Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Встраивание векторных последовательностей в геном трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) и моркови (Daucus carota L.)
ВАК РФ 03.00.15, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Встраивание векторных последовательностей в геном трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) и моркови (Daucus carota L.)"
На правах рукописи
т
Пермякова Наталья Владиславовна
ВСТРАИВАНИЕ ВЕКТОРНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ГЕНОМ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА (.NICOTIANA TABACUML.) И МОРКОВИ (DAUCUS CAROTA L.)
Генетика-03.00 15
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
ООЗ168393
Новосибирск 2008
003168393
Работа выполнена в лаборатории биоинженерии растений Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г Новосибирск
Научный руководитель: доктор биологических наук
Дейнеко Елена Викторовна Институт цитологии и генетики СО РАН, г Новосибирск
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Омельянчук Леонид Владимирович
доктор биологических наук Игнатов Александр Николаевич
Ведущее учреждение: Институт общей генетики им Н И Вавилова, г Москва
Защита состоится 14 05 2008 г на утреннем заседании Диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003 011 01) при Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН по адресу 630090, г Новосибирск, пр академика Лаврентьева, 10 Факс (383) 333-12-78, e-mail dissov@bionet nsc ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН
Автореферат разослан 2008 i
Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук
АД Груздев
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Развитие и совершенствование методов генетической инженерии, а также разработка методов переноса генетического материала в растительную клетку и методов восстановления в условиях in vitro из отдельных клеток полноценных трансформангов, позволило модифицировать геномы многих видов растений Технология создания трансгенных растений основана на переносе генов из различных гетерологичных систем (вирусов, микроорганизмов, животных, человека), поэтому трансгенные растения можно рассматривать как яркий пример преодоления физических, эволюционных и генетических барьеров, изолирующих геномы различных организмов (Miki, McHugh, 2004) Недостатком метода агробактериальной трансформации являются случайные ошибки при процессинге Т-ДНК, в результате которых в растительный геном могут быть интегрированы фрагменты векторной ДНК (ДНК, лежащей за пределами концевых повторов) (Ramanathan, Veluthambi, 1995, van der Graaff et al, 1996, Wenck et al, 1997, De Buck et al, 2000)
К настоящему времени накоплены экспериментальные данные о встраивании векторной ДНК не только в геном двудольных трансгенных растений При агробактериальной трансформации фрагменты векторной ДНК обнаруживались и в геноме однодольных растений, а также в геномах грибов и дрожжей (Olhoft et al, 2004, Lange et al, 2006, Kim et al, 2003, Michielse et al, 2004, Bundock et al, 2002)
С коммерческой точки зрения перенос векторных последовательностей в геномную ДНК трансгенных растений представляется крайне нежелатечьным Содержащиеся в плазмидной ДНК повторы, палиндромы, А-Т-богатые участки, orí репликации, содержащиеся в векторной ДНК, способны провоцировать перестройки трансгена (Muller et al, 1999, Linden et al, 1996) Множественные повторы, C-G богатые прокариотические участки могут метилироваться и вызывать метилирование трансгена, нарушая тем самым его экспрессию (Meza et al, 2002, Matzke et al, 1996, Iglesias et al, 1997, Jakowitsch et al, 1999) Мультимеризованные комплексы, состоящие из нескольких копий Т-ДНК разделенных фрагментами векторной и растительной ДНК, мейотически нестабильны, что может привести к эксцизии трансгена (Snvastava et al, 1996) Присутствие векторных последовательностей затрудняет исследование прилежащих к Т-ДНК участков растительной ДНК и выявление растительных генов, функция которых была нарушена в результате встройки чужеродной инсерции С точки зрения биобезопасности трансгенные растения не должны содержать генов устойчивости к антибиотикам и других «посторонних» фрагментов ДНК, которые могут быть перенесены вместе с векторной ДНК В то же время, перенос векторных последовательностей, по-видимому, является частью механизма агробактериальной трансформации, что необходимо принимать во внимание при получении трансгенных растений
На основе изучения феномена встраивания векторных последовательностей разработаны рекомендации для создания различных генетических конструкций, позволяющих избежать встраивания как фрагментов вектора, так и маркерных генов (Sugita et al, 2000, Hanson et al, 1999, Podevm et al, 2006, Vain et al, 2003, Coutu et al, 2007, Kondrak et al, 2006, Conner et al, 2007)
l
Понимание феномена встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений может внести существенный вклад в решение фундаментальных задач В ряде работ авторами выявлены новые детали механизма процессинга Т-ДНК и взаимодействия белков, участвующих в процессинге (Ramanathan Veluthambi, 1995, Wenck et al, 1997, Yin, Wang 2000, De Buck et al, 2000, McCormac et al ,2001, Michielse et al, 2004, Podevrn et al, 2006) Однако, несмотря на очевидный прогресс данного научного направления, остается еще много неясных вопросов Поэтому изучение феномена встраивания векторных последовательностей в геном трансгенных растений, исследование механизмов встраивания таких фрагментов, а также изучение спектра факторов, влияющих на частоту встраивания векторных фрагментов у различных видов трансгенных растений, представляется чрезвычайно актуальным
Цель и задачи настоящего исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение частоты и особенностей встраивания векторных последовательностей у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L ) и моркови (Dauciis carota L ) Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи
1 Провести ПЦР-анализ на присутствие различных участков векторной последовательности мегаплазмиды A tumefaciens у трансгенных растений табака и моркови
2 Подтвердить наличие векторных последовательностей в геномных ДНК анализируемых трансгенных растений посредством секвенирования районов ДНК, прилежащих к Т-ДНК-инсерциям
3 Установить количество копий Т-ДНК в исследуемых трансгенных растениях методом Саузерн блот гибридизации
4 Установить характер взаиморасположения фрагментов векторной, растительной и Т-ДНК для отдельных растений, несущих несколько фрагментов векторной ДНК
5 Проанализировать наследование векторных фрагментов в Трпоколении трансгенных растений
Научная новизна и практическая ценность. Настоящая работа направлена на изучение особенностей встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений табака и моркови, а также на выявление частотных характеристик исследуемого явления у двух видов растений и анализ сохранения фрагментов векторных ДНК среди потомков на примере трансгенных растений табака Охарактеризована популяция независимо полученных трансформантов табака и моркови по наличию в геноме фрагментов векторных ДНК, установлено долевое соотношение групп растений с различными видами фрагментов Установлено, что для трансгенных растений табака доля растений, в геноме которых были выявлены фрагменты векторных ДНК, составила 35 2%, а для трансгенных растений моркови - 34 9% В сумме для трансгенных растений табака и моркови доля растений, в геноме которых выявлялись фрагменты векторных ДНК различной конфигурации, составила 35 1%
Следует отметить, что отсутствие различий по частоте встраивания векторных фрагментов между различными видами трансгенных растений отмечено в литературе (Wenck et al, 1997) Однако в работе Венк выявлялась
значительно более высокая частота встраивания векторной ДНК в геном трансгенных растений табака и арабидопсиса (60% и 62% соответственно) Более того, даже если рассматривать работы различных групп исследователей на одном виде трансгенных растений (Л' ¡а'оасит), вариабельность частот встраивания достаточно высокая, от 1,3% (Натапа&ап, Уе1иЛатЫ, 1995) до 75,0% (Копопоу е? я/, 1997) Эти данные свидетельствуют о существовании неизвестных пока факторов влияющих на частоту встраивания векторных фрагментов и безусловно требуют дальнейшего изучения
Выявлен широкий спектр вариантов взаиморасположения векторных фрагментов в геноме анализируемых трансгенных растений, представленный 20 вариантами Среди растений, содержащих в геномной ДНК векторные фрагменты различной длины, интегрированные независимо от Т-ДНК выявлено два растения (табак и морковь), несущих не только фрагмент вектора, интегрировавшийся в растительный геном независимо от Т-ДНК, но также и фрагмент вектора, прилежащий к левому концевому повтору Т-ДНК Такие растения были выявлены впервые Чрезвычайный интерес представляет механизм образования такого сочетания Т-ДНК и векторных фрагментов В данном случае могло иметь место одновременно неправильное определение концевых повторов, а также и реорганизация (делеция) векторной ДНК в процессе ее транспорта и интеграции в растительный геном Дальнейшее изучение данных растений представляет несомненный интерес для более детального понимания молекулярно-генетических механизмов встраивания векторной ДНК Полученные результаты представляют большое значение для дальнейших фундаментальных и прикладных исследований по изучению механизмов агробактериального инфицирования растений
Установлено, что векторные последовательности не только могут быть перенесены в геном потомков первого поколения от самоопыления, но могут рекомбинироватъ и сегрегировать как обычные гены растений Хотя ранее предполагалось, что мультимерные комплексы, состоящие из нескольких копий Т-ДНК перемежающихся векторной и растительной ДНК, мейотически нестабильны, и, соответственно, в последующих поколениях растений может произойти их эксцизия и потеря трансгена (Snvastava е( а/, 1996)
Полученные результаты представляют большое значение при разработке и уточнении правил по биобезопасности использования генетически модифицированных организмов
Данные, полученные в ходе исследования, используются при чтении лекций в курсе «Генетическая инженерия растений» в Томском государственном университете
Положения выносимые на защиту.
1 В геномную ДНК трансгенных растений табака и моркови, полученных методом агробактериального переноса, могут быть встроены нежелательные последовательности векторной ДНК, лежащей за пределами концевых векторных повторов Т-ДНК Векторные последовательности могут быть различной длины и по разному ориентированы относительно Т-ДНК
2 Векторные последовательности, встроившиеся в геном трансгенных растений, становятся резидентной частью генома и могут быть выявлены среди потомства
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на следующих конференциях в виде устного доклада на международной научной конференций «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Минск, 24-26 ноября 2004, где доклад был удостоен диплома «За высокопрофессиональный доклад», на Дальневосточной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, 16-23 сентября 2005 г, МЭС ТИБОХ, на школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной генетики» при Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им Н И Вавилова РАН Москва, 28 июня - 2 июля 2006 г, в виде устного доклада на международной конференции «Достижения и проблемы генетики, селекции и биотехнологии», посвященной 40-летию основания Украинского общества генетиков и селекционеров и 120-летию со дня рождения Н И Вавилова, Алушта, 24-27 сентября 2007 года Материалы диссертационной работы были представлены в виде устных докладов на отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН в 2004,2007 г г
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 2 в российских рецензируемых журналах Одна работа находится в печати
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (117 наименований) Работа изложена на 98 страницах, включает 14 рисунков и 8 таблиц в тексте диссертационной работы
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исходным материалом служили трансгенные растения табака Nicotiana tabacum L и моркови Daucus carota L , полученные в лаборатории ранее Для получения трансгенных растений табака использовали линию SR1 (семена любезно предоставлены доктором Р Менделем, Институт генетики и растительных ресурсов (IPR), Гатерслебен, Германия) Для получения трансгенных растений моркови использовали семена моркови сорта «Нантская» (семена любезно предоставлены Шмыковой Н А, ВНИИСОК РАСХН, Москва) Трансформанты табака получали стандартным методом агробакгериальной трансформации листовых дисков по стандартной методике (Дрейпер и др, 1991) с использованием штамма A tumefaciens С58С1 Rií^ (PGV 2260) (Deblaere et al, 1987) Трансформанты моркови получали методом агробактериальной трансформации каллусов (Yakushenko et al, 2006), с использованием штаммов А tumefaciens С58С1 (Deblaere et al, 1987), GV2260 (McBride, Summerfelt, 1990), AGL-1 (Lazo, et al, 1991), LBA4404 (Hoekma et al, 1983), штаммы получены из Центра Биоинженерии РАН (Москва). Для трансформации табака были использованы различные типы генетических конструкций, сконструированных в секторе генной инженерии растений ИЦиГ СО РАН М В Пилюгиным и к б н А В Кочетовым (1991-1995 гг) Для трансформации моркови была использована
генетическая конструкция, сконструированная в лаборатории А А Турчиновичем с соавторами (патент РФ №2302460)
Выделение геномной ДНК из листьев табака проводилось с помощью ЦТАБ-буфера (Rogers, Bendich, 1985, с модификациями)
Гибридизацию ЕсоШ и Я/ткЯП-гидролизатов ДНК трансгенных растений проводили по методу Саузерна с модификациями (Дрейпер и сотр, 1991)
Для установления частоты встраивания векторных последовательностей в геном трансгенных растений проводились ПЦР с различными праймерами Праймеры на фрагмент векторной ДНК, прилежащий к правому концевому повтору Т-ДНК BDI 5'-acgtgaaacccaacataccc-3' и BD2 5'-atgtgcatgccaaggacag-3' Праймеры на фрагмент векторной ДНК, прилежащий к левому концевому повтору Т-ДНК BD3 5'-gatacaggcagcccatacgtc-3' и BD4 5'-tagcgccactcagcttcctcag-3' Праймеры на фрагмент векторной ДНК, находящийся в середине векторной последовательности, ближе к левому концевому повтору BD5 5'-gcaatgaagtcggtccc-З' и BD6 5'-gccgacaagtggtatgac-3' Праймеры на фрагмент векторной ДНК, находящийся в середине векторной последовательности, ближе к правому концевому повтору Т-ДНК BD7 5'-cgccatgaagtccgtgaatg -3' и BD8 5'-agttatgccgtcccgtgaat -3' Праймеры на фрагмент векторной ДНК, находящийся в середине векторной последовательности, ближе к левому концевому повтору Т-ДНК BD9 5'-ctgacgccgttggatacac-3' и BD10 5'-taatggcggaaactcactcg-3', размер фрагмента 419 пн
Для подтверждения трансгенного статуса, а также наличия в исследуемых образцах геномной ДНК соответствующих растений табака и моркови, одновременно в реакциях амплификации участвовали следующие типы праймеров - на ген nptll nptl 5'-cgacgttgtcactgaagcg-3' и npt2 5'-aagcacgaggaagcggtcag-З', на хозяйский ген NtGA2 табака NtGAl 5'-acagttgcccttgcttatcgc-З' и NtGA2 5' - ttcaacacgaacggaacagac-3', на хозяйский ген экстенсина моркови carl 5'- acctcctcctcctcaccactac- 3' и саг2 5'-taagttggcctccatcagtgtc- 3'
Для того чтобы исключить присутствие в анализируемых образцах почвенной бактерии A tumefaciens, дополнительно проводился ПЦР с праймерами на фрагмент ДНК A tumefaciens А.\ 5'-catgctcggccggctgaca-3\ А2 5'-tgcgcaggtcgcttgcttc-З'
Клонирование и секвенирование фрагментов векторной ДНК проводилось модифицированным методом «инвертированной» ПЦР (Ochman, 1990) Праймеры, использованные для секвенирования BDI 1 5'-taacgcgcaagttttcagcg-3', BD3 1 5'-tggcgtaatagcgaagaggc-3\ pbil 5'-gacctgcagtctcatattcactctcaatcc-3\ pbi2 5'-gatggatccataaattcccctcggtatcca-3\ pbi3 5'-gacctgcagtcgtttcccgccttcagt-3\ pbi4 5'-gatggatccttaattctccgctcatgatc-3', pbi5 5'-gacggatccactacgtgaaccatcac-3', pbi6 5'-cacggatccgtctatcagggcgatgg-3', pbi7 5'-gacggatccaacgtccgcaatgtgttattaag-3', pbi8 5'-cacaagcttgcccgtctcactggtga-3'
Нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов ДНК определяли с использованием «ABI PRISM Big Dye Terminator v3 0 Ready Reaction Cycle Sequencmg Kit» (Amersham, UK) в межинститутском центре секвенирования (ИХБиФМ СО РАН) Полученные с помощью секвенирования последовательности ДНК были проанализированы методом BLAST по базе
данных GenBank. О степени сходства (различия) состава нуклеотидных последовательностей фрагментов, прилежащих к одному и тому же краевому повтору, для растения 16.83 судили на основании выравнивания, построенного при помощи программы ClustalW.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Анализ частоты встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений
На рисунках 1 и 2 представлены электрофореграммы разделения продуктов амплификации геномной ДНК трансгенных растений табака. На рисунке 1 представлена электрофореграмма разделения продуктов амплификации геномной ДНК трансгенных растений табака с праймерами BDI/2, BD3/4 и BD5/6 (электрофореграммы разделения продуктов амплификации геномной ДНК моркови, выглядят аналогично, за исключением фрагмента именно геномной ДНК моркови). В каждой реакции амплификации участвовало одновременно три пары праймеров. Фрагменты геномной ДНК, обозначенные на дорожках бухвой "а", соответствуют гену NtGA2, что подтверждает наличие в образцах геномной ДНК из растений табака. Продукты амплификации, обозначенные на дорожках буквой "б", соответствуют маркерному гену nptll, что свидетельствует о трансгенном статусе анализируемых растений. Продукты амплификации, обозначенные буквами "в", "г", "д", соответствует фрагментам векторной ДНК: "в" - фрагменту BD 1/2, "г" - фрагменту BD5/6, "д" - фрагменту
Рис. 1. Взаиморасположение фрагментов, получаемых в результате ПЦР реакции и их последующего разделения
методом электрофореза в 6% акриламидном геле. Обозначения: а - фрагмент гена NtGA2 из генома табака; б - фрагмент гена nptll;
в - векторный фрагмент BD1/2; г - векторный фрагмент BD5/6; д - векторный фрагмент BD3/4. Дорожки: 1 - ДНК нетрансгенного растения табака линии SRI; 2 - ДНК трансгенного растения Res 36; 3 - 5 - ДНК трансгенного растения 16.22; 6 - ДНК плазмиды pBi 121; 7 - отрицательный контроль, без матрицы; 8 - маркер pBlueskript/wäpI, указана длина каждого фрагмента.
На рисунке 2 представлена электрофореграмма разделения продуктов амплификации геномной ДНК трансгенных растений табака с праймерами BD7/8 и BD9/10. Фрагмент геномной ДНК, обозначенный на дорожке буквой «а», соответствует гену NtGA из генома табака. Продукты амплификации, обозначенные на дорожке буквой «в», соответствуют маркерному гену nptll. Продукты амплификации, обозначенные буквами «б» и «г», соответствуют фрагментам векторной ДНК («б» - фрагменту BD7/8, «г» - фрагменту BD9/10).
BD3/4,
■ Щ ЧЁ §ä > 1 г
H-J Iii
Рис. 2. Взаиморасположение фрагментов, получаемых в результате ПЦР реакции и их последующего разделения методом электрофореза в 6% акриламидном геле. Обозначения: а - фрагмент гена NtGA из генома табака; б - векторный фрагмент BD7/8; в - фрагмент гена nptll\
г - векторный фрагмент BD9/10. На дорожках 1-3 продукты амплификации с праймерами на векторный фрагмент BD7/8: 1 - ДНК трансгенного растения табака Res79; 2 - ДНК нетрансгенного растения табака, линии SRI; 3 -положительный контроль, ДНК плазмиды pBil21. На дорожках 4-6 продукты амплификации ПЦР с праймерами на векторный фрагмент BD9/10: 4 - ДНК трансгенного растения табака Res60; 5 - ДНК нетрансгенного растения табака; 6 -положительный контроль, ДНК плазмиды pBil21; 7 - отрицательный контроль, без матрицы; 8 - маркер pBlueskript/mypI, указана длина каждого фрагмента.
При тестировании анализируемых образцов с праймерами на фрагмент ДНК почвенной бактерии A.tumefaciens ни в одном растении не было выявлено последовательностей агробактерии, что подтверждало отсутствие агробактерии в межклетниках исследуемых растений.
Для растений моркови 33/2 и 106, а также для растения табака 16.83 встраивание векторных последовательностей было подтверждено с помощью секвенирования. Выравнивание методом BLAST последовательностей ДНК, прилегающих к левому краевому повтору, секвенированных из растений 16.83 и 106, с базой данных GenBank показало гомологию 99% с участком плазмиды pBil21. Выравнивание для растения табака 16.83 представлено на рисунке 3.
16.83 7 GGATATATTGGCGGGTAA-CCTAAGAGAAAAGAGCGTTTATTAGAATAATCGGA.TATTTA 65
I 1 I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I II II I I I I I I I I I I I I I III I I I I I I I I I I I I I I II
рВ121 8696 GGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTITATTAGAATAATCGGiTATTTA 8755
16.83 66 AAAGGGCGTGAaAAGGTTIATCCSTTCGTCCATTTGTATGIGCATGCCAACCACAGGGTT 125 I II I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I
pB121 8756 AAAGGGCGTGAAAAGGTTTATCCGTTCGTCCATTTGTATGTGCATGCCAACCACAGGGTT 8815 16.83 126 CCCCAGATCTGGCGCCGGCCAGCGAGACGAGCAAGATTGGCCGCCGCCCGAAACGATCCG 185
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I III I I I I III I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I
pB121 8816 CCCCAGATCTGGCGCCGGCCAGCGAGACGAGCAAGATTGGCCGCCGCCCGAAACGATCCG 8875
16.83 186 ACAGCGCGCCCAGCACAGGTGCGCAGGCAAATTGCACCAACGCATACAGCGCCAGCAGAA 245
II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ¡11 I I pB121 8876 ACAGCGCGCCCAGCACAGGTGOGCAGGCAAATTGCACCAACGCATACAGCGCCAGCAGAA 8935
Рис. 3. Выравнивание последовательностей плазмиды pBil21 и последовательности, взятой из трансгенного растения табака 16.83.
Общее число проанализированных трансгенных растений составило 114, из которых 71 были представлены трансгенными растениями табака и 43 -трансгенными растениями моркови.
Все трансгенные растения табака были трансформированы с использованием штамма агробактерии pGV2260. Для трансформации табака было использовано 4 типа векторов, созданных на основе плазмид pBil21 (pBi-
(01и)2-Я - линия 10, 20 растений, рВ1-(С1и)2-0 - линия 16, 21 растение, неизмененная рВ1121 - линия 121, 24 растения) и рВ1101 (линия Иет, 6 растений) Векторные фрагменты различной длины были выявлены у 25 (35,2%) трансгенных растений табака
Среди 71 трансгенного растения табака 13 несли различные инсерционные мутации С использованием критерия %2 была проверена гипотеза о существовании корреляции между встраиванием векторных фрагментов и возникновением инсерционных мутаций Достоверных различий между группами трансгенных растений табака, содержащих и не содержащих инсерционные мутации, выявлено не было = 0,074) Следовательно, возникновение инсерционных мутаций в нашем случае не зависело от частоты встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений
Растения моркови были трансформированы с использованием различных штаммов агробакгерии - 7 растений со штаммом АйШ, 11 растений со штаммом рСУ2260, 25 растений со штаммом ЬВА 4404 Все растения моркови были трансформированы с использованием вектора рВ1101, содержащим целевой ген интерлейкина 18 человека Векторные фрагменты различной длины были выявлены у 15 (34,9%) трансгенных растений моркови
Вся последовательность использованной дтя трансгенеза растений плазмиды рВ1121 составляет 14758 пн Плазмида рВ1101 отличается от плазмиды рВ:121 организацией района Т-ДНК, векторные участки у обеих плазмид имеют одинаковое происхождение и не отличаются между собой Общая длина векторной (не-Т-ДНК) последовательности составляет 8600 пн Правый и левый краевые повторы Т-ДНК в плазмиде рВ1121 находятся на позициях 2454-2478 пн и 8621-8646 пн соответственно За пределами краевых повторов Т-ДНК находятся 8 генов (размером от 272 пн до 1482 пн) и 2 оп репликации Следовательно, даже самые малые фрагменты векторной ДНК могут нести плазмидный ген.
Достоверные различия с использованием критерия у} между группами трансгенных растений табака и моркови по частоте встречаемости фрагментов векторной ДНК не выявлялись (%2 = 0,001), что послужило основанием объединения в таблицах 1 и 2 результатов по двум выборкам В таблицах 1 и 2 приведены данные распределения векторных последовательностей у 114 независимо полученных трансгенных растений табака и моркови с праймерами В01/2, ВБЗ/4, ВБ5/6, ВБ7/8, В09/10 Всего было выявлено 20 типов фрагментов векторной ДНК Векторные последовательности были обнаружены у 41 из 114 проанализированных растений, что составило 35,1%
В таблице 1 представлены данные, отражающие особенности встраивания фрагментов плазмидной ДНК, прилежащих к правому и левому краевым повторам Т-ДНК
По результатам исследования было выявлено 6 растений, несущих вСе исследуемые фрагменты вектора, что составило 5,2% от общего числа растений
Всего было выявлено 13 растений, несущих участок вектора, прилежащий к левой границе Т-ДНК, что составило 11,4% от общего числа проанализированных растений Среди них было выявлено 6 растений (5,2%), содержащих фрагмент векторной ДНК длиной от 3200 пн до 5200 пн (ВБЗ/4,
BD5/6) Четыре растения (3,5%) содержали небольшой участок вектора длиной от 400 пн до 2900 пн (BD3/4) Два растения (1,8%) содержали протяженную векторную последовательность длиной от 7220 пн до 7930 пн (BD3/4, BD5/6, BD7/8, BD9/10) Одно растение (0,9%) содержало участок вектора длиной от 5820 пн до 6800 пн (BD3/4, BD5/6, BD7/8) Растений, несущих участок вектора, прилежащий к правой границе Т-ДНК, было выявлено 5, что составило 4,5% от общего числа проанализированных Среди них было выявлено 3 (2,6%) растения, несущих короткий фрагмент вектора, длиной от 600 пн до 1380 пн (BD1/2) Выявлено одно растение (0,9%), несущее фрагмент вектора средней длины от 1780 пн до 2790 пн (BD1/2, BD9/10) и одно растение (0,9%), несущее фрагмент вектора длиной от 5700 пн до 8150 пн (BD1/2, BD9/10, BD7/8, BD5/6)
Таблица 1 Сводная таблица Распределение векторных последовательностей,
прилежащих к границам Т-ДНК в геномах трансгенных растений табака и _моркови_
Доля трансгенных растений, несущих различные фрагменты векторной ДНК,% Фрагменты ДНК, выявленные с использованием следующих пар праймеров Расположение векторных последовательностей относительно Т-ДНК
BD 3/4 BD 5/6 BD 7/8 BD 9/10 BD 1/2
5,2% (6») LlStLi'" CLJS;-,, n ff. mvMJBf^^i Вся векторная последовательность L В DM ВПЬв 807« BDOHG BD1f?
1,8% (2) ^ . »А, i-i * . Векторная последовательность, прилежащая к левой границе Т-ДНК | В^В ^га
0,9% (1)
5,2% (6) 1
3,5% (4) 1
Всего 11,4% (13) растений
0,9% (I) - + j - " +,l '4-. Векторная последовательность, прилежащая к правой границе Т-ДНК BOS/1!) BOI/2 В Г- СМ1
0,9% (1) ■h *
2,6% (3)
Всего 4,4% (5) растений
0,9% (1) Векторные последовательности прилежащие как к левой, так и к правой границе Т-ДНК впаяп ВП1-7 Я ____________L ВГМ ИГЛ«
0,9% (1) L
2,6% (3)
1,8% (2) ,> 4 -i X-jf ••[:
0,9% (1) -' " i i!
Всего 7,0% (8) растений 801/3 Я L И L ВОН
Всего 28,1% (32) из 114 проанализированных растений
*- в скобках указано число растений, несущих тот или иной фрагмент
Векторные последовательности, прилежащие как к правой, так и к левой границам Т-ДНК, были выявлены у 8 растений (7,0%) в 5 различных вариантах (табл 3 2) У 3 растений (2,6%) размер фрагмента, прилежащего к левой границе Т-ДНК (ВБЗ/4 и ВБ5/6), составил от 3200 пн до 5200 пн. и размер фрагмента, прилежащего к правой границе Т-ДНК (ВБ1/2, В09/Ю) составил от 1780 пн до
2790 пн Выявлено два растения (1,8%), несущих два фрагмента векторной последовательности, один из которых, размером от 400 пн до 2900 пн (ВБЗ/4), обнаружен у левой границы Т-ДНК, и второй, размером от 3330 пн до 5350 пн (ВО 1/2, ВБ9/10, В07/8) - у правой границы Т-ДНК Также выявлено 1 растение (0,9%), несущее 2 фрагмента вектора, один из которых прилежит к левой границе Т-ДНК (ВОЗ/4, ВБ5/6, В07/8), длиной от 5820 пн до 6800 пн, а второй прилежит к правой границе Т-ДНК (В01/2), длиной от 600 пн до 1380 пн Еще 1 растение (0,9%) включало два других фрагмента векторной последовательности, один из которых, длиной от 3200 пн до 5200 пн (ВОЗ/4, ВБ5/6), прилежит к левому краевому повтору, а второй длиной от 600 пн до 1380 пн (ВЭ1/2), прилежит к правому краевому повтору Выявлено 1 растение (0,9%), несущее следующие фрагменты векторной ДНК фрагмент длиной от 400 пн до 2900 пн (ВБЗ/4), прилежащий к левому краевому повтору, и фрагмент длиной от 1780 пн до 2790 пн (ВБ1/2, В09/10), прилежащий к правому краевому повтору
Таблица 2 Распределение векторных последовательностей, встроившихся в геном трансгенных растений табака и моркови, независимо от Т-ДНК
Доля трансгенных растений, несущих различные фрагменты векторной ДНК,% Фрагменты ДНК, выявленные с использованием следующих пар праймеров' Расположение векторных последовательностей относительно Т ДНК
ВОЗ/4 В05/6 В 07/8 В09/Ю ВШ/2
0,9% (1*) + + + Векторные последовательности, прилежащие к левой границе Т-ДНК и фрагмент вектора, встроившийся независимо
0,9% (1)
+
Всего 1,8% (2) растений 1 1-о-<> -<>
1,8% (2) + Фрагменты вектора, встроившиеся независимо от Т-ДНК 607/8
0,9% (1) ' +
0,9% (1) + +
0,9% (1) +
0,9% (1) + + +
Всего 5,2% (6) растений
Всего 7,0% (8) из 114 исследованных растений
*- в скобках указано число растений несущих тот или иной фрагмент
В таблице 2 представлены частоты встраивания фрагментов вектора независимо от Т-ДНК По результатам нашего исследования было выявлено 8 растений, несущих фрагмент вектора, встроившийся независимо от Т-ДНК, что составило 7,0% от общего числа растений Среди них было выявлено 2 растения (1,8%), содержащих кроме фрагмента векторной последовательности, прилежащего к левому краевому повтору, еще и последовательность вектора, встроившуюся независимо от Т-ДНК. Одно растение (0,9%) содержало конструкцию, состоящую из участка вектора, прилежащего к левому краевому повтору, длиной от 3200 пн до 5200 пн (ВОЗ/4, В05/6), и участка плазмидной последовательности, встроившегося независимо от Т-ДНК, длиной от 420 пн до 2200 пн (ВБ 9/10) Второе растение несло конструкцию, состоящую из фрагмента плазмидной ДНК, прилежащего к левому краевому повтору, длиной от 400 пн до
2900 пн (BD3/4) и участка векторной ДНК, встроившегося независимо, дайной от 420 пн до 2200 nH(BD9/10)
Растений, содержащих только один фрагмент векторной ДНК, встроившийся независимо от Т-ДНК, выявлено 6 (5,2%) Из них 2 (1,8) содержали участок векторной ДНК длиной от 330 пн до 4750 пн (BD5/6) Еще одно растение (0,9%) содержит большой участок векторной ДНК длиной от 4300 пн до 7500 пн (BD5/6, BD7/8, BD9/10) Также по одному растению (0,9%) содержали либо фрагмент векторной ДНК длиной от 560 пн до 3570 пн (BD7/8), либо фрагмент векторной ДНК длиной от 2500 пн до 4760 пн (BD7/8, BD9/10), либо фрагмент векторной ДНК длиной от 2930 пн до 6350 пн (BD5/6, BD7/8)
По данным литературы частота переноса векторных последовательностей в геном трансгенных растений сильно варьирует У двудольных частоты встраивания векторных последовательностей варьируют весьма значительно от 1,3% у Nicotiana tabacum (Ramanathan Veluthambi, 1995) до 90,0% y Fragaria ananassa (Abdal-Aziz et al, 2006) У однодольных растений процент переноса векторных последовательностей примерно одинаков и составляет по различным источникам около 30,0% (Martineae et al, 1994, Ym, Wang, 2000, Fang et al, 2001) Однако, у различных видов трансгенных растений, исследуемых в одном эксперименте, частота встречаемости векторных последовательностей от вида к виду обычно не различается (De Buck et al, 2000, Wenck et al, 1997) Это подтверждается и нашими исследованиями. Полученная нами частота встраивания векторных последовательностей достоверно не отличалась у двух видов исходных трансгенных растений Данные свидетельствуют о том, что в каждом третьем случае (35,1%) в трансгенное растение может переноситься и встраиваться не только Т-ДНК, но и фрагменты плазмидной ДНК
Присутствие в трансгенных растениях всех исследуемых векторных фрагментов (5,2%) может свидетельствовать о встраивании всей векторной последовательности целиком Образование такого фрагмента могло произойти в результате ошибки узнавания либо левого, либо правого концевых повторов Однако такая картина может сложиться и при наличии в одном растении нескольких Т-ДНК встроек, содержащих усеченные фрагменты векторной последовательности, сочетание которых дает при ПЦР анализе все три исследуемые фрагмента По данным литературы частота встраивания всей векторной последовательности варьирует от 38,6% (Kim et al, 2003) до 6,8% (van der Graaff, 1996) и 8,0% (de Buck, 2000) В ряде работ (Miranda, 1992, McCormac et al, 2001, Kuraya et al, 2004) выдвигается предположение, что иногда синтез ниш Т-ДНК не останавливается на левой границе Т-ДНК, а продолжается дальше, «проскакивая» левый концевой повтор, в результате чего синтезируется вся последовательность плазмиды Более того, при «проскакивании» также и правого концевого повтора может снова начаться синтез Т-ДНК В таком случае в геноме трансгенного растения будет выявлено две копии Т-ДНК, соединенных между собой векторной последовательностью (Wenck et al, 1997)
Мы предполагаем, что большая часть этих фрагментов действительно образуется вследствие ошибки определения левого краевого повтора В пользу этого предположения свидетельствует то, что из всех 41 (35,1%) обнаруженных нами растений, несущих векторные фрагменты, 23 (20,2%) несли векторные
и
фрагменты, прилежащие клевому концевому повтору и только 13 (11,4%) несли векторные фрагменты, прилежащие к правому концевому повтору Более того, среди растений, содержащих векторную последовательность, прилежащую к левому концевому повтору, выше разнообразие схем встраивания (12 схем, таблицы 1 и 2), чем у растений, содержащих векторную последовательность, прилежащую к правому концевому повтору (8 схем, таблицы 1 и 2) Полученные результаты дают основание сделать вывод, что растения, несущие фрагменты вектора, прилежащие к левому концевому повтору, как и растения, несущие все пять векторных фрагментов, образуются в результате ошибок определения левого концевого повтора при процессинге Т-ДНК Полученные нами данные согласуются с данными литературы о том, что осуществление точного надреза в области правого концевого повтора является важным этапом процессинга Т-ДНК (Tinland 1996, Meza et al, 2002, Podevin et al, 2006) По крайней мере, одно из трансгенных растений (Res 66), несущих все векторные фрагменты, несет только одну копию Т-ДНК, соответственно мы полагаем, что в данном случае произошло именно встраивание всей последовательности вектора, прилежащей к левому краевому повтору Т-ДНК
Векторные последовательности могут переноситься не только вместе с Т-ДНК, но и независимо от нее (Ramanathan, Veluthambi, 1995, Kononov et al, 1997, De Buck et al, 2000, Ym, Wang, 2000) При исследованиях трансформантов риса было выявлено 4,9% растений, содержащих только фрагмент, происходящий из средней части вектора, и не содержащих при этом последовательностей вектора, прилежащих к границам Т-ДНК (Ym, Wang 2000) Предполагается, что такой фрагмент был перенесен и встроен независимо от Т-ДНК (Yin, Wang, 2000) В нашем исследовании таких фрагментов было выявлено в два раза больше, то есть 8, что составило 7,0% Предполагаемый механизм образования подобных конструкций следующий при процессинге Т-ДНК белок VirD2 после разрезания нити ДНК тесно связан не только с 5' концом Т-нити, но и с 5' концом не-Т-ДНК-овой части векторной последовательности Таким образом, белок VirD2 может инициировать перенос векторной части плазмиды, также как и Т-ДНК (De Buck et al, 2000) Можно предположить, что частота переноса векторных фрагментов, независимых от Т-ДНК, при агробактериальной трансформации может быть еще выше Так как часть трансформированных растений может нести только фрагмент вектора и не нести Т-ДНК, то при селективном отборе эти растения будут элиминированы
Высоким оказалось также и число растений, содержащих два фрагмента векторной последовательности Таких растений было выявлено 10, причем 8 из них несли последовательности вектора, прилежащие как к правому, так и к левому краевым повторам В данном случае возможно несколько вариантов расположения участков вектора, они могут как окружать одну копию Т-ДНК, так и прилежать к нескольким копиям Т-ДНК, встроившимся в геном растения независимо друг от друга Среди растений, содержащих два различных фрагмента Т-ДНК, были выявлены как растения, содержащие 1 копию Т-ДНК (121,83 и 121,86), так и растения, содержащие 2 копии Т-ДНК (16,22 и 16,83) Таким образом, мы считаем, что могут иметь место все возможные способы
взаиморасположения векторных фрагментов относительно Т-ДНК, которые будут более подробно рассмотрены в следующем разделе.
2. Особенности встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных
Часть выявленных нами растений, несущих несколько фрагментов векторной ДНК, была исследована более детально.
Растение 16.83, как и растение 16.22, несет два фрагмента векторной последовательности, которые прилежат как к левому, так и к правому концевым повторам, при исследовании методом Саузерн блот гибридизации у этих растений в геномной ДНК было выявлено две копии Т-ДНК (рис. 4, дорожки 16.83 и 16.22).
16.83 16.22 121.83 121.86
Для растения 16.83 просеквенированы участки ДНК, прилежащие к концевым повторам Т-ДНК. При выравнивании 4 фрагментов ДНК, прилежащих к левому краевому повтору Т-ДНК, было выяснено, что они делятся на две группы (1, 2, 3 и 4). При поиске гомологичных последовательностей по базе данных, последовательности 1, 2 и 3 дают устойчивую гомологию с векторными последовательностями. Последовательность 4 не обнаруживает гомологии с векторными последовательностями, зато гомологична последовательностям из растительного генома. Последовательность ДНК растения 16.83, прилежащая к правому краевому повтору, показывает устойчивую гомологию с векторными последовательностями.
Исходя из этих данных, для растения 16.83 можно предположить три возможных варианта встраивания Т-ДНК, представленные на рис. 5. Первый вариант (рис. 5.1) - из имеющихся двух копий Т-ДНК одна несет два фрагмента вектора, один из которых прилежит к правому концевому повтору Т-ДНК, а второй к левому. Вторая копия Т-ДНК несет один векторный фрагмент, прилежащий к правому краевому повтору Т-ДНК. Второй вариант (рис. 5.2) -одна копия Т-ДНК несет векторную последовательность, прилежащую к левому краевому повтору, а вторая копия Т-ДНК несет последовательность вектора, прилежащую к правому краевому повтору Т-ДНК. Третий вариант (рис. 5.3) -одна копия Т-ДНК несет два векторных фрагмента, прилежащих как к левому, так и к правому краевым повторам, а вторая копия Т-ДНК не несет ни одного
растении
\
Рис. 4. Блот-гибридизация геномных ДНК трансгенных растений табака с 32Р-меченым фрагментом гена прШ. Номера растений подписаны над дорожками. Стрелками указаны фрагменты Т-ДНК. Цифрами.указаны длины фрагментов маркера (тпн), для дорожек с геномной ДНК растений 16.83 и 16.22 маркером являлась УА\>а\\, для дорожек с геномной ДНК растений 121.83 и 121.86 маркером являлась УШпсйНГЕсоШ.
32,
векторного фрагмента Для выявления конкретного варианта встраивания Т-ДНК и векторной ДНК необходимо секвенировать одну из встроек полностью
1) "в— lb — ls рис 5 Схема расположения векторных
-ом т днк km- -cd тднк --„ 1
'--^—~—^ последовательностей относительно двух
копий Т-ДНК для растения табака 16 83 RB, LB - правая и левая границы Т-ДНК, соответственно Заштрихованы участки 3) rb_lb rb_lb векторной последовательности
~аа| тдн< [да- -[ т-днк j-
Достаточно интересным представляется случай с растениями 121 83 и 121 86, которые также несут два фрагмента векторной ДНК, но при этом на Саузерн блоте у них регистрируется всего одна копия Т-ДНК (рис 5, дорожки 12183 и 121 86) Растение 121 83 несет фрагменты плазмидной последовательности, прилежащие как к левому, так и к правому повторам Т-ДНК, но не несет среднего фрагмента плазмидной ДНК Наиболее вероятным в данном случае представляется вариант, когда при процессинге Т-ДНК-нити были неправильно определены как левый, так и правый концевые повторы, в результате получилась Т-ДНК, неправильно вырезанная с обеих сторон Растение 121 86 также несет два фрагмента вектора, один длинный - от 3200 до 5200 пн, прилежащий к левому краевому повтору Т-ДНК, и один короткий - от 420 до 2200 пн, встроившийся независимо от Т-ДНК В данном случае существуют два варианта - либо в процессе репарации участок векторной ДНК, соединяющий эта два фрагмента, был комплементарно заменен на растительную ДНК, или вовсе элиминирован, либо небольшой фрагмент интегрировался в Т-ДНК независимо от первого и от Т-ДНК, соответственно Точную картину в данном случае можно установить при определении расстояния на генетической карте, разделяющего эти два векторных фрагмента
Приведенные исследования показывают, что переносимые при агробахтериальной трансформации в ядерный геном растений векторные фрагменты имеют сложную структуру Показано, что обе границы одной Т-ДНК могут определяться и вырезаться неправильно, что приводит к образованию растений, несущих Т-ДНК с обеих сторон окруженную векторными последовательностями Показано, что в одно и то же растение, кроме Т-ДНК, вырезанной с ошибкой, может встраиваться и последовательность вектора, независимая от Т-ДНК
3. Анализ наследования векторных фрагментов В таблице 3 представлены результаты анализа встречаемости фрагментов векторной ДНК у потомков первого поколения (ТО от самоопыления исходных трансгенных растений У всех проанализированных растений Т] были обнаружены те же участки векторной ДНК, что и у родительских растений
Отсутствие расщепления векторных фрагментов у потомков растения Res 66, несущего одну копию Т-ДНК (рис 4) предоставляет дополнительные доказательства в пользу того, что в данном случае мы имеем дело со всей векторной последовательностью, встроившейся в геном трансгенного растения целиком
Таблица 3 Распределение векторных фрагментов в геноме трансгенных растений табака и их потомков первого поколения от самоопыления
Трансгенные растения Типы фрагментов векторной ДНК
ВОЗ/4 В05/6 В07/8 ВБ9/10 ъът
И^бО То - - -
т, - - - -
Яевбб Т0 * + , -
Т,-1 - +■ • - * +
Т,-2 *„'+ * г*- ' г +• V
1*6879 Т0 - +_ +
Т,-1 - - - V +. +
Т,-2 - + -1- • -
т,-з - + > - + ' - Л-
16 83 То + - - - - -к
Т,-1 . + ' - - -
Т,-2 4- - - -
т,-з + ' - - - +
Рис 6 Блот-гибиридизация геномной ДНК трансгенного растения табака Ксз79 с 32Р-мечеными фрагментами гена шс1А и гена прШ Стрелками указаны копии Т-ДНК, * помечены стрелки, указывающие на фрагменты геномной ДНК, гибридизованные с зондом на ген шс1А, + помечены стрелки, указывающие на фрагменты геномной ДНК, гибридизованные с зондом на ген прШ Цифрами указаны длины фрагментов маркера Х/НтсШ/ЕсоВЛ (тпн)
Наиболее интересным представляется случай с растением Яе579, у которого по результатам Саузерн блот анализа было обнаружено три копии Т-ДНК (рис 6). Из представленных в таблице 3 данных мы видим, что у исходного растения было представлено 4 фрагмента векторной ДНК, а среди его потомков, по-видимому в результате рекомбинации или сегрегации, произошло расщепление участков векторной последовательности У одного потомка определяется два фрагмента, прилежащих к правому краевому повтору, а у другого - только три фрагмента, не прилежащие ни к одной из границ Т-ДНК Анализ картины встраивания и рекомбинации векторных последовательностей в геном растения Яез79 и его потомков затрудняется тем, что у него присутствует три копии Т-ДНК(рис 7)
На основании имеющихся данных можно утверждать, что векторные последовательности не только стабильно переносятся в следующее поколение, но и рекомбинируют, как обычные растительные гены
ВЫВОДЫ
1 В геномной ДНК 114 независимо полученных методом агробакгериального переноса трансгенных растений табака и моркови выявлены фрагменты, соответствующие векторным последовательностям
212 ;
5
плазмид рВ1121 и рВП01. Частота данного события для двух видов растений составила 35 1%
2 Доля растений, несущих в геноме фрагменты векторных ДНК, существенно не различалась между двумя анализируемыми видами и составила 35 2% для растений табака и 34 9% - для растений моркови (у которой эта частота оценена впервые)
3 Выявлен широкий спектр взаиморасположения векторных фрагментов в геноме анализируемых трансгенных растений табака и моркови, представленный 20 вариантами Впервые установлено, что векторные фрагменты могут быть интегрированы в геном одного и того же трансгенного растения как сцеплено с Т-ДНК, так и независимо от нее
4 На основании данных о составе нуклеотидов районов растительной ДНК, фланкирующих Т-ДНК-встройки, подтверждено их соответствие векторным последовательностям
5 Доказано, что чужеродные векторные последовательности стабильно наследуются в первом поколении от самоопыления исходных трансгенных растений и способны сегрегировать и рекомбинировать, как обычные генетические маркеры
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1 Пухначева Н.В., Новоселя Т В, Зоткевич Е А, Дейнеко Е В Встраивание векторных последовательностей в геном трансгенных растений//Генетика 2005 Т.41 №9 С 1203-1209
2 Пермякова (Пухначева) Н.В, Дейнеко Е В , Шумный В К Особенности встраивания векторных последовательностей в геном трансгенных растений//Генетика 2007 Т 43 №11 С 1501-1510
3 Пухначева Н.В., Новоселя Т.В, Дейнеко Е В Интеграция краевых векторных последовательностей в геном трансгенных растений табака Материалы международной научной конференций «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Минск, 24-26 ноября 2004 г, стр 342
4 Пухначева Н.В., Филипенко Е А, Дейнеко Е В Влияние первичной структуры геномной ДНК на встраивание Т-ДНК и встраивание векторных последовательностей у трансгенных растений табака Материалы IX Дальневосточной молодежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, 16-23 сентября 2005 г, МЭС ТИБОХ, г. Владивосток, с 60
5 Пухначева Н.В., Дейнеко Е В Встраивание векторных последовательностей в геном трансгенных растений табака и моркови Материалы международной конференции «Генетика в России и в мире» посвященной 40-летию Института общей генетики им Вавилова РАН, стр 162
6 Пермякова Н.В., Шумный В К, Дейнеко Е В Агробактериальная трансформация растений перенос фрагментов векторной ДНК в растительный геном (принята в печать) Генетика
Подписано к печати 1/1У 2008 г
Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ л 1 Уч изд л 0,7
Тираж 100 экз. Заказ 31
Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр ак Лаврентьева, 10
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пермякова, Наталья Владиславовна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1 Agrobacterium tumefaciens как вектор для переноса экзогенной ДНК в растительный геном.
