Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологические основы селекционной технологии моркови

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические основы селекционной технологии моркови"

На правах рукописи

00305G0Y0

ТЮКАВИН Геннадий Борисович

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СЕЛЕКЦИОННОЙ ТЕХНОЛОГИИ МОРКОВИ (Daucus carota L.)

Специальность: 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА-2007

003056070

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте селекции и семеноводства овощных культур РАСХН в 1983-2005 гг.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Высоцкий Валерий Александрович

доктор биологических наук Долгих Юлия Ивановна

доктор биологических наук Поляков Алексей Васильевич

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева.

Защита диссертации состоится « 2jy> А* <Х S, 2007 г., в часов на заседании диссертационного совета Д.006.027.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д., 42. Тел: (495) 976-65-44, Факс: (495) 977-09-47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан «_»_2007 г.

Ученый се1фетарь

Диссертационного совета Д.006.027.01 кандидат биологических наук

Рг.

С.А. МЕЛИКОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди овощных культур морковь занимает одно из ведущих мест. По данным департамента экономики МСХ РФ (2000) до 1994 года она занимала третье место, а с 1995 года занимает второе место по валовому сбору среди основных овощных культур. Морковь используется не только как пищевой продукт, но и в качестве ингредиентов в пищевой и фармацевтической промышленности. По моркови имеется достаточное количество литературы, посвященной биологии, возделыванию, селекции и семеноводству, хранению и переработке, использованию в медицине и парфюмерии (Эдельштейн, 1962; Сечкарев, 1971; Еременко, 1975; Прохоров и др., 1981; Матвеев, Рубцов, 1985; Сазонова, Власова, 1990; Круг, 2000; Литвинова, 2001, Буренин, Федорова, 2003; Леунов и др., 2006).

Морковь являлась одним из важнейших модельных объектов при изучении фундаментальных вопросов биотехнологии растений. Каллусные культуры моркови использовались при изучении компонентов и состава питательных сред (Уайт, 1949), морфогенеза и регенерации растений (Бутенко, 1964). Суспензионная культура моркови позволила вскрыть механизмы образования и развития зародышей в культуре in vitro, что было трудно, а порой и невозможно, сделать при изучении эмбриогенеза in vivo (Ammirato, 1986). В прикладом отношении использование методов биотехнологии растений ограничивалось возможностью использования соматического эмбриогенеза для размножения родительских инбредных линий и отбора т vitro с целью получения новых источников устойчивости к болезням (Meredith, Lawrence, 1981). Использование соматического эмбриогенеза позволило разработать технологию производства искусственных семян, что открыло новый путь к сохранению и поддержанию ценных селекционных линий (Kitto, Janick, 1985; Kamada et al., 1989, Liu et al., 1992). Нерешенными оставались вопросы культуры зародышей, завязей и семяпочек, пыльников т vitro и получения трансгенных растений моркови с новыми хозяйственно полезными признаками. Решение этих вопросов является актуальным направлением в селекционных программах по моркови (Simon, 1997). В связи с этим возникла необходимость в разработке методов культуры зародышей, андрогенеза и гиногенеза in vitro и трансгеноза, способствующих ускоренному созданию нового исходного материала для селекционной технологии моркови.

Совместное использование методов генетической инженерии, клеточной инженерии и классической селекции позволит ускорить получение сортов и гибридов моркови, устойчивых к болезням и вредителям, стрессовым факторам с улучшенными вкусовыми и технологическими качествами товарной продукции

цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы являлась разработка системы биотехнологических методов для селекционной технологии моркови.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи.

1. Разработать способы стерилизации исходных эксплантов для введения в культуру in vitro бутонов, завязей, семяпочек, зародышей и пыльников моркови.

2. Разработать регенерационную систему в культуре зиготических зародышей

3. Разработать метод культуры зародышей моркови in vitro: а) состав питательной среды для культивирования изолированных зародышей; б) выявить оптимальную стадию развития для эксплантации завязей, семяпочек и зародышей на питательную среду.

4. Разработать метод культуры пыльников (андрогенеза in vitro) моркови: а) выявить взаимосвязь между стадиями развития мужского гаметофита и размерами соцветий и генеративных органов моркови; б) условия выращивания донорных растений; в) оптимальную стадию развития микроспор для эксплантации пыльников на питательные среды т vitro; г) тип первичного экспланта; состав питательных сред для индукции андрогенных структур, регенерации растений и их укоренения; д) способ адаптации растений-регенерантов к условиям выращивания in vivo.

5. Изучить цитологию эмбриогенеза в культуре пыльников и изменения плоидности у растений-регенерантов, приводящих к образованию удвоенных гаплоидов моркови

6.Разработагь метод культуры неопыленных семяпочек (гиногенеза in vitro) моркови: а) выявить взаимосвязь между стадиями развития женского гаметофита и стадиями развития мужского гаметофита, а также размерами соцветий и генеративных органов моркови; б) оптимальную стадию развития зародышевого мешка для эксплантации семяпочек на питательные среды in vitro; в) типы эксплантов; состав питательных сред для индукции гияогенных структур, регенерации растений и их укоренения.

7. Модифицировать метод генетической трансформации моркови и получить трансгенные аналога сорта Нантская 4, устойчивые к фитопатогеиам.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые разработана регенерационная система в культуре зиготических зародышей моркови. Данная система позволяет получать высоко эмбриогенный каллус, регенерировать и укоренять рас-тения-регенеранты. Регенерационная система с успехом была использована при генетической трансформации моркови репортерным геном GUS, геном растительного дефензина из семян редьки Rs-ap и геном Тауматин II (Шушкова, Тюкавин, Долгов, 1998а, 19986), а также геном итерлейкина-18 человека (Дейнеко и др., 2004; Deyneko,. Shmikova, Tukavin et al., 2005; Лопатникова и др., 2005; Yakushenko et al., 2006).

Впервые проведены исследования по разработке метода культуры изолированных зародышей моркови in vitro. Предложен состав питательной среды, позволяющий получать растения из изолированных зародышей на разных стадиях развития. Установлено, что пороговым сроком отделения завязей от материнского растения для культивирования завязей, семяпочек и зародышей in vitro является четыре недели после опыления. К этому времени зародыш достигает = 1/3 своего окончательного размера in vivo. Разработанные методические приемы были использованы для культивирования апомиктичных зародышей. В результате получено 30 линий, из которых две отобраны как перспективные формы для селекции (Тю-кавин, Тимин, Валеева, Буракова, 1988).

Впервые разработан метод культуры пыльников (андрогенеза in vitro) моркови, включающий: 1 - отбор бутонов с пыльниками на стадии вакуолизированных микроспор; 2 - стерилизацию первичных эксплантов 10%-ным водным раствором хлорамина «Б» в течение 2030 мин или 0,5 %-ным водным раствором сулемы в течение 20 мин; 3 - индукцию андроген-ных структур на среде МСм с 0,2 мг/л 2,4-Д, 4 - регенерацию растений-регенерантов на среде МСм с 0,1 мг/л кинетина; 5 - подращивание и укоренение растений-регенерантов на безгормональной среде МСм; 6 - адаптацию растений-регенерантов к условиям выращивания in vivo; 7 - молекулярно-генетический анализ С использованием метода андрогенеза т vitro моркови получен исходный материал, послуживший для создания сорта моркови столовой Соната (Авторское свидетельство № 34702 ГК РФ по испытанию и охране селекционных достижений).

Впервые разработан метод культуры неопыленных семяпочек (гиногенеза in vitro) моркови, включающий: 1 - отбор бутонов с семяпочками на стадии зрелых зародышевых мешков; 2 - выделение семяпочек и культивирование их на среде МСм с 0,2 мг/л 2,4-Д до формирования гиногепных структур; 3 - регенерацию растений-регенерантов на среде МСм с 0,1 мг/л кинетина; 4 - подращивание и укоренение растений-регенерантов на безгормональной среде МСм. С использованием метода гиногенеза получен исходный материал для создания гибридов Fi во ВНИИО (Семенова, Тюкавин, Клыгина, 2003).

Модифицирован метод бактериальной трансформации моркови с использованием реге-нерационной системы в культуре зародышей. Впервые получены трансгенные растения с геном Тауматин II и геном интерлейкина-18 человека. Показана фунгицидкая активность гена Тауматин II и получены трансгенные аналоги сорта Нантская 4, устойчивые к Fusarium avenaceum

На защиту выносятся следующие положения.

1. Методы культуры зиготических зародышей моркови.

2. Методы получения удвоенных гаплоидов моркови (андрогенез и гиногенез in vitro).

3. Метод генетической трансформации моркови.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 36 Всероссийских, Всесоюзных и Международных конференциях, научно-практических конференциях, симпозиумах и конгрессах, а также на выставке «Биотехнологии России» (г. Берлин, Германия, 2001).

В результате исследований, представленных в диссертационной работе, был получен исходный материал, использование которого в селекционных программах ЗападноСибирской овощной опытной станции и ВНИИ овощеводства позволило создать сорт Соната (Тюкавин, Рыбалко, Шмыкова, Селянин, 2005) и перспективные гибриды F] (Семенова, Тюкавин, Клыгина, 2003) моркови столовой.

Объем и структура раб о ты. Диссертация изложена на 539 страницах, включает стандартные разделы и 44 приложения. Иллюстрирована 94 таблицами и 120 рисунками. Список цитируемой литературы включает 1045 наименований, из них 732 на иностранных языках. Фактический материал получен автором лично, а также в ходе работ с сотрудниками ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур, Научно-исследовательского и селекционного института овощеводства (г. Оломоуц, Чехословакия), Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (г. Пущино), Кафедры генетики и селекции МГУ (г. Москва), ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии (г. Москва), ВНИИ овощеводства (д. Верея), Западно-Сибирской овощной опытной станцией (г. Барнаул), которым автор выражает глубокую и искреннею благодарность.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материал исследований. Объект исследований - морковь. Материалом являлись сорта, линии, гибриды, предоставленные лабораториями генетики и цитологии, селекции и семеноводства столовых корнеплодов ВНИИССОК и отделом селекции и семеноводства ВНИИО. Растения, в зависимости от времени года и решаемых задач, выращивались в полевых условиях, в теплицах различных конструкций и в вегетационных камерах при 20-25 °С и 16 часовом фотопериоде. Эксплантами служили различные органы растений -семена, зародыши, фрагменты проростков, соцветия (зонтички), бутоны, пыльники, завязи и семяпочки.

Методы исследований. Стерилизацию эксплантов проводили по разработанным нами методикам (Тюкавин, 1989, 1995). Для культивирования эксплантов использовали питательные среды различного состава МС (Murashige, Skoog, 1962), Б5 (Gamborg, Eveleigh,

196S), Нич (Nitsch, 1969), МСм (Masuda et al., 1981) и № 6 (Chu, 1982). В зависимости от решаемых задач в питательные среды добавлялись регуляторы роста как отдельно, так и в различных комбинациях и концентрациях.

Закладку опытов по стерилизации и учет инфицированности семян проводили по методикам ВИЗР (Чумаков и др., 1974).

Цитологический анализ микроспор, пыльцы, пыльников, зародышевых мешков, зародышей, а также нлоидности эмбриоидов и растений-регенерантов выполняли по общепринятым методикам (Паушева, 1970, 1988, Еналеева и др., 1972), которые при необходимости модифицировались (Тюкавин, Шмыкова, Монахова, 1999, Тюкавин, Шмыкова, 2000; Тюкавин, Наумова, 2006).

Биохимический анализ растений (содержание сухих веществ, суммы Сахаров, моносахаров, каротина) вели по общепринятым методикам исследования растений (Ермаков и др., 1987), а исследование ферментов - методом изоэлектрического фокусирования (Левитес, 1986).

RAPD - анализ проводился на базе лаборатории физиологии и биохимии ВНИИССОК и лаборатории генома растений Центра «Биоинженерия» РАН. Выделение геномной ДНК из растительной ткани проводилось микрометодом на основе протокола, предложенного Edwards et al. (1991) в модификации Дорохова и Клоке (1997).

Трансгенные растения получали методом агробактериальной трансформации каллус-ных культур из зиготических зародышей моркови. Для генетической трансформации использовались: 1 - обезоруженный супервирулентный штамм Agrobacterium tumefaciens СВЕ 21, полученный в «Центре Биоинженерии» РАН, с бинарным вектором, состоящим из плазмиды рВ1 121, гена ß-глкжуронидазы (GUS) и селективного маркера гена неомицинфосфотранс-феразы (npt II), обеспечивающего устойчивость к канамицину; 2 - обезоруженный супервирулентный штамм A. tumefaciens ЕНА 105 с бинарным вектором, состоящим из плазмиды p35S GUSintron, гена GUS intron, содержащего в кодирующей области растительный интрон, и селективного маркера гена гигромицинфосфотрансферазы (hpt), обеспечивающего устойчивость к гигромицину; 3 - обезоруженный штамм А. tumefaciens GV3101 с бинарным вектором, состоящим из плазмиды pPCV002, гена растительного дефензина из семян редьки Rs-ap, клонированного во ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии, и селективного маркера гена npt II; 4 - обезоруженный супервирулентный штамм A tumefaciens СВЕ 21с бинарным вектором, состоящим из плазмиды рВ1 121, гена тауматин II и селективного маркера гена npt II. Бинарный вектор на основе плазмиды рВ1 121 был сконструирован в ФИБХ с использованием последовательности, клонированной доктором A. Ledeboer в Лейденском универ-

ситете (Голландия). Во всех генных конструкциях для получения высокой экспрессии перенесенного гена использовался сильный конститутивный промотор гена 35S-PHK из генома вируса мозаики цветной капусты. Все штаммы агробактерий культивировали на среде NB по стандартной методике (Армитидж и др., 1991)

Регенерацию растений проводили на агаризованной и/или жидкой среде МСм, содержащей 0,1 мг/л кинетина и 50-100 мг/л канамицина или 20-30 мг/л гигромицина. В экспериментах были включены положительный и отрицательный контроли. Положительным контролем служили неинфицированные каллусы, культивируемые на регенерационной среде без антибиотика, а отрицательным контролем служили неинфицированные каллусы, культивируемые на регенерационной среде с селективным антибиотиком.

Для подтверждения встраивания последовательностей целевых генов и npt II в геном трансгенных растений моркови использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Геномную ДНК моркови выделяли с использованием 2х СТАБ буфера по методике Rogers and Benedich (1994). Иммуноблотинг трансгенных растений с целевыми генами проводили по Torbin and Gordon (1984).

Оценку на устойчивость к Fusarium avenaceum проводили по методике ВНИИО (JIe-унов и др., 2006). Семена моркови, полученные в результате самоопыления трансгенных растений Rti-t3> высевали на постоянном изолированном участке с инфекционным фоном. В почву инфекционного фона вносилась чистая культура гриба Fusarium avenaceum, размноженная на зерновом субстрате (пшеница + овес в соотношении 1 : 2). Для подготовки культуры гриба зараженную зерносмесь выдерживали в термостате при температуре 24-26 °С в течение 3-4 недель. Когда мицелий покрывал всю поверхность зерна, его подсушивали при температуре 18 °С. Дозировка задавалась через количество субстрата, на котором наработан инокулюм, т. е 250 г на 0,5 м2.

Длина делянок составляла два метра. Повторность опыта - двукратная Посев семян был проведен 20 июня 2005 г. Учет проводили в период уборки - 29 сентября 2005 г. Распространенность болезни (в %) определяли по формуле (Сазонова и др., 1987):

Я = (лхЮО) / N где п - количество пораженных растений (или отдельных органов), N - общее количество учетных растений (или органов).

Поражение растений Fusarium avenaceum определили по наличию пятнистости на черешках листьев.

Статистическая обработка экспериментальных данных. При математической обработке экспериментальных данных использовались основные математи-

ко-статистические методы, применяемые в биологических исследованиях (Плохинский, 1970, Лакин, 1980; Доспехов, 1985; Долголаптев, 1995; Дюк, 1997; Тюрин, Макаров, 1998; Гланц, 1999). Обработку экспериментальных данных проводили с использованием статистических пакетов Microsoft Excel 2000, Primer of Biostatistics Version 4.03., StatGraphics Plus for Windows Version 3.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Культура зародышей

Стерилизация семян и завязей. В исследованиях по разработке методов биотехнологии растений при введении в культуру m vitro первичных эксплантов важное значение имеет их стерилизация, суть которой заключается в том, чтобы стерилизующее средство губительно действовало на споры и вегетативные ткани всех микроорганизмов и в то же время минимально повреждалб исследуемую ткань.

Семена. При разработке способа стерилизации семян были изучены различные стерилизующие вещества: этанол, аятин, перекись водорода, перманганат калия, хлорная известь, хлорамин, диоцид, сулема, а также фитонциды лука чеснока и горчицы. В результате было установлено, что этанол снижает инфицированность грибами, при этом 96 %-й этанол оказался более эффективен по сравнению с 70 %-м. Наиболее действенными оказались ртутьсо-держащие препараты эффективность которых увеличивалась при предварительной стерилизации семян моркови 96 %-м этанолом в течение двух минут, однако при этом снижались энергия прорастания и всхожесть семян (табл. 1).

При выделении зародышей из семян и помещении их на питательные среды действие стерилизующих веществ не обнаруживалось. Прорастание выделенных зародышей моркови на питательных средах в условиях in vitro составило в среднем 83,2 ± 1,5 % при доверительном интервале 80,2-86,0 %. Существенных морфологических изменений у растений, полученных в условиях in vitro, отмечено не было.

Таким образом, на основании проведенных исследований, для получения стерильной культуры зародышей in vitro был предложен следующий способ стерилизации семян моркови: предварительная стерилизация 96 %-м этанолом в течение двух минут, а затем стерилизация 0,5 %-м водным раствором сулемы в течение 20-30 минут.

Завязи. Для стерилизации завязей моркови: предварительная стерилизация 96 %-м этанолом в течение 1 мин, а затем стерилизация 0,1 %-м водным раствором сулемы в течение 20-30 минут

Таблица 1

Инфицированность и посевные качества семян моркови при стерилизации ртутьсодержшдими препаратами (среднее по образцам, 1981-1983 гг.)

Инфи- Энергия прорастания, % Всхожесть, %

Вариант циро-ван- ность, % значение* разница с контро лем** значение* разница с контро лем**

Контроль 0,1 %-й диацид - 30 мин 0,5 %-я сулема - 30 мин 1,0 %-я сулема - 30 мин 96 %-й этанол - 2 мин -> 0,5 %-я сулема - 10 мин 96 %-й этанол - 2 мин -» 0,5 %-я сулема - 20 мин 96 %-й этанол - 2 мин 0,5 %-я сулема - 30 мин 100,0 90,3 24,0 0,3 38,0 5,3 1,5 60,8 32,8 21,1 5,5 21,2 22,8 23,0 28,0 39.7 55,3 39,6 38,0 37.8 73,4 43,7 44.6 13,2 44.7 39.8 38,2 29.7 28.8 60,2 28,7 33,6 35,2

Статистические критерии F = 147,52, Р< 0,0001 »F = 30,97; *Р < 0,0001 **НСРо5 = 8,6 •F = 22,71; *Р< 0,0001 **НСРо5 = 10,4

Разработка состава питательной среды для культивирования зиготических зародышей моркови in vitrо. Для разработки метода культуры зародышей моркови in vitro мы использовали зрелые семена моркови сорта Московская зимняя А-515. Для выделения зародышей семена моркови нужно замачивать в воде. Оптимальным вариантом является замачивание семян в течение суток или на ночь (15-18 час) при комнатной температуре или в термостате при 25 °С. При этом режиме семена не успевают прорасти, покровы и эндосперм хорошо размягчаются и зародыши легко выделяются препаровальными иглами. Иногда зародыш можно выделить из семени при надавливании на его верхнюю часть, близкую к микропилярному концу.

Во время проведения исследований нами было установлено, что рост и развитие проростков из изолированных зиготических зародышей моркови в культуре in vitro зависит от сезонности, т. е. времени проведения экспериментов. Наибольшая активность роста проростков наблюдалась в весенний период (рис. 1).

Изучение действия различных регуляторов роста на формирование, рост и развитие проростков из изолированных зародышей в культуре in vitro проводился на основе среды МСм (Masuda et al., 1981). Всего было изучено 77 вариантов сред Основными тестами служили количественные показатели (количество листьев и высота проростка), а также визуальная оценка общего состояния проростков и корневой системы.

6 -Я I

£ <M

ь о

о з

О. J с

12'

5 1 -

о \------г-.-,-,---,

25 04 18 05 30 05 19 06 10 07 30 07 27 08 03 09 Дата начала эксперимента

По дате проведения экспериментов F = 3,19; Р = 0,0030 По времени проведения анализов F = 23,90 Р < 0,0001 Рис 1 Высота проростков моркови на безгормональной среде МСм в зависимости от времени проведения экспериментов1 1 - через две недели; 2 - через три недели культивирования

□ 2 недели ПЗ недели

6 -5 5 "

Li

с

12 -и , _

0

Среда

По средам F = 6,70, Р = 0,0004 По времени F = 17,50; Р = 0,0001 Рис 2 Высота проростков моркови, полученных из зрелых зиготических зародышей сорта Московская зимняя А-515, в культуре т vitro на средах 1 - полная безгормональная МСм,

2 - минеральные соли + сахароза по МСм, 3 — МСм без мезо-

инозита и гидролизата казеина, 4 - МСм без гидролизата ка-

зеина.

В результате было установлено, что для прорастания зародышей и нормального развития проростков необходимы все компоненты основной среды. Важным фактором для прорастания зародышей является наличие сахарозы в среде Отсутствие одного или нескольких компонентов органических веществ в среде негативно сказывалось на развитии проростков (рис.2).

У ряда культур для нормального роста зародышей и последующего морфогенеза необходимо добавление в среду фи-тогормонов: ауксинов, цитоки-нинов и гиббереллинов (Здруй-ковская-Рихтер, 1981, 1985, Flmn et al., 1986; Lay-Allemand, Cornu, 1986). Положительное влияние оказывали и другие ростовые вещества - гидролизат казеина и дрожжевой экстракт (Здруйков-ская-Рихтер, 1985). В наших исследованиях по изучению влияния различных ростовых ве-

ществ на формирование, рост и развитие проростков из зиготических зародышей моркови т vitro в качестве контрольной была использована полная безгормональная среда МСм Основное внимание было уделено фитогормонам-стимуляторам. ауксинам, цитокининам и гиббе-реллину. Также изучалось действие гидролизата казеина с дрожжевым экстрактом (ТУ6-69-10-293-74), аденина и феруловой кислоты.

В итоге изучения действия состава питательной среды и различных ростовых веществ можно считать, что в целом зрелые зиготические зародыши моркови являются гормон-

независимыми, однако ряд ростовых веществ гормональной природы - кинетин (0,50 мг/л), ИУК (0,10 мг/л), ГКз (0,01 мг/л) и негормональной природы - ГК с ДЭ (2000 мг/л) оказывали благоприятное воздействие на рост и развитие проростков из зиготических зародышей в культуре in vitro.

Исходя из того, что принцип функционирования фитогормонов заключается в их взаимодействии друг с другом (Кефели, 1984), для культивирования зиготических зародышей моркови была предложена среда следующего состава: основные компоненты среды МСм с заменой гидролизата казеина на гидролизат казеина с дрожжевым экстрактом - 2 г/л + кинетин - 0,5 мг/л + ИУК - 0,1 мг/л + ГКз - 0,01 мг/л При культивировании зрелых зиготических зародышей моркови на этой среде было установлено, что образование листьев и рост проростков (рис. 3) происходило значительно лучше, чем на контрольной среде без фитогормонов.

Регенерациоииая система из зиготических зародышей моркови Каллусные культуры широко используются для изучения процесса морфогенеза растений - важной составной части клеточных технологий, создаваемых для селекции. У ряда важных сельскохозяйственных культур: кукурузы, пшеницы, ржи, тритикале, ячменя, овса, риса, гороха и др. для индукции каллуса используют культуру зародышей. У моркови каллусные культуры получали из корнеплодов (Reinert 1959,1962; Бутенко, 1964; Плащев 1982; Калашникова, 1996, Ипатова, 2004), гипокотилей проростков (Masuda et al., 1981; Simkova, 1998; Ипатова, 2004), сегментов листовых черешков (Ипатова, 2004).

В наших исследованиях каллусные культуры получали из зиготических зародышей моркови на основной среде МСм (Masuda et al., 1981) с добавлением 2,4-Д и ИУК в различных концентрациях. Для регенерации в среду добавляли аденин, кинетин, 2,4-Д, ИУК и ИМК в различных концентрациях и сочетаниях. В результате была разработана регенерационная система, заключающаяся в следующем:

- индукция каллуса проводится на среде МСм с 0,2 мг/л 2,4-Д;

Недели

По вариантам F = 4,31, Р = 0,0453, По времени F = 10,77, Р - 0,0002 Рис 3. Высота проростков моркови, полученных из зрелых зиготических зародышей сорта Московская зимняя А-515, в культуре in vitro на средах: 1 - безгормональная МСм, и 2 -МСм + ГК с ДЭ (2 г/л) + кинетин (0,5 мг/л + ИУК (0,1 мг/л) + ГК, (0,01 мг/л)

- регенерация проростков из каллусов - на среде МСм с 0,1 мг/л кинетина;

- подращивание и укоренение растений-регенерантов моркови - на фильтровальных мостиках в жидкой среде МСм без гормонов или с добавлением 0,1 мг/л кинетина.

рост и развитие завязей, семяпочек и зародышей in vivo. Процесс двойного оплодотворения у моркови был изучен на сорте Нантская 4 (Кордюм, 1967). Процессы роста и развития семени и зародыша моркови изучались на сорте Шантенэ (Еременко, 1975).

В наших исследованиях было проведено изучение роста и развития завязей, семяпочек и зиготических зародышей у растений моркови разных генотипов (Нантская 4, Московская зимняя А-515, Лосиноостровская 13, Витаминная 4, линии петалоидного типа ЦМС).

Изучение роста и развития оплодотворенной завязи показало' через неделю зародыш находится на стадии двуклеточной зиготы, эндосперм не сформирован; через две - зародыши на стадии глобулы на подвеске, эндосперм сформирован; через три - зародыши на стадии глобулы-сердца, эндосперм соответствует молочной спелости; через четыре - зародыши полностью дифференцированы и находятся на семядольной стадии, эндосперм твердеет и соответствует восковой спелости, завязи буреют и склонны к разделению на семянки. Далее происходит процесс созревания семян до их полной зрелости.

я j _ _2 .. . J Также было установлено,

что независимо от генотипа завязи достигают своего максимального размера через 4 недели, семяпочки - через 5 недель, а зародыши через 6-7 недель (рис. 4). Однако размеры завязей, семяпочек и зародышей зависят от генотипа.

Регенерация pacte-

ний in vitro из разновозрастных завязей, семяпочек и за родышей моркови. Задачей исследований являлась разработка метода культуры in vitro незрелых завязей, семяпочек и зародышей, что являлось предпосылкой целенаправленного получения апомиктичных растений и межвидовых гибридов моркови.

В результате исследований было установлено, что в условиях in vitro на питательных

Рис. 4. Динамика увеличения длины 1 - завязей; 2 — семяпочек, 3 - зародышей моркови сорта Московская зимняя А-515

средах растения можно получить из 1-2-х недельных семяпочек, 3-х недельных зародышей и 4-х недельных завязей. Однако для всех случаев пороговым сроком отделения завязей от материнского растения является четыре недели после опыления. К этому времени зародыш достигает ~ 1/3 своего окончательного размера in vivo. С увеличением возраста эксплантов всхожесть их возрастает. По эффективности прорастания экспланты можно расположить в следующем порядке: зародыши - семяпочки - завязи. В целом эффективность прорастания эксплантов и развития растений моркови т vitro зависит от состава питательной среды, генотипа донорного растения, возраста и типа экспланта.

Таблица 1

Характеристика растений из разновозрастных зиготических зародышей и семяпочек моркови через четыре недели культивирования на питательной среде МСм + 2 г/л ПС с ДЭ + 0,5 мг/л кинетина + 0,1 мг/л ИУК + 0,01 мг/л ГК3 (1984 г.)

Возраст, нед. Образец Зародыши Семяпочки Статистические критерии трехфак-торного анализа

Количество листьев, пгг

4 Московская зимняя А-515 Линия № 521 Лосиноостровская 13 3,7 ±2,18 1,6 ±0,16 2,0 ± 0,41 2,9 ± 0,47 2,4 ±0,16 3,1 ± 0,35 По возрасту F = 0,76; Р = 0,4700 По образцам F = 5,54; Р = 0,0045 По эксплантам F = 18,01; Р< 0,0001

5 Московская зимняя А-515 Линия №521 Лосиноостровская 13 2,0 ± 0,29 2,1+0,14 2,3 ±0,21 2,5 ± 0,29 2,8 ±0,19 3,2 ±0,14

6 Московская зимняя А-515 Линия № 521 Лосиноостровская 13 1,3 ±0,33 1,7 ±0,15 3,1 ± 0,49 2,2 ± 0,20 3,2 ±0,15 3,1 ± 0,20

Высота растений, см

4 Московская зимняя А-515 Линия №521 Лосиноостровская 13 0,8 ± 0,38 2,5 + 0,32 3,0 ±1,06 6.4 ± 0,59 8,3 ± 0,54 6.5 ± 0,76 По возрасту F = 40,85; Р< 0,0001 По образцам F = 8,16; Р = 0,0004 По эксплантам F = 213,3; Р< 0,0001

5 Московская зимняя А-515 Линия №521 Лосиноостровская 13 3,6 ±0,77 7,8 ± 0,52 6,8 ± 0,50 10,8 ±0,16 10,4 ± 0,46 11,1+0,48

6 Московская зимняя А-515 Линия №521 Лосиноостровская 13 3,5 ± 0,57 5,4 ±0,46 5,3 ±0,64 9,7 ±1,68 11,2 ±0,32 10,4 ±0,49

При сравнении роста и развития растений из равновозрастных зародышей и семяпочек было отмечено, что на формирование листьев существенное влияние оказывает генотип растения и тип экспланта (табл. 2). Большее количество листьев образовывалось у растений сорта Лосиноостровская 13 и наименьшее у линии № 521. В отношении эксплантов большее

количество листьев формировалось у растений из семяпочек. На высоту растений наряду с генотипом и типом экспланта значительное влияние оказывал также и возраст эксплантов (табл. 2). В целом наибольшая высота была у растений из эксплантов пятинедельного возраста и наименьшая - четырехнедельного возраста. Наибольшей высотой отличались растения линии № 521, а наименьшей - растения сорта Московская зимняя А-515. Среди эксплантов наибольшей высотой отличались растения из семяпочек. Аналогичный характер различий по количеству листьев и высоте растений сохранялся по генотипам и эксплантам и при анализе растений через шесть недель культивирования.

Разработанные методические приемы, изложенные выше, были использованы для культивирования апомиктичных завязей, семян и зародышей. В результате совместных исследований с лабораторией генетики и цитологии ВНИИССОК при культивировании апомиктичных зародышей было получено 30 линий, две из которых были отобраны как перспективные формы для селекции (Тюкавин, Тимин, Валеева, Буракова, 1988).

Культура пыльников

Фертильность донорных растений моркови При проведении исследований по культуре пыльников т vitro важно отбирать высокофертильные донорные растения. Высокая фертильность пыльцы связана с высоким андрогенетическим потенциалом (Маруненко и др., 1988, 1990). Период цветения семенного растения моркови довольно продолжителен Фертильность пыльцы в пыльниках зонтиков 1-го, 2-го и 3-го порядков находится на том же уровне, что и фертильность пыльцы пыльников центрального зонтика. Фертильность пыльцы в пыльниках разных частей зонтика также находится на одном уровне. Высокофертильные донорные растения моркови можно отбирать по фертильности пыльцы цветков центрального зонтика. Для культивирования in vitro можно использовать пыльники зонтиков 1-го порядка, а при необходимости 2-го и даже 3-го порядков. В наших исследованиях фертильность пыльцы донорных растений моркови в зависимости от сорта и места выращивания составляла 82-91 %.

Взаимосвязь между стадиями развития мужского гаметофи-та и размерами соцветий и генеративных органов моркови Важным моментом для снижения трудоемкости и увеличения производительности, при проведении исследований по получению гаплоидов и/или удвоенных гаплоидов, является выявление корреляции между морфологическими показателями генеративных органов растения и стадией развития микро- и макрогаметогенеза (Муромцев и др., 1990). В результате наших исследований были установлены биологические закономерности развития микроспоро- и гамс-

тогенеза в пыльниках моркови в зависимости от размеров зонтиков, бутонов и пыльников. Выявлена высокая корреляционная зависимость между стадиями развития микроспоро- и гаметогенеза в пыльниках моркови и диаметром зонтика (гху = 0,996), высотой бутона (гху = 0,971), длиной пыльника (гху = 1,000) (табл.3) Поскольку длина пыльника тесно связана со стадиями микроспорогенеза, то следовало ожидать, что внутри одного зонтичка и в пределах одного зонтика можно обнаружить микроспоры, находящиеся на разных стадиях развития. Это предположение нашло подтверждение в наших последующих исследованиях (Тюкавин, Шмыкова, Монахова, 1999, Шмыкова, Тюкавин, 2001).

Таблица 3

Взаимосвязь между морфологическими показателями генеративных органов и стадией микроспоро- и гаметогенеза в пыльниках наружных цветков крайних зонтичков соцветий 1-го порядка моркови (1988 г.)

Преобладающая стадия (модальный класс) микроспоро- и гаметогенеза

Абсолютные значения

Показатели регрессионного

Статистические критерии

Тетрады Распад тетрад Ранние микроспоры* Поздние микроспоры*'

Распад тетрад Ранние микроспоры Поздние микроспоры Двуклеточная пыльца

Распад тетрад Ранние микроспоры Поздние микроспоры

Диаметр зонтика, мм 10 12 15 18

Высота бутона, мм 0,8 1,0 1,2-1,4 1,6

Длина пыльника, мм 0,3 0,4 0,5

ух = -1,55 + 0,367х

Гху = 0,971 ух = 0,40 + 3,500х

Гху = 1,000

Ух = 0 + 10,000х

Р = 243,00 Р = 0,0041

Р = 49,00 Р = 0,0060

Примечание. * Ранние микроспоры - микроспоры с начальной стадией вакуолизации, ** поздние микроспоры - микроспоры с крупными вакуолями.

Однако значения свободных членов и коэффициентов регрессии уравнений линейной регрессии будут изменяться в зависимости от условий выращивания донорных растений. Было отмечено, что при выращивании донорных растений моркови сорта Нантская 4 в открытом грунте одноядерные микроспоры в пыльниках крайних цветков зонтиков 1-го порядка в 1986 г. находились в зонтиках диаметром 25-30 мм, в 1987 г. - в зонтиках диаметром 30-35 мм, а в 1988 г. - в зонтиках диаметром менее 20 мм. Поэтому в каждом конкретном случае следует проводить предварительный анализ микроспорогенеза Для этого можно использовать экспресс-методику определения стадий микроспорогенеза. Экспресс-метод за-

ключается в следующем: выделяют пыльники из бутонов, разминают их пинцетом в капле ацетокармина, удаляют остатки пыльников. Накрывают покровным стеклом и подогревают на спиртовке Оставляют препарат на 15-20 мин для прокрашивания. Препарат просматривают под микроскопом и выявляют модальный класс стадий микроспорогенеза.

Условия выращивания донорных растений моркови. Для каждого вида растений оптимальные требования для выращивания донорных растений различаются и поэтому нет единых общих рекомендаций (Данвелл, 1989). В наших исследованиях по моркови было отмечено, что эффективность эмбриогенеза была выше у пыльников донорных растений, выращенных в условиях защищенного грунта (табл. 4).

Таблица 4

Эмбриогенная активность пыльников моркови сорта Нантская 4 на среде №6 + 0,1 мг/л 2,4-Д в зависимости от условий выращивания донорных растений (1990 г.)

Время проведения Количество пыльников Количество эмбриоидов на пыльник, шт

опытов высажено, шт эмбриогенных, % культивируемый эмбриогенный

Весна - теплица 150 7,3 ±2,1 0,153 2,10

Лето - поле 200 3,5 ±1,3 0,050 1,40

Дальнейшие исследования показали, что для получения воспроизводимых результатов донорные растения моркови целесообразно выращивать в вегетационных камерах

Стерилизация первичных эксплантов. Для получения стерильной культуры пыльников наиболее эффективной является стерилизации зонтичков 10%-ным водным раствором хлорамин «Б» в течение 20—30 мин. (табл. 5).

Таблица 5

Инфицированность пыльников in vitro при стерилизации зонтичков моркови (1985-1987 гг.)

Способ стерилизации Проанализировано пыльников, шт Инфицированность пыльников, %

Стерильная дистиллированная вода - 30 мин

(контроль) 200 37,5 ± 3,42

0,1%-ая сулема - 10 мин 169 11,8 ±2,48

10%-й хлорамин «Б» - 5 мин 3400 28,8 ± 0,78

96%-й этанол - 1 мин —> 10%-й хлорамин «Б» -

10 мин 631 2,5 ± 0,62

10%-й хлорамин «Б» - 20 мин 1012 2,3 ± 0,47

10%-й хлорамин «Б» - 30 мин 700 2,7 ±0,61

Этот способ хорошо зарекомендовал себя при стерилизации зонтичков и получении стерильной культуры пыльников in vitro независимо от того, где и когда выращивались донорные растения. Для стерилизации бутонов также весьма эффективным способом является

стерилизация их 0,5%-ным водным раствором сулемы в течение 20 мин (Тюкавин, Шмыкова, 2000).

Стадия развития микроспор для индукции андрогенных структур моркови. В наших исследованиях при культивировании пыльников моркови на средах различного состава было установлено, что эмбриогенез индуцируется как на стадии тетрад, так и на стадии вакуолизированных микроспор. Однако стадия вакуолизирован-ных микроспор является более благоприятной для помещения пыльников на питательные среды (табл. 6).

Таблица 6

Эмбриогенная активность пыльников моркови гибрида Р| в зависимости от стадии развития микроспор (1990 г.)

Стадии развития микроспор Количество пыльников Статисти-

Среда высажено, шт эмбрио-генных, % ческие критерии

Нич + 0,1 мг/л 2,4-Д Тетрады Вакуолизированные 300 200 4,67 7,00 Х2= 16,48;

№6 + 0,1 мг/л 2,4-Д Тетрады Вакуолизированные 140 160 11,43 15,00 Р = 0,001

Непрямой и прямой андрогенез моркови in vitro. У разных видов растений образование андрогенных структур происходит из микроспор путем прямого (эмбриогенез) или непрямого (каллусогенез) андрогенеза in vitro.

Непрямой андрогенез in vitro. Этот способ использовался при получении гаплоидных растений и/или удвоенных гаплоидов у пшеницы-однозернянки (Tan, Halloran, 1980), ячменя (Malepszy, Grunewaldt, 1974; Sunderland et al., 1979; Sunderland, Evans, 1980; Chen et al, 1984), риса (Qu Rong-da, Chen Ying, 1984), льна (Poliakov, Proliotova, Rutkowska-Krause, 1995, Поляков, 1998, 2000), фасоли золотистой (Bajaj, Singh, 1980), гороха голубиного (Sudhakar et al., 1986), плевела опьяняющего и овсяницы луговой (Rose et al., 1987), картофеля (Марунен-ко и др., 1988, 1990; Маруненко, Кучко, 1989), арахиса (Bajaj et al., 1980), персика (Hammerschlag, 1983).

В наших исследования изучение 16 питательных сред, содержащих гормоны 2,4-Д, НУК, кинетин и зеатин в различных комбинациях и концентрациях, а также мезоинозит и высокие концентрации сахарозы показало, что оптимальным вариантом для индукции каллуса в культуре пыльников моркови является среда МСм + 0,2 мг/л 2,4-Д + 0,2 мг/л кинетина. На индукцию каллусогенеза существенное влияние оказывает состояние среды. В исследованиях 1986-1987 гг. было показано, что на агаризованной среде МСм, содержащей по

Щщ. IS щ

* I

Рис. S. Органогенез у кал л ус и ой ткани пыльников моркови in vitro на среде МСм с 0,1 мг/л киНетИШ).

0,2 мг/л 2,4-Д и кинетика каллусные культуры формировалось у 6,6 ± 0,81 % пыльников, а ещ фильтровальных мостиках в жидкой среде у 11,0 ± 0,90 % пыльников (у2 = 1 1,67; Р < 0,001).

Эффективность каллусогенеза зависит также от генотипа докорного растения и условий культивирования. Необходимым фактором индукции каллуса у пыльников моркови является культивирование их в темноте. Оптимальным вариантом для органогенеза в каллусной культуре пыльников моркови является среда МСм с 0,1 мг/л ки неги на (рис. 5). Подращивание и укоренение растений-регенерантов проводится на жидкой бечгормональной среде МСм.

Использование метода непрямого андрогенсза моркови tn vitro позволило получить ряд линий выровненных но окраске (Ткжавин, Химии, Буракова, 1989).

Примой андрогенеэ in viiro. При этом способе эмбриоиды формируются 1. при симметричном делении. Образование эмбриоидов при симметричном делении микроспор наблюдалось у кокосового ореха (Thanh-Tuyen, Guzman, 1983), картофеля (Gao Xiuyun, 198H). 11. при делении: I - вегетативной клетки у табака (Цинова и др., 1981), померанца и по ¡щи руса трех-листочковош (Telsushi, Miteuo, 1989), пшеницы (Bogouspaev el al., 1990), ячменя (Chen et al.,), тритикале (Sun Ching-san et al., 1973); 2 - генеративной клетки y белены (Rag h a van, 1976), табака (АпяпН et al., 1980). Отчасти могут образовываться химерные эмбриоиды в результате деления вегетативной и генеративной клеток. Образование эмбрион до в смешанного происхождения наблюдалось у белены (Raghavail. 1976). табака (Anand et al, 1980).

Индукция прямого эмбриогенеза в культуре пыльников, на наш взгляд, является более перспективным путем для получения удвоенных гаплоидов моркови. Впервые индуцировать прямой эмбриогенез в культуре пыльников моркови нам удалось в 1985 г, (рис. 6).

