Усовершенствование элементов технологии получения регенерантов для создания удвоенных гаплоидов моркови

Котлярова, Оксана Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Усовершенствование элементов технологии получения регенерантов для создания удвоенных гаплоидов моркови
ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование элементов технологии получения регенерантов для создания удвоенных гаплоидов моркови"

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ МОРКОВИ (Daucus carota L.)

Специальность: 06.01.05. - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

1 3 НОЯ 2010

Москва-2010

004613108

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства Россельхозакадемии в 2002-2009 гг.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Поляков Алексей Васильевич

Леунов Владимир Иванович

ГНУ вниио

Россельхозакадемии

доктор биологических наук, доцент

Соловьев Александр Александрович

РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева

Ведущая организация: ГНЦ ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова

Защита диссертации состоится «10» ноября 2010 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 006.022.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте овощеводства Россельхозакадемии по адресу: 140153 Московская обл., Раменский район, д. Верея, строение 500, ВНИИО.

Факс (49646) 2-43-64

E-mail: vniioh@yandex.ru. www.vniioh.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института овощеводства.

Автореферат разослан - « сжтября 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета

j ник

ишникова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАРАБОТЫ

Актуальность темы. Для создания высокоурожайных, выровненных по комплексу признаков гибридов F! моркови, разных сроков созревания, необходим новый линейный материал. На создание стерильных и фертильных линий традиционным способом необходимо потратить не один десяток лет. Поэтому перед селекционерами стоит задача изучить и разработать эффективные способы получения гомозиготного материала.

Одним из перспективных направлений биотехнологии является получение и использование гаплоидов и удвоенных гаплоидов. Использование методов индуцированного апомиксиса, андро- и гиногенеза позволяет в относительно короткие сроки получать генетически константные растения, которые представляют большой интерес для получения родительских линий и использования их в гетерозисной селекции (Поляков A.B., 2000;Пролетова Н.В., Поляков A.B., Лошакова Н.И., Каранова С.Л., 2003; 2004). Другие методы получения гаплоидов менее изучены и их практическое использование в селекции носит ограниченный характер.

Морковь - является модельным объектом в биотехнологических исследованиях и многие методы регенерации растений из различных тканей и органов хорошо разработаны (Тюкавин Г.Б., 2007; Калашникова Е.А., и др., 2006). Однако ряд вопросов, связанных с получением растений-регенерантов из репродуктивных органов, остаётся недостаточно изученным для практического использования в селекционном процессе.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы являлось - усовершенствование элементов технологии получения регенерантов для создания удвоенных гаплоидов моркови.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Уточить способы идентификации гаплоидов моркови;

2. Изучить полиэмбрионию для получения гаплоидов моркови;

3. Получить семена моркови при индуцированном апомиксисе;

4. Усовершенствовать элементы технологии получения удвоенных гаплоидов моркови в эмбриокультуре;

5. Усовершенствовать элементы технологии получения андро - и гино-генных растений моркови;

6. Сравнить методы получения растений-регенерантов для создания удвоенных гаплоидов (полиэмбриония, метод гаплоиндукции, андрогенез, и гиногенез) и выявить наиболее эффективный для использования в селекционном процессе.

Объект исследований - методы получения удвоенных гаплоидов моркови культура пыльников, семяпочек, индуцированный апомиксис, эм-

бриокультура, полиэмбриония.

Предмет исследований - пыльники, семяпочки, зародыши, семена линий, сортов и гибридов F] моркови столовой (Daucus carota L.J.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований усовершенствованы элементы технологии получения регенерантов из репродуктивных органов для создания удвоенных гаплоидов моркови.

Показано, что у гаплоидов число замыкающих клеток устьиц в поле зрения микроскопа при увеличении 15x40 составляет 14-16 шт., у диплоидов-9-12 шт., число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц у гаплоидов - 69 шт., у диплоидов- 12-14 шт.

Впервые показано, что частота появления полиэмбриональных семян у моркови зависит от сортообразца и колеблется от 0 до 0,25%, а частота появления близнецовых гаплоидовот 0 до 0,05%.

Опыление цветков моркови, характеризующихся петалоидным типом стерильности, пыльцой сельдерея сорта Белоснежный и петрушки сорта Алба на фоне обработки растений я-НУК в концентрации 0,075 г/л и гиббереллина в концентрации 0,025 г/л приводит к образованиию апомиктичных семян, всхожесть которых варьирует от 9% до 21%, что позволяет получить до 0,15% жизнеспособных апомиктичных растений.

Показано, что культивирование апомиктичных зародышей in vitro позволяет получить жизнеспособные растения, которые составляют от 0,5% до 2,3% от числа культивируемых зародышей.

Культивирование семяпочек на среде MSm, включающей полный состав питательных веществ и 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л, позволяет получить от 1,6% до 6,7% эмбриогенных образований.

Практическая ценность исследований. Проведено сравнение эффективности способов получения регенерантов для создания удвоенных гаплоидов моркови: андрогенез, гиногенез, эмбриокультура. Определены условия культивирования от введения эксплантов in vitro до укоренения побегов и адаптации растений-регенерантов к условиям in vivo.

Установлена частота образования близнецовых гаплоидов моркови, которая составляет от 0 до 0,05%.

Выявлено, что линия 8В характеризуется высокой андрогенной, сорт Manufuruji long - гиногенной способностью, у которых частота образования эмбриоидов соответственно составляет18,9% и 43,5%.

Установлено, что использование среды MS, содержащей половинную дозу макро- и микроэлементов, ИМК в концентрации 0,5 мг/л, сахарозу -10 г/л и агар - 7 г/л в зависимости от типа экспланта позволяет укоренить от 79,8% до 77,5% побегов.

Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениям стра-

ны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были доложены или представлены на Международной научно-практической конференции «Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке» (Москва, 2003г.), Международной научно - практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур» (Москва, 2004 г.), III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), III Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создание функциональных продуктов» (Москва, 2005 г.), а также на заседаниях методической комиссии селекции, семеноводству и биотехнологии ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии (2002-2009 гг.)

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

■ полиэмбриония у моркови как источник получения гаплоидов;

■ уточнённые условия получения апомиктичных семян;

■ оптимизированные условия получения апомиктичных растений моркови в эмбриокультуре;

■ уточнённые условия культуры пыльников моркови;

■ уточнённые условия культуры семяпочек моркови.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, выводов, заключения, предложений для использования в селекционной практике, списка использованной литературы содержащего 181 наименование, в том числе 91 иностранных авторов. Изложена диссертация на 165 страницах машинописного текста, содержит 37 таблиц, иллюстрирована 23 рисунками и 5 приложениями.

2.УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования проведены в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИО), расположенном в Раменском районе, Московской области в период 2002-2009 гг.

Исследования проводили на 16 сортообразцах моркови, полученных из отдела селекции. В качестве гаплоиндуктора использовали сорта и гибриды сельдерея и петрушки, полученные из отдела семеноводства ГНУ ВНИИО.

Полевые опыты проводили в соответствие с Методикой опытного дела в овощеводстве и бахчеводстве (под ред. Велика В.Ф., 1992).

Исследования в условиях in vitro проводили в соответствии с Методическими указаниями по культуре ткани и органов в селекции растений (Бу-

тенко Р. Г., Хромова JI. М., Седнина Г.А., 1984; Поляков A.B., 2005).

Изучение содержания сухого вещества, витамина С, Сахаров в потомствах растений-регенерантов проводили по методике И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна, (1998).

Цитологический анализ растений-регенерантов проводили по методике В.А. Пухальского, A.A. Соловьёва, Е.Д. Бадаева и др. (2004).

Математическую обработку экспериментальных данных проводили на основе методов математической статистики по методикам, опубликованным у Б.А. Доспехова (1979).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Идентификация гаплоидов моркови. Цитологический метод идентификации гаплоидов сложен и трудоемок, поэтому для облегчения работы применяют косвенные методы, позволяющие из большей по численности группы растений выделить немногочисленную группу предполагаемых гаплоидов, и тем самым, сократить количество образцов, подвергаемых цитологическому анализу.

а б

Рисунок 1 -а - гаплоидный (п=9), б - диплоидный набор хромосом (2п=18) растений моркови столовой линии 1238 В, полученных методом по-лиэмбрионии.

Проведенные нами цитологические исследования показали, что у гаплоидных растений число хромосом равно 9, число устьиц составляет - 14-16 шт., хлоропластов - 6-9 шт., а у диплоидов число хромосом равно 18 шт., устьиц - 9-12 шт., хлоропластов 12-14 шт. в замыкающих клетках устьиц в поле зрения микроскопа при увеличении 15x40 (рис. 1, табл. 1).

Таблица 1 -Цито - анатомическая характеристика гаплоидов и _диплоидов моркови (Daucus carota L.)._

Признаки Гаплоиды Диплоиды

Число хромосом, шт. 9 18

Число устьиц в поле зрения микроскопа (15x40), шт. 14-16 9-12

Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, шт. 6-9 12-14

Стерильность пыльцы, % 100 0,2-8,0

а б

Рисунок 2 - Хлоропласты в замыкающих клетках устьиц линии 1238 В: а - гаплоид (8 шт.), б - диплоид (13 шт.)

Полиэмбриония у моркови как источник получения гаплоидов.

Анализ первоисточников не выявил информациио полиэмбрионии у моркови. В связи с этим нами изучено 15 образцов этого вида культурного растения-моркови и установлено, что образование полиэмбриональных семян в значительной степени обусловлено их генотипом. Наибольшее число близнецовых проростков обнаружено у линии (0,26 %) и образца Ранний цилиндрический 2 (0,25 %).

Проведённый цито - анатомический анализ близнецов позволил выявить среди близнецовых пар 18 гаплоидов, что всреднем составило 0,05%. Наибольшая частота образования близнецовых гаплоидов была у линии ШЕ\У, которая составила 0,17% (табл. 2).

Таблица 2 - Частота встречаемости полиэмбрионии у моркови

(Daucus carota L.) 2004 - 2005 гг

Сорт, линия, Изуче- Обнаружено пар в т.ч. близнецо-

гибрид Fi но про- близнецов, вых

рост- всего гаплоидов

ков, шт. шт. %±Sp шт. %±Sp

Леандр 4055 2 0,05+0,035 0 0

НИИОХ 336 2280 1 0,04+0,04 0 0

Витаминная 6 1467 0 0 0 0

Лосиноостровская 13 1910 0 0 0 0

Нюанс 823 1 0,12+0,12 0 0

1238 П 3148 2 0,06+0,04 0 0

1238 В 4795 8 0,17+0,06 5 0,10+0,05

8В 2395 3 0,13+0,07 1 0,04+0,04

1268 С 1758 2 0,11+0,08 0 0

1268 В 1806 2 0,11+0,08 0 0

Crookham company 783 0 0 0 0

REW 2334 6 0,26+0,11 4 0,17+0,09

Ранний круглый 1 1154 2 0,17+0,12 1 0,09+0,09

Ранний цилиндрический 2 1574 4 0,25+0,13 2 0,13+0,09

Топаз Fi 5056 10 0,20+0,06 5 0,10+0,04

Исследования показали, что частота образования близнецовых гаплоидных растений с учетом их выживаемости составляла от 0 (линия 8В и образцы Ранний круглый 1, Ранний цилиндрический 2) до 0,06% ^ Топаз).

Индуцированный апомиксис. В наших опытах при обработке растений регуляторами роста и опылении растений стерильных линий моркови пыльцой сельдерея и петрушки наблюдалось образование апомиктичных семян. Наибольшее количество таких семян завязывалось при опылении пыльцой сельдерея сорта Белоснежный и пыльцой петрушки сорта Алба в сочетании с обработкой материнских растений а-НУК в концентрации 0,075г/л совместно с гиббереллином в концентрации 0,025г/л (табл.3).

Таблица 3 -Характеристика семян моркови, полученных при

индуцированном апомиксисе (2002-2005 гг.)

Показатель Варианты опыта

контроль а-НУК+ гиббереллин опыление пыльцой сельдерея сорта Белоснежный опыление пыльцой сельдерея сорта Белоснежный +а-НУК+гиббереллин опыление пыльцой петрушки сорта Алба опыление пыльцой петрушки сорта Алба + а-НУК+гибберел лин

Линия 1238 П

Число опыленных цветков, шт. 87300 89100 89950 87700 86500 87300

Получено семян, шт. 0 3128 2778 3317 527 1330

Завязываемость семян, % 0 3,5 3,1 3,8 0,6 1,5

Масса семян, г 0 0,77 0,91 1,11 0,09 0,29

Масса 1000 семян, г 0 0,25 0,33 0,33 0,17 0,22

Линия 1585 П

Число опыленных цветков, шт. 84200 83750 84670 83160 84580 83930

Получено семян, шт. 0 440 115 1080 35 1270

Завязываемость семян, % 0 0,5 0,1 1,3 0,04 1,5

Масса семян, г 0 0,55 0,12 1,04 0,08 1,69

Масса 1000 семян, г 0 1,25 1,04 0,96 1,29 1,33

Получение аиомиктичиых растений моркови в эмбриокультуре.

Использование эмбриокультуры для получения растений-регенерантов моркови in vitro может быть альтернативным способом сохранения слабожизнеспособных, в том числе гаплоидных зародышей.

Для изучения эффективности эмбриокультуры in vitro вводили 10, 20, 30, 40, 50 суточные апомиктичные зародыши, полученные от опыления стерильных линий моркови 1238 П и Г-67 пыльцой сельдерея сорта Белоснежный. Проведенные нами исследования показали, что наибольшее коли-

чество (от 3% до 6,7%) прорастающих апомиктичных зародышей было получено при культивировании 50 суточных зародышей (табл. 4).

Таблица 4 - Влияние возраста зародышей на образование жизнеспособных апомиктов моркови (среда МБш, содержащая 2,4-Д _в концентрации 0,2 мг/л, 2006-2007 гг.)_

Линия Возраст Число куль- Образовалось Образовалось

зародышей, тивируемых жизнеспособ- растущих

сутки зародышей, ных зародышей зародышей

шт. шт. %+Бр шт. %±Бр

1238 П 10 52 10 19,2+5,5 0 0

20 79 24 30,4+5,2 0 0

30 90 30 33,3+5,0 0 0

40 30 11 30,0+8,4 1 3,3±3,3

50 30 13 43,3+9,0 2 6,7+4,6

Г-67 10 50 9 18,0±5,4 0 0

20 77 24 31,2+5,3 0 0

30 90 30 33,3+5,0 0 0

40 28 10 35,7+9,0 0 0

50 32 10 31,3+8,2 1 3,1+3,0

Известно, что успешное культивирование незрелых семян и зародышей растений во многом зависит от состава питательной среды. В работе мы использовали среды, широко применяемые для культуры незрелых зародышей растений: МБт (\lasuda К., Оа^а У., 1981), Когв^ (ТЧогв^ К., 1973). Мопшег (Мопшег М., 1978) и ватЬо^ В5 (ОатЬо^ О.Ь., 1984).

Проведенные исследования показали, что наибольшее количество прорастающих зародышей образовывалось на среде МБт и составляло от 26,0% до 35,0% (табл. 5).

Таблица 5 - Эффективность культивирования апомиктичных зародышей на питательных средах, содержащих 2,4—Д в _концентрации-0,2 мг/л (2006-2007 гг.)_

Линия Среда Число культивируемых эксплантов, шт. Число растущих эксплантов

шт. %+Sp

1238 П MSm 38 10 26,3+7,1

Norstog 42 7 16,7+5,8

Monnier 40 7 20,0+6,3

Gamborg 42 5 11,9+5,0

Г-67 MSm 36 11 30,6+7,7

Norstog 42 10 23,8+6,6

Monnier 36 8 22,2+7,0

Gamborg 44 11 25,0+6,5

1585 П MSm 20 7 35,0+10,7

Norstog 22 6 27,3+9,5

Monnier 20 6 30,0+10,2

Gamborg 24 4 16,6+7,6

При культивировании апомиктичных зародышей моркови in vitro немаловажное значение имеет подбор регуляторов роста и их концентрации. В своей работе мы изучали влияние 2,4-Д, 2ip и тидиазурона в различных концентрациях. Проведенные исследования показали, что наибольшее количество растущих апомиктичных зародышей получено в вариантах при использовании 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л и составляло от 11,0% до 23,0%.

Проведенные исследования показали, что использование эмбриокультуры позволяет получить в зависимости от образца жизнеспособные растения от 0,48% (линия 1238 П) до 2,26% (линия 1585 П) (табл. 6).

Таблица 6 - Эффективность получения растений-регенерантов

Линия Проанализировано незрелых зародышей, шт. Полу регене ■чено рантов Выжило растений Образовалось жизнеспособных апомиктов,%

шт. % шт. %

1238 П 825 19 2,3 7 36,8 0,85

Г-67 827 15 1,8 4 26,7 0,48

1585 П 266 22 8,3 6 27,3 2,26

Получение регенерантов в культуре пыльников и семяпочек. Ряд

авторов отмечает положительный эффект действия различных биологически активных веществ и физических факторов на эффективность культуры пыльников (Тураев А., и др. 1996; Поляков A.B., 2000).

В наших опытах с целью повышения пролиферирующей способности пыльников и семяпочек использовали трёхкратную обработку донорных растений с интервалом в трое суток регуляторами роста: цитодеф в концентрации 0,2 мл/л, эмистим- 0,0001 мл/л, гиббереллин - 0,025 г/л и а-НУК -0,075 г/л (табл. 7).

Таблица 7- Влияние регуляторов роста на эмбриогенез моркови в _культуре пыльников и семяпочек (2003-2005 гг.)_

Сорт, Регулятор Концент- Изучено, шт. Получено эмбрио-

линия роста рация генных, %+Sp

пыль- семя- пыль- семя-

ников почек ников почек

контроль - 1573 747 0,9+0,2 22,2+1,5

Лосиноостровская 13 цитодеф 0,2 мл/л 580 242 5,5+0,9 39,7+3,1

эмистим 0,0001 мл/л 1204 698 0 13,8+1,3

а-НУК + гиббереллин 0,075 мг/л 0,025мг/л 1119 643 1,5+0,4 11,5+1,3

контроль - 1608 765 0,9+0,2 25,8+1,6

цитодеф 0,2 мл/л 709 802 7,0+0,9 45,1±1,8

Нюанс эмистим 0,0001 мл/л 1412 338 3,9+0,5 18,9+4,5

а-НУК + 0,075 мг/л 951 678 0 12,5+1,3

гиббереллин 0,025мг/л

контроль - 978 544 0,6+0,2 28,1+1,9

Monufuruji long цитодеф 0,2 мл/л 485 251 6,4+1,1 25,1+2,7

эмистим 0,0001 мл/л 396 243 4,3+1,0 21,4+2,6

а-НУК + 0,075 мг/л 401 205 0 22,9+2,9

гиббереллин 0,025мг/л

контроль - 1428 810 0,9+0,2 22,5+1,5

цитодеф 0,2 мл/л 495 248 4,2+0,9 21,8+2,6

8В эмистим 0,0001 мл/л 946 681 0 19,8+1,5

а-НУК+ гиббереллин 0,075 мг/л 0,025мг/л 826 S76 0 28,6+1,9

Отмечено, что наилучшие результаты получены при обработке до-норных растений цитодефом. Эмбриогенные экспланты при использовании этого вещества составляли от 4,0% до 7,0% в культуре пыльников и от 23,0% до 45,0% в культуре семяпочек.

Наиболее высоким эмбриогенным потенциалом в культуре пыльников характеризовалась линия 8В (19,0%),в культуре семяпочек - сорт Manufu-ruji long (44,0%) (табл.8).

Таблица 8 - Эффективность каллусо- и эмбриогенеза моркови в культуре пыльников и семяпочек (2002-2004 гг.)_

Сорт, линия Число культивируемых, шт. Получено новообразований, %+Sp

эмбриогенных каллусогенных

пыльников семяпочек пыльников семяпочек пыльников семяпочек

Лосиноостровская 13 287 97 3,5+1,1 0 14,6+2, 1 0

Нюанс 305 104 3,0±1,0 18,3+3,8 1,3±0,7 1*9+1,3

НИИИОХ 336 297 107 0 0 0 0

Manufuruji long 325 85 2,8+0,9 43,5+5,4 1,5+0,7 3,5+2,0

8В 317 48 18,9+2,2 8,3+1,4 2,2+0,8 0

1268 В 219 83 0 0 0 0

Как отмечалось ранее, одним из важных факторов in vitro технологий является состав питательной среды и концентрация ее компонентов.

В наших опытах отмечено, что культивирование пыльников и семяпочек на среде MSm, концентрация которой была снижена на 25%, 50% и 75% сопровождалось снижением морфогенетической активности. Наиболее эффективной была среда MSm, содержащая полный состав макро- и микроэлементов, позволившая получить от 4,0% до 6,0% эмбриогенных пыльников и от 2,0% (сорт Нюанс) до 7,0% (линия 8В) эмбриогенных семяпочек.

Температурный стресс может применяться в качестве стимулирующего фактора для повышения эффективности каллусо- и эмбриогенеза. При использовании метода андрогенеза in vitro используют предобработку как низкой положительной температурой (Dunwell J.M., 1985; Муромовцев Г.С. и др., 1990), так и высокой (Bajaj Y.P.S., 1983).

Исследования, проведенные Г.Б. Тюкавиным (2007) по культивированию изолированных пыльников моркови при низкой и высокой температуре, эффекта не дали. Но при этом отмечено, что холодовая предобработка соцветий способствовала активизации каллусо- и эмбриогенеза в культуре пыльников.

В наших опытах изучено влияние пониженной температуры (+5°С) на эмбриогенную активность моркови при воздействии ею в течение 12, 24, 36 и 48 часов.

Таблица 9 - Влияние пониженной температуры (+5°С) на эмбриогенную активность пыльников и семяпочек (2003-2005 гг.)

Сорт, Продолжи- Число культивируе- Получено

линия тельность мых шт. эмбриогенных, %+Sp

воздействия пыль- семя- пыль- семя-

ников почек ников почек

Лосино- контроль* 310 372 6,1+1,4 10,8+1,6

островская 12 267 236 5,2+1,4 11,9+2,1

13 24 235 206 4,3+1,3 7,3+1,2

36 258 208 4,7+1,3 0

48 320 - 8,1+1,5 -

Нюанс контроль* 292 401 9,2+1,7 8,0+1,4

12 305 336 8,2+1,6 11,6+1,7

24 287 306 5,9+1,4 2,9+0,9

36 426 294 0 6,1+1,4

48 328 - 13,1+1,9 -

МопиАггир контроль* 503 244 8,7+1,3 8,6±1,8

101^ 12 433 215 8,3^,3 10,2+2,0

24 328 190 7,3+1,4 8,4+2,0

36 492 178 5,3+1,0 0

48 342 - 10,8+1,7 -

8В контроль* 541 283 5,2+1,0 2,5+0,9

12 308 151 4,5+1,2 4,0+1,6

24 253 136 0 ' 0

36 226 110 0 0

48 327 - 9,8+1,6 -

Примечание: *контроль - культивирование пыльников при температуре 25°С.

У сорта Нюанс и линии 8В отмечено увеличение частоты образования эмбриогенных пыльников от 8,0% до 13,0% при воздействии пониженной температурой в течение 48 часов.

В культуре семяпочек у сорта Нюанс получены положительные результаты при воздействии пониженной температурой в течение 12 часов. Частота образования эмбриогенных семяпочек в этом варианте составила 11,6% (табл. 9). У других сортообразцов существенное влияние пониженной температуры на пыльники и семяпочки не отмечено.

