Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез терминаторов биосинтеза ДНК с репортерными группами

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Синтез терминаторов биосинтеза ДНК с репортерными группами"

РГ6 од

1 О М'У] рН?0ССИЙСКАЯ академия наук

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи УДК 577.152

ЛУКИН Марк Анатольевич

СИНТЕЗ ТЕРМИНАТОРОВ БИОСИНТЕЗА ДНК С РЕПОРТЕРНЫМИ ГРУППАМИ

03.00.03 — Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель—к. х. н. Александрова Л. А.

МОСКВА 1993

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ нм. В.А.Энгельгардта

На правах рукописи УДК 577.152

ЛУКИН Марк Анатольевич

СИНТЕЗ ТЕРМИНАТОРОВ БИОСИНТЕЗА ДНК С РЕПОРТЁРНЫМИ ГРУППАМИ.

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель к.х.н. Александрова Л.А.

Москва 1993

Работа выполнена в лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток Института молекулярной биологии им. В.А.Эшельгардта Российской академии наук.

Научный руководитель:

Кандидат химических наук ЛА.Александрова.

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук С.Н.Михайлов Кандидат химических наук С.Я.Мельник

Ведущая организация - НПО "Витамин" Защита состоится

2% 1993 года в/тчасов

на заседании специализированного совета Д 002 79.01 в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан " 1993 г.

»

Актуальность работы. В процессе биосинтеза ДНК быстрое и точное воспроизведение генетической информации, закодированной в ДНК, достигается с помощью особых мультифермеитных комплексов. Центральное место среди ферментов биосинтеза ДНК занимают ДНК-по-лимеразы, осуществляющие матрично-зависимую полимеризацию ДНК из предшественников - 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-тр1!фосфа-тов (dNTP). Поэтому при изучении механизмов действия указанного типа ферментов важную роль играют результаты, полученные с использованием аналогов субстратов этих ферментов - модифицированных dNTP. Среди этих веществ аналоги, способные селективно терминировать элонгацию ДНК (терминаторы), осуществляемую отдельными ферментами, представляют особы/i интерес как потому, что позволяют получить ценную информацию об особенностях действия ДНК-полкиераз, так и потому, что они могут быть использованы для создания различных прикладных генноинженерных методик. Цель работы. 1. Исследование возможности создания терминаторов пуринового ряда на основе 2\3'-дидезокси-2',3'-дидегидро-7-деазааде-нозина (d4Tu>. 2. Синтез ряда аналогов З'-дезокси-З'-ацетамидотими-дин 5'-трифосфата с различными ацильными заместителями для изучения возможности использования этих соединений в качестве терминаторов. 3. Синтез производных 2\3'-дидезокси- и 2'-дезоксиури-дин-5'-трифосфатов, несущих в положении 5 агликона различные репортерные группы.

Научная новизна. В настоящей работе осуществлен синтез 7-деазапу-риновых аналогов АТР. На основании кинетических исследований реакции кислотного гидролизз d/Ги оценено стабилизирующее влияние замены атома N-7 метанной группировкой на устойчивость гликозид-ной связи в этом нухлеозвде. Предложено возможное объяснение обнаруженного эффекта. Осуществлен синтез ряда, З'-дезокси-З'-ацил-амидотимшшн 5'-трифосфатов. Показано, что все соединения этого ряда не обладают терминирующей активностью. Зарегистрировано образование 2',3'-дидезокси-2',3,-дйдепмротамидин-5'-тряфосфзта как побочного продукта реакции восстановлении З'-дезоксн-З'-азидотимн« дин-5'-трифосфатз. Синтезирован ряд флуоресцентно меченных аналогов 2\3'-дндезо1ссн- и 2'-дезокси-5-(3-аминопропенил)уридии-5'-тр!гфосфата.

Практическая ценность. Подученные а работе 7-деазаа^алоги АТР являются сильными терминаторами многих ДНК-полимераз и могут

быть использованы для изучения различных аспектов репликации ДНК. Флуоресцентные производные используются для введения флуоресцентной метки в ДНК, в частности, в методе определении первичной структуры ДНК гибридизацией с олнгонуклеотидными зондами на матрице (SHOM). В ходе работы, был разработан ряд удобных экспериментальных методик для синтеза и выделения нуклеозидов и нуклеозид-5'-трифосфатов.

