Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка элементов технологии получения растений-регенерантов капусты брокколи (Brassica oleracea L. convar. Botrytis (L.) Alef. var. cymosa Duch.) в культуре семяпочек

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Разработка элементов технологии получения растений-регенерантов капусты брокколи (Brassica oleracea L. convar. Botrytis (L.) Alef. var. cymosa Duch.) в культуре семяпочек"

На правах рукописи

СТАРЦЕВ Сергей Викторович

РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ

РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ КАПУСТЫ БРОККОЛИ {Brassica oleráceo L. convar. Botrytis (L.) Alef. var. cymosa Duch.) В КУЛЬТУРЕ СЕМЯПОЧЕК

Специальность: 06.01.05 - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

7 НОЯ 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва - 2013

005537348

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства Россельхозакадемии в 2010-2013 гг.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Поляков Алексей Васильевич

Официальные оппоненты: Паничкин Леонид Александрович

доктор биологических наук, профессор, РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева, профессор кафедры физиологии растений

Надежкин Сергей Михайлович доктор биологических наук, профессор, ВНИИССОК, Россельхозакадемии, зав. лабораторией применения агрохимических средств

Ведущая организация Российский государственный аграрный

заочный университет

Защита диссертации состоится «28» ноября 2013 года в ^ часов на заседании диссертационного совета

Д 006.022.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте овощеводства Россельхозакадемии по адресу: 140153 Московская обл., Раменский район, д. Верея, строение 500, ВНИИО. Факс (49646) 2-43-64

E-mail: vniio@vandex.ru. сайт: www.vniio.com

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института овощеводства.

Автореферат разослан - « 28 » октября 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета /, _ Девочкина

у Наталия

Леонидовна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В последние годы возрастает интерес к капусте брокколи, так как по пищевой ценности она занимает ведущее место не только среди разновидностей капусты, но и среди многих других овощных культур. В ней содержатся флавоноиды (Williamson et al, 1996), селен (Finley et al, 2000), белок, включающий незаменимые аминокислоты, витамины А, Вь В2, С, РР, К, так же в ней присутствуют глюкозинолаты (Голубкина Н.А. и др., 2010), поэтому её используют в лечебно-профилактическом питании при онкологических заболеваниях, гипо- и авитаминозе, колите, болезнях желудочно-кишечного тракта и сердца.

Селекционная работа с капустой брокколи, в первую очередь, направлена на создание высокопродуктивных, скороспелых сортов и гибридов. Они должны быть устойчивы к фитопатогенам, пригодны к современным технологиям возделывания и соответствовать природно-климатическим условиям регионов выращивания (Литвинов С.С., 2003; Борисов В.А., 2003).

В настоящее время в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию в России на 2013 г., включено 26 сортов и гибридов Fi капусты брокколи. Все представленные сорта являются отечественными, а большинство гибридов - результат иностранной селекции.

В связи с этим необходимо усовершенствовать технологию быстрого получении исходного селекционного материала этой культуры для создания отечественных сортов и гибридов.

Целью исследований являлась разработка технологии получения растений-регенерантов капусты брокколи в культуре семяпочек, на основе оптимизации условий индукции морфогенеза на всех этапах биотехнологического процесса.

Исходя из поставленной цели, требовалось решить следующие задачи:

1. Установить длину бутона с наиболее высокой морфогенетической активностью и определить тип экспланта, обладающего наибольшей жизнеспособностью.

2. Выявить оптимальные концентрации сахарозы и регуляторов роста в питательной среде MS для индукции морфогенеза изолированных завязей и семяпочек капусты брокколи.

3. Определить оптимальные концентрации сахарозы и регуляторов роста в питательной среде MS на этапе микроклонального размножения капусты брокколи, и их влияние на повышение жизнеспособности морфогенных тканей.

4. Получить растения-регенеранты, оптимизировать условия укоренения побегов капусты брокколи.

5. Провести оценку потомства растений-регенерантов, полученных после самоопыления, по фенотипическим и морфологическим признакам.

Научная новнзна работы. Впервые в России получены растения-регенеранты из изолированных семяпочек капусты брокколи. Разработаны элементы технологии культуры завязей и семяпочек капусты брокколи: установлено, что наилучший результат может быть достигнут при использовании для выделения экспланта бутона длиной 8-9 мм.; выявлен

з

оптимальный тип экспланта для введения в культуру in vitro, состоящий из завязи и не травмированного пестика с фрагментами цветоложа, показано, что наилучший рост изолированных завязей происходит на питательной среде MS (Murashige Т., Skoog F., 1962), содержащей тидиазурон (ТДА) в концентрацией 1,0 мг/л и индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,5 мг/л, а так же сахарозу - 30 г/л.

Установлено, что выделение семяпочек из культивируемых in vitro завязей следует проводить на 28 сутки и культивировать их на среде MS, содержащей 1 мг/л ТДА, 0,5 мг/л ИУК, 30 г/л сахарозы.

Показано, что ТДА, используемый в концентрации 0,5 мг/л, ИУК - 0,1 мг/л и сахароза - 30 г/л в питательной среде при культивировании морфогенных тканей растущих семяпочек стимулируют образование высокого числа почек и побегов.

Установлено, что наилучший результат при укоренении полученных побегов на среде MS (97-99 % растений-регенерантов), достигается при использовании ИУК в концентрации 0,1 мг/л, а так же торфяных таблеток для рассады в качестве субстрата для адаптации растений-регенерантов к условиям открытого грунта (88-94% адаптированных растений).

Проведенные исследования позволили впервые в России получить из изолированных семяпочек капусты брокколи растения-регенеранты с высоким содержанием питательных веществ, а так же превышающие по большинству хозяйственно-ценных признаков исходный контрольный сорт.

Практическая ценность. Оптимизированные условия культивирования позволяют получать 93-97% растущих завязей, 44-58% растущих семяпочек, 96-98% жизнеспособных конгломератов с почками и побегами, 97% растений-регенерантов. Использование торфяных таблеток на 6-8% повышает число адаптированных растений в почвенном субстрате и на 7-9% в открытом грунте.

Выделены три семьи (№1, №5, №8) существенно превышающие по комплексу хозяйственно-ценных признаков контроль, которые представляют интерес для использования в дальнейшей селекционной работе.

Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были доложены и представлены на IV Международной научно-практической конференции преподавателей, молодых ученых, аспирантов и студентов (ФГБОУ ВПО РУДН, Москва, 2012); Международной научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 125-летию со дня рождения Н.И. Вавилова (ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии, д. Верея, 2012).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту: • культивирование эксплантов, выделенных из бутонов длиной 8,1-9,0 мм на жидкой питательной среде MS, обогащенной ТДА в концентрации 1 мг/л и ИУК - 0,5 мг/л, сахарозой в концентрации 30 г/л, позволяет получать 97,2% растущих завязей и 1,3% семяпочек;

• завязь, включающая пестик и цветоложе, обладает наиболее высокой морфогенетической активностью (95,1±1,2% растущих завязей и 1,8±0,3% семяпочек);

• применение ТДА в концентрации 1,0 мг/л и ИУК - 0,5 мг/л, для пересадки растущих изолированных семяпочек на агаризованную среду М8 обеспечивает наибольшую частоту образования жизнеспособных семяпочек (58,2±2,1 %);

• культивирование морфогенной ткани, почек и побегов, полученных из растущих семяпочек на агаризованной среде МБ, содержащей ТДА, в концентрации 0,5 мг/л и ИУК - 0,1 мг/л, сопровождается образованием 96-98% жизнеспособных конгломератов с почками и побегами;

• полученные на основе семяпочек капусты брокколи семьи растений-регенерантов отличаются высокими товарными качествами: пищевой ценностью, массой центральной головки до 193 г и продуктивностью с куста до 327 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 работы в изданиях рекомендованных перечнем ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, условий и методов проведения исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, предложения для использования в селекционной практике, списка использованной литературы (115 наименований, в том числе 69 работ иностранных авторов). Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы, 19 рисунков, 1 приложение.

2. УСЛОВИЯ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проведены в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИО), расположенном в Раменском районе, Московской области в период 2010-2013 гг.

Исходным материалом для исследований служили растения капусты брокколи сорта Тонус (Brassica oleracea L. convar. Botrytis (L.) Alef. var. cymosa Duch.), а так же завязи, входящие в состав эксплантов разного типа (рис.1).

№1

-рыльце

-лепесток — столбик

№2

_завязь _цветоложе —чашелистик ~ цветоножка

- рыльце

-лепесток — столбик

.У--11

_завязь цветоложе

-чашелистик

"цветоножка

№3

- рыльце

-лепесток

— столбик

№4

- рыльце

-лепесток — столбик

_завязь цветоложе

-чашелистик

"цветоножка

_ завязь

цветоложе —чашелистик "цветоножка

Рисунок 1 - Типы культивируемых эксплантов: 1 - пестик с рыльцем и столбиком, завязь и цветоложе; 2 - пестик с рыльцем и столбиком, завязь; 3 -базальный фрагмент пестика и завязь; 4 - базапьный фрагмент пестика, завязь и

цветоложе.

Исследования в условиях in vitro проводили в соответствии с «Методическими указаниями по культуре ткани и органов» (Бутенко Р. Г., 1964; Бутенко Р. Г., Хромова Л. М„ Седнина Г.А., 1984; Поляков A.B., 2005; Марьяхина И.Я., 1985; Поляков A.B., Шарафова О.Ф, Зонтикова С.А., 2009).

Цитогенетические анализы растений-регенерантов проводили по общепринятым методикам (Пухальский В.А., 2004,2007).

Оценку хозяйственно-ценных признаков проводили в соответствии с Методическими указаниями и рекомендациями по селекции и семеноводству капустных культур (ВНИИССОК, 2007).

Для биохимических анализов использовались соответствующие общепринятые методики (Мурри И.К., 1972; Кидин В.В., 2008; Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М., 1975).

Математическую обработку экспериментальных данных выполняли согласно Методике полевого опыта (Доспехов Б.А., 1979).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ЗЛ. Морфогенез изолированных завязей при культивировании in vitro

Стимулирование морфогенеза изолированных завязей капусты брокколи является важной задачей на начальном этапе получения расгений-регенерантов. На этом этапе необходимо создать условия для нормального развития введенных в культуру эксплантов, чтобы не только максимально раскрыть их морфогенетические способности, но и обеспечить выживание клеток находящихся в семяпочках и их дальнейшее развитие.

