Изучение экспрессии гетерологичных и собственных генов у трансгенных растений

Дейнеко, Елена Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение экспрессии гетерологичных и собственных генов у трансгенных растений
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение экспрессии гетерологичных и собственных генов у трансгенных растений"

На правах рукописи

Изучение экспрессии гетерологичных и собственных генов у трансгенных растений (на примере Мсойапа гаЪасиш Ь.)

Генетика - 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в лаборатории гетерозиса растений Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор, академик РАН В.К. Шумный

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, академик РАН СВ. Шестаков

доктор биологических наук,

профессор

Э.С. Пирузян

доктор биологических наук,

профессор

Л.А. Лутова

Ведущая организация:

Центр «Биоинженерия» РАН, Москва

Защита состоится июня 2004 года в_часов на заседании

Диссертационного совета Д002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс:(095)132-89-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан_апреля 2004 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук . . Г.Н. Полухина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Генетическая инженерия растений представляет собой новое направление в деятельности человека, позволяющее целенаправленно, по заранее намеченной программе экспериментально модифицировать геном растений. Необходимо подчеркнуть, что разработанные к настоящему времени генно-инженерные методы и подходы дают возможность перестраивать геном растения с использованием генетической информации из разных гетерологических систем: вирусов, бактерий, насекомых, животных и человека. Более того, при использовании генно-инженерных методов существенно расширяются возможности модификации генома и внутри растительного царства, снимающие естественные барьеры между отдаленными видами растений. Таким образом, дополнительно к традиционным селекционно-генетическим методам могут быть добавлены методы генетической инженерии, что позволит существенно расширить границы формообразовательного процесса при создании исходного материала. Реализация таких программ невозможна с использованием только традиционных методов селекции.

Успех любой селекционно-генетической программы, направленной на улучшение хозяйственно ценных признаков у растений с применением методов генетической инженерии, определяется высоким и стабильным уровнем экспрессии перенесенных генов. Уже через несколько лет после создания первых трансгенных растений стало очевидно, что гете-рологичные гены функционируют в новом окружении растительного генома не всегда так, как предполагалось (Matzke et al, 1989; Linn et al, 1990). Несмотря на то что интегрированные в геном растения-реципиента фрагменты экзогенной ДНК становились его облигатным компонентом (трансгеном), сохранялись в последующих поколениях как неотъемлемая часть генома и наследовались согласно законам Менделя (Potrykus et al, 1985; Budar et al, 1986; Heberle-Bors et al, 1988; Christou et al., 1989), к настоящему времени накоплено достаточно много примеров отклонений от менделевского наследования, обусловленных инакти-вированием гетерологичных генов (Matzke et al, 1989; 1998; Mejer et al., 1992; Itoch et al, 1997; Wang, 2000; Ma, Mitra, 2002). При создании трансгенных растений инактивирование трансгенов, известное как «gene silencing», представляется как нежелательное явление (Finnegan, McElroy, 1994; Brandle etal, 1995; Palauqui, Vaucheret, 1995).

Необходимо отметить, что замолкание генов встречается не только у трансгенных растений. Так, парамутации у кукурузы были известны задолго до обнаружения эффекта инактивации перенесенных генов (Brink, 1973). Однако только сравнительно недавно стали обозначаться общие черты между этими явлениями СМаЫсе et л/., 2000V енные

РОС. НАЦИОНАЛ БИБЛИОТЕК

СЛспИт О» ТОО ft«'

растения, у которых перенесенные гены относительно легко идентифицируются и находятся в инактивированном состоянии, могут служить уникальными моделями для изучения молекулярно -генетических механизмов замолкания трансгенов, а также поиска путей преодоления этого феномена. Поэтому накопление любых экспериментальных фактов, касающихся феномена инактивации трансгенов, может послужить важным шагом в его понимании, что явится дополнением к фундаментальным представлениям о функционировании генов в растениях.

Применение новых технологий, позволяющих модифицировать геном растений введением в него чужеродных генов, ставит перед исследователями ряд проблем, связанных как с функционированием самих ге-терологичных генов в новом окружении генома растений, так и их влиянием на функционирование собственных генов растения. Подобно мобильным генетическим элементам (McClintock, 1958), инсерции трансгенов в зависимости от места встраивания могут менять экспрессию отдельных генов у трансгенных растений, что фенотипически может выражаться в изменении каких-либо признаков у растений, в том числе и морфологических (Koncz et al, 1990; Tinland, 1996; Klucher et al, 1996; Azpiroz-Leehan et al, 1997; Fu et al, 2000). Изменения различных признаков, вызванные внедрением фрагментов экзогенной ДНК, классифицируются как инсерционные мутации (Feldmann et al, 1989). В настоящее время мутации, индуцированные у трансгенных растений внедрением фрагментов экзогенной ДНК, достаточно широко используются в ряде ведущих зарубежных биотехнологических центров для идентификации и клонирования генов, что является важным направлением в исследованиях по анализу структурно-функциональной организации генома растений (Feldmann et al, 1991; Rerie et al, 1994; Ohshima et al, 1997; Томилов и др., 1999).

Цель и задачи исследования. Цель данной диссертационной работы - исследование эффектов проявления гетерологичных генов в новом окружении растительного генома, а также эффектов проявления собственных генов (Т-ДНК мутации) у трансгенных растений.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Дать оценку стабильности экспрессии перенесенных генов на примере случайной выборки независимо полученных трансгенных растений табака.

2. Проанализировать стабильность сохранения перенесенного гена nptll у потомков двух независимо полученных трансгенных растений с одной инсерцией Т-ДНК на геном в течение нескольких поколений (при самоопылении).

3. Создать транс генные растения табака, моделирующие нестабильный уровень экспрессии маркерного гена ирШ введением дуплици-рованных фрагментов в состав генетических конструкций. Исследовать стабильность экспрессии ирШ-гена у полученных модельных трансгенных растений табака и их гибридов.

4. Создать модельные трансгенные растения табака на основе гибридов, полученных от скрещивания трансформантов со множественными инсерциями ирШ-гена. Оценить влияние на стабильность проявления экспрессии маркерного гена ирШ числа инсерций Т-ДНК.

5. Определить частоты появления растений с мутантным фенотипом среди трансгенных растений табака и создать коллекцию Т-ДНК индуцированных мутаций с измененным строением цветка и пониженной мужской фертильностью.

6. Изучить характер проявления и наследование мутантного фенотипа с измененным строением цветка и пониженной мужской фертиль-ностью у созданных трансгенных растений табака. Описать цитологический фенотип проявления мутации (нарушения мейоза, микроспоро- и микрогаметогенеза).

7. Оценить частоты встраивания в геном трансгенных растений фрагментов векторных ДНК.

8. Провести анализ нуклеотидных последовательностей районов интеграции Т-ДНК инсерций у отдельных трансгенных растений.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые проведен детальный анализ экспрессии гетерологичных и собственных генов на примере больших выборок исходных трансгенных растений табака (Ы. (аЬасит L.). Оценка стабильности экспрессии гете-рологичных генов (в частности, маркерного гена ирШ) проводилась у потомков от самоопыления как трансгенных растений, так и гибридов от их скрещивания в селективных условиях. Используемый подход позволяет применять микробиологические методы широкомасштабного скрининга больших выборок (тысячи и десятки тысяч индивидуальных трансгенных растений) и выявлять отдельные особенности функционирования трансгенов в новом окружении растительного генома.

На основании результатов, полученных при выполнении данной диссертационной работы, становится очевидным, что если гетерологич-ные гены и выступают как облигатный компонент генома в случайной выборке независимо полученных трансгенных растений табака, экспрессия их может быть нарушена и фенотипически они могут не проявляться среди потомков. Установлено, что у большей части независимо полученных методом агробактериального переноса трансгенных растений табака маркерный ген ирШ наследуется потомками первого поколения от самоопыления в соответствии с законами Менделя, что свидетельствует о со-

хранении его стабильного уровня экспрессии. Отклонения от менделев-ского расщепления, характеризующие нестабильный уровень экспрессии гетерологичных генов, в долевом отношении выявляются в 6 % и полная потеря экспрессии - в 2 % случаев. На основании детального анализа наследования гетерологичных генов у гибридов от скрещивания трансгенных растений с одной и множественными Т-ДНК-инсерциями впервые показано, что среди 50 реципрокных комбинаций скрещиваний трансгенных растений табака с одной инсерцией Т-ДНК уже в Б2 наблюдаются отклонения от менделевского расщепления по дигибридной схеме. Увеличение числа инсерций, интегрированных в разные группы хромосом, не влияло на стабильность экспрессии гетерологичного гена: случаев полного инактивирования нрШ-гена у гибридов от скрещивания трансформантов со множественными инсерциями Т-ДНК в разные группы хромосом не выявлено. Полученные результаты могут служить основой при создании хозяйственно ценных сортов на основе объединения нескольких гетерологичных генов в геноме гибридов.

На примере линии трансгенных растений табака впервые выявлено три аллелъных состояния нрМ-гена. (активное, инактивированное и реактивированное). Проведен генетический анализ взаимодействия аллелей нрШ-гена. Установлен доминантный характер наследования алле-ля, определяющего активное состояние «рЛ-гена по отношению к рецессивному характеру наследования аллеля, определяющего его инактивированное состояние. Реактивированное состояние аллеля обусловлено возможной мутацией другого гена растения.

Создана серия трансгенных растений табака, моделирующих нестабильный уровень экспрессии гена нрМ введением дуплицированных повторенных фрагментов (в прямой и обратной ориентации) в состав Т-ДНК инсерций. Впервые показано, что инактивация гомологичных трансгенов существенно возрастает в геноме гибридных растений. Полученные результаты представляют большое значение для дальнейших как фундаментальных, так и прикладных исследований по изучению функционирования генов растений.

Впервые создана коллекция трансгенных растений табака, проявляющих мутантный фенотип (измененное строение цветка и пониженный уровень мужской фертильности). Установлено, что растения с му-тантным фенотипом выявляются среди независимо полученных транс-формантов с частотой около 5 %. Инсерционная природа наблюдаемых отклонений для большей части растений подтверждена сцепленным характером наследования измененного признака и устойчивости к антибиотику. Установлены причины, приводящие к снижению мужской фертильности: нарушения мейоза, связанные с образованием деформированных ядер в телофазе I, изменением ориентации веретен деления в

метафазе II мейоза, перфорацией клеточной стенки с образованием ци-томиктических каналов и перемещением по ним хроматина из одного мейоцита в другой, а также нарушения на отдельных стадиях микроспоро- и микрогаметогенеза, связанные с разрушением содержимого пыльцевых зерен перед стадией первого постмейотического деления и массовой деградацией уже сформировавшейся пыльцы. Созданные растения представляют интерес для дальнейшего анализа флорального морфогенеза, микроспоро- и микрогаметогенеза.

Установлено, что при агробактериальной трансформации одновременно с Т-ДНК как вектором в геном растения могут быть перенесены фрагменты бактериальной ДНК. Полученные результаты представляют интерес при разработке и уточнении правил по биобезопасности использования генетически-модифицированных организмов.

Результаты, полученные в ходе исследования, необходимо учитывать при проведении работ по созданию генетически-модицированных растений, а также оценке биобезопасности полученных трансгенных организмов. В настоящее время полученные данные используются при чтении лекций в курсе «Генетическая инженерия растений» в Томском государственном университете.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной конференции «Биотехнология растений и молекулярная биология» (Москва, 1991); Международной конференции «Биотехнология растений и генетическая инженерия» (Киев, 1994); на III Международной конференции по геному растений (Сан-Диего, США, 1995); на Международной конференции, посвященной памяти акад. А.А. Баева (Москва, 1996); на Рабочем российско-германском совещании по биотехнологии (Санкт-Петербург, 1996); на Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997); на Международной конференции «Новые направления биотехнологии» (Москва, 1998); на Международном конгрессе «Биотехнология растений и in vitro биология в 21-м веке» (Ерусалим, Израиль, 1998); на Всероссийском симпозиуме «Изучение генома и генетическая трансформация растений» (1999, Иркутск); на IV съезде Общества физиологов растений (1999, Москва); на II съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000); на Международной конференции «Биотехнология растений - взгляд в 21-й век» (2000, Костинброд, Болгария); на Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва-Минск, 2001); на 1-м Международном конгрессе «Биотехнология -состояние и перспективы развития» (Москва, 2002); на 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Москва, 2003); на 8-й Международной конференции «Биология клеток

растений in vitro и биотехнология» (Саратов, 2003); на 2-м Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), на научных семинарах в лаборатории биологии растительной клетки университета г. Вагенингена (Нидерланды, 2002), на межлабораторном семинаре по генетике растений Института цитологии и генетики СО РАН (2003).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 198 страницах, включает стандартные разделы и приложение, иллюстрирована 36 таблицами и 54 рисунками. Список цитируемой литературы включает 249 наименований. Фактический материал получен автором лично, а также в ходе работ с сотрудниками Института цитологии и генетики СО РАН и с сотрудником Института физико-химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН М.Л. Филипенко, сотрудниками лаборатории биологии растительной клетки университета г. Вагенингена (Нидерланды), которым автор приносит глубокую и искреннюю благодарность.

По теме диссертации опубликовано 24 работы в российских и международных рецензируемых журналах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве моделей для изучения стабильности экспрессии перенесенных генов использовали трансгенные растения табака Nicotiana tabacum L., полученные на основе сорта «Gatersleben» и линии SR1 (семена были любезно предоставлены доктором Р. Менделем; Институт генетики растений и растительных ресурсов (IPK), Гатерслебен, Германия).

Трансгенные растения получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков согласно общепринятому протоколу (Horsh et ah, 1985). Для трансформации растений табака использовали штамм A tumefaciens С58С1Ш^ (PGV2260) (Deblaere et al, 1987).

Стабильность экспрессии гена nptll определяли по соотношению канамицин-устойчивых и канамицин-неустойчивых потом-

ков, полученных от самоопыления исходных трансгенных растений на селективной среде (Murashige, Skoog, 1962) с добавлением канамицина (100 мг/л). Растения, у которых nptll-тен наследовался как доминантный согласно законам Менделя, относили к группе трансформантов со стабильной экспрессией анализируемого гена. У растений с нестабильной экспрессией ^^/-гена в поколениях наблюдали отклонения от менделев-ского расщепления, мозаичность в проявлении Km-устойчивого фенотипа на уровне соматических тканей (чередование белых и зеленых секторов на листьях) и полную потерю устойчивости к антибиотику (рис. 1).

Геномную ДНК растений выделяли по стандартной методике (Ман-ниатис и др., 1994). Гибридизацию фрагментов ДНК на нейлоновых

фильтрах фирмы «Amersham» проводили по методу Саузерна с модификациями (Дрейпер и др., 1991). Активность фермента неомицинфос-фотрансферазы II определяли стандартным методом Рейса (Reiss et al.t 1984). Для клонирования векторной ДНК использовали метод ПЦР с тремя парами праймеров: на геномную ДНК растений GP1/2, на nptll-ген, на векторную ДНК (Bdl/2, Bd3/4). ПЦР анализ для двух пар праймеров на векторную ДНК проводили независимо. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, содержащих прилежащие к трансгену области геномной ДНК, определяли секвенированием по методу Сенгера (Манниатис и др., 1994). Для компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей выделенных фрагментов ДНК применяли программу «BLAST» с использованием базы данных «Gene Bank».

Рис. 1. Схема отбора потомков с Кт+-фенотипом у трансгенных растений табака. Слева соотношение Кт- соответствует 3 : 1, справа Кт"-фенотип.

Нестабильность экспрессии ^^/-гена оценивали введением в состав генетических конструкций дуплицированных фрагментов (uidA - ген в прямой и обратной ориентации). Для проведения детального анализа изменения экспрессии маркерного гена nptll в течение нескольких поколений от самоопыления использовали два растения случайно отобранные из восьми растений с моногенным наследованием ^Ш-гена.

Для выявления нарушений, приводящих к стерильности пыльцевых зерен у трансгенных растений с мутантным фенотипом, анализировали мейоз, микроспоро- и микрогаметогенез по общепринятым методикам (Паушева, 1980). Различные типы цитологических нарушений при делении мейоцитов выявляли на ультратонких срезах пыльников, предварительно фиксированных в жидком пропане. Для анализа микротрубочко-вого цитоскелета в клетках развивающихся пыльников использовали иммунохимическое окрашивание с антителами к альфа-тубулину. Окрашивание микротрубочек проводили совместно с окрашиванием ДНК пропидиум иодидом. Срезы анализировали с помощью флюоресцентного микроскопа (Nikon Labophot) или конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Biorad MRC600). Для выявления ДНК и каллозы использовали окрашивание срезов с 1 мг/мл DAPI phenylindole; Sigma), каллозные оболочки окрашивали 2 % анилиновым голубым в 20 % водном растворе К3РО4. Для изучения отдельных стадий

мейоза дополнительно использовали микроскопирование (В1С, КошагеК) на свежеизолированных препаратах пыльников; стадии развития пыльцы исследовали на сканирующем электронном микроскопе (^М-бЗООБ) с предварительным криозамораживанием пыльников. Для электронно-микроскопического анализа цитомиксиса использовали трансмиссионный электронный микроскоп (JEOL 1200ЕХ).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Изучение экспрессии гетерологичных генов у трансгенных растений табака

1. Стабильность экспрессии и наследование ^Ш-гена в случайной выборке независимо полученных трансгенныхрастений табака

Суммарные данные, отражающие долевое соотношение групп трансформантов с различным числом Т-ДНК инсерций и различным уровнем экспрессии прШ-гена. в случайной выборке независимо полученных трансгенных растений табака линии представлены на рисунке 2. В анализируемой нами популяции у большей части трансгенных растений (73,5 %) щШ-гена стабильно экспрессировался и наследовался в соответствии с законами Менделя для моно- и дигибридного типов расщепления, что для отдельных транс формантов было подтверждено блот-гибридизацией по Саузерну (рис. 3) и соответствующим соотношением в

условиях селективной среды (табл. 1). Меньшая часть растений (26,5 %) включала трансформанты с отклонениями от менделевского расщепления, множественными Т-ДНК инсерциями и потерей Кт-устойчивости. Эта часть трансформантов потенциально может быть отнесена к растениям с нестабильной экспрессией перенесенных генов.