В дальнейших исследованиях нами было показано, что прямой эмбриогенез можно индуцировать при постоянном культивировании изолированных пыльников моркови на среде МСм е высоким - 1,5 мг/л (Ткжавин. IIora-вииа. Валова, 2006) и низким - 0,1 мг/л (Тюкавин, 1У97) содержанием 2.4-Д. Также на средах иного основного состава (Б5, Нич, № 6) с низким (0,1-0,2 мг/л) содержанием 2,4-Д (Тюкавин, Таганов, Наумова, 1992; Ткжавин, Таганов, 1993). Прямой эмбриогенез также индупи-

1'ис. 6. Эмбриогенез в культуре пыльников моркови in vitro.

руется при предварительном культивировании пыльников на агаризованной среде МСм, содержащей 2,0 мг/л 2,4-Д и 0,5 мг/л кинетина, в течение 1-2 недель и последующем переносе их на жидкую безгормональную среду МСм. Эффективность достигает 12,5 %. Оригинальным способом индукции эмбриоидов является использование питательных сред кондиционированных суспензионной культурой моркови. Эффективность эмбриогенеза составляет 12-20%.

Эффектность эмбриогенеза зависит от генотипа донорного растения и от состояния среды. Жидкая среда является более предпочтительной, чем агаризованная.

После образования эмбриоидов важным этапом является отделение их от первичного экспланта и перенос на среду для регенерации. Изучение эффективности среды МСм без гормонов и с 0,1 мг/л кинетина на процесс формирования растений-регенерантов из эмбриоидов на глобулярной, сердцевидной и более поздних стадиях развития показало, что регенерация растений лучше идет на среде МСм + 0,1 мг/л кинетина (табл. 7).

Таблица 7

Органогенная способность эмбриоидов моркови при культивировании их на жидких средах (1988- 1989 гг.)

Количество эмбриоидов

Среда высажено, шт сформировало нормальные растения, % сформировало аномальные проростки, % не проросло, %

МСм безгормональная МСм + 0,1 мг/л кинетина 69 179 73,9 ± 5,3 86,6 ± 2,5 15,9 ±4,4 7,3 ± 1,9 10,2 ±3,6 6,1 ± 1,8

Статистические критерии - X2 = 4,83; Р = 0,028 - -

Растения-регенеранты из эмбриоидов можно получить и при дальнейшем культивировании пыльников с эмбриоидами на свету на исходных средах. Однако этот процесс зависит от состава исходной среды. Было установлено, что на средах МСм и Б5 шло дальнейшее развитие эмбриоидов с последующим образованием проростков. На средах Нич и № 6 при равных условиях дальнейшее развитие эмбриоидов приостанавливалось на ранних стадиях развития (глобулярной, сердцевидной). В последнем случае для регенерации растений эм-бриоиды необходимо переносить на жидкую среду МСм с 0,1 мг/л кинетина.

Способы повышения эффективности андрогеиеза в культуре изолированных пыльников моркови in vitro. Для повышения эффективности образования андрогенных структур используется различная предобработка эксплантов: повышенными и пониженными температурами или их сочетанием, гамма-лучами, лазерами, центрифугированием, снижени-

ем атмосферного давления, двуокисью углерода и биологически активными веществами.

В наших исследованиях был показан положительный эффект кратковременного воздействия (48 ч.) низкими положительными температурами (4-6 °С) на изолированные бутоны. Эффективность выхода андрогенных структур возрастала в 1,4-1,5 раза. Положительное влияние на эффективность эмбриогенеза оказало центрифугирование зонтичков моркови при 355 g в течение 4 мин. (табл. 8).

Таблица 8

Эмбриогенная активность пыльников моркови сорта Нантская 4 при предварительном культивировании на агаризованной среде МСм + 2,0 мг/л 2,4-Д + 0,5 мг/л кинетина в

течение двух недель и последующем культивировании на жидкой среде МСм без гормонов в зависимости от воздействия центрифугирования на пыльники донорных растений (1991 г.)

Время Количество пыльников Количество эмбрио-идов на пыльник, шт

Параметры центрифугирования культи-

вирования, недель высажено, шт каллусо- генных, % эмбрио- генных, % культивируемый эмбрио-генный

2 267 0,0 3,8 0,041 1,10

Контроль 6 8 267 267 1,5 1,5 13,5 14,2 0,255 0,270 1,89 1,89

10 267 1,5 15,0 0,285 1,90

Центрифугирование зонтичков при 355 % в течение 4 минут 2 6 8 10 162 162 162 162 - 1,9 14,8 18,5 20,4 0,43 0,638 0,796 0,833 2,33 4.29 4.30 4,09

Статистические критерии - - X2 = 53,6; Р < 0,001 - -

Важным моментом в разработке метода андрогенеза т vitro у моркови явилось выявление первичного экспланта. Поскольку генеративные органы моркови являются довольно мелкими (см. табл 3), то выделение пьиьников представляет собой довольно трудоемкий и малопроизводительный процесс. В связи с этим для предварительного культивирования было опробовано культивирование зонтичков и изолированных бутонов. Последний вариант оказался наиболее оптимальным. Культивирование бутонов позволяет увеличить производительность выделения пыльников в 10 раз и улучшить качество работы за счет того, что пересаживаются разросшиеся, способные к эмбриогенезу пыльники, а остальные удаляются.

В окончательном варианте метод андрогенеза т vitro для моркови состоит в следующем:

1 - стерилизацию бутонов моркови проводят 10 %-ным водным раствором хлорамина «Б» в течение 20-30 мин или 0,5 %-ным водным раствором сулемы;

2. - бутоны в течение 2-4 недель культивируют в темноте (в термостате при 25 °С) на агаризованной среде МСм с 0,2 мг/л 2,4-Д;

3. - разросшиеся пыльники выделяют из бутонов и переносят в пробирки на свежую среду того же состава, и культивируют на светоустановке с люминесцентными лампами при освещенности 2-3 клк, фотопериоде 16 ч и температуре 20-25 °С до образования эмбриои-дов и/или эмбриогенного каллуса (5-6 нед);

4. - эмбриоиды и/или эмбриогенный каллус переносят на фильтровальные мостики в стеклянные пробирки с жидкой средой МСм, содержащей 0,1 мг/л кинетина, где происходит процесс образования проростков либо из первичных, либо из вторичных эмбриоидов;

5. - подращивание и укоренение растений-регенерантов проводят на фильтровальных мостиках в стеклянных пробирках с жидкой безгормональной средой МСм.

цитология эмбриогенеза в культуре пыльников моркови in vitro. При культивировании пыльников in vitro происходят самые различные изменения в программе развития микроспор, о чем свидетельствует разнообразие получаемых анд-рогенных структур: каллусы, глобулы, эмбриоиды. Следовательно, для понимания закономерностей андрогенеза in vitro важно изучение путей развития микроспор, формирования андрогенных структур и регенерации растений.

При культивировании пыльников моркови на среде МСм + 0,2 мг/л 2,4-Д (иМСм) были выявлены две стадии развитая микроспор, на которых возможен переход на спорофитный путь развития: стадия тетрад и стадия предшествующая дифференцирующему митозу. Наиболее ранней является стадия тетрад, где наблюдалось деление одной из составляющих её клеток с последующим образованием каллуса и формированием гаплоидных эмбриоидов. Однако в этот период не завершен до конца процесс дифференциации соматических клеток пыльника, что способствует каллусообразованию из них. При культивировании пыльников на этой стадии развития микроспор может происходить развитие эмбриоидов как из гаплоидных, так и из диплоидных клеток.

Образование первых эмбриогенных структур на среде иМСм наблюдалось через неделю культивирования пыльников, а массовое образование через 3-4 недели.

При равном делении микроспор закладку проэмбрио отмечали как в обеих клетках (рис. 7а), так и в одной (рис. 76). В последнем случае вторая клетка не развивалась.

При неравном делении микроспор, когда в результате митоза образуются генеративная и вегетативная клетки, но размеры первой больше обьгтаых, возможны три пути образования эмбриоидов. 1 - Эмбриоиды развиваются из вегетативной клетки; генеративная клетка при этом деградирует (рис. 8а). 2 - Эмбриоиды развиваются из генеративной клетки, развитие

3 ó

Рис. 7. Закладка эмбриоидов и пыльцевом зерне при равном тиле деления микроспор на среде иМСм. а - образование ^мбриолдов обеих клеток пыльцеаого зерна (5 х 90); б - образование эмбриондов Ü3 одной клетки пыльцевого зерна (5 х 90). виден ВЫХОД змбриоида из оболочки пыльцевого зерна.

Рис. 8. Закладка эмбрноидов в пыльцевом зерне при неравном тине деления микроспор на среде иМСги.

а - образование змбриоида нз вегетативной клетки пыльцевого зерна после 1 митоза. Рядом видно неэмбрио] енное пыльцевое зерно {5 х 60); б - образование змбриоида из I ('•¡о:::-. ■ и^ ^и клетки пыльцевого зерна после I мктоза. Рядом видны неэмбрио генные пыльцевые зерна {5 * 60); в ■ закладка эмбриоидов из вегетативной и генеративной клеток пыльцевого зерна (5 х 90); г - многоклеточные гмбрноиды из вегетативной и генеративной клеток пыльцевого зерна (5 х 60).

вегетативной клетки при этом подавлено (рис. 86), 3 - Одновременное развитие эмбриоидов из вегетативной и генеративной клеток; генеративная клетка отличается меньшими размерами по сравнению с вегетативной (рис. 8в и Кг)

Было установлено, что процесс развитие эмбрион дои в пыльниках моркови происходит несинхронно (рис. 9). Одновременно в одном пыльнике можно наблюдать микроспоры, претерпевшие митоз, с началом развития эмбриондов и с многоклеточными эмбрисилами. Через 4 недели культивирования на среде иМСм в пыльниках наблюдали эмбриогенные структуры различных размеров (рис. 10), которые легко можно было посчитать.

Рис, 9. Микроспоры и разные стадии развития эмбриоидов на среде иМСм (3 X 90).

Рис. 10. Знбрншеиный пыльник, культивируемый в течение 4 недель на среде иМСм (10x6,4).

Высокач энбриогенная способность моркови проявляется сразу же на первых этапах развития эмбриоидов. Уже на первичных эмбриоидах, находящихся еще внутри оболочки пыльцевого зерна, происходит обособление отдельных клеток, дающих начало вторичным эмбриоидам (рис. 11).

Рис. 1 ]. Образований вторичных эмбриоидов внутри пыльника на среде иМСм

(3 х 90).

Рис. 12, Выход эмбриоидов из пыльников на среде МСм - 0,2 уг/л 2,4.Д ниш на среде МСм + 0,1 мг/л кинитина (10 х 2,5).

Рассматривая соцветия моркови, как сложную систему развития микроспор, мы выявили вполне определенную закономерность. Количество пыльников с эмбриоидами и количество эмбриоидов в расчете на культивируемый пыльник, увеличивается от центра к краю, как у сложного зонтика, так и у простых зонтичков (табл. 9).

Таблица 9

Образование эмбриоидов из микроспор в пыльниках при культивировании бутонов на среде МСм + 0,2 мг/л 2,4-Д (иМСм), 1995 г

Простой зонтичек Сложный зонтик

Центр 1/2 радиуса Край

Доля эмбриогенных пыльников, %*

Центр

1/2 радиуса

Край

4,8 ±2,1 19,6 ±3,3 28,9 ±3,7

5,4 ±1,8 35,2 ± 4,3 55,1 ± 4,4

23,8 ± 2,8 71,2 ±3,7 94,4 ± 2,2

Количество эмбриоидов на 100 культивируемых пыльников,**

Центр 14,6 21,2 72,3

1/2 радиуса 54,0 107,4 346,4

Край 108,6 262,2 544,4

Примечание. 'Приведены средние арифметические значения со стандартной ошибкой, •♦Проанализировано: 1309 пыльников и 2044 эмбриоида.

Это следует учитывать при отборе пыльников для культивирования in vitro. Было обнаружено также, что не все эмбриоиды, закладываемые внутри пыльников, «выходят» за его пределы (рис. 12). Количество эмбриоидов, «выходящих» из пыльников на среде иМСм и/или на среде МСм + 0,1 мг/л кинетина (рМСм) в 1,6-5,4 раза меньше количества потенциальных эмбриоидов, закладываемых внутри пыльников на среде иМСм.

Смена плоидности при формировании андрогенных расте-ний-регенерантов моркови in vitro. Известно, что наряду с обработкой гаплоидных растений колхицином для получения удвоенных гаплоидов используются и нетрадиционные методы. К ним относится: спонтанное удвоение числа хромосом т vitro и т vivo, повторное введение эксплантов в культуру in vitro, длительное выращивание растений in vivo. У ряда культур родов Brassica, Citrus на гипокотилях и семядолях образовываются вторичные эмбриоиды. Растения, формирующиеся из вторичных эмбриоидов, могут быть гаплоидными - озимый рапс (Shiong, Chiang, 1982), или диплоидными - лайм (Chaturvedi, Sharma, 1985).

При культивировании изолированных от пыльников эмбриоидов моркови на среде МСм с 0,1 мг/л кинетина, как правило, наблюдался процесс образования вторичных эмбриоидов. Проростки развивались и из первичных, и из вторичных эмбриоидов. Характерной особенностью проростков-регенерантов моркови являлось образование на них эмбриоидов.

Эмбриоиды у проростков чаще формировались из эпидермгшьных клеток гипокотиля, черешков и нижней стороны листовых пластинок. Таким образом, из одного исходного эмбрион да можно получить множество проростков на всех этапах культивирования,

С целью выяснения динамики плоид-ности в процессе развития эмбриоидов до растеиий-регенерантов были проведены ци-тогенетические исследования. Диплоидные и гаплоидные ядра моркови отличшотся по площади, а также линейными параметрами хромо центров. В i аплоилных клетках по сравнению с диплоидными отмечено уменьшение размеров. Количества хромо-цен гров. а также площади (рис, 13).

В результате цитологического анализа препаратов метафазиых пластинок было установлено, что е процессе вторичного эмбриогенеза и регенерации растений в системе /и vitro происходит смена плоидности от п до 2п {1 ю-кавин, Шмыкова, Монахова, 1999).

Рис. 13. Гетерохроматические участки моркови (Хр - хромоцентры) в ингерфазных ядрах (указано стрелками).

Клетки меристемы юрпя растений-рег«икрантон ЯО (х 90); а гаплоидное ядро; 6 - диплоидное ядро.

шф

■ # '£

Этот процесс начинается уже на стадии эмбриоидов, однако в этот период отмечали численное преобладание клеток гаплоидного ряда. Perene-ранты из эмбриоидов пыльников на среде МСм с 0,1 мг/л кипе™на и на безгормональной среде МСм характеризуются преобладанием диплоидных популяций клеток, однако среди проанализированных метафаэных пластинок из регенератов около 10 % находятся па гаплоидном уровне (рис. !+).

Таким образом, изменение плоидности начинается на ранних этапах формирования первичных эмбриоидов. Наличие интенсивного вторичного эмбриогенеза ускоряет этот процесс. Диплоидизашю в данном случае можно рассматривать как стабилизацию генетической системы, повышение её адаптивных свойств

Депонирование. В целях практической селекции иногда необходимо высаживать растения-регенераты одного возраста в определенное время. В исследованиях по мор-

Рис. 14. А - гаплоидная метафаза (п = У) и Ь - диплоидная (2п = 18) метафазы в меристеме клеток корня рас-тенкй-регенерантов моркови Rq (х 90).

кови для разработки способа синхронизации роста и развития растений-регенерантов использовался эффект пониженных температур.

При культивировании растений-регенерантов в обычных условиях наблюдался естественный процесс роста и развития растений. За четыре недели культивирования на 1/2 агари-зованной среде МСм высота растений-регенерантов, количество листьев, и количество корней увеличивалась соответственно в 1,86,1,94 и 2,12 раз.

В то же время при культивировании растений-регенерантов при низких температурах они впадают в состояние анабиоза, то есть рост и развитие у них практически приостанавливается (табл. 10). При переносе растений-регенерантов моркови в обычные условия культивирования происходит восстановление нормального уровня жизпенных процессов, и растения продолжают расти и развиваться (табл. 10).

Таким образом, депонирование растений-регенерантов моркови т vitro в условиях низких температур, позволяет задержать их рост и развитие с целью синхронизации определенной стадии развития для высадки на адаптацию т vivo и последующего использования в селекционных целях

Таблица 10

Динамика роста растений-регенерантов моркови сорта Нантская 4 на 1/2 агаризованной среде МСм при культивировании в течение 4-х недель (I = 2-4 °С), а затем в обычных условиях (1992 г.)

Продолжительность культивирования, недели Абсолютные значения Разность к исходному значению НСР05 Статистические критерии

Высота настоящих листьев, см

0 6,00 - -

0-2 холод 6,15 -0,15 1,82 F = 1,83; Р = 0,1481

2-4 холод 6,40 -0,40 1,82

4-6 норма 7,90 *-1,90 1,82

Количество настоящих листьев, шт

0 5,00 - -

0-2 холод 5,50 -0,50 1,45 F = 7,29, Р< 0,0001

2-4 холод 5,90 -0,90 1,45

4-6 норма 8,15 *-3,15 1,45

Количество корней, шт

0 5,35 - -

0-2 холод 2-4 холод 5,60 6,15 -0,25 -0,80 2,24 2,24 F = 3,85; Р = 0,0127

4-6 норма 8,75 *-3,40 2,24

Примечание * Указывает статистически значимые различия при НСРо;

Адаптация растений-регенерантов in vivo. Важным моментом в биотехнологической цепочке растений является адаптация растений-регенерантов, полученных в условиях in vitro, к условиям выращивания их in vivo. Большинство трудностей связано со слабым развитием сосудистой системы (Grout, Aston, 1977; Leshem, 1983), а также вследствие быстрого увядания после удаления из культурального сосуда (Conner, Conner, 1984). Предполагают, что увядание является следствием уменьшения эпикутикулы на поверхности листа (Grout, 1975; Grout, Aston, 1977; Sutter, Langhans, 1982) и ненормального функционирования устьиц (Brainerd, Fuchigami, 1981; Ziv et al., 1981; Blanke, Balcher, 1989; Huguette et al., 1993). В новых условиях культивирования in vivo у растений-регенерантов формируются новые листья с нормально развитыми устьицами (Cappelades et al., 1990).

В исследованиях по адаптации растений-регенерантов моркови были испытаны различные почвенные среды: гидропоника в керамзитовой культуре, почвенные смеси и ионит-ные субстраты (Солдатов, Перышкина, 1985). Было установлено, что на приживаемость растений-регенерантов существенное влияние оказывают состояние корневой системы и высокая влажность в течение 3-4 недель до формирования новых (2-3 шт) листьев. При испытании почвенных сред наилучшие результаты были получены на ионитных субстратах. Приживаемость растений-регенерантов на них составляла 80-98 %. Рост и развитие растений были значительно лучше по сравнению со стандартными почвенными смесями, применяемыми для выращивания рассады.

Также было установлено, что растения-регенеранты, прошедшие этап депонирования, в условиях in vivo не уступали по росту и развитию растениям-регенерантам, выращенным в обычных условиях. При сравнении роста и развития растений-регенерантов in vivo, выращенных на агаризованной и жидкой средах, различий не установлено. Однако преимущество укоренения и подращивания растений-регенерантов in vitro на фильтровальных мостиках в жидкой среде состоит в том, что при пересадке укорененных растений в почвенную среду отпадает необходимость в трудоемкой операции отмывания корней от агара и растения можно высаживать прямо с фильтровальными мостиками, что сводит к минимуму повреждение корневой системы и способствует формированию корнеплодов более правильной формы

Культура неопыленных семяпочек

Культура неопыленных семяпочек является альтернативным методом получения гаплоидов и/или удвоенных гаплоидов, по сравнению с культурой пыльников (Атанасов, 1993). Для моркови разработка этого метода важна не только для получения фертильных линий, но и, что очень значимо, для получения линий с мужской стерильностью.

Развитии генеративных органов моркови 1!ч у1у0. Изучение размеров генеративных органов в зависимости от диаметра соцветия показало, что с увеличением диаметра зонтика увеличиваются и размеры генеративных органов (бутон, завязь, семяпочка, пыльник) крайних цветков в крайних зонтичках (табл. 11),

Таблица 11

Длина генеративных органов крайних цветков в крайних зонгачках а зависимости от ;1иаме1ра зонтика моркови сорта Нантская 4 (1993 г.)

Генеративные органы Диаметр зонтика, см Длина, мм Статистические критерии

3 1,05 ±0,028

Бутон 5 1,28 ± 0,031 F = 44,05; Р < 0,0001

8 1,54 ±0,043

3 0,77 ±0,020

Завязь 5 0,96 г 0,023 Г = 58,20; Р< 0,0001

S 1,!5 ± 0,031

3 0,26 ±0,013

Семяпочка 5 0,36 ±0,012 F = 11,73; Р = 0,0002

8 0,40 ± 0,032

Пыльник 3 5 8 0,40 + 0,010 0,43 ± 0,006 0,48 + 0,012 F = 16,42; Р < 0,0001

Рис. 13, Бутоны растений моркови стерильной формы № 64 петалоиднопэ типа ЦМС из зон-тисков 1-2 ряда зонтика. Слева-направо бутоны 1-2 рядов, 3-4 рядов, центр {1995 г.).

Размеры генеративных органов растений моркови также зависят и от месторасположения их в зонтике и и зонтачке. Было установлено, что размеры генеративных органов (бутонов, завязей, семяпочек и пыльников) уменьшаются от кран к центру соцветия. Наиболее четко это прослеживается в пределах зонтичка (рис. 13). Корреляционный анализ взаимосвязи размеров различных генеративных органов моркови выявил высокую корреляционную зависимость между ними.

Взаимосвязь между стадиями развития женского гаметофи-та и стадиями развития мужского гаметофита, а также размерами соцветий и генеративных органов моркови. Установленная нами корреляционная зависимость между стадиями развития микроспорогенеза и размерами гене-

ративных органов (табл. 3), а также между размерами мужского и женского гаметофитов естественным образом наводила на мысль о существовании аналогичных связей у моркови между развитием мужского и женского гаметофитов, а также между стадиями развития и размерами женского гаметофита.

Таблица 12

Зависимость между стадиями развития женского гаметофита и морфологическими показателями соцветия и цветка растений моркови сорта Нантская 4 (1997 г.)

Показатели Г± Sr Уравнение регрессии

Диаметр зонтичка 0,79 ± 0,10 Y = 0,30 + 0,77X

Длина пыльника 0,94 ± 0,05 Y = -4,14 + 24,48X

Ширина пыльника 0,95 + 0,05 Y = - 3,46 + 23,84X

Высота нектароносного диска 0,89 ±0,07 Y = - 0,82 + 25.30X

Ширина нектароносного диска 0,92 ± 0,06 Y = -1,95 + 11,33X

Длина завязи 0,89 ± 0,07 Y = 0,82+12,2IX

Ширина завязи 0,89 ± 0,07 Y = - 3,17 + 13,89X

Длина семяпочки 0,88 ± 0,08 Y = 1,79 + 15,35X

Ширина семяпочки 0,79 ±0,10 Y = 1,39 + 29,00X

Методом регрессионного анализа была установлена сильная (г = 0,89) корреляционная зависимость между микро- и макроспоро-генезом в соцветии моркови, а также между линейными размерами генеративных органов и стадиями мак-роспорогенеза (табл. 12). Наиболее приемлемым и простым маркерным признаком, на наш взгляд, являются размеры завязей.

Таким образом, о стадии развития зародышевого мешка моркови можно судить по стадии развития мужского гаметофита и размерам завязи. Последнее особенно важно для стерильных форм петалоидного типа ЦМС.

Эмбриогенез в культуре неопыленных завязей и семяпочек моркови in vitro. Наши исследования 1988-1993 гг. показали, что завязи моркови являются гормонозависимыми репродуктивными органами Необходимым условием для индукции каллуса и/или эмбриогенеза является наличие в среде ауксина 2,4-Д. Индукция эмбриогенеза происходит либо при постоянном культивировании завязей на среде с низким содержанием 2,4-Д - 0,2 мг/л (рис. 14А), либо при последующем переносе их на среду с низким содержанием кинетина - 0,1 мг/л (рис. 14Б) Однако неясным оставался вопрос о происхождении эмбриогенных структур.

В последующем культивирование завязей и семяпочек растений моркови петалоидного типа ЦМС проводили по следующей схеме: 1 - культивирование изолированных завязей на агаризованной среде МСм с 0,2 мг/л 2,4-Д по две недели в темноте (t = 25 °С) и на свету; -» 2 - выделение семяпочек и последующее культивирование их на среде того же состава в течение четырех недель на свету; -> 3 - перенос семяпочек на агаризованную среду МСм с 0,1 мг/л кинетина.

Рис. 14. Образование эмбрнокдов у изолированных завязей: А — при постоянном культивировании на агариж ванной среде МСм с низкой концентрацией ауксина - 0,2 мг/л 2,4-Д; Б - при переносе на среду с низким содержанием цитокинина 0,1 мг/л к и истина

При культивировании семяпочек на среде с кинетином наблюдалось увеличение размеров семяпочек и их побурелие. Образование зародышей я их выход из семяпочек наблюдался у микропилярного конца (рис. 15). При последующем переносе эмбриоидрв на среду МСм с 0,1 мг/л кинетина, а затем проростком па среду МСм без гормонов формировались гйно-генные растения (рис, 16).

Рис, !5. Образование эмбриопдов у изолированных семяпочек Рис. 16, Гиногенное растение, моркови линии № 64 лета.1 он д ног о типа ЦМС (эмбрион ды указа- полученное в культуре неопы-ны стрелками). ленных семяпочек.

Цитология эмбриогенеза в культуре неопыленных семяпочек моркови. В исследованиях было установлено, что первые деления гаплоидных клеток зародышевого мешка происходят при культивировании неопылен пых завязей на индук-

тивной среде (МСм + 0,2 мг/л 2,4-Д) через трое суток. Клетки тканей, окружающие зародышевый мешок, такие как интегументы, нуцеллус, под воздействием 2,4-Д подвергаются сильному растяжению. В них происходит увеличение вакуолей, ядро принимает пристеночное положение. При этом семяпочка сильно увеличивается в размере. Наиболее активные деления клеток наблюдаются в районе яйцевого аппарата, где, как мы предполагаем, начальные деления происходили в яйцеклетке, а синергиды в процессе развития подвергались деградации. Скопления темноокрашенных клеток были обнаружены в районе антипод и в центре зародышевого мешка. При сравнении ИУК и 2,4-Д установлено, что индуктором формирования гиногенных структур в зародышевых мешках моркови является ауксин 2,4-Д в относительно низких концентрациях - 0,2 мг/л.

Смена плоидностн при формировании гиногенных расте-ний-регенерантов моркови in vitro. Установлено, что первичные эмбриоиды в основном представлены гаплоидными клетками. Процесс образования растений-регенерантов, как и в случае андрогенеза, сопровождается закономерной сменой плоидности от п до 2п. В меристематических тканях растений-регенерантов количество диплоидных ме-тафаз приближался к 90%. Наибольший разброс плоидности был отмечен на этапе вторичного эмбриогенеза. Процесс сопровождается появлением цитологических мутаций, большинство которых выражается как нарушение механизмов сегрегации хромосом: многополюсные митозы, расслоение веретена деления, изменение пространственной упорядоченности хромосом, нарушение в системе межхромосомных ассоциаций, выпадение цитокинеза и др. (Monahova, Tjukavin, Shmykova, 1998).

Анализ андрогенных и гиногенных растений моркови

Известно, что растения моркови не переносят пересадки, так как даже слабое повреждение осевого корня приводит к образованию уродливых корнеплодов (Эдельштейн, 1962; Сечкарев, 1971) При пересадках растений-регенерантов в культуре in vitro и на адаптацию in vivo неизбежны повреждения осевого корня и, как следствие, образование уродливых корнеплодов моркови поколения RA0 (разветвленные корнеплоды, несколько розеток листьев). Поэтому отбор по морфологическим признакам корнеплодов следует проводить в RA| и последующих семенных поколениях. Однако в зависимости от места и условий выращивания оценка одних и тех же образцов по морфологическим признакам не всегда бывает однозначной. В связи с этим для оценки гомозиготности андрогенных и гиногенных растений моркови мы использовали молекулярные методы анализа, которые находят широкое применение

Таблица 13

Характеристика образцов моркови вегетативного периода онтогенеза Rai (1993 г.)

Про- Компоненты химического состава Характеристика корнеплодов Однородность

исхо-

Сорт, семья жде-ние сухое вещество, % сумма моно- каротин, мг/100 г масса, г длина, см диа- индекс по изофермен-там

регенерантов* Сахаров, % сахара, % метр, см -форма по корнеплодам

Нантская 4 - 11,91 6,89 4,33 5,79 35,69 8,77 2,79 3,2-Ц гетерогенный не выровненный

По данным Са-

зоновой и Вла- - 12,01 5,89 2,66 7,44 - - - - - -

совой, 1990

46 Э - - - - 73,84 11,54 3,37 3,4-Ц константный не выровненный

52 Э 13,15 7,60 5,36 11,67 47,93 11,40 3,13 3,6-Ц константный выровненный

80 э 13,13 8,50 4,59 12,74 48,48 10,52 3,02 3,5 -Ц константный выровненный

49 к 14,46 8,90 5,33 5,41 17,18 6,15 2,42 2,6-К относительно константный не выровненный

11 Э и К 13,96 8,44 4,54 5,05 28,71 7,78 2,38 3,1 -Ц гетерогенный выровненный

26 ЭиК - - - - 43,58 9,96 2,83 3,5 -Ц гетерогенный не выровненный

81** Э и К 13,38 8,28 4,36 7,74 27,58 7,18 2,60 2,8-К гетерогенный не выровненный

F = F = F = F = F = F = F = F =

Статистические 2,10 2,62 26,51 18,34 4,01 5,06 3,43 3,56

критерии Р = Р = Р = Р< Р = Р< Р = Р =

0,2891 0,2302 0,0108 0,0001 0,0006 0,0001 0,0022 0,0016

Примечание. * Происхождение регенерантов: Э - эмбриоиды, К - каллус. Форма: К - коническая, Ц - Цилиндрическая (Сазонова и др., 1990), ** Семья получена от растения, образовавшего семена без прохождения стадии яровизации.

ча рубежом для оценки линий и гибридов моркови (Schuh et al., 1994; Stein, Nothnagel, 1995; Szklarczyk, 1996; Grrebelus et al„ 1997; Simon, 1997; Nakajima et al, 1998).

Анализ андро генных растений RA¡, полученных путем прямого эмбриогенеза, по морфологическим и биохимическим признака»), а также изоферментньш анализ позволил выявить выровненные семьи (табл. 13).

Последующий анализ растений семей № 52 и № 80 поколения полученных путем прямого эмбриогенеза, с использованием RAPD технологии показал их высокою генетическую однородность (Дорохов, Тюкав ив, Лаптева и др., 1996; Лаптева, 1999).

RAPO анализ гиногенных растений, полученных путем прямого эмбриогенеза из не-опыленных семяпочек линии № ! 66 петалоидного типа ЦМС, также обнаружил полное единообразие RAPD спектров всех протестированных генотипов (Лаптева, 1999).

При скрещивании растений двух андрогенных семей № 46 и № 77. полученных путем прямого эмбриогенеза, был получен Сорт Соната (рис. 17).

Сравнивая сорт Соната с исходным сортом (стандартом) Нантская 4 следует отметить следующие различия. Внешняя я внутренняя окраска корнеплода оранжеиая, более интенсивная; чем у сорта Нантская 4. Хотя за три года испытаний в целом но общему урожаю корнеплодов существенных различий между Сонатой и стандартом выявлено не было (табл. 14). однако при более поздних сроках уборки Соната значительно превосходит контроль по данному показателю. Так в 2000 г при уборке корнеплодов на 120-е сутки вегетации общий урожай корнеплодов у сорта Соната был - 92,3 т/га и у сорта Нантская 4 69,6 т/га. Разность составила 22,7 т/га при HCPfó = 14,4 т/га.

Соната

Рис ¡7. Схема получения сорта моркови столовой Соната

По результатам трехлетних испытаний (табл. 14) было установлено значительное преимущество сорта Соната по сравнению с сортом Нантская 4 по устойчивости к бактериозу. Сорт Соната превосходит сорт Нантская 4 по вкусовым и качественным показателям.

Таблица 14

Хозяйственные и биологические показатели нового сорта моркови столовой Соната в сравнении со стандартом - Нантская 4 (1998-2000 гг.)

Показатель Сорт Разность

Соната Нантская 4

Ранний урожай корнеплодов, т/га 36,90 37,30 -0,40

Общий урожай корнеплодов, т/га 78,70 72,23 6,47

Урожай товарных, хозяйственно годных корнепло-

дов, т/га 56,87 48,23 8,64

Масса товарного корнеплода, г 89,63 71,27 18,36

Урожай семян с одного растения, г 30,05 27,00 3,05

Развитие бактериоза на искусственном инфекцион-

ном фоне, % 54,30 68,60 "-14,30

Развитие бактериоза на естественном инфекцион-

ном фоне, % 47,77 63,80 М6,03

Вкусовая оценка, балл 4,85 3,85 *1,00

Содержание сухих веществ в корнеплодах, % 12,59 10,74 *1,85

Сумма Сахаров, % 8,62 6,64 ос OS, *

Каротин, % 18,48 12,15 »6,33

Содержание нитратов, мг/кг 143,37 178,18 34,81

Примечание * Указывает статистически значимые различия при ПСРо;

В основе репродуктивного процесса лежит мейоз. Поскольку ориентация бивалентов в метафазе 1 случайна, то хромосомы одного родителя случайно распределяются между новыми ядрами. Кроме того, благодаря кроссинговеру каждая хромосома часто состоит из фрагментов хромосом обоих родителей. Наличие же, по крайней мере, одной хиазмы в каждом биваленте делает практически невозможным получение в результате мейоза клетки, генетически тождественной любой из тех, слияние которых привело когда-то к формированию родительского организма Поскольку оршптацнл бнрадвнтор в метафазе 1 случайна, то хромо-вомм одного родителя случайно распределяются между новыми ядрами. Кроме того, благо даря кроссинговеру каждая «ромосош часто состоит из фрагментов хромосом обоих роднте-яен. Однако естественный отбор начинает оказывать элиминирующее действие сразу же, как на постмеотических этапах, так и на последующих стадиях развития растений, тем самым лишая возможности селекционера воспользоваться всем многообразием генетической изменчивости. Реализация этих возможностей с помощью методов культивирования пыльников и неопыленных семяпочек in vitro позволяет не только сохранить и отобрать ценные для селекционного процесса генотипы, но и получить за счет удвоения гаплоидов гомозиготные линии, в том числе и с рецессивными генами

В 1999-2000 гг. было проведено сравнительное изучение андрогенных и гиногенных линий моркови, полученных у фертильных растений моркови сорта Нантская 4. Исследования показали, что особых различий внутри групп андрогенных и гиногенных растений поколения Ro вегетативного периода онтогенеза не наблюдалось. Все растения по цвету корнеплодов и листьев были выровнены. Однако группы андрогенных и гиногенных растений отличались по некоторым морфологическим признакам. Гиногенные растения Rro имели полуразвалистую розетку листьев, в отличие от андрогенных растений RA0, которые имели прямостоячую розетку листьев. Последнее было обусловлено тем, что у гиногенных растений под эпидермисом отсутствовал слой пластинчатой колленхимы, что и обусловливало полуразвалистую розетку листьев Также наблюдались различия в форме сегментиков листа у регенерантов. У гиногенных растений сегментики листа были более широкими, ланцетной формы, у андрогенных - более узкими, линейно-ланцетной формы. Опушение листьев было достаточно сильным у растений, полученных через культуру пыльников, а у растений, полученных через культуру семяпочек, опушение на листьях отсутствовало.

Семенные растения поколения Ro, репродуктивного периода онтогенеза также имели некоторые морфологические различия между собой. Андрогенные семенные растения Rao имели толстые стебли и густое жесткое опушение на них. Растения гиногенного происхождения Rro не имели опушения, либо оно было очень редким

Андрогенные и гиногенные растения поколения Ri вегетативного периода онтогенеза были протестированы на выровненность с помощью RAPD технологии. RAPD анализ ДНК растений андрогенных и гиногенных линий, а также их исходного сорта Нантская 4 показал, что при наличии в их RAPD спектрах общих фрагментов для каждой линии был характерен свой специфический набор фрагментов. Такая гаметоклональная изменчивость подтверждалась также и результатами кластерного анализа. Из рис 18 видно, что каждая из дигаплоидных линий выделяется в обособленный кластер. При этом максимальное генетическое расстояние между андрогенными линиями и исходным сортом Нантская-4 составило 0,32, тогда как между гиногенными линиями и сортом Нантская 4 - 0,39. Это свидетельствует о том, что андрогенные линии генетически ближе к сорту Нантская 4, чем линии, полученные через культуру неопыленных семяпочек. Таким образом, молекулярно-генетический анализ растений Ri пяти линий моркови, полученных путем прямого эмбриогенеза при культивировании in vitro пыльников и семяпочек, выявил значительное снижение гетерогенности по сравнению с сортом Нантская-4 (рис. 18).

0.» I 0.2

15

J OIS

s

л

G.: DOS 0

£

ÏÏm il

Ш^ш^ВДщ^рЩд^^Щр* .....

ом оз

03 OIS

oje 0

SCL(LO-C- CL т-Q. CL lü. CL С1Л fLÛ.

'ne 18, Дендрограмма, генетического сходства растений моркови сортовой популяции Нантская-4 (N) и полученных на ее основе андрогенных линий (Р! I и PI2)и гнногенных линий (S204. S231, S23), построенная методом UPGMA анализа полиморфизма их RAPD фрагментов.

Генетическая трансформация моркови сорта Нантская 4

Трансформация моркови генортерным геном GUS. Лучшим вариантом для совместного культивирования агробактерий и каллуса моркови является использование фильтровальной бумаги для «подсушивания» и последующего культивирования. Для успешной трансформации необходимо совместное культивирование каллусов с агробак-териями в течение 2-3 суток. Более продолжительный период приводит к г ибели каллусных культур,

ШД.чя бинарной системы GUS + npt II первичную селекцию каллусных культур необходимо проводить при наличии в среде 200 мг/л кавамяшша, а регенерацию и укоренение растений-регенерантов при 100 мг/л

В результате при использовании ре-портерного гена GUS была показана его экс-преееия в первичных глобулярных структурах при культивировании каллуса (рис. 19), в соматических зародышах, в листьях и корнеплодах растений Ri o моркови вег етативного периода онтогенеза.

Рис. 19. Экспрессия гена GUS в первичных глобулярных структурах каллуса моркови.

Методика генетической трансформации моркови геном GUS, опосредованной Agrobac-terium tumefaciens, была использована для трансформации моркови генами Rs-ap и Тауматин II.

методика отбора трансгенных растений моркови с селективным геном NPT II. В исследованиях по генной инженерии моркови важно оценить не только экспрессию целевого гена в растениях-регенерантах Rto и отобрать трансгенные растений Rto, но и изучить характер его наследования в последующих поколениях Rti, ,„, а также отобрать линии или сформировать популяции генетически модифицированных аналогов исходного сорта, обладающих хозяйственно-полезными признаками. Достичь этого можно путем анализа и отбора по семенным поколениям. У технических (Поляков, 1998) и зерновых (Данилова, 2001) культур для этой цели используют проращивание семян в растворе канамицина с последующей высадкой их в почву. Однако для моркови этот подход мог оказаться, неприемлемым по следующим причинам: 1 - семена моркови имеют пониженную всхожесть и 2 - при высадке в почву проросших семян их всхожесть резко снижается. В связи с этим для отработки надежной методики отбора трансгенных растений Rti, ,„ моркови проращивание семян проводилось in vitro в пробирках на фильтровальных мостиках в жидкой безгормональной среде с канамицином.

В результате исследований для отбора трансгенных растений Rti, , п моркови с селективным геном npt II была предложена следующая методика. Семена стерилизуют коммерческим препаратом «Белизна» в течение 20-30 мин; -> помещают на фильтровальные мостики в пробирки 21x200 с жидкой безгормональной средой МСм (Masuda et al, 1981), содержащей канамицин в концентрации 100 мг/л; проращивание семян и выращивание растений проводят на свету; -> отбор растений проводят через четыре недели; -» растения, имеющие 2-3 настоящих листа и хорошо развитую корневую систему, высаживают в вазоны с почвой для адаптации т vívo;-> в течение 2-3 недель растения выдерживают при повышенной влажности воздуха (для этого растения закрываются перфорированными пластиковыми пакетами или стаканчиками), -> после адаптации растений проводят молекулярно-биологический анализ включения и экспрессии генов.

Трансформация моркови геном растительного дефензина RS-AP. Дефензины являются короткими цистеиясодержащими белками, проявляющими фунгицидные и бактерицидные свойства. Во ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН из Raphanus sativus был выделен ген Rs-ap, включающий область интрона, кодирующий пептидный антибиотик. Трансформация растения этим геном обеспечивает придание ему устойчивости к фитопатогенам - грибам и бактериям. Биотесты на устойчивость к грибным фитопатогенам трансгенных растений, экспрессирующих ген Rs-ap выявили устой-

36

чивые трансгенные линии томата к фитофторозу и мучнистой росе (Народицкий и др., 2000). Также были получены трансгенные растения капусты, отличающиеся устойчивостью к киле крестоцветных (Попадьин, 2002).

В наших исследованиях при трансформации гена растительного дефензина из семян редьки Яз-ар было получено более 200 растений Кто вегетативного периода онтогенеза Во всех 24-х растениях, проверенных методом ПЦР-анализа, подтверждена встройка гена. Методом иммуноблотинга показана экспрессия гена в 14-ти трансгенных растениях, (Шушкова, Тюкавин, Долгов, 1998; Долгов, Шушкова, Тюкавин, 2000).

От самоопыления четырех ПЦР-положительных растений Ято моркови репродуктивного периода онтогенеза были получены семена. Семена высевались на фильтровальные мостики в пробирках с жидкой безгормоналыюй средой МСм, содержащей 100 мг/л канамици-на. Часть проростков Ять полученных из семян трансгенных растений моркови, имели нормальное развитие. Среди проростков Яц моркови сорта Нантская 4 с геном растительного дефензина из семян редьки Яэ выделялись проростки, имеющие отклонения по ряду морфо-генетических признаков. Эти изменения можно разделить на два типа: 1 - возникающие в процессе формирования зародыша семени и 2 - проявляющиеся в процессе прорастания семени.

У моркови зрелое семя содержит биполярный зародыш, представленный осью, на которой в узле прикреплены две семядоли. Ось заканчивается на полюсах апикальными меристемами. Мы же наблюдали появление проростков со сросшейся двойной стелью и тройной стелью, соответственно с четырьмя и шестью апикальными меристемами. Также можно было видеть одновременное развитие двух проростков, один из которых нормального размера, второй являлся как бы уменьшенной копией первого. Иногда судьба образующихся двойных зародышей была разной, из одного развивался нормальный проросток, а из второго каллус с соматическими эмбриоидами. Кроме этого развитие соматических эмбриоидов можно было наблюдать из эпидермальных и субэпидермальных тканей проростков, эти проростки могли иметь как нормальный тип развития, так и отклонения от него. В некоторых случаях прорастание семян не наблюдалось, а из его тканей в микропилярной части происходил выход соматических эмбриоидов. Все вышеописанные изменения были характерны для семян трансгенных растений моркови с геном растительного дефепзина из семян редьки Кз и не происходили у трансгенных растений с геном суперсладкого белка Тауматин-И. Это указывает на то, что в зависимости от встройки гена дефензина наряду с предполагаемой устойчивостью, может происходить достаточно сильное изменение гормонального баланса у растения на уровне формирования семян и развития проростков.

В связи с обнаружившимся несовершенством векторной конструкции (нуклеотидные замены в смысловой части гена, приводящие к сбою рамки считывания) дальнейшие исследования нами были прекращены.

Трансформация моркови геном Тауматин II В настоящее время наблюдается тенденция к замене натурального сахара веществами менее калорийными и в то же время более сладкими на вкус. Сладким вкусом обладают вещества различной природы, в том числе и белок тауматин, синтезируемый в плодах африканского растения Thaumatococcus danielli Benth. Было обнаружено, по крайней мере, пять молекулярных форм тауматина, среди которых наиболее значимым является Тауматин II. Для генноинженерных исследований была выделена и секвенирована кДНК гена Тауматин II (Edens et al., 1982). Тауматин-подобные (TL) белки показали активность против ряда грибов (Roberts, Sehtren-nikoff, 1990). Сверхэкспрессия TL-белка, продукта гена Zip кукурузы, в двух трансгенных растениях показала фунгицидную активность (Malehom et al., 1994). При трансформации огурца геном Тауматин II наряду с улучшением вкуса плодов было установлено, что трансгенные растения Rto и Rxi, с экспрессией белка тауматина, проявляли повышенную устойчивость к грибному патогену Pseudoperonospora cubensis. (Szwacka et al., 2002). В последующем при трансформации земляники геном Тауматин II было показано, что трансгенные растения, содержащие белок тауматин, были более устойчивыми к грибному патогену - серой гнили земляники Botrytis cinerea (Schestibratov, Dolgov, 2005). Также было установлено, что листья трансгенных растений картофеля, несущих ген Тауматин II, имеют более высокий уровень устойчивости к фитофторозу (Кузнецова и др., 2006).

Растения Rto- При первичной трансформации геном Тауматин II было получено 120 растений Rio моркови вегетативного периода онтогенеза. Из 6 протестированных растений в 4 была обнаружена экспрессия гена npt //(Шушкова, Тюкавин, Долгов, 1998). В результате последующих исследований было выявлено 15 растений Rto, показавших высокую степень устойчивости к канамицину в условиях in vitro и образовавших семена в результате самоопыления. У этих растений был проведен анализ на присутствие гена npt II. Во всех проанализированных растениях Rto наблюдалась амплификация фрагмента гена npt II ожидаемого размера. В восьми растениях методом ПЦР выявлено присутствие ожидаемого фрагмента гена Тауматин II (рис. 20).

Методом вестерн блоттинга проведен анализ на присутствие белка тауматина в листьях пяти растений Rto. Высокий уровень содержания белка тауматина (0,7-1,5 мкг/мг общего белка) был обнаружен только в трех исходных растениях Rio - № 34, № 51 и № 61 Несмотря на наличие в геноме растения Rto № 102 перенесенной последовательности гена Тауматин П

синтез белка в листьях этого растения не был обнаружен. 13 растениях Кто № 123 белок тауматнн не обнаружен, что согласуется с данным и ПЦР анализа.

М 1 2 3 4 5 6 7 Я 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 М

Рис. 20. ПЦР анализ гране генных растений моркови полученных в результате трансформации СВЕ21 :рВ1 ШТЬаиЗ5. ДНК амплифнцпронана с использованием праймероа, специфичных для гена пр111 (верхний фореэ) и Тауматнн II (нижний форез). Размер амплифицируемых фрагментов: для гена пр! II - 742 п.н., для гена Таупатин [1 - 378 п.н. М - маркер р11С19/Тач I (1444, 736, 476); 1,2 - не трансгенные растения, 3 - плазмида рВ112П'Ьаи35; 4-18 - фа не генные растения: № 8, № 10, № 34, X« 45. № 51. 57, № 61, № 72, № 75, № 78, № 102, № 105, № 112, № 120, № 123 (Анализ проведен на станции искусственного климата «Биотрон» Ф1ШХ РАН).

М 1

5 б М

и

Рис. 21, ПЦР анализ трансгенных растений Rjl моркови семей 78 и 120 трансформированных CBE21:pB1121Thau35. ДНК нуллифицирована с использованием нраимеров, специфичных л г- ен." Тауматин 11 , Размер амп 111 i: ] м n \ емых фрагментов S78 п.н.

Верхний форез - растения RT1 семьи 78. М - маркер pUC'19/Taq Í (1444, 736, 476); 1-4 - растения К,,: № 28-12, .V» 25-й, № 2S-3 и № 28-2; 5 - не трансгенное растение; 6- плазмида рВ112 !Than35. Нижний форез - растения Rп семьи 120 М - маркер pUC 19/Taq I (1444, 736, 476); 1-4 - растения RTI: № 44-4, № 44-3, № 44-2 к Ki 44-1; -5 - не трапегенпое растение; 6- плазмида pBll zlThau35 (Анализ проведен на станции искусственного климата «Биотрон» ФИБХ РАН).

тений. В семье № 51 присутствие гена Тауматнн II

Растения Ки При посеве семян на среду с канамицииом в [999-2002 гг. было отобрано 332 растения, что составило 58,2 ± 2,1 % От проросших семян Анализ отобранных трапегенных растеши Ят! показал, что по количеству листьев, высоте розетки листьев и средней высоте листьев значимых различий но сравнению с положительным контролем не было.

Анализ растений Яп моркови, отобранных при селекции на канамиаине, показал растепление в наследовании гена Тауматин II (рис, 21). Анализ растений моркови шести семей методом ПЦР показал наличие ожидаемого фрагмента гена Тауматин И в подавляющем большинстве проанализированных рас-обнаружено у 21 (77,8 %) растений из 27

проанализированных, в семье № 61 - у 28 (87,5 %) из 32 проанализированных, в семье № 78 - у 37 (92,5 %) из 40 проанализированных, в семье № 120 - у 3 (75,0 %) из 4 проанализированных. В то же время в семье № 8 все проанализированные растения Яц содержали в геноме последовательности как гена пр1 И, так и гена Тауматин II, а в семье № 10 ни одно из 5-ти проанализированных растений 11т | не показало наличие ожидаемого фрагмента гена Тауматин II, хотя ген амплифицировался в родительском растении.

Методом Вестерн блотганга проведен анализ на присутствие белка тауматина в листьях большинства растений Яти содержащих последовательности гена Тауматин II Полученные в результате анализа данные показали, что несмотря на наличие в геноме растений Ял перенесенной последовательности гена Тауматин II, синтез белка в листьях наблюдается не во всех растениях. Также прослеживается зависимость экспрессии гена Тауматин II от исследуемой семьи. Так, например, несмотря на наличие в геноме всех растений Ят1 семьи № 8 последовательности гена Тауматин II, белок тауматин не был обнаружен ни в одном экстракте. При анализе листовых экстрактов растений 11т 1 семей № 51 и № 61 экспрессия гена Тауматин П была обнаружена только в единичных трансгенных растениях, при этом концентрация белка была низкой (0,5-1,0 мкг/1 мг общего белка).

Высокий уровень содержания белка тауматина обнаружен в растениях Ят1 семьи № 78. Из 40 проанализированных растений Кп белок тауматин был обнаружен в листовых экстрактах 18 (45,0 %) растений. Количественный анализ показал, что концентрация белка в листьях некоторых трансгенных растений достигала 10 мкг на 1 мг общего белка

Растения Итг. В 2002-2003 гт. было отобрано 287 растений, что составило 68,7 + 2,3 % от проросших семян. Этот показатель превысил эффективность отбора трансгенных растений Ят1 на 10,5 %. Молекулярно-биологический анализ включения и экспрессии генов пр1 II и Тауматин П в растения поколения Ятг моркови, отобранных при селекции на канамицине показал в ряде семей присутствие как гена селективного маркера пр! II, так и гена Тауматин II. Однако у семьи № 78(28-2) не у всех растений Иг2 был обнаружен продукт, характерный для амплификации с праймерами для гена Тауматин И, хотя последовательность гена пр1 II присутствовала в геноме всех изученных растений этой семьи.

Определение уровня экспрессии белка тауматина в трансгенных растениях Ят2 моркови методом Вестерн блоттинга выявило присутствие белка у ряда растений всех проанализированных семей.

В исследованиях 1999-2003 гг. методом Вестерн блотганга также проводился количественный анализ уровня содержания белка тауматина в листьях и корнеплодах трансгенных растений 11т 1 и Ятг вегетативного периода онтогенеза моркови. Было установлено, что общее количество тауматина в корнеплодах значительно выше по сравнению с листьями тех же

растений. Так, например, у растений RTi № 60-17 и № 60-30 семьи № 78 концентрация бежа тауматина в корнеплодах составила 10 мкг/мг общего белка, в то время как концентрация белка в листьях составила лишь 0,5-1,0 мкг/мг общего белка.

Фунгицидная активность гена Тауматин II. При отборе трансгенных растений RT2 в 2002-2003 гг. было замечено, что проростки поколения Rtz от исходного растения № 120 (рис. 20) проявляли устойчивость и нормально развивались в условиях in vitro на инфекционном фоне с грибной микрофлорой (Cladosporium и Alternaria). Этот факт дал основание предположить, что существует зависимость между содержанием белка тауматина и устойчивостью к грибным заболеваниям у моркови.

В 2005 году была проведена оценка 8 трансгенных семей Rt2-t4, содержащих ген Тауматин II, на искусственном инфекционном фоне с Fusarium avenaceum (табл. 15).

Таблица 15

Инфицированность листьев моркови Fusarium avenaceum в сравнении с исходным образцом Нантская 4, % (2005 г.)

№ сортообразца Инфицированность, % от проанализированных растений Разность с контролем % Статистические критерии

Нантская 4 (ФИБХ) 93,18 - -

1 73,56 »19,62 Х2 =5,89; Р = 0,015

4 0,00 »93,18 Х2 = 55,79; Р< 0,001

5 70,83 »22,35 %2 = 6,20, Р = 0,013

6 70,59 »22,59 %2 = 7,03; Р = 0,008

7 15,13 »78,06 Х2 = 81,40; Р <0,001

22 10,00 »83,18 Х2 = 27,98; Р < 0,001

95 72,34 »20,84 %2 = 5,45; Р = 0,020

125 33,33 »59,85 %2 = 25,97; Р < 0,001

Примечание * Указывает статистически значимые различия при HCPoj.

Из табл. 15 видно, что все трансгенные семьи существенно превышали по устойчивости исходный образец сорта Нантская 4, который поддерживался путем семенного размножения в ФИБХ. Наиболее устойчивыми оказались семьи № 4, № 7, № 22 и № 125. Следует полагать, что именно эти семьи необходимо использовать для дальнейшего размножения с целью получения трансгенных аналогов сорта Нантская 4, устойчивых к фузариозам. Наиболее перспективной является семья № 4, оказавшейся иммунной к Fusarium avenaceum в данном эксперименте (табл. 15).

Таким образом, устойчивость трансгенных растений моркови, экспрессирующих ген Тауматин II, к грибным патогенам согласуется с уже имеющимися сведениями по огурцу (Szwacka et al., 2002), землянике (Schestibratov, Dolgov, 2005) и картофелю (Кузнецова и др., 2006).

выводы

1. Впервые для селекционной технологии моркови разработаны биотехнологические методы- культура зародышей, андрогенез и гиногенез in vi tro, генетическая трансформация. Применение этих методов позволяет ускорить получение исходного материала с заданными признаками в селекционных программах по моркови.

2. При получении стерильной культуры зародышей а) из семян путем предварительной обработки 96 %-м этанолом (2 мин) и дальнейшей стерилизации 0,5 %-м водным раствором сулемы в течение 20-30 минут; 6) из завязей путем предварительной обработки 96 %-м этанолом (1 мин) и последующей стерилизации 0,1 %-м водным раствором сулемы в течение 20-30 минут инфицированность выделенных зародышей не превышает 1,7 %, а их прорастание составляет до 86 %. При получении стерильной культуры пыльников и семяпочек путем стерилизации бутонов 10%-ным водным раствором хлорамина «Б» в течение 20-30 минут инфицированность выделенных пыльников и семяпочек не превышает 2,7 %.

3. Использование в качестве первичных эксплантов зиготических зародышей моркови позволило разработать регенерационную систему, включающую: 1) индукцию каллуса на среде МСм с 0,2 мг/л 2,4-Д; 2) регенерацию проростков на среде МСм с 0,1 мг/л кииетина, 3) подращивание и укоренение растений-регенерантов на фильтровальных мостиках в жидкой безгормональной среде МСм.

4. Завязи in vivo достигают максимальных размеров через 4 недели, семяпочки - через 5 недель, зародыши - через 6-7 недель после опыления. Автономность зародышей моркови для культивирования т vitro достигается через 4 недели на семядольной стадии развития, которые к этому времени составляют ~ 1/3 своего окончательного размера in vivo.

5. Эффективность прорастания зародышей т vitro определяется их возрастом и составом основной питательной среды. Прорастание зрелых зиготических зародышей и формирование растений моркови может происходить на полной безгормональной среде МСм. Однако ряд ростовых веществ оказывает благоприятное действие на рост и развитие проростков моркови in vitro. Исходя из принципа функционирования фитогормонов, заключающегося в их взаимодействии друг с другом, для культивирования зиготических зародышей предложена среда МСм с добавлением 2 г/л ГК с ДЭ, 0,5 мг/л кинетина, 0,1 мг/л ИУК и 0,01 мг/л ГКз Рост и развитие проростков из равновозрастных зародышей зависит от генотипа материнского растения.

6. Взаимосвязь между микро- и макроспорогенезом, а также между стадиями развития мужского и женского гаметофитов и морфологическими показателями соцветия и цветков растений моркови характеризуется сильной корреляционной зависимостью. Маркерными

показателями для отбора эксплантов при андрогенезе моркови in vitro служат диаметр зонтика, высота бутона и длина пыльника, при гиногенезе - стадия развития мужского гаметофита и размер завязи.

7. Пыльники моркови являются гормонозависимыми. Для индукции андрогенных структур необходим темновой период культивирования. Индукция андрогенных структур (эмбрноидов, каллусов) происходит при культивировании бутонов и/или пыльников на среде МСм с 0,2 мг/л 2,4-Д (или с 0,2 мг/л 2,4-Д + 0,2 мг/л кинетина), регенерация растений-регенерантов - на среде МСм с 0,1 мг/л кинетина, подращивание и укоренение растений-регенерантов - на безгормональной среде МСм Выращивание донорных растений в контролируемых условиях, культивирование пыльников на фильтровальных мостиках в жидкой среде, кратковременное воздействие (48 ч.) низкими положительными температурами (4-6 °С) на изолированные бутоны, центрифугирование зонтичков моркови при 355 g в течение 4 мин. повышает эффективность андрогенеза моркови in vitro

8. При эксплантации пыльников моркови на питательные среды оптимальной стадией микроспорогенеза является вакуолизированные микроспоры. Развитие андрогенных структур происходит как при равном, так и при неравном делении микроспор. При равном делении эмбриоиды закладываются либо из одной, либо из обеих клеток микроспор. При неравном делении микроспор прослеживаются три пути образования эмбриоидов из вегетативной клетки, из генеративной клетки или одновременно из вегетативной и генеративной клеток микроспор.

9. Оптимальными условиями для индукции гиногенных структур (эмбриоидов и каллусов) при эксплантации завязей на стадии зрелого зародышевого мешка являются: а) последовательное культивирование завязей (в темноте - 14 суток) и выделенных семяпочек (на свету) на среде МСм с 0,2 мг/л 2,4-Д, б) регенерация растений-регенерантов - на среде МСм с 0,1 мг/л кинетина, в) подращивание и укоренение растений-регенерантов - на безгормональной среде МСм.

10. Регенеранты из андрогенных и гиногенных эмбриоидов характеризуются определенной нестабильностью числа хромосом, при которой, наряду с гаплоидными и диплоидными клетками в фазе метафазы с числом хромосом 9 и 18 соответственно, обнаружены ме-тафазные пластинки, содержащие от 4 до 18 хромосом. В процессе вторичного эмбриогенеза и регенерации растений in vitro происходит смена плоидности от п до 2п

11. Методами молекулярно-генетического анализа (белковых и ДНК-маркеров) показана высокая генетическая однородность андрогенных и гиногенных растений моркови, полученных путем прямого эмбриогенеза.

12. Андрогенные и галогенные растения, полученные из сорта Нантская 4, различаются между собой по анатомическим и морфологическим признакам. Эти различия обусловлены генетически, что подтверждено RAPD-анализом.

13. Культивирование растений-регенерантов моркови in vitro при низких положительных температурах (2-4 °С) замедляет их рост и развитие, что позволяет сохранять полученный материал длительное время. При дальнейшем культивировании в обычных условиях рост и развитие растений-регенерантов возобновляется.

14. Инокуляция каллуса из зиготических зародышей моркови агробактериями и их последующее совместное культивирование в течение 2-3 суток проводится на фильтровальной бумаге. Селекция каллусных культур осуществляется на среде с 200 мг/л канамицина, а регенерация и укоренение растений-регенерантов - на среде с 100 мг/л канамицина При семенном размножении отбор трансгенных растений, содержащих селективный ген npt II, проводится по проросткам при проращивании семян на безгормональной среде МСм со 100 мг/л канамицина. Наличие и экспрессия целевого гена определяется молекулярно-биологическим анализом.

15. Впервые получены трансгенные растения моркови с геном Тауматин II. Методом иммуноблотинга выявлена экспрессия гена Тауматина II в листьях и корнеплодах трансгенных растений моркови. Проростки из семян, полученных от самоопыления трансгенных растений на инфекционном фоне in vitro, обладали устойчивостью к грибам родов Cladosporium и Alternaría Растения семей поколений R.t2-t4 обладали повышенной устойчивостью к грибному патогену Fusarium avenaceum.

16. В результате практического использования разработанных биотехнологических методов были получены перспективные для дальнейшей селекции апомиктичные, андрогенные, гиногенные и трансгенные семьи моркови и сорт моркови столовой Соната.

Практические рекомендации

1. С целью получения растений из недоразвитых семян, образуемых при индуцированном апомиксисе или межвидовой гибридизации, для моркови необходимо использовать разработанный метод культуры зародышей т vitro.

2. Для ускоренного получения гомозиготных линий и повышения эффективности селекционного процесса предлагается использовать методы удвоенных гаплоидов в культуре пыльников и неопыленных семяпочек in vitro.

3. Для пополнения генофонда генами устойчивости к биотическим и абиотическим факторам у моркови столовой необходимо применять разработанные нами методы регенерации и генетической трансформации in vitro

Список ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тюкавин Г.Б., Тимин Н И., Титова И.В Использование методов культуры тканей в селекции овощных культур // Селекция овощных культур / Сб. науч. трудов ВНИИССОК. -М., 1984. - Вып. 18. - С. 43-48.

2. Тюкавин Г.Б., Тимин Н.И., Заичкин Э.И., Буракова И.А., Таганов Б.О. Получение растений в культуре изолированных пыльников моркови // Биология культивируемых клеток и биотехнология: Тез. докл. Междунар. конф., 2-6 авг. 1988. - Новосибирск, 1988. - Ч. 2. -С. 224.

3. Тюкавин Г.Б., Тимин Н.И., Валеева З.Т., Буракова И.А. Эмбриокультура в создании константных линий моркови // Биология культивируемых клеток и биотехнология: Тез. докл. Междунар. конф., 2-6 авг. 1988.-Новосибирск, 1988.-Ч. 2.-С. 239-240.

4. Таганов Б.О., Тюкавин Г.Б., Заичкин Э И. Культура пыльников моркови «ин вит-ро» // Основные направления научно-технического прогресса в картофелеводстве, плодоводстве и овощеводстве: Тез. докл. Всесоюз. науч. - практ. конф. - п. Самохваловичи, 1989. -С. 107.

5. Тюкавин Г.Б., Тимин Н.И, Буракова И.А. Использование методов культуры тканей растений in vitro в селекции моркови // Науч. - техн. бюл. ВИР. - JI., 1989. - Вып. 192. -С. 57-60.

6. Тюкавин Г.Б. Получение неинфицированных зародышей моркови для культивирования in vitro // Селекция овощных культур / Сб науч. трудов ВНИИССОК. - М., 1989. -Вып. 28.-С. 81-86.

7 Tjukavin G.B. Embryokultura mrkve in vitro // Bull.vyzk. Slecht. Ust. zelin. - Olomouc,

1989.-Bull.33 -P.45-49.

8. Tjukavin G.B., Taganov В О., Naumova S.V Embryogenesis in anther culture of carrot in vitro // Embryology and seed reproduction: Abst. XI Int. Symp. July 3-7, 1990. - Leningrad,

1990.-P. 174.

9. Тюкавин Г.Б., Таганов Б О., Наумова С.В. Индукция эмбриогенеза при культивировании пыльников моркови // Embryology and seed reproduction: Proc. XI Int Symp July 3-7, 1990. - St. Petersburg, Nauka, 1992. - P. 562-563.

10. Тюкавин Г.Б., Таганов Б О. Эмбриогенез в культуре пыльников растений моркови in vitro // Селекция овощных культур / Сб. науч. трудов ВНИИССОК. - М., 1993. - Вып. 32. -С. 12-15.

11. Тюкавин Г.Б. Культура зародышей моркови in vitro // Новые методы биотехнологии растений: Тез. докл. II Рос. симп. 18-20 мая 1993.-Пущияо, 1993.-С. 171.

12. Тюкавин Г.Б. Получение растений в культуре пыльников in vitro // Новые методы биотехнологии растений: Тез. докл. II Рос. симп. 18-20 мая 1993. - Пущино, 1993 - С. 172.

13. Тюкавин Г.Б. Культура пыльников моркови - источник разнообразия // Биология культивируемых клеток растений и биотехнология: Тез. докл. II Междунар. конф. 28 сент. -2 окт. 1993. - Алматы, 1993.-Т. 1.-С. 161.

14. Shmikova N.A., Tjukavin G.B. Culture of unpollinated ovaries and ovules in bulb onion, carrot and cucumber // Plant biotechnology and genetic engineering: Abst. Int. Symp. Ukraine, October 3-6, 1994. -Kiev, 1994. -P. 114.

15. Tjukavin G.B. Anther culture of carrot // Plant biotechnology and genetic engineering: Abst. Int. Symp. Ukraine, October 3-6,1994. - Kiev, 1994. - P. 158.

16. Тюкавин Г.Б. Индукция каллусо- и эмбриогенеза в культуре пыльников моркови // Научные труды по селекции и семеноводству ВНИИССОК. - М., 1995. - Т.1. - С. 153-164

17. Тюкавин Г.Б. Культура пыльников моркови - метод ускоренного получения фер-тильных линий для гетерозисной селекции // Селекщя овочевих i башганних культур на гетерозис: Тез. допов. МЪкнар. наук. конф. - Харюв, 1996. - С. 81-82.

18. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Культура неопыленных завязей и семяпочек моркови - путь ускоренного получения стерильных линий для гетерозисной селекции // Селекщя овочевих i баштанних культур на гетерозис. Тез. допов. М1жнар. наук. конф. - Харюв, 1996. -С. 82-83.

19. Дорохов Д.Б., Тюкавин Г.Б., Лаптева М.Н., Помозглова Г.Е, Соханова Н.М., Лит-винекко М.В. Морфологическая, биохимическая и молекулярная оценка андрогенных растений моркови // Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез. Междунар. конф - М., 1996. - С. 24.

20. Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.Б. Влияние регуляторов роста на развитие тканей пыльников моркови // Регуляторы роста и развития растений' Тез. докл. Четвертой Междунар. конф. 24-26 июня 1997. - М., 1997. - С. 319.

21. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Гормональная регуляция каллусо- и органогенеза моркови // Регуляторы роста и развития растений: Тез докл. Четвертой Междунар. конф. 24-26 июня 1997.-М., 1997. - С. 321.

22. Dolgov S.V., Lebedev V., Firsov А.Р., Tjukavin G.B., Taran S.A. Fruit taste modification of horticultural crops by Thaumatin II gene introduction // Plant Molecular Biology: Abst. 5 th Int. Cong. September 21-27, 1997. - Singapore, 1997. Abst. 1256.

23. Шмыкова H.A., Тюкавин Г.Б. Изучение потенциального эмбриогенеза микроспор моркови // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда- Тез докл. VIIМеждунар. конф. 25-28 ноября 1997.-М., 1997.-С 185.

24. Монахова М.А., Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Фенотип интерфазного ядра в клеточной селекции моркови // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда- Тез. докл. VII Междунар. конф. 25-28 ноября 1997. - М., 1997. - С. 223.

25. Дорохов Д.Б., Лаптева М.Н., Соханова Н М., Литвиненко М В., Тюкавин Г.Б. Морфологическая, биохимическая и молекулярная оценка исходного материала для гетерозисной селекции моркови // Гетерозис сельскохозяйственных растений: Материалы докл., сообщ. Междунар. симп. 1-5 декабря 1997. - М, 1997. - С. 104-107.

26. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Методы ускоренного получения линий моркови для гетерозисной селекции // Гетерозис сельскохозяйственных растений: Материалы докл., сообщ. Междунар. симп 1-5 декабря 1997 - М„ 1997. - С. 163-164.

27. Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.Б. Использование культуры пыльников ин витро для получения гомозиготных линий моркови // Гетерозис сельскохозяйственных растений: Материалы докл., сообщ. Междунар. симп. 1-5 декабря 1997. - М., 1997. - С. 174-175.

28. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А Использование методов культуры пыльников и неоп-лодотворенных семяпочек для создания константных линий моркови // Использование биотехнологических методов для решения генетико-селекционных проблем: Сб. докл. и сооб. XVIII Мичуринских чтений 27-29 октября 1997 г. - Мичуринск, 1998. - С. 35-38.

29. Tjukavin G.B., Shmykova N.A Anther culture and unpollinated ovules of carrot // Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century: Abst. IX Int. Cong, on Plant Tissue and Cell Culture. Israel, June 14-19, 1998. - Jerusalem, 1998. - P. 115.

30. Monahova M.A., Tjukavin G.B, Shmykova N.A. Change of ploidy during formation regenerated plants from androgenous and gynogenous embryos of carrot in vitro // Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century: Abst. IX Int. Cong, on Plant Tissue and Cell Culture Israel, June 14-19,1998. - Jerusalem, 1998.-P. 180.

31. Dolgov S.v., Lebedev V.G., Firsov A.P., Shushkova T.V., Tjukavin G.B., Taran S A. Fruit taste modification of horticultural crops by Thaumatin П gene introduction // Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century: Abst. IX Int. Cong, on Plant Tissue and Cell Culture. Israel, June 14-19, 1998. - Jerusalem, 1998. - P. 189.

32. Dolgov S.V., Lebedev V.G., Firsov A.P., Shushkova T.V., Tjukavin G.B., Taran S.A. Fruit taste modification of horticultural crops by Thaumatin II gene introduction // Abst. XXV Int. Horticultural Cong. (IHC) Brussels, 2-7 August 1998. - Brussels, 1998. - P. 434.

33. Dolgov S.V., Lebedev V.G., Shushkova T.V., Tukavin G.B., Shadenkov S.A. Phytopa-thogene resistance improvement of horticultural crops by plant-defensin genes introduction // Genetics and breeding for crop quality and resistance: Abst. XV EUCARPIA 1988 General Congress. I tali, September 20-25,1998. - Viterbo, 1998. - P. 32.

34. Dolgov S V., Lebedev V.G, Firsov A.P., Shushkova T.V., Tukavin G.B., Taran S.A. Fruit taste modification of horticultural crops by Thaumatin II gene introduction // Genetics and breeding for crop quality and resistance: Abst. XV EUCARPIA 1988 General Congress. Itali, September 20-25,1998. - Viterbo, 1998. - P. 85.

35. Dolgov S.V., Lebedev V.G., Firsov A.P., Taran S.A., Tjukavin G.B. Expression of thaumatin II gene in horticultural crops //Genetics and Breeding for Crop Quality and Resistance: Proc. XV EUCARPIA Congress, Viterbo, Itali, September 20-25, 1998. - Dordrecht, Boston, London, Kluwer Academic Publishers, 1999.-P. 165-172.

36. Dolgov S , Lebedev V.G., Shushkova T.V., Tukavin G.B., Shadenkov S.A., Lunin V.G Phytopathogene resistance improvement of horticultural crops by plant-defensin genes introduction // Molecular plant-microbe interactions: Abstracts 9th International Congress - Amsterdam, 1999. -P. 150.

37. Рыбалко A.A., Селянин И.Г., Тюкавин Г.Б. Влияние различных методов получения селекционного материала на выравненность корнеплодов моркови по морфологическим признакам // Материалы докл., сообщ. Междунар. симп. по селекции и семеноводству овощных культур 1-4 марта 1999. -М., 1999. - С. 277-278.

38. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Разработка методов биотехнологии растений для создания исходного материала в селекции овощных, малораспространенных и цветочных культур во ВНИИССОК // Материалы докл., сообщ. Междунар. симп. по селекции и семеноводству овощных культур 1-4 марта 1999. -М., 1999. - С. 362-371.

39. Домблидес А.С., Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Особенности анатомического строения черешков листьев андро- и гиногенных растений моркови Ro // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования Труды. III Междунар. симп. 21-25 июня 1999. - Пущино, 1999. - Т. 2. - С. 273-275.

40. Домблидес А.С., Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Влияние регуляторов роста на образование эмбриогенных структур в зародышевых мешках неопыленных семяпочек моркови // Регуляторы роста и развития растений: Тез докл Пятой Междунар. конф. 29 июня - 1 июля 1999.-М, 1999.-Ч. 2.-С. 318-319.

41. Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.Б. Влияние предобработки соцветий моркови регуляторами роста на образование «эмбриогенной» пыльцы // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. Пятой Междунар. конф. 29 июня -1 июля 1999. - М., 1999. Ч. 2. - С. 354-355.

42. Тюкавиа Г.Б., Шмыкова Н.А, Монахова M А. Цитология эмбриогенеза в культуре пыльников моркови // Физиология растений. - 1999. - Т. 46., № 6. - С. 876-883.

43. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Биотехнология в селекции овощных культур // Селекция и семеноводство. - 2000 .- № 1 - С. 42-44.

44. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Культура неопыленных семяпочек моркови // Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке: Междунар. науч.- практ. конф. 24—27 июля 2000. - М„ 2000. - Т. 2. - С. 275-277.

45. Тюкавин Г.Б., Домблидес A.C., Шмыкова H.A. Гиногенез моркови in vitro // Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке: Междунар. науч.- практ. конф. 24-27 июля 2000. - M., 2000. - Т. 2. - С. 277-279.

46. Крутенко Д В., Тюкавин Г.Б., Долгов C.B. Генетическая трансформация моркови на устойчивость к фитопатогенам // Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке: Междунар. науч.- практ. конф. 24-27 июля 2000. - М„ 2000. - Т. 1. - С. 284-285.

47 Шушкова Т.В., Тюкавин Г.Б., Долгов C.B., Шмыкова H.A. Генетическая трансформация моркови (Daucus carota L.) геном растительного дефензина // Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке: Междунар. науч.- практ. конф. 24-27 июля 2000. -М., 2000. - Т. 2. - С. 348-349.

48. Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Методические рекомендации по получению дигап-лоидов моркови методом андрогенеза. - М.: Россельхозакадемия, 2000. - 56 с.

49. Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A., Долгов C.B., Шушкова Т.В. Влияние гена растительного дефензина Rs на отклонения в ходе развития зародышей семян Ro трансгенных растений моркови и их прорастание // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. II Междунар. науч. конф. 18-19 октября 2000. - М., 2000. - С. 30-31.

50. Шмыкова H.A., Тюкавин Г.Б. Диморфизм пыльцы и андрогенез в культуре пыльников моркови (Daucus carota L.) I ! Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез докл. II Междунар. науч. конф. 18-19 октября 2000. - М., 2000. - С. 55-56

51. Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Методы получения дигаплоидов моркови in vitro II Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. II Междунар. науч. конф. 18-19 октября 2000. - М., 2000. - С. 120-121.

52. Домблидес A.C., Тюкавин Г.Б., Шмыкова H А. Получение гиногенных растений моркови in vitro с использованием тидиазурона // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. II Междунар. науч конф. 18-19 октября 2000. -М., 2000.-С. 154-155.

53. Шмыкова H.A., Тюкавин Г.Б. Диморфизм пыльцы и оценка эмбриогенной способности микроспор различных генотипов моркови // Сельскохозяйственная биология. - 2001. -№5.-С. 53-61.

54. Тюкавин Г.Б., Супрунова Т.П., Шмыкова H.A., Домблидес A.C., Дорохов Д.Б., Клыгина Т.Э. Изучение гаметоклональной изменчивости у моркови сорта Нантская 4 // Овощеводство - состояние, проблемы перспективы: Научные труды ВНИИО. - М., 2001. -С. 157-161.

55. Domblides A.S., Suprunova Т.Р., Tjukavin G.B. Gynogenesis in Daucus carota L. by in vitro culturé of unpollinated ovules and production of doubled haploid plants // Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources: Abst. Int. Symp. Ukraine, May 26-31,2002.-Yalta,2002.-P. 71.

56. Балашова H.H., Балашова (Лахматова) И.Т., Супрунова Т.П., Музыкантов В.П., Ко-зарь Е.Г., Скворцова Р.В., Гуркина JI.K, Добруцкая Е.Г., Домблидес A.C., Шмыкова H.A., Тюкавин Г.Б., Пивоваров В.Ф. Применение методов молекулярного анализа в селекционных программах (овощные культуры) // Inginerie geneticä çi biotehnologii moderne: Materialele Simpozionului al II-lea National cu participare Internationale - Chiçinâu, 2002. - С 7-12.

57. Шмыкова H.A, Тюкавин Г.Б., Особенности морфогенетических изменений в культивируемых in vitro пыльниках моркови II Биотехнология. - 2002. - № 5. - С. 65-69.

58. Семенова В.А, Тюкавин Г.Б., Клыгина Т.Э. Морфологическая характеристика гиногенных и андрогенных растений моркови // Селекция, семеноводство и биотехнологии овощных и бахчевых культур: Докл. III Междунар. конф. поев, памяти Б.В. Квасникова. -M., 2003.-С. 404-408.

59. Тюкавнп Г.Б., Долгов C.B., Шмыкова H.A. Отбор трансгенных растений Т1, ..., п моркови с селективным геном NPT II // The Biology of Plant Cells In Vitro and Biotechnology. Abst. VIII Int. Conf. September 9-13,2003. - Saratov, 2003. - C. 335.

60. Тюкавин Г.Б., Разработка регенерационной системы из зиготических зародышей моркови // Достижения науки и техники АПК. - 2003. - № 10. - С. 42-44.

61. Тюкавин Г.Б. Рост и развитие завязей, семяпочек и зародышей моркови in vivo // Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке: Труды Междупар. науч.- практ. конф 15-18 декабря 2003 г. - М., 2003. -С. 448-456.

62. Тюкавин Г.Б. Разработка состава питательной среды для культивирования зиготических зародышей моркови in vitro // Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке- Труды Междунар. науч.- практ. конф. 15-18 декабря 2003 г. - M , 2003. - С. 456-469.

63. Сидорова Т.Н., Тюкавин Г.Б., Долгов C.B. Генетическая трансформация моркови // Биотехнология овощных, бахчевых, цветочных и малораспространенных культур: Сборник науч. трудов Междунар. науч.- практ. конф. 22-25 марта 2004 г. - М., 2004. - С. 110-113.

64. Tyukavin G.B., Shmykova N. A. Embryogenesis in cultured carrot anthers // Innovation Towards Modernized Agriculture: Abst. Agriculture Cong. Malaysia, October 4-7, 2004, -Selangor, 2004. - P. 184 - 186.

65.Дейнеко E. В., Филипенко М.Л, Храпов E.A., Загорская A.A., Филипенко Е.А., Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A., Сенников C.B., Шумный В.К. Создание трансгенных растений табака и моркови с геном интерлейкина-18 человека // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. III Междунар. науч. конф. 19 октября 2004. -М., 2004.-С. 130-131.

66. Deyneko E,. Shmikova N., Tukavin G., Filipenko M., Khrapov Y., Yakuchenko E., Sennikov S., Shumnyi V. Transgenic tobacco and carrot plants producing human interleukins // New Approaches to Vaccine Development / From the bench to the field: Abst. Int. Symp. Germany, September8-10, 2005.-Berlin,2005.-N. 031.

67 Тюкавин Г.Б. Получение неинфицированных завязей и выделяемых из них зародышей моркови для культивирования in vitro // Состояние и проблемы научного обеспечения овощеводства защищенного грунта: Материалы II Междунар. науч. конф. 21-23 ноября 2005 г. -М., 2005 -С. 131-134.

68. Тюкавин Г.Б. Влияние возраста завязей, семяпочек и зародышей на регенерацию растений моркови in vitro // Состояние и проблемы научного обеспечения овощеводства защищенного грунта: Материалы II Междунар. науч. конф. 21-23 ноября 2005 г. - М., 2005. -С. 135-138

69. Тюкавин Г.Б., Тимин Н.И. Получение апомиктичных растений моркови in vivo и in vitro // Состояние и проблемы научного обеспечения овощеводства защищенного грунта: Материалы II Междунар. науч. конф. 21-23 ноября 2005 г. - M, 2005. - С. 139-143.

70. Тюкавин Г.Б., Рыбалко A.A., Шмыкова H.A., Селянин И Г. Андрогенез in vitro -метод ускоренного получения сорта столовой моркови Соната // Состояние и проблемы научного обеспечения овощеводства защищенного грунта: Материалы П Междунар. науч. конф. 21-23 ноября 2005 г. - М., 2005. - С. 144-147.

71. Тюкавин Г.Б. Андрогенез in vitro у моркови с использованием кондиционированных сред // Сборник научных трудов по овощеводству и бахчеводству ВНИИО / Селекция и семеноводство. - М., 2006. - Т.1. - С. 309-313.

72. Тюкавин Г.Б. Андрогенез in vitro у моркови // Сборник научных трудов по овощеводству и бахчеводству ВНИИО / Селекция и семеноводство. - M, 2006. - Т.1. - С. 314-320.

73. Тюкавин Г.Б. Способы повышения эффективности андрогенеза in vitro у моркови // Инновационные технологии в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных культур: Материалы Междунар. науч.- практ. конф. 7-9 августа 2006 г. - М., 2006. - Т.1. -С. 280-287.

74. Тюкавин Г.Б., Наумова C.B. Корреляция между морфологическими показателями генеративных органов растений моркови и стадиями развития микроспоро- и гаметогеиеза // Инновационные технологии в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных культур: Материалы Междунар науч.- практ. конф. 7-9 августа 2006 г. - М., 2006 - Т.1. -С. 287-295.

75. Тюкавин Г.Б., Наумова C.B., Валова П. Цветение и фертильность донорных растений моркови // Инновационные технологии в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных культур: Материалы Междунар. науч.- практ. конф. 7—9 августа 2006 г. — М., 2006. — Т 1. -С. 295-298.

76. Тюкавин Г.Б., Ногавица Р., Валова П. Культура пыльников моркови m vitro (опыт международного сотрудничества) // Инновационные технологии в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных культур: Материалы Междунар. науч.- практ. конф. 7-9 августа 2006 г. - М., 2006. - Т. 1. - С. 298- 304.

77. Тюкавин Г.Б. Основы метода андрогенеза моркови in vitro путем каллусогенеза // Гавриш - 2006.- № 4. - С. 28-32.

78. Тюкавин Г.Б., Долгов C.B., Сидорова Т.Н., Шмыкова H А., Леунов В.И. Повышение устойчивости моркови к Fusarium avenaceum путем экспрессии гена Тауматин П // Индуцированный иммунитет сельскохозяйственных культур - важное направление в защите растений: Материалы Всерос. науч.- практ. конф. 15-16 ноября 2006 г. - Большие Вяземы -Санкт-Петербург, 2006 - С. 106-109.

79. Yakushenko E.V., Lopatnikova J.A., Khrapov Е.А., Deineko E.V., Filipenko M.L., Vo-ronina E.N., Turchinovich A.A., Filipenko E.A., Pukhnatcheva N.A., Tukavin G.B., Schmikova N.A., Shumny V.K., Sennikov S.V., Kozlov V A. Use of transgenic carrot plants producing human interleukin-18 for modulation of mouse immune response // Biotechnology in biology and medicine / Eds A.M Egorov and G. Zaikov. - New York: Nova Science Publishers Inc., 2006. - P. 74-81.

80. Рыбалко A.A., Селянин И.Г., Иванова C.H., Колыхалова Г.Ф., Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Морковь - Соната: Авторское свидетельство № 34702 от 16.01.03. Государственного комитета РФ по испытания и охране селекционных достижений; по заявке №9908214 от 29.11 00.

3,25 печ. л.

Зак. 181.

Тир. 100 экз.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Тюкавин, Геннадий Борисович

ВВЕДЕНИЕ.;.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Состояние исследований по использованию методов биотехнологии в селекции растений на начало 80-х годов XX века.

1.2. Обоснование темы.

1.2.1. Клональное микроразмножение и системы регенерации растений in vitro.

1.2.2. Получение гаплоидов и/или удвоенных гаплоидов методами биотехнологии растений и их практическая значимость.

1.2.2.1. Культура зародышей.

1.2.2.2. Культура пыльников.

1.2.2.3. Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек.

1.2.3. Генетическая трансформация.

1.2.3.1. Использование методов прямого переноса генов при генетической трансформации моркови.

1.2.3.2. Агробактериальная трансформация моркови.

1.3. Связь диссертационной работы с тематическим планом научно-исследовательских работ.

1.4. Апробация работы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Растительный материал.

2.2. Стерилизация.

2.3. Выделение эксплантов.

2.4. Питательные среды - состав и приготовление.

2.5. Условия культивирования эксплантов in vitro.

2.6. Цитоэмбриологические исследования.

2.7. Генетическая трансформация моркови.

2.8. Адаптация растений-регенерантов и выращивание последующих поколений в условиях in vivo.

2.9. Биохимический анализ экспериментального материала.

2.10. Статистическая обработка экспериментальных данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Культура зародышей.

3.1.1. Стерилизация семян и завязей моркови.

3.1.2. Разработка состава питательной среды для культивирования зиготических зародышей моркови in vitro.

3.1.3. Каллусогенез и регенерация растений в культуре зародышей моркови in vitro.

3.1.4. Рост и развитие завязей, семяпочек и зародышей in vivo.

3.1.5. Регенерация растений in vitro из разновозрастных завязей, семяпочек и зародышей моркови.

3.1.6. Получение апомиктичных растений моркови in vivo.

3.1.7. Получение апомиктичных растений моркови in vitro.

3.2. Культура пыльников.

3.2.1. Цветение и фертильность донорных растений моркови.

3.2.2. Строение пыльника моркови.

3.2.3. Развитие пыльника моркови in vivo и in vitro.

3.2.4 Микроспорогенез и микрогаметогенез у моркови.

3.2.5. Взаимосвязь между стадиями развития мужского гаметофита и размерами соцветий и генеративных органов моркови.

3.2.6. Условия выращивания донорных растений моркови.

3.2.7. Стерилизация первичных эксплантов.

3.2.8. Стадия развития микроспор для индукции андрогенных структур моркови.

3.2.9. Каллусогенез и эмбриогенез в культуре пыльников моркови in vitro.

3.2.9.1. Каллусогенез.

3.2.9.2. Эмбриогенез.

3.2.10. Способы повышения эффективности получения андрогенных структур в культуре пыльников моркови in vitro.

3.2.11. Роль 2,4-Д на индукцию андрогенных структур в культуре пыльников моркови in vitro.

3.2.12. Цитология эмбриогенеза в культуре пыльников моркови.

3.2.13. Смена плоидности при формировании андрогенных растений-регенерантов моркови in vitro.

3.2.14. Депонирование.

3.2.15. Адаптация растений-регенерантов in vivo.

3.3. Культура неопыленных завязей и семяпочек.

3.3.1. Строение завязи моркови.

3.3.2. Развитие генеративных органов моркови in vivo.

3.3.3. Взаимосвязь между стадиями развития женского гаметофита и стадиями развития мужского гаметофита, а также размерами соцветий и генеративных органов моркови.

3.3.4. Каллусогенез и эмбриогенез в культуре неопыленных завязей и семяпочек моркови in vitro.

3.3.5. Цитология каллусо- и эмбриогенеза в культуре неопыленных семяпочек моркови.

3.3.6. Смена плоидности при формировании гиногенных растений-регенерантов моркови in vitro.

3.4. Анализ андрогенных и гиногенных растений моркови.

3.4.1. Растения вегетативного периода онтогенеза.

3.4.1.1. Андрогенные растения Rao.

3.4.1.2. Андрогенные растения Rai.

3.4.1.3. Андрогенные растения Ra2.

3.4.1.4. Гиногенные растения Rn.

3.4.2. Растения репродуктивного периода онтогенеза.

3.4.2.1. Андрогенные растения Rao.

3.4.2.2. Гиногенные растения Rpo.

3.4.3. Прикладное значение метода андрогенеза in vitro у моркови.

3.4.4. Сравнительная характеристика андрогенных и гиногенных растений моркови, полученных из сорта Нантская 4.

3.4.2.1. Анатомическое строение черешков листьев андрогенных и гиногенных растений моркови Ro вегетативного периода онтогенеза.

3.4.2.2. Молекулярная оценка андрогенных и гиногенных растений моркови Ri вегетативного периода онтогенеза на основе RAPD технологии.

3.4.2.3. Морфологические различия андрогенных и гиногенных растений моркови Ro репродуктивного периода онтогенеза.

3.5. Генетическая трансформация моркови сорта Нантская 4.

3.5.1. Трансформация моркови репортерным геном GUS.

3.5.2. Методика отбора трансгенных растений Rti,.,ii моркови с селективным геном npt II.

3.5.3. Отбор и анализ трансгенных растений моркови сорта Нантская 4 с геном растительного дефензина Rs-ap.

3.5.4. Отбор и анализ трансгенных растений моркови сорта Нантская 4 с геном Тауматин II.

3.5.4.1. Отбор и анализ трансгенных растений Rto.

3.5.4.2. Отбор и анализ трансгенных растений Rn.

• 3.5.4.3. Отбор и анализ трансгенных растений Rt2.

3.5.4.4. Анализ трансгенных растений Rti-тз по устойчивости к болезни, вызываемой Fusarium avenaceum.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнологические основы селекционной технологии моркови"

Биотехнология как наука, использующая биологические принципы в практических целях, возникла в конце прошлого столетия с появлением микробиологии и её применением в промышленных процессах брожения. Хотя такие биотехнологические процессы, как хлебопечение, приготовление кисломолочных продуктов, сыроварение, виноделие, улучшение полезных видов растений и животных известны с незапамятных времен.

Применение термина «биотехнология» впервые было осуществлено в 1973 году в США, в научно-исследовательской группе Станфордского университета, при получении Е-коли (EcoRl) во время проведения успешной работы в области рекомбинантов ДНК. С этого момента то, что мы теперь называем «биотехнологией», стало использоваться при описании сравнительно новых технологических процессов, входящих в общее понятие «биология», и в частности, для определения таких областей технологии, как рекомбинация ДНК, слияние клеток и др. (Хиросэ, 1986). Энциклопедическое определение биотехнологии (от греческого bios - жизнь, techne - искусство, мастерство и logos - учение), использование биологических процессов и систем в различных областях сельского хозяйства, промышленности и медицины; научное направление, объединяющее возможности биологии и техники*. В связи с этим выделяются ряд направлений в том числе и сельскохозяйственная биотехнология.

Сельскохозяйственная биотехнология - любая технология, использующая живые организмы или их части для создания или модификации продуктов, улучшения растений или животных, а также создания микроорганизмов для специального применения (James, 1991). Она охватывает использование «как Сельскохозяйственный энциклопедический словарь / Редкол.: В.К. Месяц (гл. ред.) и др. - М.: Советская энциклопедия, 1989. - С. 52. традиционной, так и современной биотехнологии». В традиционном понимании биотехнология - наука о методах и технологиях производства различных веществ и продуктов с использованием природных биологических объектов и процессов (хлебопечение, квашение, виноделие, пивоварение, биологическая защита от вредных насекомых, производство традиционных вакцин для животных, и др.). Современная биотехнология - наука о генно-инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных биологических объектов для интенсификации производства или получения новых видов продуктов различного назначения (включает новые методы культуры клеток и тканей; диагностику с использованием как монокло-нальных антител, так и зондов нуклеиновых кислот; технологию рекомбинант-ной ДНК - рДНК). Высшим достижением современной биотехнологии является генетическая трансформация, перенос чужеродных генов и других материальных носителей наследственности в клетки растений, животных и микроорганизмов, получение трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками.

Важное место в сельскохозяйственной биотехнологии занимает биотехнология растений. Одно из первых определений этому направлению было дано в начале 90-х годов XX века. Биотехнология растений - прикладная область науки, которая использует научные подходы для разработки новых технологий и оборудования с целью получения новых форм и использования их биологическими организмами (Qualset, 1991). Целями научных исследований биотехнологии растений, наряду с другими, являются: новые фундаментальные знания о процессах, происходящих в растениях, включая структуру, функцию и выражение гена; новые методологии для применения при разработке продуктов; новые генетические линии для научных исследований и селекции растений, включая растения, гаметы, клонированную ДНК; новые сорта растений для прямого использования в сельском хозяйстве.

Немаловажное значение в становлении современной биотехнологии растений сыграла разработка методологических основ культуры тканей растений области биологии, изучающей клетки, ткани и органы, изолированные от растения и выращиваемые на искусственных питательных средах, in vitro (в стекле) (Чайлахян и др., 1982).

История развития методов культуры тканей растений подробно отражена в ряде работ как зарубежных (Уайт, 1949), так и отечественных (Бутенко, 1964; Калинин и др., 1980; Муромцев и др., 1990; Бутенко, 1999) исследователей. Можно выделить следующие периоды развития методов культуры тканей растений:

1. 1834-1900 гг. - Создание и разработка клеточной теории.

2. 1901-1922 гг. - Сформулирована идея культуры тканей.

3. 1923- 1934 гг. - Безуспешные поиски методов, обеспечивающих длительное выращивание культуры тканей.

• 4. 1935-1940 гг. - Детальная разработка техники культуры растительных тканей: культивирование изолированных кончиков корня в течение неограниченного периода времени, введение в культуру новых объектов - кал-лусные ткани.

5. 1941-1960 гг. - Разрабатываются составы основных питательных сред, Изучено значение отдельных макро- и микроэлементов. Выявлена потребность тканевых культур в витаминах и стимуляторах роста. Открыт новый класс стимуляторов роста растений - цитокинины. Оценено значение натуральных экстрактов типа эндосперма кокосового ореха, каштана, кукурузы и других растений для поддержания неорганизованного клеточного роста и стимуляции процессов органогенеза и соматического эмбриогенеза в культуре каллусных тканей и клеточных суспензий. В культуру in vitro введены ткани 142 видов высших растений.

6. 1961-1975 гг. Разработан метод получения изолированных протопластов. Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточную стенку, были использованы для разработки методов гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ), а также для введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, клеток прокариотов. Разработан метод культуры меристем (клонального микроразмножения), позволяющий быстро, с высоким коэффициентом, клонально размножить растения в асептических условиях, а также получить оздоровленный посадочный материал экономически важных растений. Важное фундаментальное и прикладное значение имело открытие индукции анд-роклинии при культивировании изолированных пыльников и партеногенеза при культивировании клеток зародышевого мешка. Обнаружено явление сомаклональной изменчивости.

7. 1976 - 1990 гг. Продолжает быстро развиваться техника in vitro, изучение биологии культивируемых растительных объектов и создание биотехнологий на их основе. Разработка методов электрослияния изолированных протопластов и разнообразных методов селекции гибридных клеток значительно облегчила гибридизацию соматических клеток растений. Методы мутагенеза и клеточной селекции, получение сомаклональных вариантов и экспериментальных гаплоидов используются для создания новых форм и сортов сельскохозяйственных растений.

8. 1991 г. и по настоящее время - С использованием изолированных протопластов и генетических векторов на основе Ti-плазмид, электропорации и баллистического введения генов в клетки реципиентов стало возможным получение трансгенных растений.

В отечественной литературе термин «биотехнология» относительно растений появился в названии IV Всероссийской конференции «Культура клеток растений и биотехнология» - Кишинев, 1983 г. У зарубежных исследователей термин «биотехнология растений» подразумевал применение технологий тканевых культур, клеточных культур, слияния клеток, рекомбинацию ДНК и др. (Хиросэ, 1986). При этом выделялись три основные области применения биотехнологии растений: 1 - клональное микроразмножение и оздоровление посадочного материала; 2 - производство вторичных метаболитов; 3 - селекция растений.

В контексте нашей работы мы также будем использовать термин «биотехнология растений», подразумевая при этом область биологии, имеющую дело с растительными организмами и продуктами их жизнедеятельности, использующую все уровни организации живого - молекулярный, субклеточный, клеточный, тканевый, организменный и применяющую методы как культуры тканей, так и других биологических дисциплин для разработки практически важных технологий.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Тюкавин, Геннадий Борисович

ВЫВОДЫ

1. Впервые для селекционной технологии моркови разработаны биотехнологические методы: культура зародышей, андрогенез и гиногенез in vitro, генетическая трансформация. Применение этих методов позволяет ускорить получение исходного материала с заданными признаками в селекционных программах по моркови.

2. При получении стерильной культуры зародышей а) из семян путем предварительной обработки 96 %-м этанолом (2 мин) и дальнейшей стерилизации 0,5 %-м водным раствором сулемы в течение 20-30 минут; б) из завязей путем предварительной обработки 96 %-м этанолом (1 мин) и последующей стерилизации 0,1 %-м водным раствором сулемы в течение 20-30 минут инфицированность выделенных зародышей не превышает 1,7 %, а их прорастание составляет до 86 %. При получении стерильной культуры пыльников и семяпочек путем стерилизации бутонов 10%-ным водным раствором хлорамина «Б» в течение 20-30 минут инфицированность выделенных пыльников и семяпочек не превышает 2,7 %.

3. Использование в качестве первичных эксплантов зиготических зародышей моркови позволило разработать регенерационную систему, включающую: 1) индукцию каллуса на среде МСм с 0,2 мг/л 2,4-Д; 2) регенерацию проростков на среде МСм с 0,1 мг/л кинетина; 3) подращивание и укоренение растений-регенерантов на фильтровальных мостиках в жидкой безгормональной среде МСм.

4. Завязи in vivo достигают максимальных размеров через 4 недели, семяпочки - через 5 недель, зародыши - через 6-7 недель после опыления. Автономность зародышей моркови для культивирования in vitro достигается через 4 недели на семядольной стадии развития, которые к этому времени составляют ~ 1/3 своего окончательного размера in vivo.

5. Эффективность прорастания зародышей in vitro определяется их возрастом и составом основной питательной среды. Прорастание зрелых зиготических зародышей и формирование растений моркови может происходить на полной безгормональной среде МСм. Однако ряд ростовых веществ оказывает благоприятное действие на рост и развитие проростков моркови in vitro. Исходя из принципа функционирования фитогормонов, заключающегося в их взаимодействии друг с другом, для культивирования зиготических зародышей предложена среда МСм с добавлением 2 г/л ГК с ДЭ, 0,5 мг/л кинетина, 0,1 мг/л ИУК и 0,01 мг/л ГК3. Рост и развитие проростков из равновозрастных зародышей зависит от генотипа материнского растения.

6. Взаимосвязь между микро- и макроспорогенезом, а также между стадиями развития мужского и женского гаметофитов и морфологическими показателями соцветия и цветков растений моркови характеризуется сильной корреляционной зависимостью. Маркерными показателями для отбора эксплантов при андрогенезе моркови in vitro служат диаметр зонтика, высота бутона и длина пыльника, при гиногенезе - стадия развития мужского гаметофита и размер завязи.

7. Пыльники моркови являются гормонозависимыми. Для индукции андрогенных структур необходим темновой период культивирования. Индукция андрогенных структур (эмбриоидов, каллусов) происходит при культивировании бутонов и/или пыльников на среде МСм с 0,2 мг/л 2,4-Д (или с 0,2 мг/л 2,4-Д + 0,2 мг/л кинетина), регенерация растений-регенерантов - на среде МСм с 0,1 мг/л кинетина, подращивание и укоренение растений-регенерантов - на безгормональной среде МСм. Выращивание донорных растений в контролируемых условиях, культивирование пыльников на фильтровальных мостиках в жидкой среде, кратковременное воздействие (48 ч.) низкими положительными температурами (4-6 °С) на изолированные бутоны, центрифугирование зонтичков моркови при 355 g в течение 4 мин. повышает эффективность андрогенеза моркови in vitro.

8. При эксплантации пыльников моркови на питательные среды оптимальной стадией микроспорогенеза является вакуолизированные микроспоры. Развитие андрогенных структур происходит как при равном, так и при неравном делении микроспор. При равном делении эмбриоиды закладываются либо из одной, либо из обеих клеток микроспор. При неравном делении микроспор прослеживаются три пути образования эмбриоидов из вегетативной клетки, из генеративной клетки или одновременно из вегетативной и генеративной клеток микроспор.

9. Оптимальными условиями для индукции гиногенных структур (эмбриоидов и каллусов) при эксплантации завязей на стадии зрелого зародышевого мешка являются: а) последовательное культивирование завязей (в темноте -14 суток) и выделенных семяпочек (на свету) на среде МСм с 0,2 мг/л 2,4-Д, б) регенерация растений-регенерантов - на среде МСм с 0,1 мг/л кинетина, в) подращивание и укоренение растений-регенерантов - на безгормональной среде МСм.

10. Регенеранты из андрогенных и гиногенных эмбриоидов характеризуются определенной нестабильностью числа хромосом, при которой, наряду с гаплоидными и диплоидными клетками в фазе метафазы с числом хромосом 9 и 18 соответственно, обнаружены метафазные пластинки, содержащие от 4 до 18 хромосом. В процессе вторичного эмбриогенеза и регенерации растений in vitro происходит смена плоидности от п до 2п.

11. Методами молекулярно-генетического анализа (белковых и ДНК-маркеров) показана высокая генетическая однородность андрогенных и гиногенных растений моркови, полученных путем прямого эмбриогенеза.

12. Андрогенные и гиногенные растения, полученные из сорта Нантская 4, различаются между собой по анатомическим и морфологическим признакам. Эти различия обусловлены генетически, что подтверждено RAPD-анализом.

13. Культивирование растений-регенерантов моркови in vitro при низких положительных температурах (2^4 °С) замедляет их рост и развитие, что позволяет сохранять полученный материал длительное время. При дальнейшем культивировании в обычных условиях рост и развитие растений-регенерантов возобновляется.

14. Инокуляция каллуса из зиготических зародышей моркови агробакте-риями и их последующее совместное культивирование в течение 2-3 суток проводится на фильтровальной бумаге. Селекция каллусных культур осуществляется на среде с 200 мг/л канамицина, а регенерация и укоренение растений-регенерантов - на среде с 100 мг/л канамицина. При семенном размножении отбор трансгенных растений, содержащих селективный ген npt II, проводится по проросткам при проращивании семян на безгормональной среде МСм со 100 мг/л канамицина. Наличие и экспрессия целевого гена определяется моле-кулярно-биологическим анализом.

15. Впервые получены трансгенные растения моркови с геном Тауматин II. Методом иммуноблотинга выявлена экспрессия гена Тауматина II в листьях и корнеплодах трансгенных растений моркови. Проростки из семян, полученных от самоопыления трансгенных растений на инфекционном фоне in vitro, обладали устойчивостью к грибам родов Cladosporium и Alternaria. Растения семей поколений R-T2-T4 обладали повышенной устойчивостью к грибному патогену Fusarium avenaceum.

16. В результате практического использования разработанных биотехнологических методов были получены перспективные для дальнейшей селекции апомиктичные, андрогенные, гиногенные и трансгенные семьи моркови и сорт моркови столовой Соната.

Практические рекомендации

1. С целью получения растений из недоразвитых семян, образуемых при индуцированном апомиксисе или межвидовой гибридизации, для моркови необходимо использовать разработанный метод культуры зародышей in vitro.

2. Для ускоренного получения гомозиготных линий и повышения эффективности селекционного процесса предлагается использовать методы удвоенных гаплоидов в культуре пыльников и неопыленных семяпочек in vitro.

3. Для пополнения генофонда генами устойчивости к биотическим и абиотическим факторам у моркови столовой необходимо применять разработанные нами методы регенерации и генетической трансформации in vitro.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Тюкавин, Геннадий Борисович, Москва

1. Абраменко Н.М. Получение безвирусной суперэлиты земляники методом культуры верхушечных меристем // Вирусные болезни плодово-ягодных культур в Молдавии. Кишинев, 1973а. - Вып. 2. - С. 26-50.

2. Абраменко Н.М. Стерильная культура почек один из способов терапии пораженного вирусами винограда // Вирусные болезни плодово-ягодных культур в Молдавии. - Кишинев, 19736. - Вып. 2. - С. 22-25.

3. Аветисов В.А. Биотехнологические основы расширения генетического разнообразия картофеля: Автореф. дис. д-ра биол наук. -М., 1997.-46 с.

4. Айрапетян Э.П. Использование методов верхушечной меристемы, химиотерапии и культуры каллусной ткани в оздоровлении картофеля от мозаичных вирусов: Автореф. дис. канд. биол. наук. Ереван, 1975. - 20 с.

5. Анапияев Б.Б. Процессы морфогенеза в культуре пыльников пшеницы // Проблемы современной биологии / Тр. 20 Науч. конф. мол. ученых биол. фак. МГУ, 24-28 апр., 1989. М., 1990. - Ч. 1. - С. 73-77. - Деп. в ВИНИТИ 05.02.90. № 641-890.

6. Армитидж Ф., Уолден Р., Дрейпер Д. Агробактериальные трансформирующие векторы растений // Генная инженерия растений. Лабораторное руководство: Пер с англ. / Под ред. Дж Дрейпера и др. М.: Мир, 1991.-С. 11-86.

7. Атанасов А. Изолирани култури от прашници на тютюн и захарно цвекло като средство за получаване на хаплоидии растения и хетерогенен по плоидност калус // Генет. и селекция (НРБ). 1973. - Т.6, № 6. - С. 501-507.

8. Атанасов А., Памуков И., Кунев Л., Неделчева С. Хомозиготни линии тютюн, получени от изолоровани в условия in vitro. 1. Диплоидизирани линии от линия Шумен 13 // Генет. и селекция (НРБ). 1978. - Т. 11, № 4. - С. 297301.

9. Атанасов А.И. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 1993.-242 с.

10. Базько Л.В. Влияние генотипа и основной среды на индукцию эмбриогенеза и регенерацию растений в пыльниковой культуре пшеницы // Прогресс в селекции озимой пшеницы как фактор интенсификации производства зерна Мироновка, 1988. - С. 38^12.

11. Бойко Г.Н. Рост изолированных зародышей плодовых растений в стерильной культуре // Сб. науч. работ ВНИИ садоводства. 1971. - № 15. - С. 75-79.

12. Бондаренко О.В. Гаметоклональная изменчивость в культуре пыльников пшеницы // Пробл. теор. и прикл. генет. в Казахстане: Матер. Респ. конф., Алма-Ата, 18-22 ноября, 1990.-Алма-Ата, 1990.-С. 107-108.

13. Бохорова Н., Ланджева С. Цитогенетична характеристика на антерна калусна култура от различноплоидни Helianthus L. // Генетю и селек. 1987. -Т. 196№6.-С. 509-516.

14. Бояджиев П. Калусогенез и регенерация в антерни култури от хибридни комбинации мека пшеница // Растениевъд. науки. 1986. - Т.23, № 2. - С. 1011.

15. Бояджиев П. Мариана нов сорт ориз, получен по метода на антерните културу // Растениевъд. науки 1990. - Т.27. № 6. - С. 111-113.

16. Бояджиев П., Фам В.К., Минков И.Н. Изследване на някои физиологични показатели от антерна култура на F. комбинация (Белозем х Пловдив) ориз //Физиол. раст. 1986. - Т. 12, № 2. - С. 70-74.

17. Бугара A.M., Русина JI.B. Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек in vitro как способ получения гаплоидных растений // Физиол. и биохимия культ, раст. 1988. - Т.20, № 5. - С. 419^30.

18. Бугара A.M., Русина J1.B., Егорова Н.А., Резникова С.А. Гаплоидный каллусогенез и органогенез в культуре неоплодотворенных семяпочек шалфея и кориандра // Тез. докл. V съезда генетиков и селекционеров Украины. Киев, 1986. -Ч. 1.-С. 159.

19. Бугара A.M., Русина JI.B., Резникова С.А. Эмбриоидогенез в культуре пыльников шалфея мускатного // Физиол. и биохимия культ, раст. 1986. -Т.18,№4.-С. 381-386.

20. Бурдасов В.М. Пути использования метода изолированных зародышей в селекции яблони // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. -М.: Колос, 1979.-С. 52-57.

21. Буренин В.И., Федорова М.И. Селекция по отдельным направлениям // Методы селекции и семеноводства овощных корнеплодных растений. М., 2003.-С. 161-177.

22. Бурова Э.А. Культура изолированных зародышей ирисов // Интродукция растений. Минск: Наука и техника, 1976. - С. 23-29.

23. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений и биотехнологии на их основе: Учеб. пособие. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.

24. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. - 272 с.

25. Бутенко Р.Г., Кучко А.А. Получение межвидового соматического гибрида картофеля методом слияния изолированных протопластов // Докл. АН СССР. 1979. - Т.247, № 2. - С. 491^195.

26. Бхандари Н.Н. Микроспорангий // Эмбриология растений: использование в генетике, селекции, биотехнологии: в 2-х томах. Т. 1 / Пер. с англ. Под ред. И.П. Ермакова. М.: Агропромиздат, 1990. - С. 66-146.

27. Васильева В.Е., Батыгина Т.Б. Культивирование in vitro зародышей и семяпочек лотоса, изолированных на разных стадиях развития // Физиол раст. -1981.-Т.28,№ 2.-С. 319-327.

28. Васильчук Н.С., Дьячук Т.И., Тучин С.В. Биотехнологические методы в селекции пшеницы и ячменя достижения и перспективы // Достижения науки и техники в АПК. - 2003. - № 10. - С. 34-38.

29. Велева Н., Загорска Н. Съвременно състояние на въпроса за индуцирания андрогенезис при картофите // Гене, и селек. 1990. - Т.23, № 5. -С.499-507.

30. Винецкий Ю.П. Сладкие белки и их гены // Биотехнология. 1987. -Т.З, № 5. - С. 553-558.

31. Винклер Г., Айрапетян Э. Метод культуры каллуса в семеноводстве картофеля // Картофель и овощи. 1972. - № 2. - С. 42-43.

32. Внучкова В.А. Получение гаплоидов из пыльников тритикале и их цитологическая характеристика // Докл. ВАСХНИЛ. 19796. - № 10. - С. 8-10.

33. Внучкова В.А. Разработка метода получения растений-регенерантов томата в условиях культуры ткани // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. М.: Колос, 1979а. - С. 14-23.

34. Воробьева Г.А., Приходько Н.И. Использование культуры зародышей in vitro для получения межвидовых гибридов томатов // Тр. по прикл. ботан., генет. и селекции ВНИИ растениевод. 1980. - Т.63, № 3. - С. 64-74.

35. Вутева С., Загорска Н. Индуциран фндрогенезис при различии генотипове Datura innoxia Mill. // Генет. и селек. 1990. - Т.23, № 1. - С.Ъ9-А1.

36. Высоцкая Е.Ф., Гамбург К.З. К вопросу о природе «фактора кондиционирования» при изолированной культуре растительных клеток // Физиол. рас. 1975. - Т.22, Вып. 1. - С. 63-89.

37. Высоцкий В.А. Метод культуры изолированных тканей в питомниках // С.-х. за рубежом. 1981. - № 4. - С. 11-13.

38. Гавел Д., Новак Ф.Й. Использование культуры тканей в селекции лука (Allium сера L.) // Культура клеток растений и биотехнология: Тез. докл. IV Всесоюз. конф. 3-6 октября 1983 г. Кишинев, 1983. - С. 141.

39. Гаврикова В.Г., Трушечкин В.Г. Культура пыльников земляник // Пробл. интенсиф. садовод, в нечерноземной зоне РСФСР. М., 1989. - С. 7377.

40. Гланц С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. М.: Практика, 1998.-459 с.

41. Глеба Ю.Ю. Гибридизация соматических клеток растений // Культура клеток растений. М.: Наука, 1981. - С. 85-91.

42. Голубинская Е.С. Культура изолированных зародышей пиона // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. М.: Наука, 1970. -С. 45-47.

43. ГОСТ 12038-84 // Семена сельскохозяйственных культур: Методы определения качества. М.: Изд-во стандартов, 1991. - Ч. 2. - 416 с.

44. Гродзинский A.M., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений. 2-е изд., перераб. и доп. Киев: Наукова думка.1973. -592 с.

45. Гужов Ю. Л., Фукс А., Валичек П. Селекция и семеноводство культивируемых растений: Учебник / Под ред. Ю.Л. Гужова. М.: Изд-во РУДН, 1999.-536 с.

46. Давоян Э.И. Получение гаплоидов у риса методом культивирования неоплодотворенных завязей в условиях in vitro II Докл. ИФСХНИЛ. 1985. -Вып. 3. - С. 15-16.

47. Данвелл Д.М. Культура гаплоидных клеток // Биотехнология растений: культура клеток: Пер. с англ. М.: Агропромиздат, 1989. - С. 33-51.

48. Данилина А.Н., Лусс Е.В., Бутенко Р.Г. Особенности дифференциации специализированных клеток моркови и характеристика нарастания каллуса // Физиол. раст. 1965. - Т. 12, Вып. 3. - С. 469- 478.

49. Данилова С.А. Оптимизация агробактериального метода трансформации кукурузы: Автореф. дисканд. биол. наук. М., 2001. - 24 с.

50. Данилова Т.В. Оптимизация методики получения гаплоидов мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) в культуре пыльников in vitro и возможности их использования в селекции: Автореф. дис. канд. биол. наук. -М., 2000. 16 с.

51. Дейнеко Е.В., Филипенко М.Л., Храпов Е.А., Загорская А.А., Филипенко Е.А, Тюкавин Г.Б, Шмыкова Н.А., Сенников С.В., Шумный В.К.

52. Создание трансгенных растений табака и моркови с геном интерлейкина-18 человека // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. III международной научной конференции 19 октября 2004. Москва, 2004.-С. 130-131.

53. Диба А., Айрапетян Э., Винклер Г., Бутенко Р. Освещение и морфогенез изолированных меристем // Картофель и овощи. 1972. - № 3. - С. 44.

54. Долбик A.M., Бычко Е.А. Клональное микроразмножение тетраплоидных форм сахарной свеклы // Биотехнологические методы в селекции сахарной свеклы М., 1989. - С. 11-14.

55. Долгов С.В., Шушкова Т.В., Тюкавин Г.Б. Генетическая трансформация моркови (Daucus carota L.) // Биоорганика-2000: Тез. докл. V чтений, посвященных памяти Ю.А. Овчинникова 13-20 ноября 2000. Москва-Пущино, 2000. - С. 95.

56. Долголаптев В.Г. Работа в Excel 7.0 для Windows 95 на примерах. М.: БИНОМ, 1995.-384 с.

57. Доросиев JL, Атанасов А., Събева 3., Станоева JI. Индуциран андрогенез при антери на Triticale in vitro. 1. Калусогенез и органогенез // Генет. и селекция. 1978. - T.l 1, № 2-3. - С. 168-176.

58. Дорохов Д.Б., Клоке Э. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов // Генетика. 1997. - Т 33, № 4. - С. 476-483.

59. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). 5-е изд., доп. и перераб. М.: Агропромиздат, 1958.-351 с.

60. Достал И., Сыкорова С. Использование эмбриональных культур у пшеницы // Tag. Ber., Akad. Landwirtsch. Wiss. DDR, Berlin - 1983. - V.207. -P. 63-66.

61. Дьячук П.А., Дьячук Т.И., Кудашкина С.В., Сафронова Н.Ф., Давыдов С.Д. Получение гаплоидных растений мягкой яровой пшеницы саратовских сортов в культуре пыльников // Докл. ВАСХНИЛ. 1986. - № 10. - С. 3-4.

62. Дюк В. Обработка данных на ПК в примерах. СПб.: Питер, 1997. -240 с.

63. Евсеева З.П., Кравцов П.В. Влияние гибберелловой кислоты на прорастание изолированных зародышей яблони и груши в условиях стерильной культуры // Тр. Центр, генет. лаб. им. И.В. Мичурина. 1971. - № 18. - С. 3942.

64. Еналеева Н.Х., Тырнов B.C., Хохлов С.С. Выделение зародышевых мешков покрытосеменных растений путем мацерации тканей // Цитология и генетика. 1972. - Т.6, № 5. - С. 429-441.

65. Еременко Л.Л. Морфологические особенности овощных растений в связи с семенной продуктивностью. Новосибирск: Наука, 1975. - 472 с.

66. Ермаков А.И. Арасимович В.В., Ярош Н.П., Перуанский Ю.В., Луковникова Г.А., Иконникова М.И. Методы биохимического исследования растений / Под ред. А.И. Ермакова. 3-е изд., перераб и доп. - Л.: Агропромиздат. Ленингр. отд-ние, 1987. - 430 с.

67. Жабина В.А. Некоторые вопросы цитоэмбриологии и эмбриокультуры тритикально-пшеничных гибридов // Биология, селекция и семеноводство зерновых культур. Каменная степь, 1981. - С. 107-116.

68. Жуков О.С., Олейникова О.Я. К проблеме получения гаплоидных форм вишни // Бюл. науч. инф. Центр, генет. лаб. 1989. - № 7. - С. 21-24.

69. Жученко А.А., Салтанович Т.И., Кравченко А.Н., Смирнов А.А. Возможности использования метода культуры зародышей в селекции томатов // Культура клеток растений и биотехнология: Тез. докл. IV Всесоюз. конф. 3-6 октября 1983 г. Кишинев, 1983. - С. 193.

70. Загорска Н. Получаване на хаплоидии и хомозиготни форми от хибриди при N. tabacum в тьканни култури // Науч. тр. Ин-т тютюна и тютюневите изделия. Пловдив, 1977. - № 6. - С. 61-70.

71. Загорска Н., Палакарчева М. Используване метода на антерните и тъканните култури за съкращаване на селекционния процеспри тютюна // Растениевъдни науки. 1976. - Т. 13, № 10. - С. 24-33.

72. Загорска Н., Палакарчева М., Шабанов Д., Попристев В. Хомозиготни линии тютюн, получени при идуцирован андрогенез // Генет. и селекция. -1978.-T.il, №2-3.-С. 177-186.

73. Загорска Н.А., Шамина З.Б. Изучение растений-регенерантов, полученных в культуре тканей табака // Генетика. 1971. - Т.7, № 3. - С. 23-26.

74. Загорска Н.А., Шамина З.Б. Способность к регенерации в культурах тканей разного происхождения // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. М.: Наука, 1970. - С. 158- 163.

75. Зайкина Т.Ф., Суханов В.М., Тырнов B.C. Способ получения растений злаковых культур из пыльцы // А.с. 1276309, СССР. Заявл. 01.04.85, № 3868302/30-15, опубл. в Б.И., 1986.-№ 46.-МКИ А 01 НЗ/00.

76. Здруйковская-Рихтер А.И. Культивирование апомиктических зародышей in vitro //Апомиксис и селекция. М.: Наука, 1970. - С. 165-170.

77. Здруйковская-Рихтер А.И. Культура зародышей in vitro и получение новых форм растений: Автореф. дис. д-ра биол. наук. М., 1981. - 32 с.

78. Здруйковская-Рихтер А.И. Культура зародышей in vitro как метод селекции // Цитологические и цитоэмбриологические методы в селекции плодовых и ягодных культур. М.: Колос, 1973. - С. 34-39.

79. Здруйковская-Рихтер А.И. Культура изолированных зародышей и генеративных органов как метод селекции плодовых растений // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. М.: Колос, 1979. - С. 57-70.

80. Здруйковская-Рихтер А.И. Культура незрелых зародышей миндаля от межвидовой гибридизации и свободного опыления // Бюл. Гл. бот. сада АН СССР. 1980. - № 115. - С. 85-90.

81. Здруйковская-Рихтер А.И. Получение раносозревающих форм черешни Cerasus avium (L.) Moench. из зародышей в культуре in vitro II Докл. сов. ученых к XIX Междунар. конгр. по садоводству. Варшава, 1974. М.: Колос, 1974.-С. 82-85.

82. Здруйковская-Рихтер А.И. Получение сортов плодовых растений in vitro методом культуры изолированных зародышей // Докл. АН СССР. 1985. -№ 1. - С. 246-249.

83. Здруйковская-Рихтер А.И., Хроликова А.Х. Получение новых форм груши из зародышей в культуре in vitro II С.-х. биол. 1975. - Вып. 10., № 4. -С. 518-521.

84. Знаменская В.В., Жужжалова Т.П. Микроклональное размножение сахарной свеклы: Методические рекомендации. Воронеж, 1995. - 23 с.

85. Зубкус Л.П. Культура зародышей и семян на искусственных питательных средах как метод интродукции декоративных растений Сибири // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. М.: Наука, 1970. -С. 36-41.

86. Иванов Г.И. Биотехнологические аспекты создания исходного материала для селекции зерновых колосовых культур: Автореф. дис. . д-ра биол наук. Краснодар, 2006. - 45 с.

87. Иванов М.А. Экспериментальное получение гаплоидов у Nicotiana rus-tica (со специальным рассмотрением гаплоидии у цветковых растений // Изв. Биол.-геогр. НИИ при Вост.- Сиб. гос. ун-те. 1937. - Т.7, № 3-4. - С. 71-156.

88. Игнатова С.И. Метод культуры тканей в селекции // Сборник статей молодых ученых и аспирантов. М., 1974. - Вып. 6. - С. 119-122.

89. Ипатова Н.В. Оценка исходного материала столовой моркови на устойчивость к фузариозу и альтернариозу с использованием методов традиционной и клеточной селекции: Автореф. дис. . канд. с.-х. наук. М., -21 с.

90. ИСТА // Методика анализа семян. М., 1995. - 400 с.

91. Калашникова Е.А. Клеточная инженерия // Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии. М., - 1996. - С. 3- 57.

92. Калинин А.В. Метод культивирования пыльников в селекции картофеля // Исследования по клеточной селекции картофеля. М., - 1984. - С. 62-68.

93. Калинин Ф.Л. Выращивание незрелых зародышей в искусственных условиях // Тр. Ботан. сада Киев, ун-та. 19516. -№ 20. - С. 46-58.

94. Калинин Ф.Л. Культура изолированных зародышей, как возможный путь переделки природы растений // Тр. Ин-та физиологии растений 1951а, -№7, Вып. 7.-С. 153-192.

95. Калинин Ф.Л. Культура незрелых зародышей редьки Raphanus sativus Z. в искусственных условиях // Докл. АН СССР. 1949. - Т.66, № 6. - С. 11911194.

96. Калинин Ф.Л. Некоторые закономерности развития зародыша редьки Raphanus sativus Z. на материнском растении // Докл. АН СССР. 1950а. - Т.71. №5.-С. 945-948.

97. Калинин Ф.Л., Полищук В.Е. Фосфолипидный состав митохондриальных мембран нормальных и опухолевых клеток в культуре in vitro //Культура клеток растений: Тр. II Всесоюз. конф. Киев: Наукова думка, 1978.-С. 158-162.

98. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Наукова думка, 1980. - 488 с.

99. Калшш Ф.Л. До методики культивування незрших зародюв рослин // Доп. АН УРСР. 19506. -№ 4. - С. 325-330.

100. Каменецкая И.И. Регенерация растений из изолированных почек луков // Изв. АН КазССР / Сер. биол. 1982. - № 4. - С. 12-16.

101. Каменецкая И.И., Рахимбаев И.Р. Органогенез в культуре изолированных тканей луков // Вестн. ФР КазССР. 1982. - № 9. -С. 43-47.

102. Катаева Н.В., Аветисов В.А. Клональное размножение растений в культуре ткани // Культура клеток растений. М.: Наука, 1981. - С. 137-149.

103. Кефели В.И. Рост растений. 2-е изд., перераб. и доп. М.: Колос, 1984. - 175 с.

104. Киселева Н.С., Шелухин Н.В. Атлас по анатомии растений. Под ред. С.В.Калишевича. Минск: Вышэйшая школа, 1969. - 288 с.

105. Клейн P.M., Клейн Д.Т. Методы исследования растений / Пер. с англ. и предисл. В.И.Мельгунова. М.: Колос, 1974. - 528 с.

106. Кожахметов М.К., Шегебаев О.Ш. Размножение сахарной свеклы в культуре in vitro // Вестн. с.-х. науки Казахстана. 1989. -№ 8. - С. 22-26.

107. Кожин А.В., Кравцов П.В. Влияние пиридоксина на рост изолированных зародышей яблони и груши в стерильной культуре // Физиология растений. 1973. - Т.20, Вып. 4. - С. 693-699.

108. Колесников А.И. Колхицин и получение новых форм сельскохозяйственных растений. Л.: Колос, Ленингр. отд-ние, 1972 - 128 с.

109. Конорев А.В. Использование молекулярных маркеров в работе с генетическими ресурсами растений // С.-х. биол., 1998. - № 5. - С. 3-25.

110. Конотоп А.И., Кузьменко А.Д. Получение межвидовых гибридов табака с помощью культуры тканей // 3-я Всесоюз. конф. Культура растительных клеток раст.: Тез. докл. Абовян, 1979. - С. 185-186.

111. Константинов А.В. Мейоз. Мн., Изд-во БГУ, 1971. - 180 с.

112. Кордюм Е.А. Цито-эмбриология семейства зонтичных. Киев: Наукова думка, 1967.- 176 с.

113. Кордюм Е.Л., Веледницкая Д.Л. Особенности развития тапетума пыльника и микроспорогенез у ряда представителей Umbelliferae // Бот. журн. -1964. Т. 49. № 11. - С. 1609- 1615.

114. Корнеева И.А, Долгов С.В. Получение трансгенных растений томата, несущих ген суперсладкого белка тауматина // Материалы Междунар. научнопракт. конф. по пасленовым культурам, Астрахань, 19-22 авг. 2003. -Астрахань, 2004. С. 119-125.

115. Коршикова Н.Т. Получение отдаленных гибридов лилий методом культуры зародышей на искусственной среде // Бюл. Главного бот. сада. 1981. -Вып. 120.-С. 77-80.

116. Кравцов П.В. Действие регуляторов роста на дифференциацию и органогенез зародышей плодовых растений в стерильной культуре // Применение физиологически активных веществ в садоводстве. 1974. - № 2. -С. 87-94.

117. Кравцов П.В. Рост изолированных зародышей яблони на среде с различными концентрациями агара в стерильной культуре // Бюл. науч. информ. Центр, генет. лаб. им. И.В. Мичурина. 1971. - № 18. - С. 43-48.

118. Кравцов П.В., Касьянова В.Г. Культура изолированных зародышей как метод преодоления стерильности отдаленных гибридов плодовых растений // Физиол. раст. 1968. - Т. 15, Вып. 5. - С. 931-933.

119. Кравцов П.В., Касьянова В.Г. Опыт применения изолированных зародышей для преодоления стерильности отдаленных гибридов плодовых растений // Тр. Центр, генет. лаб. им. И.В. Мичурина. 1969. - № 10. - С. 236244.

120. Кравцов П.В., Кравцова J1.B. Культура изолированных зародышей и перспективы ее использования в селекции плодовых растений // Биофизические и физиолого-биохимические исследования плодовых и ягодных культур. М.: Колос, 1974.-С. 133-141.

121. Кравцов П.В., Кравцова JI.B. Рост изолированных зародышей и семян плодовых растений в условиях стерильной культуры при добавлении в питательную среду дрожжевого экстракта // Тр. Центр, генет. лаб. им. И.В. Мичурина. 1971. - № 12. - С. 241-244.

122. Кравцов П.В., Нафталиев Н.М. Влияние покровов семени и пониженных температур на зародыши яблони и груши при эксплантации в процессе развития. М., 1976. - Деп. в ВИНИТИ 14. 05. 76, № 1680-76.

123. Круг Г. Овощеводство / Пер. с нем. В.И. Леунова. М.: Колос, 2000. -576 с.

124. Кунах В.А. Цитогенетическая изменчивость клеточных популяций в культуре изолированных тканей растений // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. М.: Колос, 1979. - С. 38-51.

125. Курсаков Г.А. Межродовая и межвидовая гибридизация плодовых культур и искусственная культура зародышей // Отдаленная гибридизация растений и животных. М.: Колос, 19706. - Т.2. - С. 123- 126.

126. Курсаков Г.А. Опыт использования и пути применения искусственной культуры зародышей в селекции зимостойких форм плодовых растений // Биофизические и физиолого-биохимические исследования плодовых и ягодных культур. -М.: Колос, 19746. С. 141- 145.

127. Курсаков Г.А. Опыт применения искусственной культуры зародышей при отдаленной гибридизации сливы // Тр. Центр, генет. лаб. им. И.В. Мичурина. 1967. -№ 9. - С. 120-124.

128. Курсаков Г.А. Применение изолированной культуры зародышей и тканей при отдаленной гибридизации // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. М.: Колос, 1979. - С. 70-77.

129. Курсаков Г.А. Применение искусственной культуры зародышей in vitro при отдаленных скрещиваниях косточковых культур // Тр. Цент, генет. лаб. им. И.В. Мичурина. 1974а. - № 15. - С. 11-22.

130. Курсаков Г.А. Применение культуры изолированных зародышей при отдаленной гибридизации сливы // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. М.: Наука, 1970а. - С. 47-50.

131. Курсаков Г.А., Дубовицкая JI.A., Мячина О.С. Некоторые особенности тканевых культур отдаленных гибридов косточковых растений // 3-я Всесоюз. конф. Культура растительных клеток раст.: Тез. докл. Абовян, 1979. - С. 193.

132. Курсаков Г.А., Панфилкина Т.И. Применение искусственной культуры зародышей при отдаленной гибридизации моравской рябины // Бюл. науч. информ. Центр, генет. лаб. им. И.В. Мичурина. 1976. -Вып. 23. - С. 3-6.

133. Курсаков Г.А., Панфилкина Т.И. Скрещиваемость и применение искусственной культуры зародышей при отдаленной гибридизации рябины // Бюл. науч. информ. Центр, генет. лаб. им. И.В. Мичурина. 1974. -Вып. 21. -С. 18-21.

134. Кучеренко J1.A., Давоян Э.И. Культивирование незрелых зародышей риса // Бюл. науч. техн. информ. ВНИИ риса. 1975. - вып. 19. - С. 6-9.

135. Кучеренко J1.A., Харченко П.Н., Давоян Э.И. О возможности применения методов культуры изолированных органов и тканей в селекции риса // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. М.: Колос, 1979. -С. 31-38.

136. Кучеренко JI.A., Харченко П.Н., Давоян Э.И. О получении всходов из щуплых семян риса на питательных средах // Бюл. науч. техн. информ. ВНИИ риса.- 1975.-Вып. 16.-С. 3-5.

137. Кучко А.А., Бутенко Р.Г., Тарасенко В.А. Соматическая гибридизация картофеля // С.-х. биология. 1983. - № 7. - С. 54-57.

138. Кучук Н.В. Генетическая инженерия высших растений. Киев: Наукова думка, 1997.- 152 с.

139. Лакин Г.Ф. Биометрия. 3-е изд., перераб. и доп. М.: Высшая школа, 1980.-293 с.

140. Лаптева М.Н. Разработка методов молекулярной оценки селекционного материала основных овощных культур (лук, морковь, капуста белокочанная) на основе RAPD технологии: Автореф. дис. канд. с.-х. наук. М., 1999. - 25 с.

141. Ларькина Н.И. Преодоление барьера несовместимости между видами Nicotiana при использовании опыления in vitro // 3-я Всесоюз. конф. Культура растительных клеток раст.: Тез. докл. Абовян, 1979. - С. 186.

142. Лебедев В.Г. Генно-инженерные методы в селекции груши обыкновенной (Pyrus communis L.) на устойчивость к биотическим и абиотическим факторам: Автореф. дис. . канд. биол. наук. -М., 2000. -20 с.

143. Левенко В.А. Получение гаплоидов из пыльников растений // Экспериментальная полиплоидия у культурных растений. Киев: Наукова думка, 1974.-С. 25-39.

144. Левенко В.А. Применение культуры изолированных клеток, тканей и органов растений в генетике и селекции // Общая генетика / Генетика и селекция сельскохозяйственных растений. М., 1978. - Т.5. - С. 158- 206.

145. Левитес Е.В. Генетика изоферментов растений. Новосибирск: Наука, 1986.- 145 с.

146. Лейке Г., Лабес Р., Эртель К., Петерсдорф М. Использование культуры тканей и органов в селекции растений и производстве посадочного материала: Пер. с нем. М.: Колос, 1980. - 77 с.

147. Леунов В.И., Рыбалко А.А., Михеев Ю.Г., Клыгина Т.Э., Ховрин А.Н. Селекция и семеноводство моркови столовой. М., 2006. - 234 с.

148. Литвинова М.К. Морковь Daucus carota L. (биологические особенности, селекция и семеноводство, агротехника возделывания). - Пенза, 2001а.-144 с.

149. Лу Чжихуа Культура изолированных пыльников тополей и естественное удвоение числа хромосом у дерева из пыльцы // Лесовод, лес. культуры и почвовед. Л.,1987. - С. 74-78.

150. Лукьянюк С.Ф., Игнатова С.А. Выявление генетического разнообразия у тритикале при получении гаплоидов // Адаптация и рекомбиногенез у культурных растений: Тез. докл. Всес. конф. Кишинев, 1979. - С. 61-62.

151. Лукьянюк С.Ф., Игнатова С.А., Максимов Н.Г., Максимова В.И., Шеремет A.M. Использование эмбриокультуры при отдаленных скрещиваниях пшеницы и ячменя с рожью // С.-х. биол. 1981. - Вып. 16, № 5. - С 735-739.

152. Лукьянюк С.Ф., Махновская М., Игнатова С.А., Максимов Н.Г. Роль генотипа в гаплопродукции тритикале // Науч.-техн. бюл. Всес. селекц.-генет. ин-та ВАСХНИЛ. 1988. - № 2. - С. 43-47.

153. Макаров П.П. Применение биотехнологических методов в селекции и семеноводстве картофеля // Селекция и биотехнология картофеля / НИИ картоф. х-ва М., 1990. - С. 116-136.

154. Манешына Т.В., Грыб У.М. Картэль М.А. Калусаутварэнне i рэгенерацыя раслш з двухтыдневых эмбрыёнауячменю // Весщ АН БССР. Сер. Б1ял. н., Изв. АН БССР. Сер. Б1ял. н. 1980. -№ 5. - С. 29-31.

155. Маркова Н.В., Донец Н.В., Бутенко Р.Г. Использование культуры меристемы для клонального размножения огурца in vitro // Докл. ВАСХНИЛ.1989.-№8.-С. 11-13.

156. Маруненко И.М., Кучко А.А. Каллусогенез и эмбриогенез в культуре пыльников картофеля // Цитол. и генет. 1989. - Т.23, № 3. - С. 48-51.

157. Маруненко И.М., Кучко А.А., Бутенко Р.Г. Андрогенез и получение растений в культуре пыльников картофеля // Сельскохозяйственная биология.1990.-№1.- С. 138-143.

158. Маруненко И.М., Кучко А.А., Бутенко Р.Г. Физиологические аспекты получения гаплоидов картофеля методом культуры пыльников // Физиол. раст. 1988.-Т.35,№1.-С. 136-143.

159. Марьяхина И.Я. Характер морфогенеза в размножении кочанной капусты в культуре ткани при использовании различных стимуляторов роста // С.-х. биология. 1981. - Т.16, № 2. - С. 246-252.

160. Марьяхина И.Я., Крашенинник Н.В., Китаева И.Е. Разработка метода клонового размножения кочанной капусты в культуре ткани // Докл. ВАСХНИЛ. 1979. -№7. - С. 15-16.

161. Марьяхина И.Я., Крашенинник Н.В., Китаева И.Е. Способ получения семян капусты // Авт. св. СССР, кл. АО 1Р1/04, № 816439, заявл. 24.10.79, № 2845232/30-15, опубл. 30.03.81.

162. Марьяхина И.Я., Полумордвинова И.В., Козлова Н.М. Клональное размножение растений лука и формирование полиплоидных форм in vitro // С.-х. биология. 1983. -№ 6. - С. 16-21.

163. Матвеев В.П., Рубцов М.И. Овощеводство. 3-е изд. перераб. и доп. -М.: Агропромиздат, 1985.-431 с.

164. Мезенцев А.В. Методические указания по регенерации и размножению люцерны с использованием культуры тканей, клеток и протопластов. М.: Изд-во В АСХНИЛ. 1980.-25 с.

165. Мелик-Саркисов О.С., Овчинников В.Н., Ульянов Р.П. Получение безвирусного посадочного материала картофеля микроклубнями, индуцированными в культуре in vitro: Методические рекомендации. М., 1985. -16 с.

166. Модяева Т.В. Получение регенерантов капусты белокочанной методом андрогенеза // Молодые ученые интенсификации сельского хозяйства: Тез. докл. науч.-практ. конф., 26-27 июня 1990. Рига, 1990. - С. 90-91.

167. Монахова М.А. Цитогенетические аспекты организации интерфазного ядра // Успехи соврем, биол. 1990. - Т. 100, Вып. 2, № 5. С. - 163-179.

168. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Прокофьев М.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. -М.: Агропромиздат, 1990. 384 с.

169. Нам И.Я-Г. Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. М., 2004.-43 с.

170. Николаева З.В. К методике выращивания зародышей хлопчатника на искусственных питательных средах // Науч. тр. / Ташкент, ун-т. 1973 - Т. 439. -С. 271-271

171. Ницше В., Венцель Г. Гаплоиды в селекции растений: Пер. с нем. М.: Колос, 1980.- 128 с.

172. Новик Ф.И, Кубалакова М., Машкова И., Мичикова М. Влияние регуляторов роста на андрогенез хлорофильных мутантов Nicotiana tabacum // Цитол. и генет. 1980. - Т. 14, № 1. - С. 23-27.

173. Омельянчук Н.Ф., Шумный В.К. Изучение особенностей культивирования in vitro у различных видов овсов // Изв. СО АН СССР Сер. биол. н. 1986. - № 6. - С. 71-76.

174. Павленко Л.Г., Сыроватская А.П. Изучение регенерационной способности отдельных частей растения томата в культуре in vitro // Культура клеток растений и биотехнология: Тез. докл. IV Всесоюз. конф. 3-6 октября 1983 г. Кишинев, 1983. - С. 143-144.

175. Павлов А.Н., Смирнов A.M. Использование культуры изолированных зародышей для улучшения качества белка в зерне кукурузы // Биологические основы повышения качества семян с.-х. растений. -М.: Наука, 1964. С. 73-79.

176. Павлова М.К. Особенности возникновения клонов из отдельных клеток культивируемой ткани табака и их морфо-физиологические характеристики: Автореф. дис. канд. биол. наук. Киев, 1969. - 26 с.

177. Павлова М.К., Банникова В.П. Преодоление перекрестной несовместимости при отдаленной гибридизации методом культуры незрелых гибридных семян // С.-х. биотехнология. 1974. - Т.9, № 1. - С.23-27.

178. Павлова Н.К. Культура in vitro неоплодотворенных семяпочек Crepis tectorum L. // Культура клеток растений и биотехнология: Тез докл. IV Всесоюз. конф. 3-6 октября 1983. Кишинев, 1983. - С. 101.

179. Пандей Д.К. Индуцированный морфогенез и микроразмножение in vitro зизифуса индийского (Zizyphus mauritiana Lam.) и китайского (Zizyphus jujuba Mill.): Автореф. дис. канд. биол. наук. Ялта, 1996. - 25 с.

180. Папазян Н.Д. Стимуляция эмбриогенеза в пыльниках ячменя // Культура клеток растений: Тез. докл. 3-й Всесоюз. конф. Абовян, 1979. - С. 160-161.

181. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. 4-е изд., перераб. и доп. - М.: Агропромиздат, 1988. - 271 с.

182. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Колос, 1970. -255 с.

183. Петкова М. Доросиев JI. Эфективност на индуцироания атдрогенез при култура на антери от тютюна в зависимост от състава на хранителната среда // Генет. и селекция. 1980. - Т.13, № 2. - С. 97-103.

184. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений. М.: Наука, 1988.-304 с.

185. Платонова Р.Н., Абызова Л.В., Слюсаренко А.Г. Получение гаплоидных растений in vitro Gerbera jamesonii // Изв. АН СССР. Сур. биол. -1985.-№8.-С. 862-869.

186. Плащев В.М. Действие нистатина на внутреннюю инфекцию семян моркови // Тр. по прикл. ботан., генет и селекции ВНИИ растениеводства. -1982а. -Т.71, Вып. 3. С. 145-146.

187. Плащев В.М. Неоднородность начальных стадий каллусогенеза у различных эколого-географических подвидов моркови // Тр. по прикл. ботан., генет и селекции ВНИИ растениеводства. 19826. - Т.71, Вып. 3. - С. 124-128.

188. Плохинский Н.А. Биометрия. 2-е изд. М.: Изд-во Московского университета, 1970. - 368 с.

189. Поддубная-Арнольди В.А., Селезнева В.А. Выращивание орхидей из семян //Тр. Гл. бот. сада. 1953. - Т.З. - С. 106-124.

190. Поддубная-Арнольди В.А., Селезнева В.А. Орхидеи и их культура. -М.: Изд-во АН СССР. 1957.

191. Полевая B.C., Яшина С.Г., Олейникова Т.А. Размножение in vitro регенерантов томата из изолированных меристем // Физиол. раст. 1988. -Т.35,№3.-С. 612-617.

192. Полищук В.Е., Калинин Ф.Л., Жуковская И.Л. Особенности ультраструктурного строения опухолевой ткани моркови // Электронная микроскопия в ботанических исследованиях: Тез доел. IV Всесоюз. симпозиума. Рига: Зинатне, 1978. - С. 205-208.

193. Поляков А.В. Биотехнология в селекции льна. Тверь, 2000. - 180 с.

194. Поляков А.В. Усовершенствование селекционного процесса льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) на основе использования биотехнологических методов: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. М., 1998. - 50 с.

195. Попадьин П.В. Применение агробактериальной трансформации в селекции белокочанной капусты на устойчивость к болезням: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М., 2002. - 20 с.

196. Попов Ю.Г., Равкин А.С. Применение метода меристематических верхушек в селекционной работе с земляникой // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. М.: Колос, 1979. - С. 115-123.

197. Попов Ю.Г., Ускоренное размножение земляники с помощью метода культуры меристематических верхушек // С.-х. биология. 1977. - № 1. - С. 45-47.

198. Приходько Н.И. Влияние условий выращивания донорских растений на андрогенез в культуре пыльников пшеницы (Triticum aestivum L.) // Сб. науч. тр. по прикл. ботан., генет. и селекции / ВНИИ растениевод. 1989. - Вып. 128. -С. 86-89.

199. Приходько Н.И. Получение гаплоидных растений из пыльцевых зерен мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) // Тр. по прикл. ботан., генет. и селекции ВНИИ растениевод. 1980. - Т.67, № 3. - С. 75-79.

200. Приходько Н.И., Воробьева Г.А. Получение амфидигаплоидов и амфидиплоидов Lycopersikon eskulentum Mill х L. peruvianum Mill в культуре in vitro // Культура клеток растений: Тез. докл. 3-й Всесоюз. конф. Абовян, 1979. С. 183-184.

201. Прохоров И.А., Крючков А.В., Комиссаров В.А Селекция и семеноводство овощных культур / Под ред. В.А. Комиссарова. М.: Колос, 1981.-447 с.

202. Рахимбаев И.Р., Тивари Ш., Бишимбаева Н.К., Кушнаренко С.В., Азимова Е.Д. Биотехнология зерновых культур. Алма-Ата: Гылым, 1992. -240 с.

203. Резникова С.А. Цитология и физиология развивающегося пыльника. -М.: Наука, 1984.-272 с.

204. Ругузов И.А., Склонная Л.Я., Кожемякин А.В., Кузнецов С.И. Способ получения гаплоидного каллуса исчезающих видов кедра: А.С. 1497212 СССР ,МЮГ С 12 N 5/00 -№ 4522500/28-13; Заявл. 17.03.87; Опубл. 30.07.1989

205. Руте Т.Н. Выращивание меристемных растений огурца (Cucumis sativus L.) // Пол у растений и гетерозис Рига, 1979. - С. 88-94.

206. Руте Т.Н. Морфогенез в культуре каллусной ткани огурца // Культура клеток растений и биотехнология: Тез. докл. IV Всесоюз. конф. 3-6 октября 1983 г. Кишинев, 19836. - С. 89.

207. Руте Т.Н., Бутенко Р.Г., Мауриня Х.А. Действие физиологически активных веществ на сексуализацию растений огурца в условиях in vitro // Физиол. раст. 1981. - Т.28, № 6. - С. 1190-1197.

208. Руте Т.Н., Мауриня Х.А. Применение культуры изолированных апикальных меристем для изучения вопросов роста, развития и полоопределение у растений // Регуляция роста и метаболизма растений. -Таллин, 1983а.-С. 51-56.

209. Руте Т.Н., Мауриня Х.А. Размножение растений огурца в культуре in vitro // Культура клеток растений и биотехнология: Тез. докл. IV Всесоюз. конф. 3-6 октября 1983 г. Кишинев, 19836. - С. 90.

210. Рыбалко А.А. Корнеплодные культуры. Барнаул, 2005. - 23 с.

211. Сазонова JI. В., Буренин В.И., Тараканов Г.И. и др. Методические указания по селекции сортов и гетерозисных гибридов корнеплодных растений(морковь, свекла, редис, редька, репа, брюква, пастернак). М., 1987. -84 с.

212. Сазонова JI.B., Власова Э.А., Воскресенская В.В. Классификатор вида Daucus carota L. (Морковь мясистая). JI., 1990. - 27 с.

213. Сарнацкая В.В., Троян В.М., Желтоножская JI.B., Полищук В.Е., Яворская В.К., Ильченко JI.H., Мережинский Ю.Ю., Калинин Ф.Л. О связи индукции корончатогалловых опухолей растений с клеточным циклом // Цитология и генетика- 1976. Т. 10, № 5- С. 465-468.

214. Святченко Е.А. Получение in vitro гибридов Lycopersikon eskulentum с Lycopersikon peruvianum Mill, в условиях Молдавии // Экол. генет. раст. и животн. Тез. докл. Всесоюз. конф. Кишинев, 1981. Ч. 2. - С. 215-216.

215. Сеилова Л.Б., Амерханова М.Б. Микроклональное размножение в исследованиях с сахарной свеклой // Проблемы теоретической и прикладной генетики в Казахстане: Матер, конф., 18-22 ноября 1990. Алма-Ата, 1990. - С. 114-115.

216. Семенов А.Я., Потлайчук В.И. Болезни семян полевых культур. М.: Колос. Ленингр, отд-ние, 1982. - 128 с.

217. Семенова И.В., Ларькина Н.И., Казачек Т.И. Гаплоидия как метод индуцирования рекомбинантов при межсортовой и межвидовой гибридизации табака // Экол. генет. раст. и животн.: Тез докл. Всес. конф. 1981. - Кишинев, 1981.-Ч. 2.-С. 132-133.

218. Семова Н.Ю. Разработка лабораторной технологии получения андрогенных растений белокочанной капусты с использованием культуры пыльников: Автореф. дис. канд. биол. наук. -М., 1992. 18 с.

219. Сечкарев Б.И. Морковь Daucus L. // Культурная флора СССР. Корнеплодные растения. - Л.: Колос, 1971. - С. 267-373.

220. Сидорова Т.Н., Тюкавин Г.Б., Долгов С.В. Генетическая трансформация моркови // Биотехнология овощных, бахчевых, цветочных и малораспространенных культур: Сборник науч. трудов Междунар. научно-практ. конф. 22-25 марта 2004 г. М., 2004. - С. 110-113.

221. Созинов А.А., Лукьянюк С.Ф., Игнатова С.А. Индукция гаплоидных растений тритикале при культивировании пыльников // Генет., селекц. и агротехн. тритикале. Одесса, 1980. - С. 7-20.

222. Солдатов B.C., Перышкина Н.Г. Искусственные почвы для растений. -Мн.: Наука и техника, 1985. 64 с.

223. Спицын И.П., Иванов О.В. Возможность использования культуры зародышей при гибридизации огурца // Биологический сборник. Тамбов, 1972.-С. 79-80.

224. Сулима Ю.Г., Лукьянюк С.Ф., Игнатова С.А. Получение гаплоидов тритикале методом культуры пыльников in vitro II Апомиксис у раст. и животн. / Тр. Биол. ин-та СО ФН СССР № 35. Новосибирск: Наука, 1978. - С. 206210.

225. Таганов Б.О. Разработка лабораторной технологии получения андрогенных растений моркови in vitro: Автореф . дис. . канд. с.-х. наук. М., 1991.-22 с.

226. Тародей И.В., Башарова Т.В. Использование гелий-неонового лазера для увеличения частоты гаплоидии в культуре пыльников пшеницы // Апомиксис и цитоэмбриология растений Саратов, 1987. - С. 13-19.

227. Терновский М.Ф., Бутенко Р.Г., Изман Г.В., Шинкарева И.К., Гаплоидные растения табака, полученные в культуре пыльников // Генетика. -1974.-Т.10, №2.-С. 42-47.

228. Терновский М.Ф., Бутенко Р.Г., Моисеева М.Е. Культура тканей и селекция растений // Полиплоидия и селекция. Минск, 1972. - С. 45-50.

229. Терновский М.Ф., Изман Г.В., Сарычев Ю.Ф. Индуцированные in vitro андрогаплоиды и реституционные диплоиды как исходный материал для анализа и отбора признаков в синтетической селекции // Генетика. 1975. Т.11, №9.-С. 8-14.

230. Терновский М.Ф., Шинкарева И.К., Ларькина Н.И. Получение межвидовых гибридов табака путем опыления семяпочек in vitro // Генетика. -1976. Т.12, № 10. - С. 40-45.

231. Тивари Ш. Регенерация гаплоидных растений в культуре пыльников ячменя // Каз. ун-т. Алма-Ата, 1988. - 15 с. - Деп. в КазНИИНТИ 04.03.88., 2003-Ка8 8.

232. Тимин Н.И. Методы создания и идентификация генетических источников ценных признаков овощных растений (морковь, лук, салат): Автореф. дис. д-ра с.-х. наук. С.-Петербург, 1997. - 61 с.

233. Тимин Н.И., Валеева З.Т., Пыжьянова Л.Г. Индуцированный апомиксис моркови и получение гомозиготных форм растений // Селекция овощных культур / Сб. науч. трудов. М., 1994. - Вып. 34. - С. 11-16.

234. Тиссера Б. Эмбриогенез, органогенез и регенерация растений // Биотехнология растений: культура клеток: Пер. с англ. М.: Агропромиздат, 1989.-С. 97-127.

235. Титова И.В. Преодоление постгамной несовместимости в скрещиваниях лука репчатого с дикими видами методом культуры зародышей // Культура клеток растений и биотехнология: Тез. докл. IV Всесоюз. конф. 3-6 октября 1983 г.-Кишинев, 1983.-С. 190.

236. Титова И.И., Тимин Н.И., Юрьева Н.А., Дмитриева Н.Н Применение метода культуры изолированных зародышей в межвидовой гибридизации лука // Тр. ВНИИ селекции и семеновод, овощ, культур. 1982. - Вып. 15. - С. 5765.

237. Ткачев А.А., Поляков А.В. Регенерация растений огурца in vitro II Биотехнология овощных, бахчевых, цветочных и малораспространенных культур: Сборник науч. трудов Междунар. научно-практ. конф. 22-25 марта 2004г.-М., 2004.-С. 118-121.

238. Токин Б.П. Целебные яды растений. 2-е изд. перераб. Л.: Лениздат, 1974.-344 с.

239. Токин Б.П. Целебные яды растений. Повесть о фитонцидах. 3-е изд. испр. и доп. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та. 1980. - 280 с.

240. Трофимец Л.Н., Волкова Т.В., Миренкова Н.Н. Метод культуры тканей в картофелеводстве // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. -М.: Колос, 1979.-С. 123-128.

241. Трофимец JI.H., Остапенко Д.П., Бойко В.В., Зейрук Т.В., Донец Н.В. Оздоровление и ускоренное размножение семенного картофеля: Методические рекомендации. М., 1985. - 35 с.

242. Тураев A.M. Каллусогенез и деградация микроспор в культуре пыльников хлопчатника // Проблемы современной биологии / Тр. 17 Науч. конф. мол. ученых биол. фак. МГУ, 22-25 апр., 1986. М., 1986. - Ч. 1. - С. -186-190. - Деп. в ВИНИТИ 12.09.86. № 6642-В.

243. Тураев A.M., Шамина З.Б. Оптимизация состава среды для культивирования пыльников хлопчатника // Физиол. раст. 1986. - Т.ЗЗ, № 3. -С. 565-571.

244. Турбин Н.В. Генетика гетерозиса и методы селекции растений на комбинационную способность // Генетические основы селекции растений. М.: Наука, 1971.-С. 112-155.

245. Туровская Н.И., Матушкина О.В., Пронина И.Н. Методические указания по микроклональному размножению клоновых подвоев яблони и груши. -М., 1996. 17 с.

246. Тырнов B.C. Гаплоидия у растений: Научное и прикладное значение. -М.: Наука, 1998.-53 с.

247. Тюкавин Г.Б. Культура пыльников моркови метод ускоренного получения фертильных линий для гетерозисной селекции // Селекщя овочевих i баштанних культур на гетерозис: Тез. допов. М1жнар. наук. конф. - Харюв, 1996.-С. 81-82.

248. Тюкавин Г.Б. Получение неинфицированных зародышей моркови для культивирования in vitro // Селекция овощных культур / Сб. науч. трудов. М., 1989.-Вып. 28. - С.81-86.

249. Тюкавин Г.Б., Таганов Б.О. Эмбриогенез в культуре пыльников растений моркови in vitro // Селекция овощных культур / Сб. науч. трудов. М., 1993.-Вып. 32.-С. 12-15.

250. Тюкавин Г.Б., Таганов Б.О., Наумова С.В. Индукция эмбриогенеза при культивировании пыльников моркови // Embryology and seed reproduction: Proc. XI Int. Symp. July 3-7, 1990. St. Petersburg, Nauka, 1992. - P. 562-563.

251. Тюкавин Г.Б., Тимин Н.И., Буракова И.А. Использование методов культуры тканей растений in vitro в селекции моркови // Науч. техн. бюл. ВИР. -Л., 1989.-Вып. 192.-С. 57-60.

252. Тюкавин Г.Б., Тимин Н.И., Валеева З.Т., Буракова И.А. Эмбриокультура в создании константных линий моркови // Биология культивируемых клеток и биотехнология: Тез. докл. Междунар. конф., 2-6 авг. 1988. Новосибирск, 1988. - Ч. 2. - С. 239-240.

253. Тюкавин Г.Б., Тимин Н.И., Титова И.В. Использование методов культуры тканей в селекции овощных культур // Селекция овощных культур / Сб. науч. трудов. М., 1984. - Вып. 18. - С. 43-48.

254. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Методические рекомендации по получению дигаплоидов моркови методом андрогенеза. М.: Россельхозакадемия, 2000. - 56 с.

255. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А., Монахова М.А. Цитология эмбриогенеза в культуре пыльников моркови // Физиология растений. 1999. - Т. 46., № 6. -С. 876-883.

256. Тюрин Ю.Н., Макаров А.А. Статистический анализ данных на компьютере / Под ред. В.Э. Фигурнова. М.: ИНФРА-М, 1988. - 528 с.

257. Уайт Ф.Р. Культура растительных тканей. М.: Иностранная литература, 1949. - 160 с.

258. Уизерс Л.А. Криосохранение и хранение генофонда // Биотехнология растений: культура клеток: Пер. с англ. М.: Агропромиздат, 1989. - С. 204233.

259. Уралец Л.И. Культура in vitro репродуктивных органов томатов и перспективы ее использования: Автореф. Дис. канд. биол. наук. М., 1982. -23 с.

260. Уралец Л.И. Органогенез в каллусных тканях огурца (Cucumis sativus L.) // Культура клеток растений и биотехнология: Тез. докл. IV Всесоюз. конф. 3-6 октября 1983 г. Кишинев, 1983. - С. 88-89.

261. Уралец Л.И. Получение гибридных семян томатов опылением пестиков in vitro // Физиология и биохимия культурных растений. 1981. - Т. 13, № 1. -С. 77-80.

262. Фирсова Э.К., Мезенцев А.В., Рубцов М.И. Межвидовая гибридизация клевера с использованием культуры зародышей // Селекция и семеноводство. -1980.-№1.-С. 16-18.

263. Фоменко Н.Р. Морфогенетические и цитоэмбриологические особенности онтогенеза апомиктичных растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L.): Автореф. дис. . канд. биол. наук. Рамонь, 2003. - 24 с.

264. Харченко П.Н. Получение гаплоидов и гомозиготных линий у риса методом in vitro: Автореф. дис. канд. биол. наук. Л., 1986. - 25 с.

265. Харченко П.Н., Кучеренко Л.А. Получение растений риса из пыльников // Докл. ВАСХНИЛ. 1977. - № 4. - С. 15-16.

266. Харченко П.Н., Шиловский В.Н. Использование метода культуры пыльников в ускорении селекционного процесса // Доклады ВАСХНИЛ. 1982. - № 9. - С. 24-25.

267. Хиросэ А. Современное состояние и перспективы биотехнологии растений: Лекция. М., 1986. - 42 с.

268. Хотылева Л.В., Ермишин А.П. Каллусообразование и стеблевой органогенез в культуре in vitro у дителоцентрических линий мягкой пшеницы сорта Чайниз Спринг // Докл. АН БССР. 1979. - т.23, № 1. - С. 85-87.

269. Хохлов С.С., Гришина Е.В., Зайцева М.И., Тырнов B.C. Малышева-Шишкинская Н.А. Гаплоидия у покрытосеменных растений. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1970. - Ч. 1. - 140 с.

270. Хохлов С.С., Тырнов B.C. Гришина Е.В. Гаплоидия и селекция. М.: Наука, 1976.-221 с.

271. Хроликова А.Х., Здруйковская-Рихтер А.И. Новые перспективные сорта груши раннего срока созревания, полученные in vitro II Бюл. Никитского ботан. сада. 1976. - Вып. 3(31). - С. 66-69.

272. Хромова Л.М. Культивирование верхушечных меристем картофеля для оздоровления сортов от вирусных болезней // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. -М.: Колос, 1979. С. 128-137.

273. Хурошвили К.Г., Голиадзе Ш.К., Кашакашвили Ц.С. Использование культуры пыльников для получения гаплоидных растений цитрусовых // Субтроп, культуры. 1982. -№ 5. - С. 72-76.

274. Цанци JL, Цанци А. Цели и принципы микроразмножения // Технический доклад. М., 1981. - 5 с.

275. Цикова Е., Георгиева Й., Загорска Н., Язови М. Цитологично и цитохимично проучване на андрогенез при цитоплазмено мъжкостерилии тютюни // Генет. и селекция. 1981. - Т. 146 № 1. - С. 3-12.

276. Цицин Н.В., Петрова К.А. О гибридизации пшеницы с элимусом гигантским // Отдаленная гибридизация в семействе злаковых. М., 1958, - С. 19-40.

277. Чайлахян М.Х., Бутенко Р.Г., Кулаева О.Н., Кефели В.И., Аксенова Н.П. Терминология роста и развития высших растений. М.: Наука, 1982. 96 с.

278. Чеботарь А.А., Челак В.Р., Мошкович A.M., Архипенко М.Г. Эмбриология зерновых, бобовых и овоще-бахчевых возделываемых растений. -Кишинев: Штиинца, 1987.-228 с.

279. Чугункова Т.В. Динамка i характер росту зародюв жита, вирощуваних в штучних умовах // Доповщ АН УРСР. 1974. -Б, № 2. - С. 171-173.

280. Чугункова Т.В. Получение триплоидных растений ржи методом культуры зародышей // Новые методы создания и использования исходных материалов для селекции растений. Киев, 1979. - С. 52-60.

281. Чугункова Т.В. Цитогенетическое изучение триплоидных гибридов ржи, полученных с помощью культуры зародышей // Структура и генетические функции биополимеров. Киев, 1975. - С. 38.

282. Чугункова Т.В., Шевцов И.А. Преодоление нескрещиваемости автотетраплоидных и диплоидных растений ржи путем культуры зародышей // Цитология и генетика. 1972. - Т. 6, № 6. - С. 512-515.

283. Чумаков А.Е., Минкевич И.И., Власов Ю.И., Гаврилова Е.А. Основные методы фитопатологических исследований. М.: Колос, 1974. - 192 с.

284. Шамина З.Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор // Культура клеток растений. М.: Наука, 1981. - С. 124-136.

285. Шамина З.Б., Тураев A.M., Мусаев Д.А. Способность к каллусогенезу в культуре пыльников хлопчатника // Цитол. и генет. 1986. - Т.20, № 4. - 276— 280.

286. Шевцов И.А., Чугункова Т.В. Применение культуры зародышей для преодоления нескрещиваемости растений // Цитология и генетика. 1973. - Т. 7,№6.-С. 546-553.

287. Шинкарева И.К., Шамина З.Б., Сарычев Ю.Ф., Загорска Н.А., Краевой С.Я. Анеуплоидия в семенном потомстве регенерантов, полученных в культуре ткани табака // Генетика. 1973. - Т.9, № 2. - С. 21-28.

288. Шмыкова Н.А. Культура пыльников, неопыленных завязей и семяпочек лука репчатого // Научные труды по селекции и семеноводству. М., 1995. - Т. 1.-С. 164-170.

289. Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.Б. Диморфизм пыльцы и андрогенез в культуре пыльников моркови (Daucus carota L.) // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. II Междунар. науч. конф. 18-19 октября 2000. М., 2000. - С. 55-56.

290. Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.Б. Диморфизм пыльцы и оценка эмбриогенной способности микроспор различных генотипов моркови // Сельскохозяйственная биология. 2001. - №5. - С. 53-61.

291. Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.Б., Особенности морфогенетических изменений в культивируемых in vitro пыльниках моркови // Биотехнология. -2002.-№5.-С. 65-69.

292. Шумный В.К., Першина J1.A. Получение ячменно-ржаных гибридов и их клонирование методом культивирования изолированных тканей // Докл. АН СССР. 1979. - Т. 249, № 1. - С. 209-210.

293. Шушкова Т.В., Тюкавин Г.Б., Долгов С.В. Генетическая трансформация моркови (Daucus carota L.) // Новые направления биотехнологии: Тез. докл. VIII конф. 27 29 апреля 1998. - М., 1998а. - С. 34.

294. Шушкова Т.В., Тюкавин Г.Б., Долгов С.В. Генетическая трансформация моркови (Daucus carota L.) // III Пущинская конф. молодых ученых: Тез. докл. -Пущино, 19986.-С. 104-105.

295. Щеглов Н.И. Метод культуры зародышей в генетико-селекционном изучении косточковых растений // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. М.: Колос, 1979. - С. 85-93.

296. Щеглов Н.И. Применение метода культуры зародышей в селекции косточковых // Докл. АН СССР. 1973. -Т. 208, № 4. - С. 998-999.

297. Щерева Д., Крулева М., Загорска Н. Индуциране на андрогенезис в антерни култури от домати // Генет. селек. 1990. - Т.236 № 3. - С. 185-193.

298. Эделыптейн В.И. Овощеводство. 3-е изд. перераб. М.: Сельхозиздат, 1962.-440 с.

299. Юркова Г.Н., Галецкая Г.Р. Регенерационная способность коллекционных образцов культурного томата // Пробл. теор. и прикл. генет. в Казахстане: Матер. Респ. конф., Алма-Ата, 18-22 ноября 1990 г. Алма-Ата, 1990.-С. 122-123.

300. Юркова Г.Н., Левенко Б.А. Изолированная культура пыльников злаков (литературный обзор) // Эксперим. генет. раст. -Киев: Наук, думка, 1981. С. 46-65.

301. Юркова Г.Н., Сирант Л.В., Труханов В.А. Прямая регенерация растений из мезофильных клеток растений // Цитол. и генет. 1989. Т.23, № 1. - С. 6869.

302. Яковлев С.П., Кожин А.В., Луткова Е.Н., Дубовицкая Л.А. Разработка способов культивирования недоразвитых зародышей и завязей груши // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. М.: Колос, 1979. - С. 93-99.

303. Яртиев А.А., Костенко С.И. Особенности микроклонального размножения кормовой свеклы // Докл. ВАСХНИЛ. 1988. -№ 10. - С. 15-17.

304. Abo El-Nill М.М. Organogenesis and embryogenesis in callus cultures of garlic (Allium sativum L.) // Plant Science Letters. 1977. - N9. - P. 259-264.

305. Agache S., Bachelier В., Buyser J., Henry Y., Snape J. Genetic analysis of anther culture response in wheat using aneuploid, chromosome substitution and translocation lines // Theor. and Appl. Genet. 1989. - V.77, N 1. - P. 7-11.

306. Ahloowalia B.S. Somatic embryogenesis and plant regeneration in Eruca sa-tiva // Crop. Sci. 1987. - V. 27, N 4. - P. 813-814.

307. Ahmim M., Vieth J. Production de plantes haploides de Gerbera jamesonii par culture in vitro d'ovules // Can. J. Bot. 1986. - V.64, N 10. - P. 2355-2357.

308. Alissa Asad, Serieys Herve, Jonard Robert Sur les possibilies de regeneration d'especes sauvages et d'hybrides interspecifiques du genre Helianthus par an-drogenese in vitro // C. r. Acad. Sci. 1985. - Ser. 3,300, N 1. - P. 25-30

309. Ammirato P.V. Carrot // Handbook of plant cell culture / Eds D.A. Evans et al. New York: Macmillan, 1986. - V.4. - P. 457^199.

310. Ammirato P.V. Embryogenesis // Handbook of plant cell culture / Eds D.A. Evans et al. New York: Macmillan, 1983. - V.l - P. 82-123.

311. Ammirato P.V. Patterns of development in culture // Tissue culture in forestry and agriculture / Eds R.R. Henke et al. New York: Plenum Press, 1985. - P. 9-29.

312. Anadjieva M. Cytological investigation of Datura innoxia Mill, plants by an-drogenesis in vitro // Fert. and Embryogenes. Ovulated Plants: Proc. 7 Int. Cytoem-bryol. Symp., High Tatra (Rackova dolina), June 14-17, 1982. Bratislava, 1983. -P. 381-384.

313. Anagnostakis S.L. In vitro culture of immature embryos of American elm // Hort. Sci. 1977. - V. 12, N 1. - P. 44.

314. Anand V.V., Arekal G.D., Swamy B.G.L. Chimeral embryoids of pollen origin in tobacco // Curr. Sci. (India). 1980. - V.49, N 15. - P. 603-604.

315. Anand V.V., Arekal G.D., Swamy B.G.L. Foliar histology of androgenetic haploid «vegetative» and «generative» tobacco // Cur. Sci. (India). 1981b. - V.50, N7.-P. 327-328.

316. Anand V.V., Arekal G.D., Swamy B.G.L. Variation among flowers of androgenetic tobacco haploids // Curr. Sci. (India). 1981a. - V.50, N 8. - P. 372-373.

317. Andersen S.B. Anther Culture in Carrot // Hereditas Suppl. 1985. - V.3, N 12.-P. 132.

318. Arnison P.G., Keller W.A. A survey of the anther culture response of Bras-sica oleracea L. Cultivars grown under field conditions // Plant Breed. 1990. -V.104, N2.-P. 125-133.

319. Arora R., Bhojwani S.S. Production of androgenic plants through pollen em-bryogenesis in anther cultures of Brassica carinata F. Braun. // Biol, plant. 1988. -V.30, N 1. - P. 25-26.

320. Aruna M., Reddy G.M. Genotypic differences in callus initiation and plant regeneration from anthers of Indica rice // Curr. Sci. (India). 1988. - V.57, N 18. -P. 1014-1017.

321. Arya I., Chandra N. Organogenesis in anther-derived Callus culture of cow-pea (Vigna unguiculata (L.) walp. // Curr. Sci. (India) 1989. - V. 58, N 5. - P. 257259.

322. Aslam Ferre N., MacDonald M.V., Ingram D.S. Rapid-cycling Brassica species: anther culture potential of B. campestris L. and B. napus L. // New Phytol. -1990. V.l 15, N 1. - P. 1-9.

323. Assani A., Bakry F., Kerbellec F., Haicour R., Wenzel G., Foroughi-Wehr B. Production of haploids from anther cultured of banana (Musa balbisiana) // Plant Cell Repts. 2003. - V.21, N 6. - P. 511-516.

324. Assay Bah B. Culture in vitro d'embryons zygotiques de cocotiers // Oleagi-neux. 1986. - V.41, N 7. - P. 321-328.

325. Babbar S.B., Gupta S.C. Chemicals affecting androgenic response of Datura metel. Glutamine, glutamic acid, serine inositol // Beitr. Biol. Pflanz. 1985. - V.60, N3.-P. 459-466.

326. Babbar S.B., Gupta S.C. Pathways in pollen sporophyte development in anther cultures of Datura metel and Petunia hybrida // Beitr. Biol. Pflanz. 1984. -V.59, N3.-P. 475-488.

327. Babnik J., Bohanec B. Raziskava metoda in vitro mikropropagaciue vecih genotipov radica (Cichorium intybus L. var. foliosum Hegi) // Zb. Biotehn. fac. Univ. Ljubljani. 1988. -N 51. - P. 181-185.

328. Badea E., Raicu P. Experimental androgenesis in Datura innxia plants with different of ploidy (2л, 4n, 6n) Rev. roum. biol. Ser. biol. veg. 1983. - V.28, N 1. -P. 59-61.

329. Badea E.M., Prisecaru M., Angheluta R. Studies on gynogenesis in intraspecific and interspecific hybrids in genus Helianthus // Cercetary de Genetica Vegetalasi Amimala.- 1989.-N l.-P. 177-183.

330. Baenziger P.S., Wesenberg D.M., Smail V.M., Alexander W.L., Schaeffer G.W., Agronomic performance of wheat doubled-haploid lines derived from cultivars by anther culture // Plant Breed. 1989. - V.103, N 2. - P. - 101-109.

331. Bagga S., Bhalla-Sarin N., Sopory S.K., Guha-Mukheijee S. Comparison of in vitro plant from somatic tissues and pollen grains in Brassica oleracea var. botrytis. // Phytomorphology. 1982. - V.32, N 2-3. - P. 152-156.

332. Bajaj Y.P.S. Enhancement of the in vitro development of Triticale embryos by the endosperm of durum wheat // Cereal. Res. Commun. 1980. - V. 8, N 2. - P. 359-364.

333. Bajaj Y.P.S. In vitro induction of haploids in wheat (Triticum aestivum L.) // Crop Improv. 1977. - N 4. - P. 54-64.

334. Bajaj Y.P.S. In vitro production of haploids // Handbook of plant cell culture: Techniques for propagation and breeding / Eds D.A. Evans et al. New York, London.: Macmillan, 1983. - V.l. - P. 228-287.

335. Bajaj Y.P.S. Regeneration of haploid tobacco plants from isolated pollen grown in drop culture // Indian J. Exp. Biol. 1978. - V.l6. - P. 407-409.

336. Bajaj Y.P.S., Gosch G., Ottma M., Weber A., Grobler A. Production of polyploid & aneuploid plants from anthers & mesophyll protoplasts of Atropa belladonna & Nicotiana tabacum // Indian J. Exp. Biol. 1978. - v.16, N 9. - P. 947-953.

337. Bajaj Y.P.S., Labana K.S., Dhanju M.S. Induction of pollen-embryos and pollen callus in anther cultures of Arachis hypogaea and A. glabrata // Protoplasma. -1980a. V.103, N 4. - P. 397-399.

338. Bajaj Y.P.S., Ram A.K., Labana K.S., Singh H. Regeneration of genetically variable plants from the anther-derived callus of Arachis hypogaea and Arachis vil-losa // Plant Sci. Lett. 1981. - V.23, N 1. - P. 35-39.

339. Bajaj Y.P.S., Singh H. In vitro induction of androgenesis in mung bean Phaseolus aureus L. // Indian J. Exp. Biol. 1980. - V.l8, N 11. - P. 1316-1318.

340. Bajaj Y.P.S., Verma M.M., Dhanju M.S. Barley X-rye hybrids (Hordecale) through embryo culture // Curr. Sci. (India). 1980b. - V. 49, N 9. - P. 362-363.

341. Balaga H.Y., Guzman E.V. The growth and development of coconut «maka-puno» embryos in vitro // Philipp. Agr. 1970. - V. 53. N 10. - P. 551-565.

342. Balestrazzi A., Carbonera D., Cella R. Transformation of Daucus carota hy-pocotyls mediated by Agrobacterium tumefaciens // Genet. & Breed. 1991. - V 45. -P. 135-140.

343. Barloy D., Denis L., Beckert M. Comparison of the aptitude for anther culture in some androgenetic doubled haploid maize lines // Maydica. 1989. - V.34, N 4.-P. 303-308.

344. Beaville M.A. Obtention d'haploides in vitro a partir d"ovaries non fecondes de Riz, Oruza sativa L. // C. r. Acad. Sci. 1980. - V.290. N 6. - P. 489-492.

345. Bellincampi D., Morpurgo G. A method for high plating efficiency in Daucus carota cell cultures // G. Bot. ital. 1984. - V.l 18, N 1-2, suppl. 1. - P. 85-86.

346. Bendadis A. Culture des cellules isolees: le probleme du conditionnement des milieux de culture // Les cultures de tissus de plantes CNRS: Strasbourg 5-7 mai 1975.-Strasbourg, 1968.-P. 121-129.

347. Benhamou N., Broglie D., Chet I., et al. Cytology of infection of 35S-bean chitinase transgenic canola plants by Rhizoctonia solani: cytochemical aspects of chi-tin breakdown in vivo // The Plant Journal 1993. - N 4. - P. 295-305.

348. Bergmann L. A. Growth and division of single cells of higher plants in vitro // J. Gen. Physiol. 1960. - V.43, N 4. - P. 841-851.

349. Bergmann L.A. A new technique for isolation and cloning single cells of higher plants // Nature. 1959. - V. 184, N 4686, sappl. 9. - P. 648-649.

350. Bernard S. Study of some factors in vitro androgenesis of hexaploid Triticale // Ann. Amelior Plant. 1977. - V. 27, N 6. - P. 639-655.

351. Bernard S., Picard E., Buyser J. Obtention de plantes haploides de Triticale hexaploides (X Triticosecale Wittmack) par cultyre in vitro d antheres // C. r. Acad. Sci. 1976. - D283, N 3. - P. 235-238.

352. Bevan M. Binary Agrobacterium vectors for plant transformation // Nucleic Acids Res. 1984.-N 12.-P. 8711-8721.

353. Bhojwani S.S. Differentiation of haustoria in the geminating embryos of mistletoe without host stimulus // Experientia. 1969. - V.25, N 5. - P. 543-544.

354. Bhojwani S.S. In vitro propagation of garlic by shoot proliferation // Sci. Hortic. 1980. - V.l3, N 1. - P. 47-52.

355. Birnberg P.R., Somers D.A., Brenner M.L. Characterization of conditioning factors that increase colony formation from «Black Mexican Sweet Corn» protoplasts // J. plant Physiol. 1988. - V. 132, N 3. - P. 316-321.

356. Bjornstad A., Opsahl-Ferstad H.G., Aasmo M. Effects of donor plant environment and light during incubation on anther cultures of some spring wheat (Triti-cum aestivum L.) cultivars // Plant Cell. Tissue and Organ Cult. 1989. - V.17, N 1. -P. 27-37.

357. Blakeslee A.F., Belling J., Farnham M.E., Berger A.D. A haploid mutant in Datura stramonium // Science. 1922. - V.55. - P. 646-647.

358. Blanke M.M., Balcher A.R. Stomata of apples leaves cultured in vitro // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1989. - V. 19. - P. 85-89.

359. Bogouspaev K.K., Kudarov B.R., Anapiaev B.B., Rahimbaev I.R. Division and embryogenesis in isolated microspores of wheat culture // Embryology and seed reproduction: Abstracts XI Int. Symp. July 3-7,1990. Leningrad, 1990. - P. 23.

360. Bohorova N., Atanasov A., Georgieva-Todorova J In vitro organogenesis, androgenesis and embruo culture, in the genus Helianthus L. // Z. Pflanzenzucht. -1985. V.95, N 1. - P. 35-44.

361. Bohorova N.E. In vitro plant development of seeds of Helianthus interspecies hybrids // Докл. Болг. АН. 1982. - Т. 35, № 1. - С. 105-107.

362. Boladjiev P., Cuong P.V. Cytological and physiological studies of some varieties and FI hybrids of rice, Oryza sativa, using the method of anther culture // Bionature. 1988. - V.8, N 1. - P. 41-46.

363. Boppenmeier J., Zuchner S., Foroughi-Wehr B. Haploid production from barley yellow dwarf virus resistant clones of Lolium // Plant Breed. 1989. - V.103, N3.-P. 216-220.

364. Bornman C.H. Haploidization of sugar beet (Bet vulgaris) via gynogenesis // In vitro.- 1985.-N1.-P.3.

365. Borojevic K., Sesek S., Radojevic L. Responses of different genotypes on development of callus from anther cultures of wheat // Nucl. Techn. and in vitro Cult. Plant Improv: Proc. Int. Symp., Vienna, 19-23 Aug., 1985. Viena, 1986. - P. 233-237ю

366. Borovec V. Micropropagace zimnich odrud kvetaku // Zahradnictvi. 1988. -V.15, N 1. P. 21-28/

367. Borovec V. Vtristemova kultura linii ruzickove kapusty (Brassica oleracea L. var. gemmifera D.C.) // Bull. vyzk. slecht. Ust. zelin. Olomouc, 1986. - Bull. 30. -P. - 31-45.

368. Borovec V., Krivsky R. Mikropropa^ace slechtitelskych linii zele Brassica oleracea L. var. capitata (L.) // Alef Sbornik UVTIS Zahradnictvi. 1987. - V.14, N 2.-P. 105-118.

369. Bossoutrot D., Hosemans D. Gynogenesis in Beta vulgaris L.: From in vitro culture of unpollinated ovules to the production of doubled haploid plants in soil // Plant Cell Rep. 1985. - V.4, N.6. - P. 300-303.

370. Bourgin J.P., Nitsch J.P. Obtention de Nicotiana haploidesa partir d'etamines cultivees in vitro // Ann. Physiol. Veg. 1967. - V.9. - P. 377-382.

371. Bouvinet J., Rabechault H Recherches sur la culture in vitro des embiyons de palmier a huile // Oleagineux. 1965. - V.20, N 2. - P. 79-87.

372. Brachard M., Chateau M. Obtention de plantes de Melon (Cucumis melo L.) par embryogenese somtique // C. r. Acad.sci. Ser. 3. 1988. - V. 307, N 16. - P. 777-780.

373. Brainerd K.E., Fuchigami L.H. Acclimatization of aseptically cultured apple plants to low relative humidity // J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1981. - V. 106. - P. 515— 518.

374. Braser L.G, Harvey C.F. Somatic embryogenesis from anther-derived callus in two Actinidia species // Sci. hort. (Neth.) 1986. - V.29, N 4. - P. 335-346.

375. Broekaert W.F., Terras F.R.G., Cammue B.P.A., Obsborn R.W. Plant de-fensins: Novel antimicrobial peptides as components of the host defense system // Plant. Physiol. 1995. - V. 108. - P. 1353-1358.

376. Broglie K., Chet I., Holliday M. et al. Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogen Rhizoctonia solani // Science 1991. - V. 254. - P. 1194-1197.

377. Brooks H.J., Hough L.F. Vernalization studies with peach embryos // Amer. Soc. Hort. Sci. 1958. - V.71.- P. 95-102.

378. Broue P., Douglass j., Grace J,P., Marshall D.R. Glycine species indigenous to Australia via embryo culture // Euphytica. 1982. - V.31, N3. - P. 715-724.

379. Bullock W.P., Baenziger P.S., Schaeffer G.W. Anther culture of wheat (Triticum aestivum L.) Ffs and their reciprocal crosses // Theor. and Appl. Genet. -1982.-V. 62, N.2.-P. 155-159.

380. Burk L.G., Gwynn G.R., Chaplin J.F. Diploidized haploids from aseptically cultured anthers of Nicotiana tabacum. Acolchicine method applicable to plant breeding // J. Hered. 1972. - V.63, N 6. - P. 355-360.

381. Burk L.G., Matzinger D.F. Variation among anther-derived doubled haploids from an inbred line of tobacco // J. Hered. 1976. - V.67, N 6. - P. - 381-384.

382. Buyser J., Henry Y. Androgegenese sur des bles tendres de selection 1. Г obtention des plantes in vitro // Z. gflarzenzucht. 1979. - V.83, N 1. - P. 49-56.

383. Buyser J., Henry Y., Lonnet R. «Fiorina» doubled haploid wheat variety // Plant Breed. 1987. - V.98. - P. 53-56.

384. Campion В., Azzimonti M.T. Evolution of ploidy level in haploid plants of onion (Allium сера) obtained through in vitro gynogenesis // EUCARPIA Sec. Vegetables: Proc. 4th Allium Symp., Coventry, 6-9 Sept., 1988. - Wellesbourne, 1988.-P. 85-89.

385. Campion В., Azzimonti M.T., Vicini E., Schiavi M., Falavigna A. Advances in haploid plant induction in onion (Allium сера L.) through in vitro gynogenesis // Plant Sci. 1992. - V.86. - P. 97-104.

386. Campion В., Perri E., Azzimonti M.T, Vicini E., Schiavi M. Spontaneous and induced chromosome doubling in gynogenic lines of onion (.Allium сера L.) // Plant Breeding. 1995.- V. 114. - P. 243-246.

387. Caplin S.M. Mineral oil overlay for conservation of plant tissue cultures // Amer. J. Bot. 1959. - V.46. - P. 324-330.

388. Cappadocia M., Ahmim M. Comparison of two culture methods for the production of haploids by anther culture in Solanum chacoense // Can. J. Bot. 1988. -V.66, N 5. - P. 1003-1005.

389. Cappadocia M., Cheng D.S.K., Ludlum-Simonette R. Plant regeneration from in vitro culture of anthers of Solanum chacoense Bitt. and interspecific hybrids S. tuberosum L. x S . chacoense Bitt. // Theor. and Appl. Genet. 1984. - V.69, N 2. -P. 139-143.

390. Cappadocia M., Cheng D.S.K., Ludlum-Simonette R. Self-compatibility in doubled haploids and their Fj hybrids, regenerated via anther culture in self- incompatible Solanum chacoense Bitt. // Theor. and Appl. Genet. 1986. - V.72, N 1. - P. 66-69.

391. Cappadocia M., Chretien L., Laublin G. Production of haploids in Gerbera jamesonii via ovule culture: influence of fall versus spring sampling on callus formation and shoot regeneration // Can. J. Bot. 1988. - V.66. - P. 1107-1110.

392. Cappelades M., Fontarnau R., Carulla C., Debergh P. Environment influences anatomy of stomata and epidermal cell in tissue-cultured Rosa multiflora // J. Amer. Soc. Hort, Sci. 1990. - V. 115. - P. 141-145.

393. Carlson P.S. Methionine sulfoximide resistant mutants of tobacco // Science. 1973. - V. 180, N 4093. - P. 1366-1368.

394. Castillo A.M., Cistue L. Production of gynogenic haploids of Hordeum vul-gare L. // Plant Cell Rep. 1993. - V.12. - P. 139-143.

395. Cauderon Y. Hybridation interspecifique etamelioration des plantes. 1. Evolution des voies d'etude des relations entre especes // C. r. Acad. agr. France. 1981. -V. 67,N12.-P. 1001-1012.

396. Ceapoiu N. Ingineria genetica. Perspective de utilizare in transformarea plantelor si animalelor // Probl. genet, teor. si apl. 1982. - V.13, N 6. - P. 323-337.

397. Cersosimo A Colture in vitro di antere in Vitis sp. // Riv.viticolt. e. enol. -1986.-V. 39,N12.-P. 520-531.

398. Chakravarty В., Sen S. Regeneration trough somatic embryogenesis from anther explants of Scilla indica (Roxb.) Baker //Plant Cell, Tissue and Organ Cult. -1998. -V.19.N1.- P. 71-75.

399. Chandler J.M., Beard R.H. Embryo culture of Helianthus hybrids // Crop. Sci. 1983. -V. 23, N 5. - P. 1001-1007.

400. Chandra N, Hildebrandt A.C. Differentiation of plants from tobacco mosaic virus inclusion- bearing and inclusion-free single tobacco cells // Virology 1967. -V31, N 3. - P. 414-421.

401. Chandy L.P., Narayanaswamy S. Diploid and haploid androgenic plantlets from haploid Datura in vitro // Indian J. Exp. Biol. 1971. - V.9, N 4. - P. M2-A15.

402. Charmet G., Bernard S., Bernard M. Origin of aneuploid plants obtained by anther culture in triticale // Can. J. Genet, and Cytol. 1986. - V.20, N 3. - P. 444452.

403. Chaturvedi H.C, Sharma A.K. Androgenesis in Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle. // Planta. 1985a. - V.165, N 1. - P. 142-144.

404. Chaturvedi H.C, Sharma A.K. Production of androgenic plants of Citrus aurantifolia // J. Plant Physiol. 1985b. - V.l 19, N 5. - P. 473^77.

405. Chee Paul P. Somatic embryogenesis and plant regeneration of squash Cu-curbita pepo L. cv. YC 60 // Plant. Cell. Repts. 1991. - V.9< N 11. - P. 620-622.

406. Chen C.C., Chen C.M. Changes in chromosome number in microspore callus of rice during successive subcultures // Can. J. Genet, and Cytol. 1980. - V.22, N 4. -P. 607-614.

407. Chen Z., Kasha K.J., Marsolais A. Segmentation patterns and mechanisms of genome multiplications in cultured microspores of barley // Can. J. Genet, and Cytol. 1984. - V.26, N 4. - P. 475-483.

408. Chen Z., Liao H. Изучение в культуре пыльников in vitro индукции гаплоидных растений чая // J. Fujian Agr. Coll. 1988. - V.17, N 3. - P. 185-190.

409. Chen Z., Quian C., Xu X., Deng Z. Anther culture techniques of rubber tree and sugarcane // Plant Tissue Cult.: Proc. 5 Int. Congr. Plant Tissue and Cell. Cult. Tokyo and Lake Yamanaka, July 11-16,1982. Tokyo, 1982a. - P. 533-534.

410. Chen Z., Wang M., Liao H. Индукция пыльцевых растений Citrus на искусственной среде // Acta genet, sinica. 1980. - V.7, N 2. - P. 180-191.

411. Cheng Wan-eheng, Kuo Li-chuan, Kuan Yu-Ian, Huang Chao-hsiang, An His-pri, Ku Ming-kuang Индукция эмбриоидов в культуре пыльников кукурузы // Acta genet, sinica. 1978. - V.5, N 4. - P. 274-280.

412. Chopra R.N. In vitro culture of ovaries of Althaea rosea Cav. // Proc. Seminar Mod. Dev. Plant Physiol. / Ed. P Maheshwari. Delhi, 1958. - P. 87-89.

413. Chowdhyry M.K.U. An improved method for dihaploid production in Nico-tiana rustica through anther culture // Theor. and Appl. Genet. 1984. - V.69, N 2. -P. 199-204.

414. Chu C. Haploids in plant improvements // Plant improvement and somatic cell genetics / Eds. J Vasil et al. New York: Academic Press, 1982. - P. 129-158.

415. Chu Q, Zhang L. Цитогенетика анеуплоидов, происходящих из пыльцевых растений риса // Acta genet, sci. 1985. - V.l2, N 1. - P. 51-60.

416. Chua B.K., Chen Y.H., Omar O. Anther culture of rice hybrids 1854 and 1856 // MARDI Res. Bull. 1984. - V. 12, N 3. - P. 275-280.

417. Chuang C., Duyang Т., Chia H. A set of potato media for wheat anther culture // Proc. of Symposium of Plant Tissue Culture. Peking : Science Press, 1978. -P. 51-56.

418. Chueca M.C., Cauderov Y., Tempe J. Technique d'obtention d'hybrides Ble tendrexAegilops par culture in vitro d'embryons immatures // Ann. amelior. plant. -1977.-V. 27, N5.-P. 539-547.

419. Chuong P.V., Deslauriers C., Roff L., Beversdorf W.D., Effects of donor genotype and bud sampling on microspore culture of Brassica napus // Can. J. Bot. -1988. V.66, N 8. - P. 1653-1657.

420. Clapham D. Haploid Hordeum plants from anthers in vitro // Z. Pflanzen-ziicht. 1973. - V.69, N 2. - P. 142-155.

421. Clausen R.E., Mann M.C. Inheritance in Nicotiana tabacum. V. The occurrence haploid plants in interspecific progenies // Proc. Nat. Acad. Sci. 1924. - V.10. -P. 121-124.

422. Collins G.B, Genovesi A.D. Anther culture and its application to crop improvement // Application of Plant Cell and Tissue Culture to Agriculture and Industry / Eds. D.T. Tomes et al. Canada: Univ. of Guelph, 1982. - P. 1-25.

423. Collins G.B. Production and utilization of anther derived haploids in crop plants // Crop. Sci. 1977. - V.l7, N 4. - P. 583-586.

424. Collins G.B., Legg P.D., Kasperbauer M.J. Use of anther-derived haploids in Nicotiana. 1. Isolation of breeding lines in total alkaloid content // Crop. Sci. 1974. -V. 14, N 1. - P. 77-80.

425. Conner L.N., Conner A.J. Comparative water loss from leaves of Solanum laciniatum plants cultured in vitro and in vivo II Plant. Sci. Let. 1984. - V.36. - P. 241-246.

426. Cooper K.V., Dale J.E., Lyne R.L., Walker J.L. Early development of hybrids between barley and rye // 8th Congr. and Gen. Assem. EUCARPIA: Interspec. Hybrid. Plant Breed. Madrid, 1977. - P. 37.

427. Corduan G. Isozyme variation as an indicator for the generative or somatic origin of anther-derived plants of Digitalis purpurea L. // Z. Pflanzenzucht. 1976. -V.76, N l.-P. 47-55.

428. Corduan G. Regeneration of anther-derived plants from Hyoscyamys niger L. // Planta. 1975. - V.127. - P. 27-36.

429. Cossette F., Pauze F.J. La production de lignees d'orge haploides et diploi-des homozygotes par culture d'antheres // Rev. can. biol. exp. 1983. - V.42, N 1. -P. 45-49.

430. Coulibaly Y., Demarly Y. Androgenese in vitro chez Oryza sativa (var. Ci-galon) a partir d'antheres conservees dans Г azote liquide (-196 °C) // Agron. Trop. (France). 1979. - V.34, N 1. - P. 74-79.

431. Craig I.L. Haploid plants (2n = 21) from in vitro anther culture of Triticum aestivum // Can. J. Genet. 1974. - V.l6, N 3. - P. 697-700.

432. Crespan M., Cipriani G., Vischi M., Olivieri A.M. Individuzione dela micro e macrosporogenesi in orzo (Hordeum vulgare L.) e primi resultati comparativi della colture «in vitro» di antere e ovari // Riv. agron. 1988. - V.22, N 2. - P. 89-93.

433. Crouch M.L. Non-zygotic embryos of Brassica napus L. contain embryo-specific storage proteins // Planta. 1982. - V. 1982, N 6. - P. 520-524.

434. Custers J.B.M, Kruit S. Embryo culture with Cucumis species // Plant Tissue Cult.: Proc. 5 Int. Congr. Plant Tissue and Cell. Cult., Tokyo and Lake Yamanaka, July 11-16,1982.- Tokyo, 1982.-P. 777-778.

435. Custers J.B.M., Bergervoet J.H.W. In vitro culture of embryos of Cucumis spp.: Heart-stage embryos have a higher ability of direct plant formation than advanced-stage embryos // Sex. Plant Reprod. 1990. - V.3, N 3. - P. 152-159.

436. D'Halluin K., Keimer B. Production of haploid sugarbeets (Beta vulgaris L.) by ovule culture // Gen. Manipulat. Plant Breed.: Proc. Int. Symp., Berlin (West), September 8-13,1985. Berlin, New York, 1986. -P. 307-309.

437. Dahmen W.J., Mock J.J. Effects of nutrient-media composition on growth of seedlings from intact seeds and excised embryos of maize // Crop. Sci. 1972. -V.12, N4. - P. 549-550.

438. Davojan E.I., Rymar V.T. Production of haploid rice plantlets from unfertilized ovaries in vitro // Plant Tissue and cell culture application to crop improvement: Abst. Int. Symp. Czechoslovakia, September 24-29, 1984. - Olomouc, 1984. -P. 38.

439. Deaton W.R., Metz S.G., Armstrong T.A., Mascia P.N., Genetic analysis of the anther-culture response of three spring wheat crosses // Genetics 1987. - V.l 16, Nl.Pt 2. - Suppl., 26.

440. Debata B.K., Patnaik S.N. In vitro culture of anther of Crotalaria pallida Ait. for induction of haploid // Indian J. Exp. Biol. 1983. - V.21, N 1. - P. 44-46.

441. Debata B.K., Patnaik S.N. Induction of androgenesis in anther cultures of Solanum viarum Dunal. // Plant Physiol. 1988. - V. 133, N 1. - P. 124-125.

442. Dehne J., Leike H., Claus E., Kohler H. Die Gewebekultur und ihre Bedeutung fur die Getreidezuchtung // Tagungsber. Akad. Landwirtschaftswiss. DDR. 1977. - N 154. - P. 81-86.

443. Devreux M., Laneri U. Anther culture haploid plant, isogenic line and breeding researches in Nicotiana tabacum L. // Polyploidy and Induced Mutations Plant Breeding. Vienna, 1974.-P. 101-107.

444. Devreux M., Laneri U., Martinis P. Reflexions sur nos cultures d'antheres de plantes cultivees // G. bot. ital. 1975. V.109, N 6. - P. 335-349.

445. Devreux M., Saccardo F. Mutazioni sperimentali osservate su plante haploidi di tabacco ottenute per colture in vitro di antere irradiate // Atti. Assoc. genet, ital. -1971.-N 16.-P. 69-71.

446. Dietrich K. Uber kultur von embryonen ausserhalb desbsamens // Flora. -1924.-V.17.-P. 379-417.

447. Dieu P., Beckert M. Further studies of androgenetic embryo production and plant regeneration from in vitro cultured anthers in maize (Zea mays L.) // Maydica. -1986,-V.31,N3.-P. 245-259.

448. Ding-Gang H., Jun-Wen O. Callus and plantlet formation from cultured wheat anthers at different developmental stages // Plant. Sci. Lett. 1984. - V.33. -P. 71-79.

449. Doctrinal M., Sangwan R.S., Sangwan-Norreel B.S. In vitro gynogenesis in Beta vulgaris L.: Effects of plant growth regulators, temperature, genotypes and season // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 1989. - V.17, N 1. - P. 1-12.

450. Dolezel J., Novak F.J., Luzny J. Embryo development and in vitro culture of Allium сера and its interspecific hybrids // Z. Pflanzenziicht 1980. - V. 85, № 3. -P. 177-184.

451. Dollmantel H.J., Reinert J. Auxin levels, antiauxin(s) and androgenic plantlet formation in isolated pollen cultures of Nicotiana tabacum // Protoplasma. 1980. -V.103.N2.-P. 155-162.

452. Dore, c. Evaluation du niveau de plo'fdie des plantes d'une population de choux de Bruxelles (Brassica oleracea L. ssp. gemmifera) d'origine pollinique // Agronomie. 1986. - V.6, N 10. - P. 797-801.

453. Dos Santos Rozely F., Handro W., Floh Eny I.S. Ploidy in Petunia hybrida plants regenerated from tissue cultures // Rev. bras. bot. 1983. - V.6, N 1. - P. 3339.

454. Dostal J., Skladal V. Klonovani kvetaku (Brassica oleracea L. var. botrytis (L.) Alef.) in vitro // Sbornik uvtiz -Zagradnictvi. 1978-1979. - V. 5-6. - P. 177185.

455. Douglas G.C., Wetter L.R., Keller W.A., Setterfield G. Production of sexual hybrids of Nicotiana rusticaxN. tabacum and N. rusticaxn. Glutinosa via in vitro culture of fertilized ovules // Z. Pflanzenziicht. 1983. - V.90, N 2. - P.l 16-129.

456. Drira N., Benbadis A. Analyse, per culture d'antheres in vitro, des potentiali-tes androgenetiques de deux especes de citrus (Citrus medica L.et Citrus limon L. Burm.) // C. r. Acad. sci. 1975. - D 281, N 18. - P. 1321-1324.

457. Du L., Hou Y.,Chang W., Zhao Y., li A., Shao Q, Yang Z., Chen Z. Индукция растений из пыльцы и получение клонов Fritillaria ussuriensis // Acta genet, sin. 1986. - V. 13, N 4. - P. 262-265.

458. Dumas V.R., Chambonnet D. Obtention of embryos and plants from in vitro culture of unfertilized ovules of Cucurbita pepo // Gen. Manipulat. Plant Breed.: Proc. Int. Symp., Berlin (West), September 8-13, 1985. Berlin, New York, 1986. -P. 295-297.

459. Duncan E.J., Heberle E. Effect of temperature shock on nuclear phenomena in microspores of Nicotiana tabacum and consequently on plantlet production // Pro-toplasma. 1976. - N 9. - P. 173-177.

460. Dunstan D.I., Short K.C. Improved growth of tissue cultures of the onion, Allium сера // Physiol. Plant. 1977a. - V.41. N 1. - P. 70-72.

461. Dunstan D.I., Short K.C. In vitro studies on organogenesis and growth in Allium сера tissue culture // Acta. Hortic. 1977b. - V.78. - P. 139-148.

462. Dunstan D.I., Short K.C. Shoot production from cultured Allium porrum tissues // Sci. Hortic. 1979a. - V. 11, N 1 -P. 37-43.

463. Dunstan D.I., Short K.C. Shoot production from onion callus tissue cultures // Sci. Hortic. -1978. V.9, N 2. - P. 99-110.

464. Dunstan D.I., Short K.C. Shoot production from the flower head of Allium сера L. // Sci. Hortic. 1979b. - V. 10. - P. 345-356.

465. Dunwell J.M. A comparative study of environmental and developmental factors which influence induction and growth in cultured anthers of Nicotiana tabacum. II Environ. Exp. Bot. 1976. - V.16. - P. 109-118.

466. Dunwell J.M. Haploid cell cultures // Plant cell culture: Practical approach / Ed. R.A. Dixon. Oxford, Washington., 1985. - P. 21-36.

467. Dunwell J.M., Cornish M., Courcel A.G.L., Middlefell-Williams J.E. Induction and growth of microspore-derived embryos of Brassica napus ssp. oleifera // J. Exp. Bot. 1983. - V.34, N 149. - P. 1768-1778.

468. Dunwell J.M., Cornish M., Courcell A.G.L. Influence of genotype, plant growth temperature and anther incubation temperature on microspore embryo production in Brassica napus ssp. oleifera // J. exp. Bot. 1985. - V.36, N 165. - P. 679— 689.

469. Dunwell J.M., Sunderland N. Anther culture of Solanum tuberosum L. // Euphytica. 1973. - V.22. - P. 317-323.

470. Durr A., Fleek J. Production of haploid plants of Nicotiana langsdorffii // Plant Sci. Lett. 1980. - V.18, N 1. -P. 75-79.

471. Duysen M., Medich C. Anther culture of wheat and triticale // Proc. N. D. Acad. Sci.- 1987.-N41.-P. 10.

472. Eapan S., Rao P.S. Factors, controlling embryogenesis in triticale and wheat // Proc. Indian Nat. Sci. Acad. 1985. - В 51, N 3. - P. 353-359.

473. Edens L., Heslinga L., Ledeboer A.M., Maat j., Toonen M.Y., Visser C. Ver-rips C.N. Cloning of cDNA encoding the sweet-testing plant protein thaumatin and its expression in Escherichia coli // Gene. 1982. - V.18, N 1. - P. 1-12.

474. Edwards K., Johnstone C., Thompson C. F simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis // Nucleic Acids Res. 1991. -V.19, N 6. - P. 1349.

475. Elbern B. Antherenkultur und regeneration haploider pflanzen von mohn (Papaver somniferum) // Landbauforsch. Volkenrode. 1984. - V.34, N 1. - P. 6366.

476. Engvild K.C. Growth and chlorophyll formation of dark-grown pine embryos on different media // Physiol. Plant. 1964. - V. 17, N 4. - P 866-874.

477. Engvild K.C. Plantlet ploidy and flower-bud size in tobacco anther cultures // Hereditas. 1974. - V.76. - P. 320-322.

478. Engvild K.C., Linde-Laursen I., Lundquist A. Anther cultures of Datura in-noxia: Flower bud stage and embryoid level of ploidy. // Hereditas. 1972. - V.72. -P. 331-332.

479. Erickson R.O. Cytological and growth correlations in the flower bud and anther of Lilium longiflorum // Amer. J. Bot. 1948. V.35. - P. 729-739.

480. Eriksson T. Effects of ultraviolet and X-ray radiation on in vitro cultivated cells of Haplopappus gracilis // Physiol, plant. 1967. - V.20, N 3. - P. 507-518.

481. Espinasse A., Lay C., Dybing C.D. Factors controlling in vitro development of sunflower embryos // Agronomie. 1985. - V.5, N 9. - P. 825-832.

482. Evans D.A., Flick C.E., Kut S.A., Reed S.M. Comparison of Nicotiana ta-bacum and Nicotiana nesophila hybrids produced by ovule culture and protoplast fusion // Theor. and Appl. Genet. 1982. - V. 62, N 3. - P. 193-198.

483. Evans D.A., Palmyra, Morrison R.A. Tomato anther culture: Пат. 4835339 США ,МКИЛ A 01 H 1/04, A 01 H 1//00 Заявл. 14.02.86; Опубл. 30.05.1989; НКИ 800/1

484. Fadel F., Wenzel G. Medium-genotype-interaction on androgenetic haploid production in wheat // Plant Breed. 1990. - V. 105, N 4. - P. 278-282.

485. Falavigna A., Hussey G. Moltiplicazione in vitro della cipolla (Allium сера) // Genet. Agr. 1980. - V.34, N 1-2. - P. 165-166.

486. Fang Guo-wei, Liang Hai-men. Studying of value of processing by a cold on efficiency of anther culture of rice // Acta phytophysiol sin. 1985. - V.l 1, N 4. P. 366-380.

487. Feng G.H., Ouyang J.W. Fertility of Triticum aestivum plants derived from anther culture // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 1989. - V.18, N 2. - P. 227230.

488. Ferrant V., Bouharmont V. Origin of gynogenic embryos of Beta vulgaris L. // Sex. Plant Reprod. 1994. - N 7. - P. 12-16.

489. Fils-Lycaon B.R., Wiersma P.A., Eastwell K.C., Sautiere P. A cherry protein and its gene, abundantly expressed in ripening fruit, have been identified as thau-matin-like // Plant Physiology. 1996. - V.l 11. - P. 269-273.

490. Fitch M.M., Moore P.H. Haploid production from anther culture of Saccha-rum spontaneum L. // Z. Pflanzenphysiol. 1983. - V.109, N 3. - P. 197-206.

491. Flinn B. S., Webb D.T., Georgis W. In vitro control of caulogenesis by growth regulators and media components in embryonic explants of eastern white pine (Pinus strobus) // Can. J. Bot. 1986. - V.64, N 9. - P. 1948-1956.

492. Forche F., Neumann R.H. Der einflu(3 verschiedener kulturfaktoren auf die gewinnung haoloider pflanzen aus antheren von Datura inoxia und Nicotiana tabacum ssp. // Z. Pflanzenzucht. 1977. - V.79, N 3. - P. 250-255.

493. Foroughi-Wehr В., Friedt W. Rapid production of recombinant barley yellow mosaic virus resistant Hordeum vulgare lines by anther culture // Theor. and Genet. -1984. V.67, N4. P. 377-382.

494. Foroughi-Wehr В., Friedt W. Responsiveness to anther culture of Hordeum vulgare cv. 'Dissa' and its parents // Barley Genet. Newslett 1981. - N. 11 - P. 5053.

495. Foroughi-Wehr В., Friedt W., Wenzei G. On the genetic improvement of an-drogenetic haploid formation in Hordeum vulgare L. // Theor. and Appl. Genet.1982. V. 62, N.l 13. - P. 233-239.

496. Foroughi-Wehr В., Friedt W., Wenzei G. Field experiments with anther derived lines of barley (Hordeum vulgare) and rye (Secale cereale) // Plant. Cell. Cult. Crop Improv.: Proc. Int. Symp., Calcutta, 6-10 Des., 1981. New York, London,1983.-P. 475-483.

497. Foroughi-Wehr В., Mix G., Gaul H., Wilson H.M. Plant production from cultured anthers of Hordeum vulgare L. // Z. Pflanzenzucht 1976. - V.77, N 3. - P. 198-204.

498. Foroughi-Wehr В., Pickering R., Wolfgang F. Related response of barley cultivars to the «bulbosum» and anther culture techniques of haploid production // Barley Genet. Newslett. 1981. - N 11. - P. 54-59.

499. Fossard R.A. Terminology in «haploid» work // Haploids in higher plants. -Guelph, 1974. P. 403^10.

500. Friedt W. Autotetraploids derived from anther culture of winter barley (Hordeum vulgare L.) // Barley Genet. Newslett. 1984. - N 14. - P. 68-69.

501. Friedt W., Foroughi-Wehr B. Microspore derived chromosome number and structural variants of barley (Hordeum vulgare L.) // Barley Genet. Newslett. 1980. -N10.-P. 16-20.

502. Fromm M.E., Taylor L.P., Walbot V. Expression of genes transferred into monocot and dicot cells by electroporation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. -V.82.-P. 5824-5825.

503. Fu L., Tang D. Индукция регенерантов в культуре пыльников Litchi chinensis // Acta genet, sin. 1983. - V. 10, N 5. - P. 369-374.

504. Fujieda K., Ando Y., Fujita Y. Propagation of welsh onion through shoot tip culture // J. Fac. Agr. Kyushu Univer. 1977. - V.22. -P. 89-98.

505. Fujieda K., Matsuoka N., Fujita Y. Vegetative multiplication of onion Allium сера L. // Jap. J. Soc. Hortic. Sci. 1979. - V. 48. - P. 186-194.

506. Fujimura Т., Komamine A. Mode of action of 2,4-D and zeatin on somatic embryogenesis in carrot cell suspension culture // Z. Pflanzenphysiol. 1980. - V.99. -P. 1-8.

507. Gabr M.F., El-Henawy H.M„ Sabour A.M. In vitro regeneration of date palm embryos as affected by 2ip concentration and period of daily light exposure // Egypt. J. Hort. 1986. - V.l3, N 1. - P. 49-53.

508. Galieva E.R., Kuchin M.D., Abramov S.N. Ultrastructure of wheat anther wall cells at the early stages of culture. // Embryology and seed reproduction: Abstracts XI Int. Symp. July 3-7, 1990. Leningrad, 1990. - P. 46.

509. Gamborg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of glucanases in cultures of wheat and barley // Can. J. Biochem. 1968. - V.46, N 5. - P. 417421.

510. Gao Xiuyun Андрогенез и формирование растений из пыльцы картофеля // Acta Hortic. Sin. 1988. - V. 15, N 4. - P. 264-267.

511. Gathercole R.W.E., Street H.E. Isolation, stability and biochemistry of p-fluorophenylalanineresistant cell line of Acer pseudoplatanus L. // New Phytol. -1976. -V. 77, N 1. P. 29-41.

512. Gaul H., Foroughi-Wehr В., Mix G., Wilson H.M. Plants produced by barley anther culture: Further observations // Acta. biol. jugosl. 1976. - F8, N 2. - P. 111118.

513. Gautheret R.J. Sur la possibilite de realiser la culture indefmie des tissus de tubercules de Carotte // Compt. Rend. Acad. Sci. 1939. - V.208. - P. 118-121.

514. Gelebart P. Obtention de plantes haploi'des par culture in vitro d'ovaires non fecondes d'Helianthus annuus L. Bui. Soc. Bot. France. Acta Bot. 1986. - V. 133, N4.-P.71.

515. Gelebart P., San L.H. Obtention de plantes haploi'des par culture in vitro d'ovaires et d'ovules non fecondes de tournesol (Yelianthus annuus) // Agronomie. -1987. -V.7.- 81-86.

516. Genovesi A.D., Collins G.B. In vitro production of haploid plants of corn via anther culture // Crop. Sci. 1982. - V.22, N 6. - P. 1137-1144.

517. Ghosh В., Sen S. Somatic embryos in Asparagus cooperi Baker. // Curr. Sci. 1989. - V.58, N 5. - P. 256-257.

518. Gibson M.S. Diploid plant production from ovule cultures of sugarbeet // Proc. N. D. Acad. Sci. 1987. - V. 41, N 11. - P. 11.

519. Giewart J. McD., Hsu C.L. Hybridization of diploid and tetraploids cottons through in-ovulo embryo culture // J. Hered. 1978. V. 69, N 6. - 404-408.

520. Gilbert M.O., Zhang Y.Y., Punja Z.K. Introduction and expression of chiti-nase encoding genes in carrot following Agrobacterium-mediated transformation // In vitro Cellular and Developmental Biology Plant. 1996. - V 32, N 3. - 171-178.

521. Gill B.S., Waines J.G., Sharma H.C. Endosperm abortion and the production of viable Aegilops Squarrosa x Triticum boeoticum hybrids by embryo culture // Plant. Sci. Lett. 1981. - V. 23, N 2. - P. 181-187.

522. Gorecka K., Krzyzanowska D. The use androgenesis in vitro to obtain homozygous lines of vegetable plants // Vegetable Crops Bull. 2001. - V.54. - P. 711.

523. Gorecki R., Gorecka K., Krzyzanowska D., Kozik E., Nowak R., Adasik B. Rooting and adaptation of androgenic carrot plants // Vegetable Crops Bull. 2001. -V.54.-P. 25-28.

524. Gosal S.S., Bajaj Y.P.S. Interspecific hybridization between Vigna mungo and Vigna radiata through embryo culture // Euphytica. 1983. V.32, N 1. - P. 129— 137.

525. Goska M., Jassem B. Histological observation of sugar-beet ovules in in vitro cultures // Bull. Pol. Acad. Sci., Biol. Sci. 1988. - V.36, N 7-9. - P. 171-175.

526. Gregory F.G., Purvis O.N. Studies in vernalization of cereals // Ann. Bot. New. Ser.- 1938.-N2.-P. 5.

527. Gresshoff P.M., Doy C.H. Development and differentiation of haploid Ly-copersicon eskulentum (tomato) // Planta. 1972a. - V.107. - P. 161-170.

528. Gresshoff P.M., Doy C.H. Haploid Arabidopsis thaliana callus and plants from anther culture // Aust. J. Biol. Sci. 1972 b. - V.25. - P. 259-264.

529. Griga M., Sladky Z. Regeneration of plantlets from ovules of carnation (Di-anthus caryophyllus L.) after placental pollination in vitro // Scripta Fac. Sci. Nat. Univ. Purk. Brun. 1982. - V.12, N 8. - P. 377-381.

530. Grout B.W.W. Was development on leaf surfaces of Brassica oleracea var. Currawong regenerated from meristem culture // Plant. Sci. Let. 1975. - V.5. - P. 401-405.

531. Grout B.W.W., Aston M.J. Transplanting of cauliflower plants regenerated from meristem culture: I. Water loss and water transfer related to changes in leaf wax to xylem regeneration // Hort. Res. 1977. - V. 17. - P. 1-7.

532. Grunewaldt J., Malepszy S. Beobachtungen an antherenkallus von Hordeum vulgare L. // Z. Pflanzenzucht 1975. - V. 75, N 1. - P. 55-61.

533. Grzebelus D., Szklarczyk M., Michalik B. The use of RAPD markers for genotype identification of carrot lines and F. hybrids // J. Appl. Genet. 1997. -V.38A.-P. 33-41.

534. Guha S., Maheshwari S.C. Development of embryoids from pollen grains of Datura in vitro // Phytomorphology. 1967. - V. 17. - P. 454-461.

535. Guha S., Maheshwari S.C. In vitro production of embryos from anthers of Datura // Nature. 1964. - V.204. - P. 497.

536. Gupta P.P. Microspore derived haploid, diploid and triploid plants in Petunia violacea Lindl. // Plant Cell Repts. 1983. - V.2, N 5. - P. 255-256.

537. Guzman E.V. The growth and development of cocoanut «makapuno» embryo in vitro // Philipp. Agr. 1970. - V.53, N 10. - P. 566-579.

538. Guzman E.V. The growth and development of cocoanut «makapuno» embryo in vitro 1. The induction of rooting // Philipp. Agr. 1969. - V.53, N 2. - P. 6578.

539. Hadwiger M.A., Heberle-Bors E. Pollen plant production in Triticum tur-gidum ssp. durum // Gen. Manipulat. Plant Breed.: Proc. Int. Symp., Berlin (West), Sept. 8-13,1985. Berlin, New York, 1986b. - P. 303-305.

540. Hadwiger M.A., Heberle-Bors E. Pollen plant production in Triticum tur-gidum spp. durum // Nucl. Techn. and in vitro Cult. Plant Improv.: Proc. Int. Symp., Vienna, 19-23, Aug., 1985.-Vienna, 1986a.-P. 213-220.

541. Halberg N., Olesen A., Tuvesson I.K.D., Andersen S.B. Genotypes of perennial ryegrass (Lolium perenne L.) with high anther-culture response through hybridization // Plant Breed. 1990. - V.105, N 2. - P 89-94.

542. Hammerschlag F.A. Factors influencing the frequency of callus formation among cultured peach anthers // Hort Science. 1983. - V.l 8, N 2. - P. 210-211.

543. Han-min Y., Keppenne V.D., Beenziger P.S., Berke Т., Lieng G.H. Effect of genotype and medium on wheat (Triticum aestivum L.) anther culture // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 1990. - V.21, N 3. - P. 253-258.

544. Hanning E. Uber die kultur von Cruciferen embryonen ausserhalb des embryosacks // Bot. Zeitung. 1904. - V.62. - P. 45-80.

545. Hansen G., Chilton M.-D. «Agrolistic» transformation of plant cell integration of T-strands generated in plant // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. -P.14978-14983.

546. Harada H., Kyo M., Imamura J. Induction of embryogenesis and regulation of the developmental pathway in immature pollen of Nicotiana species // Curr. Top. Dev. Biol. -Orlando, 1986. V.20. - P. 397-417.

547. Hassawi D.S., Liang G.H. Affect of cultivar, incubation temperature, and stage of microspore development on anther culture in wheat and triticale // Plant Breed. 1990. - V.105, N 4. - P. 332-336.

548. Hassawi D.S., Sears R.G., Liang G.H. Microspore development in the anther culture of wheat (Triticum aestivum L.) // Cytologia 1990. - V.55, N 3. - P. 475478.

549. Havel L., Novak F.J. In vitro pollination in maize // Fert. and. Embryogenes. Ovulated Plants: Proc. 7 Int. Cytoembryol. Symp. High Tatra (Rackova dolina), June 14-17,1982. Bratislava, 1983. - P. 265-266.

550. Havranek P. Viruproste klony cesneku kuchynskeho ziskane z meristematickych kultur // Ochrana rostlin. Praha, 1972. - V.8, N 4. - P. 291-298.

551. Havranek P., Novak F.J., The bud formation in the callus cultures of Allium sativum L. // Z. Pflanzenphysiol. Bd. 1973. - V.68. - P. 308-318.

552. Havranek P., Vagera J. Regulation of in vitro androgenesis in tobacco through iron-free media // Biol. plant. 1979. - V.21, N 6. - P. 412-417.

553. He Т., Luo K., Han S., Guo X., Tu S., Li X. Эффективность культуры пыльников гибридов риса javanica х indica // Chin. J. Appl. and Environ. Biol. -2004.-V. 10, N2.-P. 146-149.

554. Heberle E., Reinert J. Factors of haploid production by isolated pollen cultures // Naturwissenschaften. -1977. V.64, N 2. - P. 100-101.

555. Heberle-Bors E. Genotypic control of pollen formation in Nicotiana tabacum L. // Theor. and Appl. Genet. 1984. - V.68, N 5. - P. 475^79.

556. Heberle-Bors E. In vitro haploid formation from pollen: a critical review // Theor. Appl. Genet. 1985. - V.71.-P. 361-374.

557. Henry Y., De Buyser J. Androgenese sur des Ble Tendres en Cours de Selection. 2. L'Obtention des Grains. //Z. Pflanzenzucht. 1980. - V.84, N 1. - P. 9-17.

558. Henry Y., De Buyser J., Guenegou Т., Ory C. Wheat microspore embryo-genesis during in vitro anther culture // Theor. and Appl. Genet. 1984. - V.67, N 2. - P. 439-442.

559. Henry Y., De Buyser J., Le Brun J. Androgenese sur des Ble Tendres (Triticum aestivum) en Cours de Selection. 3. Electrophorese des gliadines de quelgues haploi'des doubles // Z. Pflanzenzucht. 1980. - V.85, N 4. - P. 322-327.

560. Herr J.M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms // Am. J. Bot. 1971. - V. 58. - P. 785-790.

561. Heszky L. A new artificial hybrid of species from the genera Festuca and Lo-lium (Festuca pratenses Huds x Lolium temulentum L.) // Acta Agron. Acad. Sci. Hung. 1972. - V.21, N 3-4. - P. 363-368.

562. Heszky L., Mesch J. Anther culture investigations in cereal gene bank collection // Z. Pflanzenzucht. 1976. - V.77, N 3. - P. 187-197.

563. Heszky L., Paal H. Haploid novenyek felnevelese pollenekbol a Nicotiana tabacum L. portokkulturajaban // Bot. kozl. 1972. - V.59, N 2. - P. 125-127.

564. Hildebrandt A.C. Stimulation or inhibition of virus-infected and insect gall tissues and single cell clones // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1958. - V.44, N 3. - P. 354-363.

565. Hildebrandt A.C., Riker A.J. Viruses and single cell clones in plant tissues cultures // Proc. Fed. Amer. Soc. Exp. Biol. 1958. - V. 17. - P. 986-993.

566. Hirth L., Durr A Donnes recentes sur la multiplication du virus de la mosai-que du tabac dans les tissues de tabac cultives in vitro // Cultures tissus plantes C.N.R.S. 1971. - N 193. - P. 481-498.

567. Hisajima S. Microplant propagation through shoot formation from seeds and embryos // Plant Tissue Cult.; Proc. 5 Int. Congr. Plant Tissue and Cell. Cult., Tokyo and Lake Yamanaka, July 11-16,1982. Tokyo, 1982. - P. 141-142.

568. Hofer M., Grafe Ch. Induction of doubled haploids in sweet cherry (Prunus avium L.) // Euphytica. 2003. - V.130, N 2. - P. 191-197.

569. Hoffmanowa A. Some aspects of sugar nutrition of excised embryos of Lu-pinus luteus L. and Brassica oleracea L. // Acta Soc. Bot. Pol. 1964. - V. 33, N 1. -P. 193-210.

570. Holdgate D.P. Economic and technological problems associated with bulk production of plants from tissue culture // Biochem. Soc. Trans. 1980. - V.8, N 4. -P. 477-479.

571. Hosemans D., Bossoutrot D. Induction of haploid plants from in vitro culture of unpollinated beet ovules (Beta vulgaris L.) // Z. Pflanzenzucht 1983. - V. 91, N l.-P. 74-77.

572. Ни H., Xi Z., Zhuang J., Ouyang J., Jia S., Jia X., Jing J., Zhou S. Генетическое изучение образовавшихся из пыльцы растений пшеницы (Triticum aestivum) // Acta genet, sinica. 1979. - V.6, N 3. - P. 322-330.

573. Hu Han. Use of haploids in crop improvement // Biotechnology in international agricultural research / International Rice Research Institute. 1985. - P. 7581.

574. Hu K.L., Matsubara S., Murakami K. Haploid plant production by anther culture in carrot (Daucus carota L.) // J. Japan Soc. Hort. Sci. 1993. - V.62, N 3. -P.561-565.

575. Hu S., Li X. Культура семяпочек межвидовых гибридов дикого диплоидного хлопчатника с тетраплоидными сортами, развитие зародышей и проростков // Acta genet, sinica. 1982. - V.9, N 1. - P. 57-62.

576. Huang Q.T., Yang H.Y., Zhou C. Embryological observations on ovary culture of unpollinated young flowers in Hordeum vulgare L. 1982. - V.24, N 3. - P. 295-300.

577. Hughen A. Rapid regeneration of wheat in vitro // Ann. Bot. 1983. - V.51, N6.-P. 851-853.

578. Huguette S., Maryse Т., Alain C. The ultrastructure of micropropagated and greenhouse rose plant stomata // Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 1993. - V.32, N 2. - P. 227-233.

579. Hussey G. In vitro propagation of the onion Allium сера by axillary and adventitious shoot proliferation // Sci. Hortic. 1978. - N 9. P. 227-236.

580. Hussey G., Falavigna A. Origin and production of in vitro adventitious shoots in the onion, Allium сера L. // J. Exp. Bot. 1980. - V.31, N 125. - P. 16751686.

581. Ionescu A. Cercetari preliminare de haploidie prin culturi de antere la tomate // An. Inst. cerc. legumicult. si flori cult. 1984. -N 7. - P. 79-82.

582. Ivers D.R., Palmer R.G., Fehr W.R. Anther culture in soybeans // Crop. Sci. 1974. - V. 14, N 6. - Р/ 891-893.

583. Jain R.K., Brune U., Friedt W. Plant regeneration from in vitro cultures of cotyledon explants and anther of Sinapis alba and its implications on breeding of cru-cifers // Euphytica. 1989. - V.43, N 1-2. - P. 153-163.

584. Janabi K., Picard E. Transfer chez le ble tendre par androgenese in vitro des genes de compatibilite avec Hordeum bulbosum (kr 1 kr 2). // Acad. sci. 1981. - ser 3. V.292,N2.-P. 247-250.

585. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants // EMBO J. 1987. - N 6. - P. 3901-3907.ё

586. Jin-Zhuo D., Shi-Rong J. High efficiency plant regeneration from cotyledons of watermelon (Citrullus vulgaris Schrad.) // Plant Cell Rapt. — 1991. V.9, N10. -P. 559-562.

587. Johansson L., Eriksson T. Effects of carbon dioxide in anther culture // Physiol plant. 1984. - V.60. N 1. - P. 26-30.

588. Johansson L.B. Effects of activated charcoal, cold treatment and elevated C02-concentrations on embryogenesis in anther culture // Gen. Manipulat. Plant Breed.: Proc. Int. Symp., Berlin (West), Sept. 8-13,1985. Berlin, New York, 1986. -P. 257-264.

589. Jones L.E., Hildebrandt A.C., Riker A.L., Wu J.H. Growth of somatic tobacco cells in microculture // Amer. J. Bot. 1960. - V.47, N 7. - P. 468-475.

590. Jdrgensen C.A. The experimental formation of heteroploid plants in the genus Solanum// J. Genet.- 1928.- V.19. -P. 133-211.

591. Juretic В., Katavic V., Jelaska S. In vitro clonal multiplication of Cucurbita pepo by single-node culture // Acta. bot. croat. 1989. - V.48. - P.27-34.

592. Kamada H., Kobayashi K., Kiyosue Т., Harada H. Stress induced somatic embryo-genesis in carrot and its applications to synthetic seed production // In vitro Cell Div. Biol. -1989. V.25. - P Л163-1168.

593. Kameya Т., Hinata K. Induction of haploid plants from pollen grains of Brassica // Jap. J. Breed. 1970a. - V.73, N 1. - P. 82-87.

594. Karunaratne Seetha, Kurukulaarachichi Cecily, Gamage Chandra A report on the culture of embryos of dwarf coconut, Cocos nucifera L. var nana in vitro // Cocos. 1985.-N 1. -P. 1-8.

595. Kasperbauer M.J., Buckner R.C., Springer W.D. Haploid plants by anther-panicle culture of tall fescue // Crop Sci. 1980. - V.20, N 1. - P. 103-107.

596. Kasperbauer M.J., Collins G.B. Anther derived haploids in tobacco evaluation of procedures // Crop. Sci. 1974. - V.14, N 2. - P. 305-307.

597. Kasperbauer M.J., Collins G.B. Reconstitution of diploids from leaf tissue of anther-derived haploids in tobacco // Crop. Sci. 1972. - V. 12, N 1. - P. 98-101.

598. Katayama V. Karyological comparisons of haploid plants from octoploid Aegiloristicum and diploid wheat // Jap. J. Bot. 1935. - V.7, N 3^1. - P. 349-380.

599. Kavi Kishor P.B., Aruna M., Reddy G.M. Plant regeneration from haploid callus of indica rice // Proc. Indian Nat. Sci. Acad. B. 1989. - V.55, N 3. - P. 193201.

600. Kehr A.E., Schaeffer G.W. Tissue culture and differentiation of garlic // Hortscience.- 1976. V. 11, N 4. - P. 422-423.

601. Keller J. Culture of unpollinated ovules, ovaries, and flower buds in some species of the genus Allium and haploid induction via gynogenesis in onion (Allium сера L.) // Euphytica. 1990a. - V.47. - P. 241- 247.

602. Keller J. Results of anther and ovule culture in some species and hybrids the genus Allium L. // Arch. Zuchtungsforsch. 1990c. - V.20, N 3. - P. 189-197.

603. Keller J., Korzun L, Ovary and ovule culture for haploid production // In vitro haploid production in higher plants: Fundamental aspects and methods / Eds J.S. Mohan et al. Dordrecht, Boston, London, 1996. - V.l. - P. 217-235.

604. Keller W.A. Armstrong K.S., Roche A.I. The production and utilization of microspore-derived haploids Brassica crops // Plant cell culture in crop improvement. / Eds. S.K. Sen and Giles. K.L. New York, London: Plenum Press.,1982. - P. 169183.

605. Keller W.A., Armstrong K.S. High frequency production of microspore-derived plants from Brassica napus anther cultures // Z. Pflanzenzucht 1978. -V.80, N 2. - P. 100-108.

606. Keller W.A., Stringam G.R Production and utilization of microspore-derived haploid plants // Frontiers of Plant Tissue Culture / Ed. T.A. Thorpe. Calgary: Univ. of Calgary Press, 1978.-P. 113-122.

607. Kimber G., Riley R. Haploid angiosperms // Bot. Rev. 1963. - V. 29, N 4. -P. 480-531.

608. Kitto S.L., Janick J. Production of synthetic seeds by encapsulating embryos of carrot // J. Am. Soc. Hortic. Sci. 1985. - V.l 10. - P. 277-282.

609. Kivihaiju E., Laurila J., Lehtonen M., Tanhuanpaa P., Manninen O. Anther cultured properties of oax wild red oat progenies and a search for RAPD markers associated with cultured ability // Agr. and Food Sci. 2004. - V.l3, N 1-2. - P. 151— 162.

610. Kleijer J., Schmid J. Winzeler H., Fried P.M. La culture d'antheres possibili-tes et limites la selection du ble et de Tepeautre // Rev. suisse agr. 1986. - V.l8, N 6.-P. 305-311.

611. Klein T.M., Wolf E.D., Wu R., Sanford J.C. High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into cells // Nature. 1987. - V. 327. - P. 70-73.

612. Klimaszewska K., Keller W.A. The production of haploids from Brassica hirta Moench (Sinapis alba L.) anther culture // Z. Pflanzenphysiol. 1983. - V.l09, N3.-P. 235-241.

613. Knudsen S., Due I.K., Andersen S.B. Components of responds in barley anther culture // Plant Breed. 1989. - V.103, N 3. - P. 241-246.

614. Kobeticova D. Rast izolovaanych embryi Zea mays у mediach so stupajucou koncentraciom sacharozy //Biologia (CSSR). 1971. - V.26, N 4. - P. 341-348.

615. Kochhar Т., Sabharwal P., Engelberg J. Production of homozygous diploid plants by tissue cultured technique // J. Hered. 1971. - V. 62. - P. 59-61.

616. Kohler F., Wenzel G. Regeneration of isolated barley microspores in conditioned media and trails to characterize the responsible factor // Plant Physiol. 1985. - V.121, N 2. -P. 181-191.

617. Kohler K.H., Binh T. Kahi M. Wechselwirkungen von Licht und Phytohormonen bei der Gewebekultur // Potsdam. Forsch B. 1988. - N 57. - P. 128-132.

618. Kononowicz H., Kononowicz A.K., Janick J. Asexual embryogenesis via callus of Theobroma cacao L. // Z. Pflanzenphysiol. 1984. - V.l 13, N 4. - P. 347358.

619. KostofF D. An androgenic Nicotiana haploid // Ztschr. f. Zellforhg. u. Mikr. Anatomie. -1929. Bd. 9. - S. 640-642.

620. Kott L.S., Flack S., Kasha K.J. A comparative study of initiation and development of embryogenic callus from haploid embryos of several barley cultivars. II. Cytophotometry of embryos and callus // Can. J. Bot. 1986. - V.64, N 9. - P. 21072112.

621. Kott L.S., Polsoni L., Beversdorf W.D. Cytological Aspects of isolated microspore culture of Brassica napus // Can. J. Bot. 1988. - V.66, N 8. - P. 16581664.

622. Kriiger H.U. Untersuchungen zur Antherenkultur von Spargel (Asparagus officinalis L.) //Arch. Zuchtungsforsch.- 1985. V.l5,N 1. - P. 53-60.

623. Kruse A. An in vitro/in vivo embryo culture technique // Hereditas. 1974. -V.77, N 2. - P. 219-224.

624. Kuo C.S. The preliminary studies on culture of unfertilized ovary of rice in vitro // Acta. Bot. Sinica. 1982. - V.24. N 1. - P. 33-38.

625. Kuo Chung-Shen, Lu Wenliang, Kui Yao-Lin. Corn (Zea mays L.): production of pure lines through anther culture // Greps I. Berlin e. a., 1986. - P. 168-180.

626. Kuo John-shang, Wang Yu-ying, Chien Nan-fan, Ku Shu-jong, Kung Ming-liang, Hsu Hui-chun Изучение культуры in vitro пыльников Nicotiana tabacum L. and Capsicum annuum L. // Acta bot. sinica. 1973. - V.l5, N 1. - P. 37-52.

627. La Rue C.D. The growth of plant embryos in culture // Bull. Torrey. Bot. Club. 1936. - V.63, N 7. - P. 365-382.

628. Lagaja S.W., Hough L.F., Bailey C. The responses of immature peach embryos to low temperature treatment // Proc. Amer. Soc. Hortic. Sci. 1960. - V.75. -P. 171-179.

629. Lagriffol J., Monnier M. Etude de divers parametres en vue de la culture in vitro des ovules de Capsella bursa-pastoris // Can. J. Bot. 1983. - V.61, N 12. - P. 3471-3477.

630. Laibach F. Das taubwerden von bastardsamen und die ku kunstliche auffrucht fruh absterbender bastard-embryonen //Zeitschr. Bot. 1925. - V. 17, N 8. -P. 417-459.

631. Lakshmi S.G., Dore S.R., Chacko E.K., Bhat R.N. Studies on anther culture I. Induction of androgenic plants and callus in Petunia hybrida Vilm. // Curr. Sci. (India). 1976. - V.45, N 20. - P. 714-715.

632. Lammerts W.E. Embryo culture an affective technique for shortening the breeding cycle of deciduous trees and increasing germination of hybrid seed // Amer. J. Bot. 1942. - V.29, N 2. - P. 166-171.

633. Lammerts W.E. Use of embryo culture in rose breeding // Plants Gardens. -1946.-N2.-P. 2.

634. Lange W. Crosses between Hordeum vulgare L. and H. bulbosum L. 1. Production, morphology and meiosis of hybrids, haploids and dihaploids // Euphytica. -1971.-V.20, N l.-P. 14-29.

635. Langridge W.H.R., Li B.J., Szalay A.A. Electric field mediated stable transformation of carrot protoplast with naked DNA // Plant Cell Rep. 1985. - V.4. P. 355-359.

636. Laroche M., Verhoyen M. Essai de multiplication rapide in vitro de l'echalote (Allium ascalonicum L.) // Meded. Fac. Landbouw. Rijksuniv. Gent. -1980.-V. 45.-P. 323-333.

637. Lars J. Embryogenesis in anther cultures of some species in the families So-lanaceae, Ranunculaceae and Papaveraceae // Acta. univ. upsal. Abstis Uppsala Diss. Fac. Sci.-1983.-42 pp.

638. Lay-Allemand C., Cornu D. Culture in vitro d'embryos isoles de noyer commun (Juglans regia L.) // Ann. sci. forest. 1986. - V.43, N 2.- P. 189-197.

639. Lazar M.D., Baenziger P.S., Schaeffer G. W. Combining abilities and herita-bility of callus formation and plantlet regeneration in wheat (Triticum aestivum L.) anther culture //Theor. and Appl. Genet. 1984a. - V.68, N. 1-2. - P. 131-135.

640. Lazar M.D., Schaeffer G. W., Baenziger P.S. Cultivar and cultivar x environment effects on the development of callus and polyhaploid plants from anther cultures of wheat // Theor. and Appl. Genet. 1984b. - V.67, N 2-3. - P. 273-277.

641. Lazar M.D., Schaeffer G. W., Baenziger P.S. The effects of interactions of culture environment with genotype on wheat (Triticum aestivum) anther culture response // Plants Cell Repts. 1990. - V.8, N 9. - P. 525-529.

642. Leelavathi S., Reddy V.S., Sen S.K. Somatic cell genetic studies in Brassica species I. High frequency production of haploid plants in Brassica alba (L.) // Plant Cell Repts. 1984. - V.3, N 3. - P. 102-105.

643. Leelavathi S., Siva R.V., Sen S.K. Somatic cell genetic studies in Brassica species II. Production of androgenetic haploid in Brassica nigra (L.) Koch. // Euphytica. 1987. - V.36, N1. - P. 215-219.

644. Leike H., Jahr W. Stand der anwendung der in vitro vermehrungwichtiger genotypen in der gemuseziichtung // Gartenbau 1984. - V.31, N 1. P. 7-8.

645. Lelu M.A., Bollon H. Obtention d'haploides par culture d'antheres de Brassica oleracea L. var. capitata et var. gemmifera // C. r. Acad. sci. 1985. - Ser. 3, 300, N2.-P. 71-76.

646. Lescure A.M. Selection of markers of resistance to base-analogues in somatic cells cultures of Nicotiana tabacum // Plant. Sci. Lett. 1973. - V.l. - P. 375— 383.

647. Leshem B. Growth of carnation meristems in vitro: anatomical structure of abnormal plantlets and the effect of agar concentration in the medium and their formation // Ann. Bot. 1983. - V.52. - P. 413^115.

648. Li J.W., Li S.N. Генетические особенности пыльцевых растений риса // Bull. Akad. Sci. D. P. R. Korea. 1981. -N 1. - P. 50-52.

649. Li Y., Guo Z., Wang F. Культура незрелых зародышей подсолнечника // Acta bot. Yunnanica.- 1988.-V.10,N l.-P. 79-86.

650. Liang C.L., Sun C., Liu T.L., Chiang J.C. Studies on interspecific hybridization in cotton // Sci sinica. 1978. - V.21, N 4. - P. 545-560.

651. Ling D.H., Chen W.Y., Chen M.F., Ma Z.R. Somatic embryogenesis and plant regeneration in an interspecific hybrid of Oryza // Plant Cell Repts. 1983. -V.2, N 4. - P. 169-171.

652. Linthorst H.J.M., van Loon L.C., van Rossum C.M.A. et al. Analysis of acidic and basic chitinases from tobacco and petunia and their constitutive expression in transgenic tobacco // Mol. Plant-Microbe Interact. 1990. - n 3. - P. 252-258.

653. Liu D., Raghothama R.G., Hasegawa H.M., Bressan R.A., Osmotin over expression in potato delays development of disease symptoms // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.-1994.-N91.-P. 1888-1892.

654. Liu J.R., Jeon J.H., Yang S.G., Lee H.S., Song N.M., Jeong W.J. Dry type of carrot (Daucus carota L.) artificial seeds // Scientia Horticulture. 1992. - V.51. - P. 1-11.

655. Liu M.-Ch., Chen W.-H. Tissue and cell culture as aids to sugarcane breeding. I. Creation of genetic variation through callus culture // Euphytica. 1976. -V.25, N 2. - P. 393-403.

656. Loo S. W., Wang F.H. The culture of young Conifer embryos in vitro // Science. 1943. - V.98, N 2255. - P 544.

657. Lupotto E. Improvement in plantlet differentiation from anther culture of rice // Genet, agr. 1982. - V.36. N 1-2. - P. 129-142.

658. Lux H., Herrmann L., Wetzel C. Production of haploid sugar beet (Beta vulgaris L.) by culturing unpollinated ovules // Plant Breed. 1990. - V.l04. - P. 177183.

659. Macdonald M.V., Hadwiger M.A., Aslam F. N., Ingram D.S. The enhancement of anther culture efficiency in Brassica napus ssp. oleifera Metzg. (Sinsk.) using low doses of gamma irradiation //- 1988. V.l 10, N 1. - P. 101-107.

660. Machteld Y.Q., Мок С., Мок D.W.S., Stang J.R. Phenotypic and cytological variation among plants derived from anther cultures of Lilium longiflorum // In vitro Cell, and Dev. Biol. 1988. - V.24, N 5. - P. 471^76.

661. Maene I.J., Debergh P. Optimization of the transfer of tissue cultured shoots to in vitro conditions // Acta. Hort. 1987. - V.212. - P. 335-348.

662. Maheshwari N. In vitro culture of excised ovules of Papaver somniferum L. // Science. 1958. - V.127. - P. 342.

663. Maheshwari N., Lai M. In vitro culture of excised ovules of Papaver somniferum L. // Phytomorphology. -1961.-Nil.-P. 307-314.

664. Maheswaran G., Williams E.G. Primary and secondary direct somatic em-bryogenesis from immature embryos of Brassica campestris // J. Plant Physiol. -1986. -V. 124, N 5. P. 455^463.

665. Maksoud M.A., Bondok A., El-Shami M.R., Gabr M.F. Garlic tissue culture organogenesis in callus cultures // Egypt. J. Hortic. 1983. - V.l0, N 2. - P. 107— 114.

666. Malehorn D.E., Borgmeyer J.R., Smith K.E., Shah D.M. Characterization and expression of an antifungal zeamatin-like protein (Zip) gene from Zea mays // Plant Physiology. 1994,-V.l06.-P. 1471-1481.

667. Malepszy S., Grunewaldt J. Ein beitrag zur erzeugung von haploiden beiHordeum vulgare L. // Z. Pflanzenzucht. 1974. - V.72, N 3. - P. 206-211.

668. Malepszy S., Nadolska-Orczyk A. In vitro culture of Cucumis sativus. 1. Regeneration of plantlets from callus formed by leaf explants // Z. Pflanzenphysiol. -1983.-V.111,N3.-P. 273-276.

669. Malepszy S., Niemirowicz-Szczytt K., Wiszniewska J. Cucumber (Cucumis sativus L.) somatic embryogenesis in vitro // Pr. nauk. USI. Katowicach: Acta Biol. -1982.-N10.-P. 218-220.

670. Maliga P., Martin L., Sz-Breznovits A. 5-bromo-deoxyuridine-resistant cell lines from haploid tobacco // Plan. Sci. Lett. 1973a. - V.l, N 3. - P. 119-121.

671. Maliga P., Sz-Breznovits A., Martin L. Streptomycin-resistant plants from callus culture of haploid tobacco // Nature. 1973b. - V.244, N 5410. - P. 29-30.

672. Maliga P., Szilagvi M. Portoktenyeszetbol nyert haploid Nicotiana tabacum L. citologiai vizsgalata // Bot. kozl. 1973. - V.60, N 2. - P. 77-82.

673. Marciniak K., Kaczmarek Z., Adamski Т., Surma M. The anther-culture response of triticale line X tester progenies // Cell and Mol, Biol. Lett. 2003. - V.8, N 2.-P. 343-351.

674. Martin A., Cubero J.I. The use of Hordeum chilense in cereal breeding // Cereal Res. Commun. -1981. -V.9, N 4. P. 317-323.

675. Masuda K., Kikuta Y., Okazava Y. A Revision of the Medium for Somatic Embryogenesis in Carrot Suspension Culture // J. Fac. Agr. Hokkaido Univ. 1981. -Vol. 60. - P.—183—193.

676. Matsubara S., Hihara H. Onion bulblet regeneration on receptacles in vitro and in vivo // Jap. J. Soc. Hortic. Sci. 1978. - V.46. - P. 476-486.

677. Mattingly C.F., Collins G.B. The use of anther-derived haploids in Nicotiana. III. Isolation of nullisomics from monosomic lines // Chromosoma. 1974. -V.46, N1.-P. 29-36.

678. Mauch F., Mauch-Mani В., Boiler T. Antifungal hydrolyses in pea tissue // Plant Physiol 1988. - V. 88. - P. 936-942.

679. Mauch F., Staehelin L.A. Functional implications of the subcellular localization of ethylene-induced chitinase and p-1.3-glucanase in bean leaves // Plant Cell -1989.-N l.-P. 447-457.

680. Mazzolani G., Pasqua G., Monacelli B. Condizioni per la formazione di piante aploidi da pollini coltivati in vitro // Ann. bot. 1980. - N 38. - P. 107-117.

681. Medrano H., Primo M.E., Guerri J. Ethyl-methane-sulphonate effects on anther culture of Nicotiana tabacum // Euphytica. 1986. - V.35, N 1. - P. 161-168.

682. Melchers G. Potatoes for combined somatic breeding methods, plants from protoplasts and fusion of protoplasts of potato and tomato // Production of natural compounds by cell culture methods. Munchen, 1978. - P. 306-311.

683. Mercy S.T., Zapata F.J. Chromosomal behavior of anther culture derived plants of rice // Plant Cell Repts. 1986. - V.5, N 3. - P. 215-218.

684. Meredith C.P., Lawrence R.H. Report of the vegetable crops round-table // Environ and Exp. Bot. 1981. - V.21, N 3-4. - 401^105.

685. Metz S.G., Sharma H.C., Armstrong T.A., Mascia P.N. Chromosome doubling and aneuploidy in anther-derived plants from two winter wheat lines // Genome. 1988. - V.30, N 2. - P. 177-181.

686. Meynet J. Possibilities of obtainment and utilization of doubled haploids in Gerbera // Gen. Manipulat. Plant Breed.: Proc. Int. Symp., Berlin (West), September 8-13,1985.-Berlin, New York, 1986.-P.319-321.

687. Meynet J., Sibi M. Haploid plants from in vitro culture of unfertilized ovules in Gerbera jamesonii / Z. Pflanzenziicht. 1984. - V.93. - P. 78-85.

688. Miah M.A.A. Studies on the association between yield and yield components in anther derived doubled-haploid rice (Oryza sativa L.) // Bangladesh J. Bot. 1985. -V.14,N2.-P.- 147-155.

689. Miah M.A.A., Earl E.D., Khush G.S. Inheritance of callus formation ability in anther cultures of rice, Oryza sativa L. // Theor. and Appl. Genet. 1985. - V.70. N.2.-P. 113-116.

690. Miller C.O. Kinetin and kinetin-like compounds // Mod. Meth. Pflanzenanal. 1963.-V. 6, N6.-P. 194-202.

691. Minora N., Grant W.F. Callus, plantlet formation and polyploidy from cultured anthers of Lotus and Nicotiana // Can. J. Bot. 1971. - V.49, N 11. - P. 20412051.

692. Misawa M., Sakato К., Tanaka H., Hayashi M., Samejima H., Production of physiologically active substances by plant cell suspension cultures // Tissue culture and plant science. Ed. H.E.Street. London etc.: Acad, press, 1974. - P. 405-432.

693. Miszke W., Skucinska В., Kruczkowska Y., Pawlowska H. Klonowania in vitro kapusty glowiastej dla potrzeb hodowli // Acta agr. et silv. Ser. agr. 1988. - N 27. - P. 87-99.

694. Mitchell A.Z., Hanson M.R., Skvirsky R.C., Ausubel F.M. Anther culture of Petunia: Genotypes with high frequency of callus root, or plantlet formation // Z. Pflanzenphysiol. 1980. - V.l00, N 2. - P. 131-146.

695. Mix G. Anther culture of Solanum tuberosum L. and some wild species // Plant Tissue Cult.: Proc. 5 Int. Congr. Plant Tissue and Cell. Cult. Tokyo and Lake Yamanaka, July 11-16,1982,-Tokyo, 1982.-P. 273-274.

696. Mix G. Antheren- und jverienkultur von sonnenblumen (Helianthus annuus L.) // Landbauforsch. Volkenrode. 1985. - V.35, N 3. - P. 153-156.

697. Mix G., Wang H.M. In vitro erzeugung von haploiden Corpea-Pflanzen (Vigna unguiculata L.) Landbauforsch Volkenrode. 1988. - V.38, N 4. - P. 305309.

698. Mix G., Wilson H.M., Foroughi-Wehr B. The cytological status of plant of Hordeum vulgare L. regenerated from microspore callus // Z. Pflanzenziicht. 1978. -v.80, N2.-P. 89-99.

699. Mol R. In vitro gynogenesis in Melandrium album: from parthenogenetic embryos to mixoploid plants // Plant. Sci. 1992. - V. 81. - P. 261-269.

700. Monnier M., Norstog K. Effect of in Ovulo period on the differentiation and regulation of immature embryos of Zamia cultured in vitro // Exp. Bot. 1986. -V.37-N 184.-P. 1633-1642.

701. Moraes-Fernandes M.I.B., Picard E. Viability of haploid production by anther culture using Brazilian wheat genotypes // Rev. bras, genet. 1983. - V.6, N 2. -P261-277.

702. Morrison R.A., Koning R.E., Evans D.A. Pepper // Handbook of plant cell culture / Eds D.A. Evans et al. New York: Macmillan, 1986. - V.4. - P. 562-573.

703. Muir W. H., Hildebrandt A.C., Riker A.J. The preparation, isolation and growth in culture of single cells from higher plants // Amer. J. Bot. 1958. - V.45, N 8.-P. 589-597.

704. Miiller D., Keller J. Anther culture of brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera) // Arch. Zuchtungsforsch. 1990. - V.20, N 4. - P. 219-226.

705. Miiller G., Vahl U., Wiberg A. Die nutzung der antherenkulturmethode im zuchtprozefl von winterweizen II. Die Bereitstellung neuerWinterweizen-dh-Linien mit lAI^lRS-Translokation//Plant Breed.- 1989. V.103, N l.-P. 81-87.

706. Murashige T. Clonal crops through tissue culture // Plant tissue culture ant its bio-technological applications / Eds W.Barz et al. Berlin, Heidelberg, New York.: Springer-Verb, 1977. - P. 392-403.

707. Murashige T. Plant propagation through tissue culture // Ann. Rev. Plant Physiol.-1974.-V.25.-P. 135-166.

708. Murashige Т., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures // Physiol. Plant. 1962. - Vol. 15. P. 473^197.

709. Muren R.C. Haploid plant induction from unpollinated ovaries in onion // HortScience. -1989. V.24, N 5. - P. 833-834.

710. Nair S., Gupta P.K., Mascarenhas A.F. Haploid plants from in vitro anther culture of Annona squamosa Linn. // Plant Cell Repts. 1983. - V.2 N 4. - P. 198— 200.

711. Nakajima Y., Oeda K., Yamamoto T. Characterization of genetic diversity of nuclear and mitochondrial genomes in Daucus varieties by RAPD and AFLP // Plant Cell Reports. 1998. - V.17, N 11. - P. 848-853.

712. Nakamura A., Yamada Т., Kadotani N., Itagaki R. Improvement of flue-cured tobacco variety MC 1640 by means of haploid breeding and some problems of this method // Haploids in higher plants / Ed. K.J.Kasha. Univers. Guelph., 1974. -P. 277-278.

713. Nakamura C., Keller W. A. Callus proliferation and plant regeneration from immature embryos of hexaploid triticale // Z. Pflanzenziicht. 1982. - V.88, N 2. -P. 137-160.

714. Nakamura C., Keller W.A., Fedak G. In vitro propagation and chromosome doubling of a Triticum crassum x Hordeum vulgare intergeneric hybrid // Theor. and Appl. Genet. -1981. V.60, N 2. - P. 89-96.

715. Nakata К., Tanaka M. Differentiation of embryoids from germ cells in anther culture of tobacco // Jap. J. Genet. 1968. - V.43. - P. 65-71.

716. Natali L., Cavallini A. Regeneration of pea (Pisum sativum L.) plantlets by in vitro culture of immature embryos // Plant Breed. 1987. - V.99, N 2. - P. 172176.

717. Navratilova B. Mikropropagace okurku (Cucumis sativus L.) // Bull. vyzk. slecht. Ust. zelin., Olomouc, 1987. - Bull. 31. - P. 35^14.

718. Nezticky M., Novak F.J., Dolezelova M., Piovarci A. Vplyv kultivacnych podmienok na rast izolovanych embryi kulturice // Sb. UVTIZ Genet, a slecht. -1983.-V. 19, N2.-P. 127-134.

719. Nikolic D. Mogucnosti dobijanja haploidnih biljaka kulturom antera in vitro // Шумарство. 1977. - V.30, N 3^1. - P. 29-34.

720. Nitsch J.P. Experimental Androgenesis in Nicotiana // Phytomorphology. -1969.-V.19,N4.-P. 389-404.

721. Nitzsche W., Hennig L. Fruchtknotenkultur bei Grasern // Z. Pflanzenziicht. 1976.-V.77, N l.-P. 80-82.

722. Nobecourt P. Sur les radicelles des cultures de tissus du tubercule de Carotte // Compt. Rend. Soc. Biol. 1939. - V.13. - P. 1271-1272.

723. Nomura K., Komamine A. Physiological and biochemical aspects of somatic embryogenesis from single cells // Somatic Embryo Genesis Carrots: Proc. Workshop, San Miniato, May 28-31,. Rome, 1985. - P. 1-5.

724. Novak F.J. Production of garlic (Allium sativum L.) tetraploids in shoot-tip in vitro culture // Z. Pflanzenzucht. 1983. - V.91, N 4. - P. 329-333.

725. Novak F.J., Do T.H.H., Poncova J. Factory ovlivnujici proces androgeneze in vitro u Nicotiana tabacum L. // Acta Univ. Palack. Olomuc. Fac. rerum natur. -1979.-N63.-P. 93-110.

726. Novak F.J., Dolezel J., Luzny J. Cytologie a fertilita mezidruhovyh hybridu Allium сера x A. fistulosum // Sb. UVTIZ / Genet, a slecht. 1980. - V. 16, N 2. - P. 81-88.

727. Novak F.J., Dolezelova M. Hormone control of growth and differentiation in the in vitro cultured tissue of cucumber (Cucumis sativus L.) // Biologia. 1982. -V.37, N3.-P. 283-289.

728. Novak F.J., Havel L. Shut production from in vitro cultured flower heads of Allium porrum L. // Biol. Plant. 1981. V.23, N 4. - P. 266-269.

729. Novak F.J., Vyskot B. Karyology of callus cultures derived from Nicotiana tabacum L. haploids and ploidy of regenerants // Z. Pflanzenzucht. 1975. - V.l5, N l.-P. 62-70.

730. Ockendon D.J, Sutherland R.A. Genetic and non-genetic factors affecting anther culture of Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera // Theor. and Appl. Genet. 1987. - V.74, N 5. - P. 566-570.

731. Ockendon D.J. Anther culture in brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). I: embryo yields and plant regeneration // Ann. Appl. Biol. 1984. -V. 105, N 2. - P.285-291.

732. Ockendon D.J. The ploidy of plants obtained from anther culture of cauliflowers (Brassica oleracea var. botrytis) // Ann. Appl. Biol. 1988. - V.l 13, N 2. -P. 319-325.

733. Ognjanov V. Kultura antera I delove sejanaca breskve in vitro // Jugosloven. vocar. 1989. - V.23, N 1-2. - P. 471^177.

734. Olesen A., Andersen S.B., Due I.K. Anther culture response in perennial ryegrass (Lolium perenne L.) // Plant. Breed. 1988. - V.101, N 1. - P. - 60-65.

735. Ono H., barter E.N. Anther culture of Triticale // Crop. Sci. 1976. - V.l6, Nl.-P. 120-122.

736. Ono K., Tsukida T. Haploid callus formation from anther cultures in a culti-var of Paeonia. // Jap. J. Genet. 1978. - V.53, Nl.-P. 51-54.

737. Orlikowska Т., Chrastek M. Kulturu zarodkov roslinnych in vitro i mozliwosci ich wykorzystania w hodowli //Post, naukrol. 1979.- V.26, N l.-P. 27-42.

738. Ouyang J.W., He D.G., Feng G.H., Jia S.E. The response of anther culture to culture temperature varies with growth conditions of anther-donor plants // Plant Sci. 1987. -v.49, N2. - P. 145-148.

739. Ouyang J.W., Zhou S.M., Jia S.E. The response of anther culture to culture temperature in Triticum aestivum // Theor. and Appl. Genet. 1983. - V.66, N 2. -P. 101-109.

740. Overbeek J. van, Conclin M.E. Cultivation in vitro of smole Datura embryos I I Amer. J. Bot. 1942. - V.29, N 6. - P. 472-477.

741. Overbeek J. van, Conclin M.E., Blakeslee A.F. Factors in coconut milk essential for growth and development of very young Datura embryos // Science. 1941. -V.94,N2441.-P. 350-351.

742. Pace G.M., Reed J.N., Ho L.C., Fahey J.W. Anther culture of maize and the visualization of embryogenic microspores by fluorescent microscopy // Theor. and Appl. Genet. 1987. - V.73, N 6. - P. 863-869.

743. Paepe R., Bleton D., Grangbe F. Basic and extent of genetic variability among doubled haploid plants obtained by pollen culture in Nicotiana sylvestris // Theor. and Appl. Genet. 1981. - V.59, N 3. - P. 177-184.

744. Palada-Nicolau M., Alionte J., Hurduc N. Re searches concerning «in vitro» rice androgenesis // Bujl. Acad. sci. agr. et forest. 1986. - N 15. - P. 57-70.

745. Pan Ching-li, Pai Shou-hsin, Kuan Chiliang, Yu Hui-hsia Certain factors affecting the frequency of induction of wheat (Triticum vulgare) pollen plants // Acta bot. sinica. 1975. - V.17, N 2. - P. 161-166.

746. Patrascu M., lean E., Deculescu G. Obtinerea de linii izogenice prin androgeneza si utilizarea lor in ameliorarea tutunului // Probl. genet, teor.si apl. -1981. -V.13,N6.-P. 387-396.

747. Pawlicki N., Sangwan R.S., Sangwan-Norreel B.S. Factors influencing the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of carrot (Daucus carota L.) // Plant Cell Tissue cult. 1992. - V. 31. - P. 129-139.

748. Peixe A., Barroso J., Potes A., Pais M.N. Induction of haploid morphogenic calluses from in vitro cultured anthers of Prunus armeniaca cv. 'Harcot' // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 2004. - V.77, N 1. - P. 35-41.

749. Petolino J.F., Jones A.M. Anther culture of elite genotypes of maize // Crop Sci. 1986. -V. 26, N 5. - P. 1072-1074.

750. Phillips G.C., Collins G.B. Taylor N.L. Interspecific hybridization of red clover (Trifolium pratense L.) with T. sarosiense Hazsl. using in vitro embryo rescue // Theor. and Appl. Genet. 1982. - V.62, N 1. - P. 17-24.

751. Phippen C., Ockendon D.J Genotype, plant, bud size and media factors affecting anther culture of cauliflowers (Brassica oleracea var. botrytis) // Theor. and Appl. Genet. 1990. - V.79, N 1. - P. 33-38.

752. Picard E., Buyser J. Nouveaux resultats concernant la culture d'antheres de Triticum aestivum L. Conditions de regeneration des plantes haploi'des et production de lignees entierement homozygotes // C. r. Acad. sci. 1975b. - D281, N 14. - P. 989-992.

753. Picard E., Buyser J. Nouveaux resultats concernant la culture d'antheres in vitro de ble tendre (Triticum aestivum L.). Effets d'un choc thermique et de la position de Tanthere dans 1'epi // C. r. Acad. sci. 1975a. - D281, N 2-3. - P. 127-130.

754. Pickering R.A., Morgan P.W. Plant regeneration from cultured embryos Derived from Hordeum vulgare L. pollinated with H. bulbosum L. // Euphytica. 1983. -V 32,N2.-P. 585-591.

755. Pierik R.L.M. Anthurium andraeanum plantlets produced from callus tissues cultivated in vitro // Physiol, plant. 1976. - V.37, N. 1. - P. 80-82.

756. Pierik R.L.M., Steegmans H.H.M. Freesia plantlets from flower-buds cultivated in vitro // Neth. J. Agr. Sci. 1975. - V.23, N 4. - P. 334-337.

757. Pierik R.L.M., Steegmans H.H.M., Meys J.A.J. Plantlet formation in callus tissues of Anthurium andraeanum Lind. // Sci. Hort. 1974. - V.2, N 2. - P. 193— 198.

758. Pilet P.E. Auxins and the process of aging in root cells // Plant growth regulation / 4th Internet. Conf. Iowa, Univ. Press, 1961. - P. 167-179.

759. Pohler W., Schumann G., Sulze M., Kummer I.M. Cytological investigation of callus tissue and regenerated plants from triticale anther culture // Biol. Zbl. -1988. V. 107, N 6. -P. 643-652.

760. Poliakov A.V., Proliotova N.V., Rutkowska-Krause I. Some aspects of flax in vitro anther culture (Linum usitatissimum L.) cytology and pretreatment // Natural Fibres Wlokna Naturalne. - 1995. - V.39. - P. 57-64.

761. Pretova A. The influence of osmotic potential of the cultivation on the development of excised flax embryos // Biol. Plant. 1974. - V. 16, N 1. - P. 14-20.

762. Pretova A., Williams E.G. Direct somatic embryogenesis from immature zygotic embryos of flax (Linum usitatissimum L.) // J. Plant Physiol. 1986. - V.l26, N2-3.-P. 155-161.

763. Punja Z.K., Zhang Y.Y. Plant chitinases and their roles in resistance to fungal diseases // J. Nematol. 1993. - V.25. - P. 526-540.

764. Qu Rong-da, Chen Ying Пути андрогенеза и изучение культивируемых пыльцевых зерен риса // Acta bot. sin. 1984. - V.26, N 6. - P. 580-587.

765. Qualset C.O. Plant biotechnology, plant breeding, population biology and genetic resources perspectives from a university scientist // NABC Report / Nat. Agr. Biotechnol. Council., Ithaca (N.Y.). 1991. N 3. - P. 81-90.

766. Quiot J., Messiaen C., Marrou J., Leroux J. Regeneration par culture de me-ristemes de clones d'ail infectes de facon chronique par le virus de la mosaique de Tail // Actas 3 Congr. Uniao fitopatol. mediter., Oeiras, 1972. Oeiras, 1972. - P. 429-433.

767. Raageeva B. Anther culture of Nicotiana plumbaginifolia Viv. // Cur. Sci. -1987.-V.56,N 16.-P. 838-840.

768. Radojevic L., Djordjevic N., Tucic B. In vitro induction of pollen embryos and plantlets in Aesculus carnea Hayne through anther culture // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 1989. - V.l7, N 1. - P. 21-26.

769. Raghavan V. Induction of haploid plants from anther culture of henbane I IZ. Pflanzenphysiol. 1975. - V.76. - P. 89-92.

770. Raghavan V. Role of the generative cell in androgenesis in henbane // Science. 1976. - V.191, N 4225. - P. 388-389.

771. Raghavan V., Nagmani R. Morphogenesis of pollen callus of Hyoscyamus niger // Amer. J. Bot. 1983. - V.70, N 4. - P. 524-531.

772. Rajasekaran K., Mullins M.G. Embryos and plantlets from cultured anthers of hybrid grapevines // J. Exp. Bot. 1979. - V.30, N 116. - P. 399-407.

773. Rajasekaran K., Mullins M.G. Influence of genotype and sex-expression on formation of plantlets by cultured of grapevines // Agronomie. 1983. - V.3, N 3. -P. 233-238.

774. Rakoczy-Trojanowska M., Malepszy S. A method for increased plant regeneration from immature Fi and BCi embryos of Cucurbita maxima Duch. x C. pepo L. Hybrids // Plant Cell Tissue and Organ Cult. 1989. - V.18, N 2. - P. 191-194.

775. Ramanna M.S. The origin and in vitro development of embryoids in the anthers of Solanum hybrids // Euphytica. 1974. - V,23, N 3. - P. 623-632.

776. Rao A.N. Tissue culture in the orchid industry // Applied and fundamental aspects of plant cell, tissue and organ culture / Ed. J. Reinert and Y.P.S. Baja. Berlin, New York.: Springer-Verl., 1977. - P. 44-70.

777. Rappoport J. In vitro culture of plant embryos and factors controlling the growth // Bot. Rev. 1954. - V.20, N 4. - P. 201-225.

778. Rashid A. Pollen dimorphism in relation to pollen plant formation // Physiol plant. 1983. - V.58, N 4. - P. 544-548.

779. Reddy P.J., Vaidyanath K. In vitro selection for salt tolerance in Basmati rice // Indian J. Plant Physiol. 1985. -N 1. - P. 88-91.

780. Reddy V.S., Leelavathi S., Sen S.K. Influence of genotype and culture medium on microspore callus induction and green plant regeneration in anthers of Oryza sativa // Physiol, plant. -1985. V.63, N 3. - P. 309-314.

781. Redenbaugh K.M., Westfall R.D., Karnosky D.F. Dihaploid callus production from Ulmus americana anthers // Bot Gaz. 1981. - V.l42, N 1. - P. 19-26.

782. Reiffers I., Freire A.B. Production of doubled haploid rice plants (Oryza sativa L.) by anther culture // Plant Cell, Tissue and Organ Cult. - 1990. - V.21, N 2. -P. 165-170.

783. Reinert J. Morphogenesis in plant tissue cultures // Endeavour. 1962. -V.21.-P. 85-90.

784. Reinert J. Uber die kontrolle der morphogenese und die induction von adventive embryonen an gewebekulturen aus karotten // Planta. 1959. - V.53, N 4 -P. 318-333.

785. Rekha Kathal S.P. Plant regeneration from hypocotyl explant of Cucumis melo L. cv. Pusa Sharbati // Embryology and seed reproduction: Abstracts XI Int. Symp. July 3-7,1990. Leningrad, 1990. - P. 72.

786. Reynolds T.L. Callus formation and organogenesis in anther cultures of Solanum carolinense L. // J. Plant Physiol. 1984. - V.l 17, N 2. - P. 157-161.

787. Reynolds T.L. Callus formation and organogenesis in anther cultures of Solanum carolinense // J. Plant Physiol. 1984. - v.l 17, N 2. - P. 157-161.

788. Reynolds T.L. Pollen embryogenesis in anther cultures of Solanum carolinense L. // Plant Cell Repts. 1986. - V.5, N 4. - P. 273-275.

789. Rines H. W. Oat anther culture: genotype effects on callus initiation and the production of haploid plant // Crop Sci. 1983. - V.23, N 2. - P. 268-272.

790. Rivard S.R., Cappadocia M., Landry B.S. Cytological and molecular analyses of plants produced via anther culture in Solanum chacoense // Amer. J. Bot. -1989a. V.76, N 6, Sappl. - P. 153.

791. Rivard S.R., Cappadocia M., Vincent G., Brisson N., Landry B.S. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analyses of plants produced by in vitro anther culture of Solanum chacoense Bitt. // Theor. and Appl. Genet. 1989b. - V.78, N 1. -P. 49-56.

792. Roberts W.K., Selitrennikoff C.P. Zeamatin, an antifungal protein from maize with membrane-permeabilizing activity // J. Gen. Microbiology. 1990. -V.136.-P. 1771-1778.

793. Rogers S.O., Benedich A.J. Extraction of total cellular DNA from plants, algae and fungi // Plant Molecular Biology Manual / Eds Gelvin S.B., Schilperoort R.A: Dordrecht Boston, London: Kluwer Academic Publishers, 1994. - D1. - P. 18.

794. Rogozinska J.H., Goska M. Attempts to induce haploids in anther cultures of sugar, fodder and wild species of beet // Acta. soc. bot. pol. 1982. - V.51, N 1. - P. 91-105.

795. Rose J.B., Dunwell J.M., Sunderland N. Anther culture of Lolium temulen-tum, Festuca pratenses and Lolium x Festuca hybrids II. Anther and pollen development in vivo and in vitro // Ann. Bot. (USA). 1987. - V.60, N 2. - P. 203-214.

796. Roulund N., Andersen S.B., Farestveit B. Optimal concentration of sucrose for head cabbage (Brassica oleracea L. convar. capitata (1.) Alef.) anther culture //Euphytica. 1991. - V.52, N 2. - P. 125-129.

797. Ryoppy P., Honkanen J., Tigerstedt P.M.A. Increasing the efficiency of triticale anther culture // Gen. Manipulat. Plant Breed.: Proc. Int. Symp., Berlin (West), 8-13 Sept, 1985. Berlin; New York, 1986. - P. 339-341.

798. Sabir A.A, Ford-Lloyd B.V. Processing crop plant germplasm in vitro for mass production of regenerants: a case study with beet // J. Biotechnol. 1991. -V.17, N3. -P. 257-268.

799. Sachar R.C., Kapoor M. In vitro culture of ovules of Zephyranthes // Phyto-morphology. 1959. - V.9, N 21. - P. 147-156.

800. Sachar R.C., Kapoor M. Influence of kinetin and gibberellic acid on the test tube seeds of Cooperia pedunculata Herb. // Naturwissenschaften. 1958. - V.45. -P. 552-553.

801. Samac D.A., Shah D.M. Developmental and pathogen-induced activation of the Arabidopsis acidic chitinase promoter // Plant Cell. 1991. - N 3. - P. 10631072.

802. San L.H., Demarly Y. Gynogenesis in vitro and biometric studies of doubled haploids obtained by three techniques in Hordeum vulgare L. // Efficiency in Plant Breeding: Proc. X EUCARPIA Congress, Wageningen, June 19-24, 1983. Wagen-ingen, 1984.-P. 347.

803. San Noeum L.H. Haploi'des d'Hordeum vulgare L. par culture in vitro d'ovaries non fecondes // Ann. Amelior. Plant. 1976. - V.26, N 4. - P. 751-754.

804. San Noeum L.H. In vitro induction of gynogenesis in higher plants // Broadening Genet. Base Crops: Proc. Conf., Wageningen, July 3-7, 1978. Wageningen, 1979.-P. 327-329.

805. Sanchez-Monge L.E., Millan Т., Martin A. Hibridos cebadaxtrigo. Analisis de la Fi у generaciones de retrocruzamiento por trigo // An. INIA. Ser.:Agr. 1981 -N14.-P. 79-94.

806. Sangwan-Norreel B.S. Androgenic stimulating factors in the anthers and isolated pollen grain culture of Datura innoxia Mill. // J. Exp. Bot. 1977. - V.28. - P. 843-852.

807. Sangwan-Norreel B.S. Evolution in vitro du contenu en AND nucleaire et de la ploidie des embryons polliniques du Datura innoxia // Can. J. Bot. 1981. - V.59, N4.-P. 508-517.

808. Sangwan-Norreel B.S. Evolution of nuclear DNA content during microspore embryo formation in Datura innoxia // Pollen: Biol, and Implic. Plant. Breed.: Proc. Symp., Lake Garda, June 23-26,1982. New York, 1983. - P. 295-301.

809. Sasson A. Plant diotechnology-derived products: Market-value estimates and public acceptance. Dordrecht, Boston, London: Kluwer Academic Publishers. 1998. -160 p.

810. Sastri D.C., Moss J.P., Nalini M. The use of in vitro techniques in groundnut improvement // Plant Cell Cult. Crop Improv.: Calcutta, 6-10 Dec., 1981. New York; London, 1983. - P. 365-370.

811. Sato Т., Nishio Т., Hirai M. Varietal differences in embryogenic ability in anther culture of Chinese cabbage (Brassica campestris ssp. pekinensis) // Jap. J. Breed. 1989. - V.39, N 2. - P. 149-157.

812. Sator C. Regeneration von Lupinenpflanzen aus Embryonen // Landbauforsch Volkenrode.- 1985. V.35, N 1. - P. 1-4.

813. Sauton A. Doubled haploid production in melon (Cucumis melo L.) // Cucurbitaceae'88: proc. EUCARPIA Meet. Cucurbit Genet, and Breed., Avignon-Montfavet, May 31-June 1-2,1988. Paris, 1988. - P. 119-128.

814. Schestibratov K.A., Dolgov S.V. Transgenic strawberry plants expressing a thaumatin II gene demonstrate enhanced resistance to Botrytis cinerea // Sci. Hort. -2005.-N106.-P. 177-189.

815. Schiltz P., Hitier G., Cazamajour F. Utilisation de Г androgenese au cours de la selection de Nicotiana tabacum // Tabac. 1975. - Sec. 2, N 12. - P. 11-17.

816. Schinkel C., Lelley T. Somaclonal variation in triticale // Gen. Manipulat. Plant breed.: Proc. Int. Symp., Berlin (West), Sept. 8-13, 1985. Berlin, New York, 1986.-P. 625-628.

817. Schulz В., Westphal L., Wricke G. Linkage groups of isozymes, RFLP and RAPD markers in carrot (Daucus carota L. sativus) // Euphytica. 1994. - V.74, N 1-2.-P. 67-76.

818. Schumann G., Hoffmann B. Some proc and cons using potato extract medium in anther culture of triticale and wheat //Arch. Zuchtungsforsch. 1989. - V. 19, N l.-P. 21-27.

819. Scott R.J., Draper J Transformation of carrot tissues derived from proem-bryogenic suspension cells. A useful model system for gene expression studies in plants // Plant Mol. Biol. 1987. - N 8. - P. 265- 274.

820. Scowcroft W.R, Larkin P.J. Plant biotechnology, somaclonal variation and varietal improvement // Comb. Proc. / Intern. Plant Propagators' Soc. 1983 - V.32. P. 80-89.

821. Sharma D.P, Firoozabady E., Ayres N.M., Galbraith D.W. Improvement of anther culture in Nicotiana: media, cultural conditions and flow cytometric determination of ploidy levels HZ. Pflanzenphysiol. 1983. - V.l 11, N 5. - P. 441-451.

822. Sharma G.C., Wen C.W., Sapra V.T. Effect of genotype, media and temperature pretreatment on callus initiation in triticale, wheat and rye anther cultures // Cereal Res. Commun. 1982. - V.10, N 3-4. - P. 143-150.

823. Sharp W.R., Raskin R.S., Sommer H.E. Haploidy in Lilium // Phytomor-phology. 1971. - V.21, N 4. - P. 334-337.

824. Shekhawat N.S., Gordon P.N., Galston A.W. Highly regenerative tissue cultures from axillary tiller buds of sexually mature oat plants (Avena sativa L.) In Vitro. 1984. - V.20, N 9. - P. 707-711.

825. Shimada T. Haploid plants regenerated from the pollen callus of wheat (Triticum aestivum L.) // Jap. J. Genet. 1981. - V.56, N 6. - P. 581-588.

826. Shimada T. Microspore development during in vitro anther culture of wheat // Wheat Inf. Serv. 1989. - N 69. -P. 46-48.

827. Shiong L., Chiang I. Production of haploid plants from anther cultures and secondary embryoids of winter oilseed rap, Brassica napus ssp. Oleifera // New Phy-tol. 1982. - V. 91, N 3. - P. 507-516.

828. Shmikova N.A., Tjukavin G.B. Culture of unpollinated ovaries and ovules in bulb onion, carrot and cucumber // Plant biotechnology and genetic engineering: Abst. Int. Symp. Ukraine, October 3-6,1994. Kiev, 1994. - P. 114.

829. Shumny V.K., Pershina L.A., Belova L.I. Production of barleyxrye and bar-leyxwheat hybrids // Cereal Res. Commun. 1981. - V.9, N 4. - P. 265-272.

830. Sibi M., Dumas de Vaulx R., Shambonnet D. Obtention de plantes haploides par androgenese in vitro chez le Piment (Capsicum annum L.) // Ann. Amelior Plant. 1979. - V. 29, N 5. - P. 583-606.

831. Simkova H. Methylation of mitochondrial DNA in carrot (Daucus carota L.) // Plant Cell Reports. 1998. - V.17. - P. 220-224.

832. Simon P.W. Improvement of carrots for U.S. production with classical and modern techniques // J. Appl. Genet. 1997. - 38A. - P. 1-4.

833. Singsit C., Veilleux R.E. Intra- and interspecific transmission of androge-netic competence in diploid potato species // Euphytica. 1989. - V.42, N 1-2. P. 105-112.

834. Sitbon M. Production of haploid Gerbera jamesonii plants by in vitro culture of unfertilized ovules // Agronomie. 1981. - V.l, N 9. -P. 807-812.

835. Skoog F., Miller C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro // Symp. Soc. Exp. Biol. 1957. - V. 11. - P. 118-131.

836. Skucinska В., Miszke W., Pawlowska H. Wyprowadzenie homozygot z androgenetycznyh haploidov w polskim materiale hodowlanym tytoniu // Biul. Centr. lab. przem. tyton. 1974. - N 1-2. - P. 29-41.

837. Slabbert M.M., Lindeque J.M., Ferreira D.I. Rapid in vitro multiplication of Asparagus // S. Afr. J. Bot. 1990. - V.56, N 3. - P. 331-335.

838. Slusarkiewicz-Jarzina A., Zenkteler M. Development of hybrid plants from ovules of Nicotiana tabacum pollinated in vitro with pollen grains of Nicotiana knightiana // Experientia. -1983. V.39, N 12. - P. 1399-1400.

839. Smith C.W. The effect of growth substances on growth of excised embryo shoot apices of wheat in vitro // Ann. Bot. 1968. - V.32, N 127. - P. 593-600.

840. Smith J.A., Sung Z.R Increase in regeneration of plant cells by cross feeding with regenerating Daucus carota cells // Somatic Embryo Genesis Carrots: Proc. Workshop, San Miniato, May 28-31,. Rome, 1985. - P. 133-137.

841. Song H.G., Li S.N., Li G.R., Sok J.G., Cho O.B Anther culture of Oryza sa-tiva L. // Bull. Acad. Sci. D.P.R. Korea. 1976. - V. 24, N 3. - P. 116-120.

842. Sonnino A., Tanaka S., Iwanaga M., Schilde-Rentschler L. Genetic control of embryo formation in anther culture of diploid potatoes // Plant Cell Repts. 1989

843. Sopory S.K. Differentiation in callus from cultured anthers of dihaploid clones of Solanum tuberosum // Z. Pflanzenphysiol. 1977. - V.82, N 1. - P. 88-91.

844. Sopory S.K. Induction of haploids: achievements problems and possibilities // Curr. Sci. (India). -1983. v.52, N 23. - P. 1112-1113.

845. Sopory S.K., Jacobsen E., Wenzel G. Monohaploid embryoids and plantlets in cultured anthers of Solanum tuberosum // Sci. Lett. 1978. -N 12. - P. 47-54.

846. Sopory S.K., Maheshwari S.C. Production of haploid embryos by anther culture technique in Datura innoxia. A further study // Phytomorphology/ 1972. V.22, N1. P. 87-90.

847. Sopory S.K., Tan B.H. Regeneration and cytological studies of anther and pollen calli of dihaploid Solanum tuberosum // Z. Pflanzenziicht. 1979. - V.82, N 1. -P. 31-35.

848. Sorvari S. Production of haploids from anther culture agriculturally valuable Brassica campestris L. cultivars // Ann. agr. fenn. 1985. - V.24, N 3. - P. 149-160.

849. Souza M.V., Shupe J., Keller W.A. Cytoplasmic inherited atrazine resistance transmitted through anther culture in rutabaga // Z. Pflanzenziicht 1985. - V.95, N 2.-P. 179-184.

850. Sozinov A., Lukjanjuk S., Ignatova S. Anther cultivation and induction of haploid plants in triticale // Z. Pflanzenziicht. 1981. - V.86, N 4. - P. 272-285.

851. Srivastava D.R., Andrianov V.M., Piruzian E.S. Tissue culture and plant regeneration of watermelon (Citrullus vulgaris cv. Schrad. cv. Melitopolski // Plant Cell Repts. 1989. - V.8, N 5. - P. 300-302.

852. Staraycki S., Stolarz A. Haploidalne i diploidalne homozygoty Nicotiana ta-bacum L. etrzymane metoda kultur pylnikov I tkanek in vitro // Hod. rosl., aklimat. i nasienn. 1976. - V.20, N 5. - P. 455-466.

853. Stein M., Nothnagel T. Some remarks on carrot breeding (Daucus carota sativus Hoffm.) // Plant Breed. 1995. - V. 114. N 1. - P. 1-11.

854. Stolarz A. Indukcja androgenezy w ziarnach pylkowych Secale cereale L. cv. Strzekecinskiejare w warunkach in vitro (Komunikat) // Hod. rosl., aklimat. i nasienn. 1974. - V.l 8, N 3. - P. 217-220.

855. Stoltz L.P. Agar restriction of the growth of excised mature iris embryos // J. Amer. Soc. Hortic. Sci. 1971. - V 96, N 5. - P. 681-684.

856. Su C.Y., Tsay H.S. Anther culture of papaya (Carica papaya L.) // Tissue Cult. Forest and Agr.: Proc. 3rd Tenn. Symp. Plant Cell and Tissue Cult., Knoxville, Tenn., 9-13 Sept., 1984. New York; London, 1985. - P. 357.

857. Subhashini U., Venkateswari T. Genotypes and their response to in vitro production of haploids in Fj lines of Nicotiana tabacum // Theor. and Appl. Genet. -1985.-V.70, N3.-P. 225-226.

858. Sudhakar Y., Singh I.S., Singh C.P. Anther culture of pigeon pea. Physiology of callus formation and ploidy analysis // Indian J. Plant Physiol. 1986. - V.29, Nl.-P. 67-70.

859. Sudhakar Y., Singh I.S., Singh C.P. Anther culture of tobacco (Nicotiana tabacum L.) and pigeon pea (Cajanus cajan Millsp.) genotypes // Proc. Nat. Acad. Sci., India B. 1987. - V.57, N 4. - P. 487-490.

860. Sun Ching-san., Wang Chin-chu, Chu Chih-ching Cytological studies on the androgenesis of Triticale // Acta bot. sinica. 1973. - V.l 5, N 2. - P. 163-173.

861. Sunderland N. Anther culture: a progress report // Sci. Progr. 1971. - V.59, N236.-P. 527-549.

862. Sunderland N. Pollen plants and their significance // New. Sci. 1970. - V. 47, N710.-P. 142-144.

863. Sunderland N. Strategies in the improvement of yields in anther culture // Sci. Press. Proc. Symp. Plant tissue culture. Peking, 1978. - P. 65-86.

864. Sunderland N. The concept of morphogenic competence with reference to anther and pollen culture // Plant cell culture. Crop improvement: Proc. Int. Symp., Calcutta, 6-10 Dec., 1981. New York; London, 1983. - P. 125-139.

865. Sunderland N., Dunwell J.M. Anther and pollen culture // Plant tissue and cell culture / Ed. H.E. Street Oxford: Blackwell Sci. Publ., 1978. - P. 223-586.

866. Sunderland N., Evans L.J. Multicellular pollen formation in cultured barley anthers. II. The A, B, and С pathways. // J. Exp. Bot. 1980. - V.31, N 121. - P. 501-514.

867. Sunderland N., Huang B. Barley anther culture. The switch of programme and albinism. // Hereditas. - 1985. - Suppl. V.3. - P. 37-40.

868. Sunderland N, Roberts M, Evans L.J, Wildon D.C. Multicellular pollen formation in cultured barley anthers. I. Independent division of the generative and vegetative cells //J. Exp. Bot. 1979. - V.30, N 119. - P. 1133-1144.

869. Sung Z.R, Dudits D. Carrot Somatic Cell Genetics // Genetic engineering in the plant sciences / Ed. N.J. Panopoulos N. Y., 1981. - P. 11-37.

870. Sussex I.M, Frei K.A. Embryoid development in long term tissue cultures of carrot //Phytomorphology. 1968. - V.l8. - P. 339-349.

871. Sutter E, Langhans R.W. Formation of epicuticular wax and its effect on water loss in cabbage plants regenerated from shoot-tip culture // Can. J. Bot. 1982. -V.60.-P. 2896-2902.

872. Szarejko I., Maluszynski V, Polok K., Kilian A. Doubled haploids in the mutation breeding of selected crops // Plant Mutant. Breed. Crop Improv.: Proc. Int. Symp., Vienna, June 18-22,1990. Vienna, 1991. - V.2. - P. 355- 378.

873. Szklarczyk M. RELP of PCR-amplified variable sequences a new tool for carrot organelle genetics // Genet. Pol. - 1996. - V.37A. - P.86-89.

874. Szwacka M., Krzymowska M, Osuch A, Kowalczyk M.E., Malepszy S. Variable properties of transgenic cucumber containing the thaumatin II gene from Thaumatococcus danielli // Acta. Physiol. Plant. 2002. - V.24, N 2. - P. 173-185.

875. Szwacka M, Morawski M, Burza W. Agrobacterium tumefaciens mediated cucumber transformation with thaumatin II cDNA // Genet. Pol. - 1996. -V.37A.-P. 126-129.

876. Taira T, barter E.N. The factors determining development of embryos of wheat-rye hybrids in vitro //Crop. Sci. 1978. - V.l8, N 2. - P. 248-250.

877. Takanori S., Takeshi N., Masahi H. Varietal differences in embryogenic ability in anther culture of Chinese cabbage (Brassica campestris ssp. pekinensis) // Jap. J. Breed. 1989. - V.39, N 2. - P. 149-157.

878. Tan D.H., Halloran G.M. Some cytological aspects of diploid wheat anther culture. // Wheat Inform Serv. 1980. - N 15.-P. 15-18.

879. Tao Z.R, Liu M.S., Zhu Z.C. In vitro production of haploid plantlets from unpollinated ovaries of potato // Hereditas. 1985. - N 7. - P. 5.

880. Tao Z.R, Liu M.S., Zhu Z.C. Induction of dihaploid plantlets from unpollinated ovaries of potato in vitro // Acta Genet. Sin. 1988. - V.l 5, N 5. - P. 329-334.

881. Templeton-Somers K.M, Sharp W.R, Pfister R.M. Selection of cold-resistant cell lines of carrot // Z. Pflanzenziicht.- 1981. V.103, N2.-P. 139-148.

882. Terras F.R.G., Eggermont К., Kovaleva V. et. al. Small cysteine-rich antifungal proteins from radish: their role host defense // Plant Cell. 1995. - V.7. - P. 573-588.

883. Testillano P., Georgiev S., Mogensen H.L., Coronado M.J., Dumas C., Risueno M.C. // Spontaneous chromosome doubling results from nuclear fusion during in vitro maize induced microspore embryogenesis // Chromosoma. 2004. -v.112, N 7. - P. 342-349.

884. Tetsushi H., Mitsuo 0. Origin and development of embryoids from microspores in anther culture of citrus // Jap. J. Breed. 1989. - V.39, N 2. - P. 169-178.

885. Thanh-Tuyen N.T., Guzman E.D. Formation of pollen embryos in cultured anthers of coconut (Cocoa nucifera L.) // Plant Sci. Lett. 1983. - V. 29, N 1. - P. 81-88.

886. Theime R., Pett В., Griess H. Nutzung der sprossregeneration aus kartoffelkallus // Podsdam. Forsch. B. 1988. - N 57. - P. 208-209.

887. Thevenin L., Dore C. L'amelioration de l'asperge (Asparagus officinalis L.) et son atout majeur, la culture in vitro // Ann. amelior. plant. 1976. - V.26, N 4. P. 655-674.

888. Thomas E., Wenzel G. Embryogenesis from microspores of Brassica napus // Pflanzenziicht. 1975a. - V.74. - P. 77-81.

889. Thomas E., Wenzel G. Embryogenesis from microspores of rye // Naturwissenschaften. 1975b. - V.62, N 1. - P. 40-41.

890. Thomas H.M., Pickering R.A. Barleyxrye crosses. The morphology and cytology of the hybrids and amphidiploids // Z. Pflanzenziicht. 1979. - V. 82, N 3. -P. 193-200.

891. Thomas J.C., Guiltinan M.J., Bustos S., Thomas Т., Nessler C. Carrot (Daucus carota) hypocotyl transformation using Agrobacterium tumefaciens // Plant Cell Report. 1989. - N 8. - P. 354-357.

892. Thomas M.R., Scott K.J. Plant regeneration by somatic embryogenesis from callus initiated from immature embryos and immature inflorescences of Hordeum vulgare //J. Plant Physiol. 1985. - V.121, N 2. - 159-169.

893. Thurling N., Chay P.M. The influence of donor plant genotype and environment on production of multicellular microspores in cultured anthers of Brassica napus ssp. oleifera // Ann. Bot. 1984. - V.54, N 5. - P. 681-693.

894. Tian H.Q.„ Yang H.Y. Haploid embryogeny and plant regeneration in unpol-linated ovary culture of Allium tuberosum // Acta. Biol. Exp. Sin. 1989. - V.22. -P. 139-147.

895. Tilton V.R, Russell S.H. Applications of in vitro pollination/fertilization technology // Bioscience. 1984a. - V.34, N 4. - P. 239-242.

896. Tilton V.R., Russell S.H. In vitro culture of immature soybean embryos // J. Plant Physiol. 1984b. - V. 115, N 3. - P. 191-200.

897. Ting Y.C. Meiosis and progenies of anther culture-derived maize plants // Genetics. 1987.-V.l 16,N l.Pt2, Suppl, 10.

898. Tokumasa S., Kato M. Variation of chromosome numbers and essential oil components of plants from anther culture of the diploid and tetraploid in Pelargonium roseum // Euphytica. 1979. - V.28, N 2. - P. 329-338.

899. Torbin H., Gordon H. 1984. Immunoblotting and dot immunoblotting: current status and outlook // Immunol. Methods. 1984. - V.72. -P. - 313-340.

900. Truong-Andre I. In vitro haploid plants derived from pollination by irradiated pollen on cucumber // Cucurbitaceae'SB: proc. EUCARPIA Meet. Cucurbit Genet, and Breed., Avignon-Montfavet, May 31-June 1-2, 1988. Paris, 1988. - P. 143-144.

901. Truong-Andre I., Demarly Y. Obtaining plants by in vitro culture of unfertilized maize ovaries (Zea mays L.) and preliminary studies on the progeny of gynoge-netic plant // Z. Pflanzenzucht. 1984. - V.92, N 4. - P. 309-320.

902. Tsay H.S., Chen L.J., Tseng Т.Н., Lai P.C. The culture of rice anthers of ja-ponica x indica crosses // Plant Tissue Cult.: Proc. 5 Int. Congr. Plant Tissue and Cell. Cult. Tokyo and Lake Yamanaka, July 11-16, 1982. Tokyo, 1982. - P. 561562.

903. Tsay H.S., Yeh C.C., Hsu J.Y. Embryogenesis and plant regeneration from anther culture of bamboo (Sinocalamus latiflora (Munro) McCIure) // Plant Cell Repts. 1990. -V.9, N 7. -P. 349-351.

904. Tsay S.S., Tsay H.S., Chap C.Y. Cytochemical studies of callus development microspore in cultured anthers of rice // Plant Cell. Repts. 1986. - V.5, N 2. - P. 119-123.

905. Tsikov D.K., Zagorska N.A., Tsikova E.D. Haploids of cytoplasmic male sterile tabacco obtained from anthers in vitro // Докл. Болг. АН 1974. - V.27, N 12.-P. 1727-1730.

906. Tukey H.B. Artificial culture of sweet cherry embryos // J. Hered. 1933. -V.24,N l.-P. 7-12.

907. Tulecke W. A haploid tissue culture from the female gametophyte of Ginkgo biloba // Nature. 1964. - V.203, N 4940. - P. 94-95.

908. Uchimiya H., Kameya Т., Takahashi N. In vitro culture of unfertilized ovules in Solanum melongena and ovaries in Zea mays // Jap. J. Breed. 1971. - V.21, N 5. -P. 247-250.

909. Uddin M.R., Meyer M.M., Jokela J.J. Plantlet production from anthers of Eastern cottonwood (Populus Deltoides) Can. J. Forest Res. 1988. - V.l8, N 7. - P. 937-941.

910. Uhrig H. Genetic selection and liquid medium conditions improve the yield of androgenetic plants from diploid potatoes // Theor. and Appl. Genet. 1985. -V.71, N3. - P. 455-460.

911. Uijtewaal B.A., Jacobsen E., Hermsen J.G.T. Morphology and vigour of monohaploid potato clones, their corresponding homozygous diploids and tetraploids and their heterozygous diploid parent // Euphytica. 1987. - V.36, N 3. - P. 745753.

912. Vagera J., Hanackova H. Embryokultura soje tehnika kultivace a moznosti vyaziti // Rostl. vyroba. - 1979. -V.25, N 4. - P. 349-360.

913. Vagera J., Jilek M. Specification of the effect of chelating complex of iron ions in androgenesis in vitro by means of cation-free minimal medium // Biol, plant. 1984.-V.26,N 2.-P. 121-127.

914. Valieva Z.T., Timin N.I. Cytoembryology of induced apomixes of carrot // Embryology and seed reproduction: Abstracts XI Int. Symp. July 3-7, 1990. Leningrad, 1990.-P. 179.

915. Van Geyt J., D'Halluin K., Jacobs M. Induction of nuclear and cell divisions in microspores of sugar beet (Beta vulgaris L.) // Z. Pflanzenziicht 1985. - V.95, N 4.-P. 325-335.

916. Van Geyt J., Jacobs M. Induction of haploids of sugarbeet (Beta vulgaris L.) by means of androgenesis and gynogenesis // Bull. Soc. Bot. France. Act Bot. 1986. -V. 133,N4.-P. 83.

917. Van Geyt J., Speckmann G.J., D'Halluin K., Jacobs M. In vitro induction of haploid plants from unpollinated ovules and ovaries of the sugarbeet (Beta vulgaris L.) // Theor Appl. Genet. 1987. - V.73. - P. 920-925.

918. Vasil I.K. Androgenetic haploids // Perspectives in Plant Cell and Tissue Culture / Ed. I.K. Vasil. New York: Academic Press, 1980. - P. 195-223.

919. Vasil I.K., Nitsch C. Experimental production of pollen haploids and their uses // Z. Pflanzenziicht 1975. - V.76, N 3. - P. 191-212.

920. Veen H. The effect of various growth regulators on embryos of Capsella bursa-pastoris growing in vitro // Acta Bot. Neer. 1963. - V.l2, N 2. - P. 129-171.

921. Vences F.J., Vaquero F., Vazquez A.M., Perez V.M. Izozymatic changes during in vitro morphogenetic processes in self-pollinated species of Secale // J. Plant Physiol. 1986. - V. 123, N 1. - P. 31-36.

922. Vigers A.J., Roberts W.K., Selitrennikoff C.P. A new family of plant antifungal proteins // Mol. Plant-Microbe Interaction. 1991. - N 4. - P. 315-323.

923. Vogt M., Schweiger W. Untersuchungen zur Methodik der Empryokultur bei Trifolium Arch. Zzchtungsforsch 1983. - v.13, N 4. - P. 273-283.

924. Vu L., Huynth Q.K. Isolation and characterization of 27 kDa antifungal protein from the fruits of Diospyros texana 11 Biochem. Biophys Res Commun. 1994. -V.202. - P. 666-672.

925. Vyskot В., Novak F.J. Genotypic foundation of the frequency of androgenesis in vitro and characteristics of stomates in haploid plants // Scripta Fac. sci. natur. UJEP brun. Biol. 1974. - V.4, N 1. - P. 25-33.

926. Vyvadilova M., Zelenkova S., Tomaskova D. Anther culture of Brassica napus // Sci. agr. bohemost. 1987. - V.19, N 4. - P. 267-273.

927. Wagner V.T., Yang C.S., Matthys-Rochon E., Dumas C. Observation on the isolated embryo sac of Zea mays L. // Plant Sci. 1989. - V.59. - P. 127-132.

928. Wang A.S. Callus induction and plant regeneration from maize mature embryos // Plant Cell. Repts. 1987. - V.6, N 5. - P. 360-362.

929. Weatherhead M.A., Henshaw G.G The production of homozygous diplo? plants of Solanum verrucosum by tissue culture techniques // Euphytica. 1979. V.28,N 3. - P. 765-768. i ;

930. Wenzel G. Anther culture and its role in plant breeding // Plant Tissue Cult. Genet. Manipul. and Somatic Hybrid. Plant Cells.: Proc. Nat. Symp., Bombay, 27-29 Febr. 1980. Bombay, 1980. - P. 68-78.

931. Wenzel G., Bapat V.A., Uhrig H. New strategy to tackle breeding problems of potato // Plant cell culture in crop improvement. / Ed. S.K. Sen and L. Giles Kenneth. New York, London: Plenum Press., 1982. - P. 337- 349.

932. Wenzel G., Foroughi-Wehr B. Anther culture of Solanum tuberosum // Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Ed. I.K. Vasil. New York: Academic Press, 1984. - P. 293-301.

933. Wenzel G., Hoffmann F., Thomas E. Anther culture as a breeding tool in rape. I. Ploidy level and phenotype of androgenetic plants // Z. Pflanzenzucht. -1977. V.78, N2.-P. 149-155.

934. Wenzel G., Hoffmann F., Thomas E. Heterozygous microspore-derived plants in rye // Theor. and Appl. Genet. 1976. - V.48, N 4. - P. 205-208.

935. Wernicke W., Kohlenbach H.W. Antherenkulturen bei Scopolia // Z. Pflanzenphysiol. 1975. - V.77, N 1. - P. 89-93.

936. Westcott R.J., Henshaw G.G., Roca W.M. Tissue culture storage of potato germplasm: culture initiation and plant regeneration // Plant Sci. Lett. 1977. - V.9, N4.-P. 309-315.

937. Wheatley W.G., Marsolais A.A., Kasha KJ. Microspore growth and anther staging in barley anther culture // Plant Cell Repots. 1986. - v.5, N 1. - P. 47-49.

938. Widholm J.M. Cultured Nicotiana tabacum cells with an altered anthranilate synthetase which is less sensitive to feedback inhibition // Biochim. et Biophys. Acta. 1972. - V.261, N 1. - P. 52-58.

939. Widholm J.M. Selection and characteristics of biochemical mutants of cultured plant cells // Tissue culture and plant science / Ed. H.E. Street. London etc.: Acad, press, 1974 - P. 287-299.

940. Williams E. A hybrid between Trifolium repens and T. ambiguum obtained with the aid of embryo culture // N. Z. J. Bot. 1978. - V. 16, N 4. - P. 499-506.

941. Witty M. Sensory evaluation of transgenic Solanum tuberosum producing r-thaumatin II // N.Z.J. Crop. Sci. 1990. - V.18. - P. 77-80.