С этой целью нами были проведены исследования морфогенеза эксплантов, выделенных из бутонов различной длины, так как частота образования растущих семяпочек зависит от длины бутона и дальнейшей динамики роста завязей. При длине бутона 8,1-9,0 мм доля растущих завязей составила 95,6+1,2 %, а семяпочек -1,8±0,3%. Использование бутонов длинной от 7,1 до 8,0 мм было на 4-8 % менее эффективно. В варианте с длиной бутона 6,1-7,0 мм, только 74-79% завязей обладали жизнеспособностью, а доля жизнеспособных семяпочек была минимальной - 0,05±0,05%. Варианты с бутонами длиной от 4,0 до 6,0 мм отличались сравнительно высокой частотой растущих завязей - 78-89%, однако число растущих семяпочек составило от 0,2 до 0,9 %. Использование бутонов длиной более 9,0 мм не принесло положительного результата, а вызывало деградацию и отмирание эксплантов (рис. 2).

6

—□— 4-5 мм —Ж-6,1-7,0 мм —О—8,1-9 мм

-5,1-6,0 мм -7,1-8 мм

Ширина завязи, мм А

Длина завязи, мм Б

Длительность культивирования,

—О— 4-5мм -О—5,1 6мм -ь—6,1-7мм

— 7,1-8мм -8,1-9мм

Рисунок 2 - Динамика роста завязей капусты брокколи сорта Тонус, выделенных из бутонов различной длины (жидкая среда МБ; 30 г/л сахарозы; сочетании гормонов: 1,0 мг/л ТДА, 0,5мг/л ИУК, завязь включает пестик и цветоложе). А - ширина, Б - длина.

При исследовании влияния регуляторов роста на частоту образования растущих завязей и семяпочек было выявлено, что ТДА, используемый в концентрации 1,0 мг/л и ИУК - 0,5 мг/л, обеспечивали 97,2±1,0 % растущих завязей и 1,3±0,3 % семяпочек. Более низкая концентрация регуляторов роста-ТДА -0,5 мг/л и ИУК - 0,1 мг/л давала меньшее число новообразований: 93,2±1,5 % завязей и 0,8±0,2% семяпочек. При использовании бензиладенина (БА) в концентрации 4,0 мг/л и а-нафтилуксусной кислоты (НУК) - 0,3 мг/л было отмечено 84,9±2,1 % и 0,4±0,1 % растущих завязей и семяпочек. При использовании Б А в концентрации 1,0 мг/л и НУК - 0,1 мг/л доля растущих завязей и семяпочек соответственно составляла 71,4±2,6 % и 0,05±0,05 %.

Данные таблицы 1 показывают, что питательная среда МБ, обогащенная ТДА в концентрации 1 мг/л и ИУК - 0,5 мг/л, позволяет получать наибольшее число растущих завязей и семяпочек.

Таблица 1 - Число растущих завязей и семяпочек при разных сочетаниях регуляторов роста (среда МБ; концентрация сахарозы 30 г/л; завязь включает _пестик и цветоложе; длина бутона 8,1-9,0 мм)_

Вариант среды (концентрация, мг/л) Изучено завязей, шт. Обнаружено растущих завязей Изучено семяпочек, шт. Обнаружено растущих семяпочек

ТДА БА НУК ИУК шт. % шт. %±вр

1,0 - - 0,5 285 277 97,2+1,0 1989 25 1,3+03

- 4,0 0,3 - 292 248 84,9£2,1 2042 8 0,4±0,1

- 1.0 0,1 - 297 212 71,4+2,6 2001 1 0,05+0,05

0,5 - - 0,1 279 260 93,2+1,5 1997 15 0,8±02

В зависимости от состояния питательной среды менялась морфогенетическая активность завязей и семяпочек в культуре in vitro. Эксплантация изолированных завязей на жидкую питательную среду способствовала образованию 95,3-97,3% растущих завязей и 1,7±0,3% растущих семяпочек.

Применение агаризованной питательной среды значительно ограничивало рост завязей и понижало число жизнеспособных семяпочек (рис. 3).

Таким образом, наибольшее количество растущих завязей и семяпочек отмечено в варианте с жидкой питательной средой MS.

Ширина завязи, мм

Длина завязи, мм

-агаризованная среда - жидкая среда

Длительность культивирования

-агаризованная среда - жидкая среда

Длительность культивирования,

Рисунок 3 - Динамика роста завязей капусты брокколи сорта Тонус, выделенных из бутонов длиной 8,1-9,0 мм на питательных средах разного состояния (среда МЯ; 30 г/л сахарозы; гормоны: 1,0 мг/л ТДА, 0,5мг/л ИУК; завязь включает пестик и цветоложе). А - ширина, Б - длина.

Рост завязей и семяпочек зависел от концентрации сахарозы. На питательной среде, содержащей 30 г/л сахарозы проявили способность к росту 93,2±1,4 % завязей и 1,3±0,2 % семяпочек. При увеличении концентрации сахарозы в среде с 30 г/л до 60 г/л частота новообразований снижалась в среднем у завязей на 6%, а у семяпочек на 0,3 %. В вариантах с концентрацией сахарозы 90 г/л и 120 г/л снижение новообразований продолжалось. При концентрации сахарозы в питательной среде 140 г/л число растущих завязей и семяпочек было минимально - 68,0±2,6%, 0,1 ±0,06 % (рис. 4).

Результаты экспериментальных данных показали, что наличие 30 г/л сахарозы в жидкой питательной среде обеспечивает наибольшую частоту новообразований в культуре завязей среди изученных вариантов концентрации (табл. 2).

Таблица 2 - Образование растущих завязей и семяпочек в культуре завязей при

разных концентрациях сахарозы (среда МБ; ТДА - 1,0 мг/л, ИУК - 0,5мг/л; _завязь содержит пестик и цветоложе; длина бутона 8,1-9,0 мм)_

Концентрация сахарозы, г/л Изучено завязей, шт. Обнаружено растущих завязей Изучено семяпочек, шт. Обнаружено растущих семяпочек

шт. %±Бр шт. %±5р

30 310 289 93,2±1,4 2239 28 13*0,2

60 316 273 8б,4±1,9 2219 23 1.0±02

90 305 244 80,0±23 2198 16 0,7±0,2

120 319 236 74,0±2,5 2188 7 03±0,1

140 315 214 68,0±2,6 2204 2 0,1 ±0,06

Длима завязи, мм 50,00

□ 3% □ 6% 0 9% □ 12%

I 14%

28.

Продолжительность культивирования,

сут.

Рисунок 4 - Динамика роста завязей в длину при разных концентрациях сахарозы (жидкая питательная среда М8; ТДА - 1,0 мг/л, ИУК - 0,5мг/л; завязь включает пестик и цветоложе; длина бутона 8,1-9,0 мм).

Анализ полученных данных свидетельствует о преимуществе использования экспланта, состоящего из пестика с рыльцем, столбиком, завязью и цветоложем (табл. 3).

При сравнении разных типов экспланта установлено, что наименее травмированный эксплант, состоящий из целого пестика и цветоложа, обеспечивал 95,1±1,2 % растущих завязей и 1,8±0,3% семяпочек. Эксплант, включающий базальный фрагмент пестика, завязь и цветоложе, обладал близкими по активности роста свойствами - рост обнаружили у 91,1±1,5% завязей и 0,6+0,2% семяпочек. При культивировании завязи со столбиком и рыльцем пестика наблюдали 84,3±1,9% растущих завязей, а способностью к росту обладали 1,1 ±0,2% семяпочек. Использование в составе экспланта базального фрагмента пестика и завязи обеспечивало 79,3±2,1% жизнеспособных завязей и 0,2±0,1 % семяпочек.

Таблица 3 - Образование растущих семяпочек в культуре завязей при разных

типах экспланта (среда М8; ТДА - 1,0 мг/л, ИУК - 0,5мг/л; концентрация _ сахарозы 30 г/л; длина бутона 8,1-9,0 мм) _

Тип экспланта Изучено завязей, шт. Обнаружено растущих завязей Изучено семяпочек, шт. Обнаружено растущих семяпочек

шт. % шт. %±Sp

Пестик с рыльцем и столбиком, завязь и цветоложе 349 332 95,1±1Д 2651 47 1,8±0,3

Пестик с рыльцем и столбиком, завязь 357 301 84,3±li> 2489 27 1,1 ±0,2

Базальный фрагмент пестика и завязь 362 287 79,3+2,1 1580 3 0,2±0,1

Базальный фрагмент пестика,завязь и цветоложе 347 316 91,1±1,5 2047 12 0,б±0,2

3.2. Морфогенез изолированных семяпочек в культуре in vitro

Индукция морфогенеза изолированных семяпочек является самым ответственным элементом технологии получения растений-регенерантов. Семяпочки испытывают большой стресс на искусственной питательной среде. Только правильный подбор таких факторов как продолжительность культивирования морфогенных завязей, химическая природа и концентрация регуляторов роста, состояние питательной среды, количество сахарозы и концентрация штока в питательной среде, может обеспечить их дальнейшее развитие в морфогенные структуры, а затем и в растения-регенеранты.

При исследовании влияния сроков культивирования разросшихся завязей in vitro на жизнеспособность семяпочек было выявлено, что продолжительность их культивирования, после визуального определения наличия семяпочек, влияет на дальнейшую жизнеспособность находящихся в них семяпочек.

У семяпочек, выделенных из 28-ми суточных разросшихся завязей, наблюдалась более высокая способность к образованию почек и побегов, число которых на одну семяпочку было наибольшим и составляло 2 шт. и 1,5 шт. соответственно (табл. 4, рис. 5).

Использование семяпочек, изолированных из разросшихся завязей ранних сроков культивирования (от 7 до 21 суток) давало в среднем 37,8-50,0% жизнеспособных семяпочек, из которых в последующем от 4 до 12 % были способны образовывать почки, а 0,7-5,4% - побеги. Причем количество почек на одну семяпочку колебалось от 1,4 до 1,9 шт., а побегов от 1,0 до 1,4 шт. Культивирование разросшихся завязей в течение 28 суток обеспечивало 65,468,8% растущих семяпочек. Число семяпочек с почками в данном варианте составляло 18,5+1,7%, количество почек на одну семяпочку - 2,0 шт., а побегов -1,5 шт. У разросшихся завязей, культивируемых сроком 35 суток наблюдалось снижение жизнеспособности семяпочек с 65,4-68,8% (в предыдущем варианте) до 63,3±1,7%. Число жизнеспособных семяпочек так же снижалось до 15,3±1,6%. Использование разросшихся завязей, культивируемых более 35 суток

приводило к витрификации и дальнейшей гибели растительного материала.

Для полного раскрытия морфогенетического потенциала изолированных семяпочек требовалось установить оптимальное сочетание определенных гормонов и их концентрацию.

При оценке влияния регуляторов роста на частоту образования почек и побегов на семяпочках было установлено, что ТДА, используемый в концентрации 1,0 мг/л и ИУК - 0,5 мг/л, обеспечивали 58,2±2,1 % жизнеспособных семяпочек. В данном варианте число семяпочек с почками составило 29,0±2,5%, а с побегами - 22,6±2,3%. При этом в пересчете на одну семяпочку было получено 2,6 побега и 2,6 почки.

Концентрация ТДА - 0,5 мг/л и ИУК - 0,1 мг/л давала близкое по значению, но меньшее число новообразований - 42,7±2,1% жизнеспособных семяпочек, при частоте появлении семяпочек с почками 23,2+2,7% и с побегами -15,4+2,3%. Количество почек и побегов на 1 семяпочку, при этом, было меньше, чем в предыдущем варианте на 0,3 и 0,1 штуки соответственно.

При использовании БА в концентрации 4,0 мг/л и НУК - 0,1 мг/л доля жизнеспособных семяпочек составляла 19,1+1,7%. Частота появления семяпочек как с почками (6,5+2,4%), так и с побегами (2,8+1,6) была ниже, чем в остальных трех вариантах. Образование почек (2,0 шт.) и побегов (2,3 шт.) на 1 семяпочку тоже было сравнительно невысоким.

В варианте при концентрации БА 1,0 мг/л и НУК - 0,3 мг/л, отмечали 31,8+1,9% жизнеспособных семяпочек, что в среднем на 13% превышало вариант, в котором БА и НУК использовали в концентрации 4,0 мг/л и 0,1 мг/л, число семяпочек с почками и побегами, тоже было выше на 8,9% , и 5,5%. Количество почек и побегов не превышало 2,0 и 2,1 шт. на 1 семяпочку (табл.

5).

Таким образом, при изучении влияния сочетаний регуляторов роста и их концентрации на агаризованной питательной среде MS на частоту образования почек и побегов на семяпочках, наилучший результат был достигнут при использовании гормонов ТДА в концентрации 1,0 мг/л и ИУК - 0,5 мг/л.

Неотъемлемым компонентом питательной среды и источником углерода для клеток семяпочек in vitro является сахароза. Получение растений-регенерантов напрямую зависит от правильного определения концентрации этого углевода в питательной среде. Высокое содержание сахарозы может негативно сказываться на морфогенезе клеток семяпочек, так же как и её недостаток. Поэтому был проведен опыт по определению оптимальной концентрации сахарозы на агаризованной питательной среде MS.

Полученные результаты исследований свидетельствуют о том, что самой высокой морфогенетической активностью обладали изолированные семяпочки, культивируемые на твердой питательной среде MS, содержащей 30 г/л сахарозы. В этом варианте наблюдали самые высокие из всех 5 вариантов показатели жизнеспособности и способности к новообразованию (табл. 6, рис.

6).

При концентрации сахарозы в среде 30 г/л около половины семяпочек проявили способность к росту. Из отмеченных жизнеспособных семяпочек примерно 98% смогли образовывать почки, а 96% - побеги. Число почек и побегов на 1 семяпочку в данном

11

варианте имело следующее значение: 2,2 почки и 2,0 побега на 1 семяпочку. При увеличении концентрации сахарозы до 60 г/л снижалось число жизнеспособных семяпочек, их доля составила 40%. Также уменьшалась частота образования почек и побегов на 1 семяпочку (2,0 шт., и 1,9 шт.) В среднем на 10 % уменьшалось количество семяпочек с почками и побегами. Аналогичная динамика прослеживалась в вариантах с более высокой концентрацией сахарозы: 90 г/л, 120 г/л и 140 г/л.

Таблица 4 - Жизнеспособность семяпочек, в зависимости от сроков культивирования разросшихся завязей in vitro (среда

MS; завязь содержит рыльце, столбик пестика и цветоложе; концентрация сахарозы 30 г/л; регуляторы роста: __ ТДА - 1,0 мг/л, ИУК - 0,5мг/л; длина бутона 8,1-9,0 мм)__

Продолжительность культивирования завязей, сут. Число культивированных семяпочек, шт. Число жизнеспособных семяпочек Число семяпочек с почками Получено почек Число семяпочек с побегами Получено побегов

всего, шт. %±Sp всего, шт. %±Sp всего, шт. в том числе на 1 семяпочку, шт. всего, шт. %±Sp всего, шт. в том числе на 1 семяпочку, шт.

7 790 299 37,8±],7 11 3,7±1,1 15 1,4 2 0,7±0,5 2 1,0

14 783 339 43,3±1,8 24 7,0±1,4 39 1,6 8 2,3±0,8 11 1,4

21 ' 780 390 50,0±1,8 47 11,8±1,6 91 1,9 21 5,4±1,0 30 1,4

28 776 52! 67,!±1,7 98 18,5±1,7 199 2,0 39 7,5±1,1 58 1,5

35 775 491 63,3±1,7 75 15,3±1,6 120 1,6 53 10,8±1,4 75 1,4

42 769 витрификация

Продолжительность культивирования семяпочек, сут.

% жизнеспособных семяпочек

Рисунок 5 - Жизнеспособность семяпочек, в зависимости от сроков культивирования разросшихся завязей in vitro (среда MS; завязь содержит рыльце, столбик пестика и цветоложе; сахароза 30 г/л; регуляторы роста: ТДА - 1,0 мг/л,

ИУК - 0,5мг/л; длина бутона 8,1-9,0 мм)

Таблица 5 - Образование почек и побегов на семяпочках, в зависимости от используемых регуляторов роста (агаризоваиная среда МБ, сахароза 30 г/л; продолжительность культивирования 28 суток)

Копнет рация регуляторов роста, мг/л Число культивированных семяпочек, ил. Число жизнеспособных семяпочек Число семяпочек с почками Образовалось почек. Число семяпочек с побегами Образовалось побегов

Г ДА ьл ПУК ИУК всего, шт. %±Sp всего, шт. %±Sp всего, шт. в том числе на 1 семяпочку, шт. всего, шт. %±Sp всего, шт. в том числе на 1 семяпочку, шт.

1,0 - 0,5 568 328 58,2±2,1 95 29,0±2,5 244 2,6 74 22,6±2,3 188 2,6

0.5 - 0,1 564 241 42,7±2,1 56 23,2±2,7 129 2,3 37 15,4±2,3 94 2,5

4.0 0,3 - 559 107 19,1±],7 7 6,5±2,4 14 2,0 3 2,8±1,6 7 2,3

- 1.0 0.1 - 573 182 31,8±1,9 28 15,4±3,2 55 2,0 15 8,3±2,0 32 2,1

Таблица 6 - Образование почек и побегов в культуре семяпочек при различной концентрации сахарозы в питательной

Концентрация сахарозы в питательной среде, г/л Число культивированных семяпочек, шт. Число жизнеспособных семяпочек Число семяпочек с почками Образовалось почек Число семяпочек с побегами Образовалось побегов

шт. %±йр всего, шт. %±8р всего, шт. в том числе на 1 семяпочку, шт. всего, шт. %±5р всего, шт. в том числе на 1 семяпочку, шт.

30 240 120 50,0±3,2 117 97,5±1,4 257 2,2 115 95,8±1,8 221 2,0

60 241 98 41,0±3,2 88 89,8±3,0 178 2,0 85 86,7±3,4 163 1,9

90 239 76 32,0±3,0 61 80,3±4,6 125 2,0 59 78,0±4,7 107 1,8

120 240 56 23,3±3,2 39 69,6±6,0 80 2,1 37 66,1±6,3 56 1,5

140 242 29 12,0±2,1 15 51,7±9,3 31 2,1 14 48,3±9,3 21 1,5

Диаметр семяпочек, мм 10,00

0,00

I 30 г/л ЕНШЗ 60 г/л СП 90 г/л

1120 г/л

1140 г/л

концентрация сахарозы

32. Продолжительность культивирования, суг.

Рисунок 6 - Динамика роста семяпочек капусты брокколи сорт Тонус на питательной среде содержащей ТДА в

концентрации 1,0 мг/л и ИУК - 0,5 мг/л.

3.3. Микроклональное in vitro размножение почек и побегов

Микроклональное размножение является необходимым элементом технологии получения растений-регенерантов капусты брокколи. Оно представляет собой мощный инструмент расширения возможностей регенерации тканей и клеток морфогенных образований, полученных из семяпочек. На этапе микроклонального размножения нами была проведена оценка морфогенетической активности фрагментов морфогенной ткани, полученных в культуре семяпочек. При культивировании in vitro они дифференцировались в конгломераты, состоящие из почек и побегов, чья способность к росту зависела от концентрации регуляторов роста в питательной среде.

Вариант, в котором питательная среда содержала ТДА в концентрации 1,0 и ИУК - 0,5 мг/л морфогенная ткань образовала 89% способных к росту конгломератов, на которых, в свою очередь, развивались почки, в среднем, в количестве 4,1 шт., и побеги — до 1,9 шт., в пересчете на 1 конгломерат (табл. 7).

Понижение концентрации ТДА до 0,5 мг/л и ИУК до 0,1 вызвало заметное увеличение морфогенетической активности культивируемой ткани и привело к получению в среднем 98% морфогенных конгломератов. Количество почек и побегов возросло до 0,4 шт. на 1 конгломерат при сравнении с вариантом, где применялись более высокие концентрации ТДА и ИУК.

Вариант, в котором присутствовали регуляторы роста БА - 4,0 мг/л и НУК- 0,3 мг/л отличался образованием 63% морфогенных конгломератов. Это число было ниже, чем в остальных вариантах с регуляторами роста. На каждом конгломерате, в среднем, выявили не более 3,9 шт. почек и 1,9 шт. побегов.

При концентрации БА 1,0 мг/л и ИУК до 0,1 мг/л, наблюдался положительный эффект - развилось около 76% жизнеспособных конгломератов, однако, было отмечено невысокое количество почек (4,1 шт.) и побегов (2,1 шт.) на 1 конгломерат.