1.2 Интеграция векторных последовательностей в геном трансгенных растений.
1.3 Механизмы образования векторных последовательностей: процессинг и перенос Т-ДНК в геном растений.
1.4 Предпочтительные места встраивания Т-ДНК.
1.5 Частота встраивания плазмидных последовательностей в геном трансгенных растений: факторы, влияющие на частоту образования векторных фрагментов.
1.6 Создание специальных конструкций, позволяющих избежать встраивания векторных последовательностей.
1.7 Нежелательные последствия встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.
2.1 Исходный материал.
2.2 Выделение геномной ДНК из листьев табака и моркови. табака.
2.4 Полимеразная цепная реакция, проводимая для трансгенного статуса растений и наличия у них векторной ДНК подтверждения
2.5 Схема секвенирования участков растительной ДНК, принадлежащих к краевым повторам Т-ДНК.
2.6 Электрофоретический анализ ДНК.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1 Анализ частоты встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений.
3.2 Особенности встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений.
3.3 Анализ наследования векторных фрагментов.
3.4 Влияние различных факторов на частоту встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Встраивание векторных последовательностей в геном трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) и моркови (Daucus carota L.)"
В течение последних двух десятилетий в ведущих биотехнологических центрах мира интенсивно развиваются работы по модификации ядерного генома высших растений с применением методов генной инженерии. Спектр практического применения генетически модифицированных (трансгенных) растений достаточно широк: трансгенные растения могут быть использованы в качестве биореакторов для накопления различных метаболитов для практических целей, для улучшения отдельных хозяйственно-ценных признаков, а также, например, для ремидиации почв. Генетически модифицированные растения представляют удобные модели для изучения функционирования перенесенных генов в новом окружении генов растения-реципиента (Castle, Meinke, 1994, Winkler, Feldmann, 1998, Howden et al, 1998, Zhu et al., 2003).
Необходимо подчеркнуть, что чужеродные гены, переносимые в геном растения в виде фрагмента экзогенной ДНК (генетической конструкции), могут быть интегрированы в районы расположения собственных генов растения. Такие инсерции трансгенов не только изменяют функционирование генов в районе встройки, но и одновременно являются маркерами тех генов, функционирование которых было нарушено встройкой. К настоящему времени описано большое число мутаций, индуцированных инсерциями трансгенов (Winkler, Feldmann, 1998, Chiang et al, 1995, Christensen et al, 1997, Gilliland et al, 1998).
Для «доставки» чужеродных генов в ядерный геном растений в настоящее время используются два подхода: векторный перенос с помощью большой мегаплазмиды (Ti-плазмиды) почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens (преимущественно для двудольных растений) и прямой перенос с помощью генной пушки - для однодольных. При использовании метода агробактериальной трансформации гены, представляющие интерес для исследователя, клонируются между двумя непрямыми краевыми повторами (левым и правым) Т-области большой мегаплазмиды A. tumefaciens. Последовательности вектора, окаймляющие Т-ДНК, представляют собой несовершенные повторы размером 25 п.н. и являются необходимыми элементами в цис положении, играющими важную роль в процессе переноса трансгенов. Именно по районам повторов происходит вырезание генов, заключенных в Т-области мегаплазмиды, которые в дальнейшем и переносятся в ядро растительной клетки.
Долгое время общепринятым оставалось представление, что в ядро растительной клетки переносится только фрагмент ДНК (Т-ДНК), заключенный между правым и левым краевыми повторами (Tinland 1996, Zambryski et al., 1982). Однако, на основании полученных за последние годы данных, стало очевидно, что фрагменты «внешней» (векторной ДНК) также могут быть перенесены и стабильно интегрированы в растительный геном (Ramanathan, Veluthambi 1995, van der Graaff et al., 1996, Wenck et al., 1997, De Buck et al., 2000). Очевидно, что причины такого переноса могут быть связаны с ошибками процессинга Т-ДНК в агробактериальной клетке (Tinland 1996, Castle et al., 1993, Martineae 1994).
Установлено, что на всех стадиях процессинга Т-ДНК могут происходить ошибки, приводящие к вырезанию вместе с Т-ДНК и участков (фрагментов) векторной ДНК (Ramanathan, Veluthambi 1995, van der Graaff et al., 1996, Wenck et al., 1997, De Buck et al., 2000). Описаны случаи неправильного вырезания Т-ДНК фрагмента из плазмиды при недостатке белка VirD2 (Wenck et al., 1997), a также при неправильном определении данным белком границ Т-ДНК области (Yin, Wang, 2000). Установлено, что последовательности внутренних участков Т-ДНК, прилежащие к концевым повторам, также играют важную роль в процессинге. Так, например, удаление районов Т-ДНК, прилежащих к левой или правой границам Т-области и замена их на фрагменты ДНК со случайными последовательностями нуклеотидов приводит к существенному возрастанию числа ошибок узнавания границ Т-ДНК (De Buck et al., 2000).
Фрагменты, образующиеся в результате ошибок процессинга Т-ДНК, различаются по протяженности и включают как всю векторную последовательность, так и отдельные ее участки (van der Graaff et al., 1996, Yin, Wang, 2000, Miranda et al, 1992). В растительный геном такие фрагменты встраиваются совместно с Т-ДНК или независимо от нее (Ramanathan, Veluthambi 1995, De Buck et al., 2000, Kononov et al 1997).
Итак, при агробактериальной трансформации в ядерный геном растений одновременно с трансгенами могут быть перенесены и фрагменты векторной ДНК. Перенос векторных последовательностей, по-видимому, является частью механизма переноса Т-ДНК, что необходимо принимать во внимание при получении трансгенных растений.
Актуальность проблемы.
Технология создания трансгенных растений основана на переносе генов из различных гетерологичных систем (вирусов, микроорганизмов, животных, человека), поэтому трансгенные растения можно рассматривать как яркий пример преодоления физических, эволюционных и генетических барьеров, изолирующих геномы различных организмов (Miki, McHugh, 2004). Недостатком метода агробактериальной трансформации, широко применяемой для получения трансгенных растений, являются случайные ошибки при процессинге Т-ДНК, в результате которых в растительный геном могут быть интегрированы фрагменты векторных ДНК (Ramanathan, Veluthambi, 1995, van der Graaff et al, 1996, Wenck et al, 1997, De Buck et al, 2000).
К настоящему времени накоплены экспериментальные данные о встраивании векторной ДНК, не только в геном двудольных трансгенных растений. При агробактериальной трансформации фрагменты «внешней» (векторной) ДНК обнаруживались и в геноме однодольных растений, а также в геномах грибов и дрожжей (Olhoft et al., 2004, Lange et al., 2006, Kim et al., 2003, Michielse et al., 2004, Bundock et al., 2002).
С коммерческой точки зрения перенос векторных последовательностей в геномную ДНК трансгенных растений представляется крайне нежелательным. Нежелательность встраивания векторных фрагментов, с одной стороны, связана с тем, что они могут изменять стабильность экспрессии целевых генов. Нарушение стабильности экспрессии перенесенных генов в составе таких встроек описана в ряде работ (Iglesias et al., 1997, Jakowitsch et al., 1999). Известно, что прокариотические последовательности, интегрированные в растительный геном, могут быть опознаны как чужеродные и метилированы (Meza et al., 2002). С другой стороны, встраивание в геном растения векторных фрагментов может повышать нестабильность самого района встройки. Установлено, что повторяющиеся участки, или ori репликации, входящие в состав плазмидной ДНК, могут стимулировать перестройки внутри инсерции Т-ДНК (Muller et al., 1999, Linden et al., 1996), что также может приводить к изменению экспрессии перенесенных целевых генов.
Важным моментом в ошибках процессинга Т-области при агробактериальном заражении растений является то, что в растительный геном в составе векторных фрагментов могут быть перенесены гены устойчивости к антибиотикам. В случае использования не бинарных векторов в геноме трансгенных растений могут быть найдены и агробактериальные гены вирулентности. Обнаружение таких фрагментов в геноме трансгенных растений также представляется нежелательным по многим причинам. Присутствие векторных последовательностей затрудняет исследование а прилежащих к Т-ДНК участков растительной ДНК и выявление растительных генов, функция которых была нарушена в результате встройки чужеродной инсерции. С точки зрения биобезопасности трансгенные растения не должны содержать генов устойчивости к антибиотикам и других «посторонних» фрагментов ДНК. В то же время, перенос векторных последовательностей, по-видимому, является частью механизма переноса Т-ДНК, что необходимо принимать во внимание при получении трансгенных растений.
На основе изучения феномена встраивания векторных последовательностей разработаны рекомендации для создания различных генетических конструкций, позволяющих избежать встраивания как фрагментов вектора, так и маркерных генов (Sugita et al., 2000, Hanson et al., 1999, Podevin et al., 2006, Vain et al., 2003, Coutu et al., 2007, Kondrak et al., 2006, Conner et al., 2007).
Таким образом, в связи с интенсивным развитием генетической инженерии и биотехнологии растений проблема встраивания векторных последовательностей в геном трансгенных растений представляется весьма актуальной. Понимание феномена встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений может внести существенный вклад и в решение фундаментальных задач. В ряде работ авторами выявлены новые детали механизма процессинга Т-ДНК и взаимодействия белков, участвующих в процессинге (Ramanathan Veluthambi, 1995, Wenck et al., 1997, Yin, Wang 2000, De Buck et al., 2000, McCormac et al., 2001, Michielse et al., 2004, Podevin et al., 2006). Однако, несмотря на очевидный прогресс данного научного направления, остается еще много неясных вопросов. Поэтому изучение феномена встраивания векторных последовательностей в геном трансгенных растений, исследование механизмов встраивания таких фрагментов, а также изучение спектра факторов, влияющих на частоту встраивания векторных фрагментов у различных видов трансгенных растений, представляется чрезвычайно актуальным.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования являлось изучение частоты и особенностей встраивания векторных последовательностей у трансгенных растений табака {Nicotiana tabacum L.) и моркови {Daucus carota L.). Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1. Провести ПЦР-анализ на присутствие различных участков векторной последовательности мегаплазмиды A.tumefaciens у трансгенных растений табака и моркови.
2. Подтвердить наличие векторных последовательностей в геномных ДНК анализируемых трансгенных растений посредством секвенирования районов ДНК, прилежащих к Т-ДНК-инсерциям.
3. Установить количество копий Т-ДНК в исследуемых трансгенных растениях методом Саузерн блот гибридизации.
4. Установить характер взаиморасположения фрагментов векторной, растительной и Т-ДНК для отдельных растений, несущих несколько-фрагментов векторной ДНК.
5. Проанализировать наследование векторных фрагментов в поколениях трансгенных растений.
Научная новизна и практическая ценность работы. Настоящая работа направлена на изучение особенностей встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений табака и моркови, а также на выявление частотных характеристик исследуемого явления у двух видов растений и анализ сохранения фрагментов векторных ДНК среди потомков на примере трансгенных растений табака. Охарактеризована популяция независимо полученных трансформантов табака и моркови по наличию в геноме фрагментов векторных ДНК, установлено долевое соотношение групп растений с различными видами фрагментов. Установлено, что для трансгенных растений табака доля растений, в геноме которых были выявлены фрагменты векторных ДНК, составила 35.2%, а для трансгенных растений моркови - 34.9%. В сумме для трансгенных растений табака и моркови доля растений, в геноме которых выявлялись фрагменты векторных ДНК различной конфигурации, составила 35.1%.
Следует отметить, что отсутствие различий по частоте встраивания векторных фрагментов между различными видами трансгенных растений отмечено в литературе (Wenck et al., 1997). Однако в работе Венк выявлялась значительно более высокая частота встраивания векторной ДНК в геном трансгенных растений табака и арабидопсиса (60% и 62% соответственно).
Более того, даже если рассматривать работы различных групп исследователей на одном виде трансгенных растений (N. ТаЪасит), вариабельность частот встраивания достаточно высокая, от 1,3% (Ramanathan, Veluthambi, 1995) до 75,0% (Kononov et al., 1997). Эти данные свидетельствуют о существовании неизвестных пока факторов влияющих на частоту встраивания векторных фрагментов и безусловно требуют дальнейшего изучения.
Выявлен необычайно широкий спектр вариантов взаиморасположения векторных фрагментов в геноме анализируемых трансгенных растений, представленный 20 вариантами. Установлено, что у 6 трансгенных растений (5,2% от общего числа проанализированных растений) в геноме выявлялась вся последовательность вектора. У 13 (11.4%) проанализированных растений обнаруживались векторные фрагменты различной длины, прилежащие к левому краевому повтору Т-ДНК и у 5 (4.4%) - к правому краевому повтору Т-ДНК. Среди общего числа проанализированных растений выявлено 10 (8,8%), в геноме которых обнаруживались два фрагмента векторных ДНК. Выявлено 8 (7%) растений, содержащих в геномной ДНК векторные фрагменты различной длины, интегрированные независимо от Т-ДНК. Среди них присутствуют два растения (одно растения табака и одно растение моркови) несущих не только фрагмент вектора, интегрировавшийся в растительный геном независимо от Т-ДНК, но также и фрагмент вектора прилежащий к левому концевому повтору Т-ДНК. Такие растения были выявлены впервые. Между тем чрезвычайный интерес представляет механизм образования такого сочетания Т-ДНК и векторных фрагментов. В данном случае могло иметь место одновременно неправильное определение концевых повторов, а также и реорганизация (делеция) векторной ДНК в процессе ее транспорта и интеграции в растительный геном. Дальнейшее изучение данных растений представляет несомненный интерес для более детального понимания молекулярно-генетических механизмов встраивания векторной ДНК. Полученные результаты представляют большое значение для дальнейших фундаментальных и прикладных исследований по изучению механизмов агробактериального инфицирования растений.
Установлено, что векторные последовательности не только могут быть перенесены в геном потомков первого поколения от самоопыления, но могут рекомбинировать и сегрегировать как обычные гены растений. Хотя ранее предполагалось, что мультимерные комплексы (состоящие из нескольких копий Т-ДНК, перемежающихся векторной и растительной ДНК) мейотически нестабильны, соответственно, в последующих поколениях растений может произойти их эксцизия и потеря трансгена (Srivastava et al., 1996).
Полученные результаты представляют большое значение при разработке и уточнении правил по биобезопасности использования генетически модифицированных организмов.
Данные, полученные в ходе исследования, используются при чтении, лекций в курсе «Генетическая инженерия растений» в Томском государственном университете.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: в виде устного доклада на международной научной конференций «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Минск, 24-26 ноября 2004, где доклад был удостоен диплома «За высокопрофессиональный доклад»; на Дальневосточной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, 16-23 сентября 2005 г., МЭС ТИБОХ; на школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной генетики» при Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН Москва, 28 июня - 2 июля 2006 г.; в виде устного доклада на международной конференции «Достижения и проблемы генетики, селекции и биотехнологии», посвященной 40-летию основания Украинского общества генетиков и селекционеров и 120-летию со дня рождения Н. И. Вавилова, Алушта, 24-27 сентября 2007 года. Материалы диссертационной работы представлялись в устных докладах на отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН в 2004, 2007 г.г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи.
Пухначева Н.В., Новоселя Т.В., Зоткевич Е.А., Дейнеко Е.В. Встраивание векторных последовательностей в геном трансгенных растений // Генетика. 2005. Т. 41. № 9. С. 1203-1209.
Пермякова (Пухначева) Н.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Особенности встраивания векторных последовательностей в геном трансгенных растений// Генетика. 2007. Т. 43. № 11. С. 1501-1510.
1 статья находится в печати.
Пермякова Н.В., Шумный В.К., Дейнеко Е.В. Агробактериальная трансформация растений: перенос фрагментов векторной ДНК в растительный геном (принята в печать).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (117 наименований). Работа изложена на 98 страницах, включает 14 рисунков и 8 таблиц в тексте диссертационной работы.
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Пермякова, Наталья Владиславовна
ВЫВОДЫ
1. В геномной ДНК 114 независимо полученных методом агробактериального переноса трансгенных растений табака и моркови выявлены фрагменты, соответствующие векторным последовательностям плазмид pBil21 и pBilOl. Частота данного события для двух видов растений составила 35.1%
2. Доля растений, несущих в геноме фрагменты векторных ДНК, существенно не различалась между двумя анализируемыми видами и составила 35.2% для растений табака и 34.9% - для растений моркови (у которой эта частота оценена впервые).
3. Выявлен широкий спектр, взаиморасположения векторных фрагментов в геноме анализируемых трансгенных растений табака и моркови представленный 20 вариантами. Впервые установлено, что векторные фрагменты могут быть интегрированы в геном одного и того же трансгенного растения как сцеплено с Т-ДНК, так и независимо от нее.
4. На основании данных о составе нуклеотидов районов растительной ДНК, фланкирующих Т-ДНК-встройки, подтверждено их соответствие векторным последовательностям.
5. Доказано, что чужеродные векторные последовательности стабильно наследуются в первом поколении от самоопыления исходных трансгенных растений и способны сегрегировать и рекомбинировать, как обычные генетические маркеры.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Развитие новых технологий, позволяющих модифицировать геномы растений посредством переноса новых генов различного гетерологического происхождения с одной стороны существенно расширило возможности формообразовательного процесса и создания нового исходного материала для практических целей. Однако, с другой стороны, исследователи поставили перед собой ряд вопросов, связанных с оценкой «биобезопасности» разработанных технологий.
Создание трансгенных растений основано на технологиях переноса и интеграции в геном растения фрагментов экзогенной ДНК. Попадание инсерций Т-ДНК в функционально-значимые районы растительного генома может приводить к нарушению проявления генов, локализованных в данной области. Фенотипически это выражается в нарушении каких-либо признаков у растений. В терминах классической генетики подобные нарушения относятся к инсерционным мутациям. Потенциальным источником мутационных изменений собственных генов растения могут выступать как гетерологичные гены, так и фрагменты векторной ДНК. На основании представленных в диссертационной работе результатов показано, что в случайной выборке независимо полученных трансгенных растений табака и моркови обнаруживаются фрагменты векторных ДНК. Согласно нашим данным частота этого феномена была довольно высока и составила 35,1%. Полученные данные свидетельствуют о том, что при создании трансгеннных растений методом агробактериального переноса в каждом третьем случае в геном трансформанта переносится и встраивается не только Т-ДНК, но и фрагменты плазмидной ДНК. Такие фрагменты могут представлять собой дополнительный источник инсерций и потенциально приводить к мутационным изменениям.
Встраивание векторных фрагментов было подтверждено при помощи секвенирования. Гомология последовательностей ДНК, прилежащих к левому концевому повтору Т-ДНК, встроившейся в трансгенные растения табака и моркови, с последовательностью вектора, используемого для трансформации, составила 99%.
Переносимые фрагменты имеют высокую вариабельность, они могут быть различной длины и представляют собой различные участки плазмидной ДНК. Все выявленные нами фрагменты можно разделить на 2 типа - фрагменты, прилежащие к той или иной границе Т-ДНК и фрагменты, встроившиеся независимо от Т-ДНК. Также нами впервые выявлены два растения несущих фрагменты векторной ДНК промежуточного типа - один фрагмент, прилежащий к левой границе Т-ДНК и еще один фрагмент, встроившийся независимо от Т-ДНК.
Частота, с которой фрагменты векторной ДНК выявляются в геноме трансгенных растений, непосредственно связана с частотой ошибок процессинга Т-ДНК, происходящего в клетке агробактерии. В основе механизма образования большей части векторных фрагментов, по-видимому, лежат ошибки определения левого концевого повтора Т-ДНК, происходящие при репликации Т-ДНК в клетке агробактерии. В результате таких ошибок образуются протяженные фрагменты ДНК, содержащие кроме Т-ДНК еще и участок векторной последовательности прилежащий к левому концевому повтору Т-ДНК. В пользу этого предположения свидетельствует то, что из всех 40 (35.1%) обнаруженных нами растений, несущих векторные фрагменты, 23 (20.2%) несли векторные фрагменты, прилежащие к левому концевому повтору и только 13 (11.4%) несли векторные фрагменты, прилежащие к правому концевому повтору. Наши данные вполне согласуются с данными литературы, о том, что правая граница Т-ДНК чаще определяется правильно, чем левая, и что осуществление точного надреза в области правого концевого повтора является важным этапом процессинга Т-ДНК (Tinland 1996, Meza et al., 2002, Podevin et al., 2006). Фрагменты вектора прилежащие к правому концевому повтору образуются, скорее всего, по другому механизму, в основе которого лежит неправильное определение правого концевого повтора. Левый концевой повтор неправильно опознается как правый, и синтез новой цепи «Т-ДНК» начинается именно с него. Этот же механизм, скорее всего, ответственен за выявляемые нами случаи встраивания векторных фрагментов независимых от Т-ДНК. Большой интерес представляет механизм образования фрагментов векторной ДНК встроившихся в геном одного и того же трансгенного растения как вместе с Т-ДНК, так и независимо от нее. В данном случае, возможно справедливы обе гипотезы касающиеся механизма образования векторных фрагментов - имело место как неправильное определение левого концевого повтора (как правого), так и проскакивание левого концевого повтора. Также вполне вероятно, что в данном случае, в процессе транспортировки и интеграции Т-ДНК и сопутствующих векторных фрагментов в растительный геном, произошла реорганизация (делеция) векторной ДНК.
Показано, что фрагменты векторной ДНК, перенесенные в геном трансгенных растений вместе или независимо от Т-ДНК, стабильно наследуются в первом поколении от самоопыления исходных трансгенных растений. Встроившись в растительный геном, они ведут себя к традиционные генетические маркеры - свободно сегрегируют и рекомбинируют.
Феномен встраивания плазмидной ДНК в геном трансгенных растений привлекает внимание исследователей в связи с тем, что встраивание векторных фрагментов влечет за собой массу негативных последствий. Содержащиеся в плазмидной ДНК повторы, палиндромы, А-Т-богатые участки, ori репликации, содержащиеся в векторной ДНК, способны провоцировать перестройки трансгена (Muller et al., 1999, Linden et al., 1996). Множественные повторы, C-G богатые прокариотические участки могут метилироваться и вызывать метилирование трансгена, нарушая тем самым его экспрессию (Meza et al, 2002, Matzke et al, 1996, Iglesias et al, 1997, Jakowitsch et al, 1999). Мультимеризованные комплексы, то есть комплексы, состоящие из нескольких копий Т-ДНК разделенных фрагментами векторной и растительной ДНК, мейотически нестабильны, что может привести к эксцизии трансгена (Srivastava et al, 1996). Прилежащие к Т-ДНК векторные фрагменты затрудняют исследование участков растительной ДНК, окружающих трансген. Крайне нежелательным представляется встраивание в геном трансгенных растений плазмидных генов, находящихся за границами Т-ДНК, даже несмотря на то, что эти гены не содержат растительных регуляторных элементов (промоторов, терминаторов, энхансеров). Согласно данным литературы вполне вероятно встраивание векторной ДНК под растительный промотор с последующей экспрессией плазмидного гена (Takano et al., 1997, Iglesias et al., 1999, Speulman et al, 1999, Sha et al., 2004).
Необходимо отметить, на сегодняшний день разработан широкий спектр методов, применяя которые можно либо вовсе избежать встраивания векторных фрагментов, либо элиминировать их в процессе получения трансгенных растений. Для того чтобы облегчить идентификацию растений несущих векторную ДНК, можно встроить позитивный маркер за пределами Т-ДНК. чтобы растения элиминировались на этапе селективного отбора в плазмидную ДНК можно встроить негативный маркер (Kononov et al, 1997, Hanson et al., 1999, Kuraya et al, 2004). Найдены способы, позволяющие существенно повысить частоту правильного узнавания концевых повторов Т-ДНК (Kuraya et al, 2004, Podevin et al., 2006). Также на сегодняшний день разработан ряд векторов у которых минимизирована плазмидная ДНК, практически до полного ее отсутствия. Для удаления векторной ДНК и маркерных генов широко используются в векторах природные системы сайт-специфической рекомбинации (Cornielle et al., 2001, Hare, Chua, 2002, Kondrak et al., 2006). Активно разрабатывается класс принципиально новых векторов для трансформации растений - интрагенных, которые содержат только ДНК растительного происхождения (Rommens et al, 2004, Conner et al, 2007). Несомненно одно, все имеющиеся методы безусловно требуют дополнительной работы еще на стадии создания трансгенной конструкции, они удорожают и удлиняют процесс получения трансгенных растений и в большинстве случаев требуют дополнительной проверки на наличие векторной ДНК у трансгенного растения. В то же время наша работа показывает, что даже простой ПЦР анализ, направленный на выявление только фрагментов векторной ДНК прилежащих к левому краевому повтору Т-ДНК, уже позволит выявить более 50% трансгенных растений несущих векторные последовательности.
Молекулярно-генетические механизмы, приводящие к переносу векторных фрагментов в геном трансгенных растений, все еще до конца не выяснены. Данный феномен привлекает внимание исследователей в связи с возможными негативными последствиями, которые приносят с собой плазмидные последовательности. Выявленные в ходе выполнения данной работы особенности встраивания векторных фрагментов у трансгенных растений табака и моркови представляют интерес для дальнейшего изучения причин и механизмов данного явления у трансгенных растений.
84
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пермякова, Наталья Владиславовна, Новосибирск
1. Дрейпер Дж., Скотт Р. и др. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. М.: Мир, 1991. С. 277-303.
2. Пермякова Н.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Особенности встраивания векторных последовательностей в геном трансгенных растений. Генетика 2007, том 43, №11, с. 1501-1510.
3. Пухначева Н.В., Новоселя Т.В., Зоткевич Е.А., Дейнеко Е.В. Встраивание векторных последовательностей в геном трансгенных растений. Генетика 2005, том 41, №9, с. 985-990.
4. Турчинович А.А., Дейнеко Е.В., Филипенко M.JI. и др. Получение трансгенных растений табака продуцентов интерлейкина-18 человека // ДАН. 2004. Т. 395. № 5. С. 1-4.
5. Чумаков М.И. Механизм агробактериальной трансформации растений. Саратов.: Слово, 2001. 256 с.
6. Abdal-Aziz S.A., Pliego-Alfaro F., Quesada M.A., Mercado J.A. Evidence of frequent integration of non-T-DNA vector backbone sequences in transgenic strawberry plant//J. Bioscience Bioengineering. 2006. V. 101. № 6. P. 508-510.
7. Abuodeh R.O., Orbach M.J., Mandel M.A., Das A., Galgiani J.N. Genetic transformation of Coccidioides immitis facilitated by Agrobacterium tumefaciens. // J. Infect. Dis. 2000. V. 181. P. 2106-2110.
8. Barakat A., Gallois P., Raynal M., Mestre-Ortega D., Sallaud C., Guiderdoni E., Delseny M., Bernardi G. The distribution of T-DNA in the genomes of transgenic Arabidopsis and rice // FEBS Letters. 2000. V. 41. P. 161-164.
9. Barton K.A., Binns A.N., Matzke A.J., Chilton M.D. Regeneration of intact tobacco plants containing full length engineered T-DNA and transmission of T-DNA toRl progeny//Cell. 1983. V. 32. P. 1033-1043.
10. Bermetzen J.L. The contribution of retroelements to plant genome organization, function and evolution // Trends Microbiol. 1996. V. 4. P. 347 353.
11. Bundock P., van Attikum H., den Dulk-Ras A., Hooykaas P.J.J. Insertional mutagenesis in yeasts using T-DNA from Agrobacterium tumefaciens II Yeast. 2002. V. 19 №6. P. 529-536.
12. Castle L.A., Errampalli D., Atherton T.L., Franzmann L.H., Yoon E.S., Meinke D.W. Genetic and molecular characterization of embryonic mutant identified following seed transformation in Arabidopsis // Mol Gen Genet. 1993. V. 241. P. 504-514.
13. Castle L.A. Meinke D.W. A FUSCA gene of Arabidopsis encodes a novel protein essential for plant development // The Plant Cell. 1994. V. 6. P. 25-41.
14. Chiang H.H., Hwang I., Goodman H.M. Isolation of the Arabidopsis GA4 locus // The Plant Cell. 1995. V. 7. № 2. P. 195-201.
15. Chilton M.D., Drummond M.H., Merio D.J. Sciaky D., Montoya A.L., Gordon M.P., Nester E.W. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: the molecular basis of crown gall tumorgenesis // Cell. 1977. V. 11. P. 263-271.
16. Christensen C.A., King E.J., Jordan J.R., Drews G.N. Megagametogenesis in Arabidopsis wild type and the Gf mutant // Sex. Plant Reprod. 1997. V. 10. P. 4964.
17. Cluster P.D., O'Dell M., Metzlaff M., Flavell R.B. Details of T-DNA structural organization from a transgenic petunia population exhibiting co-supression //Plant Mol. Biol. 1996. V. 32. P. 1197-1203.
18. Conner A.J., Barrell P.J., Baldwin S.J., Lokerse A.S., Cooper P.A., Erasmuson A.K., Nap J.-P., Jacobs J.M.E. Intragenic vectors for gene transfer without foreign DNA // Euphytica. 2007. V. 154. P. 341-353.
19. Corneille S., Lutz K., Svab Z., Maliga P. Efficient elimination of selectable marker genes from the plastid genome by the CRE-lox-site-specific recombination system // Plant J. 2001. V. 27. P. 171-178.
20. Coutu C., Brandle J., Brown D., Brown K., Miki В., Simmonds J., Hegedus D.D. pORE: a modular binary vector series suited for both monocot and dicot plant transformation // Transgenic Res. 2007. V. 16. № 6. P. 771-781.
21. De Buck S., De Wilde C., Van Montagu M., Depicker A. T-DNA vector backbone sequences are frequently integrated into the genome of transgenic plants obtained by Agrobacterium — mediated transformation // Molecular Breeding. 2000. V. 6. P. 459-468.
22. Endo S., Kasahara Т., Sugita K. The isopentenyl transferase gene is effective as a selectable marker gene for plant transformation in tobacco (Nicotiana tabacum cv. Petite Havana SRI) // Plant Cell Rep. 2001. V. 20. P. 60-66.
23. Fang J., Zhai W.X., Wang W.M., Li S.W., Zhu L.H. Amplification andanalysis of T-DNA flanking sequences in transgenic rice // Yi Chuan Xue Bao. 2001. V. 28. No 4. P. 345-351.
24. Fladung M. Gene stability in transgenic aspen (Populus). I. Flanking DNA sequences and T-DNA structure // Mol Gen Genet. 1999. V. 260. P. 574-581.
25. Forsbach A., Schubert D., Lechtenberg В., Gils M., Schmidt R. A comprehensive characterization of single-copy T-DNA insertions in the Arabidopsis thaliana genome // Plant Molecular Biology 2003. V. 52. P. 161-176.
26. Frary A., Hamilton C.M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato // Transgenic Res. 2001. V. 10. № 2. P. 121-132.
27. Gelvin B. Agrobacterium mediated plant transformation: the biology behind the "Gene-Jockeying" tool // Microbiology and Molecular biology reviews. 2003. V. 67. № l.P. 16-37.
28. Gheysen G., Villarroel R., Van Montagu M. Illegitimate recombination in plants: a model for T-DNA integration // Genes Dev. 1991. V. 5. P. 287-297.
29. Gilliland L.U., Pawloski L.C., Kandasamy M.K., Meaghe R.B. Arabidopsis actin gene ACT7 plays an essential role in germination and root growth // The Plant Journal. 2003. V. 33. P. 319-328.
30. Hamilton С. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular weight DNA // Gene. 1997. V. 200. P. 107-116.
31. Hanson В., Engler D., Moy Y., Newman В., Ralston E., Gutterson N. A simple method to enrich an Agrobacterium-transformed population for plants containing only T-DNA sequences // Plant J. 1999. V. 9. P. 727-734.
32. Hare P.D., Chua N.-H. Excision of selectable marker genes from transgenic plants // Nat Biotechnol. 2002. V. 20. P. 113- 122.
33. Hellens R., Mullineaux P., Klee H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors // Trends in Plant Science. 2000. V. 5. №. 10. P. 446-451.
34. Hellens R.P., Edwards E.A., Leyland N.R., Bean S., Mullineaux P.M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediatQd plant transformation // Plant Mol. Bio. 2000b. V. 42. P. 819-832.
35. Hoekma A., Hirsch P.R., Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A. A binary vector strategy based on separation of the vir and T-region of the Agrobacterium tnmefaciens Ti plasmid // Nature. 1983. V. 303. P. 179-180.
36. Hood E.E., Helmer G.L., Fraley R.T., Chilton M.-D. The hypervirulence of Agrobacterium tnmefaciens A281 is encoded in a region of pTiBo542 outside of T-DNA//J Bacterid. 1986. V. 168.P. 1291-1301.
37. Hood E.E., Gelvin S.B., Melchers L.S., Hoekema A. New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants // Transgenic Res. 1993. V. 2. P. 208-218.
38. Horsch R.B., Klee H.J., Rapid assay of foreign gene expression in leaf discs transformed by Agrobacterium tumefaciens: role of T-DNA borders in the transfer process // Proc Natl Acad Sci USA. 1986. V. 83. P. 4428-4432.
39. Howden R., Park S.K., Moore J.M., Orme J., Grossniklaus U., Twell D. Selection of T-DNA-Tagged Male and Female Gametophytic Mutants by Segregation Distortion in Arabidopsis // Genetics. 1998. V. 149. P. 621-631.
40. Iglesias V.A., Moscone E.A., Papp I., Neuhuber F., Michalowsky S., Phelan Т., Spiker S., Matzke M., Matzke A.J.M. Molecular and Cytogenetic Analyses of Stably and Unstably Expressed Transgene Loci in Tobacco // The Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1251-1264.
41. Kim S.-R., Lee J., Jun S.-H., Park S., Kang H.-Gyu Kwon S., An G. Transgene structures in T-DNA-inserted rice plants // Plant Molecular Biology. 2003. V. 52. P. 761-773.
42. Kononov E., Bassuner В., Gelvin S.B. Integration of T-DNA binary vector 'backbone' sequences into the tobacco genome: evidence for multiple complex patterns of integration // The plant Journal. 1997. V. 11. № 5. P. 945-957.
43. Koncz C., Schell J. The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector//Mol. Gen. Genet. 1986. V. 204. P. 383-396.
44. Krizkova L., Hrouda M. Direct repeats of T-DNA integrated in tobacco chromosome: characterization of junction regions // Plant J. 1998. V. 16. P. 673680.
45. Krysan P.J., Young J.C., Sussman M.R. T-DNA as an Insertional Mutagen in Arabidopsis // The Plant Cell. 1999. V. 11. № 12. P. 2283-2290.
46. Kunik Т., Tzfira Т., Kapulnik Y., Пфатш Y., Dingwall C., Citovsky V. Genetic transformation of HeLa cells by Agrobacterium II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 1871-1876.
47. Lange M., Vincze E., M0ller M.G., Holm P.B., Molecular analysis of transgene and vector backbone integration into the barley genome following Agrobacterium-mediated transformation //Plant Cell Rep. 2006. V. 25. P. 815-820.
48. Laufs P., Autran D., Traas J. A chromosomal paracentric inversion associated with T-DNA integration in Arabidopsis II The Plant Journal. 1999. V. 18. №2. P. 131-139.
49. Lazo, G.R., Stein P.A., Ludwig R.A. A DNA transformation competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium I I Biotechnology. 1991. V. 9. P. 963 -967.
50. Levee V., Garin E., Klimaszewska K., Seguin A. Stable genetic transformation of white pine {Pinus strobus L.) after cocultivation of embryogenic tisues with Agrobacterium tumefaciens II Mol. Breeding. 1999. V. 5. P. 429-440.
51. Linden R.M., Winocour E., Berns K.I. The recombination signals for adeno-associated virus site-specific integration // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 7966-7972.
52. Martineau В., Voelker T.A., Sanders R.A. On defining T-DNA // The Plant Cell. 1994. №8. P. 1032-1033.
53. Matzke A.J.M., Matzke M.A. Position effects and epigenetic silencing of plant transgenes // Curr. Opp. In Plant Biology. 1998. V. 1. P. 142-148.
54. Matzke M.A., Matzke A.J.M., Eggleston W.B. Paramutation and transgene silencing: A common response to invasive DNA? // Trends Plant Sci. 1996. V. 1. P. 382-388.
55. McBride K.E., Summerfelt K.R. Improved binary vectors for Agrobacterium -mediated plant transformation // Plant Mol. Biol. 1990. V. 14. P. 269-276.
56. McCormac A.C., Fowel M.R., Chen D.- F., Elliot M.C. Efficient со -transformation of Nicotiana tabacum by two independent T DNAs, the effect of T -DNA size and implications for genetic separation // Transgenic Research. 2001. № 10. P. 143-155.
57. Miki В., McHugh S. Selectable marker genes in transgenic plants: applications, alternatives and biosafety // Journal of Biotechnology. 2004. V. 107. P. 193-232.
58. Miranda A., Janssen G., Hodges L., Peralta E.G., Ream, W.J. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism // Bactreiol. 1992. V. 174. P. 2288 2297.
59. Muller A.E., Kamisugi Y., Gruneberg R., Neidenhof I., Horold R.J., Meyer P. Palindromic sequences and A+T-reach DNA elements promote illegitimate recombination in Nicotiama tabacum II J. Mol. Biol. 1999. V. 291. P. 29-46.
60. Ochman H., Ajioka J.W., Garza D., HartI D.L. PCR technology: principles and applications for DNA amplification // Biotechnology. 1990. V. 8. P. 759-760.
61. Olhoft P.M., Flagel L.E., Somers D.A. T-DNA locus structure in a large population of soybean plants transformed using the Agrobacterium -mediated cotyledonary-node method // Plant Biotechnology Journal. 2004. V. 2. P. 289-300.
62. Ooms G., Bakker A., Molendijk L., Wullems G.J., Gordon M.P., Nester E.W., Schllperoort R.A. T-DNA organization in homogeneous and heterogeneous octopine-type crown gall tissues of Nicotiana tabacum // Cell. 1982. V. 30. P. 589597.
63. Pan X., Li Y., Stein L. Site Preferences of insertional mutagenesis agents in Arabidopsis // Plant Physiol. 2005. V. 137. P. 168 175.
64. Perez-Hernandez J.B., Swennen R., Sagi L. Number and accuracy of T-DNA insertions in transgenic banana (Musa spp.) plants characterized by an improved anchored PCR technique // Transgenic Research. 2006. V. 15. P. 139— 150.
65. Piers K.L., Heath J.D., Liang X., Stephens K.M., Nester E.W. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 1613-1618.
66. Podevin N., De Buck S., De Wilde C., Depicker A. Insights into recognition of the T-DNA border repeats as termination sites for T-strand synthesis by Agrobacterium tumefaciens //Transgenic Res. 2006. № 15. P. 557-571.
67. Porsch P., Jahnke A., During K. A plant transformation vector with a minimal T DNA II. Irregular integration patterns of the T - DNA in the plant genome // Plant Molecular Biology. 1998. V. 37 P. 581 - 585.
68. Ramanathan V., Veluthambi K. Transfer of non T - DNA portions of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiA6 from the left terminus of Tl - DNA // Plant Molecular Biology. 1995. V. 28. P. 1149 - 1154.
69. Ream W. Modern microbial genetics. 2nd ed. Edited by Streips U.N., Yasbin R.E. Wiley Liss Inc. 2002. P. 672.
70. Rogers S.O. Bendish A.J. In Plant Molecular Biology Manual. Dordrecht. Kluwer Academic publishers. 1988. P. 1-10.
71. Rommens C.M., Humara J.M., Ye J.S., Yan H., Richael C., Zhang L., Perry R., Swords K. Crop improvement through modification of the plant's own DNA // Plant Physiol. 2004. V. 35. P. 421-431.
72. Sha Y., Li S., Pei Z., Luo L., Tian Y., He C. Generation and flanking sequence analysis of a rice T-DNA tagged population // Theor Appl Genet. 2004. V. 108. P. 306-314.
73. Speulman E., Metz P.L.J., van Arkel G., Hekkert B.L., Stiekema W.J., Pereira A. A Two Component Enhancer - Inhibitor Transposon Mutagenesis System for Functional Analysis of the Arabidopsis Genome // The Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1853-1866.
74. Srivastava V., Vasil V., Vasil I.K. Molecular characterization of the fate of transgenes in transformed wheat (Triticum aestivum L.) // Theor Appl Genet. 1996. V. 92. P. 1031-1037.
75. Stougaard J. Substrate-dependent negative selection in plants using a bacterial cytosine deaminase gene // Plant. J. 1993. V. 3. P. 755-761.
76. Sugita K., Kasahara Т., Matsunaga E., Ebinuma H. A transformation vector for the production of markerfree transgenic plants containing a single copy transgene at high frequency // Plant J. 2000. V. 22. P. 461-469.
77. Sviatashev S.K., Pawlowski W.P., Makarevitch I., Plank D.W., Somers D. Complex transgene locus structures implicate multiple mechanisms for plant transgene rearrangement. The Plant Journal (2002), 32, pp. 433-445.
78. Takano M., Egawa H., Ikeda Joh-E, Wakasa K. The structures of integration sites in transgenic rice // The Plant Journal. 1997. V.l 1. № 3. P. 381-361.
79. Tinland B. The integration of T-DNA into plant genomes // Trends in Plant Science. 1996. V. 1. № 6. P. 178-183.
80. Того N., Datta A., Carmi O.A., Young C., Prusti R.K., Nester E.W. The Agrobacterium tumefaciens virCl gene product binds to overdrive, a T-DNA transfer enhancer//J. Bacteriol. 1989. V. 171. P. 6845-6849.
81. Того N., Datta A., Yanofsky M., Nester E. Role of the overdrive sequence in T-DNA border cleavage in Agrobacterium II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 8558-8562.
82. Tzfira Т., Li J., Lacroix В., Citovsky V. Agrobacterium T-DNA integration: molecules and models // Trends in Genetics. 2004. V. 20. № 8. P. 375-383.
83. Waters V.L., Guiney D.G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication // Mol Microbiol. 1993. V. 9. P. 11231130.
84. Wenck A.R., Czako M., Kanevski I., Marton L. Frequent collinear long transfer of DNA inclusive of the whole binary vector during Agrobacterium-mediated transformation // Plant Mol Biol. 1997. V. 34. №> 6. P. 913-22.
85. Wenck A.R., Quinn M., Whetten R.W. Pullman G., Sederoff R. High-efficiency Agrobacterium-mQ<\\a.iQ& transformation of Norway spruce (Picea abies) and loblolly pine {Pinus taeda) I/ Plant Mol. Biol. 1999. V. 39. P. 407-416.
86. Winkler R, Feldmann K.A. Identifying T-DNA insertion mutants in Arabidopsis using PCR // Methods in molecular biology, Arabidopsis protocols. Martinez-Zapater, J.M and Salinas J. (eds.). 1998. V. 82. P. 129-136.
87. Wu H., Sparks C.A., Jones H.D. Characterisation of t-DNA loci and vector backbone sequences in transgenic wheat produced by Agrobacterium-mediated transformation // Mol. Breeding. 2006. V. 18. P. 195 208.
88. Yin Z, Wang G-L. Evidence of multiple complex patterns of T-DNA integration into the rice genome // Theor Appl Genet 2000. V. 100. P. 461-470.
89. Zambryski P., Depicker A., Kruger K., Goodman H.M. Tumour induction by Agrobacterium tumefaciens: analysis of the boundaries of T-DNA // J. Mol. Appl. Genet. 1982. V. 1. № 4. P. 361-370.
90. Zhang J., Guo D., Chang Y., You C., Li X., Dai X., Weng Q., Zhang J., Chen G., Li X., Liu H., Han., Zhang Q., Wu C. Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed by analyzing 13 804
91. T-DNA flanking sequences from an enhancer trag^rlutant library // The Plant Journal. 2007. V. 49. P. 947 - 959.
92. Zhong G.-Y. Genetic issues and pitfalls in transgenic plant breeding // Euphytica. 2001. V. 118. P. 137-144.
93. Zhu Y., Nam J., Humara J.M., Mysore K.S. et al. 2003. Identification of Arabidopsis rat mutants. Plant Physiology, v. 132, 494-505.
94. Zhu J., Oger P.M., Schrammeijer В., Hooykaas P.J., Farrand S.K., Winans. The Bases of Crown Gall Tumorigenesis // J. Bacterid. 2000. V. 182. № 14. P. 3885-3895.
95. Ziemienowicz A. Odyssey of Agrobacterium T-DNA // Acta Biochimica Polonica. 2001. V. 48. № 3. P. 623-635.
96. Zupan J., Muth T.R., Draper O., Zambryski P. The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights // The Plant Journal. 2000. V. 23. № 1. P. 11-28.
-
Пермякова, Наталья Владиславовна
-
кандидата биологических наук
-
Новосибирск, 2008
-
ВАК 03.00.15
- Изучение экспрессии гетерологичных и собственных генов у трансгенных растений
- Создание и оценка трансгенных растений картофеля устойчивых к грибным болезням
- Биотехнологические основы селекционной технологии моркови
- Конструирование трансгенных растений Nicotiana tabacum, экспрессирующих ген дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis
- Конститутивная и индуцибельная экспрессия генов экспансинов в трансгенных растениях табака
