РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ, НАПРАВЛЕННЫХ НА УСКОРЕНИЕ СЕЛЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР

Шмыкова, Наталья Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ, НАПРАВЛЕННЫХ НА УСКОРЕНИЕ СЕЛЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ, НАПРАВЛЕННЫХ НА УСКОРЕНИЕ СЕЛЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР"

На правах рукописи

ШМЫКОВА Нятялья Анатольевна

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ БИОТЕХНОЛОГИЧБСКИХ МЕТОДОВ, НАПРАВЛЕННЫХ НА УСКОРЕНИЕ СЕЛЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА

ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР

Специальности: 06.01.05, - селекция и семеноводство 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук

МОСКВА - 2006

Диссертационная работа вы полнена-в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур» в 1991-2005 гг.

Научный консультант: доктор сельскохозяйственных наук, академик РАСХН В.Ф. Пивоваров

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук

МЛ. Мамедов

доктор биологических наук A.B. Поляков

доктор биологических наук Ю.В. Чесноков

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии

Защита диссертации состоится .^октября 2006 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.019.0) при ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур по адресу: 143080, Московская обл.. Одинцовский р-н, п/о Лесной городок, пос. ВНИИССОК.

Факс:(095)599-22-77; E-mall:vniis$ok@mall.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур.

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 220. 019.01 доктор с.-х. наук, профессор г Е.Г.Добруцкня

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Центральным вопросом селекции является репродукция (воспроизводство) растительного материала, Селекционеры используют половую и вегетативную репродукцию на различных этапах селекционного процесса, включая создание исходного материала, отбор, поддержание и размножение перспективного сортол и немного материала или сортов и гибридов сельскохозяйственных растений.

В связи с этим методы культуры тканей, направленные на размножение исходного материала, приобретают большое значение для построения рациональных систем создания гибридных семян в селекции овощных культур. Важными предпосылками экономически выгодного использования методов культуры тканей являются высокие коэффициенты размножения при сохранении генетической стабильности, а также экономия времени при размножении т у/гго, что дает возможность включать их в селекционный процесс.

С Другой стороны» репродуктивная фаза жизненного цикла растений представляет своеобразную природную систему «генетической инженерии», в которой новые комбинации генов, собранные в гаметах, проверяются в системах гаметофитного отбора. Гаплоидное же состояние генома в отличие от диплоидного позволяет обнаружить редкие рецессивные аллели, а получение дигаплоидных растений из микроспор и клеток зародышевого мешка - реализовать гаметокпональную изменчивость в индивидуальные растения и ускорить процесс получения гомозиготного материала в несколько раз.

Необходимо отметить, что основой селекционного процесса является понимание того, как влияют способы репродукции на изменчивость растений, как происходит развитие репродуктивной системы у растений. Ограниченность знаний о репродуктивных особенностях растений - основная причина недостаточного использования процессов гаметогенеза. В естественных условиях отбор мужских гаметофитов представляет а обой и^^^ДОШ^^-'траненное

ление у высших растений. ' имени К.А. Тимирязева

ЦНБ имени Н И. Железное» | Фонд научайУ

Таким образом, приведенные аргументы со всей очевидностью показывают, что для ускорения селекционного процесса необходимы научные исследования, направленные на детальное изучение процессов ми крое пор о ге-неза, микрогаметогенеза, опыления, андрогенеза, гиногенеэа и клонального микроразмножения ценных овощных культур.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось теоретическое и экспериментальное обоснование использования современных биотехнологи чески х методов в селекции овощных культур, направленных на ускорение селекционного процесса.

Для достижения этой цели необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить особенности развития пыльников и пыльцы у овощных культур; разработать принципы оптимизации питательных сред для определения жизнеспособности пыльцы.

2. Определить морфологические признаки цветков и цитологические особенности развития пыльников у овощных растений с мужской стерильностью.

3. Выявить действие биотических и абиотических факторов на жизнеспособность пыльцы овошных культур; определить принципы методики гаметного отбора.

4. Оценить и усовершенствовать методику получения ди гаплоидных растений в культуре неопыленных семяпочек лука репчатого.

5. Изучить проблемы методов получения ди гаплоидных растений в культуре пыльников и микроспор/пыльцы овощных культур, выявить перспективы их использования в селекции.

6. Разработать основные элементы технологии клонального микроразмножения овощных культур (состав питательных сред, типы эксплантов) и изучить влияние индуцирующих факторов на морфогенез.

Научная новизна. Разработана система биотехнологических методов и показана их перспектива в ускорении селекционного процесса у овощных культур. Рассмотрены принципы и проблемы разработки таких методов, как гаметкая селекция, андрогенез, гиногенез, клональное микроразмножение.

При изучении индукции андрогеиеза выявлено, что у овощных растений в культуре пыльников преобладает соматический эмбриогенез «3 эндотеция (морковь, огурец, капуста), средних слоев (томат, перец) и паренхимных клеток связника (огурец, укроп, капуста). Каллус и эмбрионды не могут развиваться из клеток тапетума овощных растений, так как уже в период микроспорогенеза наблюдается его деградация, которая резко ускоряется при культивировании пыльников in vitro.

Установлено, что в большинстве случаев получение пыльцевых д и гаплоидов заканчивается на этапах каплусогенеза и раннего эмбриогенеза, что свидетельствует о нескольких уровнях детерминации, контролирующих этапы перехода на спорофитный путь развития.

Показано специфическое действие регуляторов роста производных фенил мочевины (тидиазурона и CCPU) на меристем этические ткани овощных культур. Впервые выявлено индуцирующее действие бора на побегообразование у капусты при клональном микроразмножении, позволяющее увеличить коэффициент размножения.

Практическая ценность. Разработаны искусственные питательные среды для проращивания пыльцы у огурца, капусты, редиса, да и кона, перца, которые могут быть использованы для предварительной оценки жизнеспособности пыльцы, а также при разработке методов гаметного отбора, позволяющих ускорить селекционный процесс.

Разработана схема селекционного процесса с использованием мужского гаметофита на устойчивость к бактериозу у лука репчатого.

Усовершенствована методика получения днгаплоидов лука в культуре неопыленных семяпочек.

Для получения растен и н-регенера нтов из микроспор с гаметоклональной изменчивостью у моркови предложено использовать методику культуры пыльников in vitro {Тюкавин, Шмыкова, 2000).

Разработаны элементы технологий кяонального микроразмножения капусты, огурца, редиса, которые могут быть использованы для размножения

селекционно ценных генотипов.

Положения, выносимые на защиту: Система биотехнологических методов, позволяющая ускорить селекционный процесс у оаошных культур.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на: международных симпозиумах и научных конференциях: «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология» (Алматы, 1993 г.); «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 1995 Г.); «Гетерозис сельскохозяйственных растений и перспективы их использования» (Москва, 1997 г.); « Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда»( Москва, 1997 г.); «Plant Biotecnology and In Vitro Biology the 21 st Century» (Jerusalem, 1998 г.); IV Съезд общ. физиологов растений России (Москва, 1999 г.); «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2000 г.); «Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке» (Москва, 2003 г.); «Биотехнология и генетическая инженерия микроорганизмов, растений и животных» (Ольштын, 2004 г.); «Современное состояние и перспективы развития селекции и семеноводства овощных культур» (Москва, 2005 г.).

По материалам докторской диссертации опубликована 71 научная работа, в том числе 7 методических указаний и статьи в международных и отечественных сборниках научных трудов и журналах, из них 7 статей в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на J6S~ страницах компьютерного текста и состоит из введения, 8 глав, выводов, практических рекомендаций; включает 73 таблицы, 128 рисунков и список используемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использован селекционный материал из рабочих коллекций селекционных лабораторий ВНИИССОК. Исследования проводили с 1991 по 2005 г, в лаборатории биотехнологии института.

Донориые растения, в зависимости от времени года, выращивали в открытом грунте, пленочной теплице и в вегетационной камере при освещенности 7-8 кЛк и ) 6 часовом периоде.

Цитологический анализ пыльников, микроспор, пыльцы и определение жизнеспособности проводили по методике З.П.Паушевой (1988).

Клональное микроразмножение, культивирование неолыленных семяпочек, пыльников и микроспор проводили по общепринятым методам работы с культурами растительных тканей (Бутенко, 1984).

Биологические опыты проводили в шестикратной повторности. Статистическую обработку экспериментальных данных выполняли по Б.А.Доспехоау (1985) с помощью прикладных программ Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Развитие пыльника и образование пыльцы у овощных растений

Проводимые нами исследования направлены на обобщение литературных данных и изучение особенностей развития пыльников и образование фертиль-ной пыльцы у целого ряда овощных культур. Знание закономерностей развития мужского гаметофита служит основой для создания методов, ускоряющих селекционный процесс и способствующих увеличению генетического разнообразия исходного материала, а также понимания проявления мужской стерильности у растений.

Развитие пыльника может быть разделено на два больших периода. В конце первого периода пыльник содержит большинство специализированных клеток и тканей и тетрады микроспор, находящиеся в микроспорангиях. В течение второго периода микроспоры дифференцируются, развиваются пыльцевые зерна. Дифференцированный пыльник имеет несколько высокое педализированных тканей: эпидерму, эндотеций, средние слои и тапетум. По мере развития микроспор и пыльцы они претерпевают изменения. В период раскрытия пыльника стенки его чаше всего состоят из эпидермы и эндотеция. Клетки средних слоев у моркови, капусты, огурца уплощаются и лизируются вместе с тапетумом, а в стенках клеток эндотеция образуются фиброзные

утолшения. У томата, напротив, клетки средних слоев сохраняются, а в клетках эндотеция не наблюдается фиброзных утолшеннй.

Микроспоры, образующиеся после распада тетрад, как правило, имеют ядро, расположенное в центре клетки, плотную цитоплазму и тонкую оболочку. По мере развития микроспоры в ней образуется крупная вакуоль и состоящая из двух слоев (интнны и экзины) оболочка. На последнем этапе развития микроспоры ядро смещается в пристеночную позицию, вакуоль занимает центральное положение. На этой стадии микроспора завершает свое существование и вступает в асимметричный (дифференцирующий) митоз, в результате которого образуется новая структура - пыльцевое зерно. Оно состоит из вегетативной и генеративной клеток. Вскоре после первого митоза у ряда растений (морковь, капуста, редис) генеративная клетка вступает во второй митоз и образуются два спермня (трехклеточное пыльцевое зерно). У огурца, томата, перца, лука, спаржи пыльца двухклеточная, второй митоз наступает при прорастании пыльцы. На протяжении всего периода существования пыльцевого зерна происходит его подготовка к прорастанию и оплодотворению.

Развитие цветка управляется взаимодействием гомеотических генов. Тычиночные примордии появляются после того, как появились примордии чащелистиков и лепестков, но до инициирования плодолистиков. Эта взаимосвязь в развитии частей цветка сохраняется на протяжении всего периода его жизни, поэтому по морфологическим признакам одних частей можно косвенно

судить о степени развития других (табл.1, 2),

Таблица 1

Стадии развития микроспор и пыльцевых зерен у огурца

Длина, мм Сталин развития микроспор н пыльны

чашечгн венчика

<.0- Я.О 2.0 тетрады, распад тетрад

6.» 2.5 начато ил ргуо:1и1ацмн мнкросоор, ядро в иеггтре

6.0 3.0 пактояизироаамнде ымхроегторы. с прнотночно расположении** ядром

6.0 4.0 образование аегстатнвной н гснерлтненоА спетс^-

8.0 ю.о лаух клеточная. сильно вакуолнзнронаммая пыльиа

8.0 11.0 уменьшение вакуоли

10.0 |.ч.о то *е

12.0 18.0 ногезновенне накали

13.0 20.0 зрелые пьмьиеаые х*Рма

М,0 22.0 то же

и.о 25.0 то НИ*

Таблица 2

Сталин развития микроспор н пыльиевых зерен у лука репчатого, сорт Штуттгартер - рнзен

Длина, мм Стадии развития микроспор и пыльцы

бутона тычинки пестика

1.5 и 1,0 тетрады

2.0 и ранние микроспоры

2.5 1.7 и микроспоры с двумя большими вакуолями

3.0 2.0 и микроспоры в канун первого мигом, часть их находится в фазе митоза

3.5 2.1 1,4 деухклеточная пыльца, генеративная клетка округлой формы

3.8 2.3 ¡,8 двух клеточная пыльца, генеративная клетка смешена к радиальной стенке

4.0 3.0 1.8 двух клеточная пыльца, генеративная клетка приобретает тшюаман'ую форму

4.5 3.5 2,0 двух клеточная пыльца, генеративная клетка вытянутой лин-•м видной формы, удалена от стенки

Например, коэффициент корреляции между размером бутона и стадией развития мужского гаметофита у капусты составляет 0,85 - 0,94.

Для успешной оценки и отбора генотипов на микрогаметофитном уровне необходимо быстро и эффективно определять жизнеспособность пыльцы. В научной литературе почти для каждой культуры можно найти несколько прописей состава питательных сред для оценки жизнеспособности пыльцы. Основными компонентами этих сред являются сахароза, борная кислота, соли кальция и магния. Сахароза создает осмотическое давление и может служить компонентом стенки пыльцевой трубки. По литературным данным в системе рыльие - завязь существуют градиенты концентрации ионов кальция, бора и водорода. Концентрация этих компонентов в репродуктивных органах у разных генотипов индивидуальна, отсюда и индивидуальная концентрация их в средах.

Это хорошо прослеживается на пыльце лука. В популяции пыльцы присутствуют отдельные пыльцевые зерна способные прорастать при концентрации сахарозы 1% и 30%, однако основная масса пыльцевых зерен прорастает при оптимальной для этого сорта концентрации (рис. 1 а,б).

. 40 -

I» I го

:tafi

1 3 5 10 15 М ,25 30 концентрации сйхаро*ыг %

JVc, 1 л. Прорастание оыомы ryu р«ы»тдо (сорт Шгуттгвртер стали) in vitro на питательных средах с phiwwmi сод*?**1*** eaxftp^sw

U^d,

1 1 S 10 IS 10 25 Э0 концентрации сахаром, 4

Рис 1 С. Предо™**»* пыльцы гужз репчатого (сорт Даниловский 301) In vitro мз ецгсвтепьнык среден с рил»«ым сбдерошним сахарозы

Из рисунка 2 видно, что потребность в сахарозе у пыльцы различных видов и сортов капусты разная. На способность пыльцы прорастать влияет не • только концентрация сахарозы, но и значение рН среды. Несколько меньше доля влияния рН среды у *тредставнтелей семейства капустные из рода КарЬапиз, но доля влияние концентрации сахарозы велика и изменяется от 50 до 85%.

Образцы перца сильно различаются по способности пыльцы прорастать при разных значениях рН среды (рис.3). Одни лучше прорастают в нейтральной среде, а другие в щелочной. При скрещивании таких сортообразиов можно ожидать низкую зааязываемость семян.

1 2 3 4- 5 67

Рис.2. Доля ялгянин pH среды и концентрации go*apos*4 не прорастание пыльцы капусты In vitro <1 - Белорус«« 455, 2 ~ Става 1305.3- Малиновка, 4 -Тонус. 5- Höttep первый грибомжий 147, капусте «*та*с*эп Ns93S. 7 - *алусга tn-Z, - '- ' ' «ижевская N>944)

]DpH ■ КОИЦ. £)VBp4»

Г*^ -

10 219 гго Сйртообдои*

11 п>; 1иТ

121 214 21В 21в

Ри^Э. Прораг-мм пыльчы мрцй ОАочногб у!*» и| пит*ТйЛьныч ереми С амличии»«

ОрН-7

ОрН=»

Таким образом, для определения жизнеспособности пыльцы у овощных культур необходимо индивидуально для каждого сорго образца подбирать состав питательной среды, включающей бор, ионы кальция и магния, сахарозу и имеющей оптимальное значение рН .

Явление мужской стерильности представляет большой интерес для получения гибридов. В основе морфологических нарушений в пыльниках стерильных растений лежат биохимические изменения, обусловленные генетическими особенностями растении, обладающих мужской стерильностью.

Данкон. Нами проведено морфологическое и цитологическое изучение проявления мужской стерильности у выращиваемых в Московской области стерильных растений дайкона МБ Сепэике.

V стерильных растений дайхона (форма М5 йетике) нарушения проявляются после распада тетрад, процесс вакуолизации опережает формирование клеточной стенки. Микроспоры слипаются, образуя конгломераты, которые не контактируют со стенками пыльника. При утолщении стенки микроспор не образуется характерный скульптурный рисунок. Патологические изменения наблюдаются и в соматических тканях пыльника, клетки тапетума имеют в несколько раз меньшие размеры (рис.4).

Мужская стерильность у овощных растений

а . -13 б

Рис. 4. Клетки тапетума в пыльниках дай кона фертнльных (а) и мужских стерильных растениях (б) на стадии рач вития микроспор Деструктурирование их начинается на стадии тетрад, а образовавшаяся из них неклеточная структура сохраняется до момента раскрытия пыльника.

- Тапетум в пыльниках фертильных растений сохраняется до образования двух-, трех клеточкой пыльцы с последующим разрушением клеток, и в период раскрытия пыльника он отсутствует. Пыльники стерильных растений сильно отличаются от пыльников фертильных растений по окраске и размерам. Различия прослеживаются по отношению высоты пестика к высоте тычинок ещё в нераскрывшихся бутонах. У стерильных растений высота пестика значительно больше высоты тычинок по сравнению с фертильными. В цветках этот признак сохраняется.

Перец. В пыльниках перца изменения в тапетуме наступают на стадии мейоза. Вместо тапетума секреторного типа образуется периплазмодиальный тип тапетума, то есть тапетум стерильных растений утрачивает клеточную структуру (оис. 5). Это затрудняет контакт с микроспорами.

Рис.5. Клетки тапетума в пыльниках лерца фертильных (а) и мужских стерильных растении* (б) на сталии развития микроспор

Для определения наличия реакции у пыльцы лука репчатого использовали непосредственный контакт её с суспензией трехсуточной культуры Егм/Ша сагоипюга в концентрации 1£>4' клеток. Эта концентрация полностью подавляла способность пыльцы к прорастанию. Для дифференциации пыльцы по устойчивости к воздействию бактерий использовали ряд разведений: исходная суспензия (10+т);9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5; 4:6; 3:7; 2:8; 1:9; дистиллированная вода.

У различных образцов наблюдалась зависимость изменения жизнеспособности пыльцы от бактериальной нагрузки: чем выше концентрация бактерий в суспензии, тем меньше число проросших микроспор (табл.3). По характеру этих изменений сорта можно разделить на устойчивые и восприимчивые. К устойчивым относятся сорта Штуттгартер ризен, Одинцовец, последний отличается большой гетерогенностью, к восприимчивым относятся Даниловский и Стригу но вский.

Таблица 3

Жизнеспособность пыльцы лука репчатого под действием бактериальной нагрузки {Егштш сагоПу^ога)

Концентрация бактерий (суспензия : вода) Проросшая пыльца, %

Штуттгартер рте и Даниловский Стригу-иоаский Одинцоеец Скаирский Арзамасский

Kowrpo/ib (дистиллированная иода) 68.7± 12,3 61,5*10.5 53.01153 40.7122.3 22.217.5 48.41 И.5

1:9 67,717,4 64.3111.2 42,3±1 3.7 27.2119.4 23.1 + 1.9 41.4120.5

2:8 70.4+10.8 25.2+10.9 24.5116.6 32.2111.3 5.4112 32.0t 14,0

3:7 54.9112.5 23.0117.4 9.818.9 14.3110.8 8.914.7 7J±6.a

4:6 29.7 ±11.9 14.2+11.5 10,712,2 19.217,9 15.814.7 11-918,9

5:5 13.014.6 2Л±!.2 4.713.8 11.2±7,0 13.316.6 25-6+15.3

6:4 9.916.6 4.7+3.7 4.912.5 19.718.5 0.0+0,0 3.112.0

7:3 12.015.5 5.314,2 0.5*0.0 19.5+6.4 3.513.3 6-2*4.3

8:2 5,711.5 1,812.5 1.7*1.9 10.1110.2 11.419.4 1 3.413.1

9:1 0.5+0.4 0.611.3 5.6±5.2 4.6+4.2 3.112.8 5-3+2.6

Исходная суспензия I0'7 к.1. 3.412.1 0.511 Л 0.0=0.0 о.о±о,о 2.412.6 | 2.912.7

Однако использовать суспензию из живых бактерий в качестве барьера при опылении растений лука невозможно, тах как будет происходить заражение цветков лука, соответственно и будущих семян. Для этого была разработана методика, которая заключалась в следующем. Молодые листья лука устойчивого сорта заливали бактериальной суспензией и оставляли на трое суток. Это приводило к выделению пектолитических ферментов в среду и мацерации листьев, Полученную суспензию фильтровали первоначально через бумажный фильтр, а затем стерилизовали путем фильтрации через бактериальный фильтр. Из фильтрата готовили разведения, концентрацию которых контролировали по способности подавлять прорас тание пыльцы лука устойчивого сорта

Раствор, при действии которого на пыльцу оставалось 3-4 проросших пыльцевых зерен, использовали для предварительной обработки пыльцы перед опылением. Количество завязавшихся семян зависело от устойчивости сорта и концентрации раствора (табл.4).

Таблица 4

Завязываемое! ь семян в зависимости от концентрации и растворе _метаболитов Ег» Ыш саго/ом'ога (1993-1994 гг.)_

Сорт Завятываемость семян а процентах к контролю

Разведение а 40 рм Разделение и 100 раз

Штутт партер ризен 6Л 20.7

Арзамасский 0 21.1

Одиниоаец 0 6.2

Даниловский 0 3.4

Мячковский 0 4.1

Таким образом, на основании проведенных исследований предложена схема селекционного процесса на устойчивость к бактериозу с использованием мужского гаметофнта (рис.7).

Рис. 7. Схема селекционного процесса на устойчивость .тука репчатого к бактериозу с использованием мужского гаметофнта.

Одной из задач селекции является создание новых холодоустойчивых или менее требовательных к теплу сортов и гибридов огурца. Для изучения холодоустойчивости сортов и гибридов необходимы простые, эффективные н надежные методы оценки растений, позволяющие её прогнозировать. В онтогенезе растений выделяется два периода, когда растение наиболее чувствительно к пониженным температурам. Это фазы развития проростков и бутонизации.

Материалом исследований служила пыльца различных сортообразцов огурца из лаборатории селекции и семеноводства тыквенных культур.

Пыльца линий №№ 2, 5 и 10 за сутки почти достигла контрольных показателей, то есть михрогаметофит этих линий менее чувствителен к пониженной температуре, тогда как линия 9 имела всего 50-60 % проросших пыльцевых зерен от контроля.

Анализ экспериментальных данных, полученных при оценке проростков этих же линий на холодоустойчивость, показал, что существуют различия между ними. Из четырех инцухт-линий наибольшей холодоустойчивостью обладала линия № 10, у которой наблюдался наибольший процент проросших семян.

Для большей эффективности отбора температура в опыте была понижена до +12... 14" С. Такое снижение положительной температуры позволило выявить гетерогенность линии № 10 по холодоустойчивости. При пониженной температуре у этого образца прорастало всего 10 -20% семян при 100% всхожести. Для дальнейших исследований внутри этой линии отобрали холодоустойчивые формы, которые прорастали при температуре +12... 14°С, и нехолодоустончи-вые, прораставшие при +23...25°С. Из этих проростков получили взрослые растения, которые различались между собой размерами цветка - у холодоустойчивых форм цветок был меньше, а пыльца была более крупных размеров (рис. 8). При анализе размеров пыльцы следующего поколения видно, что у холодоустойчивых форм увеличилась доля пыльцы с более крупными размерами. Характер кривой показывает, что популяция холодоусточивых генотипов

неоднородна. У теплолюбивых генотипов сохранилась популяция пыльцы с прежними размерами.

-ХОПОЛОУСТОИЧШЫ»

- тапсцци «устойчивые

5 6 7 8 Э 10 11 12 13 Диаметр пыльцевого зерна

-холодоустойчивы» - ксподонеустоймкч»»«

4 5 6 7 8 Э 10 11 12 13 ^ Диаметр пыльцевого зерна

Рис.8 Влиянии отбора пророетио» огурца Л-20 при пониженной твилвмтур» на рииярш п*льц»ых »р«к; А • после первого

отбора; Б - <хх!ле второго отбора (1992-1994г) 1

Однако при оценке на холодоустойчивость коллекции огурца, выращиваемой в весенне-летнем обороте, когда температура в дневные часы превышала +30а С. Воздействие пониженных температур в этом случае не подавляло прорастание пыльцы, а напротив стимулировало его. Подобную закономерность наблюдал целый ряд авторов на различных культурах таких, как кукуруза, японская репа, томагг (Лях, Сорока, 1993; Степанов. 1998; Садто-нович, 1998; Козлова, 1999).

Известно, что влияние высоких температур, приходящееся на последующие стадии микроспорогенеза, приводит к замене асимметричного митоза на

обычный и синтезу белков теплового шока (Te)meret al. 1995), а на стадии мик-рогаметогенеза к изменениям углеводного обмена < Aloni et al., 2001).

С другой стороны, период, предшествующий рассеиванию пыльцы, сопровождается интенсивным углеводным обменом. Углеводы являются главными питательными веществами, из которых идет образование клеточной стенки пыльцы, в том числе и пыльцевой трубки (Pacini, 1996).

Таким образом, для достоверной оценки генотипов на холодоустойчивость по мужскому гаметофиту необходимым условиям является выращивание растений при пониженных температурах или близких к ним оптимальных.

Культура неопыленных семяпочек лука in vitro

В современной селекции одной из важнейших задач является быстрое достижение константности селекционного материала. Наиболее остро эта проблема возникает при создании гетерозисных гибридов, для которых требуются гомозиготные линии с высокой комбинационной способностью. В традиционной селекции гомози готность достигается путем инбридинга в ряде поколений. В современной биотехнологии предложен альтернативный метод ускоренного получения гомозиготных линий через культуру неопыленных семяпочек и культуру пыльников и микроспор.

Получение гаплоидных растений в культуре in vino неопыленных семяпочек является результатом перехода клеток зародышевого метка с гаметофитного пути развития на спорофитный с образованием из них эмбрион-дов или морфогенного каллуса. На процесс индукции гииогенеза влияет большое число факторов таких, как генотип растения, стадия развития женского гаметофита, состав питательных сред, условия выращивания донорных растений.

Наши исследования показали, что 2,4 Д влияет на разрастание интегумен-тое семяпочек лука репчатого. Семяпочки достигают размера полностью сформированного семени, однако клетки нуцеллуса часто отмирают, и внутри

образуется полость. На питательных средах с БАП или без гормонов происходит менее интенсивное разрастание покровов семяпочек, клетки нуцеллуса сохраняются, а при высоких концентрациях БАП наблюдается разрастание нуцеллуса. Проростки могут быть получены как на среде с гормонами, так и без них. Наиболее определяющим фактором исхода эксперимента является стадия развития семяпочки. Для культивирования неопыленных семяпочек лука оптимальными являются бутоны длиной 5 мм. При этом можно выделить несколько типов реакции:

- формирование структур подобных семенам, развивающихся из опыленных семяпочек, с черно-коричневой кожурой без формирования зародыша;

- прорастание семяпочек, развитие проростков;

- семяпочки с лизированными зародышевыми мешками.

Для индукции гиногенеза в культуре неопыленных семяпочек лука in vitro был проведен сравнительный анализ следующих способов культивирования завязей:

- на питательной среде БДС с 2 мг/л 2,4 Д и БАП до полного формирования побегов;

- на питательной среде, вышеуказанного состава, в течение первых двух месяцев с последующим переносом на среду БДС с 2 мг/л НУК и 4 мг/л БАП;

- на питательной безгормональной среде БДС в течение двух недель с последующим переносом на среду БДС с 2 мг/л ИМК, 0,12 мг/л БАП, 3,5 мг/л ГК до формирования побегов.

В каждом варианте было заложено по 250 завязей лука сорта Штуттгар-тер рмзен и по 25-60 завязей межвидовых гибридов. Анализ изменений, протекающих в завязях и семяпочках (разрастание, образование структур подобных семенам, каллуса, проростков), проводили через неделю в течение первых двух месяцев, а затем с интервалом в один месяц.

Из 2150 завязей или 12600 семяпочек, культивируемых in vitro и относящихся к 19 генотипам, образование единичных эмбрион до в наблюдалось лишь

у межвидовых гибридов №1, №2, №9, №12, № 14,№ 17 и сорта Штутгартер ри-зен.

Полученные результаты показали, что наиболее значимым фактором в культуре неопыленных семяпочек является генотип растения.

Культивирование пыльников и микроспор in vtiro овощных растений

Накопленный опыт культивирования пыльников и микроспор разнообразных объектов позволяет выявить их общее свойство: низкий выход гаплоидных растений по отношению к общему количеству высеваемой пыльцы - в большинстве случаев он не превышает 0,5 % (Sunderland, 1978). Разработка методики получения гаплоидов в культуре пыльников или микроспор требует проведения индивидуальных исследований для каждого вида или даже сорта растения.

Пыльца, способная к образованию эмбрноидов, каллусов в условиях in vitro у многих видов по морфологическим признакам отличается от нормальной пыльцы, реализующей гаметофитную программу. Микроспоры, прошедшие по спорофитному пути развития, претерпевают равное или неравное деление, образуя при этом аномальные пыльцевые зерна. Но такие зерна могут образовываться из микроспор, детерминированных к гаметофитному пути развития, даже из двухклеточной пыльцы, приступившей к отложению запасных веществ, но не завершившей его (Ермаков, Матвеева, 1986).

Полученные нами результаты культивирования пыльников и микроспор овощных культур показали, что критической фазой для перехода с гаметофит-ного пути развития на спорофитный у исследуемых растений является стадия развития микроспор, предшествующая первому гаплоидному митозу (морковь, капуста, томат) и ранняя стадия двухклеточной пыльцы (капуста, огурец, томат). Однако наряду с этим возможен переход и на стадии тетрад у томата (рис. 9).

Ш1 Щ3$1

|gg§ ;

ШФФШ

12 3 4

Рис. 9. Развитие микроспор и пыльцы у овощных растений поспорофитиому пути в культуре in vitru (I - морковь, 2- капуста, 3 - томат. 4 —огурец). Изменение тканей стенки пыльника у ряда овощных растений в культуре /л vitro

Пыльник представляет собой целостную интегрированную систему. Развитие соматических тканей пыльника и репродуктивных клеток происходит взаимосвязано. Это отражается на процессах, происходящих при культивировании пыльников ('и vitro. Проведенный цитологический анализ показал типы изменений, протекающие в культуре пыльников in vitro у наиболее распространенных овощных культур, таких как капуста, томат, огурец, лук, морковь.

Капуста. На период оптимальной стадии для индукции андрогенеза, соматические ткани стенки пыльника слабо дифференцированы (рис.10). При культивировании таких пыльников возможно образование змбриоидов из клеток эндотеция и паренхимных клеток связника.

Морковь. Отклонения от гаметофитного пути развития начинаются на стадии поляризации микроспоры, предшествующей митозу. В этот период ткани стенок пыльника моркови сорта Нантская 4 достаточно дифференцированы (рис. ) I). Как правило, такие соматические ткани пыльника каллус не образуют. Однако степень дифференциации зависит от генотипа растения. Например, у сортотипа Флакки эндотеций во время, предшествующее митозу, недостаточно дифференцирован, поэтому при культивировании пыльников этого сорта мож-

но наблюдать образование каллуса. Развитие каллуса можно было увидеть при культивировании пыльников отдельных трансгенных растений моркови сорта Нантская 4 с релортерным геном GUS.

Рис, 10. Схема развития пыльцы и стенок пыльника капусты: А-В - стадии развития ммкроспор>; Г- Е-стадии развития пыльиы

Эп.-

Рис. II.Схема развития пыльцы и стенок пыльника моркови эпидермис; Эн. - эндотений: С р. сл. - средний слой; Т.- тзпетум: А- Д развития микроспор: Е-Ж - стадии ратвнтия иьиьиы

— пали и

Огурец. Образование каллуса из вегетативной клетки у огурца происходит на ранней вакуолизированной стадии пыльцы, стенки пыльника слабо дифференцированы (рис. 12). Образование каллуса наблюдается, как из стенок пыльника, так и клеток связника.

Рис. 12. Схема развития пыльиы н стенок пыльника огурца: А-В - стадия микроспор:

Г-Е - стадия пыльцы;

Перец и томат. Стенки пыльников перца и томата в отличие от выше оли-санных овощных культур имеют несколько рядов клеток среднего слоя, которые сохраняются в течение длительного отрезка времени. При культивировании пыльников происходит интенсивное развитие каллуса из клеток средних слоев.

Лук н спаржа. При культивировании пыльников лука независимо от степени дифференциации тканей стенок пыльника мы никогда не наблюдали образование каллуса из них. Совершенно противоположная картина прослеживалась при культивировании пыльников спаржи. Каллус развивался как из

слабо дифференцированных клеток эндотеция, так и из сильно вакуолизиро-ванных клеток, имеющих фиброзные утолщения.

Из вышеизложенного следует, что при культивировании пыльников in viíro наряду с а ндро генными эмбрион дам и возможно развитие каллуса и соматических эмбриоидоа из тканей стенок пыльника. Чаще всего образование каллуса происходит из клеток эндотеция или средних слоев в зависимости от вида растения, но, как правило, каллус никогда не развивается из клеток тапетума, так как в период мнкроспорогенеза он уже подвергается лизису.

Определение зависимости между размерами бутона и стадией развития микроспор/пыльцы Многочисленные исследования, проводимые на культивируемых in vitro микроспорах и пыльце, показали, что имеются определенные дискретные окна в их развитии, когда под внешним воздействием возможен переход на споро-фитный путь развития (Cheryl et al, 1992; Zarski, 1992; Binarova et at, 1993). Морфологические исследования, проведенные на рапсе, выявили, что -эмбриогенез может быть индуцироаан на поздней стадии развития микроспор и ранней стадии двух клеточной пыльцы (Fan et al, 1988; Telmer et at, 1992; Hause et al, 1993). Pechan и Keller (1988) определили, что промежуток времени, в течение которого возможен переход с гаметофитного пути развития на спорофитный, составляет менее 8 часов в цикле развития микроспоры. Главная проблема в создании технологии культивирования изолированных микроспор касается способности исследователя точно идентифицировать те бутоны, которые содержат потенциально эмбрногенные микроспоры. Обычно для этой цели используют множество характеристик бутона: длина бутона, длина пыльника, длина цветоножки, положение бутона в соцветии и отношение длины лепестка к длине тычинки. Задачей наших исследований являлось - найти наиболее информативный показатель характеристики бутона.

Для выявления информативности морфологических параметров органов иветка капусты, указывающих на стадию развития микроспор н пыльцы были промерены их длина у различных бутонов брокколи гибрида Аркадия и олре-

делена доля микроспор (табл.5). Полученные данные показали, что все параметры цветка изменяются более или менее синхронно. Всегда можно предвидеть, что у более длинного бутона будут более длинные тычинки, лепестки и пестик. В пыльниках более крупных бутонов микроспоры и пыльца также будут находиться на более поздних стадиях.

Таблица 5

Доля микроспор в пыльниках бутонов брокколи гибрида Аркадия разной длины

Длина бутона, мм Соотношение длины лепестка к длине тычинки Доля микроспор. % Доля двух-, трехклеточной ПЫЛЬЦЫ. %

2.0 0.63 100.0 0

2J 0.65 100,0 0

3,0 0.77 47,0 3.0

3.5 0.89 77.0 23.0

4.0 1,00 66.7 33,3

4.5 1.02 10.8 89.2

5,0 1.20 0.9 99,1

Однако не всегда бутоны одного размера имеют одинаковые по длине тычинки и лепестки, в большей степени изменению подвержено соотношение длины лепестка К длине тычинки. Для того, чтобы выявить наиболее информативный показатель, из соцветия одного растения были выделены бутоны одинаковой длины, но с разным соотношением длины лепестков и тычинок (табл. б). При длине бутона 3,0 мм отношение длины лепестка к длине тычинки изменялось от 0,90 до 1,04, соответственно, доля микроспор в пыльниках составляла от 32,0% до 97,1%, а пыльцы от 2,9 до 68,0%. По данным Pechan и Keller (1988) норма удлинения бутона рапса в сутки составляет 0,75 ± 0,02 мм, а время, в течение которого микроспора у рапса является способной к прохождению эмбриогенеза, приблизительно равно 8 часам. Это период между стадией Gj перед митозом и стадией Gtпосле митоза (Cheryl et al, 1992), поэтому определить оптимальную стадию развития бутона для культивирования микроспор, ориентируясь только на его размер, проблематично.

Таблица 6

Доля микроспср в пыльниках бутонов брокколи гибрида Аркадия длиной Змм при разном соотношении длины лепестка к длине тычинки

№ бутона Отношение длины лепестка к длине тычинки Доля микроспор. % Доля даух-. трех клеточной пыльцы. %

1 0,90 97.1 2.9

2 0.93 89.2 10.8

3 0,95 88.9 11.1

4 1.04 32.0 68,0

Однако при культивировании первого бутона следует ожидать, что образуется большое количество стерильной пыльцы, так как большинство микроспор находится на ранних стадиях развития. Оптимальными для культивирования микроспор являются 2 и 3 бутоны, соотношение длины лепестка к " длине тычинки у них составляет 0,93 — 0,95, фракция микроспор, находящихся перед митотическим делением, будет у них значительной, так как доля пыльцы приближается к 11%.

У моркови цветки, а тем более бутоны мелкие, проводить их измерения без специального оборудования невозможно, поэтому необходимо найти такой морфологический признак, который бы позволял без специальных измерений визуально выбрать необходимый бутон. На основании проведенного анализа зонтичков моркови мы пришли к заключению, что таким признаком является размер завязи (табл. 7).

Таблица 7

Стадии развития мужского и женского гаметофита у моркови, сорг Нантская 4

Длина, мм Коли честно проанализированных бутонов, шт. Стадия развития мужского гаметофита Стадия ра жития женского гаметофита

завязи семяпочки

0.15 0.10 20 двухклеточная пыльца ме|-аслора

0.15 0,13 35 двухклеточная пыльца мегаспора

0.20 0.1« 40 трехклеточнам пыльца вакуолизация, митоз, «формирование зародыш свою мешка, увеличение объема

0.4« 0.30 35

0.50 0.40 30

0.60 0.50 25

Так, например, при исследовании зонтичка 54 % бутонов, не имеющих четко выраженную нижнюю завязь, содержали в пыльниках одноядерные микроспоры, 6% бутонов с небольшой завязью до 1,5 мм были с двухклеточной пыльцой, и остальные бутоны, завязь у которых превышала 2 мм, имели трех-клеточную пыльцу. Количество бутонов в зонтичках с даучклеточной пыльцой у моркови всегда незначительно, так как эта стадия развития пыльцы занимает очень короткий промежуток времени.

Влияние генотипа растения на эмбриогенез в культуре пыльников

Были проанализированы 45 образцов различных видов капусты. Для индукции андрогенеза использовали 17 вариантов индукционных сред, разнообразные обработки и условия культивирования. Анализ способности генотипов к андрогенезу оценивали по доле пыльцевых зерен с нарушенным асимметричным митозом. Среди исследованных генотипов способность к индукции андрогенеза была выявлена: у шести генотипов брокколи (Тонус, Аркадия Fi, Лазер F<, Emerald F|, Green Valiant, Бр-21), 2 генотипов капусты белокочанной (К-124-0, К-221-9), 2 генотипов капусты цветной (Цв-1 и Цв~4) и у капусты китайской сорта Ласточка.

Исследования по влиянию генотипа индивидуального растения было проведено на 56 растениях брокколи сорта Тонус, выращенных в условиях открытого фунта. По доле делящихся микроспор на седьмые сутки культивирования судили о процессе индукции спорофитного развития в культуре пыльников m vitro. Только у 14 из 56 растений были обнаружены развивающиеся по спорофитному пути микроспоры. Это составляет лишь одну четвертую часть от общего количества исследованных растений данного сорта. Кроме того, доля индуцированных микроспор колебалась в широких пределах (от 0,3до 31,2 %). Таким образом, эмбриогенная способность микроспор/ пыльцы может сильно различаться между растениями одного сорта.

Количество эмбриоидов, образующихся в культуре пыльников моркови на среде МСм с 0,2 мг/л 2,4 Д по разработанной нами методике может достигать до 544/100 пыльников (Тюкавин и др., 1999).

Эта методика была апробирована в лаборатории биотехнологии на целом ряде сортообразцов моркови европейского происхождения, таких как НИИОХ 336, Витаминная, Московская зимняя А-515, Лосиноостровская 13, Леандр, Шантанэ 2461, сортотип Амстердамская, Нале, Рондо, гибридах F| Кара тан. Кал исто. Среди растений-регенерантов, полученных в культуре пыльников, прослеживалась гаметоклональная изменчивость. Визуально это можно увидеть по окраске и форме листовой пластинки и корнеплодов растеииЙ-регенерантов, • и также подтверждено результатами RAPD- анализа (Тюкавин и др., 2000).

Однако при культивировании пыльников моркови гибрида Fg Scarlet won. der, относящегося к восточному подвиду, растения-регенеранты не были получены. Чтобы найти различия между двумя контрастными по способности к андрогенезу генотипами моркови, мы исследовали действие растворов 2,4 Д на соцветия. У обоих сортообразцов наблюдали нарушения асимметричного митоза, только процесс образования стерильной пыльцы у гибрида Scarlet wonder происходил быстрее (табл. 8,9)

Таблица 8

Развитие микроспор и пьшьиы в соц&етии моркови сорта Нанте кап 4. помешенном в раствор 2,4 Д (1998-1999 гг.)

Время воздействия Стадии развития микроспор и пыльцы

1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 »

Крайние ряды бутонов в зонтмчке

исходное сосгоян не 0 1.340,6 93,4±1,4 3,1±l,3 0 0 0.ÓÍ0.4 0.9±0.5

J сутки и 0 50.6±3.3 19.8*2,1 0.1*0.6 0 26. Ш.1 3.011.0

3 суток 0 0 14,2±2.9 4.6± 1.0 6.8«. 1 0 50.8±3.3 23±2.9

3-4 ряды бутонов Ь зонтичкс

исходное состояние 3,5±1,4 7J,0±4,7 21.6±S,3 0 0 0 0 0.9±a9

1 сутки 0 IU±7.S 86.4 ±7.7 0L3±O,3 0 0 l.6±0.9 0.4 ±0.0

3 суток 0 0 I6,4±2.S s.4±:.6 12 ±0,8 4 56.3±3.J I9.7±0.5

5 -6 ряды бутов в чонтичке

исходное состояние 97.7±5.1 2,3 ±0.1 0 0 0 0 0 0

1 сутки 5.9± 1,1 63.3±4.l 4,5± 1.7 S.3± 1,8 0 0 |.Я±0.3 I4.2±3.4

3 суток 0 I9.S±2.8 Í5.2±3J! 3.4 ±0.9 0.2+0.2 0 0.3 ±0,3 46.8±5.4

( — )е1ралы. 2 — распад тетрад; 3 - микроспора с лдром, расположенным № центре, и ;м»умя крупными вакуолями: 4- микроспора С паром, смешенным к полюсу; 5 - двукклеточнан пыльна: 6 -трехклеточная пыльца: 7-е нарушенным асимметричным ми.токт: 3 - сгернльлач пылыщ.

Таблица 9

Развитие микроспор и пыльиы в соцветии моркови гибрида F| Scarlet wonder, помешенном в раствор 2.4Д (1998-1гг.)

Время воздействия Стадии развития микроспор и пыльны

1 12 13)4151 6

Крайние ряды 0угонов в юнтичке

н сходное состояние 10,7+7,Я 8.510.9 24,3±3.2 28.212.5 0.6Ю.4 0.910.5

1 сутки 0 0 1.310.2 75.514.3 2,111.0 21.113,3

3 суток и 0.2Ю.2 0 84.212.0 2.0*0.:? ] 1.Я11.7

3-4 ряды бутонов в зонтичке

исходное состояние 34.811.4 30.812.4 18.611.5 1,710.6 9,6+ и 5 Л 1.3

1 сутки 0.5±0.3 0.1Ю.1 8.913.6 49.415.7 2 0.8 ±2.8 20,312.3

3 суток 0 0.410.3 2,111,1 81,813.5 1.710,5 13,912,7

Центральные ряды бутонов в зонтачке

исходное состояние 56,411.5 43.611,5 0 0 0 0

I сутки 2.310.9 2.310,8 14.9+1.1 8.713.0 28.9+2.0 32.212.0

3 суток 3.4+1.1 4.4±1.б 6.711.5 34.913.2 3.711.0 46.812.4

I — микроспора с ядром, расположенным в центре; 2- микроспора с ядром, сметенным к полюсу: 3 - двух клеточная пыльца; 4 - трехкпеточная пыльца; 5-е нарушенным асимметричным митозом; 6 - стерильная пыльца.

По литературным данным 2,4 Д может подавлять соматический эмбриогенез у некоторых видов семейства сельдерейные, поэтому пыльники обоих сортообразцов были прокультивированы на средах, содержащих ИУК. Здесь также проявилось нарушение асимметричного митоза, как у моркови сорта Нантская 4, так и у гибрида Scarlet wonder, но развитие эмбриоидов не происходило (табл.10). При клональном микроразмножении гибрида F| Scarlet wonder соматический эмбриогенез не наблюдался, проявлялось лишь побегообразование.

Это указывает на то, что 2,4 Д индуцирует у сортообразцов моркови европейского происхождения все этапы эмбриогенеза. ИУК индуцирует лишь первый этап у сортобразцов этого подвида.

Иная картина наблюдается у гибрида Ft Scarlet wonder, когда оба регулятора роста индуцируют лишь первый этап - нарушение асимметричного митоза. Аналогичные изменения наблюдались при культивировании пыльников укропа, петрушки и сельдерея.

Таблица 10

Нарушения асимметричного митоза в культивируемых invtiro пыльниках моркови сорта Нантская 4 н гибрнла Fi Scarlet wonder на средах, содержащих ПУК (1998-1999 it.)

Концентрация ИУКв среде мг/л Микроспоры Пыльна

с нормальным развитием с нарушенной вакуолизацией лвухкяеточ-ная Стерильна* морфогешшя. тип деления

неравный равный

Сорт Нантская - 4

1 37.01:5.8 2.8Ю.5 U ±0,4 8.9±1.6 35.314.3 14.2±1,9

2 40.814.4 0 0 6,111.6 37.411.5 15,613,1

3 2 Я.312.9 0.1 Ю,1 1Л10.6 13.1 ±3.4 53.812.7 3.0Ю.9

4 18.612.8 5.2113 6,511,4 9.012.6 48313.6 И.2+1.6

5 20.114.0 2.511.4 0.510.1 26,613.7 43314.8 4.811.1)

Гибрида F| Scarlet wonder

1 27,812,1 0 0 7.712.3 54,9+2.3 9,612.0

2 20,6+5.0 0,410.2 UM.3 7.812.1 50.514.4 19.3+2.2

3 36.0+3.1 0 0 12.211,7 47.712.6 3.311,3

4 46,3+3.6 0 0 14312,7 35.711.3 6.012.6

5 61.512,3 0 0 6.611.0 29.712.1 (.910.7

Как по литературным данным, так и в наших опытах большая часть попыток получения пыльцевых гаплоидов заканчивается на разных этапах каллусо -или эмбриогенеза. Можно полагать, что в основе этого лежат объективные причины, отражающие существование нескольких уровней детерминации, специфически связанных со спорофитным развитием. Таким образом, получение гомозиготных линий в культуре пыльников возможно лишь у отдельных генотипов овошных культур, у которых возможен переход микроспор/лыльцы с гаметофнтного пути развития на спорофитный.

Полученный в лаборатории биотехнологии исходный материал с применением культуры пыльников моркови in vitro передан в селекционные лаборатории в ВНИИССОК, НИИОХ, Западно-сибирскую овощную опытную станцию. Использование этого материала на Западно-сибирской овощной опытной станции позволило создать сорт моркови Соната (Тюкавкн и др., 2005).

Клонапъное микроразмиожеиие овощных растений

Получение гибридов Р, является основой для интенсивной технологии возделывания овощных культур. Значительную роль в этом процессе могут играть биотехнологические методы. Они облегчают и ускоряют традиционный селекционный процесс в создания новых форм н сортов растений. Важная область применения биотехнологических методов — это поддержание растений с мужской стерильностью или самонесовместимостью путем вегетативного размножения с целью получения генетически идентичных клонов для их использования в гетерозисной селекции.

Важную роль в «локальном микроразмножении играют выбор исходного экспланта и гормональный состав сред, индуцирующих побегообразование.

Капуста. В исследованиях использовали стерильные проростки капусты белокочанной сортов Подарок, Слава 1305, Амагер 611, Зимовка 1474, Московская поздняя 15, Номер первый грибовскиЙ 147, В качестве экспланта брали фрагменты семядолей пятисуточных проростков.

При подборе среды, индуцирующей побегообразование, составили 12 вариантов, содержащих различные цитокинины н ауксины. Во всех вариантах при использовании в качестве экспланта фрагментов семядолей через две недели культивирования наблюдали образование канлусных тканей с последующей регенерацией корней. Наиболее интенсивное корнеобразовакие происходило на средах, содержащих НУК и ИУК, развитие побегов было единичным.

При анализе результатов опытов с использованием в качестве эксплантов участков гипокотилей было отмечено, что образование каллуса в первую очередь происходит из коровой части. Это рыхлый каллус светлой или слегка буроватой окраски, из которого развиваются корни. В ряде случаев образуется каллус из клеток сердцевины. Он также рыхлый, светлой окраски, но из него не наблюдалось регенерации ни корней, ни побегов. Наибольший интерес представляет каллус зеленого цвета, плотный с незначительным приростом, образующийся на границе флоэмы и ксилемы, то есть на месте нахождения камбия. Из него, как правило, образуются дополнительные побеги.

Большое значение имеет местоположение фрагмента гипокотиля в проростке. У фрагментов, выделенных из верхней части гипокотиля, наблюдается развитие многочисленных побегов. Если эксплантом служит средняя часть гипокотиля, то происходит образование единичных побегов. У эксплантов, выделенных из нижней части гипокотиля, наряду с появлением каллуса из коровой части развиваются корни. Экспланты из верхней части гипокотиля частично захватывают ткани эпнкотиля, которые детерминированы на развитие побега. Побегообразование в этом случае происходит как из апикальной, так и из периферической меристем.

Из двенадцати использованных вариантов сред оптимальными являются среды со следующими сочетаниями регуляторов роста: по 0,2 мг/л 2,4 Д и СРРи и по 0,2 мг/л НУК и СРРК (табл. 11).

Таблица 11

Каллусогенез и органогенез у эксплантов капусты белокочанной _сорта Номер первый грибовскнй 147 (2001- 2002 гг.)_

Цнтокинннь! Ауксины

НУК ИУК 2.4 Д

1 2 1 2 1 2

Тидиазурон Каллус. Каллус, по- Каллус. Каллус с Каллус, Каллус

корнеоб- бегообразо- корнеоб- небольшим корнеоб- побегооб-

разованке вание раэование приросте« раэование разование

2- ¡р Тоже Каллус. То же Каллус, Тоже Каллус.

корнеобра- корнеобра- корнеоб-

зоааиие зование раэование

Кииетин Тоже То же То же Тоже То же То же

БАП Тоже Каллус, по- Тоже Тоже 1о же То же

бегообразо-

вание

I - зкспдантом служили сегменты семядолей; 2 - эксплантом служили сегменты гипокотиля

Использование в качестве экспланта частей бутона позволяет клонально размножать стерильные или же с низкой завязываемостью семян самонесо-вмсстимые растения капусты, выделенные в период цветения растений. Эффективность такой методики была показана для размножения стерильных растений Вгшхк-а гара Ь.<Уапце1 а!.. 2000).

Разработку клоналького микроразмножения с использованием различных

частей бутона проводили на капусте брокколи сорта Тонус. Варианты питательных сред были составлены по аналогии работы Yang с соавторами (2000). Для индукции каллусообразования - среда МСм с 1-6 мг/л 2,4 Д и 0,1 мг/л ки-нетина и побегообразования - среда МСм с 1-5 мг/л БАП и 0,2 мг/л НУК. В качестве экслланта использовали пестик с остатками цветоложа.

На всех средах независимо от концентрации 2,4 Д происходило образование каллуса. При переносе каллуса на ре генерационные среды, несмотря на его глобулярную структуру, развитие побегов не наблюдалось. Из каллуса, перенесенного со среды с высоким содержанием 2,4 Д, появлялись корневые волоски через две недели культивирования, при более низких концентрациях 2,4 Д-позднее.

В следующей серии опытов мы использовали для индукции каллусообразования среду МСм с 0,2 мг/л 2,4 Д и тидназурона по аналогии с предыдущими нашими опытами и для сравнения среду МСм с 3 мг/л 2,4 Д и 0,1 мг/л кинетнна. Наличие в среде тнаиазурона индуцировало образование плотного зеленого каллуса. К концу культивирования из крайних тканей цветоложа произошло образование белого рыхлого каллуса. Для гистологического анализа происхождения каллусных тканей был сделан срез с цветоложа. На срезе прослеживаются тяжи камбиальных тканей у основания частей околоцветника, где наблюдалось развитие зеленого каллуса, и рыхлые паренхнмные тканн на месте появления белого каллуса (рис.13). При культивировании пестиков ти-диазурон инициировал развитие зеленого каллуса из меристем этических клеток цветоложа, так же, как в опытах с эп и котил ем.

Рис. 13. Развитие почек из каплусныч тканей, образовавшихся из клеток качбш в основании околоцветника капусты.

Для индукции побегообразования испытывали следующие среды: МСм с 0.2 мг/ л НУК и тидиазурона, 0,2 мгУл БАП и тидиазурона и в качестве контроля с 3 мг/л БАП и 0,2 мг/л НУК (табл.12).

Таблица 12

Органогенеэ в каллусных тканях, полученных из пестиков бутонов капусты брокколи __сорта Тонус (2002-2003 гг.)_

Варианты регене-рацнонных сред Варианты сред, индуцирующих каллусообразование

МСм с 02 мг/л 2.4 Д и тидиазурона МСы с 3 мг/л 2.4 Д и 0.1 мг/л кине-тина

МСм с 0.2мг/л НУК и 3 мг/л БАП Единичные побеги из зеленого каллуса, ризогенез и) светлого каллуса, побурение каллусных тканей через 4 недели культивирования. Разрастание светлых каллусных тканей, ризогенез.

МСм с 0.2 мг/л НУК и тидиазурона Единичные побеги из зеленого каллуса, ризогенез из светлого каллуса, разрастание каллусных тканей. Разрастание каллусных тканей, появление светло зеленых участков. ризогенез.

МСм с 0.2 мг/л КАП и тидиазурона Множественные побеги из зеленого каллуса, ризогенез из светлого каллуса. Разрастание каллусных тканей, образование темно зеленых участков каллуса, ризогенез,

В течение первых двух недель наблюдали появление единичных побегов

из зеленых участков каллуса на средах с БАП и тидиазуроном и на средах с БАП и НУК. Ризогенез происходил на всех средах из светлого каллуса. Однако к концу четвертой недели процессы регенерации на средах с БАП и НУК прекратились, началось побурение каллусных тканей. На средах с ПУК и тидиазуроном одновременно происходил прирост, как светлого каллуса, так и зеленого, но формирование глобулярных структур н почек не наблюдалось, единичные побеги появились лишь через 4 недели культивирования. На среде, содержащей тидиазурон в комплексе с БАП, к концу четвертой недели индуцировалось образование побегов из зеленого каллуса (рис. 13), а из светлого каллуса развивались корни. Из каллуса, полученного на среде с высоким содержанием 2,4 Д, на всех регенераиионных средах образовывались корни.

Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности использования тидиазурона как для индукции каллусообразования, так и для инициации побегообразования у эксплантов капусты.

Редис. Изучение морфогенетической активности у различных типов эксплантов на примере редиса сорта Фея показало, что органообразовательиой и регенерациокной способностью обладали только фрагменты гипокотапей, выделенные из верхней их части, н захватывающие ткани эп и коти л я с высокой меристематической активностью. Клетки семядольных эксплантов были детерминированы только на ризогенез (13,6%), а морфогенетическая активность корневых сегментов и нижних участков ги но котел ей вообще не обнаружена.

Огурец. Для индукции каллусообраэования, побегообразования и эмбриогенеза использовали среду МСм с 30 г/л сахарозы с различными комбинациями регуляторов роста: 1 - 0,5 мг/л БАП; 2—2 мг/л кинетика; 3-2 мг/л 2,4Д и 0,5 мг/л ки нети на; 4 - 0,8 мг/л 2,4Д и 2ip; 5 - ] мг/л НУК. 2.4Д и 0,5 мг/л БАП. Данные представлены в таблице 13, из которой видно, что почти во всех вариантах происходит ризогенез. Перенос каллуса, полученного из семядолей, на ре генерационные среды (I — 1 мгУл НУК и 0,5 мг/л БАП; 2 - 10мг/л НУК и 0,5 мг/л БАП; 3 — 1 мг/л ИУК и 0,5 мг/л БАП) положительных результатов не дал.

Таблица 13

Каллусогеиез и органогенез у эксплантов огурца линии Л-42 (2002-2003 гг.)

Рыулягары роста Тип экспланта

Гиоокотияь Семядоли

0,5 мг/л ВАЛ У 50% эксплантов - побегообразование Семядоли не использовались

2.0 мг/л «иие-тина У 30% эксплантов - побегообразование То же

2.0 мг/л 2.4Д и 0.5 мг/л кике-тина У 25% эксплантов - корнсобразовая ие; у 12% • образование каллуса по поверхности среза Скручивание, образование светлого каллуса но поверхности среза, прирост незначителен ый

0.8мг/л 2.4Д и 2¡p У 50% эксплантов • корнеобраэо-вакие: и у всех образование бурого каллуса по поверхности среза У всех, эксплантов разлитие каллуса с последующим ризогеиеюм

1.0 мг/л НУК, t .O мг/л 2.4 Д и 0.5 мг/л к и нетина Каллусообразовакне с последующим риюгенезом Каллусообраздвание, каллус рыхлый с глобулярной структурой, ризогенез

Однако нами было отмечено, что культивирование верхних участков ги-

п о котил я на средах с цитокининами индуцирует побегообразование и

способствует образованию дополнительных почек. На основании этого нами были составлены следующие варианты сред: 1-1,0 мг/л 2 ¡р; 2 — 1,0 мг/л БАП; 3 - 1,0 мг/л ки нети на; 4 - 0,2 мг/л СРР1Л

При культивировании верхних отрезков гипокотиля на этих средах проявилась зависимость числа побегов от положения экспланта на среде. При помещении экспланта точкой роста вниз (точка роста в этом варианте оказывается погруженной в питательную среду) происходит образование дополнительных побегов. При появлении первого листочка и соприкосновении его верхней стороны со средой, содержащей 0,2 мгУл СРРи, индуцируется закладка многочисленных почек. Однако если листочек контактирует со средой нижней стороной, то образование почек не происходит. Предположительно, это связано с транспортом регуляторов роста, так как только при прямом контакте мы наблюдаем положительный эффект.

Ре генерационную способность можно повысить, воздействуя различными соединениями, индуцирующими организованный рост в дедифференцирован-ной ткани.

Бор - один из наиболее важных для растений микроэлементов. В нем наиболее нуждаются двудольные растения. Среди них выделяется ряд семейств, у которых это явление выражено в большей степени. К ним относится семейство капустные. Бор необходим для нормальной деятельности верхушечных меристем.

Предобработка эксплантов раствором борной кислоты стимулировала процесс побегообразования у сорта Номер первый грибовскнй 147 в два раза уже после двух недель культивирования. У сорта Амагер 611 эффект влияния борной кислоты был меньше. Вследствие этого было изучено влияние различных концентраций растворов борной кислоты, используемых для предобработки эксплантов у разных сортов капусты белокочанной. Полученные результаты свидетельствуют о том, что экспланты сортов капусты белокочанной различаются по потребности в боре, она изменяется от 1 мг/мл до 2 мг/мл.

Аналогичные результаты были получены при культивировании частей бу-

тона. Наилучший эффект получен при двойной обработке эксплантов раствором борной кислот и пониженной температурой (табл. 14).

Таблица 14

Регенерация побегов капусты брокколи сорта Тонус па среде МСм с 0.2 мг/л ВАП И тидиазурона н1 каллуса, полученного на среде МСм с 0.2 мг/л 2.4 Д и тидиазурона <20022004 гг.)

№ п/п Тип морфо генетических изменений Контроль Обработка

раствором борной КИСЛОТЫ пониженной температурой раствором борной кислоты и пониженной температурой

1 Тип каллуса а). Светлый с рнзогенезом б). Зеленый без побегообразования а). Светлый С ризомиезом б). Зеленый без побегообразования а). Светлый с рмзогенезом б). Зеленый без no&ecooS-раздвания а). Светлый с ритогенезом б). Зеленый без побегообразования

2 % эксплантовс кор-необразован нем 100 100 100 100

3 % эксплантов с побегообразованием 37,5 28,S 50 J. 100

4 Число побегов на эксплант 0-4 0-3 0-5 10-30

Итак, при работе с экс п л антам и капусты, редиса, огурца прослеживалось

избирательное действие регуляторов роста производных фенилмочевины на меристематические ткани, которые детерминированы на побегообразование. Это в свою очередь позволяет успешно разрабатывать технологии клопального размножения капусты с использование СРРи и тидиазурона.

При использовании разработанных элементов технологии для размножения само несовместимых и стерильных образцов капусты белокочанной и брокколи удалось повысить число побегов, образующихся на одном экелланте до 50-60 штук. Весь период размножения от выделения экспланта и посадки растения-ре генеранта в почву составляет 2,5-3,0 месяца, что способствует ускорению селекционного процесса. Применение этой технологии позволило размножить самонесовместимые и стерильные формы капусты белокочанной, капусты броколли, капусты декоративной, которые используются в селекционном процессе в лаборатории селекции и семеноводства капустных культур ВНИИССОК.

вышенных температур, регуляторов роста на соцветия in vivo позволяет ускорить процесс подбора оптимальных условий культивирования.

11. Во время индукции клетки разных тканей одного и того же органа приобретают детерминацию к специфическому органогенезу (побегообразование, корнеобразованне, каллусообразовэкие или эмбриогенез). Клетки коровой паренхимы капусты, редиса, дайкона, огурца детерминированы на ризогенез, а клетки меристематических тканей на побегообразование.

12. Избирательное действие на меристемагические ткани эксплантов овощных культур оказывают регуляторы роста производные фен и л моче вины, индуцирующие из них побегообразование. Это могут быть латеральные меристемы, или остатки маргинальных меристем молодых листочков. Индуцирующий эффект регуляторов роста для капусты можно усилить, используя предобработку эксплантов пониженными температурами или раствором борной кислоты.

Практические рекомендации

Для предварительной оценки жизнеспособности пыльцы у таких культур, как капуста, редис, перец рекомендуется использовать питательные среды с учетом значения рН. Пыльцу лука можно проращивать in vitro только на плотных а гари зова иных средах. Концентрация сахарозы может быть индивидуальной для сортообразцов капусты, редиса, лука.

При проведении селекции лука на устойчивость к бактериозу с использованием мужского гаметофита в качестве селектирующего барьера рекомендуется использовать смесь пектолитических ферментов, выделившихся в среду при мацерации листьев лука бактериальной суспензией Erwinia carota-vora.

Оценку генотипов овоишых культур на холодоустойчивость по мужскому гаметофиту можно проводить лишь на растениях, выращиваемых при пониженной и нормальной температуре, так как в пыльце, сформированной на фоне повышенных температур, воздействие низких температур вызывает неадекватную реакцию.

Для получения дигаплоидов лука в культуре неопылекных семяпочек можно использовать питательные среды, содержащие 2мг/л НУ К и 4 мг/л БАП или НУК и тидиазурон.

Для предварительного определения стадии развития микроспор у растений капусты рекомендуется использовать соотношение длины тычинок к лепесткам, а у моркови длину завязи.

Сократить количество вариантов предобработок пыльников капусты можно путем предварительной оценки эффективности воздействия повышенных температур, регуляторов роста на изолированные соцветия in vivo.

Для получения растений-регенерантов моркови из микроспор с гамето-клональной изменчивостью рекомендуется использовать методику культивирования пыльников моркови ш vitro (Тгокавин, Шмыкова,2000).

При размножении самонесовместимых и стерильных линий капусты и редиса для индукции каллусообразования и побегообразования рекомендуется использовать тидиазурон или CPPU, а для увеличения количества образующихся побегов использовать предобработку эксплантов положительными пониженными температурами и 0,1 - 0.2 % раствором борной кислоты.

Дня индукции побегообразования при клональном микроразмножении огурца рекомендуется использовать ОД мг/л тидиаэурона или CCPU.

Слисок работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шмыкова Н.А. Титова И.В. культура in vitro неопылекных завягей межвидовых гибри лов лука // Биология культивируемых клеток растений и биотехнология; Tei. докл. 11 Между нар. конф. 28 сент,- 2 окт. 1993,-А л.чаты. 1993. - Т.]- С. 154.

2. Тюка вин Г.Б., Шмыкова Н-А. (Саплусо- и эмбриогенез orypua in vitro ft Конференция но генетике соматических клеток в культуре: Тез. докл. - М., 1993. - С. 44.

3. Shmikova N. A.. Tjukavin G.B. Culture of unpollinated ovaries and ovules in bulb onion, carrot and cucumber // Plant biotechnology and genetic engineering: Abst. Int. Symp. Ukraine. October 3-6.1994.-Kiev. 1994,- P. 114,

4. Shmikova N. A. Anther culture oF Allium сера L. ft Plant biotechnology and genetic engineering: Abst,Int.Symp. Ukraine.October 3-6.1994,-Kiev, 1994,- P. 113.

5. Gavrilenko ТЛ„ Dorokhov D.B.,Pavlov A.V.. Sochanova N.M.. Shmikova N.A. A cytogenetics!. ptvenotypic. biochemical and molecular characterization of intergeneric somatic hybrids of tomato Lycopersicon esculeiuum Mill, and non-tuberous potato species from

Etuberosa series // Plant biotechnology and genetic engineering; Abet, Int. Symp. Ukraine. October 3 -6,1994. - Kiev, 1994. - P. 52.

6. Настенко H.В.. Шмыкова H.A., Балашова H.H., Кущнерева В.П. Разработка способа предварительной оценки растений огурца на устойчивость к фуззриозу // Селекция овощных культур: Научные труды ВНИССОК. - M., 1994.- Вып. 34, -С.75-79.

7. Настенко H B., Шмыкова H.A. Совершенствование методики определения жизнеспособности огурца И Селекция овощнык культур: Научные труды ВНИССОК. - М„

1994.- Вып. 34. -С.47 - 50.

8. Шмыкова H.A., Хомякова Е.М. К вопросу получения гибридов спаржи // Новые н нетрадиционные растения н перспективы нх использования (/ Труды i Между нар. сим п. t -5 августа! 995. - Пущи но, 1995.-С. 313-334.

9. Настенко Н.В., Шмыкова H.A.. Балашова H.H.. Кущнерева В.П. Селекция огурца к корневым лшлям //Труды ВНИИССОК (к 75 - летию-).- М.. 1995. - С. 31 -40.

(О. Шмыкова H.A.. Агафонов А.Ф., Шкляр С.Н. Перспективы использования мужского !Вметофита в селекции лука репчатого // Труды ВНИИССОК (к 75 - летя to).- M..

1995.-С. 170-175.

11. Балашова H.H.. Игнатов А.Н., Самосвалов А.Н.. Рогачев Ю. Б., Шмыкова H.A. Жизнеспособность микрогаметофкта белокочанной капусты под влиянием возбудителей бактериозов н кияы//С.-х. биология. - 1995.- №5.- С. 115-118.

12. Самохвалов А.Н., Рогачев Ю.Б., Шмыкова H.A., Настенко Н.В., (крова Т.Н. Фититок-сическое действие грибов рода Fusarium // Научные труды по селекции и семеноводству. М-, 1995. - Т. 1. - С 124- 125.

13. Шмыкова H.A. Культура пыльникой. нсопыленных завязей и семяпочек лука репчатого //Научные труды по селекции и семеноводству. М„ 1995.-Т. I,-С 164 -170.

14. Настенко Н.В., Шмыкова H.A., Кущнерева В.П, Разработка методов селекции orypua на устойчивость к корневым гнилям с использованием мужского гаметофита И Зашита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса, экономика, -эффективность, экономичность. И Сб. докл. В се рос, съезда по защите растений. -Санкт-Петербург, 1995. - С, 224..

15. Балашова H.H., Шлыкова H.A.. Шкляр С.Н.. Агафонов А.Ф. Использование мужского гамстофнта в селекции репчатого лука на устойчивость к бактериальной гнили // Зашита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса, экономика, эффективность, экономичность. // Сб. докл. Всерос. съезда по защите растений. - Санкт - Петербург, 199S. - С. 158.

16. Тюкавин Г.В., Шмыкова H.A. Культура иеолыленных завязей и семяпочек моркови -путь ускоренного получения стерильных линий гетерозисной селекции // Се лети я овочевых i баштан ни* культур на гетерозис : Тез. допов. М'икнар. наук конф. - XapkiB.

1996. С. 82-83.

17. Шмыкова H.A.. Тюкавин Г.Б. Использование культуры пыльников ни витро для получения гомозиготных линий моркови // Гетерозис сельскохозяйственных растений; Материалы докл.и сооадц. Между нар. симп. 1-5 декабря 1997.-М- 1997, - С. 174-175

18. Тюкавин Г.Б- Шмыкова H.A. Разработка методов андро- и гиногенеча для создания дигаплоидных линий в селекции Fl гетерозисиых гибридов овошных культур // Гетерозис сельскохозяйственных растений: Материалы докл.и сообт. Между кар. сими. 15 декабря 1997,-М- 1997, - С.16Ы62.

19. Агафонов А.Ф., Шмыкова H.A. Использование мужского гаметофита в селекиии лука репчатого на устойчивость к бактериозу И Методические указания по селекции луковых культур.-М, 1997.-С. 28-31.

20. Гкжавкп Г.Б., Шмыкова НЛ Методы ускоренного получения линий моркови для гетерозис ной селекции // Гетерозис сельскохозяйственных растений: Маг «риалы докл.и сообш. Междунар. сим», 1-5 декабря 1997.-М.. 1997. - С.163-164.

21. Монахом М.А.. Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Фенотип интерфазного ядра в клеточной селекции моркови // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: Тез. докл. VII Междунар. конф. 25-28 ноября 1997. - М„ 1997.- С. 223.

22. Шмыкова H.A., Тюкавин Г.Б. Изучение потенциального эмбриогенеза микроспор моркови // Биология клеток растений in vitro. биотехнология и сохранение генофонда: Тез. докл. VII Между нар, конф. 25-28 ноября 1997. -М., 1997. - С. 185,

23. Шмыкова H.A., Тюкавин Г.Б. Влияние регуляторов роста на развитие тканей пыльников моркови // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. Четвертой Между нар. конф. 24-26 июня 1997, -М., 1997.-С. 319.

24. Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Гормональная регуляиня каллусо- и органогенеза моркови // Регуляторы роста н развитии растений: Тез. докл. Четвертой Междунар. конф. 24-26июня IW7.-M,, 1997.-С.321.

25. Настенко Н.В., Шмыкова H.A.. Кушнерева В.П. Новый подход S сеяекиии огурца на устойчивость к фузариозу // Новые и нетрадиционные растения н перспективы их практического использования. Материалы симп. Пушино. 1997. - Т 4. - С. 469 -470.

26. Тюкавин Г.Б.. Шмыкова H.A. Использование методов культуры пыльников и нсопло-дотвореиных семяпочек ДЛЯ создания константных линий моркови // Использование биотехнологических методов для решения генетико-селегцнонных проблем: Сб. докл. и сооб. XVIII Мичуринских чтений 27-29 октября 1997 г, - Мичуринск, 1998. - С. 71 -

27. Шмыкова H.A., Тюкавин Г.Б. Альбинизм в культуре пыльников моркови in vitro н его возможные механизмы К 11 Всероссийский съезд фотобиопогов (Пу шино. 8-12 июня 1998 .): Материалы съезда, -М- 1998. - С. 152.

28. Tjukavin G.B,. S hm> ko va N.A. Anther culture and un pollinated ovules of carrot H Plant Biotecnology and In Vitro Biology in the 2Г' Century: Absl. IX Inl Cong, on Plant Tissue and Cell Culture/ Israel. June 14-19, 1988. Jerusalem, 1998. - P. 1 IS.

29. Monahova MA, Tjukavin G.B.. Shmykova H.A. Change of ploidy during formation regenerated plants from androgenous and gynogenous embryos of carrol in vitro d Plant Biotecnology and In Vitro Biology in the 21s1 Century: Abst IX Int Cong, on Plant Tissue and Cell Culture/Israel, June 14-19,1988. Jerusalem. 1998.-P. 180.

30. Тюкавин Г.Б, Шмыкова H.A. Разработка методов биотехнологии растений для создания исходного материала в селекции овощных, малораспространенных и цветочных культур во ВНИИССОК // Материалы докладов, сообщ. Международного симп. >га селекции и семеноводству овощных культур 1 - 4 марта 1999. - М.. 1999, - С. 362 -371.

31. Дрмблидес A.C., Тюкавин Г.К„ Шмыкова H.A. Влияние регуляторов роста на образование эмбрногенных структур в зародышевых мешках неопылениых семяпочек моркови И Регуляторы роста и развития растений: Тез, докл. Пятой Международной конф. 29 июня-1 июля 1999.-М„ 1999. - 4.2.-СЛ 8-319.

32. Шмыкова H.A., Тюкавин Г.В. Влияние предобработки соцветий моркови регуляторами роста на образование «змбриогениой» пыльны // Регуляторы роста н развития растений: Тез. докл. Пятой Международной конф. 29 июня - I июля 1999, - М.. 1999, - 4.2. - С. 354 - 355.

33. Шмыкова НА., Тюкавин Г.В. Влияние регуляторов роста на образование пзмбрио-генной пыльцы в культивируемых In vilro пыльниках различных генотипов моркови // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. Пятой Международной конф, 29 нюня-J июля 1999.-М., 1999. - 4.2. - С. 353-354.

34. Хомякова Е.М., Шмыкова H.A.. Панфилов А.Г.. Циуиель М.М. Методические указания по использованию культуры m viini при сорго поддержан ии и размножении ревеня, М,- 1998. -41 с.

35. Заячковскнй В.А., Шмыкова H.A., Старцев В.И, Цитологическое изучение особенностей микроспорогенеза в пыльниках у стерильной формы столовой свеклы // 111 Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования: Труды 111 Между нар. с им п .2 t -25 июня 1999.-Пущино. 1999,-Т.З. - С.478 480.

36, Тюкавин Г. Б., Шмыкова H Л. Монахова М.А, Цитология эмбриогенеза в культуре пыльников моркови//Физиология растений,- 1999-T.4Ó. - ífc6.-С, 876 —883.

3 7, Доиблйлес Б.Л,, Шмыкова H.A. Попытка идентификации потенциальной здбриопен-ной способности микроспор у представителей рола Brassica // IV съезд Общ. Фнзкол. Раст, России, «Физиология растений- наука lit тысячелетня»: Теч, докл. Междунар. науч. конф. 4-9 октября. 1999.-М.. 1999.-Т.2. - С. 57Ü.

38. Домблидес Е.А., Шмыкова H.A. Влияние обработки регуляторами роста соцветий на развитие микроспор представителей рода Brassica in vivo //Селекция и семеновиистш овощных культур в XXI веке: Междунар. научно-практическая конференция 24-27 июля 2000. M., - Т.2.- С. 392-393.

39. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А.Биотехнология в селекции овощных культур // Селекция и семеноводство. - 2000. - №1. - С. 42 - 44.

40. Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Культура неопыленных семяпочек моркови // Селекция и семеноводство овощных культур в XXI веке: Международная научно - практическая конф. 24 - 27 июля 2000. М. 2000. - С. 27S - 277

41. Тюкавин Г.Б., Домблидес A.C., Шмыкова H.A. Гииогенез моркови in vitra //Селекция н семеноводство овошных культур в XXI веке: Между и ародиа* научно - практическая конф. 24 - 27 июля 2000. М„ 2000. - С.277 - 279.

42. Тюкавин Г.Б., Шмыкова H.A. Методические рекомендации по получению дигаплоидов моркови методом андрогенеэа-М. 2000,- 56 с.

43. Шмыкова H.A.. Тюкавин Г.Б. Диморфизм пыльцы и андрогенеэ в культуре пыльников моркови (Dauern carota L.) П Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. II Международной научной конференции 18 - 19 октября 2000, - М.. 2000. - С.55 - 56.

44. Тюкавин Г.Б., Шмыкова НА.Методы получения дигаплоидов моркови in vitro // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. Ii Международной научной конференции 18 - 19 октября 2000, - М„ 2000. - С.120-121,

45. Домблидес АС„ Тюкавин Г.Е., Шмыкова H.A. Получение гиногенных растений моркови in vitro с использованием тидназурона // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве п ветеринарии; Тез, докл. II Международной научной конференции 18-19 октября 2000, - М., 2000. - С. 154 - 15 5.

46. Тюкавин Г.Б., Шмыкова НА. Культура пыльников моркови Н Доклады ТСХА.. М.:2000.- Вып. 272 - С. 55 - 60,

47. Шмыкова H.A., Тюкавин Г.Б. Диморфизм пыльцы и оценка эмбриогенной способности микроспор различных генотипов моркови //Сельскохозяйственная биология. -200!,-№5.-53-61,

4S. Тюкавин Г.Б., Супрунова Т. П.. Шмыкова H.A., Домблидес A.C.. Дорохов ДБ.. Клы-гина Т. Э. Изучение гаметоклональной изменчивости у моркови сорта Нантская 4 //Овощеводство - состояние, проблемы, перспективы: Научные труды (к 70 - легию ВНИИО) В 2 т..- М.. 2000.- T.I.-C.157- 161.

49. Кушиерева В.П.. Гладышко С.Н.. Шмыкова H.A. Исходный материал для селекции огурца партенокарпического типа для открытого фунта. !! В сб.: Итоги и перспективы развития плодоводства и овошеводствз. Международная конференция, посвященная 90-летик> со дня рождения профессора А.Н. Ипатьева Тез. докладов. Горки. 2001. - С. 74-79.

50. Домблидес Е,А„ Шмыкова H.A. Развитие пыльников капусты in vho и при культивировании in vitroM Селекиня и семеноводство о&ощных культур. Сборник научных трудов ВНИИССОК - М.. 2001. - Вып. 37. - С.

51. Кушнерееа В.П., Гладыцисо С.Н., Шмыкова H.A. Оценка oiypqa на холодоустойчивость t! Селекция и семеноводство овощных культур. Сборник научных трудов ВНИИССОК - М.. 2001. Вып. 37. - С. 93 -100.

52. Домблидес A.C., Шмыкова H.A., Тюкавнн Г.Б. Цитологическое изучение модификации дифференциации тканей пыльников моркови сорта НИИОХ 336 с петалоидным типом стерильности // Овощеводство — состояние, проблемы, перспективы: Научные труды (к 70 - летяю ВНИИО). - М., 2002,- Т.1. - С.75 - 79.

53. Тюкаеин Г.Б., Шмыкова НА, Технологи» получения удвоенных гаплоидов моркови ft Материалы научной генетической конференции, посвященной 100 - летню со дня рождения А.П.Жебрака и 70 -летаю образования кафедры генетики в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А.Тимирязева. М,: Над - во МСХА. 2002, -С.327 -329.

54. Шмыкова ПА., Тюкавии Г.Б. Морфогенети чески е изменения в культивируемых ín tifio пыльниках моркови //. Доклады ТСХЛ. - М.: Ила -во МСХА, 2002. - Вып. 274. -С.511 -516.

55. Domblides Е.А., Shmykova H.A. Embryogenèse in culture of isolated microspore of Broccoli (Brasñca olerácea var/ itálico) in vitra tf Biotechnology approaches for exploitaiion and preservation of plant resources: Abst. Int. Symp. Ukraine. May 26-31, 2002. - Yalta, 2002. - P. 29,

56. Шмыкова H.A., Ткжавин Г.Б. Особенности морфогенетическнх изменений в культивируемых in vitro пыльниках моркови// Биотехнология. - 2Û02. - №5. - С.65-69.

57. Балашова H.H.. Балашова И.Т., Супрунова Т.П., Музыкантов В.ti. Козарь t.Г.. Скворцом Н.В., Гуркнна Л.К.. Добруцкая Е.Г., Домблидес A.C.. Шмыкова H.A., Тк>-кавин Г.Б.. Пивоваров В.Ф. Применение методов молекулярного анализа н селекционных программах (овощные культуры) // Inginerie yenetica si biotehnologn moderne: Malerialele Simpozionului al 11 - lea National cu participare Internationa la. -Chisinau.2002.-C.7-12

58. Иванушкина T. В.. Шмыкова H.A.. Бунин М.С. Разработка метода клональною мик-рораэчножения культур вила Ruphanus xiuivus. tí Прнортетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке: Междунар, Научно-практическая конф. 15- 18 декабря 2003 г. -М„ 2003. -С.376-379.

59. Букин М.С. Шмыкова Н А, Иванушкина Т, В. Методические рекомендации по определению жизнеспособности пыльцы культур вида Raphanus xo/ivi«. - М,- 2003, - 34 с.

60. Беспалько A.B., Козарь Е.Г., Шмыкова H.A., Балашова H.H. // Методические особенности оценки жизнеспособности пыльцы перца сладкого in vitro // Сб. Между нар. иаучно-лракт. конф. по пасленовым культурам. — Астрахань. 2003. - С. 45.

61. Бунин М.С., Шмыкова H.A., Степанов В. А.. Старцев В.И , Бондарева Л.Л. Методы репродуктивной биологии в селекции овощных культур рода Brassica I. — M. 2003. -52 с.

62. Иванушкина Т. В., Шмыкова H.A., Бунин М.С. Влияние нитрата серебра на процесс побегообразования из ги по кот ильных эксплантов растений вида Ди/гЬат/х salivas in vitro, а Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур. Сборник научных трудов международной научно-практической конференции (22 - 25 марта 2004 г,) - М., 2004, - С. 206 - 2 П.

63. Иванушкина Т. В., Шмыкова H.A.. Бунин М.С. Цитологическое изучение особенностей развития пыльника растений вида Raphanus sativas с ЦМС - Ogura. Н Доклады ТСХА. - М.: Изд -во МСХА. - 2004. - В. 276. - С. 461 -465.

64. Бунин М.С.. Шмыкова H.A.. Бочарникова Н.И;, Пышная ОН.. Джое Е.А, Методические рекомендация по определению жизнеспособности пыльцы вина Capsicum иппишп L. - M., 2004. - 32 с.

65. Шмыкова H.A.. Бочарникова Н.И., Пышная О.Н., Джое Е.А. Искусственная питательная среда для определения жизнеспособности пыльцы перца Capsicum annum» I.

//Проблемы научного обеспечения овощеводства tort России. Материалы международной научно - практической конференции (4-7 августа). Краснодар, 2004. ~ С.209 -213.

66. Бунин М.С., Шмыкова НА. Использование биотехиологическнх методов для получения исходного материала капусты • М., 2004. - 42 с.

67. Tyuksvin G. В., Shmykova N.A. Embryogenesh in cultured carrot anthers // Innovation Towards Modernized Agriculture. Book of Abstracts of AGRICONGRESS 2004. - Malaysia 2004,- P. 184 - 186.

68. Левко Г.Д., Шмыкова Н А, Грубиянова М. И. Определение жизнеспособности пыльцы у разных видов от рода Чина (Lathy rus L.) // Доклады ТСХА. - Мл Изд-во МСХА. - 2004. - В. 276.- С. 491 - 496.

69. Шмыкова Н.А Разработка методов репродуктивной Биологии для селекции овощных культур ft Современное состояние и перспективы развития селекции и семеноводства овощных культур: Материалы Международного симпозиума.- 9-12 августа 2005г. М.. 2005. -Т.1.-С.Э83 -390,

70. Шмыкова Н.А. Перспективы использования клон&пъиого микроразмножения 8 селекции овощных культур // Вестник РАСХН. 2005. - №4. - С. 48-49.

71. Тсокавкн Г.Б., Рыбалко А А., Шмыкова Н.А., Селянин И.Г. Андрогенеэ in vitro - метод ускоренного получения сорта столовой моркови Соната // Состояние и проблемы научного обеспечения овощеводства защищенного грунта: Материалы II Международной конференции,- 21-23 ноября 2005 г. М. 2005.-С. 144-147.

Верстка, печать ООО "Полиграф Плюс ОК" г. Одинцово, ул. Комсомольская, % т/ф: 593-20-01 Заказ № 172. Тираж 100 экз.

Информация о работе

Шмыкова, Наталья Анатольевна
доктора сельскохозяйственных наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.23

Автореферат

Похожие работы