Таблица 1

Сопоставление данных о числе инсерций с данными по расщеплению гибридов от скрещивания моноинсерционных трансформантов в условиях селективного отбора

Номер гибридного растения Число инсерций у по Саузерну Число растений р2 Расщепление х2

Кщ Кщ фактич. теоретич.

№»45 х №411(2) 2 341 20 17,1:1 15:1 0,310*

№49 х №44(1) 2 334 9 37,1:1 15:1 7,697

№49 х №44(2) 2 248 11 22,5:1 15:1 1,773*

* Фактическое расщепление соответствует теоретическому при х2*ю,05 = 3,841 = 1). В скобках указаны номера гибридных растений.

Рис 2 Структура популяции трансгенных растений табака (линия SRI) по числу Т-ДНК инсерций и характеру экспрессии nptll-гена у потомк®|от самоопыления

Рис 3 Гибридизация по Саузерну геномных ДНК трансгенных растений и их гибридов 1-4 - ¿соМ-гидролизаты ДНК растений 49, 44, 45 и 41, 5-7 - £соШ-щцролизаты ДНК Рирастений от скрещивания 45 х 41 и 44 х 49 (прямого и обратного) соответственно

Нестабильность экспрессии перенесенных генов часто связывают с интеграцией нескольких копий трансгена как в один, так и в разные районы генома, тогда как моноинсерционные встройки более стабильны и являются предпочтительными при создании трансгенных растений (Cherdshewasart в1 а1, 1993; FlaveU, 1994; Matzke MA., Matzke АШ., 1995). На основании полученных нами результатов по анализу соотношений 1С : Кт"-потомков у растений как с одной, так и с несколькими встроенными в разные группы хромосом Т-ДНК инсерциями можно заключить, что «дальнейшая судьба» перенесенных генов определяется в

первую очередь особенностями отдельных событий интеграции фрагментов экзогенной ДНК. Так, при самоопылении трансформантов, несущих в геноме три и более встроек в разные группы хромосом, соотношение Кш+ : КпТ-потомков соответствовало теоретически ожидаемым (табл. 2). Более того, у гибридов от скрещивания таких растений между собой, у которых число инсерций возрастает, нами не было выявлено ни одного случая полного инактивирования nptll-rem. Тогда как среди 50 прямых и обратных гибридных комбинаций, полученных от скрещивания моноинсерционных трансформантов, в 18 % случаев нами были зарегистрированы отклонения от менделевского расщепления для дигиб-ридных схем. Таким образом, инсерций трансгена могут происходить в такие области генома, где гетерологичные гены будут стабильно экспрессироваться и наследоваться даже при изменении в геноме числа гомологичных встроек. Если же встройки произойдут в район, в котором возможность инактивирования перенесенного гена (генов) будет повышена, то в дальнейшем с большей вероятностью будет происходить нарушение экспрессии перенесенных генов.

Таблица 2

Расщепления по гену nptll в первом и втором поколениях от самоопыления трансгенных растений табака

Номер растения

Расщепление

число растений Кт : Кт

фактическое (теоретическое)*

Расщепление

число растений Кщ I Кт

фактическое (теоретическое)

45 410 412 78 714

387:9 343:6 206:2 309:3 300:0 417: И 223:4

43,0:1 (63 :1) 57,2 :1 (63 :1) 102,0 :1 (>63:1) 103,0:1 (>63 :1) 300,0:0 (>63 :1) 37,9:1 (63:1) 55,8: 1 (63 :1)

411:6 352:16 206:0 254:0 247:5 452:21 428:0

68,5 :1 (63 : 1) 22,0 :1 (£15 :1) 206,0:0 (¿63 :1) 254,0: 0 (>63:1) 55,0:1 (63 :1) 21,5:1(15:1) 428,0: 0 (>63: 1)

* Соответствие фактического расщепления теоретическому оценивалось критерием

2. Экспрессия ^Ш-генау трансгенных растений табака с отклонениями от менделевского наследования

Среди группы трансгенных растений с отклонениями от менделевского наследования, выделенных при анализе случайной выборки независимо полученных трансформантов, особый интерес представляло растение N^1, потомки которого на селективной среде с антибио-

тиком канамицином стабильно проявляли мозаичный фенотип. Однако среди потомков этого растения были выделены отдельные трансформанты, у которых доля растений с мозаичным фенотипом либо уменьшалась (№21/5), либо увеличивалась (№21/6) (табл. 3). Присутствие на фореграмме двух близко расположенных полос у всех проанализированных потомков растения №21 во втором и третьем поколениях от их самоопыления (рис. 4) свидетельствовало о близком расположении двух инсерций в пределах одной хромосомы и их сцепленном наследовании. Таким образом, случайная интеграция гетерологичных генов в виде двух тесно сцепленных фрагментов Т-ДНК влияет на особенности проявления ^Ш-гена. у растения N^21.

8 9 • '3 23456789

Рис 4 Блот-шбрвдизация геномных ДНК трансгенных растений табака N1121 с 32Р-меченым фрагментом тшпрШ. потомки Тг (елею) ипотомки Тэ (справа)

3. Моделирование нестабильной экспрессии прШ-гена у трансгенных растений табака

Влияние дуплицированных фрагментов ДНК в районе встройки на стабильность экспрессии маркерного гена оценивали у потомков от самооопыления независимо полученных трансформантов, у которых ^Ш-ген находился в «соседстве» с двумя генами uidA, представленными в виде тандемно сцепленных фрагментов в прямой и обратной ориентации в пределах Т-ДНК-инсерции.

Наличие дуплицированных фрагментов в составе Т-ДНК-инсерций приводило к снижению стабильного уровня экспрессии 'лрШ-гена у созданных нами трансгенных растений табака уже в первом поколении от самоопыления исходных трансформантов (табл. 4). Доля потомков с нестабильным характером проявления анализируемого гена у растений с дупликацией по гену uidA (в обратной ориентации) составила 80,0 %. Среди растений с нестабильным уровнем экспрессии ^Ш-гена значительно возросла доля потомков с мозаичным фенотипом (61,3 % против 26,3 % в контроле). Необходимо подчеркнуть, что снижение стабильности экспрессии маркерного гена наблюдалось не у всех трансформантов с дуплицированным uidA-геном (в обратной ориентации): 20 % растений этой группы проявляли стабильный характер наследования прШ-гена (табл.4). Вероятно,механизм,

Таблица 3

Анализ стабильности экспрессии ^Ш-гена у Тг и Тз потомков трансгенного растения табака №21

' Фактическое расщепление соответствует теоретическому при х'яо.и = 3,841 (<!.£ = 1).

основанный на опознавании дуплицированных фрагментов в обратной ориентации, не универсален и, возможно, какие-либо дополнительные звенья его запускания и отсутствуют у выявленных трансгенных растений со стабильным уровнем экспрессии пЬШ -гена.

Таблица 4

Стабильность экспрессии маркерного гена нрШ в потомстве от самоопыления исходных трансгенных растений табака

Исходные трансгенные растения

Уровень экспрессии теиапрШ . №121 (контроль) №16 (дупликация гена шсЫ в прямой ориентации) №10 (дупликация гена шс1А в обратной ориентации)

Стабильный 65,0 62,6 20,0

Нестабильный 35,0 37,4 80,0

из них доля растений: - с мозаичным феноти- 26,8 26,3 61,3*

пом;

- с отклонениями от 7,2 8,1 16,0

менделевского расщепления; 1,0 3,0 2,7

- с полной потерей

экспрессии трансгена

Всего проанализировано растений 97 99 75

* Имеется достоверное различие с контролем.

Интересным дополнением к проявлению механизма инактивирова-ния гетерологичных генов могут служить полученные нами данные по изучению экспрессии нрШ-гена у гибридов от скрещивания трансформантов с дуплицированным ^Ш-геном (в прямой ориентации). Для получения гибридов использовали только те трансформанты, у которых соотношение Кт+: Кт"-потомков соответствовало 3:1. Присутствие, в структуре Т-ДНК двух копий гена ш<1А в прямой ориентации у взятых для скрещиваний исходных родительских растений подтверждалось наличием в их геномной ДНК фрагмента длиной 1247 пар нуклеотидов (рис. 5). На основании сравнительного анализа двух групп F1 растений установлено драматическое снижение стабильности экспрессии нрй1-гена у гибридов с дуплицированным Ш(1А-гетм. Если в 126 прямых и обратных комбинациях скрещиваний у растений контрольной группы (табл. 5) отклонения от менделевского расщепления наблюдались только

в 7 случаях (5,5 % от общего числа проанализированных вариантов), то в модельной группе (табл. 6) - в 90 случаях (71,4 %).

Таблица 5

Анализ расщепления в потомствах от скрещивания трансгенных растений табака с одной инсерцией Т-ДНК (ген шёА в виде уникальной последовательности)

ьв

иША

прШ

Схема Т-ДНК иясерцни

ИВ

-О-

Примечание. В закрашенных ячейках представлены результаты скрещиваний растений, проявляющих отклонения от менделевского расщепления.

12 3 4 5 67 8 9 10 11

Рис. 5. ПЦР-анализ исходных трансгенных растений табака с прямым тандемным повтором гена шёА в структуре Т-ДНК.

1 - ПЦР без ДНК; 2 - отрицательный контроль, ДНК растения 121,9; 3 - ДНК плазми-ды рВ1-(01и)2-Б; 4-10-ДНК растений № 16,22; 16,36; 16,40; 16,48; 16,53; 16,74; 16,83 соответственно; 11 - маркер молекулярной массы

Таблица 6

Анализ расщепления в потомствах от скрещивания трансгенных растений табака с одной инсерцией Т-ДНК (ген uidA в виде тандемного повтора в прямой ориентации)

4. Экспрессия прМ-гена у трансгенных растений табака при инбридинге

Известно, что один и тот же ген может быть представлен в геноме растения несколькими состояниями (множественный аллелизм). В исследуемых нами моноинсерционных модельных линиях трансгенных растений табака Т0-5 и Т0-6 после ряда нескольких последовательных самоопылений произошло изменение исходного состояния пр!//-гена среди потомков линии Т0-5 (рис. 6). Такое изменение в терминах классической генетики следует рассматривать как мутацию, т.е. переход гена от «дикого типа» к мутантному. В данном случае «дикий тип» фенотипически проявлялся как Km-устойчивость, а мутантный как Кга-неустойчивость.

Рис. 6. Схема создания двух линий (То-5 и То-6) трансгенных растений табака. Аллельные состояния nptll-гена:

е: © - инактивигюванное;0 К - {

- активное; V" - инактивированное;^-/ к - реактивированное.

Как видно из данных таблицы 7, у всех Кт+- и Кт~-потомков линий Т0-5 И Т0-6 в геномной ДНК содержались фрагменты, соответствующие интегрированной экзогенной ДНК. Однако фермент неомицин-фосфотрансфераза-П был активен и выявлялся МРТП-тестом только среди

Таблица 7

Анализ потомства от самоопыления трансгенных растений табака Тг-5 и Т2-6

№ растения Соотношение Кт-устойчивых и Кт-неустойчивых потомков ОТТИ ПЦР

Т2-6/5 3:1 (ирг +/-) + +

Тг-6/7 3:1 (лр/+/-) + +

Т2-6/6 Кт-устойчивые (ир/ +/пр1+) + +

Т2-6/18 Кт-устойчивые (пр1 +/пр1+) + +

Тг-5/3 Кш-устойчивые (пр1 +/пр(+) + +

Тг-5/18 3:/1 (прг +/-) + +

Тг-5/6 Кт-неустойчивые - +

Тг-5/8 Кш-неустойчивые - +

Тг-5/15 Кт-неустойчивые - +

Тг-5/17 Кт-неустойчивые - +

Среди потомков от нескольких поколений самоопылений линии Т0-5 в условиях селективной среды по устойчивости к антибиотику ка-намицину ^Ш-ген проявлялся в трех аллельных состояниях: активном, инактивированном и реактивированном (рис. 6). Частота такой реверсии составила 1 х 10"4. Все потомки растения Т0-6 характеризовались сохранением стабильной экспрессии ^Ш-гена и моногенным типом его наследования в течение 5 поколений от самоопыления.

Активное состояние анализируемого гена фенотипически проявлялось как доминантный признак, тогда как инактивированное - как рецессивный, так как соотношение Кт+- и Кт~-потомков от скрещивания трансгенных растений линии То-5 с активным и инактивирован-ным состояниями аллелей гена нрШ соответствовало 3 : 1 для моногибридного типа расщепления. Аналогичные результаты, подтверждающие рецессивный характер мутации ^Ш-гена, установленные при анализе взаимодействия анализируемых аллелей в гомозиготе, получены нами и в случае взаимодействия аллелей в дигетерозиготе (по дигибрид-ной схеме скрещиваний). Реактивированное состояние аллеля прШ-тенг, фенотипически проявлялось как доминантный признак по отношению

к инактивированному состоянию. Если рассматривать реактивированное состояние аллеля гена прШ как полную реверсию к дикому типу, то у гибридов Бг от скрещивания растений с инактивированным и реактивированным состояниями аллелей анализируемого гена следовало ожидать расщепление ЗКга+ :1Кга~. Такой тип соотношений Кп,+- и Кт~-потомков, действительно, выявлялся среди анализируемых растений. Однако наряду с вышеупомянутым вариантом имели место и растения с полным восстановлением Кт-устойчивого фенотипа, растения со значительной частью потомков с Кт-устойчивым фенотипом, а также растения с мозаичным проявлением признака (0,2-15,6%) (рис. 7). Появление таких классов растений среди потомков Бг от скрещивания растений с инактивированным и реактивированным проявлением гена наводит на мысль о возможности мутирования другого гена, маскирующего проявление исследуемой мутации.

Рис 7. Анализ активности фермента МРТП в белых и зеленых частях листовых пластинок у гибридных растений с мозаичным проявлением Кт-устойчивого фенотипа, полученных от скрещивания трансгенных растений табака линии То-5 (с инактивированным состоянием аллеля гена ^Ш) и трансгенных растений линии То-6 1-2 - экстракты из растения 21 х 6 из белой и зеленой зон соответственно, 3-4 - экстракты из растения 23 х 6 из белой и зеленой зон соответственно, 5-6 - экстракты из растения 19 х 6 из белой и зеленой зон соответственно; 7 - экстракт из нетрансгенного растения (отрицательный контроль), 8 - экстракт из трансгенного растения линии То-5 с инактивированным состоянием гена и^Й/(отрицательный контроль), 9 - экстракт из трансгенного растения линии То-5 с активным состоянием гена npttt (положительный контроль)

Для всех проанализированных образцов Кт~-растений число хромосом было равно 48 (2и = 48), что является основным числом хромосом для растений этого вида. Изменение концентраций канамицина в среде для культивирования Кт"-растений in vitro не оказывало влияния на проявление Km-неустойчивого фенотипа. Однако изменение экзогенного уровня фитогормонов в среде для культивирования листовых эксплантов привело к восстановлению Km-устойчивого фенотипа у части растений-регенерантов. Предположение о влиянии других гормональных факторов, возможное перемещение которых с общими потоками веществ в растении приведет к изменению экспрессии гена nptll и восстановлению Km-устойчивости, оказалось несостоятельным, что подтверждалось экспериментами с реципрокными прививками.

Изучение экспрессии собственных генов у трансгенных растений табака

1. Создание и анализ коллекции трансгенных растений табака с мутантным фенотипом

В связи с развитием работ по модификации генома растений методами генетической инженерии, а также с возрастающими масштабами использования трансгенных растений в коммерческих целях представляется чрезвычайно важным выяснение влияния чужеродной ДНК на экспрессию собственных генов растения, и в особенности выявление и анализ мутационных эффектов введенных в геном фрагментов рекомбинантной ДНК. Это позволит исследовать изменчивость у трансгенных растений, вызванную интеграцией в растительный геном Т-ДНК инсерций и, возможно, инсерций векторной рекомбинантной ДНК, а также получить новые данные о механизмах наблюдаемых процессов.

Среди 580 независимо полученных трансгенных растений табака (линия SR1) с частотой 5,5 % были выявлены отдельные трансформанты с измененным строением цветка: волнистым венчиком, увеличенным в диаметре рыльцем и удлиненным пестиком (лонгостилия) (табл. 8, рис. 8). У одних линий с мутантным фенотипом проявлялись все вышеперечисленные признаки, тогда как у других - один или два в различных сочетаниях. Среди контрольных растений такие отклонения в структуре цветка не регистрировались.

Таблица 8

Частота встречаемости растений с измененным строением цветка у трансгенных растений табака

Общее число Число растений

Объект проанализированных расте- с измененным строени-

ний ем цветка*

Нетрансгенные растения

(контроль 1) 275 0

Регенеранты (контроль 2) 240 0

Трансгенные растения 580 32 (5,5 %)

* В скобках - доля растений в процентах от числа проанализированных.

Рис. 8. Изменение структуры цветка у трансгенных растений табака №4/11: удлиненный пестик (лонгостилия). Контроль - нетрансгенное растение (слева).

Так как создание трансгенных растений основано на технологиях переноса и интеграции в геном растения фрагментов экзогенной ДНК, то попадание инсерций Т-ДНК в функционально значимые районы растительного генома может приводить к нарушению проявления генов, локализованных в данной области. В таких случаях измененный признак наследуется сцепленно с устойчивостью к антибиотику (табл. 9).

Таблица 9

Анализ потомков от самоопыления трансгенных растений табака по Km-устойчивости и морфологическим признакам

Номера Соотношение потомков по Кт-устойчивости Расщепление х2 (Л£ = 1) Оценка Кга+-растений по морфологическим признакам

Кт фактическое теоретическое

№4/11 124 34 3,6:1 3:1 1,021 Лонгостилия

Яевбб 88 23 3,8:1 3:1 1,083 Волнистый венчик

Примечание. <!.£ - число степеней свободы; х2поо5~ 3,841

2. Цитологический фенотип мутации у трансгенных растений табака с измененной структурой цветка

Изменение структуры цветка коррелировало со снижением фер-тильности пыльцевых зерен (рис. 9). У большей части анализируемых растений снижение мужской фертильности было обусловлено аномалиями в отдельных стадиях мейоза, у двух трансформантов - аномалиями в микроспоро- и микрогаметогенезе.

Рис. 9. Распределение пыльцы в пыльниках нетрансгенного (слева) и трансгенного Кев79 (справа) растений табака

Обобщенная картина цитологических нарушений при формировании материнских клеток пыльцы у трансгенных растений с измененной структурой цветка в целом включала следующие отклонения:

1. Цитомиксис в профазе I первого мейотического деления материнских клеток пыльцы и перфорацию клеточной мембраны с образованием цитомиктических каналов (рис. 10). Установлено, что первые цито-миктические перемещения хроматина из одного мейоцита в другой начинаются после последнего митотического деления до вступления клеток в мейоз.

2. Образование деформированных ядер в профазе II второго деления мейоза.

3. Нарушение ориентации веретен деления в метафазе II второго деления мейоза.

4. Образование полиад. Формирование пыльцевых зерен с пониженной фертильностью.

У растения ГР4/11 перед стадией первого постмейотического деления разрушалось содержимое пыльцевых зерен, тогда как у растения №4/2 происходила массовая деградация уже сформированных пыльцевых зерен. Перечисленные выше нарушения микроспоро- и микрогаме-тогенеза приводили к формированию стерильных пыльцевых зерен.

Рис. 10 Перфорация клеточной мембраны мейоцитов и цитомиксис у трансгенных растений табака линии Res79

А - контроль, нетрансгенное растение табака, Б - перфорация клеточной мембраны (Res79), В, Г, Д - цитомиксис.

Большая часть трансформантов проявляла сцепленное наследование признаков Km-устойчивости и аномалий цветка, что свидетельствовало в пользу инсерционной природы наблюдаемых изменений, тогда как у другой части растений такое сцепление отсутствовало. Однако ин-серционная природа наблюдаемых изменений в группе растений, не проявляющих сцепленного наследования Km-устойчивости и мутантного признака, не может быть исключена. Инсерционным элементом в этом случае могли быть фрагменты векторной ДНК, поскольку в геномных ДНК трансгенных растений с мутантным фенотипом выявлялись фрагменты, соответствующие векторной (агробактериальной) ДНК (рис. 11). Из трех потомков от самоопыления Res79 фрагменты векторной ДНК обнаруживались только у двух растений и отсутствовали у одного. Следовательно, векторная ДНК, подобно Т-ДНК, стабильно передавалась через митоз и мейоз как наследуемая часть генома растений.

Рис 11 Электрофоретический анализ продуктов ПЦР реакции с вР1/2 (верхний ряд), прШ1/2(средний ряд), ББЗ/4 (нижний ряд) праймерами в 2,5 % ага-розном геле

1 - без матрицы, 2 - (контроль), 3-12 - трансгенные растения с мугангыым фенотипом, 13 - рШ 121,14 - маркёр молекулярных весов (р5К[1(+уА/зр1)

Среди 61 трансгенного растения табака (как с мутантным фенотипом, так и без него) в 33 % случаев в геномной ДНК нами выявлены фрагменты, соответствующие векторной ДНК. Среди них 9 растений несли полноразмерные копии вектора (15 %), 7 растений содержали фрагменты вектора, прилежащие к левому повтору (11 %) и 4 растения содержали последовательности, прилежащие к правому повтору (7 %). Полученные нами данные о высоком проценте растений с полноразмерными копиями векторной ДНК, интегрированными в ядерный геном, согласовывались с данными других исследователей (De Buck et al, 2000).

3. Анализ районов встраивания Т-ДНК инсерций у трансгенных растений табака

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов растительной ДНК, фланкирующих Т-ДНК-встройки у анализируемых трансгенных растений табака, выявил наличие гомологии с векторными ДНК для трансгенных растений табака с мутантным фенотипом (табл. 10).

Высокая степень гомологии выявлена для части нуклеотидной последовательности клона 121.83.3-1 с последовательностью ДНК табака, секвенированной ранее независимой группой исследователей (Iglesias et al., 1997) в Австрии при исследовании районов растительной ДНК, прилежащих к Т-ДНК встройкам (рис. 12). Авторами было показано, что данная последовательность ДНК относится к области повторов средней копийности (Iglesias et al., 1997). Не исключено, что область обнаруженной нами гомологии является коровой последова-

тельностью повтора, что свидетельствует о предпочтительности встраивания Т-ДНК в район данного семейства повторов.

Таблица 10

Результаты ПЦР анализа трансгенных растений табака с мутантным фенотипом

№ растения Праймеры

GP1/2 Nptl/2 Bdl/2 Bd3/4

1 10,57 + + - -

2 10,8 + + - -

3 16,70 + + - -

4 121,41 + + - -

5 121,57 + + - -

6 121,76 + + - -

|7 1 121,83 + + + +

S 121,86 + + - +

9 121,861) (18) + + - +

10 121,89 + + - -

11 121,92 + + - +

12 Res36 + + - -

13 Res60I| + + - +

14 Res61 + + - -

f 15 Res66I|(l) + + + +

^16 Res66I,(2) + + +

, 17 Res66I2 + + - +

18 Res73 + + - -

19 Res79I,(l) + + + -

20 Res79Ii(2) + + - -

21 Res79I|(3) + + + -

Примечание Темно-серым цветом выделены растения, у которых фрагменты геномной ДНК гибридизовались с двумя парами праймеров (БШ/2 и Бё3/4), светлосерым - только с одним из этих праймеров

Анализ областей растительной ДНК, прилежащих к правой границе у растения 121,57, выявил слабую гомологию с последовательностями ретротранспозонов A. thaliana и картофеля (Camirand, Brisson, 1990). Для растения 121,86 выявлена гомология с последовательностью Х80829, соответствующей гену PAR (Takahashi et al, 1989).

3 1 süm

10 20 30 40 50

ctgtgctcgaaatcaatatttggtgataaaattccta-tttttacttgaatatacatttt

у1253 4 attattattattattattattattattattattattagagcaaagtccaacaaatatttt 180 190 200 210 220 230

60 70 80 90 100 110_

3 1 süm gaa---at-ttttaaaaaatttaaaaaactg-gtgttgcttgaggttgaagata-^taial

y12534

caactaatatgttcgtccattgaacaaaatgcaaagttctttagagagaaatgats;

240 250 260 270 280 290

рч ^щщриД ^ ^tmvnaiMM^a^ ^ I mwi'^^P n> ■»■ ««¡цк» H^ÜWWHIHIKI«»!»^ 3Ä»

3 1 SUM t AATTGCACGGGGCGCCCTATTTGCTCTCCTCAATTTAACCTATACCC—ТТТТТАААААА

П2534

Гсттт'

Ьтп:

300 180

310 190

320 200

330 210

3 1 süm [ cttttaacttgtacctactrrtttaaacaacttc^gctctcrictcagcttcagtacctct

340 220

350 230

y12534 {ctttyafitttgtagcxact^itteft&ätaacttcagtcctc'nj-tctcctcgcttttctcc

360 240

370 250

380 260

390 270

400

410

3 1 sum caaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgactgca

y12534

TACTTCT7TTTCTTCTTCTTTC7TTCTTTCT77CTTTCTTC 420 430 440 450

Рис. 12. Выравнивание пуклеотидных последовательностей клона 3_1 и последовательности Y12534. Подчеркиванием выделены последовательности Т-ДНК, закрашена область гомологии.

Содержание АТ-пар нуклеотидов варьировало от 51 % до 74 % (табл. 11). Тенденция встраивания Т-ДНК инсерций в АТ-богатые районы у 16 проанализированных нами трансгенных растений табака не наблюдалась, поскольку общее АТ-содержание в геноме табака равно 64 % (Karlin, Mrazek, 1997). В целом в настоящее время общая картина особенностей распределения Т-ДНК инсерций в растительном геноме представляется довольно ясной только на примере A. thaliana. Однако она не отражает всех закономерностей интеграции Т-ДНК инсерций для других видов растений. Так, например, в отличие от генома A. thaliana геном табака характеризуется насыщенностью различными ретротранспозон-подобными элементами, что может сказаться на особенностях интеграции чужеродных последовательностей. Ожидаемое опубликование данных о секвенировании генома табака должно добавить информативности нашему анализу.

Таблица 11

Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов растительной ДНК, фланкирующих Т-ДНК встройки у трансгенных растений табака с мутантным фенотипом

Районы растительной ДНК, прилежащие к Т-ДНК инсерции:

Трансгенное растение с левой стороны с правой стороны

размер гомология с последовательностями из "Gene Bank" А/Г, % размер гомология с последовательностями из "Gene Bank" А/Т, %

10,48 139 - 65 300 вектор

16,70 224 - 58 171 DI 7456 52

121,41 130 - 74 133 - 51

121,57 163 - 66 212 Y08010 61

121,76 190 Z73149 53 211 - 71

121,83 223 - 70 103 Y12534 65

121,86 350 - 67 166 Х80829, PAR ген 66

121,89 - 320 - 56

Res60 300 вектор 165 - 69

Res66 550 вектор 279 - 61

Res47 313 - 64 256 Х59606 55

Res36 320 вектор 164 - 62

Res73 92 Z73149 70 200 вектор

Res79 320 вектор -

Res92 538 Х79006 68 -

10,18 430 вектор 318 М77826;Х14059, АВ058958, AJ416574, Х145934; AJ131837 70

Не совсем ясным остается вопрос об однотипности наблюдаемых изменений среди выделенных трансгенных растений табака, проявляющих мутантный фенотип. При создании исследуемой коллекции трансгенные растения отбирались только по признаку нарушения строения цветка и поэтому могли быть отобраны однотипные мутации, вызванные нарушением сложной цепи генов, принимающих участие в контроле таких процессов, как формирование цветка и, в частности, генеративных органов. Полученная нами коллекция трансгенных растений табака с мутантным фенотипом представляет уникальную модель для дальнейшего развития работ в направлении изучения мутационных эффектов ге-терологичных генов у трансгенных растений.

Выводы

1. Гетерологичные гены в новом окружении растительного генома различаются по уровню экспрессии среди независимо полученных трансгенных растений табака. Установлено, что при самоопылении исходных трансформантов большая часть трансгенов наследуется по мен-делевскому расщеплению для моно- и дигибридных типов (73,5 %). Отклонения от менделевского расщепления свидетельствуют о нестабильности их экспрессии.

2. Экспрессия гетерологичных генов может быть изменена при инбридинге. Впервые выявлено три аллельных состояния nptll-гена. (активное, инактивированное и реактивированное) и установлены их ал-лельные взаимодействия. Активное состояние прМ-гена по отношению к инактивированному проявляется как доминантный признак. Реактивированное состояние аллеля обусловлено возможной мутацией другого гена растения.

3. Нестабильный уровень экспрессии гетерологичных генов смоделирован введением дуплицированных повторенных фрагментов (в прямой и обратной ориентации) в состав Т-ДНК инсерций. Установлено, что инактивация гомологичных трансгенов с дуплицированными повторенными фрагментами (в прямой ориентации) существенно возрастает в геноме гибридных растений.

4. Нестабильный уровень экспрессии гена прШ(мозаицизм по Кт-устой-чивости) у растения Nu21 связан со спонтанной встройкой в геном двух сцепленно наследуемых трансгенов, что подтверждает влияние дуплицированных фрагментов на стабильность экспрессии гетероло-гичных генов.

5. Гетерологичные гены, а также фрагменты векторной ДНК при агро-бактериальной трансформации могут являться потенциальным источником мутационных изменений собственных генов растения. Создана коллекция трансгенных растений табака с измененным строением цветка и пониженным уровнем мужской фертильности.

6. Впервые проведен детальный цитологический анализ мейоза у трансгенных растений табака с мутантным фенотипом, выявивший серию нарушений, связанных с образованием деформированных ядер в тело-фазе I и изменением ориентации веретен деления в метафазе II мейоза, перфорацией клеточной стенки с образованием цитомиктических каналов и перемещением по ним хроматина из одного мейоцита в другой, приводящих к образованию полиад и формированию пыльцевых зерен с пониженной фертильностью.

7. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов растительных ДНК, фланкирующих Т-ДНК встройки, в отдельных случаях выявил наличие гомологии с известными нуклеотидными последовательностями «Gene Bank». Тенденция встраивания Т-ДНК инсерций в АТ-богатые районы нами не подтвердилась.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Дейнеко Е.В., Ривкин М.И., Комарова М.Л., Вершинин А.В., Шумный В.К. Генетическая трансформация люцерны методом кокультиви-рования листовых дисков //Докл. АН. 1991. Т. 19, №6. С. 1473-1476.

2. Дейнеко Е.В., Ситникова В.В., Ривкин М.И. К вопросу о стабильности встраивания и наследования чужеродных генов в геноме транс-генных растений // Особенности реконструкции генома и популяций высших растений. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 1993. С. 16-23.

3. Ривкин М.И., Дейнеко Е.В., Комарова М.Л., Кочетов А.В., Шумный В.К. Оценка вирусоустойчивости трансгенных растений табака, несущих ген бета-интерферона человека // Докл. АН. 1993. Т. 331. С. 652-654.

4. Дейнеко Е.В., Ривкин М.И., Шумный В.К. Использование методов генетической инженерии в селекционно-генетических программах по улучшению хозяйственно ценных признаков растений // Особенности реконструкции генома и популяций высших растений. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 1993. С. 5-15.

5. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Филипенко М.Л., Кочетов А.В., Шумный В.К. Изменение уровня экспрессии и наследование маркерного гена nptll в потомстве трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. // Докл. АН. 1995. Т. 344, № 3. С. 407-411.

6. Rivkin M.I., Deineko E.V., Komarova M.L., Shumny V.K. Analysis of virus resistance of tobacco and alfalfa transgenic plants bearing human P-interferone gene // Biotechnol. and Biotechnolog. Equipment. 1995. N 1. P. 40-44.

7. Deineko E.V., Zagorskaya A.A., Filipenko MX., Filipenko E.A., Novo-selya T.V., Komarova M.L., Kochetov AV., Shumny V.K. Instability of nptll gene expression in the progeny of transgenic tobacco plants // Biotechnol. and Biotechnolog. Equipment. 1996. N 3. P. 89-92.

8. Кочетов А.В., Шакирова Н.В., Лукашева В.В., Пилюгин М.В., Комарова М.Л., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Экспрессия бицистронов у трансгенных растений //Докл. АН. 1996. Т. 349, № 4. С. 549-582.

9. Кочетов А.В., Лукашева В.В., Пилюгин М.В., Комарова М.Л., Ривкин М.И., Дейнеко Е.В., МакКлин Ф., Шумный В.К. Оперонная организация транскрипционных единиц в клетках растений: экспрессия модельных бицистронов // Цитология и генетика. 1997. № 6. С. 17-28.

10. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Филипенко М.Л., Кочетов А.В., Шумный В.К. Нестабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений при инбридинге // Генетика. 1998. Т. 34, № 9. С. 1212-1219.

11. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Филипенко Е.А., Шумный В.К. Стабильность экспрессии и наследование гена nptll в популяции трансгенных растений табака// Докл. АН. 1999. Т. 369, № 3. С. 420-423.

12. Дейнеко Е.В., Сидорчук Ю.В., Загорская А.А., Новоселя Т.В., Филипенко Е.А., Шумный В.К. Аномалии строения цветков и мужская сте-

рильность у трансгенных растений табака // Докл. АН. 1999. Т. 368, № 1.С. 135-138.

13. Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Стабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака со множественными инсерциями // Генетика. 2000. Т. 36, № 3. С. 427-430.

14. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Новоселя Т.В., Филипенко ЕА, Шумный В.К. Нестабильность экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2000. Т. 47, № 3. С. 446-452.

15. Филипенко Е.А., Филипенко М.Л., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Анализ сайтов встраивания Т-ДНК у трансгенных растений табака с му-тантным фенотипом // Докл. АН. 2000. Т. 370, № 2. С. 273-276.

16. Сидорчук Ю.В., Загорская А.А., Дейнеко Е.В., Шамина Н.В., Шумный В.К. Т-ДНК индуцированные аномалии цветков и мужская стерильность у трансгенных растений табака: морфометрический и цитологический анализ // Цитология и генетика. 2000. Т. 34, № 6. С. 3-8.

17. Шамина Н.В., Дорогова Н.В., Сидорчук Ю.В., Загорская А.А., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Нарушения мужского мейоза в трансгенной линии res9l табака // Цитология. 2000. Т. 42, № 12. С. 1173-1178.

18. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Сидорчук Ю.В., Новоселя Т.В., Филипенко Е.А., Комарова М.Л., Шумный В.К. Особенности морфологических признаков и фертилыюсти пыльцы у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2000. Т. 47, № 1. С. 73-78.

19. Shamina N.V., Dorogova N.V., Zagorskaya A.A., Deineko E.V., Shum-ny V.K. Abnormalities of meiotic division caused by T-DNA tagged mutation in tobacco (Nicotiana tabacum) IICBI. 2001. V. 25, N 4. P. 367-369.

20. Novoselya T.V., Deineko E.V., Filipenko E.A., Shumny V.K. Expression stability of marker gene nptll in transgenic plants Nicotiana tabacum L. with single T-DNA insertion // Biotechnol. and Biotechnolog. Equipment. 2001. V. 15, N2. P. 3-7.

21. Загорская А.А., Дейнеко Е.В., Сидорчук Ю.В., Шумный В.К. Наследование признака измененного строения цветка и устойчивости к антибиотику канамицину у трансгенных растений табака // Генетика. 2001. Т. 37, № 6. С. 784-790.

22. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская А.А., Филипенко Е.А., Пух-начева Н.В., Шумный ВЛ. Инактивирование чужеродных генов у трансгенных растений табака (обзор) // Изучение генома и генетическая трансформация растений. Новосибирск: Наука, 2001. С. 132-142.

23. Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В. Моделирование нестабильности экспрессии nptll-гена, у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2002. Т. 49, № 3. С. 437-443.

24. Сидорчук Ю.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Цитомиксис в материнских клетках пыльцы у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) // Докл. АН. 2004. Т. 394, № 2. С. 282-285.

*йо

Подписано к печати 9 апреля 2004г. Формат бумаги 60 х 90. Печ.л. 2. Уч.издл. 1.4. Тираж 100 экз. Заказ 41.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Дейнеко, Елена Викторовна

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Стабильность экспрессии и наследование чужеродных генов у трансгенных растений.

1.1.1. Клонирование генов для переноса их в геном растений.

1.1.2. Создание генетических конструкций.

1.1.3. Перенос созданных генетических конструкций в геном растений.

1.1.3.1. Агробактериальная трансформация: генетическая карта Тьплазмиды и Т-ДНК.

1.1.3.2. Общая схема переноса Т-ДНК в клетки растений.

1.1.3.3. Перенос векторных последовательностей в процессе агробактериальной трансформации.

1.1.4. Оценка трансгенных растений по стабильности экспрессии перенесенных генов и отбор отдельных трансформантов для дальнейшей селекционной доработки.26

1.1.4.1, Наследование трансгенов у трансгенных растений.

1.1.4.2. Вариабельность экспрессии перенесенных генов.

1.2. Изменение экспрессии перенесенных генов в новом окружении генома растений: эффект замолкания.30'

1.2.1. Частота инактивирования трансгенов у независимо полученных трансгенных растений.

1.2.2. Возможные причины инактивирования трансгенов.

1.2.3. Молекулярные механизмы инактивации трансгенов.

1.2.4. Генетический контроль инактивации/реактивации трансгенов

1.3. Изменение проявления» собственных генов у трансгенных растений: Т-ДНК-индуцированные мутации.

1.3.1. Возможные причины возникновения Т-ДНК индуцированных мутаций.

1.3.2. Примеры Т-ДНК индуцированных мутаций у трансгенных растений.

1.3.3. Перспективы использования инсерционного мутагенеза.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Создание исходного материала.

2.2. Подтверждение трансгенной природы растений-трансформантов

2.3. Анализ стабильности экспрессии маркерного гена nptll на селективных средах с антибиотиком канамицином.

2.4. Анализ фрагментов векторной ДНК у трансгенных растений.

2.5. Создание коллекции трансгенных растений табака с мутантным фенотипом.

2.6. Анализ цитологического фенотипа трансгенных растений, характеризующихся измененной структурой цветка и пониженным уровнем мужской фертильности.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Анализ популяции трансгенных растений табака по стабильности экспрессии маркерного гена nptll.

3.1.1. Анализ трансгенных растений табака сорта «Gatersleben» по стабильности экспрессии «pi/7-гена.

3.1.2. Анализ трансгенных растений табака линии SRI по стабильности экспрессии nptll-YQUQ.

3.1.3. Анализ инактивированного состояния гена nptll у трансгенных растений То-10, Nu22 и 615.

3.1.4. Анализ стабильности экспрессии и наследование гена nptll у трансгенных растений табака (линия SRI) с одной инсер-цией Т-ДНК на геном.

3.1.5. Анализ стабильности экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака (линия SRI) со множественными инсер-циями Т-ДНК на геном.

3.1.6. Анализ стабильности экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака с отклонениями от менделевского расщепления.

3.2. Анализ стабильности экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака при инбридинге.

3.2.1. Наследование гена nptll у трансгенных растений линий Т0и То-6.

3.2.2. Анализ нестабильности экспрессии гена nptll у растений линий Т0-5 и Т0-6. 96 ►

3.2.3. Анализ взаимодействия аллелей гена nptll у трансгенных растений линии Т0-5.

3.3. Моделирование нестабильной экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений.

3.4. Т-ДНК-индуцированные мутации у трансгенных растений табака

3.4.1. Создание и анализ коллекции трансгенных растений табака с мутантным фенотипом.

3.4.2. Анализ цитологических нарушений мейоза у трансгенных растений табака линии Res79.

3.4.3. Интеграция векторной ДНК в геном трансгенных растений табака.

3.4.3.1. Анализ трансгенных растений табака с мутантным фенотипом на наличие в геноме векторной ДНК.

3.4.3.2. Анализ трансгенных растений табака, не проявляющих мутантного фенотипа, на наличие в геноме векторной ДНК.

3.4.4. Анализ районов встраивания Т-ДНК инсерций у трансгенных растений табака с мутантным фенотипом.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение экспрессии гетерологичных и собственных генов у трансгенных растений"

Актуальность темы. Генетическая инженерия растений представляет собой новое направление в деятельности человека, которое позволяет целенаправленно, по заранее намеченной программе экспериментально модифицировать геном растений. Необходимо подчеркнуть, что разработанные к настоящему времени генно-инженерные методы и подходы дают возможность перестраивать геном растения с использованием генетической информации из разных гетерологических систем: вирусов, бактерий, насекомых, животных и человека. Более того, при использовании генно-инженерных методов существенно расширяются возможности модификации генома и внутри растительного царства, что снимает естественные барьеры между отдаленными видами растений. В этом случае становится возможным переносить отдельные гены в систематически удаленные виды, например, из однодольных в геном двудольных растений. Таким образом, к традиционным селекционно-генетическим методам дополнительно могут быть добавлены методы генетической инженерии, что позволит существенно расширить границы формообразовательного процесса при создании исходного материала. Реализация таких программ невозможна при использовании только традиционных методов селекции.

Успех любой селекционно-генетической программы, направленной на улучшение хозяйственно ценных признаков у растений с применением методов генетической инженерии определяется высоким и стабильным уровнем экспрессии перенесенных генов. Уже через несколько лет после создания первых трансгенных растений стало очевидно, что перенесенные гены функционируют в новом генетическом окружении растительного генома не всегда так, как предполагалось. Наблюдалась широкая вариабельность в экспрессии трансгенов среди индивидуальных трансформантов, а также случаи их полной инактивации.

Как правило, перенесенные гены наследуются согласно законам Менделя, однако к настоящему времени накоплено достаточно много примеров отклонений от менделевского наследования, обусловленных инактивирова-нием трансгенов. Потеря экспрессии (инактивирование) трансгенов, известное как «gene silencing», представляется как нежелательное явление при создании трансгенных растений. Несмотря на интенсивные исследования этого явления во многих ведущих биотехнологических центрах мира, причины и молекулярно-генетические механизмы все еще остаются до конца не выясненными.

Необходимо отметить, что замолкание генов встречается не только у трансгенных растений. Так, парамутации у кукурузы были известны еще задолго до обнаружения эффекта инактивации перенесенных генов (Brink, 1973). Однако только сравнительно недавно стали обозначаться общие черты между этими явлениями. Трансгенные растения, у которых перенесенные гены относительно легко идентифицируются и находятся в инактивированном состоянии, могут служить уникальными моделями для изучения молекуляр-но-генетических механизмов замолкания трансгенов, а также поиска путей преодоления этого феномена. Поэтому накопление любых экспериментальных фактов, касающихся феномена инактивирования трансгенов, может послужить важным шагом в его понимании, что явится дополнением к фундаментальным представлениям о функционировании генов в растениях.

Подобно мобильным генетическим элементам инсерции трансгенов в зависимости от места встраивания могут менять экспрессию отдельных генов у трансгенных растений, что фенотипически может выражаться в изменении каких-либо признаков у растений, в том числе и морфологических. Изменения различных признаков, вызванные внедрением фрагментов ДНК, классифицируются как инсерционные мутации. В настоящее время мутации, индуцированные у трансгенных растений внедрением фрагментов экзогенной ДНК, достаточно широко используются в ведущих зарубежных биотехнологических центрах для идентификации и клонирования генов, что является важным направлением по анализу структурно-функциональной организации генома растений.

Цель и задачи исследования. Целью данной диссертационной работы явилось исследование эффектов проявления перенесенных (гетерологич-ных) генов в новом окружении растительного генома, а также эффектов проявления собственных генов (Т-ДНК мутации) у трансгенных растений.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Дать оценку стабильности экспрессии перенесенных генов у трансгенных растений. Выявить соотношение долей трансформантов с менделев-ским типом наследования трансгенов, а также трансформантов с отклонениями от ожидаемого типа расщепления на примере выборки из независимо полученных трансформантов.

2. Проанализировать стабильность сохранения перенесенного гена прШ у потомков двух независимо полученных трансгенных растений с одной инсерцией Т-ДНК на геном в течение нескольких поколений (при самоопылении).

3. Создать модельные трансгенные растения табака на основе гибридов, полученных от скрещивания трансформантов со множественными ин-серциями пр(11-гена. Оценить влияние на стабильность проявления экспрессии маркерного гена прШ числа инсерций Т-ДНК.

4. Создать трансгенные растения табака, моделирующие нестабильный уровень экспрессии маркерного гена и/?/// введением дуплицированных фрагментов в состав генетических конструкций. Исследовать стабильность экспрессии прШ-гена у полученных модельных трансгенных растений табака и их гибридов.

6. Изучить характер проявления и наследование мутантного фенотипа с измененным строением цветка и пониженной мужской фертильностью у созданных трансгенных растений табака.

7. Описать цитологический фенотип проявления мутации на примере трансгенного растения Яе579 (нарушения мейоза, микроспоро- и микрога-метогенеза).

8. Оценить частоты встраивания в геном трансгенных растений фрагментов векторных ДНК.

9. Провести анализ нуклеотидных последовательностей районов интеграции Т-ДНК инсерций у отдельных трансгенных растений.

Основные положения, вынесенные на защиту.

1. В популяции независимо полученных трансгенных растений табака экспрессия маркерного гена прШ в новом окружении растительного генома может быть изменена уже среди потомков первого поколения от самоопыления (полная инактивация трансгена: мозаицизм по инактивации трансгена).

2. При инбридинге у потомков от самоопыления трансгенных растений табака в течение нескольких поколений экспрессия «р?//-гена может быть изменена (инактивация и реактивация трансгена).

3. Введение в состав генетических конструкций дуплицированных фрагментов экзогенной ДНК в прямой и обратной ориентации приводит к нестабильности экспрессии прШ-гена как у потомков от самоопыления независимо полученных трансформантов, так и у гибридов от их скрещивания.

4. Перенесенные гены вызывают изменения проявления собственных генов у трансгенных растений (инсерционный мутагенез). Описан синдром морфологических изменений строения цветка и снижения уровня мужской фертильности. Выявлены причины, приводящие к снижению мужской фертильности, связанные с различными нарушениями мейоза, а также с цитомиксисом.

5. Фрагменты векторной ДНК могут быть перенесены в геном трансгенного растения и являться потенциальным источником мутационных изменений инсерционной природы.

6. Анализ состава нуклеотидных последовательностей районов интеграции Т-ДНК инсерций может свидетельствовать о предпочтительности районов встраивания фрагментов экзогенной ДНК при агробактериальной трансформации.

Научная новизна. Установлено, что у большей части независимо полученных методом агробактериального переноса трансгенных растений табака маркерный ген прШ наследуется потомками первого поколения от самоопыления в соответствии с законами Менделя, что свидетельствует о сохранении его стабильного уровня экспрессии. Отклонения от менделевского расщепления, свидетельствующие о нестабильности экспрессии перенесенных генов, в долевом отношении выявляются в 6 % случаев и полная потеря экспрессии — в 2 % случаев.

Стабильность экспрессии пр1Н-гена изменяется в потомстве гибридных растений. Показано, что среди 50 реципрокных комбинаций $2 У 15 независимо полученных моноинсерционных трансгенных растений табака в 18% случаев наблюдались отклонения от менделевского расщепления по дигибридной схеме.

Установлено, что увеличение числа инсерций, интегрированных в разные группы хромосом, не влияло на стабильность экспрессии анализируемого маркерного гена. У гибридов, полученных от скрещивания трансформантов со множественными инсерциями Т-ДНК, не выявлено случаев полного инактивирования яр/ТТ-гена.

На примере линии Т0-5 трансгенных растений табака впервые выявлено три аллельных состояния ирГ//-гена (активное, инактивированное и реактивированное). Проведен генетический анализ взаимодействия аллелей прШ-гена. Установлен доминантный характер наследования аллеля, определяющего активное состояние лр//7-гена по отношению к рецессивному характеру наследования аллеля, определяющего его инактивированное состояние.

Создана серия трансгенных растений табака, моделирующих нестабильный уровень экспрессии гена прШ введением дуплицированных повторенных фрагментов (в прямой и обратной ориентации) в состав Т-ДНК инсерций. Впервые показано, что инактивация гомологичных трансгенов существенно возрастает в геноме гибридных растений.

Впервые создана коллекция трансгенных растений табака, проявляющих мутантный фенотип (измененное строение цветка и пониженный уровень мужской фертильности) для дальнейшего анализа флорального морфогенеза, микроспоро- и микрогаметогенеза.

Впервые проведен детальный цитологический анализ мейоза у растения К.ез79, выявивший серию нарушений, проявляющихся в различной степени среди других трансгенных растений с мутантным фенотипом. Нарушения включали образование деформированных ядер в телофазе I и ориентацию веретен деления в метафазе II мейоза, перфорацию клеточной стенки с образованием цитомиктических каналов и перемещением по ним хроматина из одного мейоцита в другой, приводящих к образованию полиад и формированию пыльцевых зерен с пониженной фертильностью.

Показано, что при агробактериальной трансформации в геном трансгенного растения могут быть перенесены фрагменты векторных ДНК. Установлено, что среди независимо полученных трансформантов доля растений с фрагментами векторных ДНК составила 33 %.

Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов растительных ДНК, фланкирующих Т-ДНК встройки, в отдельных случаях выявил наличие гомологий с известными нуклеотидными последовательностями мирового банка данных «Gene bank».

Научная и* практическая ценность работы. Настоящая работа направлена на изучение особенностей проявления гетерологичных генов у трансгенных растений, а также на изучение их влияния на проявление собственных генов растения (Т-ДНК-мутации). Охарактеризована популяция независимо полученных трансгенных растений табака по стабильности экспрессии маркерного гена nptll, установлено долевое соотношение групп растений со стабильным уровнем экспрессии, соответствующем расщеплению потомков в соответствии с законами Менделя. Выделены группы растений, проявляющие отклонения от менделевского расщепления, что свидетельствует о нестабильности экспрессии, а также группа растений с полной потерей экспрессии исследуемого трансгена. Проведен анализ наследования трансгенов у гибридов от скрещивания трансгенных растений с одной и множественными Т-ДНК-инсерциями. Полученные результаты могут служить основой при создании хозяйственно ценных сортов, созданных при объединении нескольких трансгенов в геноме гибридов. Впервые проанализировано сохранение стабильного уровня экспрессии гена nptll у потомков<-двух независимо полученных линий трансгенных растений табака в течение нескольких поколений. Показано, что у части потомков линии Т0-5 экспрессия анализируемого гена может быть инактивирована и в последующих поколениях восстановлена у отдельных потомков. Проанализировано взаимодействие аллелей гена nptll. Создана серия трансгенных растений табака, моделирующих нестабильный уровень экспрессии я/?///-гена введением ду-плицированных фрагментов (в прямой и обратной ориентации) в состав Т-ДНК инсерций. Установлено, что инактивация гомологичных трансгенов существенно возрастает в геноме гибридных растений. Полученные результаты представляют большое значение для дальнейших фундаментальных и прикладных исследований по изучению функционирования генов растений. Создана серия трансгенных растений табака с мутантным фенотипом. Установлено, что растения с мутантным фенотипом выявляются среди независимо полученных трансформантов с частотой около 5 %. Большая часть растений с мутантным фенотипом проявляла сцепленное наследование измененного признака с устойчивостью к антибиотику, что подтверждало их инсер-ционную природу. Проведен детальный цитологический анализ нарушений мейоза, приводящих к снижению мужской фертильности. Установлено, что при агробактериальной трансформации одновременно с Т-ДНК в геном растения могут быть перенесены фрагменты бактериальной ДНК, что представляется нежелательным с точки зрения коммерческого использования трансгенных растений. Полученные результаты представляют большое значение при разработке и уточнении правил по биобезопасности использования генетически модифицированных организмов.

Данные, полученные в ходе исследования, используются при чтении лекций в курсе «Генетическая инженерия растений» в Томском государственном университете.

Аппробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях, симпозиумах и конгрессах:

1. International conference «Plant biotechnology and molecular biology», Moscow, 1991.

2. International Conference «Plant Biotechnology and Genetic Engineering», Oct. 3-6, Kiev, Ukraine, 1994.

3. Plant Genome III Conf., SanDiego (January 15-19), 1995.

4. Международная конференция, посвященная памяти акад. А.А. Баева. Москва, 20-22 мая, 1996.

5. German-Russian Cooperation in Biotechnology. Workshop IV. Russia, St-Petersburg. October 10-13, 1996.

6. Международная конференция «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». Москва, 1997.

7. Международная конференция «Новые направления биотехнологии». Москва, 27-29 апреля, 1998.

8. International Congres «Plant Biotechnology and in vitro biology in the 21st century». Jerusalem, Israel, June 14-19, 1998.

9. Всероссийский симпозиум «Изучение генома и генетическая трансформация растений». 23-27 августа 1999, Иркутск.

10. IV съезд Общества физиологов растений (ОФР), 4-9 октября 1999, Москва.

11.11 съезд Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (ВОГИС), 1-5 февраля 2000.

12. International conference «Plant Biotechnology — Facing the New Millenium», 16-18 Oct. 2000. Kostinbrod. Bulgaria.

13. Международный симпозиум «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология», Москва (18-21 ноября) - Минск (22-24 ноября) 2001.

14. 1-й Международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития». Москва, 14-18 октября 2002.

15. 2-я конференция Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова. Москва, 20-21 февраля 2003.

16. 8-я Международная конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». Саратов. 9-13 сентября 2003.

17. 2-й Международный конгресс «Биотехнология — состояние и перспективы развития». Москва, 10-14 ноября 2003.

Список работ по теме диссертации, опубликованных в журналах и периодических изданиях:

1. Дейнеко Е.В., Ривкин М.И., Комарова M.JL, Вершинин Л.В., Шумный В.К. Генетическая трансформация люцерны с использованием Ti-плазмидной системы Agrobacterium tumefaciens II Докл. АН. 1991. Т. 19, №6. С. 1473-1476.

2. Дейнеко Е.В., Ситникова В.В., Ривкин М.И. К вопросу о стабильности встраивания и наследования чужеродных генов в геноме трансгенных растений // Особенности реконструкции генома и популяций высших растений. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 1993. С. 16-23.

3. Ривкин М.И., Дейнеко Е.В., Комарова М.Л., Кочетов A.B., Шумный В.К. Оценка вирусоустойчивости трансгенных растений табака, несущих ген бета-интерферона человека// Докл. АН. 1993. Т. 331. С. 652-654.

4. Дейнеко Е.В., Ривкин М.И., Шумный В.К. Использование методов генетической инженерии в селекционно-генетических программах по улучшению хозяйственно-ценных признаков растений // Особенности реконструкции генома и популяций высших растений. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 1993. С. 5-15.

5. Дейнеко Е.В., Загорская A.A., Филипенко M.JL, Кочетов A.B., Шумный В.К. Изменение уровня экспрессии и наследование маркерного гена nptll в потомстве трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. // Докл. АН. 1995. Т. 344, № 3. С. 407-411.

6. Rivkin M.I., Deineko E.V., Komarova M.L., Shumnyi V.K. Analysis of virus resistance of tobacco and alfalfa transgenic plants bearing human ß-interferone gene // Biotechnol. and Biotechnolog. Equipment. 1995. N 1. P. 40-44.

7. Deineko E.V., Zagorskaya A.A., Filipenko M.L., Filipenko E.A., Novo-selya T.V., Komarova M.L., Kochetov A.V., Shumny V.K. Instability of nptH gene expression in the progeny of transgenic tobacco plants // Biotechnol. and Biotechnolog. Equipment. 1996. N 3. P. 89-92.

8. Кочетов A.B., Шакирова H.B., Лукашева В.В., Пилюгин М.В., Комарова M.JL, Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Экспрессия бицистронов у трансгенных растений // Докл. АН. 1996. Т. 349, № 4. С. 549-582.

9. Кочетов A.B., Лукашева В.В., Пилюгин М.В., Комарова М.Л., Ривкин М.И., Дейнеко Е.В., МакКлин Ф., Шумный В.К. Оперонная организация транскрипционных единиц в клетках растений: экспрессия модельных бицистронов // Цитология и генетика. 1997. № 6. С. 17-28.

10. Дейнеко Е.В., Загорская A.A., Филипенко М.Л., Кочетов A.B., Шумный В.К. Нестабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений при инбридинге // Генетика. 1998. Т. 34, № 9. С. 1212-1219.

11. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Филипенко Е.А., Шумный В.К. Стабильность экспрессии и наследование гена nptll в популяции трансгенных растений табака // Докл. АН. 1999. Т. 369, № 3. С. 420-423.

12. Дейнеко Е.В., Сидорчук Ю.В., Загорская A.A., Новоселя Т.В., Филипенко Е.А., Шумный В.К. Аномалии строения цветков и мужская стерильность у трансгенных растений табака // Докл. АН. 1999. Т. 368, № 1. С. 135-138.

13. Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Стабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака со множественными инсерция-ми // Генетика. 2000. Т. 36, № 3. С. 427-430.

14. Дейнеко Е.В., Загорская A.A., Новоселя Т.В., Филипенко Е.А., Шумный В.К. Нестабильность экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2000. Т. 47, № 3. С. 446-452.

15. Филипенко Е.А., Филипенко М.Л., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Анализ сайтов встраивания Т-ДНК у трансгенных растений табака с мутантным фенотипом // Докл. АН. 2000. Т. 370, № 2. С. 273-276.

16. Сидорчук Ю.В., Загорская A.A., Дейнеко Е.В., Шамина Н.В., Шумный В.К. Т-ДНК индуцированные аномалии цветков и мужская стерильность у трансгенных растений табака: морфометрический и цитологический анализ // Цитология и генетика. 2000. Т. 34, № 6. С. 3-8.

17. Шамина Н.В., Дорогова Н.В., Сидорчук Ю.В., Загорская A.A., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Нарушения мужского мейоза в трансгенной линии res9\ табака // Цитология. 2000. Т. 42, № 12. С. 1173-1178.

18. Дейнеко Е.В., Загорская A.A., Сидорчук Ю.В., Новоселя Т.В., Филипенко Е.А., Комарова М.Л., Шумный В.К. Особенности морфологических признаков и фертильности пыльцы у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2000. Т. 47, № 1. С. 73-78.

21. Загорская A.A., Дейнеко E.B., Сидорчук Ю.В., Шумный В.К. Наследование признака измененного строения цветка и устойчивости к антибиотику канамицину у трансгенных растений табака // Генетика. 2001. Т. 37, № 6. С. 784-790.

22. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская A.A., Филипенко Е.А., Пухначе-ва Н.В., Шумный В.Л. Инактивирование чужеродных генов у трансгенных растений табака (обзор) // Изучение генома и генетическая трансформация растений. Новосибирск: Наука, 2001. С. 132-142.

23. Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В. Моделирование нестабильности экспрессии nptll-гена у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2002. Т. 49, № 3. С. 437-443.

25. Deineko Е., Kieft Н., Anne Mie Emons, van Lammeren A.A.M. T-DNA insertions leads to male sterility in tobacco through cytomixis and chromatin translocation. Protoplasma, 2004.

Объем и структура работы. Работа изложена на 198 страницах и состоит из введения, трех глав с описанием современного состояния проблемы на основании источников литературы, описанием исходного материала и методов, используемых при решении поставленных задач, экспериментальных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 249 наименований и приложения. Работа иллюстрирована 36 таблицами и 54 рисунками. Фактический материал получен автором лично, а также в ходе работ с сотрудниками Института цитологии и генетики СО РАН.

Работа выполнена в лаборатории гетерозиса растений Института цитологии и генетики СО РАН, а также в лаборатории биологии растительных клеток университета г. Вагенингена в Нидерландах и в разные периоды была поддержана отечественными и зарубежными грантами, в которых соискатель была исполнителем и руководителем:

- РФФИ (№ 02-04-49295) - Молекулярно-генетический анализ Т-ДНК индуцированной изменчивости у трансгенных растений табака.

- РФФИ-Белорусия (№ 00-04-81077Бел2000а) - Мутационная изменчивость у растений рода Solanaceae как результат интеграции чужеродной ДНК.

- РФФИ (№ 00-04-49557) — Молекулярно-генетические механизмы функционирования чужеродных генов в геноме трансгенных растений.

- РФФИ (№ 99-04-49324) — Т-ДНК индуцированная изменчивость у трансгенных растений табака: молекулярно-генетический и цитологический анализ.

- РФФИ (№ 97-04-48763) — Инактивирование чужеродных генов в геноме трансгенных растений: молекулярно-генетические механизмы.

- РФФИ (№ 97-04-49334) - Нестабильность экспрессии чужеродных генов в поколениях трансгенных растений: исследование роли дупликаций в структуре Т-ДНК.

- РФФИ (№ 96-04-51075) - Наследование и стабильность экспрессии чужеродных генов в геноме трансгенных растений: молекулярно-генетический анализ гена nptll у трансгенных растений табака.

- РФФИ (00-15-97968) - Особенности преобразования геномов и функционирование генов в процессе хромосомной и генной инженерии растений.

- Грант Минпромнауки № 43.106.11.11.0004 - Создание трансгенных растений - биопродуцентов белков медицинского назначения.

- Госконтракт 43.050. 11.1537 от 05.02.2002 - Молекулярно-биологический анализ генетических факторов, влияющих на «замолкание» целевого гена в ряду поколений трансгенных растений табака.

- Грант IAC (2002, Wageningen, The Netherlands) для проведения исследований по анализу цитологического фенотипа у трансгенных растений линии Res 79.

Автор выражает благодарность директору Института цитологии и генетики СО РАН академику В.К. Шумному за предоставленную возможность и помощь в выполнении данной работы. Автор выражает крайнюю признательность сотрудникам лаборатории гетерозиса растений и сектора генетической инженерии растений Института цитологии и генетики СО РАН, а также Хенку Кифту, Андре Ван Ламмерену и Анни Мие Эмонс (университет г. Вагенингена, Нидерланды), которые на разных этапах исследований принимали участие либо в выполнении ряда экспериментов, либо обсуждении полученных данных, что нашло отражение в совместных публикациях.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Дейнеко, Елена Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Гетерологичные гены в новом окружении растительного генома различаются по уровню экспрессии среди независимо полученных трансгенных растений табака. Установлено, что при самоопылении исходных трансформантов большая часть трансгенов наследуется по менделевско-му расщеплению для моно- и дигибридных типов (73,5 %). Отклонения от менделевского расщепления свидетельствуют о нестабильности их экспрессии.

2. Экспрессия гетерологичных генов может быть изменена при инбридинге. Впервые выявлено три аллельных состояния riptll-rtua. (активное, инакти-вированное и реактивированное) и установлены их аллельные взаимодействия. Активное состояние nptíl-гена по отношению к инактивированно-му проявляется как доминантный признак. Реактивированное состояние аллеля обусловлено возможной мутацией другого гена растения.

4. Нестабильный уровень экспрессии гена nptll (мозаицизм по Кш-устойчи-вости) у растения Nu21 связан со спонтанной встройкой в геном двух сцепленно наследуемых трансгенов, что подтверждает влияние дуплицированных фрагментов на стабильность экспрессии гетерологичных генов.

5. Гетерологичные гены, а также фрагменты векторной ДНК при агробакте-риальной трансформации могут являться потенциальным источником мутационных изменений собственных генов растения. Создана коллекция трансгенных растений табака с измененным строением цветка и пониженным уровнем мужской фертильности.

6. Впервые проведен детальный цитологический анализ мейоза у трансгенных растений табака с мутантным фенотипом, выявивший серию нарушений, связанных с образованием деформированных ядер в телофазе I и изменением ориентации веретен деления в метафазе II мейоза, перфорацией клеточной стенки с образованием цитомиктических каналов и перемещением по ним хроматина из одного мейоцита в другой, приводящих к образованию полиад и формированию пыльцевых зерен с пониженной фертильностью.

7. Анализ нукпеотидных последовательностей фрагментов растительных ДНК, фланкирующих Т-ДНК встройки, в отдельных случаях выявил наличие гомологий с известными нуклеотидными последовательностями Gene bank. Тенденция встраивания Т-ДНК инсерций в АТ-богатые районы нами не подтвердилась.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Конец 20-го столетия в биологии завершился созданием новых направлений, таких, как биотехнология и генетическая инженерия растений. Открытие новых возможностей управляемой модификации ядерных геномов эукариот позволило преодолевать естественные природные барьеры не только между отдаленными видами и родами растений, но и между различными гетерологическими системами (вирусы, бактерии, животные и человек). Необходимо отметить, что данные подходы широко используются как в прикладных, так и фундаментальных исследованиях, являясь основой новых направлений в фармакологической индустрии, растениеводстве и животноводстве.

В настоящее время генетическая инженерия представляет собой мощный инструмент для проведения фундаментальных исследований в области генетики растений. Введение в состав генетических конструкций, переносимых в геном растения, маркерных и репортерных генов, в частности генов устойчивости к антибиотикам, дает возможность приме1шть микробиологические подходы для тестирования больших выборок генетически модифицированных организмов на клеточном уровне с последующей регенерацией полноценных растений. Простота идентификации маркерных и репортерных генов позволяет оценивать функционирование перенесенных генов на всех возможных уровнях их проявления: транскрипционном, посттранскрипционном и на уровне фенотипа. В этом направлении трансгенные растения выступают как уникальные модели для изучения фундаментальных проблем функционирования генов.

Трансгенные растения являются ценным инструментом для фундаментального изучения структуры и механизмов функционирования растительного генома. Следует подчеркнуть, что встраивание фрагментов экзогенной ДНК в растительный геном в некоторой степени сходно с перемещением мобильных генетических элементов. Подобно мобильным генетическим элементам инсерции чужеродных генов у трансгенных растений могут менять экспрессию генов и вызывать изменения отдельных морфологических признаков. В таких случаях встройка экзогенной ДНК маркирует область расположения гена, ответственного за проявление измененного признака. Клонирование прилежащих к трансгену областей геномной ДНК у трансгенных растений с мутантным фенотипом является первым этапом идентификации гена, экспрессия которого была нарушена инсерцией. Таким образом, в данном аспекте подходы генетической инженерии сходны с методами инсерционного мутагенеза и выступают в качестве инструмента для поиска и изучения новых генов у растений.

Трансгенные растения, в геноме которых присутствуют гомологичные гены различного происхождения (собственные и трансгены), а также несколько копий гомологичных трансгенов, представляют собой удобные модели для изучения механизмов взаимодействия и регуляции генов растений (эффекты цис- и транс-инактивации, «gene silencing», ко-супрессия), а также для изучения механизмов противовирусной защиты у растений.

На основании результатов, полученных нами при выполнении данной диссертационной работы, становится очевидным, что если перенесенные гены и выступают как облигатный компонент генома в случайной выборке среди независимо полученных трансгенных растений табака, то экспрессия их может быть нарушена и фенотипически они могут не проявляться у потомков. Как показывают результаты, полученные нами при анализе потомков от самоопыления достаточно большой выборки исходных трансгенных растений табака (102 независимо полученных трансформанта линии SR1 и 15 независимо полученных трансформантов сорта «Gatersleben»), у большей части растений наблюдалось сохранение стабильной экспрессии перенесенных генов среди потомков от самоопыления исходных трансформантов. В долевом отношении это выражалось как 92,2 % у растений линии SR1 и 93,4 % у растений сорта «Gatersleben». Критерием для оценки стабильности экспрессии перенесенных генов (в частности, в нашем эксперименте маркерного гена nptll) служило соответствие расщеплению по Менделю среди анализируемых потомков в условиях селективного отбора. Как показали результаты тестирования исходных трансформантов, большая часть встроек (73,5%) происходила в один или два независимых района растительного генома и наследовалась согласно законам менделевского расщепления как 3 : 1 и 15 : 1 соответственно.

Известны примеры когда фрагменты экзогенной ДНК опознаются растением как чужеродные. В таких случаях у растений срабатывают механизмы, приводящие к инактивации гетерологичных генов. Несмотря на то что инактивированные чужеродные гены и остаются резидентной частью генома, у потомков они не проявляются. По нашим данным, в долевом отношении процент таких растений невысок. Так, при анализе выборки из 102 независимо полученных трансгенных растений табака с геном nptll только 1,9 % растений проявили полное отсутствие Кш-устойчивого фенотипа. У 5,9 % растений анализируемой выборки наблюдались отклонения от менделевского расщепления, свидетельствующие об изменении экспрессии анализируемого маркерного гена среди потомков от самоопыления исходных трансформантов.

Поскольку интеграция трансгенов в геном растения происходит случайным образом, каждое событие уникально, с точки зрения генетики, и отражает особенности взаимодействия перенесенного гена с генами района встройки Т-ДНК. Генное окружение в районе интеграции гетерологичного гена может измениться у потомков в последующих поколениях от самоопыления, а также у гибридов от скрещивания исходных трансформантов. Так, при самоопылении 9 трансгенных растений Т0 с одной Т-ДНК встройкой в геноме отклонения от расщепления по Менделю наблюдались уже во втором поколении (Т2) у двух растений (N1142 и N11410). Среди растений Р2, полученных от скрещивания моноинсерционных транс формантов между собой как в прямой, так и обратной комбинации, наблюдались отклонения от мен-делевского расщепления по дигибридной схеме (18 % случаев среди 50 комбинаций реципрокных скрещиваний).

На основании анализа характера проявления гена прШ у двух независимо полученных трансгенных растений табака, отобранных случайным образом, установлено, что у одного растения (линия Т0-6) экспрессия прШ-гена стабильна среди потомков в течение нескольких поколений от самоопыления, что подтверждалось наследованием трансгена среди потомков, согласно законам Менделя для моногибридного типа расщепления. Однако у другого растения (линия Т0-5) экспрессия гетерологичного гена проявлялась нестабильно - среди потомков Тз прШ-ген проявлялся в двух аллель-ных состояниях - активном и инактивированном. Установлено, что активное состояние трансгена является доминантным по отношению к инактиви-рованному. На основании результатов генетического анализа аллельных взаимодействий сделан вывод, что восстановление экспрессии пр1'//-гена является результатом мутации другого (собственного) гена растения.

Можно предположить, что нестабильность экспрессии гена прШ у растений линии Т0-5 по сравнению с линией Т0-6 связана с особенностями района, в который произошло встраивание Т-ДНК (вблизи расположения гетерохроматина, различная степень метилирования района встройки). Изменения в районе интеграции трансгена могли произойти и в результате перестроек в прилегающих к трансгену районов ДНК (мутации, рекомбинации, неравный кроссинговер и т. д.), что так же могло привести, например, к метилированию ДНК и потере функциональной активности промотора встроенного гена. Мутация другого гена в геноме растения с Кт-неустойчивым фенотипом могла инициировать деметилирование и привести к восстановлению функциональной активности промотора у трансгенного растения с мутантным фенотипом, что и наблюдалось у рас-тения-ревертанта линии Т0-5. В литературе описаны мутации, изменяющие инактивированное состояние гетерологичных генов у трансгенных растений А. thaliana (Amedeo et al., 2000; Dalmay et al., 2000; Hiroshika et al., 2000; Scheid et al., 2002).

Известно, что один и тот же ген ¿может изменяться и быть представленным в геноме растения несколькими состояниями. В классической генетике описано достаточно много примеров множественного аплелизма для различных видов растений. В исследуемой нами модельной линии трансгенных растений табака Т0-5 с инсерцией гена nptll после ряда нескольких последовательных самоопылений произошло изменение исходного состояния этого гена. Такое изменение в терминах классической генетики следует рассматривать как мутацию, т.е. переход гена от «дикого типа» к мутантно-му. В данном случае «дикий тип» фенотипически проявляется в Km-устойчивости трансгенных растений табака, а мутантный — в отсутствии этого признака. Мутации, приводящие к различным отклонениям от «дикого типа», относятся к группе прямых мутаций, тогда как фенотипическое восстановление (частичное или полное) измененного признака рассматривается как обратная мутация или реверсия. Известно, что прямые мутации, как правило, являются рецессивными. Обратные мутации могут быть связаны либо с повторными изменениями мутантного фенотипа, что приведет к восстановлению «дикого типа», либо с изменениями другого гена, мутация в котором будет подавлять проявление исследуемой прямой мутации.

На сегодняшний день, по данным литературы, известны два механизма, связанные с инактивированием трансгенов, которые реализуются на транскрипционном и пост-транскрипционном уровнях. Первый из них связан с выключением регуляторной части (промотора) гена и реализуется через метилирование ДНК. Второй механизм включается на посттранскрипционном уровне и связан с разрушением мРНК чужеродного гена в цитоплазме клетки. Все еще остается не ясным, включаются ли эти механизмы только в частных случаях, связанных с переносом в геном растений фрагментов экзогенной ДНК, или они отражают более общие механизмы защиты растений на внедрение чужеродной ДНК, например, защиты растений на внедрение вирусной инфекции. В любом случае для более глубокого понимания данного явления представляется крайне важным накопление большего числа феноменологических данных, связанных с инактивированием перенесенных генов.

Трансгенные растения представляются удобными моделями для решения подобного рода проблем. Прежде всего, это связано с тем, что в состав переносимых в геном генетических конструкций, как правило, включаются селективные гены устойчивости к антибиотикам, что позволяет применять микробиологические методы широкомасштабного скрининга больших популяций (тысячи и десятки тысяч индивидуальных трансгенных растений) и выявлять отдельные особенности функционирования трансгенов в новом генетическом окружении генома растений.

Полученные нами данные по моделированию нестабильного уровня экспрессии гена nptll введением в состав Т-ДНК инсерции дуплицированно-го фрагмента (два гена uidA в прямой и обратной ориентации) показали, что у исходных трансгенных растений, как правило, опознаются и инактивиру-ются районы интеграции инсерций, включающие дупликации гена iridA в обратной ориентации. В данном эксперименте было установлено, что из 75 проанализированных растений большая часть (80,0 %) проявляла нестабильный уровень экспрессии гена nptll. Нестабильность экспрессии исследуемого гена выражалась в появлении растений с мозаичным фенотипом, в отклонениях от менделевского расщепления, а также в полной потере Km-устойчивого фенотипа. Вместе с тем необходимо подчеркнуть, что не во всех случаях, связанных с интеграцией в растительный геном инсерций Т-ДНК с дупликациями гена iridA в инвертированном состоянии, происходит их опознавание в геноме трансгенного растения. Как показывают результаты проведенных нами экспериментов, из 75 растений у 15 трансформантов наблюдался стабильный уровень экспрессии маркерного гена, что составило 20,0 % от общего числа проанализированных трансгенных растений. У трансгенных растений с дупликацией гена uidA в прямой ориентации нестабильность в экспрессии анализируемого гена проявлялась на уровне контроля. Вероятно, механизм, основанный на опознавании дуплицирован-ных фрагментов в обратной ориентации, не универсален, и, возможно, существуют какие-либо дополнительные звенья его запускания, которые и отсутствуют у выявленных трансгенных растений со стабильным уровнем экспрессии nptll-TQua.

Интересным дополнением к проявлению механизма инактивирования трансгенов являются полученные нами данные по моделированию нестабильного уровня экспрессии гена nptll при объединении в геноме гибридных растений двух инсерций Т-ДНК, включающих ген uidA в прямой ориентации. Если у трансгенных растений с дуплицированным фрагментом гена uidA. в прямой ориентации в Т-ДНК инсерциях стабильность экспрессии гена nptll проявлялась на уровне контроля (в пределах ошибки эксперимента), то при объединении таких инсерций в геноме гибридных растений, полученных от скрещивания моноинсерционных форм, уровень стабильности экспрессии анализируемого гена катастрофически снижался. Дальнейшее развитие этих работ направлено на анализ транскрипционной активности промоторов, а также на анализ уровня экспрессии гена uidA.

Известно, что гетерологичные гены могут быть интегрированы в геном растения случайным образом в виде тесно сцепленных копий. У выделенного нами трансформанта Nu21, как показали результаты блот-гибридизации по Саузерну, перенесенные гены интегрировали случайным образом в виде двух близко расположенных тандемно повторенных фрагментов. Это нашло отражение в нестабильном уровне экспрессии гена nptll в соматических тканях листовых пластинок на ранних стадиях развития растения (мозаицизм). Характер проявления нестабильной экспрессии гена nptll у растения Nu21 в отличие от других моделей, описанных в литературе, вызывает особый интерес в силу его уникальности. Данное растение может быть использовано в качестве модели для дальнейших исследований механизмов инактивирования трансгенов на уровне соматических тканей.

Создание трансгенных растений основано на технологиях переноса и интеграции в геном растения фрагментов экзогенной ДНК. Попадание инсерций Т-ДНК в функционально значимые районы растительного генома может приводить к нарушению проявления генов, локализованных в данной области. Фенотипически это выражается в нарушении каких-либо признаков у растений. В терминах классической генетики подобные нарушения относятся к инсерционным мутациям. Потенциальным источником мутационных изменений собственных генов растения могут выступать как гетерологичные гены, так и фрагменты векторной ДНК. На основании представленных в диссертационной работе результатов показано, что в случайной выборке независимо полученных трансгенных растений табака отдельные трансформанты проявляли мутантный фенотип, что составило 5,5 % от общего числа проанализированных растений. У большей части растений измененные признаки (нарушение структуры цветка и пониженный уровень мужской фертильности) сцепленно наследовались с устойчивостью к антибиотику канамицину, что подтверждало инсерцион-ную природу наблюдаемых изменений.

Среди 61 проанализированного трансгенного растения табака (как с мутантным фенотипом, так и без него) у 20 растений в геномной ДНК выявлялись фрагменты, соответствующие векторной ДНК. Доля таких растений составила 33 %, среди которых растения с полноразмерными копиями вектора составили 15 %. Большой процент растений с полноразмерными копиями векторной ДНК согласовывался с данными, полученными в работе De Buck et al. (2000). Таким образом, интеграция фрагментов векторных ДНК при агробактериалыюй трансформации растений может служить потенциальным источником мутационных изменений инсерционной природы.

Детальный анализ причин, приводящих к снижению уровня фертильности у траснгенных растений табака с мутантным фенотипом, выявил ряд нарушений на разных стадиях мейоза, микроспоро- и микрогаметогенеза. У большей части анализируемых растений снижение фертильности пыльцевых зерен было обусловлено аномалиями отдельных стадий мейоза. Среди 21 трансгенного растения с измененным строением цветка у 19 трансформантов наблюдали различные нарушения в мейозе, тогда как только у 2 (IF4/1 и Nu4/2) — в микроспоро- и микрогаметогенезе. У растения IF4/11 перед стадией первого постмейотического деления разрушалось содержимое пыльцевых зерен, тогда как у растения Nu4/2 происходила массовая деградация уже сформированных пыльцевых зерен.

При анализе цитологического фенотипа нарушений мейоза, приводящих к снижению мужской фертильности у трансгенных растений с измененным строением цветка, необходимо отметить асинхронность делений материнских клеток пыльцы. Одновременно в ткани пыльника можно было наблюдать все стадии первого и второго делений мейоза, а также стадии микроспорогенеза. В целом нарушения мейоза затрагивали образование деформированных ядер в телофазе I первого деления мейоза, изменение ориентации веретен деления в метафазе II второго деления мейоза, перфорацию клеточной мембраны в профазе I первого мейотического деления материнских клеток пыльцы с образованием цитомиктических каналов и перемещением по ним хроматина из одного мейоцита в другой. Нами впервые установлено, что первые цитомиктические перемещения хроматина начинаются в период подготовки археспориальных клеток к мейотическим делениям, т.е. после последнего митотического деления археспориальных клеток до их вступления в мейоз. В профазе I мейоза этот процесс усиливается и захватывает в некоторых случаях до половины мейоцитов в отдельных пыльцевых мешках пыльников. Вышеперечисленные нарушения, наблюдаемые у трансгенных растений табака с мутантным фенотипом, приводят к образованию полиад и формированию пыльцевых зерен с пониженной фертильностью. ~ Не совсем ясным остается вопрос об однотипности наблюдаемых изменений среди выделенных трансгенных растений табака, проявляющих мутантный фенотип. При создании исследуемой коллекции трансгенные растения отбирались только по признаку нарушения строения цветка, и поэтому могли быть отобраны однотипные мутации, вызванные нарушением сложной цепи генов, принимающих участие в контроле таких процессов, как формирование цветка и, в частности генеративных органов. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов растительных ДНК, фланкирующих Т-ДНК инсерции у трансгенных растений с мутантным фенотипом, не выявил каких-либо гомологий, свидетельствующих о предпочтительности встраивания инсерцин в определенные районы генома. Полученная нами коллекция трансгенных растений табака с мутантным фенотипом представляет уникальную модель для дальнейшего развития работ в направлении изучения мутационных эффектов гетерологичных генов у трансгенных растений.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Дейнеко, Елена Викторовна, Новосибирск

1. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Новоселя Т.В., Филипенко Е.А., Шумный В.К. Нестабильность экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2000. Т. 47, № 3. С. 446-452.

2. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Филипенко M.JI., Кочетов А.В., Шумный В.К. Изменение уровня экспрессии и наследование маркерного гена nptll в потомстве трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. // Докл. АН. 1995. Т. 344, № 3. С. 407-411.

3. Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Филипенко Е.А., Филипенко M.JI., Комарова Н.И., Кочетов А.В., Шумный В.К. Нестабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) при инбридинге // Генетика. 1998. Т. 34, № 9. С. 1212-1219.

4. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская А.А., Филипенко Е.А., Шумный В.К. Стабильность экспрессии и наследование гена nptll в популяции трансгенных растений табака // Докл. АН. 1999. Т. 369, № 3. С.420-423.

5. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дъюри Г., Джекоб JI., Уолден Р., Ку-мар А., Джефферсон Р., Хемил Дж. Генная инженерия растений: лабораторное руководство. М.: Мир, 1991. 408 с.

6. Ли А., Тинланд Б. Интеграция Т-ДНК в геном растений: прототип и реальность // Физиология растений. 2000. Т. 47, № 3. С. 354-359.

7. Лутова Л.А., Павлова З.Б., Иванова М.М. Агробактериальная трансформация как способ изменения гормонального метаболизма у высших растений // Генетика. 1998. Т. 34, № 2. С. 165-182.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1994. 477 с.

9. Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В. Моделирование нестабильности экспрессии ирг//-гена у трансгенных растений табака // Физиология растений. 2002. Т. 49, N3. С. 437-443.

10. Новоселя Т.В., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Стабильность экспрессии гена nptll у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L.) с множественными инсерциями Т-ДНК // Генетика. 2000. Т. 36, № 3. С. 427-430.

11. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Колос, 1980. 304 с.

12. Сидорчук Ю.В., Загорская А.А., Дейнеко Е.В., Шамина Н.В., Шумный В.К. Т-ДНК индуцированные аномалии цветков и мужская стерильность у трансгенных растений табака: морфометрический и цитологический анализ // Цитология и генетика. 2000. Т. 34, № 6. С. 3-8.

13. Томило в А. А., Томилова Н.Б., Огаркова О. А., Тарасов В. А. Инсерционный мутагенез Arabidopsis thaliana: увеличение эффективности трансформации прорастающих семян в результате предобработки их ультразвуком // Генетика. 1999. Т. 35, № 9. С. 1214-1222.

14. Чумаков М.И. Механизм агробактериальной трансформации растений. Саратов: Слово, 2001. С. 17-61; 118-150.

15. Шамина Н.В., Дорогова Н.В., Сидорчук Ю.В., Загорская А.А., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Нарушения мужского мейоза в трансгенной линии res9\ табака // Цитология. 2000. Т. 42, № 12. С. 1173-1178.

16. Aeschenbacher R.A., Hauser М.-Т., Feldmann К.А., Benfey P.N. The SABRE gene is required for normal cell expansion in Arabidopsis // Genes and Devel. 1995. V. 9. P. 330-340.

17. Al-Kaff N.S., Covey S.N., Kreike M.M., Page A.M., Pinder R., Dale P.J. Transcriptional and posttranscriptional plant gene silencing in response to a pathogen // Sciene. 1998. V. 279. P. 2113-2115.

18. Ambros P.F., Matzke A.J.M., Matzke M.A. Localization of Agrobacterium rhfcogenes T-DNA in plant chromosomes by in situ hybridization // EMBO J. 1986. V. 5. P. 2073-2077.

19. Amedeo P., Habu Y., Asfar K., Scheid O.M., Paszkowski I. Disruption of the plant gene MOM releases transcriptional silencing of methylated genes // Nature. 2000. V. 405. P. 203-206.

20. Andre D., Colau D., Schell J., van Montagu M., Hernalsteens J.P. Gene tagging in plants by T-DNA insertion mutagen that creates APH3'II-plant gene fusions // Mol. Gen. Genet. 1986. V. 204. P. 512-518.

21. Assaad F.F., Tucker K.L., Singer E.R. Epigenetic repeat-induced silencing (RIGS) in Arabidopsis II Plant Mol. Biol. 1993. V. 22. P. 1067-1085.

22. Azpiroz-Leehan R., Feldmann K.A. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: going back and forth// Trends Genet. 1997. V. 13. P. 152-156.

23. Bachem C.W.B., Speckmann G.J., Vanderlinde P.C.G. Antisense expression of polyphenol oxidase genes inhibits enzymatic browning in potato tubers // Biotechnology. 1994. V. 12. P. 1101-1105.

24. Baram G.L., Grachev M.A., Komarova N.I. Microcolumn liquid chromatography with multi-wave-length photometric detection // J. Chromatogr. 1983. V. 264. P. 69-90.

25. Beaujean A., Sangwan R.S., Hodges M., Sangwan-Norreel B.S. Effect of ploidy and homozygosity on transgene expression in primary tobacco transformants and their androgenetic progenies // Mol. Gen. Genet. 1998. V. 260, N4. P. 362-371.

26. Bennetzen J.L. The contribution of retroelements to plant genome organization, function and evolution // Trends Microbiol. 1996. V. 4. P. 347-353.

27. Bollmann J., Carpenter R., Coen E.S. Related articles, allelic interactions at the nivea locus of Antirrhinum II Plant Cell. 1991. V. 3(12). P. 1327-1336.

28. Brandle J.E., McHugh S.G., James L., Labbe H., Miki B.I. Instability of transgene expression in field grown tobacco earring the csrl-1 gene for sunfonylurea herbicide resistance // Bio/Technology. 1995. V. 13. P. 994-998.

29. Brink R.A. A genetic change associated with the R locus in maize which is directed and potentially reversible // Genetics. 1956. V. 41. P. 872-889.

30. Brink R.A. Basis of a genetic change wich invariably occurs in certain maize heterozygotes // Science. 1958. V. 127. P. 1182-1183.

31. Brink R.A. Paramutation // Annu. Rev. Genet. 1973. V. 7. P. 129-152.

32. Brink R.A., Styles E.D., Axtell J.D. Paramutation: directed genetic change // Science. 1968. V. 159. P. 161-170.

33. Budar F., Thia-Toong, Montagu van M. Agrobacterium-mediated gene transfer results mainly in transgenic plants transmitting T-DNA as a single Mendelian factor//Genetics. 1986. V. 114. P. 303-313.

34. Camirand A., Brisson N. The complete nucleotide sequence of the Tstl retro-transposon of potato // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 4929.

35. Castle L.A., Errampalli D., Atherton T.L., Franzmann L.H., Yoon E.S., Meinke D.W. Genetic and molecular characterization of embryonic mutants identified following seed transformation in Arabidopsis II Mol. Gen. Genet. 1993. V. 241. P. 504-514.

36. Castle L.A., Meinke D.W. A FUSCA gene of Arabidopsis encodes a novel protein essensial for plant development // The Plant Cell. 1994. V. 6. P. 25-41.

37. Cherdshewasart W., Ghart-Chhetri G.B., Saul M.W. et al. Expression instability and genetic disorders in transgenic Nicotiana plumbaginifolia L. plants // Transgenic Res. 1993. V. 2. P. 307-320.

38. Chiang H.H., Hwang I., Goodman H.M. Isolation of the Arabidopsis GA4 locus // The Plant Cell. 1995. V. 7(2). P. 195-201.

39. Christou P., Swain W.F., Yang N.S., McCabe D.E. Inheritance and expression of foreign genes in transgenic soybean plants // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 7500-7504.

40. Chyi Y.-S., Jorgensen R.A., Goldstein D., Tanksley S.D., Loaiza-Figuegoa F. Locations and stability of Agrobacterium-mediated T-DNA insertions in the Lycopersicon genome // Mol. Gen. Genet. 1986. V. 204. P. 64-69.

41. Cluster P.D., O'Dell M., Metzlaff M., Flavell R.B. Details of T-DNA structural organization a transgenic petunia population exhibiting co-suppression // Plant Mol. Biol. 1996. V. 32. P. 1197-1203.

42. Conceizro A.S., Van Vliet A., Krebbers E. Unexpectedly higher expression levels of a chimeric 2S albumin seed protein transgene from a tandem array construct//Plant Mol. Biol. 1994. V.26,N3.P. 1001-1005.

43. Dalmay T„ Hamilton A., Rudd S., Angell S., Baulcombe D.C. An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscrip-tional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus // Cell. 2000. V. 101, N5. P. 543-553.

44. Daniell H., Streatfield S., Wycoff K. Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants // Trends in Plant Science. 2001. V. 6. P. 219-226.

45. De Blok M., Botterman J., Vandewiele M. Engineering herbicide resistance in plants by expression of a detoxifying enzyme // EMBO J. 1987. V. 6. P. 2513-2518.

46. De Borne F., Vincentz M., Chupeau Y., Vaucheret H. Co-supression of nitrate reductase host genes and transgenes in transgenic tobacco plants // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 243. P. 613-621.

47. De Buck S., De Wilde C., Montagu van M., Depicker A. T-DNA vector backbone sequences are frequently integrated into the genome of transgenic plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation // Mol. Breed. 2000. V. 6. P. 459-468.

48. De la Riva G., Gonzalez-Cabrera J., Vazquez-Padron R., Ayra-Pardo C. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation // Electronic J. of Biotechnol. 1998. V. 1,N3.

49. Deblaere R., Reynaerts A., Hofte H. et al. Vectors for cloning in plant cells // Methods Enzymol. 1987. V. 153. P. 277-291.

50. Dehio Ch., Schell J. Stable expression of a single-copy rolA gene in transgenic Arabidopsis thaliana plants allow an exhaustive mutagenic analysis of the transgene-associated phenotype // Mol. Gen. Genet. 1993. V. 241. P. 359-366.

51. Depicker A., Montagu M. Post-transcriptional gene silencing in plants // Curr. Opinion in Cell Biol. 1997. N 9. P. 373-382.

52. Deroles S.C., Gardner R.C. Analysis of the T-DNA structure in a large number of transgenic petunias generated by Agrobacterium-mediated transformation // Plant Mol. Biol. 1988. V. 11. P. 365-377.

53. Dilkes B.P., Feldmann K.A. Cloning genes from T-DNA tagged mutants // Methods Mol. Biol. 1998. V. 82. P. 339-351.

54. Dooner H.K., Belachew A. Chromosome breakage by pairs of closely linked transposable elements of the Ac-Ds family in maize // Genetics. 1991. V. 129(3). P. 855-862.

55. Dorer D.R., Henikoff S. Transgene repeat arrays interact with distant heterochro-matin and cause silencing in cis and trans II Genetics. 1997. V. 147. P. 1181-1190.

56. Dubreucq B., Grappin Ph., Caboche M. A new method for identification and isolation of genes essential for Arabidopsis thaliana seed germination // Mol. Gen. Genet. 1996. V. 252. P. 42-50.

57. Eichholtz D.A., Rogers S.G., Horsch R.B. Expression of mouse dihydrofolate reductase gene confers methotrexate resistance in transgenic Petunia plants // Somatic Cell. Mol. Genet. 1987. V. 13. P. 67-77.

58. Ellis J., Shirsat A.H., Hepher A., Garwood J. et al. Tissue specific expression of a pea legumin gene in seeds of Nicotiana plumbaginifolia II Plant Mol. Biol. 1988. V. 10. P. 203-214.

59. Elmayan T., Balzergue S., Beon F., Bourdon V., Daubremet J., Guenet Y., Mour-rain P., Palauqui J.C., Vernhettes S., Vialle T., Wostrikoff K., Vauche-ret H. Arabidopsis mutants impaired in cosuppression // Plant Cell. 1998. V. 10(10). P. 1747-1758.

60. Elomaa P., Holton T. Modification of flower colour using genetic engineering // Bio-technol. Genet. Eng. Rev. 1994. V. 12. P. 63-88.

61. English J.J., Mueller E., Baulcombe D.C. Supression of virus accumulation in transgenic plants exhibiting silencing of nuclear genes // Plant Cell. 1996. V. 8. P. 179-188.

62. Errampali D., Patton D., Castle L., Mickelson K., Hansen K., Schnall J., Feldmann BC., Meinke D. Embryogenic lethals and T-DNA insertional mutagenesis in Arabidopsis II Plant Cell. 1991. V. 3. P. 149-157.

63. Fagard M., Vaucheret H. Systemic silencing signals I I Plant Mol. Biol. 2000. V. 43, N2/3. P. 285-293.

64. Feldmann K.A. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: mutation spectrum I I Plant J. 1991. V. 1. P. 71-82.

65. Feldmann K.A., Marks M.D., Christiansos M.L., Quatrano R.S. A dwarf mutant of Arabidopsis generated by T-DNA insertion mutagenesis // Science. 1989. V. 243. P. 1351-1354.

66. Feldmann K.A. Seed transformation in Arabidopsis thaliana II Gene Transfer to Plants. Berlin: Springer Lab. Manual. 1995. P. 11-18.

67. Feldmann K.A., Marks M.D. Agrobacterium-mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: a non-tissue culture approach // Mol. Gen. Genet. 1987. V. 208. P. 1-9.

68. Finnegan J., McElroy D. Transgene inactivation: plants fight back! // Bio/Technology. 1994. V. 12. P. 883-887.

69. Flavell R.B. Inactivation of gene expression in plants as a consequence of specific sequence duplication // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 3490-3496.

70. Flavell R.B., O'Dell M., Metzlaff M., Bonhomme S., Cluster P.D. Developmental regulation of co-supression in petunia hybrida // Gene silencing in higher plants and related phenomens in others eukaryotes / Ed. P. Meyer. Springer, 1998.

71. Frank A., Guilley H., Jonard G. Nucleotide sequence of cauliflower mosaic virus DNA // Cell. 1980. V. 21. P. 285-294.

72. Franzmann L.H., Yoon E.S., Meinke D.W. Saturating the genetic map of Arabidopsis thaliana with embryonic mutations // Plant J. 1995. V. 10. P. 459-467.

73. Freitas F.A., Yunes J.A., Silva M.J., Arruda P., Leite A. Structural characterization and promoter activity analysis of the gamma-kafirin gene from sorghum // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 245, N2. P. 177-186.

74. Fu X., Due L.T., Fontana S. et al. Linear transgene constructs lacking vector backbone sequences generate low-copy-number transgenic plants with simple integration patterns // Transgenic Res. 2000. V. 9. P. 11-19.

75. Furner J.J., Sheikh M.A., Collett C.E. Gene silencing and homology-dependent gene silencing in Arabidopsis: genetic modifiers and DNA methylation // Genetics. 1998. V. 149. P. 651-662.

76. Gendloff E.H., Bowen B., Buchhoilz W.G. Quantitation of chloramphenico; acetyl transferase in transgenic tobacco plants by ELISA and correlation with gene copy number// Plant Mol. Biol. 1990. V. 14. P. 575-583.

77. Gheysen G., Montagu van M., Zambryski P. Integration of Agrobacterium tume-faciens transfer DNA (T-DNA) involves rearrangements of target plant DNA sequences // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 6169-6173.

78. Gheysen G., Villarroel R., van Montagu M. Illegimate recombination in plants: model for T-DNA integration // Genes Dev. 1991. V. 5. P. 287-297.

79. Giddings G., Allison G., Brooks D., Carte A. Transgenic plants as factors for bio-pharmaceuticals // Nature Biotechnol. 2000. V. 18. P. 1151-1155.

80. Glover J., Blomer K.C., Farrell L.B. et al. Searching for tagged male-sterile mutants of Arabidopsis II Plant Mol. Biol. Reporter. 1996. V. 14, N 4. P. 330-342.

81. Graaff van der E., Make der D.-R., Hooykaas P.J.J. Deviating T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to plants // Plant Mol. Biol. 1996. V. 36. P. 677-681.

82. Grevelding C., Suter-Crazzolara C., Menges von A., Kemper E., Maesterson R., Schell J., Reiss B. Characterization of a new allele of pale cress and its role in greening in Arabidopsis thaliana II Mol. Gen. Genet. 1996. V. 251, N 5. P. 532-541.

83. Gritz L., Davies J. Plasmid-encoded hygromicin B resistance: the sequence of hy-gromicin B phosphotransferase gene and its expression in Esherichia coli and Saccharomyces cerevisiae II Gene. 1983. V. 25. P. 179-188.

84. Hain R., Stabel P., Chernilofsky A.P., Steibniss H.H., Herrera-Estrella L., Schell J. Uptake, integration, expression and genetic transmission of a selectable chimeric gene by plant protoplasts // Mol. Gen. Genet. 1985. V. 199. P. 161-168.

85. Hamilton A.J., Baulcombe D.C. A species of small antisense RNA in posttrans-criptional gene silencing in plants // Science. 1999. V. 286, N 5441. P. 950-952.

86. Haseloff J., Siemering K.R., Prasher D.C., Hodge S. Removal of cryptic intron and subcellular localisation of green fluorescent protein are required to mark transgenic Arabidopsis plants brightly // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 2122-2127.

87. Heberle-Bors E., Charvat B., Thompson D., Scherthaner J.P., Barta A., Matzke A.J.M., Matzke A.M. Genetic analysis of T-DNA insertion into tobacco genome // Plant Cell Rep. 1988. V. 7. P. 571-574.

88. Herman L., Jacobs A., Montagu van M., Depicker A. Plant chromosome/marker gene fusion assay for study of normal and truncated T-DNA integration events // Mol. Gen. Genet. 1990. V. 224. P. 248-256.

89. Hobbs S.L.A., Jackson J.A., Baliski D.S., DeLong M.O., Mahon J. Genotype- and promoter-induced variability in transient beta-glucuronidase expression in pea protoplasts // Plants Cell Reports. 1990. V. 9. P. 17-20.

90. Hobbs S.L.A., Warkauntin T.D., DeLong C.M.O. Transgene copy number can be positevly or negativly associated with transgene expression // Plant Mol. Biol. 1993. V. 21. P. 17-26.

91. Hoeven van der C., Dietz A., Landsmann J. Variability of organ-specific gene expression in transgenic tobacco plants // Transgenic Res. 1994. V. 3. P. 159-165.

92. Holton T.A., Tanaka Y. Blue roses a pigment of our imagination? // Trends Bio-technol. 1994. V. 12. P. 40-42.

93. Hirochika H., Okamoto H., Kakutani T. Silencing of retrotransposons in Arabi-dopsis and reactivation by the ddml mutation // Plant Cell. 2000. V. 12. P. 357-368.

94. Horsch R.B., Fraley R.T., Rogers S.G., Sanders P.R., Hoffmann L.A.N. Inheritance of functional foreign genes in plants // Science. 1984. V. 223, N 4635. P. 496-499.

95. Jeddeloh J.A., Bender J., Richards E. The DNA methylation locus DDM1 is required for maintenance of gene silencing in Arabidopsis // Genes and Development. 1998. V. 12. P. 1714-1725.

96. Jeddeloh J.A., Stokes T.L., Richards E.J. Maintenance of genomic methylation requires a SWI2/SNF2-like protein // Nat Genet. 1999. V. 22. P. 94-97.

97. Jefferson R.A., Kavanagh C., Bevan M.W. GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants // EMBO J. 1987. V. 6. P. 3901-3907.

98. Jofuku K.D., den Boer B.G.V., Montagu van M., Okamuro J.K. Control of Arabidopsis flower and seed development by the homeotic gene APETALA2 // Plant Cell. 1994. V. 6. P. 1211-1225.

99. Jones A.L., Thomas C.L., Manle A.J. De novo methylation and co-suppression induced by a cytoplasmically replicating plant RNA virus // EMBO J. 1999. V. 17,N21. P. 6385-6393.

100. Jones J.D.G., Gilbert D.E., Grady K.L., Jorgensen R.A. T-DNA structure and gene expression in petunia plants transformed by Agrobacterium tumefaciens C58 derivatives // Mol. Gen. Genet. 1987. V. 207. P. 478-485.

101. Jorgensen R.A. Cosupression, flower color patterns and metastable gene expression states // Science. 1995. V. 268. P. 686-691.

102. Karlin S., Mrazek J. Compositional differences within and between eukaryotic genomes // PNAS. 1997. V. 94. P. 10227-10232.

103. Khan M.R.I., Ceriotti A., Tabe I. Accumulation of a sulphur-rich seed albumin from sunflower in the leaves of transgenic subterranean clover (Trifolium sub-terraneum L.) // Transgenic Res. 1996. V. 5. P. 179-185.

104. Kilby N.J., Leyser H.M.O., Furner I.J. Promoter methilation and progressive transgene inactivation in Arabidopsis II Plant Mol. Biol. 1992. V. 20. P. 103-112.

105. Klucher K.M., Chow H., Reiser L., Fisher R.L. The AINTEGUMENTA gene of Arabidopsis required for ovule and female gametophyte development is related to the floral homeotic gene APETALA2 II The Plant Cell. 1996. V. 8. P. 137-153.

106. Komari T. Genetic characterization of a double-flowered tobacco plants obtained in a transformation experiment // Theor. Appl. Genet. 1990. V. 80. P. 167-171.

107. Koncz C., Martini N., Mayerhofer R. High frequency T-DNA-mediated gene tagging in plants // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 8467-8471.

108. Koncz C., Mayerhofer R., Koncz-Kalman Z. et al. Isolation of a gene encoding a novel chloroplast protein by T-DNA tagging in Arabidopsis thaliana II EMBO J. 1990. V. 9, N 5. P. 1337-1346.

109. Koncz C., Nemeth K., Redei G., Schell J. Homology recognition during T-DNA integration into the plant genome // Homologous Recombination and Gene Silencing in Plants / Ed. J. Paszkowski. Kluver Academic Publishers. Netherlands, 1994. P. 167-189.

110. Koncz C., Schell J. The promoter of Tl-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector // Mol. Gen. Genet. 1986. V. 204. P. 383-396.

111. Kononov M.E., Bassuner B., Gelvin S.B. Integration of T-DNA binary vector 'backbone' sequences into the tobacco genome: evidence for multiple complex pattern of integration // Plant J. 1997. V. 11, N 5. P. 945-957.

112. Koornneef M. The complex syndrome of ttg mutants // Arab. Jnf. Serv. 1981. V. 18. P. 45-51.

113. Koornneef M. Arabidopsis genetics // Arabidopsis / Eds. E. Meyerowitz, C. Somerville. Cold Spring Harb, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1994.

114. Koornneef M., Veen van der J.N. Induction and analysis of gibberellin sensitive mutants in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. // Theor. Appl. Genet. 1980. V. 58. P. 257-263.

115. Korpowski H., Yusibov V. The green revolution: plants as heterologous expression vectors // Vaccine. 2001. V. 19. P. 2735-2741.

116. R., Martin-Hernandez A.M., Peart J.R., Malcuit I., Baulcombe D.C. Virus-induced gene silencing in plants // Methods. 2003. V. 30, N 4. P. 296-303.

117. Ma C., Mitra A. Intrinsic direct repeats generate consistent post-transcriptional gene silencing in tobacco // Plant J. 2002. V. 31. P. 37-49.

118. Mannerlof M., Terming P. Variability of gene expression in transgenic tobacco // Euphytica. 1997. V. 98. P. 133-139.

119. Marathe R., Anandalakshmi R., Smith T.H., Pruss G.J., Vance V.B. RNA viruses as inducers, suppressors and targets of post-transcriptional gene silencing // Plant Mol. Biol. 2000. V. 43, N 2/3. P. 295-306.

120. Mariani C., Beuckeleer M., Truetuer J. Induction of male sterility in plants by a chimaeric ribonuclease gene //Nature. 1990. V. 347. P. 737-741.

121. Marton L., Hrouda M., Pecsvaradi A., Czako M. T-DNA-insert-independent mutations induced in transformed plant cells during Agrobacterium co-cultivation // Transgenic Res. 1994. V. 3. P. 317-325.

122. Matzke M.A., Jorgensen R.A. From plants to mammals // Science. 1996. V. 271, N 5254. P. 1347-1348.

123. Matzke M.A., Matzke A.J.M. How and why do plants inactivate homologous (Trans) genes // Plant Physiol. 1995. V. 107, N 3. P. 679-685.

124. Matzke M.A., Matzke A.J.M. Epigenetic silencing of plant transgenes as a consequence of diverse cellular defence responses // Cel. and Mol. Life Sci. 1998. V. 54. P. 94-103.

125. Matzke M.A., Mette M.F., Matzke A.J.M. Transgene silencing by the host genome gefense: implications for the evolution of epigenetic control mechanisms in plants and vertebrates // Plant Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 401-415.

126. Matzke M.A., Neuhuber F., Matzke A.J.M. A variety of epistatic interactions can occur between partially homologous transgene loci brought together by sexual crossing // Mol. Gen. Genet. 1993. V. 236. P. 379-386.

127. Matzke A., Neuhubar F., Park Y.D. et al. Homology-dependent gene silencing in transgenic plants: epistatic silencing loci contain multiple copies of methylated transgenes // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 244. P. 219-229.

128. Matzke M.A., Priming M., Tronovsky J., Matzke A.J.M. Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed tobacco plants // EMBO J. 1989. V. 8. P. 643-649.

129. Matzke A.J., Stoger E.M., Schernthaner J.P., Matzke M.A. Deletion analysis of a zein gene promoter in transgenic tobacco plants // Plant Mol. Biol. 1990. V. 14, N3. P. 323-332.

130. Mayerhofer R., Koncz-Kalman Z., Nawrath C., Bakkeren G., Crameri A., Angelis K., Rebei G.P., Schell J., Hohn B., Koncz C. T-DNA integration: a mode of illegitimate recombination in plants // EMBO J. 1991. V. 10. P. 697-704.

131. McClintock B. The supressor-mutation system of control of gene action in maize /carnegie // Inst. Wash.Yrbk., 1958. V. 57. P. 415^52.

132. McNevin J.P., Woodward W., Hannoufa A., Feldmann K.A., Lemieux B. Isolation and characterization of eceriferum (cer) mutants induced by T-DNA insertions in Arabidopsis thalianall Genome. 1993. V. 36. P. 610-618.

133. Meinke D.W. Embrio-lethal mutants of A. thaliana: analysis of mutants with a wide range of lethal phases // TAG. 1985. V. 69. P. 543-552.

134. Meinke D.W., Franzmann L.H., Nickle T.C., Yeung E.C. Leafy cotyledone mutants of Arabidopsis 11 Plant Cell. 1994. V. 6. P. 1049-1064.

135. Meinke D.W., Sussex I.M. Embrio-lethal mutants of Arabidopsis thaliana: a model sistem for genetic analysis of plant embryo development // Dev. Biol. 1979. V. 72. P. 50.

136. Mette M.F., Aufsatz W., Winden J., Matzke M.A., Matzke A.J.M. Silencing and promoter methylation triggered by double-satranded RNA // EMBO J. 2000. V. 19. P. 5194-5201.

137. Meyer P., Heidmann I. Epigenetic variants of a transgenic petunia line show hy-permetilation in transgene DNA: an indication for specific recognition of foregn DNA in transgenic plants // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 243. P. 390-399.

138. Meyer P., Heidmann I., Niedenhof I. Differences in DNA-methylation are associated with a paramutation phenomenon in transgenic petunia // The Plant J. 1993. V. 4. P. 86-100.

139. Mikula G. Heritable changes in R-locus expression in maize in response to environment// Genetics. 1967. V. 56. P. 733-742.

140. Miranda A., Janssen G., Hodges L., Peralta E.G., Ream \V. Agrobacterium tume-faciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism // J. Bacteriol. 1992. V. 174, N 7. P. 2288-2297.

141. Modrusan Z., Roiser L., Feldmann K.A., Fisher R., Haughn G.W. Homeotic transformation of ovules into carpel-like struktures in Arabidopsis II The Plant Cell. 1994. V. 6. P. 333-349.

142. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

143. Nacry P., Camilleri C., Courtial B., Caboche M., Bouchez D. Major chromosomal rearrangement induced by T-DNA transformation in Arabidopsis II Genetics. 1998. V. 149. P. 641-650.

144. Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-supression of homologous genes in trans // Plant Cell. 1990. V. 2. P. 279-289.

145. Narayan R.K.J. Discontinuous DNA variation in the evolution of plant species // J. Genet. 1985. V. 64. P. 101-109.

146. Narayan R.K.J. Nuclear DNA changes, genome differentiation and evolution in Nicotiana (Solanaceae) II Plant Syst. Evol. 1987. V. 157. P. 161-180.

147. Negruk V., Eisner G., Lemieux B. Addition-deletion mutations in transgenic Arabi-dopsis thaliana generated by the seed co-cultivation method // Genome. 1996. V. 39. P. 1117-1122.

148. Neuhuber F., Park Y.-D., Matzke A.J.M., Matzke M.A. Susceptibility of transgene loci to homology-dependent gene silencing // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 244. P. 230-241.

149. Niebel A., Heungens K., Barthels N., Inze D., Montagu van M., Gheysen G. Characterization of a pathogen-induced potato catalase and its systemic expression upon nematode and bacterial infection // Mol. Plant Microbe Interact. 1995. V. 8(3). P. 371-378.

150. Ohba T., Yoshioka Y., Machida C. DNA rearragement associated with the integration of T-DNA in tobacco: an example for multiple duplications of DNA around the integration taget // Plant J. 1995. V. 7. P. 157-164.

151. Ohshima S., Murata M., Sanamoto W., Ogura Y., Motoyoshi F. Cloning and molecular analysis of Arabidopsis gene Terminal Flower 1 // Mol. Gen. Genet. 1997. V. 254. P. 186-194.

152. Oppenheimer D.G., Herman P.L., Sivakumaran S., Esch J., Marks M.D. A myb gene required for leaf trichome differentiation in Arabidopsis is expressed in stipules // Cell. 1991. V. 67. P. 483-493.

153. Palauqui J-Ch., Vaucheret H. Field trial analysis of nitrate reductase co-supression: a comparative study of 38 combinations of transgene loci // Plant Mol. Biol. 1995. V. 29. P. 149-159.

154. Park Y., Cheong H. Expression and production of recombinant human inter-leukin-2 in potato plants // Protein Expr. Purif. 2002. V. 25. P. 160-165.

155. Park S., Yong Hwi Yoon, Byung Chul Kim et al. Pollen of male-sterile mutant A. thaliana isolated from a T-DNA insertion pool is not effectivly released from the anther locule // Plant Cell Physiol. 1996a. V. 37, N 5. P. 580-585.

156. Papp I., Iglesias V.A., Moscone E.A., Michalowski S., Spiker S., Park Y.D., Matzke M.A., Matzke A.J. Structural instability of a transgene locus in tobacco is associated with aneuploidy // Plant J. 1996. V. 10, N 3. P. 469-478.

157. Patterson G.I., Chandler V.L. Paramutation in maize and related allelic interactions // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995. V. 197. P. 121-141.

158. Peach C., Velten J. Transgen expression variability (position effects) of CAT and GUS reporter genes driven by linked divergent T-DNA promoters // Plant Mol. Biol. 1991. V. 17. P. 49-60.

159. Pennarubia L., Kim R., Giovannoni J. Production of the sweet protein monellin in transgenic plants // Biothechnology. 1992. V. 10. P. 561-563.

160. Petrhans A., Schlupmann H., Basse C., Paszkowski J. Intrachromosomal recombination in plants // EMBO J. 1990. V. 9, N 11. P. 3437-3445.

161. Porsch P., Jahnke A., During K. A plant transformation vector with a minimal T-DNA II. Irregular integration patterns of the T-DNA in the plant genome // Plant Mol. Biol. 1998. V. 37. P. 581-585.

162. Potrykus I., Paszkowski J., Saul M., Petruska J., Shillito R. Molecular and general genetics of hybrid foreign gene introduced into tobacco by direct gene transfer// Mol. Gen. Genet. 1985. V. 199. P. 169-177.

163. Prols F., Meyer P. The methylation patterns of chromosomal integration regions influence gene activity of transferred DNA in Petunia hybrida II Plant J. 1992. V. 2. P. 465-475.

164. Ramanathan V., Veluthambi K. Transfer of non-T-DNA portions of the Agrobac-terinm tumefaciens Ti plasmid pTiA6 from the left terminus of TL-DNA // Plant Mol. Biol. 1995. V. 28. P. 1149-1154.

165. Ratcliff F., Harrison B.D., Baulcombe D.C. A similarity between viral defense and gene silencing in plants // Sciene. 1997. V. 276. P. 1558-1560.

166. Reiss B., Sprengel R., Will H., Schaller H. A new sensitive method for qualitative and quantitative assay of neomycinphosphotransferase in crude cell eztracts // Gene. 1984. V. 30. P. 211-218.

167. Renckens S., De Greve H., Montagu van M., Hernalateens J-P. Petunia plants escape from negative selection against a transgene by silencing the foreign DNA via methylation // Mol. Gen. Genet. 1992. V. 233. P. 53-64.

168. Rerie W.G., Feldmann K.A., Marks M.D. The Glabra2 gene encodes a ho-meodomain protein required for normal trihome development in Arabidopsis thaliana II Genes and Devel. 1994. V. 8. P. 1388-1399.

169. Rhounim L., Rossignol J.-L., Faugeron G. Epimutation of repeated genes in Ascobolus immerses // EMBO J. 1992. V. 11, N 12. P. 4451-4457.

170. Robinson-Beers K., Pruitt R.E., Gasser C.S. Ovule development in wild-type Arabidopsis and two female-sterile mutants // Plant Cell. 1992. V. 4. P. 1237-1249.

171. Arabidopsis thaliana II Mol. Gen. Genet. 1991. V. 228. P. 104-112. Scheid O.M., Probst A.V., Afsar K., Paszkowski J. Two regulatory levels of transcriptional gene silencing in Arabidopsis II PNAS. 2002. V. 99. P.13659-13662.

172. Speulman E., Metz P.L.J., Gert van A., Hekkert B.L., Stiekema W.J., Pereira A. A two component enhancer inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the Arabidopsis genome // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1853-1866.

173. Spielman A., Simpson R.B. T-DNA structure in transgenic tobacco plants with multiple independent integration sites // Mol. Gen. Genet. 1986. V. 205. P. 34—41.

174. Stalberg K., Ellerstrom M., Josefsson L., Rask L. Deletion analysis of a 2S seed storage protein promoter of Brassica napus in transgenic tobacco // Plant Mol. Biol. 1993. V. 23. P. 671-683.

175. Stiff C., Killan A., Zhou H., Kudrna D., Kleinhofs A. Stable transformation of barley callus using biolistic particle bombardment and the phosphinothricin acetyltransferase (bar) gene // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1995. V. 40. P. 243-248.

176. Stretfield S., Howard J. Plant-based vaccines // Int. J. Parasitol. 2003. V. 33. P. 479-493.

177. Stretfield S., Jika J., Hood E., Turner D., Bailey M., Mayor J., Woodard S., Beifuss K., Horn M., Delaney D., Tizard J., Howard J. Plant-based vaccine: unique advantages // Vaccine. 2000. V. 19. P. 2742-2748.

178. Svitashev S.K., Somers D.A. Characterization of transgene loci in plants using FISH: a picture is worth a thousand words // Tissue and Organ Culture. 2002. V. 69. P. 205-214.

179. Tacket C.O., Mason H. A review of oral vaccination with transgenic vegetables // Microbes and Infection. 1999. V. 1. P. 777-783.

180. Takahashi Yo., Kuroda H., Tanaka T., Mashida Ya., Takebe I., Nagata T. Isolation of an auxin-regulated gene cDNA expressed during the transition from Go to S phase in tobacco mesophyll protoplasts // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 9279-9283.

181. Takano M., Egawa H., Ikeda J-E., Wakasa K. The structure of integration sites in transgenic rice // Plant J. 1997. V. 11. P. 381-361.

182. Talon M., Koornneef M., Zeevaart J.A. Endogenous gibberellins in Arabidopsis thaliana and possible steps bloked in the biosynthetic pathways of the semidwarf ga4 and ga5 mutants // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 7983-7987.

183. Tinland B. The integration of T-DNA into plant genomes // Trends in Plant Science. 1996. V. 1, N 6. P. 178-183.

184. Tinland B., Hohn B., Puchta H. Agrobacterium tumefaciens transfers single-stranded transferred DNA (T-DNA) into the plant cells nucleus // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 8000-8004.

185. Tinland B., Schoumacher F., Gloeckler V., Bravo-Angel A.M., Hohn B. The Agrobacterium tumefaciens virulence D2 protein is responsible for precise integration of T-DNA into the plant genome // EMBO J. 1995. V. 14. P. 3585-3595.

186. Todd J.J., Vodkin L.O. Duplications that suppress and deletions that restore expression from a chalcone synthase multigene family // Plant Cell. 1996. V. 8, N 4. P. 687-699.

187. Topfer R., Martini N., Schell J. Modification of plant lipid synthesis // Science. 1995. V. 268. P. 681-686.

188. Ulian E.C., Magill J.M., Smith R.H. Expression and inheritance pattern of two foreign genes in petunia//Theor. Appl. Genet. 1994. V. 88. P. 433^440.

189. Vaucheret H. Identification of a general silencer for 19S and 35S promoters in a transgenic tobacco plant: 90 bp of homology in the promoter sequence are sufficient for trans-inactivation // C. R. Acad. Sci. Paris. 1993. V. 316. P.1471-1483.

190. Vaucheret H. Promoter-dependent trans-inactivation in transgenic tobacco plants: kinetic aspects of gene silencing and gene reactivation // C.R. Acad. Sci. Paris, 1994. V. 316. P. 310-323.

191. Vaucheret H., Fagard M. Transcriptional gene silencing in plants: targets, inducers and regulators // Trends Genet. 2001. V. 17, N 1. P. 29-35.

192. Vionnet O., Baulcombe D.C. Systemic signalling in gene silencing // Nature. 1997. N389. P. 553.

193. Vongs A., Kakutani T., Martienssen R.A., Richards E J. Arabidopsis thaliana DNA methylation mutants // Science. 1993. V. 260(5116). P. 1926-1928.

194. Wallroth M., Gerats A.G.M., Rogers S.G., Fraley R.T., Horsh R.B. Chromosomal location of foreign genes in Petunia hybrida // Mol. Gen. Genet. 1986. V. 202. P. 6-15.

195. Walter Ch., Broer I., Hillemann D., Puhler A. High frequency, heat treatment-induced inactivation of the phosphinothricin resistance gene in transgenic single cell suspension cultures of Medicago sativa // Mol. Gen. Genet. 1992. V. 235. P. 189-196.

196. Wang M.-B., Waterhouse P.M. High-efficiency of a P-glucuronidase gene in rice is correlated with repetitive transgene structure but is independent of DNA methylation // Plant Mol. Biol. 2000. V. 43. P. 67-82.

197. Waterhouse P.M., Helliwell C.A. Exploring plant genomes by RNA-induced gene silencing // Nat. Rev. Genet. 2003. V. 4, N 1. P. 29-38.

198. Wenck A., Czako M., Kanevski I., Marton L. Frequent collinear long transfer of DNA inclusive of the whole binary vector during Agrobacterium-mediated transformation // Plant Mol. Biol. 1997. V. 34. P. 913-922.

199. Winkler R.G., Feldmann K.A. PCR-based identification of T-DNA insertion mutants //Methods Mol. Biol. 1998. V. 82. P. 129-136.

200. Wolters A.-M.A., Trindade L.M., Jacobsen E., Visser R.G.F. Fluorescence in situ hybridization on extended DNA fibres as a tool to analyse complex T-DNA loci in potato // Plant J. 1998. V. 13. P. 837-847.

201. Yanofsky M.F., Hong Ma, Bowman J.L., Drews G.N., Feldmann K.A., Meyerowitz E.M. The protein encoded by the Arabidopsis homeotic gene agamous resembles transcription factors //Nature. 1990. V. 346. P. 35-39.

202. Yin Z., Wang G.-L. Evidence of multiple complex patterns of T-DNA integration into the rice genome // Theor. Appl. Genet. 2000. V. 100. P. 461-470.

203. Zambryski P. Chronicles from the Agrobacterium-plant cell DNA transfer story // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1992. V. 43. P. 465-490.

204. Zambryski P., Tempe J., Schell J. Transfer and function of T-DNA genes from Agrobacterium Ti and Ri plasmids in plants // Cell. 1989. V. 56. P. 193-201.

205. Zhao Y., Leisy D J., Okita T.W. Tissue-specific expression and temporal regulation of the rice glutelin Gt3 gene are conferred by at least two spatially separated cis-regulatory elements // Plant Mol. Biol. 1994. V. 25. P. 429-436.

206. Zrenner R., Salanoubat M., Willmitzer L., Sonnewald U. Evidence of the crutial role of sucrose synthase for sink strenght using transgenic potato plants {Solanum tuberosum L.) // Plant J. 1995. V. 7. P. 97-107.

Информация о работе

Дейнеко, Елена Викторовна
доктора биологических наук
Новосибирск, 2004
ВАК 03.00.15

Диссертация

Изучение экспрессии гетерологичных и собственных генов у трансгенных растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы