Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Усовершенствование элементов технологии получения растений - регенерантов моркови столовой (Daucus carota L.) в культуре пыльников и микроспор

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование элементов технологии получения растений - регенерантов моркови столовой (Daucus carota L.) в культуре пыльников и микроспор"

На правах рукописи

V

ДЕМИДКИНА Марина Александровна

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ - РЕГЕНЕРАНТОВ МОРКОВИ СТОЛОВОЙ (Daucus carota L.) В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ И МИКРОСПОР

Специальность: 06.01.05 - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

14 Ш 2013

Москва-2013 005535829

005535829

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства Россельхозакадемии в 2008-2013 гг.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Поляков Алексей Васильевич

Официальные оппоненты: Калашникова Елена Анатольевна

доктор биологических наук, профессор, Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева, профессор кафедры генетики и биотехнологии

Автошина Ольга Алексеевна

кандидат сельскохозяйственных наук, Рязанский государственный агротехнологи-ческий университет им. П. А. Костычева, доцент кафедры лесного хозяйства, экологии и селекции

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт селекции и семеноводства овощных культур

Защита состоится «14» ноября 2013 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 006.022.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте овощеводства Россельхозакадемии по адресу: 140153 Московская обл., Раменский район, д. Верея, строение 500, ВНИИО.

Факс (496) 462-43-64

E-mail: vniioh@vandex.ru. сайт: www.vniioh.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института овощеводства Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «12» октября 2013 года

Ученый секретарь Ik ^

диссертационного совета Девочкина Наталия Леонидовна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАРАБОТЫ

Актуальность темы. Морковь столовая является перекрёстноопыляемым растением, имеющим двухлетний цикл развития. В связи с этим селекционный процесс этой культуры является длительным, трудоемким и преимущественно основан на внутривидовой гибридизации с последующим многократным отбором, использовании инфекционно-провокационных фонов для оценки материала на устойчивость к стрессовым факторам среды (Поляков A.B., 2004).

Использование биотехнологических методов позволяет создавать принципиально новые, ранее не существовавшие генотипы, придавать заданные свойства уже существующим, что затруднено при использовании традиционных методах селекции. Это дает возможность значительно расширить генетическое разнообразие исходного материала для селекции возделываемых культур и повысить эффективность отбора генотипов с ценными хозяйственно-биологическими признаками (Жамбакин К.Ж., 2004).

В России уже разработаны методы получения растений-регенерантов, в том числе гаплоидов и удвоенных гаплоидов моркови столовой в культуре изолированных пыльников (Тюкавин Г.Б., 2000, 2007; Поляков A.B., Ильченко О.В., 2003); культуре семяпочек (Домблидес Е.А., 2000; Поляков A.B., Ильченко О.В., 2003; Тюкавин Г.Б., 2007); индуцированном апомиксисе (Ти-мин Н.И., 1994; Ильченко О.В., 2007). Однако, несмотря на большое внимание, уделяемое методам биотехнологии, все еще остается множество проблем, препятствующих широкому её внедрению в селекционную практику.

Очевидно, что усовершенствование методов получения растений-регенерантов моркови столовой позволит повысить эффективность селекционного процесса и увеличить производство высококачественной продукции.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось усовершенствование элементов технологии получения растений-регенерантов моркови столовой (Dauern carota L.) в культуре пыльников и микроспор.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• подобрать способ выделения микроспор;

• выявить влияние наночастиц серебра на эмбриогенез в культуре микроспор;

• исследовать влияние температурной предобработки бутонов на эмбриогенез в культуре микроспор;

• подобрать питательные среды для культивирования микроспор;

• изучить влияние сахарозы на рост и развитие микроспор;

• подобрать оптимальные условия предобработки донорных растений различными веществами для индукции эмбриогенеза в культуре пыльников;

• изучить влияние нитрата серебра на индукцию эмбриогенеза в культуре пыльников;

• оценить растения-регенеранты моркови столовой, полученные в культуре пыльников, по хозяйственно-ценным признакам.

Объект исследований- методика получения растений-регенерантов моркови столовой в культуре пыльников и микроспор.

Предмет исследований- зонтички, бутоны, пыльники, микроспоры, эм-бриоиды, растения-регенеранты моркови столовой (Daucus carota L.).

Научная новизна работы. Установлено, что предобработка донорных растений моркови столовой нитратом серебра в концентрации 60 мг/л позволяет ускорить начало каллусогенеза на 44-63 суток по сравнению с контролем, а также в зависимости от сорта получать 32-45% каллусогенных пыльников. Добавление нитрата серебра в концентрации 40 мг/л в агаризованную среду МСм в культуре пыльников позволяет получать в зависимости от сорта 7,4-11,1% каллусогенных пыльников, по сравнению 0-5,9% в контроле.

Предобработка бутонов пониженными температурами (+4...+5 °С) при экспозиции 48 часов увеличивает образование эмбриоидов на 0,13-0,14% в культуре микроспор в зависимости от сорта.

В культуре микроспор моркови столовой использование сахарозы в комбинациях: агаризованная МСм среда, содержащая 30 г/л и жидкая среда - 30 г/л или агаризованная среда - 30 г/л и жидкая среда - 60 г/л на фоне 2,4-Д, используемом в концентрации 0,2 мг/л, позволяет получать 0,41-0,49% эмбриоидов в зависимости от сорта.

Практическая ценность исследований. Усовершенствованы элементы технологии, применение которых позволяют ускорить начало каллусогенеза на 44-63 суток, индуцировать ризогенез у 54,3-59,1% трудноукореняемых побегов моркови столовой, снизить себестоимость получения 1 растения-регенеранта в культуре пыльников на 5,2%, а затраты энергии- на 666,1 КДж.

Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были представлены на 22-ой специализированной выставке-ярмарке «ФАЗЕНДА» (Москва, 2012 г.), Международной научно-практической конференции молодых учёных, посвященной 125-летию со дня рождения Н.И. Вавилова «Овощеводство будущего: новые знания и идеи» (Москва, 2012 г.), а также на заседаниях методической комиссии по селекции, семеноводству и биотехнологии ГНУ ВНИИО Россельхозака-демии (2009-2012 гг.).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

• предобработка донорных растений моркови столовой нитратом серебра в концентрации 60 мг/л ускоряет начало каллусогенеза на 44-63 суток в культуре пыльников;

• добавление в питательную среду МСм нитрата серебра в концентрации 40 мг/л индуцирует каллусогенез у 7,4-11,1% пыльников у моркови столовой;

• использование жидкой питательной среды MC с концентрацией питательных элементов 75% и НУК-0,1 мг/л индуцирует ризогенез у 54,3-59,1% побегов с зачатком корнеплода;

• предобработка бутонов моркови столовой пониженными температурами (+4...+5 °С) в течение 48 ч увеличивает образование эмбриоидов на 0,13-0,14% в культуре микроспор в зависимости от сорта;

• эффективность образования эмбриоидов при механическом выделение микроспор 0,15-0,24%;

• добавление в агаризованную среду МСм сахарозы в концентрации 30 г/л и жидкую среду -30 г/л или агаризованную среду- 30 г/л и жидкую среду-60 г/л, позволяет получать 0,41-0,49% эмбриоидов в культуре микроспор;

• концентрация микроспор 50000 шт./1 мл питательной среды позволяет получать эмбриоиды моркови столовой с частотой 0,12-0,35%.

Доля личного участия. Доля личного участия в проведении опытов 100%, в выполнении биохимических анализов 80%.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов, заключения, предложений для использования в селекционной практике, списка литературы, содержащего 189 наименований, в т.ч. 105 иностранных авторов, ресурсы интернет. Изложена на 160 страницах компьютерного текста, содержит 31 табл., 17 приложений и иллюстрирована 18 рис.

2.УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проведены в ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии, расположенном в Раменском районе, Московской области в период 2008-2013 гг. в соответствии с тематическими планами НИР института и отдела биотехнологии (задание 04.04.04.01), является законченной НИР, содержит решение актуальности вопроса (№ ГР 01201169874, инв. № 02201358777).

Исследования проводили на 4 сортах моркови столовой, полученных из отдела селекции ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии.

Полевые опыты вели в соответствии с Методикой опытного дела в овощеводстве и бахчеводстве (под ред. Велика В.Ф., 1992).

Исследования в условиях in vitro проводили по Методическим указаниям по культуре ткани и органов в селекции растений (Бутенко Р.Г., Хромова Л.М., Седнина Г.А., 1984; Поляков A.B., 2005).

Определение содержания сухих веществ, Сахаров в потомствах растений-регенерантов проводили по методике И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна, (1998).

Цитологический анализ растений-регенерантов осуществляли по методи-

ке В.А. Пухальского, A.A. Соловьёва, Е.Д. Бадаева и др. (2004).

Математическую обработку экспериментальных данных проводили на основе методов математической статистики по методикам, опубликованным у Б.А. Доспехова (1985), С.С. Литвинова (2011).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Эффективность способов получения культуры микроспор

Развитие микроспор происходит внутри пыльника и для их освобождения необходимо использовать эффективные приёмы. Из литературных источников известны методы выделения микроспор: культивирование пыльников в жидкой среде (Sunderland N., Roberts М., 1975), освобождение микроспор из пыльников и перемешивание их на магнитной мешалке после нескольких суток предкультивирования (Zaki М.А.М., 1991), механический метод (Hunter, C.R., 1985; Поляков A.B., 2000,2007; Зонтиков Д.Н., 2009).

3.1.1. Доращивание зонтичков

В результате проведения исследований изучено два способа доращивания зонтичков моркови столовой в лабораторных условиях.

Для анализа брали хорошо развитые раскрытые цветки. При этом у цветков тычиночные нити были скрученны, пыльники хорошо развиты.

Доращивание зонтичков в условиях in vitro осуществляли в течение одних и двух суток на среде MC с содержанием сахарозы (г/л): 25, 50,100,150, 200, 250,400.

Исследования показали, что при доращивании в течение одних суток зонтичков моркови, при содержании сахарозы в питательной среде 250 г/л и 400 г/л раскрытых пыльников было 30% и 40%, но пыльца из них не высыпалась, в других вариантах пыльники не раскрылись. При доращивании зонтичков моркови столовой в течение двух суток на среде с содержанием сахарозы 100 г/л доля жизнеспособных раскрывшихся пыльников составила 14,3%, а при концентрации сахарозы 150 г/л и 200 г/л - 6,6% и 8,5%, соответственно.

Доращивание зонтичков на питательной среде осуществляли в термостате при температуре +25°С и +32°С, в экспозиции одних и двух суток. При доращивании зонтичков в таких условиях в течение одних суток при температуре +25°С на питательной среде с содержанием сахарозы в концентрации 100 г/л у исследуемых сортов пыльники были жизнеспособными, но не раскрывшимися. При культивировании их при температуре +32°С на среде с содержанием сахарозы 100 г/л и 150 г/л у сортов Витаминная 6 и Лосиноостровская 13-жизнеспособными, но не раскрывшимися.

При подращивании зонтичков моркови столовой при температуре +25°С и +32°С в течение 2 суток наблюдали их полное увядание.

3.1.2. Растрескиваемость пыльников в жидкой питательной среде в зависимости от концентрации сахарозы

Пыльники моркови столовой сорта Rondo, изолированные на стадии одноядерных микроспор, помещали в жидкую питательную среду МСм, содержащую 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л, сахарозу (г/л): 30, 60, 90, 120 и 140. Затем пыльники культивировали в термостатируемой качалке в течение 14 суток при температуре +37°С и 450 об./мин. В последующем пыльники моркови культивировали при температуре +19...+20°С на той же питательной среде.

На 16 сутки культивирования в среде, содержащую сахарозу в концентрации 120 г/л и 140 г/л наблюдалось расгрескивание 10% и 15% пыльников и выход микроспор в питательную среду. При последующем их культивировании в жидкой питательной среде образования эмбриоидов не обнаружено.

3.1.3. Эффективность образования эмбриоидов при механическом выделение микроспор из пыльников в жидкой питательной среде

При механическом выделении микроспор пыльники разрезали скальпелем в капле жидкой среды, удаляли его стенки и помещали микроспоры в среду МСм, содержащую 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л, сахарозу (г/л): 30, 60, 90, 120 и 140. Микроспоры культивировали в термостатируемой качалке в течение 14 суток при температуре +37°С и 450 об./мин, в последующем- при +19..+20°С на той же питательной среде.

Последующее культивирование микроспор в жидкой питательной среде аналогичного состава с содержанием сахарозы в концентрации 30 г/л, сопровождалось образованием эмбриоидов у сорта Шантенэ королевская, их доля составила 0,03%. В других вариантах содержания сахарозы в питательной среде эмбриоиды у этого сорта не образовывались.

При помещении суспензии микроспор сорта Шантенэ королевская на ага-ризованную среду МСм аналогичного состава на 40 сутки культивирования наблюдали образование эмбриоидов. В зависимости от сорта доля эмбриоидов составляла 0,15-0,24%. У сортов Rondo и Лосиноостровская 13 эмбриоиды не образовывались.

3.2. Влияние концентрации микроспор на эмбриогенез

Известна зависимость между эмбриогенезом и числом закладываемых на питательную среду микроспор, например, у капусты белокочанной более интенсивный эмбриогенез (0,164%) наблюдался при плотности 50000 микроспор/1 мл питательной среды, при повышении концентрации эффективность эмбриогенеза снижалась (Зонтиков Д.Н., 2009).

В наших опытах по определению оптимальной концентрации микроспор использовались следующие концентрации (шт./мл среды): 10000, 20000, 50000. Питательная среда МСм, содержала 2,4-Д в концентрации ОД мг/л, сахарозу- 30 г/л, агар - 6 г/л.

Лучшие результаты получены при концентрации 50 000 микроспор на

1 мл среды, где при культивировании микроспор в течение 42-х суток частота образования эмбриоидов составила у сорта Rondo 0,3%, у сорта Витаминная 6 - 0,15%, у сорта Лосиноостровская 13 -0,12%. В других вариантах, в зависимости от концентрации микроспор, доля эмбриогенных микроспор составила у сорта Rondo от 0 до 0,15%, у сорта Витаминная 6-от 0 до 0,10%. У сорта Лосиноостровская 13 при концентрации микроспор менее 50000 шт./мл среды эмбриоиды при культивировании микроспор в течение 42 суток не образовывались. На 70-е сутки культивирования микроспор доля образовавшихся эмбриоидов при плотности суспензии 50000 шт./мл среды увеличилась у сорта Rondo на 0,05%, у сорта Витаминная 6- на 0,07% (табл.1).

Таблица 1- Эмбрио- и каллусогенез моркови столовой при различной концентрации микроспор в питательной среде МСм на 70 сутки

Концентрация Образовалось

Сорт микроспор, шт./мл эмбриоидов каллусов

среды шт. % шт. %

контроль* 0 0 2 3,9

Лосиноост- 10000 0 0 0 0

ровская 13 20000 8 0,04 0 0

50000 60 0,12 2 0

контроль* 0 0 0 0

Rondo 10000 0 0 0 0

20000 150 0,25 4 0,01

50000 525 0,35 12 0,01

контроль* 0 0 0 0

витаминная 6 10000 0 0 0 0

20000 108 0,18 0 0

50000 220 0,22 0 0

Примечание: * - в качестве контроля использовали культуру пыльников.

3.3. Влияние температурной предобработки бутонов на эмбриогенез в культуре микроспор

В опыте изучали влияние положительных пониженных (+4...+5°С) в течение 12, 24, 36 и 48 часов и повышенных температур (+32...+33°С) в течение 6, 12,18,24,30 часов на эмбриогенез моркови в культуре микроспор.

