам нуклеозвд-5'-трифосфатов с уплощенной конформацией углеводного фрагмента молекулы. Для этого разработаны методы синтеза и получены 5'-трифосфорилированные нуклеозиды, содержащие 2',3'-двойную связь, а также 2',Т-ликсо-'и 2\'3'-рибоэпокси группы. Описан эффективный способ получения У-трифосфатов из соответствующих модифицированных нуклеозщгов. Выявлена низкая специфичность обратных транскриптаз ретровирусов к субстратам с уплощенным углеводным фрагментом.

- Продемонстрирована способность ряда ДНК-полимераз использовать в качестве субстратов аР-алкилированные нуклеозид-У-трифосфаты и катализировать образование цепей ДНК с незаряженными межнуклеотидными звеньями. Предложен способ получения аР-модифицированных ¿ТЯТР без выделения промежуточных продуктов. Показана высокая селективность ДНК-полимераз по отношению к стереоизомерам аР-арилированных трифосфатных аналогов. На примере аР-алкилированных и арилированных (ЮТР продемонстрирована низкая специфичность обратных транскриптаз к модификациям а-фосфатных остатков. V ■ -

- С учетом этого свойства предложено использовать с качестве блокатора репродукции HIV 5-монофосфаты нуклеозвдов, кодифицированные по атому фосфора. На основании предложенных ранее н найденных нами подходов осуществлен синтез новых групп соединений - фосфонатов и фторфосфатов нуклсозндов, модифицированных по углеводному остатку, многие из которых оказались высокоэффективными ингибиторами репродукции HIV в клеточных культурах.

- Разработан метод стереохонтролируемого синтеза всех четырех изомеров карбоциклического аналога 2',3'-дидезокси-2',3,-дидегидро-5'-норадено-зина, исходя из одного ключевого соединения. Полученные трифосфатньте производные с траяо-расположением аденина и трлфосфатного - остатка оказались селективными ингибиторами концевой дезоксинухлеотидил-трансферазы. Таким образом, впервые найдены высокоселективные ингибиторы этого фермента.

Практическая ценность. Найдены нуклеозидные производные, эффективно ингибирующие репродукцию вируса иммунодефицита человека в культуре клеток. Одно из наиболее актизных соединений - 5'- _ Н-фосфонат 3'-азидо-2',3'-дидезокс!гггЬмидина ("Фосфазид") в настоящее время успешно прошло доклинические испытания по правилам Фармакологического Комитета РФ в Кардиологическом Научном Центре РАМН. Разработаны препаративные методы получения потенциальных противовирусных препаратов: - • • •- •■• -

Апробация работы. Диссертационная работа была апробирована на заседании межлабораторного научного семинара Института Молекулярной Биологии им.В АЭнгельгардта РАН в феврале 1995 г.

Основные результаты работы докладывались на конкурсе научных работ ЙМБ РАН в 1989, 1991, 1993 годах, а также на международных симпозиумах "Проблемы иммунофармакалогии" (Тбилиси, 1990 г.), "Синтетические олигонуклеотиды: проблемы и границы практического применения" (Москва, 1991 г.), 7-ом и 9-ом Симпозиумах по химии компонентов нуклеиновых кислот (Чехия, 1987г. и 1993 г.), 2-ом Международном симпозиуме по фосфорной химии, ориентированной на биологию (Лодзь, 1986 г.), УШ Средиземноморском конгрессе по химиотерапии (Афины, 1993 г.), VIII Международном конгрессе по вирусологии (Берлин, 1990 г.), на 9-ом, 10-ом и 11-ом Международных круглых столах " Нуклеозиды, нуклеотиды и их биологическое применение" (Уппсала, 1990 г.; Парк-Сита, 1992 г.; Лувен, 1994 г.).

Структура работы. Диссертация изложена в настоящей работе в виде научного доклада. Основная часть результатов получена в соавторстве с АА.Арзумановым, Л.СВикторовой, М.К.Кухановой, Д.Г.Семизаровым, А.М.Атражевым, З.Г.Чиджавадзе, Р.Ш.Бибилашвили, М. фон Янта-Л'тилским. Вклад других соавторов отражен в публикациях по теме диссертации. Всем коллегам приношу глубокую благодарность за участие в совместных работах. Искренне признательна А_А.Краевскому за постоянный интерес, помощь, поддержку и обсуждение работы.

Список сокращений

сЮТР - 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфат

В - гетероциклическое основание

НГ/ - вирус иммунодефицита человека

АМУ - вирус птичьего миелобластоза

СМУ - цитомегаловирус человека

ТЯГ - концевая дезоксинуклеотидилггрансфераза

НЗУ - вирус герпеса простого, тип I человека

Р !3\' - Еирус саркомы Рауса

БРА - ДНК-полимераза А термоацидофильной архебактерии БиИЫоЬг^

аа'восМапш КГ- фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I из ЕсоП АСТ -3'-азидо-2',3'-дидезокситимщтн УЦТ - 3'-фтор-2',3'-дчдезокситимидин (ЗаК - 2',3-дидезоксинуклеозид (14~Ы - 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидронуклеоз1щ БМР - ИДЧ-диметилформамид ЕБТА - этилендиаминтетраацетат БСС - Ы^'-дициклогексилкарбодиимид КШ - К,Ы'-карбонилдиимидазол ТР8С1 - 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорид МБИТ - мезитилен-2-сульфонил-3-шггро-1,2,4-триазол ТВАР - тетрабугиламмоний фтористый

СОя, - концентрация вещества, при которой рост клеток подавляется на 50%.

ГОзд - концентрация вещества, при которой происходит 50% подавление

репродукции-вируса. 81 - индекс селективности (Б! = СОзо/ГОзд ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Субстратные свойства нуклеозид-5*-трифосфзтов с мод^фэдм^елнпьш углеводным фрагментом

К началу нашего исследования сравнительное изучглкс ДНК-полимераз различного происхождения с помощью модифицированных субстратов уже показало свою продуктивность. Такой подход позволил выявил, существенные различия в субстратной специфичности этой группы ферментов. Наиболее полезным охазалось замещение 3'-гидроксильной группы 2'-дезоксирибофуранозного цикла па некоторые другие группы, что позволяет 5'-трифосфатам модифицированных нуклеозидов включаться в З'-положение строящейся цепи ДНК и прекращать элонгацию цепи. Соединения с таким механизмом действия называются терминаторными субстратами биосинтеза ДНК. Ранее были синтезированы и изучены в ферментативных реакциях следующие 3'-модифицированные аналоги сШТР:

Методом ПМР бьшо показано, что в комплексе [ДНК-полимераза 1 + dNTP], где dNTP - dATP и (ПТР, субстраты принимают 04'-эндо-конформацию дезоксирибофуранозного остатка, в которой атомы СГ, С2', СЗ' и С4' лежат практически в одной плоскости (Fenin and Mildvan, 1985). Однако оставалось непонятным, сохраняется ли эта конформация dNTP в полном синтезирующем ДНК комплексе [ДНК-полимераза + праймер-матрица + dNTP], Известно, что комплекс (ДНК-полимераза + dNTP] при связывании праймер-матрицы теряет dNTP и лишь после образования комплекса [ДНК-полимераза I + праймер-матрица] повторно связывает dNTP (Biyant et ai, 1983). Поэтому можно было, представить, что конформация dNTP в комплексе [фермент + dNTP] может отличаться от конформацни субстрата с продуктивном комплексе.

Я Я я

X = Н (Atkinson et at, 1969; Sanger et a!., 1977 )

X

X =' N3 (Chidgeavadze et at,-1986) X = NH2 (Chidgeavadze et al., 1984) X = NHAc (Chidgeavadze et ai., 1986)

б

С целью изучения этого вопроса мы синтезировали несколько анало! ов бЬТТР с ограниченной подвижностью углеводной части молекулы. Были получены также несколько новых З'-замещенных аналогов ЛТР. Синтез З'-хлор (2) и З'-тиоцианато- (3) производных 2\3'-дидезокс:пимидина осуществлен путем раскрытия 2тЗ'-ангидроцикла нукпеозида 1 под действием хлористого аммония или тиоцианата калия, соответственно, с последующим детритилированием (схема 1). Обработка 1 цианистым натрием приводила после детротилирования к 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидину 6. Сруктура полученных нуклеозидов подтверждена ЯМР-, масс- и ИК-спектрами.

Схема 1

Л

Лснз

V

ТгО-| ' \

-О

N

iv —>•

сн,

Г?

X

2 X = С1

3 X = 5СИ

X

4 х = а

5 X = БСИ

7

6

©з — Р3°9^Н4>4 I: а. Н+; Ь. РОС1з, 1,2,4-триазол, триэтиламин; с. Р2О7Н4-2 ВизЫ; й. Н2О п: а. МН4С1 или КБСК, ОМБ; Ь. Н+

ш: а. РОС13, 1,2,4-триазол, триэтиламин; Ь. Р207Н4-2 ВизЫ; с. Н2О ¡V; а. ИаСИ, БМР; Ь. Н+

Поскольку всё синтезированные нуклеозщш не содержат вторичных гидроксильных групп, для фосфорилирования был использован высоко

реакционноспособный фосфотрис(1,2,4-триазолид), получаемый ипл реакции хлорокиси фосфора и триазола в присутствии триэтиламика использованный без выделения. Первая стадия - получение фосфобис(триазолида) нуклеозида - длилась 5-10 мин. Дальнейшая обработка продукта реакции трибутиламмонийной солью пирофосфорной кислоты в течение 1-2 ч при комнатной температуре с последующим пиролизом триазольного остатка приводила ^, к трифосфаткым производным 4, 5, 7, 8. Трифосфаты нуклеозидов выделяли ионообменной колоночной хроматографией в ЫЩНСОз-буферс, их гомогенность показана ВЭЖХ. Спектральные и хроматографические хараетериешки полученных трифосфатов приведены в табл. 1.

Кроме того были синтезированы два адениновых производных с ограниченной подвижностью рибозного кольца - 5'-трифосфаг?л рибоангидро- (9) и ликсоангидро- (10) аденозина. Трифосфаты 9 и 10 были получены из соответствующих нуклеозидов, любезно предоставленных А-В.Папчихиным. Фосфорилирование проводили как описано выше.

Все соединения были испытаны в модельной системе элонгации синтетических праймеров на матрице -ДНК фага М13шр10 в присутствии ДНК-полимераз из различных источников. Результаты испытаний приведены в табл. 2.

Наиболее сильные терминаторные рвойства продемонстрировало трифосфатное производное <34Т (7). Соединение 7 терминирует синтез ДНК, катализируемый всеми испытанными ферментами, кроме ДНК-полимеразы а из тимуса теленка. Этот фермент не включал остатох 7 даже при 50-кратном избытке 7 относительно природных сЮТР. По отношению к другим ДНК-паишеразам терминирующая активность 7, особенно в случае ДНК-полимеразы I, значительно превосходила активность всех других описанных термияаторных субстратов. Можно предполохаггь, что высокие терминационные свойства этого трифосфата связаны с особенностью конформации его фуранозиого кольца.

Присутствие двойной связи в -.положении С2' - СЗ' должно понижать конформационную подбижность фуранозного цикла и уплощать его.

Таблица .1. Спектральные и хромато графические свойства синтезированных нуклеозид-5'-трифосфатов

Соединение УФ(НаО) Хмах (е.)" Rf* Время удерживания (мин)**

4 269 (9900) 0,18 11,1

5 267 (10000) 0,15 16,7 •

7 267 (9980) 0.30 17,3

S 254 (8500) 0,29 18.1

9 260 (15100) 0,11 17,4

10 259 (15000) 0,12 16,6 •

* диоксан-аммиак-вода 6:4:1 (v/v/v), Kieselgel 60 F254 (Merck) ** колонка (250 x 4,6 мм) Nucleosil 120-7 NH2 в линейном градиенте КН2РО4 (0,05 - 1 М) в течение 30 мин со скоростью 1 мл/мин, время удерживания сПТР - 11,8 мин, dATP - 14,3 мин

/

Это согласуется с данными рештеноструктурного исследования 2',3'-дидезокси-2',3'-д11дегидротимидина 6 (d4T). Рентгеноструктурный анализ показал, что.,, действительно, особенностью молекулы d4T является плоскостное строение его фуранозного цикла с незначительным (0,lA) отклонением атома 04' в эидо-положение. При этом атомы водородов при С2' и СЗ' занимают экваториальную позицию. Относительно N-гликозвдной связи наблюдается конформацнонная подвижность.

Планарность углеводного цикла d4T, а также чрезвычайно высокие терминационные свойства его трифосфата 7 могут свидетельствовать в пользу того, что субстраты ДНК-полимеразы р , TdT и обратных транскриптаз при связывании этими ферментами переходят в состояние, при котором фуранозный цикл находится в уплощенной конформации. Такая конформааия, по-видимому, сохраняется и в полном синтезирующем ДНК комплексе. С другой стороны, плоскостное строение дидезоксщщдепшрофуранозного цикла й отсутствие выходяшлх из плоскости атомов водорода при С2' и СЗ' обеспечивают возможность более свободного вращения нуклеинового основания вокруг гликозидной связи. Тонкая конформайионная подстройка с низким энергетическим барьером в активном центре фермента облегчает образование правильной уотсон-

криковской пары (Guiskaya et al., 1991; Van Roev ei al., 1993), что обусловливает высокое субстратное сродство трифосфата 7 ко многим ДНК-полимеразам.

Таблица 2. Терминация синтеза ДНК, катализируемого различными ДНК-полимеразами, в присутствии трифосфатов модифицированных нуклеозидов

Соед. I(Kf) а ß AMV TdT RSV DPA

4 + - + + +

5 - + + _

7 + - + ++ ++ ++

8 - - - - -

9 + - + + + +

10 - - - + + -

+ терминация при соотношении концентраций тестируемого

соединения к dNTP равном (1-10):1. "I—Ь терминация при соотношении концентраций тестируемого

соединения к dNTP менее, чем 1:1 для матричных ферментов. - отсутствие терминации

Трифосфаш 8-10 также имеют ограниченную конформационнуто подвижность и определенное уплощение углеводного кольца из-за наличия дополнительного цикла (Koole et 'al., 1991). Соединения 9 и 10 являлись субстрахами TdT и обратной транскршпазы AMV, а 9 также и субстратом DPA и ДНК-полимеразы I (Kf). В то же время соединение 8 не терминировало синтез ДНК ни в одном случае.

Соединения 7-10 представляют собой молекулы с достаточно жесткой циклической структурой углеводных фрагментов. Это может ограничивать возможность их информационных превращений, необходимых два образования компетентного для реакции комплекса, каталитического акта и последующей диссоциации продуктов реакции. Поэтому нами были синтезированы ациклические аналоги dNTP 11-13,обладающие определенной конформационной подвижностью. Трифосфаты 11-13 были получены по методике, описанной выше, из соответствующих ациклических нуклеозидов, синтезированных А-В.Цытович и соавт.

н4о9?3о—[ ? 11. В = лае

I I 12. В = Суг

\_/ 13. В = ТЬу

Трифосфаты 11-13 проявляли свойства терминагорных субстратов по отношению к игарокому набору ДНК-полимераз: а и е из плаценты человека, р из печени крыс, ТсГГ, обратных транскриптаз АМУ и НГ\Л Ед1Шствен?гь:м исключением являлась ДНК-палнмераза I (КО из КсоП, которая не только не включала ациклические иуклеотидные остатки, но и синтез ДНК в присутствии этих соединений не ингибировался (Кгауеузку е1 а1., 1993). Таким образом, можно полагать, что плоскостное расположение атомов СГ, С2', СЗ' и С4' в соединениях 11-13, сочетающееся с определенной конформационной подвижностью вследствие отсутствия цикла, определяет эффективные свойства ациклических аналогов как терминаторных субстратов многих ДНК-полимераз, в том числе ДНК-полимеразы а.

Анализируя данные о субстратной активное™ синтезированных нами трифосфатов, можно сделать следующие выводы:

1. Наименее специфичны к аналогам <1ЫТР обратные транскриптазы. Катализируемый этими ферментами синтез ДНК терминировался всеми испытанным соединениями, кроме 8. ' " ' ""

2. ДНК-полимеразы а из разных источников обладают наибольшей субстратной специфичностью. Биосинтез ДНК, катализируемый этими ферментами, терминировался лишь производными ациклонуклеозидов.

К основным требованиям, предъявляемым к соединениям с противовирусными, в том числе анти-НЛ/, свойствами, относится не только иншбировакие вирусной ДНК-полимеразы, но и низкое сродство к ДНК-пслимеразам человека. Высокая селективность в модельных ферментных системах является одним из факторов, определяющих низкую токсичность противовирусного препарата. Поиск веществ с селективным противовирусным действием в ряду нуклеозидных аналогов остается в настоящее время актуальной задачей. Одной из возможностей является введение в молекулу нуклеозида, замещенного по углеводному остатку, еще одной модификации. Это может привести к снижению сродства субстрата к ДНК-полнмеразам человека без изменения его субстратных свойств по отношению к обратным транскриптазам, как наименее

селективным ферментам. Синтез и противовирусные свойства такого рода соединений рассмотрены в главе 2.

2. 5'-Фосфонаты модифицированных по сахарному остатку пир&мцдиноаых нуклеозидов как ингибиторы Н1У

Известно большое количество модифицированных по 3'-рибофуранозному остатку 2'-дезоксинуклеозидов, активно подавляющих продукцию Н1У в культурах клеток, несколько таких нуклеозидов используются для лечения СПИД у людей. Молекулярный механизм действия этих нуклеозидов включает их превращение в соответствующие монофосфаты, затем в дифосфаты и, наконец, в 5'-трифосфаты. Последние ингибируют синтез провирусной ДНК по терминационному механизму.

Многие нуклеозиды, однако, плохо фосфорилируются в клетках соответствующими нуклеозидкиназами и нуклеотидкиназами из-за высокой специфичности этих ферментов. Таете соединения, несмотря на высокую активность их трифосфатов в модельных системах, прояаляют очень слабую активность в подавления НГУ, либо не активны вообще. Использование нуклеозвд-5'-фосфатов ограничено их возможным ферментативным дефосфоршшрованием в межклеточной среде, а также трудностью проникновения несущих отрицательный заряд фосфатов через-клеточную мембрану. Поиск нуклеозидных аналогов, имеющих фосфорсодержащую группу в 5'-положении, способных проникать в клетки и ингибировать репродукцию Н1У, представляет практический интерес. Кроме того, такие соединения полезны для изучения свойств ферментов нуклеинового обмена, в том числе ДНК-полимераз. Они могли бы исключить зависимость активности ингибитора от нуклеозиякнназ, а •также некоторые побочные катаболитические пути, характерные для нуклеозидов. Однако можно было опасаться того, чго наличие двух модификаций в молекуле ингибитора снизит их сродство к нуклеотидкиназам, а также к обратной транскриптазе НГУ.

В настоящее время синтезировано большое количество аналогов <ШМР, модифицированных по фосфатному остатку - главным образом эфиров и фосфзмидов ¿ИМР (МасСок а а1., 1990; Perigaud ег а1., 1992; МасС1^п е! 1993 и цитированное там). Однако эти соединения можно рассматривать лишь как предшественники нуклеотидов, в которых фосфатная группа защищена эфирным или амидньш остатком. Нами

разработан метод синтеза и выделения 5'-фбсфитов (5'-Н-фосфонатов), 5'-

дезоксинуклеозидов пиримидинового ряда, что сделало возможным изучение их противовирусных свойств. Можно было ожидать, что, такие соединения будут либо имитировать г'-дезоксинуклеознд-У-монофосфат, превращаясь в соответствующее модифицированное трифосфатное производное, либо отщеплять фосфорсодержащую группу и затем подвергаться фосфорилированию клеточными киназами. Нельзя было исключить, что Н-фосфонаты способны окисляться до соответствующих монофосфатов.

Первым и по настоящий день самым широко применяемым в клинике препаратом для лечения СПИД является 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин (А2Т). Его применение, однако, сдерживается довольно высокой токсичностью этого соединения. Нами был синтезирован Н-фосфонат АСТ 14 (схема 2). До начала нашего исследования поиск антиметаболитов в ряду Н-фосфонатов не проводился. Для получения 14 был использован метод, принятый для синтеза Н-фосфонатов в олигонуклеотидном синтезе - обработка нуклеозида хлорангидридом салицилиденфосфористой кислоты (Maгugg е1 а!., 1986). После ионообменной хроматографии фосфонат 14 бьш получен с выходом 75%.

Недостаток описанного способа заключается в использовании дорогостоящего реагента и трудности отделения продукта реакции от салициловой кислоты. Биологические испытания, в том числе изучение токсичности, потребовали получения значительных количеств Н-фосфоната 14. Наиболее экономичным и удобным способом синтеза в этом случае оказалась конденсация нуклеозида с фосфористой кислотой в присутствии ОСС (схема 3). Практически все описанные в данной главе

фосфонатов и 5'-фторфосфатов З'-моднфицированных 2'-

Схема 2

о и

фосфонаты и Н-фосфонаты были получены этим методом с применением различных конденсирующих агентов - ОСС, ТРБС! или МБЫТ.

Схема 3

НО

Р

DCC, Н3Р03

12 ■

14: B=Thy, X=N3 15: B=Thy, X=F lfcB=Thy, X=H 17: B=Ura, X=F 18: B=5-BrUra, X=F

x 75-80%

Введение атома фтора в молекулу нуклеотида приводит к соединениям с широким спектром биологической активности. Атом фтора можно рассматривать как изостеричный атому водорода (радиусы Ван-тер Ваальса для Н - 1,20 А, для И - 1,35 А). С другой стороны, электроотрицательные свойства атома фтора подобны таковым кислорода. Нам представлялось интересным синтезировать и изучить противовирусные свойства нуклеозцд-5'-фгорфосфатов.

Схема 4

FPO(OH)2

MSNT

О

II

F-P-0 НО

V

X

Соединение Время реакции Выход, %

19. B=Thy, X=N, 2 час 36

20. B=Thy, X=F 20 мин 62

21. B=Tliy, X=H 50 мин 64

23. B=Ura, X=H 3 час 60

Ранее было предложено несколько подходов к синтезу фторфоефатов нуклеозидов. Так, было описано фторирование нуклеозид-5-монофосфатов действием 2,4-динитрофторбензола или БОзСШ (БаЫ^гИ е1 а!., 1992). Инозин-5-фторфосфат был получен конденсаций инозина с фторангидрвдом фосфорной кислоты в присутствии ОСС (№сЬо! е1 а1., 1967). Однако, такой способ позволил нам получить лишь следы нуклеотидов 19-23 . Наиболее подходящими конденсирующими агентами для синтеза фторфоефатов оказались ТРБО и МБЫТ (схема 4).

Следует отметить низкую активность (ИС в реакции конденсации с фторангидридом фосфорной кислоты (схема 5). После защиты аминогруппы действием диметил ацетата диметилформамида реакционоспособность нуклеозида в реакции конденсации возросла до уровня тимпдиновых производных. Деблокирование щггозинового остатка происходило в процессе аннонообменной хроматографии в ИНдНСОз-буфере, 22 был выделен с выходом 67%, считая на сЗеЗС.

Схема 5

ИН,

&йС

11=СН-?/(СН3)2 1. (СН3)2ЫСН(ОСН3)2/ОМР; и. РР(0)(0Н)2, МБЫТ/Ру; ш. анионообменная хроматография в ЫЩНСОз-буфгре

22

Фторалкилфосфонатные и дифторалкилфосфонатные производные были выбраны в качестве близких изоэлектронных и изостерических аналогов фосфатов. Винилфосфонатные аналога представляют иной тип фосфонатов - не содержащих фтора, но несущих электроотрицательную группу. В качестве примера соединений с электронодонорным эффектом заместителя при атоме фосфора были получены 2'-дгзоксинуклеозид-5'-метилфосфонаты. Синтез фосфонатных производных проводили по схеме 6(1) конденсацией нуклеозида с соответствующей фосфоновой кислотой.

Схема 6

НО-

|А_]

-Ь. НО-Р-I

я

11

ш

IV

I

НО-Р-

СН2С1

СНпОАс

Г*

НО-Р

НО-Р-

сн2он НО-Р

- й

>

НО-Р-

п

соон

1. Реагенты приведены в тебл.З ц. С1СН2РОС12, РО(ОВ)3 ш. АсОСН2РО(ОН)2, ТРЗС1

¡v. ЕЮОСРО(ОН)2, ТРБС! V. КаОН, Н20

На следующем этапе нами были получены ссед;ше;п'.я, ссдерх при атоме фосфора заместители, несущие функциональные группы. Хлорметилфосфонаты получали реакцией нуклеозида с дихлорангидридом хлорметилфосфоновой кислоты в триалкллфосфате с выходом около 70% (схема 601».

Оксиметильные производные получали конденсацией нуклеозидов с ацетоксиметилфосфоновой кислотой с последующим щелочным пиролизом (схема 6011)).

Для получения карбоксифосфоната 47 А2Т конденсировали с зтсксикарбонилфосфоновой кислотой, затем этильную группу удаляли щелочным гидролизом (схема 6(Ь0). Условия реакшш, реагенты и выход продуктов приведены в табл. 3.

Таблица 3. Экспериментальные условия и выход фосфонатных аналогов, полученных по схеме 6

О

Соединение Реагент Конд. агент Время реакции Выход %

24. В=ТЬу. СН, СН,РО(ОН), трза 20 мин 78

25. В=ТЬу. К=.СН?ОН . АсОСН-)РО(ОНЬ трэа 30 мин . 60

26. В=ТЬу, Я= СН7С1 асн,Рось 10 час 73

27. В=Т11у, Я= СН,1 1СН,РО(ОН), ТРБО 30 мин 76

28. В=ТЬу, СН,Р РСН,РО(ОНЪ ТРБС! 30 мин 76

29. В=ТЬу, Л= СН=СН, СН,=СНРО(ОНЬ тРБа 30 мин 72

30. В=ТЬу, СООЕ1 ЕЮОСРО(ОНЪ ТРБО 30 мин 67

31. В=ТЬу, Я= CN ЫСРО(ОН)-, ТРБО 40 мин 63

32. В=ТЬу, Я= СНР, Р,СНРО(ОН), ТР5С1 30 мин 78

33. В=ТЬу, Я= СНРС1 РСШСРО(ОН), ОСС 72 час 56

34. В=ига, Я= СН, СН?РО(ОН)у ТТСС) 20 мин 78

35. В=ига, Я= СН,1 1СН,РО(ОН), трза 25 мин 75

36. В=ига, СН?ОН АсОСН,РО(ОНЬ ТРБО 30 мин 60

37. В=5-ВШга, Я= СН, СН,РО(ОНЬ трбсл 35 мин 72

38. В=5-Вгига, Я= СН,1 1СН,РО(ОНЬ ТРБО 35 мин 71

39. В=5-Вгига, Л= СН7ОН АсОСН?РО(ОНЬ ТРБС! 30 мин 58

40. В=5-ЕШга, Я= СН-, СН-,РО(ОНЬ трбо 20 мин 67

о

Соед. Реагент Конд. Время^ Выход

агент реакции %

41. 11= Р РРО(ОН), МБет 45 мин 44

42. Я=СНЬ р>СНРО(ОНЪ ТРЗС1 30 мин 52

43. Pv= СН,Р РСН,РО(ОН), ТРБО 30 мин 52

44. ¡1= СНРС1 РСШСРО(ОН), мэит 10 час 34

45. СН=СН, СН,=СНРО(ОН)7 мэит 30 мин 78

Соед. Реагент' Конд." агент Время реакции Выход %

46. СНч СНчРОЮНЬ ТРБС1 20 мин 60

47. К= СООН АсОСН7РО(ОН)7 МЭШ- 30 мин | 60

Все фосфонатные и фторфосфагпше производные выделяли хроматографией на БЕАЕ-носителе и дополнительно очищали обращеннофазовой хроматографией на силикагеле ЫСкгоргер С-18. Строение полученных фосфонатов было подтверждено 'Н-, 31Р-ЯМР- и масс-спектрами. В табл. 4 приведены параметры спектров ЯМР, характеризующие строение фосфорсодержащего фрагмента.

Синтезированные соединения были изучены в качестве ингибиторов репродукции ШУ в клеточных культурах. В табл. 5-7 приведены результаты этих испытаний.

Таблица 4. Некоторые данные спектров ЯМР соединений 14-46, характеризующие строение фосфорсодержащего фрагмента

Соединения Заместитель при Р-атоме lH-ЯМР*, 5 мл. 31Р-ЯМР*, 5 мд. JH,P Гц JH,F Гц JP,F Гц

14- 18 H 6,60а 630 -

19 - 23, 41 F - 6,90 _ - 935

24, 34, 37, 40, 46 СН3 1,30д -

25, 36, 39 СН,ОН 3,80д 7.5 _ -

26 СН,С1 3,60д 9,5 -

27, 35, 38 СН,1 2,95д 9.5 - -

28,43 CH,F 4.65д 12,95д 4.5 48 58

29, 45 сн=сн, 5,50-6,00м 8,25с - -

32, 42 CFH, 5,80дд -6,30т 21 48 81

33**, 44" CHFC1 6,42д и 6,40д 14,60д 6,0 46 70

30 COOEt 1,20дг (СН3) 4,25-4,20м (CH,) 0,8 —

31 CN -9,80с - - -

.Спектры регистрировали bJDjO. 31Р-ЯМР спектры регистрировали с подавлением фосфор-протонного спин-спинового взаимодействия. * В таблице приведены усредненные значения хим. сдвигов дая соответствующих групп соединений ** R и S стерсоизомсры в соотношении 1:1.

Все фосфонаты, показавшие противовирусную активность, являлись производными нуклеозидов, обладающих ангаретровирусными свойствами. Среди соединений 14-18 наиболее интересными оказались Н-фосфонаты ACT и FLT (табл. 5). Испытания показали, что Н-фосфонаты как правило несколько менее активны, чем родительские нуклеозиды, но в то же время- и менее токсичны. Это приводят к тому, что их индекс селективности близок индексу селективности соответствующих нуклеозидов. Было показано также, что 14 эффективно защищает инфицированные клетки от цитопатогенного действия вируса: в концентрациях от "0,3 до 3,0 мкМ обеспечивает сохранение боле« 50% инфицированных клеток. В настоящее время показано, что -90% 14 в

крови кролика превращается в А2Т, 50% которого выводится ш организма за 3 часа. Для А2Т этот показатель составляет 50 мин (данные ВКНЦ РАМН). Это позволяет рассматривать Н-фосфонат А2ГГ как потенциальный противовирусный препарат, который может найти практическое применение в лечении НГУ-инфекций.

Таблица 5. Противовирусный эффект и цитотоксичность 5'-Н-фосфонатов AZT и FLT в культуре клеток МТ4.

Соед. CD,0, ID™, мкМ SI Приме-

мкМ по вирус- по актив- по вирус- по актив- чание

ному ности обр. ному ности обр.

антигену транскр. антигену транскр.

14 174 0,12 0,054 1450 3222 1

AZT 84 0,013 0,012 6462 701)0

14 2500 0,072 34700 2

AZT 154 ' 0,005 30800

14 102 0,03 3400 3

AZT 72 ' 0,06 1200

2 123 0,13 0,092 946 1337 1

FLT 89 0,0029 0,0084 30690 10595

2 >500 0,088 0,178 >56000 >28000 2

FLT 190 0,069 0,008 27530 23750

1. Данные А.Г.Покровского (НПО "Вектор", пос. Кольцове, Новосибирская область); 2. Данные B.PoIsky (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New-YoiJc, USA); 3. Данные Г-А-Галетова и Э.В.Карамова (Институт вирусологии 1ш. Ивановского, Москва)

Ряд фторфосфатов также показал хорошие противовирусные свойства (табл. 6). Введение фторфосфатной группы не ведет к падению активности по сравнению с соответствующими нуклеозидами. Наиболее активным в этой группе оказался фторфосфат FLT 20, индекс селективности которого близок к таковому для FLT.

Большая часть фосфоиатов 24-47 не проявила какой-либо заметной противовирусной активности при испытаниях в клеточных культурах.

Данные для наиболее активных соединений прзязедены в табл. 7. Как видно, наиболее сильным противовирусным действием обладал Карбсксифосфонат А2Т 47. При активности практически равной А27Г, его токсичность существенно ниже. Это приводит к тому, что индекс селективности у фосфоната 47 выше, чем у А2ГГ.

Таблица 6. Противовирусное действие фторфосфатов нуклеозидов.

Соединение Тип клеток СБ™, мкМ ГО™, мкМ

19 Н9 нгпри 100 0,14

А2Т Н 9 нт при 100 0,23

20 РВЬ 630 0,004. 157500

ИТ РВЬ 775 0,002 387500

7 Н9 нт при 100 0.3

р иг Н9 нт при 100 .0,2

21 РВЬ 580 100 5.8

аат РВЬ 4300 1,4 3070

22 РВЬ нт при 1000 <0,08

ddC РВЬ 3500 0,08 437500

23 РВЬ 100

ddU РВЬ 100

нг - не токсичны (результаты получены В.Рокку)

В настоящее время молекулярный механизм дейстьля испытанных фторфосфатных и фосфонатных производных не выяснен и, по-видимому, может бьтгь различным для различных сединений. Од1Ш из возможных путей ингибирования репродукции вируса заключается в превращении фосфоната нуклеозида под действием клеточных нуклеотидкиназ или других фосфорилирующих нуклеотиды ферментов в дифосфорил-фосфонатное производное, которое конкурирует с природным ¿КГР в процессе элонгашш цепи ДНК, катализируемой вирусной ДНК-полимеразы. Стабильность и субстратные свойства таких трифосфатных аналогов будут рассмотрены в главе 3.

Таблица 7. Противовирусное действие фосфонатов нуклеозидов.

Соединение Тип клеток СБа, мкМ Шэд, мкМ Прим.

28 Н9 нтпри 100 10-100 1

29 Н9 нтпри 100 24 1

30 Н9 нт при 100 30 1

32 Н9 нт при 100 8 1

33 Н9 нт при 100 2,5 1

РЬТ Н9 нт при 100 0,2 1

46 МТ4 нт при 145 0,093 2

47 МТ4 161 0,016 10069 2

А2Т МТ4 84 0,013 6462 2

1. Данные В.РоЫсу

2. Данные А.Г.Покровского. Активность измерена по вирусному антигену

Таким образом, среди более чем 30 изученных аналогов сШМР найдены четыре высокоактивных соединения - фосфонаты 14, 15, 20 и 47. Это подтверждает перспективность применения фосфонатов активных нуклеозидов в качестве ингибиторов НГУ-инфекции. Важным моментом является снижение токсичности после введения фосфонатной группы. Это позволяет предположить, что использованный подход к получению модифицированных производных нуклеозидоз со сниженной цлтотоксичносгью является достаточно перспективным.

3. Синтез и изучение субстратных свойств аР-модифицированных 2-дезоксинухлеозяд-5'-трифосфатов

Изучение аналогов сШТР, модифицированных по аР-положению, представляет интерес с нескольких точек зрения. Во-первых, наличие двух модификаций в молекуле <ШТР, по аР-положеник> и в углеводной части, приводит к значительному ухудшению субстратных свойств. Это позволяет увидеть разницу в субстратной специфичности ДНК-полимераз из различных источников и разработать подходы к синтезу селективных ингибиторов определенных ДНК-полимераз. Во-вторых, замещение в аР-положении приводит к возникновению хирального атома фосфора, что обуславливает появление двух диастереомеров. Таким образом, аР-мадифицированные аналога бКГР оказываются полезным инструментом

для изучения стереохимии реакции переноса нуклеотидного остатка под действием ДНК-полимеразы. Ранее было показано, что ДНК-полимеразы из КсоН, фагов Т4 и Т7 и обратная транскриптаза AMV используют только Sp-изомер а-тиотрифосфатов 2'-дезоксинуклеозидов, образуя межнуклеотилную связь с Rp конфигурацией (Eckstein, 1983). Стереоспецифичность реакции элонгации цепи ДНК в присутствии ¡шдивидуальных изомеров ctP-ал килированных производных dNTP ранее не была изучена.

3.1. Получение З'-модифицированных нуклеозид-5'-а-тиотрифосфзгюа и их способность терминировать биоситсз ДНК.

Как было показано ранее, dNTP, у которых З'-гидроксильная группа замещена на N3, NH2 или F, являются хорошими терминаторными субстратами многих ДНК-полимераз (Краевский и соавт., 1987). Нам представлялось интересным изучить воздействие модификаций трифосфатного остатка на субстратные свойства таких соединений. Для этой цели были синтезированы а-тиотрифосфаты З'-модифицированных нухлеозидов (схема 7). Первый синтез а-тиотрифосфатов был осуществлен путем последовательного получения тиофосфата нуклеозида, его активации CDI и конденсации соответствующего имидазолида с пирофосфатом (Eckstein et al., 1967). Позднее был описан способ синтеза тиотрифосфатоЁ, основанный 'на- реакции - 'нуклеозида с PSClj с последующим пирофосфорилированием без выделения промежуточных продуктов (Goody et al., 1986).

Наличие лишь одной свободной гидроксильной труппы нуклеозидов AZT, FLT и 48 позволило нам использовать менее избирательный по сравнению с PSCI3, но более активный фосфорилирующий агент -тиофосфотрис(1,2,4-триазашш) 51. Взаимодействие PSCI3 с триазолом в CH3CN в присутствии трех эквивалентов триэтиламина на холоду приводила к образованию тразолида 51 (схема 7). Этот реагент без

с

дополнительной очистки использовали v для фосфорияирования нуклеозидов AZT, FLT и 48, реакция завершалась за 5-10 мин. Продукт фосфорияирования 49 без выделения обрабатывали три-н-бутиламмониевой солью пирофосфорной кислоты в течение 2-3 часов.. Тиотрифосфаты 50а-с выделяли со средним выходом 45% хроматографией на DEAE-носителе в градиенте М^НСОз-буфера.

Схема 7

HO~b°J

Thy

PSClj + 1,2,4-триазол *

[PS(Tri)3]

51

X=N3 (AZT) X=F (FLT) X=OAo ' 48

H4P207.2Bu3N

ff fl 8 xj,v

hop-o-p-o-p-o—| о | y

¿H OH ¿H t 1 X

50

Tri —N I \=N

s

M

Tri-P-

•Iri

Thy

49

— a X=N3 b X=F с X=OAc

d x=nh2

с X=OH

>

i - h2s, Py/H20 ii - nh4oh, h2o

Деблокирование 50c проводили водным аммиаком, полученный трифосфат 50е еще раз очищали хроматографией. Аминонуклеотид 50d .- получали, восстановлением азидонуклеотида 50а.. Использование применявшегося ранее для восстановления азидонуклеозидов трифенилфосфина в данном случае приводило к сложной смеси продуктов, содержащей лишь следы требуемого нуклеотида 50d- С наибольшим выходом 50d был получен при обработке раствора 50а в водном пиридине газообразным сероводородом при комнатной температуре в течение часа. После хроматографии на DEAE-носителе 50d был получен с выходом 60%, считая на 50а.

Все полученные соединения были выделены .в виде смеси Rp и Sp изомеров, что подтверждено набором сигналов а, ß и у-атомов фосфора в спектрах 31Р-ЯМР. Наличие атома серы в а-положении также подтверждалось 31Р-ЯМР спектрами, характерными для этого типа соединений (Eckstein, 1983) (табл.8). Их чистота была установлена с помощью ВЭЖХ на колонке Zorbax-NH2 в градиенте КН2РО4. Тиотрифосфаты 50a-b,d-e имели меньшее время удерштния, чем соответствующие соединения с природной трифосфатной группой.

Таблица 8. 31Р-ЯМР-спектры тиотрифосфатов 50а-е

Соед. химические сдвиги, 5, м.д. константы спин-спино-

вого взаимод., J, Нг

Ра РЗ Рг Ш

50а 43.52Д -20,70 - -1,62ц 9,1 19,8

42,42д -23,34м -8,17д 9.5 24.9

50Ь 42,б1д -21,50 - -6,65д 10,5 17,6

42,48д -23,97м -6,41д П,2 19,4

5оа 43,38д -21,07 - -8,47д 5,1 13,5 ■

42,71д -23,35м -8,64д 3,4 10,1

50е 43,22д -20,58 - ' -7,44д 13,2 17,0

42,59д -23,95м -8,23д 15,0 20,0

Спектры регистрировали в 0,5М ЕВТА в 020 по отношению к 1М н3ро4 (внешний стандарт) в ОгО.

Чтобы исследовать терминирующие свойства синтезированных соединений, были поставлены опыты по элонгации олигонуклеотида, находящегося в комплексе с ДНК фага М13тр10, результаты которых приведены в табл. 9.

Как видно из табл. 9, ни одно из испытанных соединений не являлось субстратом ДНК-полимеразы а из тимуса теленка. В случае обратной транскриггтазы АМУ ситуация была противоположной -эффективными терминаторами оказались все испытанные соединения, причем соотношение концентраций терминатора и природного субстрата, обеспечивающее терминацию биосинтеза, было такое же, как и для аналогов с природной трифосфатной группой. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой I (И), не терминировался 50а, хотя при увеличении концентрации наблюдалось неспецифическое ингибирование. Нуклеотиды 50Ь и 50с1 обладали хорошими терминирующими свойствами по отношению к этому ферменту. Эти соединения хорошо терминировали также синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой р из печени крысы.

Таким образом, и в случае тиопроизводных йШТ наименьшей субстратной избирательностью обладает обратная транскриптаза АМУ -замена кислорода у аР атома на серу не затрудняет узнавания терминирующих аналогов (ЗЫТР этим ферментом". В то же время наибольшую субстратную специфичность проявляет ДНК-полимераза ос.

Таблица 9. Соотношение концентраций терминатора и природного субстрата (моль/моль), необходимое для терминирования синтеза ДНК, катализируемого разными ДНК-полимеразами

ДНК-по- 50а З'-азидо- 50Ь З'-фторо- 50<1 З'-айцно-

лимераза <птр <птр сптр

ки) - - - 10 200-400 30-50

а - _ _ _ 50

В .. 200-500 0,5-1 0,5 5 1

аму 25 20-50 20 20 10 10

3.2 Синтез аР-алкилированных и -арилированных нуклеозцд- 5'-трифосфатов и изучение их субстратных свойств в реакциях с ДНК-полимеразами

В 1990 году было показано, что тимидин-5'-а-метилфосфонил-р,т-дифосфат является субстратом ТйТ (Ш^сЫ й а1., 199Э). Этот фермент, хотя и с низкой эффективностью, катализировал образование олигонуклеотидной цепи с несколькими встроенными метилированными межнуклеотидными фрагментами. Нам представлялось интересным изучить сврйства этой группы соединений по отношению к матричным ДНК-полимеразам. Изучение молекулярного механизма их действия в модельных ферментных системах имело смысл в связи с тем, что ряд нуклеозид-5-фосфонатов проявил высокую активность в подавлении НГУ в клеточных культурах (глава 2). Один из возможных механизмов действия 5-фосфонатов заключается в их превращении -в соответствующие Р ,у -дифосфатные производные, которые либо терминируют элонгацию цепи ДНК, либо ингибиторуют ДНК-полимеразу, либо происходят оба процесса. Чтобы изучить свойства фосфонилдифосфатных аналогов ¿ТИТР, мы синтезировали ряд а -метил-, а -фенил- и а -децил-р,у -дифосфатов 2'-дезокситимидина и ИЛ- (схема 8).

Фосфонаты 52а, 53, 54а, 55 и 56а были получены в результате конденсации ИТ или 48 с соответствующей фосфоновой кислотой в присутствии ТРБС1 в пиридине. Фосфонатные производные были выделены с помощью хроматографии на ОЕАЕ-носителе с выходом 6070%. После удаления З'-О-ацетильной группы водным аммиаком фосфонаты 52й, 54А и 56Ь были очищены обрашеннофазовой хроматографией: низкого давления на колонке с сгликонизироваиным

силикагелем ЦСЬгоргер С-18. Соединения 52Ь, 53, 54Ь, 55 и 56Ь обрабатывали СБ1 и полученные имидазолиды конденсировали с пирофосфатом. Трифосфатные аналоги 57-61 выделяли на ОЕАЕ-Тоуореаг1 в градиенте ЛЩНСОз-буфера. Для уменьшения времени элюции в случае соединений 59-61 добавляли к элюату 10% метанола. Трифосфаты дополнительно очищали на колонке с ЫСИгоргер С-18 в воде (57, 58) или 5% метаноле (59-61). Некоторые спектральные характеристики полученных соединений приведены в табл. 10.

Схема 8

но~\0 X

риг х=р

48 Х=ОАс

ТЪу

О

но-4-

? ? я

НОР-О-Р-О-Р-О

А

Н ОН я

ТЪу

57-61

52а Л=СН3 Х=ОАс 52Ь Л=СН3 Х=ОН 53 Я=СН3 Х=Р 54а Я=С6Н5 Х=ОАс 54Ь Л=С6Н5 Х-ОН 55 Я=С6Н5 Х=Р 56аИ=С1оН21 Х=ОАс 56ЬЯ=С10Н11 Х=ОН

57 Л=СН3

58 Я=СН3

59 Я=С6Н5.

60 Я=С6Н5

Х=ОН Х=Р Х=ОН. Х=Р

61 И=С10Н21 Х-ОН

РЬТ РЬТ 48 48 -

53^58

55-

60

. 1 - метил-, фенил- или

децилфосфоновая кислота, ТРБС!, пиридин

' г9_ 41

¿¿а—. 3 н - СБ1, Р207Н4- 2 ВичН, ОМР

54Ь-^—59 ... _„ ш - МН4ОН

48 56а^»56Ь—«-61

• 54а

111

Выход продуктов реакции определяли, измеряя оптическую плотность растворов после обращеннофазовой хроматографии и принимая коэффициент экстинкции тимидиновых производных и равным 9800. Средний выход составил 25% для 57-58 и 18-20% для 59-61.

Табл. 10. Данные 31Р-ЯМР и РАВ-масс спектров а-фосфонил-р.у-дифосфатов

Соед. химические сдвига, 6 мл. константы спин-спинового взаимодействия, .1, Нг РАВ-масс, т/г

<х-Р е-р 7-Р а-3 Р-Т

57 25,18д 25,08д -22,96м -23,77м -9,12а -9,77А , 21,31 22,32 19,76 19,25 481(М+Н)+ 498(М+Н+

58 25,55д 25,34д -22,98м . -7,57д -7,61д 21,87 22,02 20,66 20,85 483(М+Н)+ 500(М+Н +КН,)+

59 12,75д 12,70д -22,50м -22,20м -9,50шс -8,50шс 24,10 22,70 543(М+Н)+ 560(М+Н

60 27,80д 27,40д -26,03м 13,Обще 25,00 25,50 545(М+1)+ 562(М+1+ МН,)+

61 ПДЗд 10,93д -23,65м 10,18шс 23,90 23,50 - 607(М+1)+ 624(М+1+

65 26,90д -26,20т -7,5шс 20,50 20,50' 506(М+1)+ 523(М+1+ >1Н,)+

66 26,20д 26,10д -22,80м -8,9шс -9,1шс 21,20 19,00 20,10 20,10 595(М+1)+ 612(М+1+

Спектры регистрировали в Б20 относительно 85% Нз?04 (внешний стандарт) в 020.

Следует отметить низкую стабильность полученных соединений. Частичное отщепление пирофосфата (до 5%) наблюдалось уже в процессе хроматографии. При хранении сухих веществ или 10 мМ растворов в течение недели при -20°С происходило образование от 10% до 17% соответствующих фосфонатов 52Ь, 53, 54Ь, 55 и 56Ь. Стабильность уменьшалась в зависимости от заместителя при атоме фосфора следующим образом: СНз>С^Н5>СюН21- Наличие небольших количеств

монофосфорного производного в препарате трифосфата, однако, не оказывает влияния на синтез ДНК в модельных системах с ДНК-полимеразами. Истинную концентрацию трифосфатов 57-61 в растворах определяли с помощью ВЭЖХ непосредственно перед экспериментами с ферментами.

Повторяющиеся этимологические опыты и нестабильность трифосфатных аналогов требовали приготовления новых образцов. Описанный выше способ синтеза трудоемок, так как включает в себя несколько разделений с помощью колоночной хроматографии. Нами был предложен альтернативный способ синтеза трифосфата 57, а таюке 3'-азидо-3'-дезоксити?.пщин-5'-а-метилфосфонил-р,у-Дифосфата 66 (схема 9).

Сшггез был осуществлен двумя способами. Подход А аналогичен синтезу, описанному ранее для природных dNTP (Ludwig, 1981). Тимидин или FLT обрабатывали хлорангидридом метилфосфоновой кислоты в триалкилфосфате, полученные нуклеотиды 63а,Ь без выделения конденсировали с пирофосфатом. При этом около 30% нуклеотида 63а,Ь не вступало в реакцию, что позволяло получить трифосфаты 57 и 65 с выходом не более 25%. Подход В аналогичен способу получения а -тлотрифосфатов, описанному выше. Фосфонипирование AZT, успешно осуществленное с помощью метилфосфоно-й/с-(1,2,4-триазолида), полученного из хлорангидрида- метилфосфоновой кислоты и триазола, -приводило к . образованию триазольного производного 64а. Для фосфонилирования тимидина требовалось защитить гидроксильную группу в З'-положении. Защитные группы ацильного типа оказались неподходящими, т.к. в процессе дезацилирования трифосфатное производное полностью разрушалось. Введение в З'-положение диметокситритильной группы сделало 5'-гидроксильную группу инертной в реакции фосфонилирования. Наиболее удачной в данном случае оказалась трет.-бутиддиметилсилильная защитная группа. Обработка 3-трет.-бутилдиметилсилильного производного тимидина 62 метилфосфоно-<жс-(1,2,4-триззалидом) приводит к нуклеотиду 64Ь. Нуклеотиды 64a,b без выделения обрабатывали пирофосфатом, образовавшиеся трифосфатные производные 65 и 66 выделяли анионообменной хроматографией на DEAE-Toyopead. Трет.-бугилдимепшсилильную защиту удаляли п--толуолсульфокислотой (TsOH) в водном 'ацетонитрилс и получали трифосфат 57. Подход В позволил синтезировать соединения 65 и 57 с выходами около 36%.

Схема 9

в

а-?-

сн

63а x-N,

,._ ТЬу

гр

63Ь х-он

9 И А

НОР-О-Р-О-Р-О

¿н он сн3

I СН,Р(0)С12> (ЕЮ)3РО Щ. Р207Н4- 2 БизЫ, БМР

лгт х-^

„п_ ТЬу

пи ко I тимидик х-он

\_/ 62 Х-ОБ;(СНз)2С(СНЗ)З

v

В Г"

9

ТЬу

ТЬу

Т11-Р-

¿н

64а

64Ь х-оа(сн3)2с(сн3)3

65 х-к3

66 Х-05(СН3)2С(СН3)3 ■ 57 х-он

и. СН3Р(0)С12, триазол, СН3СЫ, Е^ ¡v. Т50Н, СН3СК, Ы20 .

Наши попытки получить индивидуальные Бр и Яр стереоизомеры 57, 53, 65 и 66 путем разделения смеси ионообменной или обращеннофазовой ВЭЖХ не привели к желаемым результатам. Однако для соединений 59-61, имеющих большие гидрофобные заместители при атоме фосфора, такое разделение оказалось возможным. Так, диастереомерная смесь 59 была разделена препаративной обращеннофазовой ВЭЖХ в 0,05М КН2Р04-буфере. Профили ВЭЖХ до и после препаративного разделения представлены на рис 1. В Ш-ЯМР спектре соединения 59а, характеризующегося меньшим временем удерживания, наблюдался сдвиг сигналов протонов тимина и Н-Г в сильное поле по сравнению с сигналами изомера 59в (рис 1). Отнесения абсолютной конфигурации диастереомеров 59а и 59Ь не проводили.

Диастереомерные смеси 57-58, 60-61 и индивидуальные изомеры 59а и 59Ь были изучены в модельной системе биосинтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразами. Были использованы Т<1Т, обратные

транскриптазы AMV и HIV, ДНК-полимеразы I (Kf), а и ß из плаценты человека, CMV, HSV. Результаты испытаний приведены в табл. 11.

Из табл. 11 видно, что ДНК-полимеразы а , CMV и HSV не включают нуклеозидфосфонатный остаток в растущую цепь ДНК, в то время как обратные транскриптазы и TdT способны катализировать образование, фосфонодиэфирной связи. Только диастереомер с меньшим временем удерживания является субстратом указанных выше ДНК-полимераз.

Рис. 1. ВЭЖХ анализ смеси стереоизомерных трифосфатов 59 и индивидуальных изомеров 59а и 59Ь после препаративной ВЭЖХ, а также данные их 1Н-ЯМР спектров

1Н-ЯМР, хим.сдвнг, 5 , м.д. Н-б СН3 Н-1'

59

12.1

7,35д 1,58д 6,18т

7,43д 1,77а 6,22т (DjO, внутренний стандарт -гексаметилдисилоксан) 5 10 15 время (мин)

Пик 12,1 мин соответствует времени удерживания фосфоната 52Ь. Условия препаративного разделения: колонка Silasorb RP-18 (10 х 250 мм, 12 ц), скорость потока 5 мл/мин, линейный градиент ch3cn в 0,05 М КН2РО4 (0-35%, 25 мин).

Таким образом, нуклеозвд-5'-фосфошшшфосфаты являются субстратами некоторых ДНК-полимераз, в том числе обратной транскриптазы HIV. Следовательно, механизм действия фосфонатов нуклеозидов, основанный на их превращении в соответствующие трифосфатные аналоги и включении нуклеозидфосфонатного звена в цепь ДНК, может рассматриваться как вполне вероятный.

Табл. 11. Субстратные свойства трифосфатных аналогов 57-61.

фермент соединение

57 58 59а 59Ь 60 г 61

ККИ) + + _ _ -

а - - _ _ _

Р + + + _ + +

СМУ _ _ _ -

НБУ _ _ - -

Т<ГГ + л. + - ■ + +

АМУ + + + _ + +

Н1У + + + - + +

Полученные нами данные о . субстратных свойствах метилфосфонилдифосфата 57 были использованы для катализируемого ДНК-пояимеразой I синтеза 167-членного олигонуклеотида, содержащего от 1 до 42 мегилфосфонатных звеньев (Бшеуа е1 я1., 1993).

Совокупность данных, полученных нами и другими авторами (ЕсЗвМет, 1983; КёисЫ е1 а1., 1990; Бепеуа е1 а1., 1993; Тотагг е1 а1., 1992) об использовании аР-модифицированных <ЮТР. как субстратов ДНК-псшимераз, позволяет сделать следующие выводы:

- ряд , ДНК-полимераз способны включать в. цепь. ДНК ортатки нуклеозидфосфонатов и, таким образом, катализировать образование олигонуклеотидов с не имеющими заряда межнуклеотвдными фрагментами.

- ДНК-полимераза В и обратные транскрттгазы наименее чувствительны к замещениям по атому фосфора в молекуле субстрата, в то время как ДНК-полимераза а является более избирательным ферментом,

- ДНК-полимеразы могут использовать только один из диастереомеров модифицированных по аР-атому субстратов.

4. Огсрсонапразленный синтез и субстратные свойства четырех изомеров дифосфорилфосфоната карбоцихличсского аналога 2',3'-дидезокси-2'гЗ'-дидегидро-5,-норадспозина

6 первой главе была рассмотрена роль строения и конформации сахарного остатка (ЮТР в связывании субстрата с комплексом праймер-матрица-фермент. Карбоциклические аналоги нуклеозидов представляют

особый интерес из-за метаболической стабильности in vivo (Borthwick et al., 1992) и высокой противовирусной активности рада соединений этого типа. Большинство нуклеозидов, обладающих противовирусной активностью, имеет P-D-конфигурацию углеводной части. Например, соединения 67 и d4T имеют сродство к обратной транскрипгазе HIV в 50 раз выше, чем энантиомеры с L-конфигурацией сахарного остатка (Van Draanen et al., 1992). Среди карбоцихлических нуклеозидов противовирусную активность также проявляли соединения, абсолютная конфигурация цикяопентанового остатка которых соответствовала конфигурации природных p-D-нуклеозидов (Vince et al., 1990). Недавно, однако, было показано, что соединение 68 является более слабым ингибитором обратной транскриптазы HIV, чем его энантиомер ent-68 (Merlo et al., 1994). Нам казалось интересным изучить различия в субстратных свойствах всех четырех возможных стереоизомерных соединений этого типа.

Я

нЗР2°7-РСН20 _ Thy Н4Р3О10_ „

ОН

ТУ

67 d4T

- я . . и

Н3Р207—РСН20 . Gua Gua ОСН2Р—07Р2Н'3

ОН

ОН

68 ent-68

К началу нашего исследования сочетанием химических и ферментативных методов были получены несколько сгереохимически чистых карбоциклических нуклеозидов (Borthwick et al., 1992, Merlo et al., 1993). Мы разработали способ получения всех четырех изомеров (двух пар энангиомеров) карбоциклических аналогов 2',3,-дидезокси-2',3'-дидегидро-5-нораденозина, используя единственное ключевое соединение моноацетат циклопентена 69. Стереохимически чистые нуклеозидные аналоги были затем превращены в соответствующие трифосфатные производные и испытаны в качестве субстратов матричного фермента -обратной транскриптазы HIV и нематричного фермента - TdT.

4.1. Синтез четырех стереоизомеров карбоциклического аналога 2',3-дидезокси^З'-дидегидро-У-нораденозина

Синтез проводили по схеме 10. В качестве ключевого соединения был использован моноацетат 69, полученный д-ром Ф.Тайлом путем транеэтерифкхации дао-циклЬпент-2-ен-1,4-диала под действием панкреатиновой липазы с оптической чистотой более 99,5% (Theil et al., 1991). Замещение гидроксильной группы в аллильном положении без изменения конфигурации проводили через стадию образования и-аллильного палладиевого помежуточного соединения (Trost et aL, 19S8). Атака нуклеофила в анти-положение по отношению к палладию приводит к соединению с дас-расположением нуклеофильного и присутствовавшего ранее заместителя.

Реакция моноацетата 69 со слабым нуклеофилом - натриевой солью 6-хлорпурина - в присутствии тетракис(трифенилфосфин)палладия приводила к карбоциклу 70а с сохранением конфигурации при углеродном атоме, связанном с ацетильной группой. Взаимодействие 69 с 6-хлорпурином в "условиях реакции Мицунобу протекало с обращением конфигурации у углеродного атома, соседнего с гцдроксилом и приводило к карбоциклу 71а. После аммонолиза были получены аналоги зденозина 70Ь и 7 lb. Нуклеозиды выделяли с помощью двукратной колоночной хроматографии на сияикагеле в системах хлороформ-метанол (97:3), а затем в водном этил ацетате.

Чтобы синтезировать соединение ent-70b, мы использовали различную реакционную способность уходящих групп в аллильном положении в ходе реакции замещения, катализируемой Pd(0). Ранее было установлено на ряде примеров, что активность уходящих трупп убывает в .ряду. OPO(OEt)2>OAc>OH (Taginawa et al., 1982; Mitsunobu, 1991). Превращение моноацетата 69 в диэтилфосфат 72 приводит х изменению направления реакции, катализируемой Pd(0). Взаимодействие 72 с натриевой солью 6-хлорпурина в присутствии палладиевого катализатора приводило к замещению фосфатной группы без изменения конфигурации при углеродном атоме с образованием ацетата 73. Мы не наблюдали образования каких-либо побочных продуктов, связанных с реакцией по ацетильной группе. Аммонолиз 73 приводил к аденозиновому производному ent-70b. Защита свободной гидроксильной группы 69 трет,-бутилдимстилсилильной группой с последующим дезацетилированием позволила получить циклопентен 74 и изменить, таким образом, место

атаки нуклеофила в ходе реакции Мицунобу. Из 74 в результате реакции Мицунобу был получен карбоциклический нуклеозид 75, деблокирование и аммонолиз которого привели к аденозиновому аналогу еги-71Ь.

Схема 10

/ он

то» х=а 70Ъ х=ин2-

13

ОРО(ОЕ1)2

г яо

ХУ

\=/ 73 Х=а Л=Ас_

I—еш-70«х=-а я=н ¡¡; " I»- еп1-70ЪХ*МН2

69

6с"

оя

¡¡¡I— 7и х=а к=Ас

V 71Ь Х-ИНз я=н

<У

С.П1-69

ОН I— 75 х=а К^ВиМс^Г

V! «111-71» Х=а К.=Ас —, ... V- еп1-71Ь Х=Ш2 Я=Н 111

1: 6-хлорпурин, ИаН, Рс1(РР11з)4, РРЬз, тетрагидрофуран и: б-хлорпурин, РРЬз, диэтилазодикарбоксилат, тетрагидрофуран ш: ЫН3/СН3ОН; ¡V: а-ТВАБ Ь. ЫНз/СН3ОН V: (ЕЮ)2РОС1, имидазол, ацетонитрил; ук а. 1-ВиМе251С1, имидазол Ь. ИНз/СНзОН

Структура соединений епЬ70Ь и еп!-71Ь была подтверждена встречным синтезом из энантиомерного циклопентена ея1-69. Соединение

яи-69 было получено ферментативным гидролизом соответствующего диацетата с оптической чистотой более 99.5% и также любезно предоставлено д-ром Ф.Тайлом (ТЬеИ « аЬ, 1991). Введение ет-69 в реакцию Мицунобу' с последующим аммонолизом приводило к нуклеозидным аналогам еп1.-71а и ет-71Ь. Реакция яй-69 с натриевой солью 6-хлорпурина при катализе Р<1(0) позволила получшъ еп!-70а и после аммонолиза сп1-70Ь. Образцы соединений сп1-70Ь и сп£-71Ь, полученные из 69, были идентичны образцам, полученным из еп!-69.

Таким образом, синтез кабоцюслических нуклеозидных аналогов 70Ь и 71Ь, а также их энантиомеров епЬ70Ь и спЬ-71Ь из одного энантиомерно чистого ключевого соединения .демонстрирует универсальность нашей схемы, которая позволяет, изменяя функциональные группы циклопентена, получить все четыре возможных стереоизомера (две пары энантиомеров). В качестве исходного соединения может быть использован не только циклопентен 69, но и его энантиомер епМ>9, что подтверждено синтезом еЩ-70Ь и еп1-71Ь.

Структура полученных соединений подтверждена спектрами 1Н- и 13С-ЯМР. Выхода целевых продуктов и их некоторые физико-химические характеристики приведены в табл. 12.

Таблица 12. Выходы и физико-химические характеристики карбоциклических аналогов нораденозина

70b ent-70b 71Ь eot-71b

выход в рас- 42 25 (45) 41 25 (43)

чете на 69, %

(на ent-69, %)

Тпл, "С 196-197 192-193 208-209 207-2С9

(ацетон) (ацетон) (этанол) (этанол)

lain20, - 110,0 +122,0 -208,8 +222,1

метанол (с 0,56) (с 0,56) (с 0,85) (с 0,59)

иУ(метанол), 261,4 (13 300) 260,4 (14 400)

X тах(нм) (е ) 212,2 (14 800) 212,6 (14 200)

Масс-спектр 217 (М+), 200 (М+-ОН), 218 (М++1), 217 (М+),

m/z 135 (Ads+) 200 (М+-ОН), 136 (Ade++I)

Для изучения субстратных свойств карбоциклических аналогов 70Ь, 71Ь, сп1-70Ъ и сп1-71Ь необходимо было получить их трифосфатные производные. Синтезированные нами соединения не имели первичной

гадрохсильной группы в 5'-положении. Для того чтобы сохранить нзостсричксггь монофосфорных производных карбоциклов по отношению к природным dNMP мы синтезировали фосфонометильные аналоги 70d, 71d, cnt-70d и ent-7Id_ Выбор фосфонометильной группы определялся стабильностью соответствующих производных, а также тем, что днфосфорилфосфонаты "арбоциклических 5'-норнуклеозидов оказались хорошими ингибиторами обратной транскригггазы HIV (Сое et al., 1992).

Введение фосфонометильной группы требует защиты амино-группы аденина, в противном случае образуется значительное количество бис-N.O-алкилированных производных (Jahne et aL, 1992). Действительно, обработка 70b диметиловым эфиром п-толуолсульфонилоксиметан-фосфоновой кислоты 7б (Holy et al., 1982) дала сложную смесь продуктов, из которой целевое соединение 70d было выделено с выходом 16%. Мы воспользовались моноэтиловым эфиром п-толуолсульфонилоксиметан-сульфоновой кислоты 77 (Ясько и соавт., 1994), что позволило избежать защиты амино-группы аденина. ;

(CH30)2P(0)CH20Ts (C2H50)(H0)P(0)CH20Ts

76: 77

Схема 11

Ade . с ' Ade

^ ff

НО ^^ NaH, DMF H0-P-CH2-0

: I7 ent-71c

ent-71b OC2H5

(CH3)3SiBr * ~ Ade

HO— P—1CH2-0

HO ent-71d

Аналогично:

71b-► 71c ___ 71d

Фосфонилирование аналогов с транс- расположением . аденина и гадроксильной группы представлено на схеме И. Обработка натриевой соли нуклеозида ет-71Ь сульфонатом 77 приводила к 4'-алкилироЕанному продукту еп1-71с. После удаления защитной грулпы дейстзнем триметилбромсилана в БМР фосфонат еп1-71(1 был выделен анионообменной хроматограф«! с выходом 40%. Аналогичным образом был получен 71й из 71Ь.

Схема 12

NH

Я аДск^Дл fl

«. Г.МР А* ;СН2Т-ОВ1 ¿н ЦА»* ОСН2Р-OEt

70b -YY ОН + V/ 0Н

^ 70с 78 — .

1

(CH3)3SiBr

9

Ade ОСН2Р—ОН ОН 70d '

лис VI

Аналогично: ent-70b-cnt-70c + ent-78

1

cnt-70d

Алкилирование дис-нуклеозвдов 70b и ent-70b в тех же условиях протекало иначе. После обработки натриевой соли нуклеозида 70Ь сульфонатом 77 была получена смесь моно- 70с и бис- 78 алкилированных продуктов, которые были разделены ионообменной хроматографией. Деблокирование 70с привело к целевом!' соединению 70d с выходом 30%, считая на 70Ь. Наличие двух фрсфонатных групп в молекуле 78 подтверждалось FAB-масс спектром - m/z 461 (М+Н)+. В 'Н-ЯМР спектре наблюдался слабопольный сдвиг сигнала Н-2 на 0,15 мд. по

сравнению с сигналами Н-2 соединений 70Ь-<1, в -"Р-ЯМР спектре наблюдали сигналы двух атомов фосфора. Соединение 73 было получено с выходом 13%, считая на 70Ь. Некоторые спектральные данные для 78 в сравнении с целевым продуктом 70(1 приведены в табл. 13.

Схема 13

70d

— NMe,

<ХЗ

XI

П /=sN

OCHjP—N^Jj

ОН

i

NHi

Чг^

70e

fl fl fl 0CH->P-0-P-0-P-0H

'I

-OH

I

OH

.¿H . .

R'=H Y=H

R—Ade Y=H

R,=sH

Y=0CH2P309H4

Фосфонаты 70d, ent-70d, 71 d и ent-71d были превращены в соответствующие дифосфорилфосфонатные производные 70е, cnt-70e, 71е и ent-71e через стадию образования активных имидазольных производных (схема 13). Для улучшения растворимости фосфонатов 70d, ent-70d, 71d и ent-71d в DMF мы использовали соответствующие диметиламино-

cnt-70e

71е

ent-71e

R=Ade

Х=0СН2Р309Н4 R=H .

Х=0СН2Р309Н4

R=Ade Х=Н

метиленовые производные. Защитная группа с количественным выходом удалялась действием ИН^Н.

Таблица 13. Спектральные характеристики фосфонатов 78 и 70d

Соед. УФ (Н20,рН7) X шах, пш FAB-масс m/z (М++1) Щ-ЯМР (D20), 5 MJJ. Н-2 Н-8 31р_ямр внешн.ст,- 85% Н,Р04

70d 262.5 312 8,18с 8,16с 16,62с

78 270,7 461 8,33с 8,18с 18,94с 18,59с

Трифосфатные аналоги были выделены анионосбменной хроматографией и очищены обращеннофазовон хроматографией низкого давления. Все соединения были гомогенны по ВЭЖХ и их струкг^-ра подтверждена УФ-, масс- и 31Р-ЯМР спектрами.

Таблица 14. Кинетические константы реакции присоединения субстратов 70е, еп1-70е к праймеру, катализируемой обратной транскриптазой АМУ

complex а complex Ъ

Кт,цМ Ушах/ Утяу(г1АТР1 Кт,цМ ^тах/ Утду^АТР-»

ent-70e 0,03±0.004 0,72 0,028±0.003 0,63

70с 0,019±0.002 0,77 0,0076±0.0 04 0,77

ddATP _ _ 0,21±0.05 0.S3

dATP 1,72+0.14 1,00 0,034±0.003 1,00

Использованные праймер-матричные комплексы : а: ¿(ССаТСАСТССТССААСАТПТССТСССССТ...)

[5-.32р]с)((5АсзтТСТААААСС) Ь: г(С0А6АСССААиАСССиСАС0АССиАА..)

[5'-32р]а(АТСССАСТССТСС)

Синтезированные соединения были изучены в системе биосинтеза ДНК, катализируемого ТсГГ и обратными транскриптазами АМУ и КГ/ с использованием ДНК- и РНК-матриц. /£ггс-нуклеотиды 70с и сги-70е проявили себя как хорошие терминирующие. субстраты Н1У и АМУ

обратных транскрюгтаз, в то ьрсмя как тртл/о-нуклеотиды 71е и cnt-71c этими ферментами не узнавались. Кинетические параметры субстратов 70е и ent-7Crt в реакции удлинения праймера в присутствии матричных ДНК-полимераз приведены в табл. 14 и 15. Все испытанные соединения узнаются ТиТ и удлиняют цепь праймера. В табл. 16 приведены кинетические константы синтезированных соединений в реакции удлинения праймера под действием TdT.

Таблица 15. Кинетические константы реакции присоединения субстратов 70е, еп1-70е к праймеру на матрице РНК, катализируемой обратными транскрилтазами АМ\' и НГУ

AMY HIV

Km,pM ^тах/ VmnvMATPI Кт,дМ Углах/ VmayidATP>

ent-70e 0,069±0.05 1,38 0,021+0.002 1,26

70е 0,014+0.001 1,51 0,0034±0.001 1,52 •

ddATP 0,19±0.03 1,00 0,19+0.04 1,00

Праймер-матричный комплекс: r(CGAGAGGGAAUACGCUGAGGACGUAA) [5'-32p]d(GCTCTCCCTTATGCGACTCC)

Таблица 16. Кинетические константы реакции присоединения субстратов 70е, ent-70e, 71е и ent-71e к олитонуклеотиду, катализируемой TdT

ent-70e 70e ent-71e 71c

Km, uM 3.1+0.3 5.0+0.2 - 10.1+0.4 5.2±0.2

V /V 'max.' "max (ent-70e) 1.00 0.88 0.45 0.76

Тетрадекаолигонуклеотид: [5,-32р]с)(ССТСТСССТТАТ6С0АСТСС)

Анализируя рассмотренные в этой главе и в главе 1 результаты, можно предположить, что роль углеводного ( или выполняющего его роль) фрагмента dNTP в процессе биосинтеза цепи ДНК заключается в обеспечении правильного взаимного расположения гетероциклического основания и трифосфатного остатка.

Было выполнено компьютерное моделирование молекул диастереомеров cnt-70c и 71е, являющихся аналогами p-D- и a-D-нораденозина (Macromodel V3.5X Silicon Graphics). Расчеты показали, что цис- и транс- изомеры, находящиеся в одинаковой экзо-O-í-конформации. различаются только расстоянием между a -Р и N-7 атомами. Для унс-изомера cnt-70e это расстояние равно 6,48 А, что обеспечивает правильное расположение трифосфатного остатка после образования уотсон-криковской пары между нуклеиновьми основаниями субстрата и матрицы. Для транс-изомера 71с это расстояние увеличивается до 7,06 А и не позволяет образоваться фосфонодиэфирной связи. Нематричный фермент TdT не предполагает образование уотсон-крикозской пары; для этого фермента, по видимому, не важно растояние между а -Р и N-7 атомами. Поэтому как ии>, так и транс- изомеры явлются субстратами TdT.

Высокая субстратная активность цис-нзомеров 70е и cnt-70e подтверждает сделанное в главе 1 предположение о том, что аналоги dNTP с уплощенным углеводным (или его заменяющим) фрагментом проявляют хорошие субстратные свойства, поскольку моделируют переходное состояние dNTP в комплексе фермент-матрица-субстрат.

Таким • образом, карбоцикпические аналоги 5'-нораденозина цио-ряда показали высокое сродство к обратной транскриптазе H1V. Они обладают энзиматически негидролизусмыми связями между гетероциклический основанием, циклопентеновым 'кольцом и фосфорсодержащим остатком, что позволяет рассматривать их как потенциальные ингибиторы продукции HIV. Из приведенных данных следует, что соединение 70е, яляющееся аналогом нуклеотида p-L-ряда, проявляет лучшие субстратные свойства, чем dATP и ddATP. Его энантиомер ent-70e, моделирующий p-D-ряд, проявляет субстратные свойства, близкие dATP и ddATP. Аналогичные результаты были получены независимо для гуанозиновых производных 68 и ent-68 (Merlo et al., 1994).

Соединения транс-ряда являются селективными ингибиторами TdT. Биологическая функция этого фермента в настоящее время изучена мало. Известно, что уровень TdT резко возрастает в лейкоцитах больных лейкозом (Spigehnan et al, 1988). Селективные ингибиторы TdT могут быть полезны при изучении молекулярно-биологических аспектов этой болезни.

выводы

1. Сформулирована система представлений о специфичности различных ДНК-полимераз по отношению к ¿ЫТР, модифицированным по углеводному и/или трифосфатному остаткам. Разрабо-танч методы синтеза и получен набор модифицированных <ШТР, обеспечивший выявление следующих закономерностей:

а) А].'."лсги (ЮТ"Р с уплощенной структурой углеводного остатка или фрагмента, ;го имитирующего, обладают высоким сродством к ряду ДНК-полимераз, по-видимому, моделируя структуру природного ¿ИГР в хс-.гплехсе [ДНК-пс)лимераза + субстрат + праймер-матрица]. Разработаны эффективные способы синтеза и очистки тхсих аналогов <1№ГР.

б) Для обратных транскриптаз ретровирусов существенно только взаимное расположение трифосфатного остатка и гетероциклического основания в молекуле аналога (ЮТР. В то же время для независимой от матрицы ТсЗТ взаимное расположение нуклеинового основания и трифосфатного остатка не является определяющим, что позволило впервые выявить высокоселективные ингибиторы этого фермента. Получение этих данных стало возможным после того, как был разработан метод синтеза индивидуальных стереомеров 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидро-5'-нораденозина, исходя из одного ключевого соединения.

в) В молекуле сНЧТР шдроксильная группа при аР-атоме не является необходимой для протекания реакции присоединения нуклео-тидного остатка к цепи ДНК .при катализе некоторыми ДНК-полимеразами. Таким образом, ' эти ферменты способны катализировать образование цепей ДНК с неионными фрагментами, однако обладают высокой стереоспецифичностью по отношению к изомерам по аР-атому. Для этого исследования разработаны методы

. синтеза аР-алкилированных и арилированных аналогов (ЮТР. Предложен быстрый и эффективный способ получения а-метилфосфонил-р,у-дифосфата нуклеозидов без выделения промежуточных соединений. Впервые разделена диастереомерная смесь и получены индивидуальные изомеры 5'-а-фенилфосфошш-' Р,у-дифосфата 3'-фтор-2',3'-дидезокситимшшна.

2. На основании полученных данных о низкой субстратной специфичности обратной транскриптазы HIV предложено использовать фосфорилированные нуклеозиды с модификациями одновременно по фосфатному и углеводному остаткам как блокаторы репродукции HIV. Для этого синтезированы 5-Н-фосфонаты, 5'-фторфосфаты и 5'-фосфонаты модифицированных нуклеозидов, эффективно подавляющие репродукцию HIV в клеточных культурах. Одно из соединений - З-азидо-2',3'-дидезокситимшшн-5'-Н-фосфонат ("фосфазид") - успешно прошел все доклинические испытания по правилам Фармакологического Комитета РФ, показав активность, сравнимую с прототипом - AZT, при токсичности в 10 раз более низкой. Препарат в настоящее время передан на клинические испытания.

СПИСОК работ, опубликованных по теме диссертации

1. N.Dyatkina,' Sh.Minassian, M.Kukhanova, A.Krayevsky, M. von Janta-Lipinski, Z.Chidgeavadze and R.Beabtalashvilli. Properties of 2',3'-dideoxy-2,3-didehydrothymidine 5'-triphosphate in terminating DNA synthesis catalyzed by several different DNA polymerases. FEBS Letters 1987, v.219, N 1, p.151-155.

2. N.B.Dyatkina, AAArzumanov. Terminating substrates of DNA-polymerases: synthesis and functional study, in Biophosphates and thoir Analogues - Synthesis, Structure, Mcthabolism and Activity, K.S.Bruzik, WJ.Stec (Eds), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1986.

3. А-М-Атражев, Н.БДяткина, ААКраевский, М.К.Куханова, З.Г.Чвджавадзе, Р.Ш.Бибилашвили. Способность З'-замещенных фосфотиоатов нуклеотидов терминировать синтез ДНК, катализируемый разными ДНК-полкмеразами. Биоорган, химия 1987, т. 13, N 8, с. 1045-1052.

4. Н.БДяткина, М. фон Янта-Липкнски, Ш.Х.Минасян, М.К.Куханова, АА-Краевский, З.Г.Чиджавадзе, Р.Ш.Бибилашвили. Новый терминатор биосинтеза ДНК - возможный конформационный аналог субстрата в ДНК-синтезируюшем комплексе. Биоорган, химия 1987, т.13, N 10, с.1366-1374.

5. Л-МАтражев, Н.Е.Дяткина, Т.А-Розовская, Л-ААлександрова З.Г.Чиюкавадзе, М. фон Янта-Липински. Аналоги дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов, модифицированные по основанию и сахарному остатку: субстратные свойства при биоситезе ДНК в бесклеточных системах. Биооргзд. химия 1987, т.13, N 10, с.1375-1381.

6. . N.B.Dyatkira, A.A.Arzumanov. Terminating substrates of DNA-

polymerases: synthesis and functional study. Nucl. Acids Res. Symposium Ser. N 18 1937, p.l 17-120.

7. A.Kraysvsky, M.Kukhanova, A.Atrazhev, N.Dyatkina, A.Papchikhin, Z.Ohidgeavadze and R.BcabeaIashvilli. Selective inhibition of DNA chain elongation catalyzed by DMA polymerases. Nucleosides & Nucleotides 1988, v.7, N S&.6, p.613-617.

8. Н.БДятккна, ЕДАтраххва, ЛАЛлехсанярова, А.А.Краевсхий, М. фен Янта-Липш гски. Синтез новых терминатерных субстратов ДНК-пол^Мьраз - нуклеозид-5-грифосфатов с кодифицированными углеводным остатком. Биосрган. химия 1988, т.14, N б, с.815-819.

9. D.Z.Chinchaladze, D.A.Prangishvilli, AV.Scamrov, R.Sh. Beabealashviffi, N.B.Dyatkina, A.A.Krayevsky. Nucleoside 5'-triphosphates modified at sugar residues as substrates for DNA polymerase from the thermoacidophilic archeabacterium SulfrJcbus Bcidocaldarius. Biochim. Biophys. Acta 1989, v.1008, p.113-115.

10. З.ГЛиджавадзе, Р.Ш.БибилашЕили, Т.А.Розовская, А.М.Атражев, - . Н.Б.Тарусова, Ш.Х.Минасян,. Н.БДяткина, Е.Д,Атражева, М.К.Куханова, А-В.Папчихин, ААЛСраевский. Конформационно ограниченные нуклеозид-5'-трифосфаты как терминаторные субстраты ДНК-полимераз. Мол. Биология 1989, т.23, N 6, с.1732-1742.

11. АА.Хорлин, Н.Б.Тарусова, Н.БДяткина, АА.Краевский, Р.Ш.Бибилашвили, Г.А.Галегов, В.М.Жданов, М.Н.Корнеева, Д.Н.Носик, С.Н.Майорова, В.М.Шобухов. 5'-Фосфонаты 3'-азидо-2',3'-дидезоксинуклеозидов, являющиеся специфическими ингибиторами вируса СПИД в культуре лимфоцитов человека. Авторское свидетельство N 440761 от 29.12.1987; Патент США N 5, 043,437 от 27.08.91; Европейский патент N 0-354-246 от 18.08.90.

12. N.Dyatkina, AArzumanov, N.Tarussova. Synthesis of 5'-H-phosphonates of З'-substituted purine deoxynucleosides. Nucleosides & Nucleotides 1991, v.10, N 1-3, p.731-732.

13. N.Dyatkina, LVictorova, A-Atrazhev, D.Mozzherin, M.Kukhanova. Nucleoside 5'-(a-methylphosplionyl)-p,>'-diphosphates as substrates for DNA polymerases. Nucl. Acids Res., Symp. Ser. N 24 1991, p.238.

14. Г.В.Гурская, А-В.Бочкарев, А.С.Жданов, Н.БДяткина, А.А Краевский. Рентгеноструктурное исследование 2',3'-дидезохси-2',3'-дидегидро-тимидина - терминаторного субстрата ДНК-полимераз с ограниченной конформационной подвижностью. Мол. Биология -1991, т.25, N 2, с.483-491.

15. G.V.Gurskaya, A.V.Bochkarev, A.S.Zdaiiov, N.B.Dyatkina, A.A.Krayevsk>. Tenninating substrates with restricted conformational flexibility studied by-X-ray analysis. Int. J. Pur. & Pyr. Res. 1991, v.l, N 2, p.418-423.

16. Н.БДяткина, Л.С.Викторова, Д.Ю.Мозжерин, А.М.Атражев, С.Г.Розекберг, М.К.Куханова, АА Краевский. Образование фосфонодиэфирных связей, катализируемое ДНК-полимеразами. Мол. Биология 1991, т.25, N 6, с.1638- 1700.

17. Н.Б.Дятюша, М.В. Ясько, АААрзуманов, А.А.Краевский, Ф.М.Семченко, О.Г.Еремин, Б.И.Мартынов. Синтез 5-фторалкилфосфонатов нуклеозидов - соединений с потенциальными противовирусными свойствами. Биоорган, химия 1992, т. 18, N 1,

с. 100-106. -

18. А.А.Арзумаков, Н.БДяткина, М.К.Куханова, А.А.Краевский, Ф.М.Семченко, О.Г.Еремин, Б.И.Мартынов. З'-Фгор-З'-дезокситимидин-5'-фторфосфат - эффективный ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека в клеточных культурах. Биоорган, химия 1993, т.19, N 10, с.978-980.

19. Б^И.Мицнер, М.В.Кочетхова, Д.В.Филипов, А-В.Цытович, Н.БДяткина. Синтез аналогов нуклеозвдов, содержащих цис-2-пентеновый фрагмент, и их трифосфатов. Малекудярн. Биология 1993, т.27, N 1, с.174-184.

20. О.А.Мамаева, ОА.Плясунова, А.Г.Покровский, Н.Б.Дяткина, АА^фзуманос. Изучение анти-НГУ-активности 5-фосфонатов азидотимидина и фтортимидина. Мол. Биология 1994, т.28, NN 1, с. 137-142.

21. LVictorova, N.Dyatkina, D.Mozzherin, A-Atrazhev, A-Krayevsky, M.Kukhanova. Formation of phosphonester bonds catalyzed by DNA polymerase. Nucl. Acids Res., 1992, v.20, N4, p.783-789.

22. J.Matulic-Adamic, I.Rosenberg, Aj\rzumanov, N.Dyatkina, E.Shirokova, AJCrnyevsky, K-Watanabe. A simple multi-gram synthesis of 5'-pliosphorofluoridates' of sugar modified nucleosides. Nucleosides&Nucleotides 1993, v.12, N 10, p.1085-1092.

23. N.Dyatkina, A-Arzumanov, L.Victorova. Nucleoside 5'-a-phosphonyl-P,7-diphosphates: synthecis and functional study. Coll. Czech. Chem. Comm. 1S93, Special Issue v.58, p.91-93.

24. D.Mozzherin, L.Victorova, N.Dyatkina, A-Atrazhev, M.Kukhanova. Testing cf several analogues of 2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates in cell-free Lystemes with DNA-polymerases a and s from human placenta. J. of Chemotcrapy Supplement N 1 1993, p.S03-804.

25. N.Dyatkina, B.Ccstisella, F.Theil, M. von Janta-Lipinski. Syntliesis of the four possible stereoisomic 5'-nor carbocyclic nucleosides from one common enantiomerical-y pure starting materiaL Tetrahedron Letters 1994, v .35, N 13, p. 1961-1964.

26. D.Semizarov, L.Victorova, N.Dyatkina, M. von Janta-Lipinski, A.Krayevsky. Selectivity of DNA polymerases toward a and p nucleotide substrates of D and L series. FEES Letters 1994, v. 354, p.187-190.

27. A-Arzumanov, N.Dyatkina. An alternative route for preparation of a-meihyl-p^-diphosphates of thymidine derivatives. Nucleosides&Nucleotides, 1994, v.13, N5, p.1031-1039. ^

28 N.Dyatkina^ A-Arzumanov, A-Krayevsky, B.O'Hara, Y.Gluzman, P.Baron,' C. MacLow, B.Polsky. Syntliesis and antiviral activity of some fluorinated nucleotide derivatives. Nucleosides&Nucleotides 1994, v.13, N 1-3, p.325-337. . _

30. N.Dyatkina, F.Theil, M. von Janta-Lipinski. Stereocontrolled synthesis of four stereoisomer^ diphosphorylphosphonates of carbocyclic 2',3-dideoxy-2',3'-didehydro-5'-nor-adenosine. Tetrahedron 1995, v.51, N3, p.761-772.

Подписано к печати .199^ р.

Отпечатано на ротапринте в Формат бумаги 30x42/4 Производственном комбинате О бьем ¿р п.л. Литературного фонда Зак. и г\ Тир. 100