Публикации. По материалам работы опубликовано 4 статьи. Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Ш рабочем совещании по изучению ДНК-полимераз (Пушино, 1990), на Восьмом международном симпозиуме по химии компонентов нуклеиновых кислот (Bechyiie castle, Czechoslovakia, 1990), нз международных симпозиумах: "Synthetic oligonucleotides: problems and frontiers of practical application" (Москва, 1991) и "Modern enzymology: problems and trends" {Санкт-Петербург, 1992).

Объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и содержит 2Д- схему и таблиц. Она

состоит из введения, литературного обзора Тликозидная снизь в нуклеозидах. Устойчивость и механизмы гидролиза", обсуждении результатов, экспериментальной части, приложения, выводов и списка цитированной литературы < J ^^-ссылок на литературные источники). ' _ .

Содержание работы

/. Синтез производных пуриновых нуыеомдтрифосфитов со стабилизированной гчикошдной связью '

2',3'-Дидезокси-2',3'-дидегидротимидии-5'-трифосфат является наиболее эффективным терминатором большинства ДНК-полимераз. Следует ожидать, что подобные ..свойства будут проявлять и аналогичные трифосфаты с другими природными основаниями. Поэтому представляется целесообразным создание на их основе терминаторов, способных нести разнообразные репортерные группы. Однако реализации подобного подхода осложняется тем обстоятельством, что все представители этого класса нуклеозидов (в особенности иуриновые) обладают весьма нестабильной, гликозидной связью. Видимо, поэтому синтез пуриновых аналогов d4TTP в литературе не описан. ■

»

Нами был предложен следующий подход к решению этой проблемы. Известно, что гликозидная связь в некоторых 7-деазапурино-вых нуклеозидах весьма стабильна. Известно также, что 7-деазааналог аденозина - туберцидин (1) в клетхе имеет сходные со своим про-

си он

(1) (2)

тотипом пути метабол этической активации и деградации. В частности, 2'-дезокситуберцидин-5'-трифосфат является хорошим субстратом многих ДНК-полимераз и включается ими в растущую цепь ДНК вместо <ЗАТР. Поэтому можно предположить, что 5'-трифосфат 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротуберцидина (2) будет проявлять свойства эффективного терминатора ДНК-полимераз и, в то же время, иметь достаточно стабильную гликозидную связь для того, чтобы на его основе можно было создать терминатор, несущий различные репортерные группы. Для того, чтобы проверить это предположение мы синтезировали 2',3'-дидезокси-2',3,-дидегидротуберцидии (7, «5Ди) и его 5'-трифосфат (2).

Для синтеза луклсозида нами была использована следующая схема (Схема 1). 2"-Дезоксич>Сериидин (3), синтетический аналог туберцидина, который был получен с использованием ранее опубликованных методик, превращали в У-т^тг-бутшщиметилсшшльное Производное (4), л далее без выделения мезилировали по З'-положе-нию; деблокирование полученного мезилата (5) приводило к 2'-дез-окси-З'-метансульфонилтуберцидину (б) с общим выходом 70%. Последний был превращен в целевой нуклеозид (7) с выходом 80% обработкой метил атом натрия в ДМФА . Физико-химические свойства полученных нуклеозидов хорошо совпадают с ранее опублйкованы-мп. Гидрированием 4,Ти над 10% Рс{/. Ва504 с выходом 80% был полу-чен также 2\3'-лидезокситуберцидин (8).

Кинетику кислотного гидролиза аналогов тубернидина псследо-рали в среде ЮМ БС1 в Р20; с использованием спектроскопии ПМР (скорость изотопного обмена в этих условиях пренебрежимо мала).

Схема 1.

М(г

m

(в>

Результаты кинетических экспериментов приведены в таблице I. Для сра&пёнки мы определили значения эффективных констант скорости 'птролиза аденозина и 2'-дезоксицитидина в аналогичных усл«геийх. Так скорость гидролиза 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидро-аденЛйШа' ^Аао) в этих условиях слишком велика, полученные дан-«Ыенк позволякзт количественно оценить,сравнительную стабиль" tiocn. 4f,Tu и d4Ado . однако можно утверждать, что замена атома N-7 « молекуйё a4Ado метиниой группировкой стабилизирует гликозидную связь минимум в 100 pax

Таблица i

Константы скорости гидролиза псевдопервого порядка исследованных иуклеозидое яри 37"С в ЮМ DCL

Нуклеозид k, мин-' о

" d/Ги 0.15 0.05

Ado 0,12 0,065

dtAdo »10 •

dCyd o.oos 0.02

Расчеты сродства к протону атома N-9 частиц (9, 11, 13) и, соответственно, атома N-7 частиц (10, 12, 14) методом AMI свидетельствуют, что, в пределах точности метода, частицы (9) и (10), (11) и (12), (13) и (14) должны быть примерно одинаковыми уходящими группами.

NH,

(13)

NH,

(12) (14)

Расчитанные методом М^О значения АНек, реакции протони-рования атома N-7 в 9-метйладенине и атома С-5 в 4-амино-7-метил-. пирроло|2,3-с!|пнримидине (15 а, б) ( Схема 2) показывают (Рис. 1), что, в то время как в первом случае реакция протекает практически без активационного барьера, в случае 4-амино-7-метилпирроло|2,3-й)-пиримидина он составляет почти 12 ккал/моль. Такое различие вполне объяснимо, так как в переходном состоянии реакции протониро-вания соединения (15 б) нарушается ароматичность пиррольного кольца. Результаты расчетов подтверждаются тем фактом, что в среде 10 N ОС! в 020 Яри 37°С изотопного обмена атома Н-5 не происходит в течение как минимум 10 периодов полураспада нуклеозида (7). Это значит, что реакция гидролиза с14Ти не протекает через стадию образования протонированного по С-5 интермедиата, и частица (14) не является уходящей группой в этой реакции.

Тот факт, что реакция протежирования пиррольного цикла пир-роло12,3-с!1пиримидиновых нуклеозидов имеет высокий активацион-иый барьер, объясняет также стабильность гликозидной связи в моно-протонирйванной форме с34Ти. Известно, что гидролиз пуриновых нуклеозидов протекает через переходное состояние (16 а), в котором атом N-7 частично пратонирован, что приводит к компенсации образующегося на уходящей группе отрицательного заряда. В случае 7-де-

азапуриновых нуклеозидов аналогичное состояние (16 б) реализоваться не может, что затрудняет разрыв гликозидной связи.

н/>

¿»К

(15 а,б) X - а) N. б) СН

И\г

Ь6

СН,

Схема 2

N—

СН,

ЛИ,

обр

200

а)

« 6)

Рис. I. Расчет ППЭ реакиии протонированин соединений 16 а и 16 б ( г -расстояние между оксониевым протоном и иротонируемым атомом гетероцикла, см. Схему 2).

н \

о.

и'

<141 ¡1 || .

\ 1>.

н' Ч

.....ш,

»11 ОН || |

(16 а) (16 6)

Трифосфорилирование нуклеозидов (7) и (8) давало трифосфа-ТЫ (2) н (17) соответственно с выходом 65% в обоих случаях.

Испытания в системе in vitro е обратной транскриптззой вируса иммунодефицита человека и ДНК-полимеразой / из Е. coli, фрагментом Кленова, показали, что трифосфат (2) является эффективным терминатором синтеза ДНК, катализируемого указанным» ферментами; при этом не было обнаружено заметного различия в активности трифосфатов (2) я 2',3'-дндезоксиаденозин-5'-трифосфата.

NHj

ob

Ь » I

" п; о

<17)

dclTuTP (17) обладает такой же активностью, следовательно, можно утверждать, что замещение атома N-7 в адениновом основании метинным фрагментом не изменяет субстратные свойства данных нуклеозидтрнфосфатов.

2. Синтез потенциальных терминаторов биосинтеза ДНК на основе аминотимидттрцфосфата.

2\3'-Дидезокеи-3'-амннонуклеозид-5'-трифосфаты (18) являются хорошими терминирующими субстратами всех исследованных ДНК-полимераз. В настоящее время разработаны удобные методики получения этих соединений, что делает их достаточно доступными.

и О и

:< « II «.„

(18) Base = Me, Giu, Tliy, Cyt. З'-Аминогруппа легко конденсируется с любым реагентом, имеющим активированную карбоксильную группу, изотиоцианзтами, ele. Это позволяет вводить репортерную группу в молекулу трифосфата (18) на последней стадии синтеза, что снимает многие ограничения, связанные с химическими свойствами меток. Возможность введении репортерной группы не зависит от природы гетероциклического агликона, поэтому данный подход в случае его реализации позволил бы создать серию терминаторов с однотипной структурой углеводного остатка и всеми четырьмя природными основаниями.

Первой задачей, требующей решения, являлось изучение влияния размеров и природы ацильного заместителя в З'-положении ами-нонуклеозидтри фосфата на его терминаторные свойства. Для этой цели нами был синтезирован ряд соединений типа (19). При этом предполагалось, что для подобных модификаций сахарного остатка будет выполняться установленное ранее правило: одинаковая модификация сахарного остатка нуклеозидтрифосфатов с различными агликонами

000 ' О О I

1 J I Tbj i f

NH2

изменяет их свойства примерно одинаковым образом. То. есть; закономерности, обнаруженные в ряду нуклеозидтрифосфатов томннового ряда, должны быть справедливыми для нуклеозидтрифосфатов цито-зинового, гуанинового и аденинового радоа.

Синтез соединений (19 а,о,д,ж) осуществляла конденсацией имидазолидов (в случае соединений а,в,ж) или Ы-гиар*ксисукцин-имидных эфиров ( в случае соединения д) соответствующих карбоно-вых кислот. Несмотря на значительный избыток ацилирующего аген* та, аминогруппа трифосфата (18) ацилируется не полностью и в реакционной смеси остается 5 - 10% исходного вещества. Для полного и гарантированного отделения от трифосфата (18) соединения (19) подвергались очистке с использованием ион-парной ВЭЖХ. Гидрогенолиз трифосфатов (18 в) (18 ж) давал трифосфаты (18 6) и (18 г) соответственно. Конденсация трифосфата (18 г) с гкдрокси-сукцинимидным эфиром флуоресцеин-5-карбоновой кислоты при-

водила к соединению (18 е). Структура полученных соединений подтверждена данными электронной абсорбционной и ЯМР-спект-роскопии, а в случае соединений флуоресцеина - спектрами эмиссии.

Все синтезированные соединения (19) были" исследованы in vitro в системе с обратными транскриптазами вируса саркомы Моло-ни и вируса птичьего миелобластоза, ДНК-иолимеразой 1 из Е. со//, фрагментом Кдекова, ДНК-полимеразой а из тимуса теленка. Результаты исследований позволяют утверждать, что, в противоположность ранее опубликованным данным для подобных соединений, все изученные аналоги ТТР не являются терминаторами биосинтеза ДНК, катализируемого изученными ферментами.

Для того, чтобы установить причину такого несоответствия результатов, мы синтезировали ранее- описанный представитель этого ряда соединений - 3'-дезокси-3'-ацетамидотнмидин-5'-трифосфат ( ацетамидоТТР, 20), который, по данным ранних работ, являлся сильным терминатором многих ДНК-полимераз. В результате испытаний этого соединения описанный ранее эффект не воспроизводился: синтезированный нами аиетамидоТТР не терминировал биосинтез ДНК, катализируемый изучаемым типом ферментов.

„ „

И II и I I

г

«'"з ,(20)

Мы установили, что подобное расхождение результатов объясняется тем, что в процессе синтеза аминоТТР (18) восстановлением азидоТТР (21) происходит образование высокоактивных терминатор-ных примесей, которые на следующей стадии - ацетилировании аминогруппы - способны загрязнять целевой ацетамидоТТР и обуславливать терминирующую активность препарата. Природа побочных продуктов зависит от способа восстановления. При гидрировании образуется примерно 10% 2',3'-дидезокситимидин-5'-трифосфата (с1<ЛТР, 22). Используя в этой реакции газообразный дейтерий вместо водорода мы установили, что реакция протекает через образование 2',3'-дадезокси-2\3'-дидегидротимидин-5'-трифосфата (иДТР, 23), который в. условиях реакции восстанавливается до с!сЛТР (Схема 3).

При восстановлении азидоТТР трифенилфосфином (в соответствии .с ранее опубликованной методикой) мы зарегистрировали образован«^ с)4ТТР с выходом примерно 40%, а также следов природного ТТР. Возможно, это превращение происходит за счет аномального распада фосфазида (24), протекающего с разрывом связи С^ и образованием карбениевого иона <25). Последний далее превращается либо в олефин {по пути Е1), либо в спирт (по пути 5Л>1) (Схема 4).

Схема 3

2 0

8 К !,' ГНТТ о о . '"Г^Г

я II II II 1 11 II II 11

У <Н1 •\ /

(21) о,.« I (Н^ . М)

II (I И

V»

Т^Г »00 с"|цЛ5»

- II 1 »ни I I

о- О- о* / * \ у

(23)

Т11у

X®

(24) .

ГЪ'

57

ТЬу

|Н>1» £ИН»

(22)

Схема 4

т2

ТИу

ТЬу

(25)

Т)|у

ООО и" о- о-

РЗ1

Т)1у

Предложенное нами объяснение, разумеется, является всего лишь гипотезой. Для выяснения точного механизма этого необычного

превращения необходимо произвести более детальные исследования, которые выходят за рамки данной работы.

3. Синтез пчримидиновых 2'-дезокси и 2',3'-<)идезоксинуклео-зид-5'-трифосфатов с модификацией в положении 5.

Известно, что некоторые аналоги пиримиднновых с1ЫТР, содержащие заместители в положении 5 агликоиа, легко включаются многими ДНК-нолпмеразами в растушую цепь ДНК и полученная таким образом модифицированная ДНК может служить матрицей для последующей репликации. Этот факт был , использован для создания простой методики энзиматического включения биотиновой метки в природные полинуклеотиды с использованием 5-биотштлированного аналога сШТР (26).

Однако, модифицированные подобным образом аналоги имеют,

он

(26)

кзк правило, несколько худшие субстратные свойства по отношению к большинству ДНК-полимераз, чем их природные прототипы. Поэтому использование проб, меченных с помощью этих трифосфатов, дает, как правило, большую величину фонового сигнала и меньшую чувствительность, чем при использовании радиоактивных меток. Несмотря на то, что описан синтез аналогов dNTP, несущих в положении 5 различные заместители, считается, что указанный метод может быть использован для введения в ДНК только относительно небольших гаптенов, но не люминофоров, флуорофоров и других остатков большого размера.

Для того, чтобы оценить природу меток, способных энзимати-чески включаться в ДНК, находясь в составе модифицированного dNTP, мы синтезировали несколько аналогов ddUTP и dUTP, содержащих флуоресцентные метки, обычно используемые для определения первичной структуры ДНК на лазерных секвенаторах фирмы "Applied Biosystems".

Синтез исходного трифосфата (27) осуществляли по ранее описанному методу (Схема 5) с некоторыми модификациями. Обработка 2',3'-дидезоксиуридин-5'-трифосфата (28) ацетатом ртути (И) и хлоридом лития давала 5-хлормеркуро-2',3'-дидезоксиуридин-5'-трифосфат (29). Последний далее был сконденсирован с ацетатом аллиламмония в присутствии тетрахлорпалладата (II) калия с образованием целевого . 5-(3-аминопропс>тл)-2',3'-дидезоксиурид1ш-5'-трифосфзта (27).

« и и

......

(Я)

Схема 5

Л.У

(29)

и » и

(25)

Полученное соединие (27) было далее введено в реакцию с активированными формами флуоресцентных красителей (30 а, б, в, г) (Схема 6), в результате чего мы получили флуоресцентно меченные трифосфаты (31 а-г).

Схема б

НЛ-^У^Ч-^Ы»,

I I » «и

■ЛЛ-Л-тр, •

о о о

X = Н (27), ОН (32)

(30 а-г)

(33 а-г, X 34 а-г, Х-ОН)

.) о) »> г»

Аналогичная реакция с использованием трифосфата (32) привела к субстратным аналогам сЛТР (34 а-г). Полученные соединения яаля-

ются хорошими субстратами обратных транскриптаз вируса миело-бластоза птиц и саркомы Молоии, фрагмента Кленова ДНК-полиме-разы 1 из £ coil., ДНК-полимеразы р из печени крысы и концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы из тимуса теленка и умеренными субстратами ДНК-полимеразы из Tertnus aquatkus. Данные соединения могут быть использованы для введения соответствующих флуоресцентных меток в состав ДНК.

Методом атом-атомных потенциалов (используя поле AMBER 3.0) ми произвели расчет конформации фрагмента ДНК фага MHmpIO, содержащего остаток 2'-дезоксиуридина, флуоресцентно меченного в положении 5 (Рис. 2). Как видно из рисунка, введение заместителя не вызывает заметных искажений в молекуле ДНК. Возможно, это является одним из объяснений легкости включения соединений (33, 34) в состав ДНК многими ДНК-синтезирующими ферментами.

Рис 2. Фрагмент двойной спирали ДНК (В-форма), содержащей флуоресцентно меченный нуклеотидный остаток (стереопара).

Выводы

1. Синтезированы 2',3'-дидезокси- и 2',3'-дидезокси-2',3'-Диде-гидротуберцидин-5'-трифосфатм - эффективные терминаторы ДНК-полимераз, имеющие стабилизированную гликозидную связь. Предложено возможное объяснение стабилизации гликозидной связи в 7-деазапуриновых нуклеозидах.

2. Осуществлен синтез ряда З'-дезокси-З'-ациламидотимидин 5'-трифосфатов. Показано, что все соединения этого ряда не обладают субстратными свойствами по отношению к исследованным ДНК-полимеразам.

3. Зарегистрировано образование 2',3'-дидезокситимидин-5'-три-фосфата и 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидин-5'-трифосфата как побочных продуктов реакции восстановления З'-дезокси-З'-азидотимидин-5'-трифосфата. Предложен возможный механизм наблюдаемых реакций.

4. Синтезирован ряд флуоресцентно меченных аналогов 2',3'-дидезокси- и 2'-дезокси-5-(3-аминопропенил)уридин-5'-трифосфата, являющихся хорошими субстратами некоторых ДНК-синтезирубщих ферментов.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Александрова Л.А., Лукин М.А., Розовская Т.А., Атражев A.M., Ку-ханова М.К., Краевский А.А. Флуоресцентные аналоги нуклеозид-5'-трифосфатов для изучения нуклеиновых кислот нерадиоактивными методами // Молекулярная биология.-1990.-Т.24.-N4.-C.1100-И08.

2. Alexandrova L.A., Lukin М.А., Rosovskaya Т.А., Kukhanova M.К. Fluorescent analogues of nucleoside 5'-triphospliates for investigation of nucleic acids by nonradioactive methods // Coll. Czech. Ciem. Comm.-1990. V.55,-Sp.l, N1.-P.149-151.

3. Alexandrova L.A., Lukin M.A., Victorova L.S., Rosovskaya T.A. Enzymatic incorporation of fluorescent labels into oligonucleotides // Nucleic Acids Research. -Symposium series.-199I.-V.I9.-N24.-P.227.

4. Савочкина Л.П., Дьяченко Л.Б., Лукин М.А., Александрова Л.А. Аналоги нукпеозидов, модифицированные по сахарному остатку и основанию, в реакции синтеза ДНК, катализируемой ДНК-поли-меразой Thermus aquaticus // Молекулярная биология.-1992.-T.26.-N1.-

С.191-200.