В результате проведенных исследований установлено, что воздействие на бутоны пониженными температурами (+4...+5°С) положительно влияет на образование эмбриоидов. Так, у сорта Лосиноостровская 13 лучший результат был получен при экспозиции 48 часов. Доля эмбриоидов в этом варианте составила 0,23% и превысила контроль на 0,22%, а у сорта Шантенэ королевская - 0,18% (табл. 2).

В результате воздействия на бутоны повышенными температурами (+32...+33°С) установлено, что лучшей экспозицией для сорта Лосиноостровская 13 является 12 часов, доля эмбриогенных микроспор составила 0,28%.

Положительные пониженные температуры (+4...+5°С) в течение 48 часов

оказывают благоприятное воздействие на эмбриогенез моркови в культуре микроспор и позволяют полечить 0,18-0,23% эмбриоидов в зависимости от сорта.

Таблица 2 - Влияние температурной предобработки бутонов на эмбриогенез в культуре микроспор, /3=50000_

Сорт Период температурной предобработки, ч

без обработки +4...+5°С +32...+33°С

12 24 36 48 6 12 18 24 30

Образовалось эмбриоидов, %.

Лосиноостровская 13 0,1 ±0,03 0,16 ±0,03 0,12 ±0,03 0,06 ±0,02 ОДЗ ±0,04 0,2 ±0,03 0,28 ±0,04 0 0,04 ±0,02 0,13 ±0,03

Шантенэ королевская 0,14 ±0,03 0,06 ±0,02 0 0 0,18 ±0,03 0,02 ±0,03 0,05 ±0,02 0 0 0,1 ±0,03

3.4. Влияние наночастиц серебра на индукцию эмбриогенеза в культуре

микроспор

Наночастицы серебра в концентрациях 0,08 мМ, 0,4 мМ, 0,8 мМ добавляли в питательную среду МСм, содержащую 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л, сахарозу-30 г/л, агар-6 г/л, в качестве стимулирующего агента.

В ходе проведения исследований выявлено, что добавление НЧ серебра ингибирует образование эмбриоидов моркови сорта Лосиноостровская 13. Доля образовавшихся эмбриоидов составила от 0,07% до 0,11%, что было значительно ниже по сравнению с контролем (0,23%).

3.5. Подбор питательных сред для культивирования микроспор

Состав питательных сред подбирается опытным путем и содержит минеральные соли, углеводы, аминокислоты, витамины, фитотогормоны, агар и другие добавки - кокосовое молоко, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина, и т.д.

В результате культивирования микроспор моркови сортов Лосиноостровская 13, Шантенэ королевская и Rondo на агаризованных питательных средах МСм, МС и МСп, различающихся по отдельным компонентам и содержащих 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л, сахарозу-30 г/л, агар-6 г/л, установлено, что наибольшее количество эмбриогенных микроспор образовалось на среде МСм и составило 0,34% у сорта Rondo, 0,49%-у сорта Лосиноостровская 13, 0,41%-у сорта Шантенэ королевская (табл. 3).

Таблица 3- Доля эмбриогенных микроспор моркови столовой на различных _ питательных средах (п =50000)_

Сорт Об разовалось эмбриоидов

МСм МС МСп

шт. %±Sp шт. %±Sp шт. %±Sp

Лосиноостровская 13 738 0,49±0,03 627 0,42±0,03 414 0,28±0,02

Шантенэ королевская 612 0,41±0,03 591 0,39±0,03 429 0,28±0,02

Rondo 507 034±0,03 423 0,28±0,02 351 0,23±0,02

3.6. Влияние сахарозы на образование эмбриоидов на двухслойной питательной среде при введении в культуру in vitro

Микроспоры моркови помещали на двухслойную питательную среду МСм, содержащую 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л, сахарозу (г/л): 30 (контроль), 60,90, 120,140.

В зависимости от концентрации сахарозы количество эмбриоидов у сорта Rondo составляло от 0,31% (при содержании сахарозы в агаризованной и жидкой средах 140 г/л) до 0,78% (при концентрации сахарозы в агаризованной и жидкой средах 30 г/л). Лучший результат достигнут при сочетании твердой среды, содержащей сахарозу 30 г/л, и жидкой среды с содержанием сахарозы 30 г/л-0,78%, а также твердой среды, содержащей сахарозу в концентрации 60 г/л, и жидкой среды - 30 г/л доля эмбриогенных микроспор составила 0,75%.

У сорта Лосиноостровская 13 лучший результат, 0,49% эмбриоидов от числа культивируемых микроспор, получен в вариантах использования комбинаций агаризованной среды с содержанием сахарозы 30 г/л и жидкой среды с концентрацией сахарозы 30 г/л, а также при сочетании агаризованной среды - 30 г/л и жидкой среды - 60 г/л - 0,47%.

У сорта Шантенэ королевская- при использовании комбинаций агаризованной среды с содержанием сахарозы 30 г/л и жидкой среды -30 г/л, агаризованной среды с содержанием сахарозы 30 г/л и жидкой среды с концентрацией сахарозы 60 г/л- 0,41%.

На агаризованной среде, содержащей сахарозу в концентрации 60 г/л, наибольшее количество эмбриоидов (0,35%) образовалось, когда в жидкой среде концентрация сахарозы составляла 30 г/л.

2 м' 5 °

го т а

п о

3 х

а. о.

>о ю

О I

Содержание сахарозы в жидкой питательной среде:

30 60 90 120 140

Содержание сахарозы в агаризованной среде, г/л

■ 30

■ 60

■ 90

■ 120 ■ 140

о

о I

Содержание сахарозы в жидкий пишгельной среде:

1111 Т

30 60 90 120 140 Содержание сахарозы в агаризованной среде, г/л

■ 30

■ 60

■ 90

■ 120 ■ 140

Рисунок 1- Эмбриогенез моркови столовой в культуре микроспор на двухслойной питательной среде: А- сорт Лосиноостровская 13, Б- сорт Шантенэ королевская

3.7. Усовершенствование элементов методики культуры пыльников 3.7.1. Влияние обработки донорных растений нитратом серебра на ускорение начала каллусогенеза

В период вегетации (отрастание, начало образование зонтиков, появления зонтика первого порядка) проводили обработку растений моркови столовой нитратом серебра в концентрациях (мг/л): 20, 40, 60 и 80, контроль -дистиллированная вода.

В стерильных условиях пыльники переносили на агаризованную питательную среду МСм, содержащую 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л, сахарозу-30 г/л, агар- 6 г/л.

При изучении влияния предобработки растений в культуре пыльников отмечено, что после обработки донорных растений моркови сорта Лосиноостровская 13 нитратом серебра в концентрации 60 мг/л каллусогенез начался на 46 сутки культивирования (табл.4). В этом варианте образовалось наибольшее количество каллусогенных пыльников 45%, то время как в контрольном варианте начало каллусогенеза было отмечено лишь на 109 сутки, а доля морфогенных пыльников составила 13%. У сорта Шантенэ королевская начало каллусогенеза был отмечен на 79 сутки, доля каллусогенных пыльни-

ков составила 32% (табл. 4). В контрольном варианте начало каллусогенеза было отмечено на 123 сутки культивирования пыльников, доля каллусоген-ных пыльников составила 7,0%.

Таблица 4— Влияние обработки донорных растений моркови столовой нитратом серебра на ускорение начала каллусогенеза пыльников в условиях _in vitro, я—100_

Вариант обработки растений Сорт Лосиноостроская 13 Сорт Шантенэ королевская

начало морфогенеза, сутки доля каллусогенных пыльников, % начало морфогенеза, сутки доля каллусогенных пыльников. %

Контроль 109 13,0±3,4 123 7,0±2,5

AgN03 (20 мг/л) 62 18,0±3,8 157 5,0±2,2

AgN03(40 мг/л) 75 24,0±4,3 94 5,0±2,2

AgNO, (60 мг/л) 46 45,0±4,9 79 32,0±4,6

AgN03 (80 мг/л) 68 29,0±4,5 112 7,0±2,5

Начало каллусогенеза в вариантах обработки донорных растений нитратом серебра в концентрациях 20 мг/л, 40 мг/л и 80 мг/л отмечено на 62-157 сутки, доля каллусогенных пыльников составляла 5,0-29,0% в зависимости от сорта.

3.7.2. Влияние нитрата серебра на индукцию эмбриогенеза в культуре бутонов и пыльников

Отмечено, что лучшие результаты получены при культивировании бутонов на агаризованной среде по сравнению с жидкой.

На агаризованной среде в зависимости от сорта получено от 11,3% до 14,4% растущих пыльников (табл. 5).

У сорта Шантенэ королевская на агаризованной среде доля разросшихся пыльников составила 14,4%, каллусогенных -7,4%, а при добавлении нитрата серебра - 10,3% и 3,3% соответственно.

У сорта Лосиноостровская 13 добавление нитрата серебра в агаризован-ную питательную среду способствовало увеличению образования каллусогенных пыльников на 18,2% по сравнению с контролем.

Добавление нитрата серебра в жидкую среду снижало жизнеспособность пыльников и не способствовало образованию каллуса.

В культуре изолированных пыльников у сорта Лосиноостровская 13 на агаризованной и жидкой средах доля растущих пыльников составила 73,979,2%.

Таблица 5 - Доля растущих и каллусогенных пыльников

Сорт Среда МСм Изучено пыльников, шт. Получено пыльников

растущих каллусогенных

шт. %tSp шт. %tSp

Лосиноостровская 13 агаризованная (контроль) 177 20 11,3±2,4 9 5,1±1,7

агаризованная, АяШ, 150 16 10,7±2,5 35 23,3±3,5

жидкая 500 100 20±1,8 0 0

жидкая, 450 37 8,2±1,3 0 0

Шантенэ королевская агаризованная (контроль) 180 26 14,4±2,6 6 3,3±1,3

агаризованная, А.еКО, 174 18 10,3±2,3 13 7,4±2

жидкая 450 40 8,8±1,3 0 0

жидкая, AgNOз 400 15 3,7±0,9 0 0

Добавление нитрата серебра в агаризованную среду сопровождалось образованием каллуса у 31,2% пыльников, в то время как в контроле их доля составила 8,7%. При этом на среде, содержащей нитрат серебра в концентрации 40 мг/л, в пересчете на 1 эксплант было получено 4,5 шт. побегов, а в контроле - 3,0 шт. (табл. 6).

На жидкой среде каллус и побеги не образовались. Добавление нитрата серебра в жидкую среду снижало жизнеспособность пыльников на 19%.

Таблица 6— Каллусогенез моркови столовой сорта Лосиноостровская 13 в культуре пыльников на различных вариантах среды на 30 сутки_

Среда МСм Проанализировано пыль ников, 1UT Получено пыльников Получено побегов

растущих с каллусом всего, шт. на 1 эксплант

шт. %±Sp шт. %±Sp

Агаризованная (контроль) 46 34 73,9±6,5 4 8,7±4,2 12 3

Агаризованная, AgN03 48 38 79,2±5,9 15 31,2±6,7 68 4,5

Жидкая 200 150 75,0±3,1 0 0 0 0

Жидкая, AgNO; 200 112 56,0±3,5 0 0 0

3.7.3. Получение растений-регенерантов из каллуса

По мере образования эмбриоидов, почек и побегов их пересаживали на агаризованную питательную среду МСм, содержащую кинетин в концентрации 0,1 мг/л, сахарозу - 30 г/л, агар - 6 г/л.

У сорта Лосиноостровская 13 в варианте без обработки донорных растений и при обработке их раствором ДМСО в концентрации 10 мл/л получено наибольшее количество эмбриоидов 25 шт. и 59 шт. на 1 трансплант.при предкультивировании пыльников на агаризованной среде, содержащей нитрат серебра в концентрации 40 мг/л, что существенно превышало контроль (13 шт./трансплант).

При предкультивировании пыльников на среде, содержащей нитрат серебра в концентрациях 20 мг/л и 60 мг/л, в зависимости от предобработкедо-норных растений получено от 3 шт. до 17 шт. эмбриоидов на 1 трансплант.

У сорта Шантенэ королевская в варианте обработки донорных растений раствором 2,4-Д в концентрации 5 мл/л совместно с ДМСО -10 мл/л, наибольшее количество эмбриоидов на 1 трансплант (39 шт.) получено при предкультивировании пыльников на агаризованой среде, содержащей нитрат серебра в концентрации 40 мг/л. В других вариантах опыта образования эмбриоидов не наблюдали.

3.7.4. Укоренение побегов, полученных в культуре пыльников

Для целей селекции, когда требуется получение большого количества растений с использованием методов андрогенеза и других методов биотехнологии, необходимо использование довольно простых и дешевых способов укоренения и адаптации растений-регенерантов моркови.

Для укоренения побегов часто используют безгормональные жидкие и агаризованные питательные среды, с содержанием питательных элементов сниженным в два раза, а концентрация сахарозы составляет 1% (Поляков A.B., 2000, 2007; Тюкавин Г.Б., 2007). Эти условия способствуют хорошей укореняемости и интенсивному развитию корневой системы растений-регенерантов.

Укоренение растений-регенерантов осуществляли на агаризованной питательной среде MC, содержащей сахарозу в концентрации 10 г/л и агар -6 г/л, а также на среде аналогичного состава с добавлением нитрата серебра в концентрации (мг/л): 20,40,60. Ризогенез был более эффективным на средах, не содержащих нитрат серебра.

При образовании зачатков корнеплода процесс ризогенеза резко ухудшался. В связи с этим была проведена серия исследований по изучению концентраций питательных элементов и НУК в жидкой питательной среде (табл. 7).

Таблица 7—Укоренение побегов моркови сорта Лосиноостровская 13 _на жидкой питательной среде, п= 22__

Концентрация питательных элементов среды МС, % Концентрация НУК в среде для укоренения, мг/л Укоренилось побегов

шт. %tSp

0(контроль) 10 45,4+2,3

100 0,1 11 50,0+2,3

0.3 4 18,2+1,7

0,5 1 4,5-И),9

0(контроль) 8 36,4+2,2

75 0,1 13 59,1+2,2

0,3 6 27,3+2

0,5 3 13,6+1,5

0 (контроль) 10 45,4+2,3

50 0,1 11 50,0+2,3

0.3 5 22,7+1,9

0,5 1 4,5+0,9

При проведении исследований по оптимизации питательной среды для укоренения побегов моркови отмечено, что наибольшие количество укоренившихся побегов 59,1% получено в варианте с содержанием НУК в концентрации 0,1 мг/л и питательных элементов 75%.

При добавлении в жидкую среду для укоренения НУК в концентрации 0,3 мг/л доля укоренившихся побегов составила 18,2-27,3%, что было ниже контрольных вариантов на 9,1-27,3% в зависимости от концентрации питательных веществ.

Применение НУК в концентрации 0,5 мг/л приводило к образованию каллуса на основаниях побегов и витрификации растений-регенерантов, а доля укоренившихся растений была на уровне 4,5%.

3.7.5. Адаптация растений-регенерантов моркови Важным моментом в биотехнологическом процессе является адаптация растений-регенерантов, полученных в условиях in vitro к условиям in vivo. Стадия адаптации in vivo является довольно проблематичной для многих культур. Большинство трудностей связано со слабым развитием сосудистой системы растений-регенерантов, а также быстрым увяданием после удаления их из культивационного сосуда (Тюкавин Г.Б., 2007).

Проведенные исследования по культивированию пыльников моркови столовой при различных вариантах предобработке донорных растений на средах с различным содержанием нитрата серебра позволил получить более 200 пробирочных растений-регенерантов сорта Лосиноостровская 13.

Применение данной технологии адаптации к условиям in vivo у сорта Лосиноостровская 13 из 238 шт. адаптируемых растении-регенерантов было адаптировано 55,9%, а 36,6% растений было хорошо развитых в условиях in vivo и в последующем образовали семена от самоопыления.

У сорта Шантенэ королевская в результате использования предложенной технологии получено 25% (12 шт.) адаптированных растений к условиям in vivo.

Рисунок 4—Схема получения растений-регенерантов моркови столовой in vitro в культуре пыльников: a-введенные в культуру in vitro пыльники; б, в-эмбриогенез; г-побеги; д-укоренённые побеги; е -адаптированные к условиям in vivo растения-регенеранты

ГЛАВА 4. ОЦЕНКА РАСТЕНИЙ-РЕГНЕРАНТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ 4.1. Оценка растений-регнерантов по числу замыкающих клеток устьиц

а хлоропластов в них

Как показали исследования, предполагаемые гаплоиды, отличаются от диплоидов высокой и полной стерильностью пыльцы, меньшими размерами анатомических элементов, и в частности клеток эпидермиса и замыкающих клеток устьиц.

В результате оценки растений-регенерантов по числу устьиц в поле зрения микроскопа при увеличении 15x40 выявлено, что у 73,6% растений их количество составляло 12-17 шт., в то время как у контрольных растений - 6-12 шт.

У сорта Лосиноостровская 13 число устьиц 14-18 шт. было отмечено у 14,9% растений-регенерантов, у сорта Шантенэ королевская 13-17 шт. устьиц в поле зрения микроскопа отмечено у 30% растений-регенерантов.

Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц в поле зрения микроскопа при увеличении 15x40 у контрольных растений составляло 13-17 шт. У 57,5% растений-регенерантов сорта Лосиноостровская 13 было 6-10 шт. хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, у сорта Шантенэ королевская—у 50,0% растений.

Однако, доля растений-регенерантов, у которых наблюдалось 12-17 шт. устьиц в поле зрения микроскопа в сочетании с 6-10 шт. хлоропластов в замыкающих клетках устьиц при увеличении 15x60 составила 14,9-30,0% в зависимости от сорта, что косвенно доказывает их гаплоидную природу.

4.2. Характеристика растений-регенерантов Ro

Оценка по морфологическим признакам показала, что все растения-регенеранты моркови имели полустоячую форму розетки листьев, оранжевый корнеплод.

У сорта Шантенэ королевская оба растения, выращенные в условиях защищенного грунта, имели антоциановую окраску основания черешка листа и головки корнеплода с этапа адаптации их к условиям in vivo до начала стеблевания. В период цветения этот признак отсутствовал, как у контрольных растений.

Из 66 изученных растений-регенерантов Ro сорта Лосиноостровская 13, выращенных в условиях защищенного грунта, 80% имели типичную для сорта ромбовидную форму листовой пластинки зеленой окраски (79%). У 75% растений опушенность листа была редкой, у 5%-голой, что отличало их от контрольных растений исходного сорта.

Высота розетки растений в среднем была 31 см (V 20,4), а в контроле 29 (V 19,4). Черешок листа имел длину 13 см при высоком коэффициенте вариации (V 24), 95%-зеленой окраски с редким опущением (94,5%), 1,7%-голый. В контроле черешок листа был 11 см (V 18) зеленой окраски с густым опушением.

В течение вегетации растения Ro прошли яровизацию и образовали семена от самоопыления, которые были оценены в лабораторных условиях (табл. 8).

В результате оценки установлено, что по всхожести контроль превышали на 12% и 15% семена двух регенерантов № 9 и 10. У 30,3% растений всхожесть была на уровне контроля, у остальных- значительно ниже. Самая низкая всхожесть семян 18-20% была у регенерантов № 16,36, соответственно.

Таблица 8- Посевные качества семян растений-регенерантов Ro сорта

Лосиноостровская 13 (защищенный грунт)

№ растения-регенеранта Масса 1000 семян, г Всхожесть, %

Контроль 1,58 65

6 1,18 34

8 2,12 54

9 1,46 77

10 1,48 80

15 1,3 18

35 1,50 20

Масса 1000 семян большинства растений была на уровне контроля, а у регенерата №8 превышала контроль на 0,54 г. У 13,9% растений этот показатель был ниже контрольного в среднем на 0,3 г.

На всхожесть семян моркови негативное влияние могло оказать несколько факторов. Основными являются: высокая температура воздуха в теплице (более 35°С) во время цветения, высокая влажность воздуха в период завязывания семян, зараженность семян грибами рода АИегпапа, а также в связи с проведением самоопыления.

4.2.1. Характеристика растений Я] сорта Лосиноостровская 13

Семена моркови, полученные от самоопыления растений-регенерантов, были высеяны в условия защищенного и открытого грунтов, оценены по морфологическим признакам. Установлено, что коэффициенты вариации по признакам (высота розетки, число листьев, толщина черешка листа, опущен-ность, окраска) не превышали 33,3%, что свидетельствует об однородности растений. Растения моркови столовой Я, имели оранжевый корнеплод конической формы с гладкой поверхностью и не отличались от исходного сорта.

Наиболее выровненные образцы моркови были оценены по содержанию в них сухих веществ, каротиноидов и Сахаров. Установлено, что наибольшим содержанием каротиноидов (16,4 мг%) характеризовались корнеплоды растения № 5, которые превышали контроль на 0,8 мг%. (табл. 9).

Таблица 9-Биохимический состав корнеплодов п=6

Номер растения-регенеранта Содержание сухих веществ, % Содержание каротиноидов, мг% Сумма Сахаров, % Моносахара, % Дисахара, %

Контроль 11,5 15,6 6,7 3,2 3,4

2 10,4 16,3 7,0 3,4 3.6

5 11,4 16,4 6,6 3,3 3,0

8 10,9 16,0 7,1 3,6 3,5

11 11,5 15,3 7,2 3,5 3,7

13 11,9 15,0 7,1 3,5 3,6

Общая сумма Сахаров у проанализированных образцов была на уровне 6,6-7,2%, при этом наибольшее количество дисахаров 3,7% содержалось в корнеплодах образца №11.

ГЛАВА 5. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГНЕРАНТОВ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ

Экономическая эффективность является интегральным показателем, определяющим возможность практического применения научных результатов.

В результате проведенных исследований разработана методика получения растений-регенерантов в культуре пыльников. Предлагаемая методика включает в себя 7 этапов, что на 1 этап меньше по сравнению с методикой, разработанной Г.Б. Тюкавиным (2000) и позволяет снизить затраты труда на 7 чел.час. Затраты энергии на получения одного растения-регенеранта моркови столовой, полученного по предлагаемой методике, снижены на 666,1 КДж, себестоимость-на 2,4 руб. (5,2%).

Таблица 10 - Экономическая эффективность получения 1000 шт. растений-

регенерантов моркови столовой в культуре пыльников

№ п/п Статьи расхода Затраты

денежные, руб. трудовые, чел.час энергетические, МДж

предлагаемая методика методика Тюкавина Г.Б. предлага емая методика методика Тюкавина Г.Б. предлагаемая методика методика Тюкавина Г.Б.

1. Выращивание растений 1 г.ж.в открытом грунте и донорных растений 2 г.ж. в защищенном грунте 1267,45 1267,45 35,5 35,5 1115,55 1115,55

2. Введение в культуру in vitro бутонов, подрщи-вание пыльников 0 4058,1 0 7 0 982,54

3. Введение/посадка пыльников in vitro, получение каллуса 7138,09 4363,62 7 7 1616,06 1299,3

4. Получение эмбриоидов, проростков из каллуса 7760,79 9078,95 11 11 1460,27 1460,27

5. Размножение растений-регенерантов 8719,01 8669,28 21 21 1542,85 1542,85

6. 3 пассаж in vitro 8668,22 8621,16 21 21 1542,85 1542,85

7. Подращивание и укоренение растений-регенерантов 7841,4 7745,7 21 21 1351,55 1351,55

8. Адаптация растений-регенерантов к условиям in vivo 4672,11 4672,11 33 33 1460,23 1460,23

ИТОГО 46067,07 48476,37 149,5 156,5 10089,04 10755,14

ВЫВОДЫ

1. Предобработка бутонов моркови пониженными температурами (+4...+5 °С) при экспозиции 48 часов увеличивает образование эмбриоидов на 0,13-0,14% в зависимости от сорта.

2. Использование питательной среды МСм, содержащей 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л, и сахарозу-30 г/л, агар -6 г/л, позволяет получить от 0,340,49% эмбриоидов в зависимости от сорта.

3. Использование комбинаций сахарозы: в агаризованной среде 30 г/л и жидкой среде 30 г/л или агаризованной среде 30 г/л и жидкой среде 60 г/л позволяет получить 0,41-0,49% эмбриоидов в зависимости от сорта.

4. Добавление НЧ серебра ингибирует образование эмбриоидов моркови сорта Лосиноостровская 13.

5. Предобработка донорных растений моркови нитратом серебра в концентрации 60 мг/л позволяет получить 32-45% каллусогенных пыльников и ускорить начало каллусогенеза на 44-63 суток и в зависимости от сорта.

6. Добавление нитрата серебра в концентрации 40 мг/л в агаризованную среду МСм в культуре пыльников моркови столовой увеличивает морфоген-ную активность до 30%.

7. У 14,9% растений-регенерантов Ro сорта Лосиноостровская 13 число устьиц в поле зрения микроскопа при увеличении 15x40 составляет 14—18 шт., у 30% растений сорта Шантенэ королевская - 13-17 шт., а у контрольных растений - 6-12 шт. Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц у выделившихся растений составляет 6-10 шт., в контроле их количество было 12-14 шт.

8. Растения-регенеранты Ro сорта Лосиноостровская 13 отличаются от контрольных растений по степени и качеству опушенности, что, объясняется влиянием культуры in vitro. У сорта Шантенэ королевская все растения имеют антоциановую окраску основания черешка листа и головки корнеплода с этапа адаптации их к условиям in vivo до начала стеблевания, в период цветения этот признак отсутствует, как и у контрольных растений.

9. Растения-регенеранты Ri по морфологическим признакам не отличаются от контрольных растений по изучаемым признакам. Наибольшее содержание каротиноидов (16,4 мг%) отмечено в корнеплодах растения № 5, наибольшее количество дисахаров (3,7%)-образца №11.

10. Предлагаемая методика позволяет снизить затраты затраты энергии на получения одного растения-регенеранта моркови столовой в культуре пыльников на 666,1 КДж, себестоимость -на 2,4 руб. (5,2%).

Предложения для использования в селекционной практике

1. Для получения эмбриоидов в культуре микроспор:

• проводить обработку бутонов пониженными температурами (+4...+5 °С) в течении 48 ч;

• выделять микроспоры механически в жидкой питательной среде МСм, содержащей 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л, сахарозу-30 г/л, рН 5,6;

• культивировать микроспоры на двухслойной питательной среде МСм, содержащей 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л, сахарозу в агаризованной среде 30 г/л и жидкой среде 30 г/л или агаризованной среде 30 г/л и жидкой среде 60 г/л, агар-6 г/л, рН 5,6.

2. Для получения растений-регенерантов в культуре пыльников:

• проводить обработку донорных растений раствором нитрата серебра в концентрации 60 мг/л;

• пыльники культивировать на среде МСм, включающей полный состав питательных веществ и 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л, нитрат серебра- 40 мг/л, сахарозу-30 г/л, агар-6 г/л, рН 5,6;

• микроразмножение растений-регенерантов осуществлять на питательной среде МС, включающей полный состав питательных веществ и кинетин в концентрации 0,1 мг/л, сахарозу —30 г/л, агар- 6 г/л, рН 5,6;

• укоренение побегов с зачатками корнеплода осуществлять на жидкой питательной среде МС, где содержание питательных элементов снижено на 25%, концентрация НУК составляет 0,1 мг/л.

Список опубликованных работ по теме диссертации

По результатам исследований опубликовано 8 работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ.

1. Демидкина, М.А. Эффективность культуры микроспор моркови столовой (.Dauern carota L.) при доращивании зонтичков и разной концентрации микроспор в питательной среде/ М.А. Демидкина, A.B. Поляков//Сборник научных трудов по овощеводству и бахчеводству (к 80-летию со дня основания ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института овощеводства Россельхозакадемии).-М.: ГНУ ВНИИО, 2011.-С.299-301.

2. Демидкина, М.А. Влияние нитрата серебра на морфогенез моркови столовой (Daucus carota L.) в культуре пыльников/ A.B. Поляков, М.А. Деми-дкина//Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты: Сборник научных трудов. Выпуск 19.-М.: РАЕН, 2011,- С.78-80.

3. Демидкина, М.А. Влияние сахарозы на эмбриогенез Daucus carota L. в культуре микроспор на двухслойной питательной среде/ A.B. Поляков, М.А. Демидкина/ЛОбилейный сборник научных трудов студентов, аспирантов и преподавателей ФГБОУ ВПО РГАТУ агроэкологического факультета посвященный 100-летию со дня рождения профессора С.А. Наумова. Материалы научно-практической конференции-Рязань: РГАТУ, 2012.-С.246-248.

4. Демидкина, М.А. Получение растений-регенерантов моркови столовой (Daucus carota L.) в культуре пыльников/М.А. Демидкина/Ювощеводство будущего: новые знания и идеи. Материалы научно- практической конференции молодых ученых «Овощеводство будущего: новые знания и идеи», посвященные 125-летию со дня рождения Н.И. Вавилова - М.: ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии, 2012 — С. 12 7-131.

5. Демидкина, М.А. Получение растений-регенерантов моркови столовой методом андрогенеза и их характеристика/М.А. Демидкина, A.B. Поля-ков//Известия Горского ГАУ.- Владикавказ: ФГБОУ ВПО «Горский госагро-университет», 2013.- № 50 (1).-С.51-53.

6. Демидкина, М.А. Эмбриогенез моркови столовой {Daucus carota L.) в культуре микроспор/М.А. Демидкина, A.B. Поляков, Д.Н. Зонтиков//Вестник Костромского государственного университета имени H.A. Некрасова.-Кострома: КГУ им. H.A. Некрасова, 2013,- № 4.-С.24-28.

7. Демидкина, М.А. Получение гаплоидов моркови столовой (Daucus carota L.) в культуре пыльников и микроспор для использования в селекционном процессе/А.В. Поляков, М.А. Демидкина//Селекция на адаптивность и создание нового генофонда в современном овощеводстве (VI Квасниковские чтения). Международная научно-практическая конференция (8 августа 2013 г.). Материалы докладов, сообщений./ВНИИО-М.: 000«Полиграф-Бизнес», 2013.-С.253-258.

8. Демидкина, М.А. Влияние нитрата серебра на ускорение и эффективность каллусогенеза моркови столовой (Daucus carota L.) в культуре пыльни-ков/А.В. Поляков, М.А. Демидкина//Естественные и технические науки.-М.: «Спутник+», 2013.-№4 (66)—С. 113.

Отпечатано в ООО «Издательство Спутник+» ПД № 1-00007 от 26.09.2000 г. Подписано в печать 10.10.2013 г. Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0 Печать авторефератов (495)730-47-74, 778-45-60

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Демидкина, Марина Александровна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ГНУ ВСЕРОСИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОВОЩЕВОДСТВА (ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии)

На правах рукописи

04201363216

ДЕМИДКИНА МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ - РЕГЕНЕРАНТОВ МОРКОВИ СТОЛОВОЙ (Daucus carota L.) В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ И МИКРОСПОР

06.01.05. - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

Диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор А. В. Поляков

Москва-2013

\

СОДЕРЖАНИЕ

стр

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..............................................................................4

ВВЕДЕНИЕ......................................................................•............................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................;............................11

1.1. Гаплоидия......................................................................................11

1.2. Факторы, влияющие на продуктивность андрогенеза.......!..........................13

1.2.1. Генотип................................................................•..........................13

1.2.2. Физиологические факторы..........................................................................................................13

1.2.3. Химические факторы..........................................................................................................................19

1.3. Характеристика удвоенных гаплоидов..............................................................................23

1.3.1. Способы удвоения гаплоидов....................................:............................24

1.4. Ботанические и биологические особенности Истсш саго1а Ь..................26

1.4.1. Эмбриологические и кариологические особенности..................................31

1.4.2. Строение пыльника моркови..................................................................................................33

1.4.3. Развитие пыльника моркови ш у/уо.............................!..........................34

1.4.4. Микроспорогенез и микрогаметогенез у моркови..................................36

1.4.5. Типы микроспор и их способность к андрогенезу..............................................38

1.5. Условия культивирования..........................................................................................................39

1.5.1. Методы изолирования микроспор......................................................................................40

ГЛАВА 2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛ,

МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТЫ................................................42

2.1. Цель, задачи исследований................................................... 42

2.2. Схема исследований............................................................ 43

2.3 Почвенные и агрохимические условия проведения исследований... 46

2.3.1 Погодные условия в период проведения исследования.................. 47

2.4. Материалы и методики проведения исследований........................ 52

2.4.1. Исходный материал.............................................................. 52

2.4.2. Методика проведения исследований......................................... 55

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...................... ............. 60

3.1. Эффективность способов получения культуры микроспор

моркови столовой................................................................ 60

3.1.1. Доращивание зонтичков в лабораторных условиях........................ 60

3.1.2. Растрескиваемость пыльников в жидкой питательной среде в зависимости от концентрации сахарозы.................................... 62

3.1.3. Механическое выделение микроспор из пыльников в жидкой питательной среде.................................................................. 62

3.2. Влияние концентрации микроспор на эмбриогенез моркови столовой ......................................................................................... 63

3.3. Влияние температурной предобработки бутонов на эмбриогенез моркови в культуре микроспор....................................................... 65

3.4. Влияние наночастиц серебра на эффективность эмбриогенеза моркови столовой........................................................................... 66

3.4.1. Влияние наночастиц серебра на донорные растения моркови столо- 66

вой...............................................................................

3.4.2. Влияние наночастиц серебра на индукцию эмбриогенеза моркови

столовой в культуре микроспор................................................ 71

3.5. Подбор питательных сред для культивирования микроспор моркови столовой............................................................................. 72

3.6. Влияние сахарозы на рост и развитие микроспор в двухслойной питательной среде при введении в культуру in vitro.............\............... 73

3.7. Усовершенствование элементов методики культуры пыльников моркови столовой........................................................1.............. 76

3.7.1. Подбор оптимальных условий предобработки донорных растений .... 76

3.7.1.1. Влияние нитрата серебра на эффективность эмбриогенеза моркови столовой в культуре пыльников................................................. 76

3.7.1.2. Влияние обработки донорных растений различными веществами на индукцию эмбриогенеза моркови в культуре пыльников................. 78

3.7.1.3. Влияние обработки донорных растений препаратами Энергия -Ми Циркон на начало каллусогенеза моркови в культуре пыльников..................................................................................................................................................................80

3.7.2. Влияние нитрата серебра на индукцию эмбриогенеза моркови столовой в культуре бутонов и пыльников.......................................... ^2

3.7.2.1. Влияние нитрата серебра на индукцию эмбриогенеза моркови в культуре бутонов..............................................................................................................................................82

3.7.2.2. Влияние нитрата серебра на индукцию эмбриогенеза моркови в культуре пыльников....................................................i............. 83

3.8 Получение растений-регенерантов моркови столовой......\..........................87

3.8.1. Регенерация растений - регенерантов моркови столовой из каллуса.... 87

3.8.2. Укоренение побегов моркови, полученных в культуре пыльников.... 88

3.8.3. Адаптация растений - регенерантов моркови..............................................................91

ГЛАВА 4. ОЦЕНКА РАСТЕНИЙ - РЕГЕНЕРАНТОВ МОРКОВИ

СТОЛОВОЙ, ПОЛУЧЕННЫХ В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ................................94

4.1. Идентификация гаплоидов моркови....................................................................................94

4.2. Характеристика растений - регенерантов Ro.........................................95

4.2.1. Характеристика растений - регенерантов R] ..............................................................101

ГЛАВА 5. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ - РЕГНЕРАНТОВ МОРКОВИ СТОЛОВОЙ В КУЛЬТУРЕ

ПЫЛЬНИКОВ..............................................................................................................................................................107

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..............................................................................................................................................................109

ВЫВОДЫ............................................................................................................................................................................112

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОЙ

ПРАКТИКЕ.................................................................................... 113

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................. 114

ПРИЛОЖЕНИЯ............................................................................... 129

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Сокращенное название

ГНУВНИИО Россельхозакадемии

МС

МСм

МСп 2,4-Д

нч кин

а-НУК ДМСО

Полное название

Государственное научное учреждение Всероссийский научно - исследовательский институт овощеводства Россельхозакадемии

питательная среда Мурасиге - Скуга (Мига1^е Т., 8коо§ Б., 1962)

питательная модифицированная среда (МаБиёа К., КлкигаУ., 1981)

питательная среда (РоНакоу А.У., 2001) 2,4 - дихлорфеноксиуксусная кислота наночастицы кинетин

а - нафтилуксусная кислота диметилсульфоксид

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Впервые о моркови упоминалось в Вавилонии (нынешний Ирак) в X в. до н. э., а также в литературных источниках Древней Греции. Морковь стала известна человеку более 4 тыс. лёт назад, о чем свидетельствуют исследования археологов в различных странах. Так, в Швейцарии (г. Берн), в окаменелостях над свайными постройками древности найдены ее остатки. Раскопки Помпеи, Геркуланума и Стабии, погребенных под лавой извергнувшегося Везувия в 79 году н. э., показали, что на стенах древних домов изображены пучки моркови (Николайчук JI.B, Жигар М.П., 1993). При изучении ареалов её распространения в Афганистане было выявлено большое разнообразие моркови, которая по своим признакам отличалась от европейских сортов. В связи с этим был сделан вывод о двух центрах происхождения культурной моркови: Средиземноморском и Юго -западно - азиатском (Сазонова JI.B., Власова Э.А., 1990). ;

Современная культурная морковь Daucus carota L. возникла в результате скрещивания дикой формы ssp. carota с распространенной в средиземно-морско-переднеазиатских областях формой ssp. maxima. Возможно, это произошло в результате нескольких мутаций: от красно-фиолетовой формы к желтой, белой и, затем, к оранжевой. Красно-фиолетовая форма моркови распространилась из Азии в Средиземноморье, где развились мутанты с желтой окраской корнеплода. В XIV-XV вв. обе формы проникли в среднюю Европу, где прежде всего была распространена форма с желтой окраской корнеплода. Из нее в XVII в. мутировала форма с белой окраской корнеплода. Желтую и белую формы возделывали в Европе до начала XX в. и известны как конская морковь. Предположительно, в Нидерландах из формы с белым корнеплодом возникла форма с оранжевым корнеплодом, которая распространилась по всей Европе. Исходные формы многих культивируемых до настоящего времени сортов возделывались уже в XIX в., сорта с высоким содержанием каротина были выделены только в последние десятилетия XX в. (Круг Г., 2000).

Корнеплоды моркови обладают высокой питательной и диетической ценностью, особой из которой является содержание каротина (провитамина А). В оранжево-красных корнеплодах каротина не менее 15-17 мг%, а при благоприятных условиях роста и развития растений - до 20-27 мг°/о (в последнее время созданы высококаротиновые сорта, в которых содержание каротина достигает 37 мг%). Морковь богата сахарами, количество которых в лучших

1

сортах достигает 12%, содержит клетчатку (1,7%), крахмал (от 1,5 до 6,6% в сухом веществе), азотистые вещества представлены белками (до 6,7% сухого вещества), аминокислотами (5,5%), амидами. В корнеплодах обнаружены ала-нин, аспарагин, глютамин, глицин, лизин, серин, валин и другие ценные аминокислоты, много калия, имеются натрий, кальций, фосфор, железо, алюминий, бор, бром, йод, марганец, молибден, олово, цинк, все витамины группы В (тиамин (витамин В]), рибофлавин (витамин В2), пантотеновая1 кислота (витамин В5), теридоксин (витамин Вб), фолиевая кислота (В9)), инозит, витамин С, никотиновая кислота (витамин РР), биотин (витамин Н), флавоноиды (витамин Р), токоферолы (Е). Листья, семена и корнеплоды моркови содержат эфирное масло. Энергетическая ценность 100 г моркови 33 ккал, или 138 кДж (Пивоваров В.Ф., 2006).

Морковь нашла свое применение и в медицине. Ее используют для профилактики и лечения авитаминозов, малокровия, сердечнососудистой системы, гипертонии, печени, почек, для выделения из организма холестерина. Морковь - ценное косметическое средство (Литвинов С.С., Россошанский А.А., 1998).

На сегодняшний день селекция растений остается длительным и трудоемким процессом, основанным преимущественно на внутривидовой гибридизации с последующим многократным отбором, использовании. инфекционно-провокационных фонов для оценки материала на устойчивость к стрессовым факторам среды и зависимости от вида растения вегетативного или репродуктивного способов размножения. В настоящее время решение практических задач селекции во многом определяется эффективностью вовлечения современ-

ных биотехнологических методов, которые могут быть успешно использованы на всех этапах селекционного процесса, включая создание генетического разнообразия, получение генетически стабильных линий, идентификацию генотипов и их размножение (Поляков A.B., 2004). Морковь имеет довольно мелкие генеративные органы и на начало 80-х годов XX века ¡высказывалось скептическое мнение о возможности получения гаплоидов с использованием метода андрогенеза in vitro (Dudits D., 1981). На сегодняшний день существующие методы получения гаплоидов и удвоенных гаплоидбв моркови не получили достаточно широкого использования в селекционной практике и нуждаются в усовершенствовании. В связи с тем, что в последние годы в производстве особое внимание стали уделять технологиям, сортам и гибридам, приводящим к получению высокой выравненное™, товарности, урожайности, поэтому использование удвоенных гаплоидов в овощеводстве особенно актуально.

Роль гаплоидных растений в селекции велика. Применение их позволяет существенно повысить эффективность селекционного процесса в связи с тем, что гаплоиды ускоряют получение генетически стабильных линий и облегчают поиск редких признаков, контролируемых рецессивными генами (Поляков A.B., 2000).

В настоящее время разработаны методы получения гаплоидов и удвоенных гаплоидов моркови столовой в культуре изолированных пыльников (Тю-кавин Г.Б., 2000, 2007; Поляков A.B., Ильченко О.В., 2003); культуре семяпочек (Домблидес Е.А., 2000; Поляков A.B., Ильченко О.В., 2003; Тюкавин Г.Б., 2007); индуцированном апомиксисе (Тимин Н.И., 1994; Ильченко О.В., 2007). Эти методы остаются недостаточно эффективными для того, чтобы использовать в селекционном процессе и нуждаются в усовершенствовании.

Данная работа посвящена усовершенствованию технологии получения растений - регенерантов моркови столовой в культуре пыльников и микроспор для использования в селекционном процессе.

Объект исследований — технология получения растений-регенерантов

моркови столовой в культуре пыльников и микроспор.

Предмет исследований - зонтички, бутоны, пыльники и микроспоры, эм-бриоиды, растения-регенеранты моркови столовой (Daucus carota L.).

Научная новизна работы. Установлено, что предобработка донорных растений моркови столовой нитратом серебра в концентрации 60 мг/л позволяет ускорить начало каллусогенеза на 44-63 суток по сравнению с контролем, а также в зависимости от сорта получать 32-45% каллусогенных пыльников. Добавление нитрата серебра в концентрации 40 мг/л в агаризованную среду МСм в культуре пыльников позволяет получать в зависимости от сорта 7,4— 11,1% каллусогенных пыльников, по сравнению 0-5,9% в контроле.

Предобработка бутонов пониженными температурами (+4...+5 °С) при экспозиции 48 часов увеличивает образование эмбриоидов на 0,13-0,14% в культуре микроспор в зависимости от сорта.

В культуре микроспор моркови столовой использование сахарозы в комбинациях: агаризованная МСм среда, содержащая 30 г/л и жидкая среда - 30 г/л или агаризованная среда - 30 г/л и жидкая среда - 60 г/л на фоне 2,4-Д, используемом в концентрации 0,2 мг/л, позволяет получать 0,41-0,49% эмбриоидов в зависимости от сорта.

Практическая ценность исследований. Усовершенствованы элементы технологии, применение которых позволяют ускорить начало каллусогенеза на 44-63 суток, индуцировать ризогенез у 54,3-59,1% трудноукореняемых побегов моркови столовой, снизить себестоимость получнения 1 растения-регенеранта в культуре пыльников на 5,2%, затраты энергии - на 666,1 КДж.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическими планами НИР института и отдела биотехнологии ГНУ ВНИИО Россельхозакаде-мии в 2008-2013 гг. (задание 04.04.04.01), является законченной НИР, содержит решение актуальности вопроса (№ ГР 01201169874, инв. № 02201358777).

Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследо-

ваниями, статистической обработкой полученных данных.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были представлены на 22-ой специализированной выставке - ярмарке «ФАЗЕНДА» (Москва, 2012; г.), Международной научно - практической конференции молодых учёных, посвящённой

125-летию со дня рождения Н.И. Вавилова «Овощеводство будущего: новые знания и идеи» (Москва, 2012 г.), а также на заседаниях методической комиссии по селекции, семеноводству и биотехнологии ГНУ ВНИИО Россельхоза-кадемии (2009 - 2012 гг.).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

• предобработка донорных растений моркови столовой нитратом серебра в концентрации 60 мг/л ускоряет начало каллусогенеза на 44-63 суток в культуре пыльников;

• добавление в питательную среду МС нитрата серебра в концентрации 40 мг/л индуцирует каллусогенез у 7,4-11,1% пыльников у моркови столовой;

• использование жидкой питательной среды МС с концентрацией питательных элементов 75% и НУК-0,1 мг/л индуцирует ризогенез у 54,3-59,1% побегов с зачатком корнеплода;

• предобработка бутонов моркови столовой пониженными температурами (+4...+5 °С) в течении 48 ч увеличивает образование эмбриоидов на 0,130,14% в культуре микроспор в зависимости от сорта;

• эффективность образования эмбриоидов при механическом выделение микроспор 0,15-0,24%;

• добавление в агаризованную среду МСм сахарозы в концентрации 30 г/л и жидкую среду -30 г/л или агаризованную среду- 30 г/л и жидкую среду- 60 г/л, позволяет получать 0,41-0,49% эмбриоидов в культуре микроспор;

• концентрация микроспор 50000 шт./1 мл питательной среды позволяет получать эмбриоиды моркови столовой с частотой 0,12-0,35%.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ.

«

Структура и объем работы

]

Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов, заключения, предложений для использования в селекционной практике, списка литературы, содержащего 189 наимено