Укоренение. Для укоренения побегов часто используют безгормональные агаризованные питательные среды, у которых содержание макро- и

микроэлементов снижено в два раза, а концентрация сахарозы составляет 1% (Полякова A.B., 2000, 2007, 2010). Эти условия способствуют хорошей уко-реняемости и интенсивному развитию корневой системы растений-регенерантов.

Наши исследования показали, что наибольшее количество укоренившихся побегов в культуре пыльников (79,8)% и семяпочек (77,5)% на среде, где содержание макро- и микроэлементов было снижено в два раза (1Л MS), содержание индолилмасляной кислоты (ИМК) составляло 0,5 мг/л, сахарозы - 10 г/л (табл. 100).

Применение индолилмасляной кислоты (ИМК) в концентрации 1,0 мг/л приводило к образованию каллуса на основаниях побегов и витрифика-ции растений - регенерантов.

Таблица 10- Укоренение побегов моркови на среде'/; MS

Концентра- Число укореняе- Укоренилось побегов

ция ИМК в мых побегов, шт. шт. %+Sp

среде, мг/л пыль- семя- пыль- семя- пыль- семя-

ников почек ников почек ников почек

0 (контроль) 117 120 49 40 41,9+4,6 33,3+4,3

од 95 106 47 45 49,5+5,1 42,4+4,8

0,25 102 91 67 57 65,6+4,7 62,6+5,1

0,5 84 71 62 55 79,8+5,3 77,5+4,9

1,0 90 98 59 68 65,5+5,0 69,4+4,7

Проведенные исследования по культивированию пыльников и семяпочек, а затем образовавшихся на их основе эмбриоидов, почек и побегов позволили получить растения-регенеранты, которые с использованием влажной камеры были адаптированы к обычным условиям (рис. 2). Лучше всего прошли адаптацию растения-регенеранты сорта Manufuruji long, полученные в культуре пыльников, и сорта Нюанс, полученные в культуре семяпочек, их доля составила по 94,0%.

В течение вегетации часть растений погибла и к уборке из регенерантов, полученных в культуре пыльников, выжило от 50 % (линия 8В) до 79% (сорт Нюанс), а в культуре семяпочек - от 53% (сорт Manufuruji long) до 73% (сорт Нюанс) (табл. 11).

Таблица 11 - Адаптация растений-регенерантов

Сорт, линия Изучено растений-регенерантов, шт. Число адаптированных in vivo растений ?/o±Sp Число выживших in vivo растений %+Sp

1* 2* 1* 2* 1* 2*

Нюанс 85 97 92,9+2,8 93,8+2,4 78,8+4,4 73,1+4,5

Manufuruji long 32 229 93,8+4,3 72,9+2,9 65,6+8,4 52,8+3,3

8В 285 74 88,4+1,9 82,4+4,4 49,5+3,0 63,5+5,6

Примечание: *1 — культура пыльникв; *2 - культура семяпочек.

Рисунок 2 - Растения-регенеранты моркови, полученные в культуре пыльников

Анализ результатов показал, что количество жизнеспособных расте-ний-регенерантовв в пересчете от числа введенных в культуру эксплантов в зависимости от образца, составило в культуре пыльников от 0,3% (Manufumji long) до 1,7% (линия 8В), а в культуре семяпочек - от 0,87% (линия 8В) до 3,65% (Manufuruji long) (табл.12, 13).

Таблица 12 - Эффективность получения растений-регенерантов

моркови в культуре пыльников

Сорт, линия Проаналн-зировано-пыльников, шт. Получено растений Выжило растений Образовалось жизнеспособных растений от числа культивируемых пыльников,%

шт. % шт. %

Нюанс 8962 85 0,95 67 78,8 0,8

Мапийн-цр 1опк 6151 32 0,52 21 65,6 0,3

8В 8087 285 3,52 141 49,5 1,7

Таблица 13 -Эффективность получения растений-регенерантов

моркови в культуре семяпочек

Сорт, линия Проанализировано семяпочек, шт. Получено растений Выжило растений Образовалось жизнеспособных растений от числа культивируемых семяпочек, %

шт. % шт. %

Нюанс 6104 97 1,59 71 73,2 1,2

МапиГипщ 3313 229 6,91 121 52,8 3,65

8В 5378 74 1,38 47 63,5 0,87

Проведённый цитологический анализ растений-регенерантов, полученных при индуцированном апомиксисе, эмбриокультуре, а также в культуре пыльников и семяпочек показал, что все они являются удвоенными гаплоидами (табл. 14).

Таблица 14 - Цитологический анализ растений

Вариант Получено регенератов, ШТ. Проанализировано ре-генерантов всего, шт. Обнаружено

удвоенных гаплоидов гаплоидов

шт. %±Sp шт. %±Sp

Индуцированный апомиксис 337 64 18 19,0+2,1 0 0

Эмбрио-культура 17 15 15 88,2+7,8 0 0

Культура пыльников 229 77 77 33,6±3,1 0 0

Культура семяпочек 239 82 82 34,3+3,1 0 0

Сравнительный анализ эффективности способов получения удвоенных гаплоидов моркови показал, что культура семяпочек является наиболее перспективной для использования в селекционном процессе. В зависимости от условий культивирования и сортообразца этот метод позволяет получать удвоенные гаплоиды с частотой 0,9-3,7% при минимальном риске появления мутаций (табл.15).

Таблица 15- Эффективность методов получения удвоенных _гаплоидов моркови_

Способ получения Частота образования

гаплоидов удвоенных гаплоидов

Полиэмбриония 0 - 0,06 0

Индуцированный апомиксис 0 0-0,15

Эмбриокультура 0 0,48 - 2,26

Культура пыльников 0 0,34-1,74

Культура семяпочек 0 0,87 - 3,65

В литературных источниках мало встречается данных об изменении морфологических признаков полученных удвоенных гаплоидов по сравнению с исходным образцом. В некоторых источниках отмечено, что удвоенные гаплоиды не уступают, а иногда и превосходят исходные формы по хозяйственно ценным признакам (Поляков A.B., 2000).

Морфологический анализ показал, что ряд потомств растений-регенерантов, полученных различными способами и в результате самоопыления, характеризовалось большей выравненностью по сравнению с исходными образцами (табл. 16).

Таблица 16 - Характеристика линий первого поколения Я] по морфологическим признакам

Линия Изучено растений, шт. Окраска корнеплода, % Поверхность корнеплода, % Форма корнеплода, % Форма головки корнеплода, % Размер головки корнеплода, %

1 2 3 4 5 6 7

Индуцированный апомиксис

1238 П (контроль) 14 оранж. 100 гладкая неровная 79* 21* конич. уд.конич. 79* 21* округлая сл.вогнут. 86* 14* маленькая средняя 57* 43*

14 оранж. жел.-ор. 93* 7* гладкая неровная 93* 7* конич. уд.конич. 79* 21* округлая сл.вогнут. 93* 7* маленькая средняя 50* 50*

»» 14 оранж. 100 гладкая неровная 86* 14* конич. уд.конич. 86* 14* округлая сл.вогнут. 93* 7* маленькая средняя 57* 43*

1585 П (контроль) 15 оранж. 100 гладкая неровная 87* 13* конич. уд.конич. цилиндр. 80* 7* 13* округлая сл.вогнут. вогнутая 80* 7* 13* маленькая средняя 60* 40*

Ки 15 оранж. жел.-ор. 93* 7* гладкая неровная 93* 7* конич. уд.конич. цилиндр. 79* 7* 13* округлая сл.вогнут. вогнутая. 87* 13* 0 маленькая средняя 53* 47*

15 оранж. 100 гладкая неровная 87* 13* конич. уд.конич. цилиндр. 87* 0 13* округлая сл.вогнут. вогнутая 80* 7* 13* маленькая средняя 60* 40*

Культура пыльников

Нюанс (контроль) 12 оранж. 100 гладкая неровная 83* 17* цилиндр, конич. 83* 17* округлая сл.вогнут. 92* 8* маленькая средняя 58* 42*

12 оранж. 100 гладкая неровная 92* 8* цилиндр, конич. 92* 8* округлая сл.вогнут. 83* 17* маленькая средняя 50* 50*

Продолжение таблицы 17

1 2 3 4 5 6 7

2 12 оранж. 100 гладкая неровная 83* 17* цилиндр, конич. 83* 17* округлая с л. вогнут. 92* 8* маленькая средняя 58* 42*

8 В (контроль) 14 оранж. 100 гладкая неровная 86* 14* цилиндр, конич. 86* 14* округлая сл.вогнут. 93* 7* маленькая средняя 57* 43*

*26 14 оранж. 100 гладкая неровная 93* 7* цилиндр, конич. 86* 14* округлая сл.вогнут. 93* 7* маленькая средняя 50* 50*

К29 14 оранж. 100 гладкая неровная 86* 14* цилиндр, конич. 93* 7* округлая сл.вогнут. 93* 7* маленькая средняя 57* 43*

Культура семяпочек

Нюанс (контроль) 14 оранж. 100 гладкая неровная 86* 14* цилиндр, конич. 93* 7* округлая сл.вогнут. 86* 14* маленькая средняя 64* 36*

14 оранж. 100 гладкая неровная 93* 7* цилиндр, конич. 93* 7* округлая сл.вогнут. 93* 7* маленькая средняя 57* 43*

14 оранж. 100 гладкая неровная 86* 14* цилиндр, конич. 86* 14* округлая сл.вогнут. 93* 7* маленькая средняя 57* 43*

8 В (контроль) 14 оранж. 100 гладкая неровная 86* 14* цилиндр, конич. 86* 14* округлая сл.вогнут. 93* 7* маленькая средняя 64* 36*

К28 14 оранж. 100 гладкая неровная 93* у* цилиндр, конич. 93* 7* округлая сл.вогнут. 93* 7* маленькая средняя 50* 50*

К37 14 оранж. 100 гладкая неровная 86* 14* цилиндр, конич. 93* 7* округлая сл.вогнут. 93* 7* маленькая средняя 64* 36*

*Примечание: доля корнеплодов, характеризующихся данными признаками.

Проведенный химический анализ корнеплодов показал, что потомство растения-регенеранта номера 90 линии 1238 П, полученного при индуцированном апомиксисе и 105 линии 8В, полученного в культуре пыльников, выделились по содержанию каротиноидов и сухого вещества. Эти показатели были выше, чем у исходных форм на 14,7% и 10,9% по каротиноидам и на 2,4% и 2,2% по сухому веществу (табл. 17).

Таблица 17 -Содержание каротиноидов и сухого вещества _в корнеплодах Я) (п=12)_

Сорт, линия Содержание каротиноидов, мг/% Содержание сухого вещества, %

размах варьирования Хер. размах варьирования Хер.

Линия 1238 В, контроль 12,0...16,6 14,3 10,7... 12,7 11,7

1238 П - 90 + пыльца сельдерея сорта Белоснежный 24,0...34,0 29,0 12,2...16,0 14,1

1238 П - 99+гиббереллин 0,025 г/л, НУК- 0,075 г/л 11,5...20,3 15,9 10,4... 12,2 11,3

Лосиноостровская 13, контроль 18,0...22,5 20,2 9,1...11,5 10,3

Лосиноостровская 13 -101 (культура семяпочек) 14,5...20,0 17,3 9,8...12,5 12,5

Лосиноостровская 13-103 (культура семяпочек) 11,5...18,0 14,7 9,4... 14,0 11,7

Линия 8В, контроль 9,0... 16,8 12,9 9,7...11,1 10,4

8В - 105 (культура пыльников) 17,0...30,4 23,8 10,2... 14,8 12,5

8В - 107 (культура пыльников) 12,5...20,5 16,5 8,1...10,7 9,4

При этом потомство регенеранта 90 линии1238 П, полученного методом индуцированного апомиксиса,на 1,5% превышало исходную форму по содержанию аскорбиновой кислоты и дисахаров (табл. 18). Потомств регене-рантов, превосходящих исходные формы по содержанию глюкозы, выявлено не было.

Таблица 18 - Содержание углеводов и аскорбиновой кислоты в

корнеплодах R| (п=12)

Вариант Аскорбиновая кислота, мг/% Дисахара, % Глюкоза, г/100 г

Линия 1238 В (контроль) 2,0 2,5 1,3

1238 П - 90 + пыльца сельдерея Белоснежный. 3,4 4,0 1,0

1238 П- 99+ гиббереллин 0,025 г/л,НУК - 0,075г/л. 1,3 3,2 1,3

Лосиноостровская 13 (контроль) 2,4 3,6 0,7

Лосиноостровская 13 101(культура семяпочек) 2,7 3,7 0,5

Лосиноостровская 13 103 (культура семяпочек) 1,9 3,4 1,0

Линия 8В (контроль) 3,4 1,0 1,1

8В - 105 (культура пыльников) 4,1 2,9 0,2

8В - 107 (культура пыльников) 2,8 3,7 0,6

ВЫВОДЫ

1. Из изученных способов получения удвоенных гаплоидов моркови (культура пыльников, семяпочек, эмбриокультура, апомиксис) наиболее эффективным является культура семяпочек. В зависимости от условий культивирования и образца он позволяет получать удвоенные гаплоиды с частотой 0,9-3,7%.

2. Полиэмбриония у моркови может служить источником получения гаплоидов, частота образования которых в зависимости от образца составляет от 0 до 0,17%, а с учётом их выживаемости от 0 до 0,06%. Наибольшая частота полиэмбриональных гаплоидов обнаружена у линий REW и F| Топаз.

3. Опыление цветков моркови пыльцой сельдерея сорта Белоснежный и петрушки сорта Алба на фоне обработки растений раствором а-НУК в концентрации 0,075 г/л и гиббереллина - 0,025 г/л сопровождается формированием апомиктичных семян. Всхожесть семян варьирует от 9% до 21%, что позволяет получить до 0,15% жизнеспособных апомиктичных растений. Наиболее отзывчивой является линия Г- 67.

4.0птимизированы условия, влияющие на выход апомиктичных растений моркови в эмбриокультуре:

• оптимальный возраст введения зародышей в культуру in vitro составляет 50 суток;

• культивирование зародышей на среде MSm в зависимости от линии позволяет получить от 26,3% до 35,0% растущих эксплантов;

• метод эмбриокультуры позволяет получить апомиктичные жизнеспособные растения от 0,5% (линия 1238 П) до 2,3% (линия 1585 П).

5. Уточнены условия, влияющие на выход растений - регенерантов в культуре пыльников:

» обработка донорных растений регуляторами роста позволяет получить от 4,2% до 9,9% эмбриогенных и от 6,5% до 41,2% каллусоген-ных эксплантов в зависимости от сорта;

• выявлены образцы, характеризующиеся различной андрогенетиче-ской способностью. Наиболее высоким эмбриогенным потенциалом характеризуется линия 8В, у которой частота образования эмбриогенных эксплантов составляет 19,0%.

• культивирование пыльников на среде MSm, включающей полный состав питательных веществ, 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л, 2 ip — 2 мг/л позволяет получать до 4,5% эмбриогенных эксплантов;

• укоренение побегов на среде MS, содержащей половинную концентрацию макро- и микроэлементов, ИМК в концентрации 0,5 мг/л, сахарозу - 10 г/л и агар - 7 г/л позволяет получать до 79,8% укоренившихся побегов. Выживаемость растений in vivo в зависимости от образца составляет 49,5% - 78,8%;

• метод культуры пыльников в зависимости от образца позволяет получить от 0,34% (Manufurujilong) до 1,74% (линия 8В) жизнеспособных растений-регенерантов.

6. Оптимизированы условия, влияющие на выход растений-регенерантов моркови в культуре семяпочек:

• обработка донорных растений регуляторами роста позволяет получать от 11,5% до 45,1% эмбриогенных эксплантов в зависимости от образца и варианта обработки;

• выделены образцы, характеризующиеся различной гиногенной способностью. Наиболее высоким эмбриогенным потенциалом характеризуется линия 8В (8,3%) и сорт Manufuruji long(43,5 %);

• культивирование семяпочек на среде MSm, включающей полный состав питательных веществ, 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л позволяет получить от 1,6% до 6,7% эмбриогенных образований;

• укоренение побегов моркови на среде MS, содержание макро- и микроэлементов в которой снижено в два раза, ИМК в концентрации 0,5 мг/л, сахарозу -10 г/л и агар - 7 г/л позволяет получать 77,5% укоренившихся побегов. Выживаемость растений-регенерантов в условиях in vivo составляет от 52,8% до 73,1% в зависимости от образца.

Предложения для использования в селекционной практике

1. Для получения растений-регенерантов в культуре семяпочек:

• проводить обработку донорных растений раствором цитодефа в концентрации 0,2 мл/л;

• семяпочки культивировать на среде MSm, включающей полный состав питательных веществ и 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л;

• укоренение побегов осуществлять на питательной среде MS, где содержание макро- и микроэлементов снижено в два раза, концентрация ИМК составляет 0,5 мг/л, сахарозы -10 г/л, агар - 7 г/л.

2. Идентификацию гаплоидных растений (п=9) следует проводить по числу устьиц (12-14 шт. в поле зрения микроскопа при увеличении 15x40) на нижней стороне листа и количеству хлоропластов (6-9 шт.) в замыкающих клетках устьиц.

Список опубликованных работ по теме диссертации

По результатам исследований по теме диссертации опубликовано 6 работ, в т.ч. одна в журнале «Картофель и овощи», рекомендованном ВАК РФ.

1. Ильченко О.В. Оценка генотипов моркови различного географического происхождения на устойчивость к фузариозу и альтернариозу в условиях искусственного инфекционного фона / Т.Н. Лебедева, Н.В. Ипатова, А.В. Поляков, О.В. Ильченко//Материалы Всероссийского совещания: «Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии», 16-18 июля 2003 г. М.: ВНИИФ, 2003,- С. 61 - 63.

2. Ильченко О.В. Андро- и гиногенез моркови (Daucus carota L.) /А.В. Поляков, О.В. Ильченко // Международная научно-практическая конференция «Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке», Москва, 2003. - С. 420-422.

IlchenkoO.V. Andro- andgynogenesis of carrot (Daucus carota L.) / A.V. Poliakov, O.V. Ilchenko// «International scientific - practical conference «Perspective directions in breeding and seed production of agricultural plants in XXI centure» Moscow, 2003. - P. 420-422.

3. Ilchenko O.V. Production of andro- and gynogenic plants of carrot (Daucuscarota L.) / A.V. Poliakov, O.V. Ilchenko //Proceedings of International Scientific Practical Conference "Biotechnology of vegetable, flower and not widely spread crops" (March, 22 - 25, 2004). - Moscow: Institute of Vegetable crops, 2004.-P. 146-150.

Н.Н., О.В. Ильченко, Ананьина, Н.Н. Лебедева, М.И. Иванова, Т.В. Ларионова, И.Н. Боровикова //III Моековскиймеждународный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - Москва (14 - 18 марта 2005 г.), 2005. - С. 286-287.

Ilchenko O.V. Obtaining régénérants of Apiaceae, Cucurbitaceae, Brassi-caceae and some flower crops in vitro / A.V. Poliakov, I.I. Tarasenkov, O.I. Fedor-ishyna, A.A. Tkacheva, O.V. Ilchenko, N.N. Ananina, N.N. Lebedeva, M.I. Ivanova, T.V. Larionova, I.N. Borovikova //III Moscow International Congress "Biotechnology: state of the art and prospects of development".- Moscow (March, 14 -18, 2005), 2005. - P. 286-287.

5. Ильченко O.B. Распространение полиэмбрионии у моркови (Dau-eus carota L.) / A.B. Поляков, Т.Э. Клыгина, O.B. Ильченко /ЛИ Российская научно-практическая конференция "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов". - Москва: РАЕН, (6-7 июня 2005 г.), 2005,- С. 40 - 41.

6. Ильченко О.В. Получение апомиктичных семян моркови. /О.В. Ильченко //Картофель и овощи. - 2007. - №6. - С.31.

Отпечатано в ООО «Копировальный центр «В ПЕЧАТЬ!» Тираж 100 экз. Условный печатный лист 1,0 Подписано в печать 06.10.2010 г. Москва ул. Трубная, д. 21. www.vp24.ru

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Котлярова, Оксана Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Значение и биологические особенности моркови (Daucus сагоta L.).

Достижения и перспективы использования методов in vitro в селекции растений.

1.3. Получение гаплоидов растений методами биотехнологии и их практическое значение.

1.4. Преимущества использования гаплоидов и удвоенных гаплоидов в селекционной работе.

1.5. Идентификацмя гаплоидов.

1.6. Распространение полиэмбрионии (многозародышевости).

1.7. Апомиксис.

1.7.1. Факторы, влияющие на процесс получения удвоенных гаплоидов методом гаплопродюсера.

1.7.2. Культура зародышей (эмбриокультура).

1.8. Метод андрогенеза.

1.8.1. Культура микроспор.

1.8.2. Основные факторы, влияющие на процесс андрогенеза в культуре in vitro.

1.9. Культура завязей и семяпочек.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ, ИСХОДНЫЙ

МАТЕРИАЛ, СХЕМА И МЕТОДИКИ ОПЫТОВ.

2.1. Цель, задачи исследований.

2.2. Схема исследований.

2.3. Условия проведения исследований.

2.3.1. Почвенные и агроклиматические условия проведения исследований.

2.3.2. Погодные условия вегетационных периодов 2002-2007 гг.

2.4. Материал и методика проведения исследований.

2.4.1. Исходный материал.

2.4.2. Методики лабораторных опытов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

ГЛАВА 3. ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ

УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ МОРКОВИ (Daucus carota L.).

3.1. Идентификация гаплоидов моркови.

3.2. Получение гаплоидов моркови из полиэмбриональных семян.

3.3. Получение семян моркови при индуцированном апомиксисе.

3.4. Использование эмбриокультуры для получения апомиктов моркови.

3.5. Получение растений-регенерантов моркови в культуре пыльников.

3.5.1. Предообработка донорных растений моркови биологически активными веществами и регуляторами роста для повышения эффективности культуры пыльников.

3.5.2. Уточнение режима стерилизации бутонов моркови для введения в культуру in vitro. ' ' Сортоспецифицность андрогенеза.

3.5.4. Питательная среда как индуктор новообразований в культуре пыльников.

3.5.5. Воздействие положительной пониженной температуры на мор-фогенетическую активность моркови в культуре пыльников.

3.5.6 Укоренение побегов моркови полученных в культуре пыльников.

3.5.7. Адаптация растений-регенерантов.

3.6. Получение растений-регенерантов полученных в культуре семяпочек.

3.6.1. Предобработка донорных растений биологически активными веществами и регуляторами роста для повышнния эффективности культуры семяпочек.

3.6.2. Сортоспецифичность гиногенеза.

3.6.3. Питательная среда как индуктор новообразований в культуре семяпочек.

3.6.4 Влияние положительной пониженной температуры на морфоге-нетическую активность моркови в культуре семяпочек.

3.6.5. Укоренение побегов моркови, полученных в культуре семяпочек.

3.6.6. Адаптация растений—регенерантов.

3.7. Цитологический анализ растений-регенерантов.

3.8. Эффективность методов получения гаплоидов и удвоенных гаплоидов моркови.

3.9. Характеристика растений-регенерантов моркови и апомиктов полученных различными способами.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Усовершенствование элементов технологии получения регенерантов для создания удвоенных гаплоидов моркови"

Актуальность темы. Основной целью селекционных программ является повышение урожайности сельскохозяйственных культур, создание новых сортов и гибридов, обладающих улучшенными качествами продукта, комплексной устойчивостью к болезням, вредителям и стрессовым факторам среды, менее требовательных к условиям возделывания (Лаврова Н.В., 2006).

В настоящие время, по-прежнему, одной из важнейших задач селекции является сокращение сроков создания новых сортов и гибридов сельскохозяйственных культур. Современный уровень и темпы развития сельскохозяйственного производства диктуют поиск новых путей, применение новых технологий, усовершенствование существующих технологий. Одним из таких современных направлений является, применение методов биотехнологии, которые позволяют сократить сроки создания сортов и гибридов, новых устойчивых форм, оздоравливать растительный материал от вирусов.

Морковь (Daucus carota L., var. Sativus Hojfmn ) является главной овощной культурой. Её выращивают во всех частях света на площади 584000 га. Наибольшие посевные площади сосредоточены в Азии (28%), особенно в Китае и Японии, и Европе (134000 га) (в основном в Польше, во Франции и в Великобритании) (Круг Г., 2000).

Особая ценность моркови состоит в том, что её корнеплод, имеющий оранжевую окраску, содержит в себе каротин (провитамин А), калий, кальций, железо, фосфор и другие полезные минеральные элементы (Тюкавин Г.Б., 2007).

Увеличение видов потребления моркови повлияло на рост количества сортов и гибридов. Открытие признака ЦМС и введение его во многие селекционные программы, в первую очередь США, Германии, Нидерландов, Великобритании, Польши, Франции и России. Массовое создание гибридов Fi моркови явилось соответствующим ответом селекционеров на требование рынка по увеличению видов потребления. Дальнейшая интенсификация селекционных программ привела к использованию мировой генной плазмы как культурной, так и дикорастущих морковей, в результате чего были созданы новые сортотипы моркови для Южной Америки (Kuroda, Brasilia) и введен ген устойчивости к морковной мухе от D.I capillifolius. Такие изменения произошли в мире в производстве и селекции моркови столовой.

Для более быстрого и целенаправленного решения селекционных вопросов, необходимо использовать последние достижения науки и техники, в частности, биотехнологические методы, которые способствуют ускорению размножения и сохранению ценного исходного материала, расширению спектра генетической изменчивости, созданию ценных иммунных форм и линий (Клыгина Т.Э., Леунов В.И., Ипатова Н.В., 2003).

Одним из перспективных направлений биотехнологии является получение и использование гаплоидов и удвоенных гаплоидов. Использование методов андро- и гиногенеза позволяет в относительно короткие сроки получать генетически константные растения, которые представляют большой интерес для получения родительских линий и использования их в гетерозисной селекции (Пролетова Ы.В., Поляков А.В., Лошакова Н.И., Каранова С.Л., 2003; 2004). При применении традиционных методов селекции для получения аналогичного результата необходимо сделать гораздо большие затраты.

Для создания высокоурожайных, выровненных по форме гибридов F| моркови разных сроков созревания необходим новый линейный материал. На создание стерильных и фертильных линий традиционным способом необходимо потратить пе один десяток лет, в то время как на российском рынке семян ежегодно появляется всё новые и новые зарубежные гибриды F| моркови. Поэтому перед нами стоит задача изучить все возможные способы получения гомозиготного линейного материала.

Целью данной работы являлось — усовершенствование элементов технологии получения регенерантов для создания удвоенных гаплоидов моркови.

Объект исследований — методы получения гаплоидов иудвоенных гаплоидов моркови, метод культуры пыльников (андрогенез), семяпочек (гино-генез), индуцированого апомиксиса, эмбриокультура, полиэмбриония.

Предмет исследований — пыльники, семяпочки, зародыши, семена линий, сортов И гибридов F] моркови столовой (Daucus carota L.J.

Научная новизна работы. Научная новизна работы. В результате проведенных исследований усовершенствованы элементы технологии получения регенерангов из репродуктивных органов для создания удвоенных гаплоидов моркови.

Показано, что у гаплоидов число замыкающих клеток устьиц в поле зрения микроскопа при увеличении 15x40 составляет 14-16 шт., у диплоидов- 912 шт., число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц у гаплоидов - 6-9 шт., у диплоидов- 12-14 шт.

Опыление цветков моркови, характеризующихся петалоидным типом стерильности, пыльцой сельдерея сорта Белоснежный и петрушки сорта Алба на фоне обработки растений <я-НУК в концентрации 0,075 г/л и гиббереллина в концентрации 0,025 г/л приводит к образованиию апомиктичных семян, всхожесть которых варьирует от 9% до 21%, что позволяет получить до 0,15% жизнеспособных апомиктичных растений.

Практическая ценность исследований. Проведено сравнение эффективности способов получения регенераптов для создания удвоенных гаплоидов моркови: андрогенез, гиногенез, эмбриокультура. Определены условия культивирования от введения эксплантов in vitro до укоренения побегов и адаптации растений-регенерантов к условиям in vivo.

Установлена частота образования близнецовых гаплоидов моркови, которая составляет от 0 до 0,05%. Выявлено, что линия 8В характеризуется высокой андрогенной, сорт Manufuruji long - гиногенной способностью, у которых частота образования эмбриоидов соответственно составляет 18,9% и 43,5%. Установлено, что использование среды MS, содержащей половинную дозу макро- и микроэлементов, ИМК в концентрации 0,5 мг/л, сахарозу - 10 г/л и агар - 7 г/л в зависимости от типа экспланта позволяет укоренить от 79,8% до 77,5% побегов.

Работа выполнена в отделе биотехнологии ГНУ Всероссийского научно - исследовательского института овощеводства в 2002 - 2009 гг. под руководством доктора биологических наук, профессора Полякова А.В.

Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были доложены или представлены на Международной научно-практической конференции «Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке» (Москва, 2003 г.), Международной научно - практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур» (Москва, 2004 г.), III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005 г.), III Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создание функциональных продуктов» (Москва, 2005 г.), а также на заседаниях методической комиссии селекции, семеноводству и биотехнологии ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии (2002-2009 гг.)

Основные положения диссертации, выносимые на защиту: полиэмбриония у моркови как источник получения гаплоидов; уточнённые условия получения апомиктичных семян; оптимизированные условия получения апомиктичных растений моркови в эмбриокультуре; уточнённые условия культуры пыльников моркови; уточнённые условия культуры семяпочек моркови.

Публикации результатов исследований

1. Ильченко О.В. Оценка генотипов моркови различного географического происхождения на устойчивость к фузариозу и альтернариозу в условиях искусственного инфекционного фона / Т.Н. Лебедева, Н.В. Ипагова, А.В. Поляков, О.В. Ильченко//Материалы Всероссийского совещания: «Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии», 16-18 июля 2003 г. М.: ВНИИФ, 2003С. 61 - 63.

2. Ильченко О.В. Андро- и гиногепез моркови (Daucus carota L.) /А.В. Поляков, О.В. Ильченко // Международная научно-практическая конференция «Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке», Москва, 2003. - С. 420-422. llchenkoO.V. Andro- andgynogenesis of carrol (Daucus carota L.) / A.V. Poliakov, O.V. Ilchenko// «International scientific - practical conference «Perspective directions in breeding and seed production of agricultural plants in XXI centure» Moscow, 2003. - P. 420-422.

3 .Ilchenko O.V. Production of andro- and gynogenic plants of carrot (Dau-cuscarota L.) / A.V. Poliakov, O.V. Ilchenko //Proceedings of International Scientific Practical Conference "Biotechnology of vegetable, flower and not widely spread crops" (March, 22 - 25, 2004). - Moscow: Institute of Vegetable crops,

2004.-P. 146- 150.

4. Ильченко О.В. Получение регенерантов сельдерейных (Apiaceae), тыквенных (Cucurbitaceae), капустных (Brassicaceae) и ряда цветочных культур in vitro / А.В. Поляков, И.И. Тарасенков, О.И. Федоришина, А.А. Ткачева, Н.Н., О.В. Ильченко, Ананьина, Н.Н. Лебедева, М.И. Иванова, Т.В. Ларионова, И.Н. Боровикова //III Московскиймеждународный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - Москва (14 - 18 марта 2005 г.),

2005. - С. 286-287.

Ilchenko O.V. Obtaining regenerants of Apiaceae, Cucurbitaceae, Brassicaceae and some flower crops in vitro / A.V. Poliakov, I.I. Tarasenkov, O.I. Fedori-shyna, A.A. Tkacheva, O.V. Ilchenko, N.N. Ananina, N.N. Lebedeva, M.I. Ivano-va, T.V. Larionova, I.N. Borovikova //III Moscow International Congress "Biotechnology: state of the art and prospects of development".- Moscow (March, 14 -18, 2005), 2005. - P. 286-287.

5.Ильченко О.В. Распространение полиэмбрионии у моркови (Daucus carota L.) / А.В. Поляков, Т.Э. Клыгина, О.В. Ильченко //III Российская научно-практическая конференция "Актуальные проблемы инноваций с нечради-ционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов". -Москва: РАЕН, (6-7 июня 2005 г.), 2005,- С. 40 - 41.

6.Ильченко О.В. Получение апомиктичных семян моркови. /О.В. Ильченко //Картофель и овощи. - 2007. - №6. - С.31.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, выводов, заключения, предложений для использования в селекционной практике, списка использованной литературы содержащего 181 наименований, в том числе 91 иностранных авторов, и 90 отечественных авторов. Она изложена на 165

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Котлярова, Оксана Валерьевна

выводы

4.Оптимизированы условия, влияющие на выход апомиктичных растений моркови в эмбриокультуре:

• оптимальный возраст введения зародышей в культуру in vitro составляет 50 суток;

5. Уточнены условия, влияющие на выход растений - регенерантов в культуре пыльников:

• обработка донорных растений регуляторами роста позволяет получить от 4,2% до 9,9% эмбриогенных и от 6,5% до 41,2% каллусогенных экс-плантов в зависимости от сорта;

• выявлены образцы, характеризующиеся различной андрогенетической способностью. Наиболее высоким эмбриогепным потенциалом характеризуется линия 8В, у которой частота образования эмбриогенных эксплантов составляет 19,0%.

• культивирование пыльников на среде MSm, включающей полный состав питательных веществ, 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л, 2 ip - 2 мг/л позволяет получать до 4,5% эмбриогенных эксплантов;

• метод культуры пыльников в зависимости от образца позволяет получить от 0,34% (Manufuruji long) до 1,74% (линия 8В) жизнеспособных растений-регенерантов.

6. Оптимизированы условия, влияющие на выход растений-регенерантов моркови в культуре семяпочек:

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКЕ

1. Для получения растений-регенерантов в культуре семяпочек:

• проводить обработку донорных растений раствором цитодефа в концентрации 0,2 мл/л;

• укоренение побегов осуществлять на питательной среде MS, где содержание макро- и микроэлементов снижено в два. раза, концентрация ИМК составляет 0,5 мг/л, сахарозы - 10 г/л, агар - 7 г/л.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время селекция моркови направлена на создание гетеро-зисных гибридов, применение которых увеличивает урожайность, обеспечивает выравненность и устойчивость к стрессовым условиям среды. Вследствие этого, одной из важнейших задач селекционной работы является получение генетически стабильных линий для использования в качестве исходного материала для получения гетерозисных гибридов. Вовлечение в селекционную работу биотехнологических приемов, в частности, методов культуры семяпочек и пыльников, индуцирование апомиксиса, эмбриокультуры на основе апомиксиса позволяет сокращать сроки получения константных гомозиготных линий и тем самым облегчает селекционный процесс.

В результате проведенных исследований по выявлению наиболее эффективного метода получения растений-регенерантов моркови из репродуктивных органов и полиэмбриональных семян и изучению различных факторов, влияющих на выход растений-регенерантов моркови установлено что:

• метод культуры семяпочек является наиболее эффективным для получения растений-регенерантов для использования в селекционном процессе;

• подсчет количества устьиц на единице площади листа и количества хлоропластов в замыкающих клетках устьиц позволяет идентифицировать гаплоидные растения моркови.

Оптимизированы условия, влияющие на выход растений-регенерантов, полученных методом культуры пальников, семяпочек и эмбриокультуры. Показано, что использование метода индуцированого апомиксиса позволяет получать апомиктичные семена, всхожесть которых в зависимости от сорта варирует от 9% до 21%, что позволяет получить до 0,15% жизнеспособных апомиктичных растений.

Обнаружены различия у 14 сортообразцов моркови по способности формировать полиэмбриональные семена, которые являются источником получения гаплоидов с частотой до 0,17%.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Котлярова, Оксана Валерьевна, Москва

1. Атабекова, А.И. Цитология растений 3-е изд., перераб. и доп. / А.И. Атабекова, Е.И. Устинова. - М.: Колос, 1980.- 327 с.

2. Атанасов А.И. Биотехнология в растениеводстве /А.И. Атанасов Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 1993.- 242 с.

3. Ахрем, А.А. Тонкослойная хроматография / А.А. Ахрем, А.И. Кузнецова. М.: Наука, 1965,- 141 с.

4. Батыгина, Т.Б. Цитология /Т.Б. Батыгина, Н.Н. Круглова, В.Ю. Горбунова, 1994.- Т.36. №9-10.-.993с.

5. Батыгина, Т.Б. Культура изолированных пыльников злаков с позиции экспериментальной эмбриологии растений (метологические аспекты) / Т.Б. Батыгина, Н.Н. Круглова, В.Ю. Горбунова. Уфа: БНЦ УрО РАН , 1992. - 32с.

6. Бороевич, С. Принципы и методы селекции растений /С.Бороевич.-М.: Колос, 1984,- 167с.

7. Бугара, A.M. Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек in vitro как способ получения гаплоидных растений /A.M. Бугара, Л.В. Русина//

8. Физиол. и биохимия культ, раст. 1988. - Т.20, № 5. - С. 419-430.

9. Бурдасов В.М. Пути использования метода изолированных зародышей в селекции яблони / Тканевые и клеточные культуры в селекции растений/.- М: ВАСХНИЛ, 1979.- С. 52.

10. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений и биотехнологии на их основе /Р.Г. Бутенко //Учеб. пособие. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.

11. Гужов, Ю.Л. Селекция и семеноводство культивируемых растений /ЮЛ. Гужов, А. Фукс, П. Валичек. М.: Мир, 2003. - С. 289 - 293.

12. Данвелл, Д. М. Культура гаплоидных клеток /Д.М. Данвелл //Биотехнология растений: культура клеток: Пер. с англ.-М.: Агропром-издат, 1989. С. 33-51.

13. Дворядкина, А.Г. Гаплоидия у клещевины как метод создания гомозиготных форм в целях селекции: Автореф. дисс. канд. биол. Наук /А.Г. Дворядкина-Краснодар: ВНИИМК, 1972. 25 с.

14. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта / под ред. Б.А. Доспехова -М.: Агропромиздат, 1985. 208 с.

15. Дьячук, Е.И. Культура пыльников злаков: современное состояние и перспективы /Е.И. Дьячук, П.А. Дьячук //Сельскохозяйственная биотехнология, 1989.-№5,-С.3-10.

16. Дьячук, П.А. Возможности перспекимвы использования гаплоидии в селекции пшеницы и ячменя /П.А. Дьячук, Т.И. Дьячук, И.Г. Прокофьева, С.В. Тучин //Селекция и семеноводство зерновых культур. Саратов, 1986.- С.46-50.

17. Ермаков, А.И. Биохимия льна / В кн.: Биохимия культурных растений.-А.И. Ермаков. Сельхозгиз, 1972. - Т. 3. - С. 67-132.

18. Ермишин, А.П. Использование ди- и тетраплоидного исходного материала картофеля на гетерозис: Автореф. дис. .д-ра биол. Наук /А.П. Ермишин.-Минск, 1996.- 17с.

19. Жамбакин, К.Ж. Наследование способности к кал-лусогенезу в культуре пыльников мягкой пшеницы /К.Ж. Жамбакин // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана, 2002. № 8,- С. 11-14.

20. Жамбакин, К.Ж. Гаплоидная биотехнология растений. /К.Ж Жамбакин.- Алматы, 2004.-186 с.

21. Железнов, А.В. Апомиксис и его использование в селекции.- М., 1976.67 с.

22. Здруйковская-Рихтер А.И. Культивирование апомиктических зародышей in vitro //Апомиксис и селекция. М: Наука, 1970. - С. 165-170.

23. Здруйковская-Рихтер А.И. Культура зародышей in vitro и получение новых форм растений: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. -М., 1981.-32 с.

24. Ильенко, И.И., Белоус В.Е. Использование культуры незрелых зародышей при получении гаплоидных растений сахарной свеклы /И.И. Ильенко, В.Е. Белоус:Сб. тр. / Гаметная и зиготная селекция растений. -Кишинёв: Штиинца,1987.-. 156 с.

25. Калинин, Ф.Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений /Ф.Л. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. Киев: Наукова думка, 1980.-488 с.

26. Карпеченко, Г.Д., /В кн.: Достижения и перспективы в области прикладной ботаники, генетики и селекции.- Л.: 1929. С. 71-86.

27. Карпеченко Г.Д. В кн.: Теоретические основы селекции растений, т.1. /Г.Д. Карпеченко.- М.-Л.: Сельхозгиз, 1935. С.397-434.

28. Кириллова, Г.А. Явление гаплоидии у покрытосеменных растений // Генетика. 1966. -№ 2.-С.137-147.

29. Клыгина Т.Э. Основные направления селекции моркови ВНИИО /Т.Э. Клыгина //В кн.: Селекция и семеноводство корнеплодных овощных культур.-М.:2005,- С. 86-92.

30. Клыгина, Т.Э. Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке /Т.Э. Клыгина, В.И. Ле-унов, Н.В. Ипатова,- М.:2003.- 284с.

31. Круг Г. Овощеводство/Г. Круг. Пер. с нем. В.И. Леунова.- М.: Колос, 2000.-576 с.:ил.

32. Круглова Н.Н. Эмбриологические основы метода культуры пыльников пшеницы как биотехнологического приёма /Н.Н. Круглова //II съезд Вавилов, о-ва генетиков и селекционеров: Тез.докл. СПб.: 2000.- Т.1.-С. 151-152.

33. Лаврова Н.В. Технологические аспекты создания андрогенных гаплоидов озимой пшеницы /Н.В. Лаврова.- М.: 2006. 124 с.

34. Левенко В.А. Применение культуры изолированных клеток, тканей и органов растений в генетике и селекции /В.А. Левенко //Общая генетика. Генетика и селекция сельскохозяйственных растений. М.: 1978. -Т.5. - С. 158- 206.

35. Лейке Г. Использование культуры тканей и органов в селекции растений и производстве посадочного материала /Г. Лейке, Р. Лабес, К. Эр-тель, М. Петерсдорф. Пер. с нем. и предисл. Ю.Л. Гужова. М.: Колос, 1980. - 77 с.

36. Леунов, В.И. Селекция и семеноводство моркови столовой /В.И. Ле-унов, А.А. Рыбалко, Ю.Г. Михеев, Т.Э. Клыгина, А.Н. Ховрин.-М.: 2006. -233 с.

37. Лукьянюк С.Ф. Сельскохозяйственная биология /С.Ф. Лукьянюк.-1983.-№5.-С. 8-15.

38. Лукьянюк С.Ф. Получение гаплоидных растений тритикале при культ-вировании пыльников /С.Ф. Лукьянюк, Ю.Г. Сулима, С.А. Игнатова //Доклады ВАСХНИЛ. 1979. - С.7-10.

39. Лутова Л.А. Биотехнология высших растений: Учебник. СПб.: Изд-во С.- Петерб.ун-та, 2003. - 228 с.

40. Маруненко, И.М. и др. Физиологические аспекты гаплоидов кортофеля методом культуры пыльников /И.М. Маруненко //Физиол. Растений.1988,- Т.35.- Вып. 9.

41. Муромцев, Г.С. Основы сельскохозяйственной биотехнологии /Г.С. Муромцев, Р.Г. Бутенко, Т.И. Тихоненко, М.И. Прокофьев. М.: Агро-промиздат, 1990. - 384 с.

42. Навашин, М.С. Бот.журн.- 1934.- № 4.- С.640-64.

43. Ницше, В. Гаплоиды в селекции растений /В. Ницше, Г.Венцель Пер. с англ. В.В. Попова, предисл. Ю.П. Лаптева,- М.: Колос, 1980. - 128 с

44. Новак, Ф.И. Индукция гаплоидов в культуре тканей и их значение в селекции растений /Ф.И. Новак //Культура клеток растений и биотех-нология.-М.: Наука, 1986.- С.107-113.

45. Петров Д.Ф. Апомиксис в природе и эксперименте /Д.Ф. Петров.-Новосибирск, 1988.- С.46 -52.

46. Пивоваров В.Ф. Овощеводство России /В.Ф. Пивоваров М.: 2006.-383 с.

47. Пивоваров В.Ф. Селекция и семеноводство овощных культур /В.Ф. Пи-воваров.-М.: 1999,-т. 2,- 584 с.

48. Поддубная-Арнольди, В.А. Общая эмбриология покрытосеменных растений /В.А. Поддубная-Арнольди. М.: Наука, 1964.-257 с.

49. Поляков А.В. Получение гаплоидов льна из полиэмбриональных семян // Сельскохозяйственная биология.- 1984.- № 6.- С. 62-65.

50. Поляков, А.В. Усовершенствование селекционного процесса льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) на основе использования биотехнологических методов: Автореф. дисс. д-ра биол. Наук / РАСХН, 1998. -50 с.

51. Поляков А.В. Проявление полиэмбрионии у межсортовых гибридов культурного льна.- Генетика,- 1985.- Т. XXI.- № 2.- С. 283-287.

52. Поляков А.В. Спонтанное изменение полиэмбрионии у льна- долгунца.- В кн.: Селекция, семеноводство и агротехника возделывания льна // Сб. науч. трудов, вып. XXI11, 1986. С. 35-40.

53. Поляков А.В. Получение гаплоидов льна при опылении "чужеродной" и поврежденной пыльцой // В кн.: Совершенствование селекции, технологии возделывания и переработки льна-долгунца.- Тез. докладов конф. молодых ученых.- Торжок, ВНИИЛ, ВАСХНИЛ, 1987. С. 3.

54. Поляков А.В. Получение апомиктических гаплоидов у культурного льна // Использование искусственного климата в селекции сельскохозяйственных культур.- Сб. науч. трудов.-Л.: ВАСХНИЛ, СевероЗападный НИИСХ, 1988. С. 80-86.

55. Поляков А.В. Биотехнология в селекции льна. — Тверь, 2000. -.198 с.

56. Поляков, А.В. Получение регенерангов овощных культур и их размножение in vitro. Методические рекомендации. /А.В. Поляков — М.: ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии, 2005. 36 с.

57. Поляков А.В. Биотехнология в селекции льна: Монография.- изд. 2-е.- -М.: 2010.-201 с.ил.

58. Пухальский В.А. Цитология и цитогенетика растений /В.А. Пухаль-ский, А.А. Соловьев, В.Н. Юрцев. М.: Издат-во МСХА, 2004. 118с.

59. Рахимбаев И.Р. Биотехнология зерновых культур /И.Р. Рахимбаев, Ш. Тивари, Н.К. Бишимбаева, С.В. Кушнаренко, Е.Д. Азимова.- Алма-Ата: Гылым, 1992,- 240с.

60. Резникова С.А. Мейоз в культуре изолированных пыльников /С. А. Резникова, Ю.Ф.Богданов//Генетика. 1972.- №9.- С.30-41.

61. Резникова С.А. Цитология и физиология развивающегося пыльника /С.А. Резникова.-М.: Наука, 1984. 272 с.

62. Рубацкий В.Е. Саймон Ф.В. Морковь и другие овощные культуры семейства зонтичных /В.Е. Рубацкий, К.Ф. Кирос, Ф.В. Саймон Пер. с англ. М.: Т-во научных изданий КМК, 2007. 358 с.

63. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / Под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. М.: Брандес, Медицина, 1998. - С. 128-140.

64. Селиванов, А.С. Многозародышевость семян и селекция /А.С. Селива-нов.-Саратов, 1983. -. 82с.

65. Селиванов А.С. Полиэмбриония и гаплоидия /А.С. Селиванов, B.C. Тырнов //Гаплоидия и селекция.- М.: 1976.- С. 77 97.

66. Селиванов А.С. Полиэмбриония и гаплоидия у перца Capsicum annum L. /А.С. Селиванов, B.C. Тырнов //Апомиксис и цитоэмбриология растений. Саратов, 1975.- Вып.З. - С. 109 - 122.

67. Ситникова О.И. Преодоление несовместимости при межвидовой гибtридизации для создания исходного селекционного материала тыквы (С.MAXIMA L.) автореф. дисс. канд. с-х. наук.- М.: 2008,- 23 с.

68. Таганов Б.О. Разработка лабораторной технологии получения андро-генных растений моркови in vitro: Автореф. дис. Канд. с-х н. /ВНИИССОК М.:1991,- 22с.

69. Тырно, B.C. Гаплоидия у растений: Научное и прикладное значение /B.C. Тырнов.-М.: Наука, 1998.-53 с.

70. Тюкавин Г.Б. Основы биотехнологии моркови. / Г.Б. Тюкавин.- М.: 2007.-480 с.

71. Тюкавин Г.Б. « Получение неинфицированных завязей и выделяемых из них зародышей для культивирования in vitro» / Г.Б. Тюкавин //Состояние и проблемы научного обеспечения овощеводства защищенного грунта. М.: 2005. - 183 с.

72. Тюкавин Г.Б. Методические рекомендации по получению дигагшоидов моркови методом андрогенеза /Г.Б. Тюкавин, Н.А. Шмыкова.- М.: 2000,- 37 с.

73. Тюкавин Г.Б. Культура зародышей in vitro / Новые методы биотехнологии растений / Г.Б. Тюкавин. Пущино, 1993.- 171 с.

74. Тюкавин Г.Б., Тимин Н.И., Буракова И.А. Использование методов культуры тканей растений in vitro в селекции моркови // Науч. техн. Бюл. ВИР. - Л.: 1989.- Вып. 192. - С. 57-60.

75. Фотев Ю.В. Условия культивирования пыльников диких видов томата /Ю.В. Фотев, Л.А. Аветисов //Интенсификация производства овощей и технических культур в Новосибирской области.-Новосибирск. -1989. — С.32-35.

76. Хаджинов М.И., Паншин Б.И. В кн.: Теоретические основы селекции растений, 1935,- т. 1. -С. 569-596.

77. Хохлов С.С. Гаплоидия и селекция /С.С. Хохлов, B.C. Тырнов, Е.В. Гришина. М.: Наука, 1976.-221 с.

78. Хохлов С.С. Гаплоидия у покрытосеменных растений / С.С. Хохлов, Е.В. Гришина, М.И. Зайцева, B.C. Тырнов, Н.А. Малышева-Шишкинская.-Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1970.-Ч. 1.-140 с.

79. Чистякова В.Н. Гаплоиды неполных пшенично-пырейных амфидип-лоидов, мягкой пшеницы и ячменя: получение и использование.-М.: МАКС Пресс, 2000.-355 с.

80. Шамина З.Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор /З.Б. Шамина, //Культура клеток растений.-М.: Наука, 1981.-С. 124-136.

81. Шамина З.Б., Тураев A.M., Мусаев Д.А. Способность к каллусогенезу вкультуре пыльников хлопчатника /З.Б. Шамина, A.M. Тураев, Д.А. Му-саев //Цитол. и генет. 1986. - Т.20, № 4. - 276-280.

82. Щеглов Н.И. Меиод культуры зародышей в генетико- селекционном изучении косточковых растений / Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. М.:1979.- С. 85-93.

83. Щерева Л. и др. Индукция андрогенеза в культуре пыльников томатов /Л. Щерева, и др. //Генетика и селекция, 1990. №3.- С. 185-193.

84. Юркова Г.Н., Левенко Б.А. Изолированная культура пыльников злаков /Т.Н. Юркова, Б.А. Левенко //Эксперим. генет. раст. -Киев: Наук, думка, 1981.-С. 46-65.

85. Яковлев С.П., Кожин А.В., Луткова Е.Н., Дубовицкая Л.А. Разработка способов культивирования недоразвитых зародышей груши / Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. М.:1979.- С. 93-99.

86. Andersen S.B. Anther Culture in Carrot // Hereditas. 1985. V.3. - P. 132.

87. Bajaj Y.P.S.Protoplast isolation, culture and somatic hybridization // Applied and fundamental aspects of plant cell, tissue and organ culture / Ed. J.R rei-nert, Y.P.S. Bajaj. Berlin ets: Springer - Verl., 1977. - P. 467-497

88. Bajaj Y.P.S. In vitro production of haploids // Handbook of plant cell culture: Techniques for propagation and breeding /Y.P.S. Bajaj, Eds D.A. Evans et al. New York, London.: Macmillan, 1983. - V.l. - P. 228-287.

89. Ball S.T. Sucrose concentration and its relationship to anther culture in wheat /S.T. Ball, H. Zhou, C.F. Konzak //Crop. Science. -1992.-32, 1. P.75

90. Batty N. Effect of maltose on the response of potato anthers in culture /N. Batty, J. Dunwell //Plant Cell, Tissue and Organ Cult. -1989,18, 2. -P.221-226.

91. Bedo Z. Breadmaking quality of doubled haploid lines derived from wheat anther culture /Z. Bedo, I. Karsal, V. Gy, L.Lang //Journal of Genetics and Breeding. 1992. - 46, 3. P. 263-267.

92. Blakeslee A.F. A haploid mutant in Datura stramonium /A.F. Blakeslee, J. Belling, M.E. Farnham, A.D. Berger//Science. 1922. - V.55. - P. 646-647.

93. Bossoutrot D., Hosemans D. Gynogenesis in Beta vulgaris L.: From in vitro culture of unpollinated ovules to the production of doubled haploid plants in soil // Plant Cell Rep. 1985. - V.4, N.6. - P. 300-303.

94. Bourgin J.P. Obtention de Nicotiana haploidesa partir d'etamines cultivees in vitro /J.P. Bourgin, J.P. Nitsch //Ann. Physiol. Veg. 1967. - V.9. - P. 377382.

95. Chase S.S. Canad.J.genet. and Cetol.- 1964.-N 4.- P. 359-363.

96. Chase, S.S. Monoploids and monoploid derivatives of maize (Zea mays. L.) /S.S. Chase //Bot. Rev. - 1969.-№ 2. - P. 117.

97. Cho U.H. The effect of calcium on ethylene production and microspore-derived embryogenesis in barley (Hardeum vulgare L.) and wheat (Triticum aestivum 1.) anter cultures /U.H. Cho, K.J. Kasha //Jornal of plant Physiology.-1995.- P.-677-680.

98. Clausen R.E. Inheritance in Nicotiana tabacum. V. The occurrence haploid plants in interspecific progenies /R.E. Clausen, M.C. Mann //Proc. Nat. Acad. Sci. 1924. -V.10.-P. 121-124.

99. Collins G.M. Production and utilization of anthers derived haploids in crop plants//Crop Sci., 1977.-V. 17,-P.583-586.

100. Chuang C.C. A set of Potato medium for wheat anther culture /С.С. Chuang, J.W. Ouyang //Proc. Symp. Plant Tissue Culture. Science Press: Peking. -1978.- P.51-56.

101. Chu С Haploids in plant improvements // Plant improvement and somatic cell genetics / Eds. J Vasil et al. New York: Academic Press, 1982. - P. 129-158.

102. Chuong P. V., Deslauriers C, Roff L., Beversdorf W.D., Effects of donor genotype and bud sampling on microspore culture of Brassica napus // Can. J. Bot. -1988.-V.66.-N8.-P. 1653-1657.

103. Corduan G. Regeneration of anther-derived plants from Hyoscyamys niger L. // Planta. 1975. - V. 127. - P. 27-36.

104. Buyser J. Henry Y Androgenese surdes Bles tendres en coins deselection. 1. L'obtention des plantes in vitro. Z Pflanzenz Ucht.- 1979. P. 49-56.

105. Buyser J. Henry Y. and Taler G. Wheat androgenesis: cytogenetical anally-sis and agronomic performance of doubled haploids // Z. Pflanzenzuchtung. -1985. V.95.- P. 23-24.

106. Ding-Gang H., Jun-Wen O. Callus and plantlet formation from cultured wheat anthers at different developmental stages // Plant. Sci. Lett. 1984. -V.33. - P. 71-79.

107. Friedt W., Bickert C., Schaub H. In vitro breeding of high linolenic, doubled-haploid lines of linseed (Linum usitatissimum L.) via Androgenesis /W. Friedt, C. Bickert, H. Schaub. Plant breeding.- 1995.- V. 114,- P. 322326.

108. Gamborg O.L. Plant Cell Culture: Nutrition and Media. Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plant (Laboratory procedures and their applications) / O.L. Gamborg // Acad Press Jnc. 1984. - P. 19-26

109. Genovesi A.D. and Collins G.W. In vitro production of haploid plants of corn vie anther culture // Crop Sci., 1982.- V.6.-P. 1137-1143.

110. Engvild K.C. Plantlet ploidy and flower bud size in tobacco anther cultures /К.С. Engvild //Hereditas. - 1974. - V.76. - P. 320 - 322.

111. Fosker D.S. Harmonal control of morhogenesis in cultured tissues /D.S. Fosker //Plant Substances, 1979. -p.362-369.).

112. Fossard R.A. Terminology in «haploid» work /R.A. Fossard //Haploids in higher plants. -Guelph, 1974. -P. 403-110.

113. Guha S. Development of embryoids from pollen grains of Datura in vitro /S. Guha S.C. Maheshwari //Phytomorphology. 1967. - V. 17. - P. 454л61.

114. Guha S. In vitro production of embryos from anthers of Datura IS. Guha, S.C. Maheshwari //Nature. 1964. - V.204. - P. 497.

115. Guha S. In vitro Production of Embryos of Datura /S. Guha, S.C. Maheshwari //Nature. -1964.-V.204. -.497 p.

116. Heberle-Bors, E. In vitro haploid formation from pollen: a critical review /Е. Heberle-Bors //Theor. Appl. Genet. 1985. - V.71. - P. 361-374.

117. Ни K.K., Matsudara S., Murakami K. Haploid plant by anther culture in carrot (Daucus carota L.) // J. Japan. Soc. Hort. Sci. 1993. - V.62, N3. -P.561-565.

118. Henzer L.l. Henotype and Media effection callus formation and generation in barley /L.I. Henzer, I.P. Miller, M.A. Brinkman, E. Tendos //Crop. Science.- 1985,-V.25.-P.27-31.

119. Ни H. Use of haploids in crop improvement /Н. Hu, Biotechnology in internationl agricultura research International Rise Research Institute.-1985. -P.75-84.

120. Inagaki M.N. Comparison of crossabilities of tetraploid wheat with Hordeum bulbosum and maize // Cereal Res. Com., -1995.-V.25. -N4.-P. 339-343.

121. Jaranowski J. Haploid diploid twin embryos in Melilotus /J. Jaranowski //Genetica Poloniu.-1961.- №2.-129p.

122. Kamada H., Kobayashi K., Harada H. Strees induced somatic embryogenesis in carrot and its applications to synthetic seed production // In vitro Cell Div. Biol. 1989. -V.25. - P.l 163-1168.

123. Jorgensen C.A. The experimental formation of heteroploid plants in the genus Solanum /С.А. Jorgensen. J. Genet. 1928. - V.19. - P. 133-211.

124. Kameya Т., Hinata K. Induction of haploid from plants Grains of Brassica /Т. Kameya, K. Hinata //Jpn Breed 20.- 1970.- P. 82- 87.

125. Katayama V. Karyological comparisons of haploid plants from octoploid Aegiloristicum and diploid wheat /V. Katayama //Jap. J. Bot. 1935. - V.7, N3-4. - P. 349-380.

126. Keller J., Korzun L, Ovary and ovule culture for haploid production /J. Keller, L. Korzun // In vitro haploid production in higher plants: Fundamental aspects and methods / Eds J.S. Mohan et al. Dordrecht, Boston, London, 1996.-V. 1.-P. 217-235.

127. Keller W. A. Rajhathy R., Lacapra J. In vitro production of plants from pollen in Brassica camprestris /W. A. Keller, R. Rajhathy, J. Lacapra //Can. j

128. Genet Cytol 17.- 1975.-P. 655- 666.

129. Keller W.A. et al. The production and utilisation of microspore derived haploids in Brassica crops .In: Plant cell culture in crop improvement. (Ed.Giles K.L.,Sen S.K.) Plenum Press, N-Y.: 1983.

130. Kimber G., Riley R. Haploid angiosperms /G. Kimber, R. Riley //Bot. Rev. -1963. V. 29, N4. -P. 480-531.

131. Kitto S.L., Janick J. Production of synthetic seeds by encapsulating embryos of carrot//J. Am. Soc. Hortic. Sci. 1985. - V.l 10. - P. 277-282.

132. Kostoff D. An androgenic Nicotiana haploid /D.Kostoff //Ztschr. f. Zell-forhg. u. Mikr. Anatomie. -1929. P. 640-642.

133. Lasar M.D. Combining abilities and heritability of callus formation and plantlet regeneration in wheat (Triticum aestivum L) anther cultures /M.D. Lasar, G.W. Shaeffer, P.S. Baenziger //Theor and Appl. Genetics, 1984 -V.68, N1-2.-P. 131-135

134. Li H. The influence of different temperature treatments on anther culture responce of spring wheat (Triticum. aestivum L.) /Н. Li, J. A. Qurenshi, K.K. Kartha //Plant Sci, I988.-V57.-N1.- P.55-6I.

135. Li D.W., He Z.Y., Hu O.D. The crossability of Triticum aestivum with te-traploid Hordeum bulbosum // Annu. Rep. Inst. Genet. Acad. Sinica.-1981 .1982,- P. 136-138.

136. Liu J.R., Jeon J.H. Yang S.G., Lee H.S., Song N.M., Jeong W.J. Dry type of carrot (Daucus carota L.) artificial seeds // Scientia Horticulture. 1992.1. V.51. P.l-l 1.

137. Moieni A., Sarrafi A. Genetic analysis for haploid-regenera-tion responses of hexaploid-wheat anther cultures /А. Moieni, A. Sarrafi //Plant Breeding. -1995.- P. 247-249.

138. Masuda K., Kikuta Y., Okazava Y. Revision of the Medium for Somanic Embryogenesis in Carron suspensions Culnure // J. Fac.A gr. Hokkaido Univ. 1981.-V. 60.- P.183-193.

139. Moieni A. The effects of gibberellic acid phenylethylamine, 2,4 D, and genotype on androgenesis in hexaploid wheat (Triticum aestivum) /А. Moieni, A. Sarrfai //Cereal Research Communication. 1996. - P. 139-145.

140. Monnier M. Culture of zygotic embryos / Monnier, M. // Frontiers of plant tissue culture/ Proc. 4th Intern. Congress for Plant Tissue and Cell Culture, Canada.- 1978,- P. 277-286.

141. Morgan D. A cytogenic study of the original of multiple seed lings of Capsicum frutescens /D. Morgan, R. Rappleys, J.Amer //Bot., 41,576

142. Murashige T. A. Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures /Т. Murashige, F. Skoog //Physiologia Plantarum. -1962. V. 15.-P.473-497.

143. Nakajima Y., Oeda K., Yamamoto T. Characterization of genetic diversity of nuclear and mitochondrial genomes in Daucus varieties by RAPD and AFLP // Plant Cell Reports. 1998. - V.l7, N11. -P.848-853.

144. Mix G. Antheren- und jverienkultur von sonnenblumen (Helianthus annuus L.) // Landbauforsch. Volkenrode. 1985. - V.35, N 3. - P. 153-156.

145. Nakata K. Differentiation of embryoids from germ cells in anther culture of tobacco /К. Nakata, M. Tanaka //Jap. J. Genet. 1968. - V.43. - P. 65-71.

146. Nitsch J.P. Experimental Androgenesis in Nicotiana // Phytomorphology. -1969.-V.19, N4.-P. 389-404.

147. Nitsch, P.C. Proceedings of the 18th International Horticulture Congress /Р.С. Nitsch //Tel Ariv. 1972. V.2 - P. 19-58.

148. Nich P.C. B. Effect dun choc sur lepouvoir embryogenis pollen de Datura in no xia culture dans lanthere on isole de lanture /Р.С. Nich, B. Noreel //C.R. Acad.Sci. 1973.- P.305-306.

149. Nichterlein K. New methods and recent progress in the breeding of flax. -Flax as a fibre and oil bearing crop /К. Nichterlein, M. Nikel, H. Umbach, W. Friedt //Proceedings of the FAO European Regional Workshop on Flax. Brno.-1991. P. 175-183.

150. Norstog K. New synthetic medium for the culture of premature barley embryos / K. Norstog // In vitro. 1973. - V. 8.- P. 307-308.

151. Ockendon D.J. Genetic and non-genetic factors affecting antherculture of Brussels sprouts (Brassica olerucea var. gemmifera) /D.J. Ockendon, R.A. Sutherland //Theor Appl. Genet. -1987. -№74.- P. 566-570.

152. Orlikowska Т., Chrastek M. Kulturu zarodkov roslinnych in vitro i mozliwosci ich wykorzystania w hodowli // Post, nauk rol. 1979. - V.26, N 1. -P. 27-42.

153. Ouyang S.M. The response of anther culture temperature in triticum aestivum /S.M. Ouyang, S.M. Zhou, S.E. Jia //Treor and Appl. Genet.-1983.-V.66,-P.101-109.

154. Ramiah K. Polyembriony in rise (Oryza sativa) /К.Р. Ramiah, N. arthasarihi, S. Ramanujam // Indian J. Agric. Sci. 1935. - P. 199.

155. Reynolds T.L. Callus formation and organogenesis in anther cultures of So-lanum carolinense // J. Plant Physiol.- 1984.-V. 117, N2,- P. 157-161.

156. Reynolds T.L. Pollen embryogenesis in in anther cultures of Solanum carolinense L. // Plant Cell Repts. 1986.-V.5, N4.- P. 273-275.

157. San Noeum L.H. Haploides d'Hordeum vulgare L. par culture in vitro d'ova-ries non fecondes // Ann. Amelior. Plant. 1976. - V.26, N 4. - P. 751-754.

158. Sangwan-Norreel B.S. Male gametophyte nuclear DNA content evolution during androgenetic induction in Datura innoxia Mill. // Z. Pflanzenphysiol-ogy, 1983,-V.lll -P. 47-54.

159. Scheike R., Gerold E., Brennicke A., Mehring-limper M., Wricke G. Unique patterns of mikochondrial genes, transcripts and proteins in different malesterile cytoplasms of Daucus carota // Theor. Appl. Genet. 1992. V. - 83. -P.419-427.

160. Sesek S. The potential of anther culture technique in wheat breeding /S. Se-sek, S. Dencic //Cereal Research Communications. 1996. - P. 163-170.

161. Sevenier R. Ethylene production and involvement during the first steps of durum wheat anther culture /R. Sevenier, M. Coumans //Physiologia Planta-rum .-1996.-.P.146-151.

162. Shultz В., Westphal L., Wricke G. Linkage groups of isozymes, RELE and RAPD markers in carrot (Daucus carota 1. sativus) // Euphytica. 1994. -V.74.-N 1-2.-P. 67-76.

163. Simon P.W. Improvement of carrots for U.S. production with classical and modern techniques // J.Appl.Genet. 1997. - V.38A. - P. 1-4.

164. Simonson R.L. Wheat anther culture as affected by various cultural changes and supplement J.Appl /R.L. Simonson, P.S. Baenziger, V.D. Gustafson //GENET.- 1997.- P.381-392.

165. Sopory S.K., Jacobsen E., Wenzel G. Monohaploid embryoids and plantlets in cultured anthers of Solanum tuberosum // Sci. Lett. 1978. - N 12. - P. 4754.

166. Steinborn R., Weihe A., Boerner T. Mitochondrial genome diversity within a cultivar of Daucus carota (ssp. sativus) revealed dy restriction fragment analysis of single plants // Plants Breeding. 1992. - V.109. - P. 75-77.

167. Sneep J. and Hendriksen, A.J. (eds). Plant Breeding Perspectives; Current breeding methods /J. Sneep, A,J. Hendriksen. Pudos, Wageningen.- 1979.-P. 104-233.

168. Sung Z.R. Carrot Somatics Cell Genetics /Z.R. Sung, D. Dudits //Genetics Engineering in the Plant Sciences //Ed. Panopoulos N.J.N.Y.; Praeger, 1981.- P.ll-37.

169. Szarejko I. Doubled haploids in the mutation breeding of selected crops /I. Szarejko, V. Maluszynski, K. Polok, A. Kilian //Plant Mutant. Breed. Crop Improv.: Proc. Int. Symp., Vienna, June 18-22, 1990,- Vienna.- 1991.-V.2.-P. 355-378.

170. Tanno-Suenaga L., Ichikowa H., Imamura J., Transfer of the CMS trait in Daucus carota L. by donor-recipient protoplast fusion // Theor. APPL.Genet. 1988. - V.76.-P.855-860.

171. Thomas E. Embryogenesis from microspores of Brassica napus /Е. Thomas, G. Wenzel Pflanzenziicht. 1975a. - V.74. - P. 77-81.

172. Thomas E. Embryogenesis from microspores of Brassika napus /Е. Thomas, G. Wenzel Z. Planzenzucht.- 1975.- P.77-81.

173. Vasil I.K. Androgenetic haploids /1.К. Vasil //Perspectives in Plant Cell and

174. Tissue Culture / Ed. I.K. Vasil. New York: Academic Press.- 1980. - P. 195-223.

175. Vasil I.K. Experimental production of pollen haploids and their uses /I.K. Vasil, C. Nitsch Z. Pflanzenzucht 1975. - V.76, N 3. - P. 191-212.

176. Yang O. A study of factors affecting anther culture of cauliflower Brassica oleracea var. botrytis. // O. Yang, J. E. Chauvin, Y. Herve. //Plant Cell, Tissue and Organ Culture.- 1992.- P. 289-296.

177. Zhou C, Yang H.Y., Tian R, Liu Z., Yan H. In vitro culture of unpoliinated ovaries in Oruza sativa L. // Haploids of Higher Plants In Vitro // Eds Ни H., Yang H. Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag.-1986. - P. 165181.

178. Zagorska N.A., Abadjieva M.D., Georgiev H.A. Induction regeneration in anther cultures of tomatoes (Lycopersicon esculentum Mill.). // Докл. Болг. АН. -1982. V.35, N 1. - P. 97-100.

Информация о работе

Котлярова, Оксана Валерьевна
кандидата сельскохозяйственных наук
Москва, 2010
ВАК 06.01.05

Диссертация

Усовершенствование элементов технологии получения регенерантов для создания удвоенных гаплоидов моркови - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы