Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение активности 5'-регуляторной области гена Gb из Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение активности 5'-регуляторной области гена Gb из Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens"

ргб (Л

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им.В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

На .правах рукописи УДК 577.218

Багян Ирана Левозовна

ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ 5' -РЕГУЛНТОРНОИ ОБЛАСТИ ГЕКА 5ъ 13 Т-ДНК АОЮВАСТЕВМЫ ТиМеГАГСЕКЗ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертихЕК вн соискализ ученой степени кандидата хш.оиесиз наук

Москва 1994 г.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биология растений Центра "Биоивженерия" РАН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук, профессор,

член-корр. РАСХН К.Г.Скрябин

кандидат биологических наук Е.В.Ревенкова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук А.А.Аграновский

доктор биологических наук Г.А.Романов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной генетики РАН

Зашита состоится 1994 г. В часов Еа

заседании диссертационного совета Д 002.79.01 цри Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул.Вавилова, д.32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан

9"

г.

Учений секретарь диссертационного сое кандидат химических

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность . работы. Agrobacterlun tumsfaclens почвенный фитопатогея, вызываний у растения образование опухоли (корончатого галла) в месте заражения. Механизм образования ОПухаЛИ ИЗВеСТеН В ОбЩИХ Чертах fHooykaas and Schiiperoort, 1992!, однако, многое в этом процессе остается пока не выясненным. Фрагмент Ti-плазмшш агробактерия -Т-ДНК - переносится при инфекции в клетка растения и интегрируется в ядерный геном. Гены, входящие в состав Т-ДНК, экстре с сирузот с я в растительных клетках. Часть генов Т-ДНК кодирует биосинтез фитогормснов - ауксина и цихокзнина, экспрессия зтпх генов приводит к образованию опухоли в месте заражения. Кроме того, Т-ДНК дсшша содержать гены,- продукты которых регулировали Он развитие опухали. Один из таких генов был идентифицирован - ген 5, который регулирует активность ауксина в клетках опухоли ¡Когъег et ai, 1991!. в последние годы стала интенсивно изучаться регуляция активности промоторов генов, входящих в состав Т-ДНК. Бнло показано, что промотора генов Т-ДНК способны обеспечивать диЗференциальнув экспрессии репортерного гена в трансгеннпх растениях органоспецифячную и зависимую от стадии развития растения; для некоторых из этих промоторов было показано, что они способны реагировать на поранение растения и фитогормонн (An et al, 1986, 1990; Langridge et al, 1939; Koncz and Schell, 19S6; Korber et al, 1991; Kononowicz et al, 1992; Uattsson et al, 1992; Strabala et al, 1993 ). ВЫЯВЛвНЫ ФУНКЦИОНЭЛЬНО важные элементы этих промоторов, определявдие их диффзренциальнув экспрессию (Kononowicz et al, 1992; Neuteboom et al, 1993a; Leung et al, 1991; Cuavara-Garcia et al, 1993; Ha et al, 1989; Mitra et al, 1990; Kim et al, 1994). Определены белковые факторы, взаимодействующие с этими tfuc-элементами (Hsuteboom et al, 1993b; Lam et al, 1969; Singh et al, 1989, 1990,- Fromm et al, 1989; Tokuhlsa et al, 19901. такие исследования, во-первнх, способствует пониманию механизмов развития и функционирования опухоли. Во-вторых, генв^Т-ДНК являются удобной модельл для изучения

механизмов регуляции генов в растениях, поскольку имеет регулятораые области небольшой протяженности.

Ген бъ является одним из немногих генов Т-ДНК, функция которых пока неизвестна. Выяснено только, что экспрессия гена бъ, особым образом модулирует клеточный рост, и функции, этого гена связаны с регуляцией активности фитогормонов в клетках оцухоли (Spanifcr et al, 1989; TinlancL et al. 19B9, 1990, 1992). 5'-регуляторная область гена бъ никогда ранее не изучалась. Мы поставили своей целью изучить регуляторную активность 5' -фланкирующей области гена бъ из Т1-плаз:.:йды Во542 (Hood et al, 1984) в трансгенных растениях. Результаты исследования регуляции активности гена бь могут быть полезны при изучении роли этого гена в цроцессе развития корончатого галла.

Цель работи • 1. Клонирование и определение нуклеотшшой последовательности 5' -фяанкируидей области гена бь из п-ДНК рТ1Во542. 2. Изучение активности данной регуляторной области в различных органах трансгенных растений и сравнение ее с активностьв промотора 35S-e. з. Выяснение влияния поранения растения на активность регуляторной области гена бь. 4. Изученио влияния фитогормонов на активность регуляторной области гена 6'j.

Научная норизна и практическая ценность работы■

Впервые клонирована и секвенирована 5'-регуляторная область гена бь из pTiFo542, являвшегося одним из немногих генов T-A-iX. функция которого пока неизвестна и регуляция экспрессии которого никогда ранее не анализировалась. Впервые проведен функциональный анализ 5'-регуляторной области гена бь. Показано, что она способна обеспечивать диффоразциаяьпут эххцрзссиэ как в вегетативных, так .и в репродуктивных органах трансгенных растений. Проведено сравнение уровней" экспрессии, обвспечивае'яхх изучаемой областью и промотором 353-е в различных органах трансгенных растений. Изучено влияние фитогормонов на активность 5'-регуляторной области гена бъ, впервые показано, что эта активность стимулируется ауксинзж, а такхе в ответ на поранение растения. Полученные данные могут быть полезны при

изучении роли гена 6ь в развитии корончатого галла. Кроме того, 5'-регуляторная область гена бъ, активность которой нами охарактеризована, монет быть использована )уш экспрессии генов в трансгенных растениях.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на I Всесоюзном симпозиуме "Новне методы биотехнологии растений", Пущно, 1991; на XI Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, 1993; на 2 Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология". Алма-Ата, 1993; на Конференции "Генетическая инггнерия и биотехнология", Минск, 1994; на заседании коллоквиума Цзнтра "Биопшшнерня" РАН.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из .введения; трех глав, выводов и списка литературы. Она изложена на страницах, содержит рисунков и

библиографический список из названий.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Клонирование и секвенировачие 5' -фланкирурдей области гена бъ та ИгйЖ оТ1Во542.

Ко времени начала данной работы в наэей лаборатории был клонирован в рТ219В ВааНХ фрагмент 10 И-ДЕЕС рГ1Во54.2 (7,5 т.н.п.), содержащий правую часть П.-ЛНК (обозначение фрагмента 23 работы Кошаг! е± а1, 1986), и методом блот-гибтшшзации по Саузерну Сало оправлено положение 5'-конца гена бь относительно ХЬа1 сайта (рис. 1а). Была получена серия делений ХЬа1-ВаиН1 фрагмента с шмотью нуклеазы Ва131, полученные (фрагменты (делецаонныз варианты) были • клонированы в рГ219й и проанализированы с.помоэьо блот-гибргдизацпи (Ревенкова с соавт, 1993). Ь'зченнЯ зонд был синтезирован на фрагменте рТ1АсЬ5, вкдзчакзем 5'-конец гена въ и предяествутгдай ему нетранскрпбируемнй участок. Делеционннй вариант N5 (рис. 1а, б) фрагмента п.-ДНК рПВо542 , который слабо гибршгазовался с указанным зондом. От выбран для дальнейшей работы по поиску 5'-конца гена бь П-ДНК рТ1Вэ542.

Мы перенесла Ecofii-Hlndiil фрагмент (рис.16) этого клона длина около 1,6 т.н.п. в вектор шзшрю и определили нуклеотивддв последовательность ЕсоИ-конца

фрагмента. Полученную последовательность сравнили с опубликованной последовательностью промоторной области гена

6Ь ИЗ TL-да pTiAch5 (Gielen et al, 1984 1, ВЫЯСНИЛОСЬ. ЧТО

последовательность ecobi -конца клонированного фрагмента tl-ДНК ртив&542 начинается с tata блока промотора гена бь. Для того, чтобы клонировать 5'-фланкирующую область гена бь, прилеганщув к atg кодону, был взят более длинный фрагмент tl-ДНК рТ1Во542 длиной. около 1.8 т.н.п. - делецаонный вариант 4 (рис.1а), клонированный в pTZi9R (предоставлен Е.Б.Ревенковой). EcoRl-Hlndlii фрагмент этого клона аналогично От перенесен в вектор Mi3mpio и секвенирован с EcoRi-конца. Полученную последовательность сравнили с соответствуаяим участком опубликованной последовательности TL-ДНК pTlAch5 (Gielen et al, 1984). БЫЛО обнаружено, ЧТО клонированная фрагмент содериит начало кодируицей части гена бь (129 н.п.) и 5'-фланкируидув область (общая длина фрагмента - около 1,8 т.н.п.). На протяжении 220 н.п. перед атс кодовом последовательности 5'-фланкирующей области гена 6ь из рт1ш54? 'и pTiAch5' в высокой 'степени гомологичны (гомология Ш.), далее область высокой гомологии обрывается. Выла найдена вероятные tata и ссаат блоки промотора гена бъ ИЗ рТ1Во542 (по аналогии с pTiAch5). Оказалось, что последовательности ТАТА-блока и ССААТ-блоков pTiAchs совпадают, за искличением одного нуклеотида в TATA -блоке

(TATAAGA В pTiBo542 И ТАТАААА В рТ1АсЬ5).

2. Перэиесение 5'1 -фланкирующей области гена бъ рТ1Во542 в вектор для тестирования регуляторноя активности в-растениях.

На основании полученной нами нуклеотидной последовательности 5'-фланкирушдей области гена бь рТ1Во542 был синтезирован олигонуклеотид, комплементарный последовательности, прилегащей к atg кодону гена бъ (далее 3' -праймэр):

5' -CCCATGGCAATTTTCGTATTTACTACAAAT-3'

а)

BamHl

Xbal

*

ннн _111

BamHl

6) EcoRl

HindlD Hindni

7t

4'

РИС.1.

а) Схема ВажН1 фрагмента 10 (7,5 т.п.н.) п.-дна Рпво542 (предоставлена "Е.З.Ревенковой). Звездочкой показано положение зонда, содеткащего 5'-конец гена бь из рПАсЬЭ и Ш/ЗдпествуЕций ему ■ нетранскрибируемнй участок. Стрелкой обозначено напмзление транскрипции гена бь. Внизу показано лолоненае делециозянх вариантов Хьа1-ВаиЩ фоагмента (7, 4, 5, 3, 17). Делеционные варианты N 4 и 5 были предоставлены Е.В.Ревенковой для дальнейшего клонирования 5' -фпанкирумаей области гена бь рПВс542. н - сайт" узнавания рйстриктазы Н1п<Ш1.

0) Схеш клона м 5, содетжашего делеционннй вашант 5 ХЬа1-ЗасШ' фрагмента Т1-ДНК рТ1Во542, шюнявованннй в ргаэи (делениснаые вашантн различались по концу^ фланкированному сайтом ЕсоН).

На 5'-конце этого праймера был предусмотрен сайт узнавания рестриктазн Ncol (ccatgg) - для того, чтобы в "результате ПЦР создать сайт Ncoi на конце фрагмента регуляторной области гена бь, прилегавшем к atg кодону. Это необходимо для встраивания изучаемой регулягорвой области перед ato кодоном репортерного гена.

К это'^у времени в результате совместной работы лаб. молекулярной биологии растений Центра ТЗиозЕгенерия" и группы секвензрования и картирования генома человека Института молекулярной биологии методом shotgun бзл создан банк фрагментов tl-ДНК ptiBo542, клонированных в фаге М13прю по сайгу Sumí и секвенированных (Краев, Банников, неопубликованные данные). Определеннув нами нукгеотиднув

последовательность 5' -фланкируылей области гена бъ сравнили с последовательностями этого банка. Таким способом в этом банке был найден клон м 13. несущий 826 н.п. 5' -фланкирующей области и часть кодирующей области гена бъ (рис.2). Этот клон был взят для дальнейшей работы. Следует отметить, что протяженность регуляторной области гена бь неизвестна, а протяженность межгешой области соответствующего участка тх-днк рг1ась5 (между терминирующим кодоном гена oes и atg КОДОНОМ геаа 6Ъ) составляет 877 Н.П. (Gielen et al, 1984).

ДНК этого клона использовали в качестве матрицы в ПНР для амшшфахации фрагмента 5'-фланкирующей области гена бь, праймерами служили описанный выше 3' -праймер и обратный праймер на щз. Электрофоретически гомогенный продукт 1ШР обработали рестриктазами Neo i и Есизбп (изошизомер Ssti, дающий туша конец). Полученный фратент ДНК содеркит

Рис.2. Структура клона ч 13 из банка последовательностей ть-ДНК рТ1Во542. Показано положение З'-праймера (З'-рг.) и обратного праймера (НР), использовавшихся для амшшфикации посредством ПНР фрагмента 5" -фланкирующей области гена бь длиной 826 н.п. (Клон предоставлен А.С.Краевым).

5'-фланкирунцуш область гена бь длиной 826 н.п., нуклеотидпая последовательность которой.приведена на рис.3.

На 5'-конце фрагмента имеется семь нуклеотидов из полилинкера ш ЗшР1о (стссссс). в природной последовательности гена бъ из рТ1Бо542 в положении -1 относительно атс кодона находится нуклеотид с, который был

Ncol

3' — рГ.1 6b coding region

•, Sma. 1

EP J - "

polylinker M13mpl0

Eel 136 II

заменен на с при создании сайта узнавания N001. Никаких других ■ замен .или дополнительных, последовательностей в изучаемую область при клонировании перед репортераш геном не вводится. Этот фрагмент ДНК был встроен (путем транйфшщионного слияния) в соответствулцей ориентации в специализированный вектор рМоп755 перед репортерным геном иеГГвгзоа еЬ а.1, 1986!, ВМвСТО ПрОМОТОра 35Э-е (рис.4).

-826

СТСССССТСАССАТСТСАСССССААССТСТССАССТССАААСАССАА

САТСТСААТГГТАТСТТТССССГГТТАССААСАААТССАТАСАСССССССС

САААССАСССТСТАССССССААССАТАТАССТТТТСССТСТАССССАСАС

ТАСТССТТССССАСГГСаАТТТАССТСССАСТААСААТАТССАТСТСССТТ

АСАССААСАТТСТТСССТТСАТТАСАСССАСАСААСТССАТАТТСТГСАС

АССАСААТАСТСТТТСААССАСССААТСАСААССССТТСТССССАТСССТ

ТСССААТТСААТСАААСТСААСАТАСТТСТТААССТСТСТСТТСТССААС

ТССССТСТСССАСТАСТСТТСААСАСАСТСТТССАССАСАСССССССТАА

ТАСССАСССССАСТТССГССААтПТССТСАСАССАСТСССССТСАСТС

АТТТСССТССТСАТТТСТТАТТАТСАССССТСТТАСССССАТСССССТТА

ТАТАСССССССТАСССТАГАСТСАСТСССАСААТААСАСТСАААТССТСТ

ТТСААААСССАССАТТТССССТСАТТСААТСАТТТСААССАСГГАССТТТТ

СААТТТТАААААТСААСТСАССАСАААТТСГГТАСАТСССССТАСССССАС

ТТТТСССАСАСАТСТСССССССАССАССССААААТТСАААТССССТАТТС

-131 -94

ААТССТАТСААТСТСТССТСТТТТТАСАССССАТСАСАСССТСАССААТС -62

АССТСААТССССАТССТТАСТСААТАГААСААССААТАССТСАСАСТТАС ~ ■ -1 САСССССАССТАТТТСТАСТАААТАССААААТТСССаЬе

Рис.3. Нукяеотщшая последовательность б'-фяанкирулцей области гена бъ длиной 826 н.п. Курсивом выделена последовательность от полшшнкета шзшрю (стс - от сайта Ее И зби, есс - от сайта Биа!). Подчетжзутн последовательности вероятных ССААТ блоков (-131 и -94) и ТАТА-блока (-62).

- а -

Notl

Рис.4. Плаз;,гада piion755, несущая репортерши! ген gus. йсследуему» 5"-фланкирующую область гена бъ (Р-бь) встраивали в рМоп755 ВМеСТО ПрОМОТОра 35S-e ( P-35S-E ;. gus - кодирующая область гена р-глюкуронидазы E.coli; nos з • - з ■ -рогуляторная область " гена нопалшсинтазы A.tuinefaclecs.

Таким образом, ' уровень активности gus в тканях трднсгенных растений должен отражать активность изучаемой регуляторной области, под контролем которой находится репортерный ген gus.

Кассету экспрессии P6b-gus-rios 3' вырезали из рМоп755 по сайтам ftotl и встраивали в бинарный вектор рмопэоь в сайт NotI такиа образом, чтобы направления транскрипции гена gus и гена npt и были противоположны. Полученная плазмада была обозначена как Рбь-gus (рис.5), fia предполагали сравнить регуляторнув активность изучаемой 5'-фланкируппей области гена бь С активностьл промотора 35S-e (Monsanto Co., ЕР О 339009 А,), который представляет собой усиленный посредством дупликации энхансерной области вариант широко используемого для экспрессии вводимых генов в растениях промотора 35S РНК

вируса мозаики цветной капусты. Мы переклонировали кассету экспрессии РЗбБ-е-ёиг-Ж^ 3' из ИСХОДНОЙ длазмидн рИоп755 в рМопйоь по сайту Пои,. полученная плазмида рМог>505: :Р355-е-ё1М-Г)05 3' была обозначена как Р355-е-£из. От Рбь-^з она отличается только регуляторной областью.

стоящей перед геном sus.

Notl

Tri 7 Spc/StrR Рис.5. Структура плазмщы P&b-gus: • - - -• -RK2 - фрагмент плазмщщ с широким кругом хозяев RK2, содержащий сайты инициации репликации и переноса; ori322 -фрагмент, содержащий сайт инициации репликации рШ322; ЕВ -пшвая пограничная последовательность Т-ДНК рптз7; nos рПТ37 - ген нопалинсинтазн ИЗ pTiT37; Tn7 Spc/StrB -фрагмент из Тп7, • содериапшй ген устойчивости к спеетиномицину/стрептомицину; п pt ri - химерный ген неомицинфосфотрансферазы XX с промотором и терминатором гена нопалшсинтазы из Т-ДНК; Р-бь - 5' -фланкирующая область гена 6Ь; gus- кодирующая часть репортерного гена р-глшуронидазы Е. coli; nos з1 — 3'-регуляторная область гена нопалинсинтазн Т-ДНК. Стрелками указано направление транскрипции.

3- Получение трансгенных растения Nlcotlana tabacum. несудих регюртерныя ген ■ gus поя контролем • 5 ' -регуляторной области гена 6Ь. и растения, несущих ген pus под контролем промотора 35S-6.

РБЪ-gus перенесли в штамм-помощник A.tumef&ciens B6S3SE

методом трансформации. Присутствие Рбь-gus в полученных клонах A.tunefaclens было подтверждено методом блот-гибщдвзации по Саузервд. Один из зтзх mioses использовали для трансформации листовых дисков N. tabac игл Sri . в результате были получены трансгенные растения N. tabacuB, несуше репортерннй ген gus под контролем изучаемой 5'-фланкирующей области гена бь. Аналогичным образом были подучены трансгенные растения N.tabacun, несущие ген gus под контролем промотора 35s-e. Присутствие гена gus в геномной ДНК полученных растений подтверждали с помощьв ПЦР. Было отобрано 8 независимых трансформантов, несущих Рбъ-gus, и 6 независимых трансформантов, несущих 35s-e-gus. Отсутствие агробактериального загрязнения полученных растений подтверждали путем растирания листьев в богатой среде и инкубации при 28° в течение 2 суток.

4. Определение активности 5'-регуляторной области гена бЪ В. клетках A-tmnafaclens .

Мы - определили ахтивность gus в исходном штамме A.tumefaciens b6s3se и в штаммах, несущих Рбъ-gus и P35s-e-gus. В клетках исходного штамма активность gus не была обнаружена; в то же время, и Рбь-gus, и Р35s-е-gus обеспечивали высокий -уровень экспрессии гена gus в-A.tuffiefacleas - 24 нмаяЫШ/ (мш*мг белка) и 2400 нмольми/(мзн*мг белка), соответственно. Гены. Т-ДНК, в том числе и ген бъ, имеют типичные эукариотические сигналы ТраНМфИПЦИИ (Glslen et al, 19S4; Depicker et al, 1962; De Greva et al, 1982), ОДНЭКО ДЛЯ npOMOTOpOB НбКОТОрыХ Г6НОВ ИЗ

Т-ДНК (например, генов маннопинсинтазы, ms (Gelvin et al, 19B1; Gelvin et al, 1965; DIRita and Gelvln, 1967; Hen3sens et al, 1992) было показано, что они работает В A.tumefaciens. Также было показано (Janssens et ai, 1964), что некоторые районы Т-ДНК из pTicse транофибируиггея в агробактерап. Авторы этой работы предположили, что некоторые продукты- генов Т-ДНК, например те, которые вовлечены в биосинтез фитогормонов, могут участвовать в физиологических процессах, происходящих на ранних стадиях агробактериальной инфекции, до переноса Т-ДНК в растительные клетки. Однако,

вполне возможно, что транскрипция с промотора гена бь в агробактерии имеет иное биологическое значение. -Для промотора 35S тоже было показано, что он активен в клетках

A.tumef&clens (Henssens et al, 19921.

5. Определение активности 5• -регуляторноя области гена бъ в трансгенных растениях N.tabacum (_в первичных трансаормантахi и ее сравнение с активностьр промотора 355-а.

Мы определили активность gus в молодых (ивенильных) листьях и корнях полученных растений. Было проанализировано 8 независимых трансфоркантов бъ-gus, и 5 независимых трансформантов 35S-e-gus. Анализ проводили m vitro, в грубых экстрактах растительных тканей; с использованием флуорогенного субстрата - 4-hug. Интенсивность флуоресценции 4-ми измеряли на минифлуориметре. Это дало возможность количественно оценачь уровень зкспрессгз репорггерного гена. Было обнаружено, что растения бъ-gus. имею в среднем в 100 раз меньший уровень активности gus в молодых листьях, чем растения 35s-e-gt¡s (0,1-0,5 нмоль ми/(мин»мг белка) и 9-63 нмолыш/(мин»мг белка), соответственно). В корнях растений Бъ-gus активность gus была в среднем в 30 раз меньие, чем в корнях растений 35s-e-gus (8-18 нмольии/(миа«мг белка) и !'208-500 нмольми/(шш * мг--белка), соответственно). При-этом, активность gus в корнях растений бь-Gus была в 20-80 раз больше, чем в листьях этих растений. Промотор 35s-e тоже обеспечивал более высокую активность gus в корнях, чем в молодых листьях, в среднем в 25 раз. Яетрансформированные растения N.tab&cum sai не содержали активности gus.

6. Определение влияния поранения растения на активность регуляторноя области гена бь.

Ранее для промоторов генов nos и ms была показана стимуляция экспрессии поранением растительной ткани (An et al, 1990; Langridge et al, 1989; Teeri et al, 1969; Gelvin et al, 1994), что не -является неожиданностью, поскольку агробактерия способна заражать растение только в месте поранения. Для того, чтобы проверить, имеет ли место этот эффект в случае промотора гена бъ, мы провели следующий

опыт. Листья трансгенных растений (первичных трансформантов, перенесенных в искусственный грунт и выращенных до стадии 12 листьев) Озли разрезаны на фрагменты размером около 0,5 см2, которые затем инкубировали в стерильной воце в течение 22 часов. Такая обработка существенно увеличила активность cus по сравнению с исходной в листьях растений оь-gus - в 3-8 раз (рис.6а). Активность gus в листьях растений 35s-e-gus не изменилась в результате подобной обработки.

шо saw cao гакг

Рис.6. Возрастание активности 5'-регуляторной области гена бь в ответ "на поранение растения.

а) Возрастание активности gus в листовых эксплантах растений бъ-gus (выращенных в искусственном грунте) в результате инкубации их в течение 22 часов в стерильной воде (W) по сравнении с исходной активностью gus в листьях (11, 20, 21, 38, 51, 60 - номера независимых ттинсформантов).

б) Возрастание активности gus ~!за 22 часа) в листьях ■растений бъ-gus (выращенных in vitro) в результате поранения "(v) по сравнению с исходной активностью gus в этих листьях (О). 20 , 38, 45 , 60 - номера независимых трансформантов.

По оси ординат - активность gus, нмольми/(мин х мг белка).

В дальнейшем' мы проверяли, будет ли наблюдаться подобный эффект, если пораненный лист оставить на растении. В этом эксперименте использовали трансгенные растения

- i з -

первого поколения, выращенные т vitro из семян самоопыленных первичных трансформантов. Б зрелых листьях этих растений делали по 2 отверстия (вырезали 2 диска), определяли активность cus в этих дисках, а пораненные листья оставляли на растении.. Через 22 часа определяли активность cus в этих листьях. Оказалось, что активность gus в листьях растений бь-gus возрастала в ответ на поранение в 1,5-3 раза (рис.66). Активность сиз в листьях растений 35S-e-gus после такой обработки не изменилась. Таким образом, данные этих двух экспериментов свидетельствуют о стимуляции активности 5" -регуляторной области гена бъ в ответ на поранение растения.

7. Изучение влияния фитогормонов на активность регуляторной области гена бъ.

Как полагают, ген бь вовлечен в регуляцию активности фитогормонов В клетках опухоли (Spanier et al, 1989; Tinland et al, 1989, 1990, 1992). На ЭТОМ ОСНОВЭНИИ МОЖНО'

предположить, что активность регуляторной области гена бъ должна реагировать на изменение концентраций или соотношения концентраций фитогормонов. Для того, чтобы проверить это предположение, мы поместили фрагменты зрелых листьев трансгенных растений на среду "для 'каллусообразования' (с высоким соотношением ауксин:цитокинин - 0,5 мг/л НУК, 0,2 мг/л БАЛ). За 6 суток инкубации активность gus в эксплантах листьев растений бъ-GUS возросла в среднем в 51 раз, а- для 25s-6-gu? - только в 3 раза. Такой анализ был проведен для 8 независимых трансформавтов бъ-gus и 5 независимых трансформантов 35S-e-Gus.

Мы поставили своей целью выяснить, обусловлен ли подобный стимулиружиий эффект каким-то одним из этих фитогормонов (и каким именно), или не определявшее значение имеет их соотношение (соотношение ауксин:цитокинин), а также выяснить, будут ли оказывать влияние другие ауксины и цитокинины. Для этого мн провели серив экспериментов, заключающихся в следующем: фрагменты листьев • трансгенных растений (первичных трансформантов), выращенных в искусственном грунте, помещали в водные растворы, содержащие

ауксины и/или цитокинины в различных концентрациях. Все использовавшиеся концентрации входят в диапазон рабочих концентраций различных фитогормон'ов (каталог "Sigma. Plant

cell culture.", 1990 ) - концентраций, ИСПОЛЬЗУИЩХСЯ при

культивировании клеток и тканей растений. Контрольные диски инкубировали просто в стерильной воде, чтобы учесть вклад поранения листьев в усиление экспрессии. Определяли активность gus в листовых эксплантах до и после инкубации. Таким способом было проанализировано 3 независимых трансформанта ьъ-gus и 3 независимых трансформанта 35s—e-gus. Было обнаружено, что активность регуляторной области гена бъ существенно стимулируется ауксинами - КУК, НУК и 2,4-Д, причем эффект зависит от тдпа ауксина. Природный ауксин ИУК вызывает наименьший среди опробованных ауксинов эффект - обработка 10мкМ раствором КУК вызывает увеличение активности gus в среднем в 1,8 раза. Максимальный эффект вызывает 2,4-Д - обработка IQmkM раствором 2,4-Д вызывает увеличение активности в среднем в 7 раз, НУК в той же концентрации вызывает промежуточный эффект. Цитокинины в использовавшихся нами концентрациях (1, 2 и 10мкМ ВАЛ; 1 и IDmkM кинетин) не оказывали такого заметного влияния на активность регуляторной области гена бъ. Растворы, содержание и цитокинины, и. ауксины одновременно, вызывали эффект, который оцределялся количественно содержанием ауксина. Активность gus в листьях растений 35s-e-gi¡s не изменилась в результате такой обработки.

Характер той регуляции активности фитогормонов в клетках опухоли, в которой участвует ген бь, в настоящее время неизвестен. Изучение зависимости активности регуляторной области гена бъ от концентрации фитогормонов может помочь ответить на этот вопрос. Для того, чтобы более подробно изучить зависимость активности регуляторной области гена бъ - от концентрации ауксинов, выяснить, оказывает ли . влияние цитокинезы, взятые в других концентрациях, чем в предыдущем анализе, и определить, влияиг ли цитокинины на эффект ауксинов, мы провели анализ, аналогичный описанному выше, но с использованием растворов

фитогормонов. указанных в подписях к рис.7 и 8. Результаты этого анализа показаны на рис.7 и 8. Исследование, проведенное для 3 независимых трансформантов бь-gus, выявило одинаковую картину: ауксины существенно увеличивают активность регуляторной области гена бъ, причем повышение концентрации ауксина увеличивает эффект. Наибольший эффект вызывает (как было показано и в предыдущем анализе) 2,4-Д. Штокиняны. взятые в отдельности, не оказывают влияния на активность регуляторной области гена бъ, однако цитокинин БАЛ немного (до полутора раз) усиливает эффект ауксина НУК (рис.8).

Поскольку для ауксинов стимулирующий эффект зависел от типа ауксина, мы решили проверить, не оказывают ли влияние другие цитокинпны (природные цитокиниш транс-зеатин и изопентеноладенин), в отличие от исследованных ранее, на активность регуляторной области гена бъ. Этот анализ провели для трех молодых растений бъ-gus первого поколения, выращенных • in vitro из семян самоопыленных первичных трансформантов. Мы использовали в анализе минимальные, промежуточные и максимальные концентрации фитогормонов из 'диапазона рабочих концентраций этих фитогормонов. Существенных изменений в активности регуляторной области гена бъ под действием цитокиненов наш не было обнаружено.

Ранее другими исследователями была показана зависимость от фитогормонов активности промоторов других генов из Т-ДНК - OOS (An et al, 1990 1, mas (Langridge et al, 1989; Leung et al, 1991 !, и гена 5 (Koncz and Schell, 1966; Korber et al.

19911. Как и в нашем исследовании активности 5'-регуляторной области гена бь, при исследовании промотора гена aos было показано (An et al, 1990), что его активность возрастает под действием ауксинов, аффект зависит от типа и концентрации ауксина; питокинаны не оказывают существенного влияния на активность этого промотора. В результате исследования влияния фнтогорконоз на активность промотора гена ms (Langridge et аХ, 1989) ВЫЯСНИЛОСЬ, ЧТО ОНЭ СТИМУЛИруеТСЯ

воздействием как ауксина (НУК), так и цатокинина (БАЛ), однако эффект ауксина выше. Увеличение концентрации ауксина

го

38

nmo!iro/(min х mg рг.)

15

10

IT К1К2 В1В2

и

21

nmollfU/(inm х mg рг.)

10 16 14 12 10

8 в 4

2 О

45

шпо1Ми/(тш х mg рг.)

DllD3\ 2N3 D2 D4

Ж.

ir Kl кг BiBz

и

N1

\ M)D3\ 2N3 D2 D

20

15

10

EL

1

IT Kl К2 B1B2

I1H2>):

Рис.7. Определение

концентрационной зависимости влияния фитогормонов на активность 5'-регуляторной области гена бь. На отдельных диаграммах показаны данные. полученные при анализе трех независимых трансформантов еъ-gus - с номерами 38, 45, 21. о - активность gus в эксплантах листьег до инкубации, w -активность gus в эксплантах после инкубации в стерильной ВОДе. Kl, К2, В1, В2, M1-N3, D1-D4 - активность gus в эксплантах после инкубации в водных растворах фитогормонов: Kl - 0,1 мг/л кинетин; кг - 5,0 мг/л кинетин; ei - 0,1 мг/л БАЛ; б2 - 5,0 мг/л БАЛ; N1 -0,1 мг/л ЕУК; n2 - 2,0 мг/л ЕУК; мз - 5,0 мг/л НУК; Dl -a ¿a м 0,1 мг/л 2,4-Д; d2 - 0,5 мг/л 2,4-Д; Ю - 1,0 мг/л 2,4-Д; D4 - 5.0 мг/л 2,4-Д, По оси ординат - активность gus, нмапъмидмин х мг белка).

■

01

15

10

21

nmottfU/(min x mg pr.)

DI

\

5

OH

D4 " " X

D3, NB3 -Л

DS*""* {¿г,, N N3

o i ■ ; 45

nmolMU/(min ж mg pr.

20

38

nmolMU/(min x mg pr.)

0-

3 4 5 mg/1

D3 —*D4

Щ NB3

—*~"Ñ3

-

O 1

3 4 5 mg/1

Ряс.З. Зависимость активности 5" -тягуляторзоа области гена бъ от " фзтогормонов, взятых в различных концентрациях: nbi -+31 (0,1 МГ/Л ЕУК; 0,1 мг/л БАЛ); НВ2 - N2 + si (2,0 да/л НУК; 0.1 мг/Л БАЛ); NB3 - N3 + В1 (5,0 мг/Л НУК: 0.1 МГ/Л БАЛ). Остальные обозначения те se, что на рас. 7-По оси абсцисс - концентрация фзтогор?:онов, мг/л. По оси ординат - активность cus, нмолы:и/"(мин х мг белка).

5 mg/1

ведет к увеличению активности промотора гена mas. Для промотора гена 5 было показано,что его активность зависит от соотношения ауксингцитокинин, увеличение этого соотношения увеличивает активность промотора, а уменьшение - снижает (Koncz and Schell, 19вб), эффект зависит как от типа, так и ОТ концентрации ауксина (Korber et al, 1991 ). Выяснение того факта, что активность промотора гена 54обратимо индуцируется увеличением соотношения ауксин:цятокинин в среде, помогло понять роль гена 5 в развитии корончатого галла - было установлено, что функция этого гена заключается в модулировании ответа клеток опухоли на ауксин путем авторегулируемого синтеза антагониста ауксина в ответ на повышение концентрации ауксина в клетке. Таким образом осуществляется регуляция активности ауксина в клетках корончатого галла (Korber et al, 1991). Автора этой работы высказали предположение, что ген бь выполняет сходную функцию в отношении цитокининов. Наш данные не подтверидаиг этого предположения, поскольку в нашем анализе активность регуляторной области гена бъ не изменялась в ответ на на изменение концентрации цитокининов. Однако, опровергнуть это предположение на основании наших результатов мы не можем, поскольку не исследовано влияние продукта самого гена № на активность регуляторной .области этого гена и его взаимодействие с активностью ауксина и цитокинина. В то ке время, наш данные согласуются с высказанным другими исследователями (ТInland et al, 1990) предположением о том,, что роль гена бъ в клетках корончатого галла заключается в уменьшении ингибирувдего эффекта высоких концентраций ауксина, продуцируемого в клетках опухали, на рост этих клеток.

8. Определение органоспециФичнои активности 5'-регуляторной области гена g. проростках-

Мы проанализировали активность gus в 40-дневных проростках, выращенных на среде с канамицином из семян сашошленных первичных трансформантов (в анализ брали по 30 проростков от 6 первичных трансформантов бь-gus и 5 35s-e-gus). Активность gus определяли в корнях, гипокотшшх

а семядолях проростков. Для проростков еъ-gus максимальная активность наблюдалась в корнях - в среднем в 17 раз большая, чем в семядолях, и в 70 раз большая, чем в гипокотилях, где была минимальная активность. В проростках . 35S-e-gus наблюдался иной характер экспрессии - максимальная активность была такие в корнях, но, в среднем, только в полтора раза большая, чем в семядолях, и в 20 раз большая, чем в гипокотилях.

9. Определение активности 5' -регуляторноя области гена 6Ъ в вегетативных органах трансгенйых растения первого поколения и e¿ сравнение с. активностью промотора 355-е.

Мы проанализировали активность gus в различных органах трансгенных растений первого поколения, выращенных in vitro из семян самоопыленных первичных трансформантов до стадии 12 листьев. Было проанализировано 8 независимых трансформантов бъ-gus и 6 независимых трансформантов 35s-e-gus. Результаты приведены на рисунке 9. Было обнаруаено, что 5'-регуляторная область 'гена бъ обеспечивает наибольшую активность gus в корнях, наименьшую - в листьях (активность в корнях на два порядка больше, чем в верхних листьях; в среднем в 50 раз больше, чем в средних листьях, ж на порядок больше,"чем в'старых листьях): Стебли -содержат промежуточное значение активности gus . мы обнаружили базипетальный градиент активности gus в растениях бъ-gus - возрастание активности gus от верхушки к основанию растения. Такой градиент активности наблюдался и в листьях, и в стебле. Его нельзя объяснить просто накоплением активности gus в более старых частях растений, поскольку этого градиента не было обнаружено в растениях 35S-e-gus.

Промотор 35s-e обеспечивал иной характер экспрессии. Наибольшая активность наблюдается в корнях, однако, она в среднем только в 15 раз больше, чем в молодых листьях. Базипетального градиента активности не наблвдалось; напротив, в молодых листьях уровень активности промотора 35S—е выше, чем в зрелых и старых листьях и чем в стебле.

Сравнение активностей 5'-регулягорной области гена бъ (РбЬ) и промотора 35s-e (P35S~ei показывает, что в молодых

- ->n -

nmolMU/(m.in x mg pr.)

35S—e- gus

S1S2 S3 cus в различных

L1L2L3/ | \ R S1S2 S3

Рис. 9. Средние значения активности органах растений бь-gus и 25S-e-gus. L1 - молодой лист (1-й сверху, 2,5-3,5 см длиной), L2 -зрелый лист (5-й или 6-й сверху, 4,5-6,5 см длиной), L3 -старый лист (12-й лист, 3-4 см длиной), si, S2, s3 - секции стебля, взятые из междоузлий под листьями с соответствуищиш номерами, в - корни (корни Орали для анализа целиком). По оси ординат - активность gus, нмольии/(мин х мг белка).

листьях Рбь обеспечивает в среднем в 50 раз меньший уровень экспрессии, чем рззэ-е, в средних листьях - только в 5 раз меньший, а в нижних листьях Рбъ обеспечивает примерно тот же уровень экспрессии, что и Р355-е. в корнях активность РбЬ в среднем „в 7 раз меньше, чем активность Р35Б-е. в верхней части стебля Рбъ и Р35Б-0 обеспечивает примерно одинаковый уровень экспрессии, однако в средней и нижней частях стебля Рбь более активна, чем Р35Е-е, в среднем в. 4 и 3 раза, соответственно.

Значения активности сиз в листьях, показанные на рис. 9, соответствуют активности сиз в листовых пластинках. Для-зрелых листьев мы определили активность о из и в других частях листа - в срединной жилке и в черешке. Оказалось, что зрелые листья растений бъ-гиз имеют наименьшую активность в листовых пластинках, в срединных жилках - в среднем в 5 раз большую активность, и еще в 2 раза большую активность - в черешках. Таким образом, регуляторная область гена бъ более активна в органах, богатых проводящими тканями. Поскольку мы не проводили гистологического определения активности ига, мы не можем утверждать, что тленно в проводящих тканях эта активность максимальна. Другими авторами для ауксин-регулируешх промоторов генов шз и гена '5 было показано, что они наиболее активны - в клетках флоэмы

(Сиэ\гага-Сагс1а, 1993; КогЪег et аХ, 1991). ВЫЛО ВЫСКаЗЭНО предположение, что, поскольку транспорт ауксинов в растении происходит ПО флоэме (Davi.es РЛ., 1987), ЭТО, ВОЗМОЖЕО, И определяет высокую активность ауксин-регулируемых промоторов В этой ТКаНИ (КогЬег et а1, 1991 ).

Обнаруженное нами распределение активности 5'-регуляторной области гена бъ в различных органах трансгенных растений сходно с характером активности других ауксин-стимулируекых и индуцируемых поранением промоторов генов Т-ДНК - гена ПОЭ (Ап е± аХ, 1988) И Ю5 (1-апгг1с18е et аХ, 1989, Guвva.ra-Gaгcia et аХ, 1993). ПрОМОТОрЯ ГвНОВ ПОЗ И шз тоже наиболее активны в корнях трансгенных растений. Для них, как и для гена бъ, в надземных органах - стебле и листьях - характерен базипетальный градиент активности

[возрастание активности от верхушки растения к основании). Таким образом, активность этих промоторов минимальна в верхушке побега, хотя именно верхушка побега является местом синтеза ауксина в растении (Полевой и Салматова, 1991). Исследователи, занимающиеся изучением промотора mas, показали ILangridge et al, 1989), ЧТО В Верхушке ПОбега. синтезируется вещество, ингибируизее индукцию ауксинами активности ras-промотора. Это вещество транспортируется сверху вниз по стеблю, что, как полагают авторы работы, и определяет базипетальный градиент активности mas -промотора.

Агробактерия является почвенным фитопатогеном, заражающим растение в месте поранения. Можно предположить, что характер дифференциальной активности промоторов генов Т-ДНК - наибольшая активность в корнях и низших частях растений - обусловлен тем, что эти части растения являются наиболее вероятным местом заражения агробактерпей в природных условиях. В природе инфекция обычно локализуется на границе корня и стебля,' у корневой шейки (коронки) растения (неслучайно название - "корончатый галл").

10- Определение активности 5'-регуляторноя области гена 5ъ в цветах■

Мы проанализировали активность gus в различных органах " цветков трансгенных растений" - первичных трансформантов-, выращенных в искусственном грунте. Мы определили активность cus в венчике, тычинках, завязи, столбике и рыльце, чашелистиках, а также, для сравнения, в первом от соцветия листе, для 7 независимых трансформантов бь-gus и 6 независимых трансфорлантов 35S-e-gus. Для анализа брали по 3 цветка с каждого растения на 1-2 день после начала пыления. Было обнаружено, что 5'-регуляторная область гена бь обеспечивает высокий уровень экспрессии репортерного гена в различных органах цветков; наибольшую - в венчике, в тычинках и в столбике/рыльце - в среднем в 2 раза ниже. Уровень активности gus в чашелистиках близок к активности в верхнем листе, и на порядок ниже, чем в венчике. Активность Рбъ в завязи едва детектировалась. Промотор 35s-e в цветках менее активен, чем в верхних листьях. Другими

исследователями для промоторов генов nos и mas такие было показано, что они обеспечивают высокий уровень экспрессии в цветках (An et al, 19В8; Langrldge et al, 1989).

Таким образом, нами охарактеризована активность 5'-регуляторной области гена бъ, одного из немногих генов Т-ДНК. 5'-регуляторная область которого не изучалась ранее. Эти данные могут быть полезны прд изучении роли гена бъ в индукции опухоли. Кроме того. 5'-регуляторная область гена бь может быть использована для экспрессии генов в трансгенных растениях.

выводи

1. Клонирована и секвешрована 5'-фланкирупцая область гена бь из TL-ДЙК рГ1Во542 (826 Н.Л.).

2. Показано, что изучаемая регуляторная область гена 6ъ обеспечивает диЗфэретртадьнуа экспрессию репортерного гена gus как в вегетативных, так и в репродуктивных органах трансгенных растений Nicotlana tabacum. Максимальный уровень экспрессии обнаружен в корнях, показано возрастание .активности регуляторной области гена бь от верхушки растеяия к основании. ... ...

3. Проведено сравнение активности 5' -регуляторной области гена бъ и промотора 353-е в различных органах трансгенных растений. Показано, что в верхних и средних листьях и в корнях регуляторная область гена Sï> обеспечивает существенно тенькай уровень экспрессии, чем промотор 253-s, в нижних листьях и в верхней части стебля эта уровня примерно одинаковы, а в средней и низней частях стебля регуляторная область гена бь обеспечивает солее высокий уровень экспрессия, чем проггатор 35s-e.

4. Показано усиление активности регуляторной области гена бъ в ответ на поранение ргстеняя.

5. Исследовано влияние разданных ауксинов и цжгокеншов на уровень экспрессия, обеспечнваегшй регуляторной областью гена бъ. Показано усиление экспрессии в ответ на обработку ауксина?,га и зависимость этого эффекта от типа и концентрации ауксина.

Результаты диссертации излонены в следующих статьи и докладах:

1. Ревенкова Е.В., Дорохов Д.Б., Багян И.Л., Краев A.C., Скрябин К.г. -Исследование структуры tl-ДНК плазвддн рТ1Во542.-Тезисы i Всесоюзного симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", Лущино, 1991, с.36.

2. Ревенкова Е.В., Багян И.Л., Краев A.C., Скрябин К.Г. -Исследование структуры Т-ДНК длазмвды рТ1Во542.-Молекулярная биология, 1993, т.27, вып.1, с.58-63.

3. Багян И.Л., Ревенкова Е.В., Краев A.C., Скрябин К.Г. -Клонирование и определение промоторной активности 5'-фланкирувдей области гена бъ из tl-ДНК рт1во542.-Тезисы il Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, 1993, с.10.

4. Багян И.Л., Ревенкова Е.В., Краев A.C., Скрябин К.Г. -Изучение работы б'-фяанкирувдей области гена бъ из Т-ДНК A.tumeîaclens, участвушцего в регуляции баланса фитогормонов.-Тезисы' 2 Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений а биотехнология", Алма-Ата, 1993, с.84.

5. Багян И.Л., Ревенкова Е.В., Краев A.C., йгоябин К.Г. .-Определение . . вдиящя .фитогормонов на активность 5' -регуляторной области гена бъ из Т-ДНК A.tuasíасleas.-Тезисы конференции "Генетическая инженерия и биотехнология", Минск, 1994, с.6.

6. Багян И.Л., Ревенкова Е.В., Краев A.C., Скрябин К.Г. -Функциональный анализ 5' -фланкирувдой области гена бъ из тх-дак рТ1Во542 в трансгенных растениях табака.-Молекулярная биология. 1994, т. 28, вып.4, с.744-751.

Подписано к печати С (о 199Уг. Отпечатано на ротапринте в Формат бумаги 30x42/4 Производственном комбинате Объем ¿,.01. л. Литературного фонда Зак. ¡Гч, Тир. 1Ш •