В описываемом опыте так же проводилось исследование влияния безгормональной питательной среды MS на развитие фрагментов морфогенных тканей семяпочек, так как гормоны могут вызывать не только морфогенетическую активность, но и повышенный стресс у растительных клеток. Следовательно, на этапе микроклонального размножения полученного материала возникла необходимость установить величину влияния безгормональной питательной среды.

В контрольном варианте - без регуляторов роста, частота образования морфогенных конгломератов была в среднем на 24% меньше, чем в варианте с ТДА, в концентрации 0,5 мг/л и ИУК - 0,1мг/л. Количество почек на 1 конгломерат уменьшилось до 3,0 шт., а побегов - до 1,5 шт. (табл. 7).

Таким образом, опытным путем установлено, что использование ТДА, в концентрации 0,5 мг/л и ИУК - 0,1 мг/л, приводило к образованию максимального числа жизнеспособных конгломератов при максимальном, среди других вариантов, среднем количестве почек и побегов на 1 конгломерат.

Суммарный коэффициент размножения при данном сочетании регуляторов роста и их концентрации имел значение -6,6.

Таблица 7 - Рост фрагментов морфогенной ткани, полученных в культуре семяпочек, в зависимости от использованных регуляторов роста (агаризованная среда МБ, концентрация сахарозы 30 г/л, продолжительность культивирования

28 суток)

Регуляторы роста Число культивируемых фрагментов морфогенной ткани, шт. Получено морфогенных конгломератов Образовалось, шт. Суммарный коэфф. размножения

шт. %±Sp почек побегов

всего в том числе на 1 конгломе рат icero ВТОМ числе на 1 конгломе рат

цитокинин ауксин концентрация, мг/л

Контр< (без регулято эль ров росга) 172 124 72,1 ±3,4 375 3,0 187 1,5 3,2

ТДА 1,0 150 134 89,3±2,5 549 4,1 256 1,9 5,4

ИУК 0,5

ТДА 0,5 146 143 97,9±1,2 644 4,5 325 2,3 6,6

ИУК 0,1

БА 4,0 152 96 63,2±4,0 378 3,9 184 1,9 3,7

НУК 0,3

БА 1,0 147 112 76,2±3,5 457 4,1 231 2,1 4,7

НУК 0,1

Примечание: суммарный коэффициент размножения определяли через отношение суммы образовавшихся почек и побегов к числу культивируемых фрагментов морфогенной ткани.

Транспланты с почками, перенесенные на агаризованную среду, содержащую ТДА в концентрации 0,5 мг/л и ИУК - 0,1мг/л, характеризовались следующей морфогенетической активностью: на 175 изученных трансплантах образовалось 824 почки и 708 побегов, что соответственно составляло 4,7 шт. и 4,1 шт. на 1 трансплант. При этом образование корней не отмечено. На трансплантах, состоящих из ткани и почек, культивируемых на среде с БА, используемым в концентрации 1,0 мг/л и НУК - 0,1 мг/л, образовалось меньше почек и побегов. В пересчете на один трансплант число почек составило 3,4 шт., а побегов 2,9 шт., но при этом наблюдалось и образование корней, число которых в пересчете на один трансплант составило 5,0 шт. (табл. 8).

Таким образом, сочетание гормонов ТДА - 0,5 мг/л, ИУК - 0,1 мг/л было эффективно для размножения побегов-трансплантов in vitro, в то время как, использование 1,0 мг/л БА, 0,1 мг/л НУК - стимулировало корнеобразование при меньшем количестве почек и побегов.

Таблица 8 - Морфогенез при культивировании побегов на агаризованной среде __МБ при разных вариантах регуляторов роста_

Вариант регуляторов роста Проанализировано побегов-трансплангов, шт. Обнаружено морфогенных трансплантов Образовалось побегов, шт. Образовалось почек Образовалось корней

шт. %±Sp всего ВТОМ числе на 1 транс-плант шт. ВТОМ числе на 1 транс-плант шт. в том числе на 1 транс-плант

ТДА 0,5 мг/л, ИУК 0,1 мг/л 175 172 98,3±1,0 708 4,1 824 4,7 0 0

БА 1,0 мг/л, НУК 0,1 мг/л 160 148 92,5 ±2,1 468 2,9 546 3,4 805 5,0

3.4. Получение растений-регенерантов, укоренение и адаптация

Для получения полноценных растений in vitro из побегов требуется стимулирование ризогенеза посредством пересадки растительного материала на питательную среду, содержащую ауксины в определенной (как правило, не высокой) концентрации, либо полное отсутствие регуляторов роста. С этой целью, после размножения, полученные побеги отделяли от конгломератов с почками и морфогенной тканью, и помещали на 3 варианта питательной среды для укоренения.

В варианте с нулевым содержанием регуляторов роста было отмечено 82 % регенерантов с корнями, а количество образовавшихся корней составило 4,5 шт. на 1 регенерант. Корни начинали образовываться на 17 сутки.

Использование в питательной среде 1,0 мг/л БА, 0,1 мг/л НУК приводило к стимулированию образования регенерантов с развитыми корнями до 92%. По сравнению с предыдущим вариантом на 0,6 шт. увеличилось количество корней на 1 регенерант, а срок корнеобразования сократился на двое суток (табл. 9).

На питательной среде содержащей ИУК в концентрации 0,1 мг/л было получено 97% растений-регенерантов. В данном варианте общее количество корней составило 1411 шт. и 6,5 шт. на 1 регенерант. При этом срок необходимый для образования корней составлял 10 суток.

Следовательно, для получения растений-регенерантов с корнями, пригодных для дальнейшего адаптирования в почвенном субстрате, необходимо использовать агаризованную питательную среду MS с концентрацией ИУК 0,1 мг/л.

При адаптировании растений-регенерантов к условиям открытого грунта, необходимо решить проблему по выбору почвенного субстрата, с целью уменьшения риска поражения растений возбудителями болезней и послепересадочного стресса. В опытах по адаптированию полученных регенерантов использовали 2 варианта почвенного субстрата. В варианте, где в качестве субстрата были использованы торфяные таблетке фирмы «Jiffy», число регенерантов адаптированных к условиям световой комнаты составило 78,5-85,5%, а 88,1-93,9% из них было успешно адаптировано в открытом грунте. В специально простерилизованном торфяном субстрате число

адаптированных к условиям световой комнаты растений было ниже и составляло 60,5-68,9%, из них к условиям открытого фунта успешно адаптировали 79,4-87,0% (табл. 10).

Экспериментальные данные свидетельствуют о преимуществе использования при адаптировании растений-регенерантов капусты брокколи к условиям открытого грунта специальных торфяных таблеток.

Таблица 9 - Эффективность укоренения побегов, в зависимости от __концентрации регуляторов роста_

Среда для укоренения Число укореняемых побегов, шт. Число жизнеспособных побегов Число регенеракгов с корнями Число корней, шт. Начало образования корней, сут.

шт. %±5р шт. %±5р всего на 1 регене-рант

без регуляторов роста 228 218 95,6±1,4 179 82,1±2,1 807 4,5 17

БА 1 мг/л, НУК 0,1 мг/л 234 226 96,5±1Д 198 92,6±1,9 1011 5,1 15

ИУК 0,1мг/л 225 220 97,8±1,0 217 98,6±0,8 1411 6,5 10

Таблица 10 - Эффективность адаптации растений-регенерантов в зависимости __от используемого субстрата_

Почвенный субстрат Число адаптируемых растений-регенерантов, шт. Число ад регенеран С1 каптированных тов в почвенном ^бстрате Число регенерантов, адаптированных в открытом грунте

всего, шт. всего, шт. %±5р

Торфяные таблетки для рассады 122 100 82,0±3,5 91 91,0±2,9

Стерилизованный торфяной субстрат 147 95 64,4±3,9 79 83,2±3,8

4. ОЦЕНКА РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ КАПУСТЫ БРОККОЛИ, ПОЛУЧЕННЫХ В КУЛЬТУРЕ ЗАВЯЗЕЙ И СЕМЯПОЧЕК

В результате проведенных исследований было получено 170 растений-регенерантов и 169 семей Я,.

Оценка семей, полученных от растений-регенерантов капусты брокколи, проведенная по морфологическим признакам, показала, что изученные семьи имели плотно сомкнутые головки темно-зеленого цвета и плоской формы. Листья всех проанализированных растений были лировидной формы с усечено-яйцевидной пластинкой и надрезанными, слабоволнистыми краями.

При этом растения трех семей (№1, №5, №8) на 11-19 % превысили

контроль по продуктивности, на 12-18 % по массе центральной головки, на 2,611 % по массе 1000 семян, на 13-19 % по количеству боковых головок и на 511% по массе боковых головок. Скороспелость и срок появления боковых головок у растений семей также превысили контроль на 6,2-14,7 и 0,1-1,6 суток (табл. 11).

В результате проведенных биохимических анализов было установлено, что растения семей Я! по содержанию сухого вещества превысили контроль на 2,26 -3,44%, по аскорбиновой кислоте - от 3,0 до 38,0 мг/%, по моносахарам -на 0,46-0,61%, по ионам калия - на 33,0-39,0 мг/%.

По содержанию фотопигментов, в частности каротина, семьи превышали контроль на 0,14-0,21 мг/г.

По суммарному содержанию антиоксидантов, выраженных в единицах аскорбиновой кислоты, семьи превышали контроль на 1,9-10,15 мг/г, а в единицах галловой кислоты - на 0,37-1,38 мг/г. Также, они на 0,10-0,30% превысили контроль по содержанию сырого белка (табл. 12).

Таблица 11 - Характеристика растений по основным хозяйственно-ценным признакам у наиболее перспективных семей

Семья, № Общая продуктивность, г Средняя масса центральной головки,г Количество боковых головок (среднее по семье), шт. Средняя масса боковой головки, г Период от всходов до технической зрелости головки,сут. Период появления головок 2-го порядка, после срезки центральной, сут. Масса 1000 семян, г

1 306,00 182,00 7,10 17,13 66,90 6,80 3,54

5 327,30 193,60 7,50 18,09 62,40 5,50 3,84

8 249,20 155,00 4,80 14,50 70,90 7,00 2,97

Контроль, сорт Тонус 275,70 163,40 6,30 16,33 77,10 7,10 3,45

НСР„5 10,72 18,92 1,00 1,61 4,91 0,98 0,27

Таблица 12 - Данные биохимического анализа растений капусты брокколи,

2013 г.

Анализируемое вещество, в принятых единицах измерения Образец (семья И,)

1 5 8 контроль, сорт Тонус

Сухое вещество, % 13,94 13,06 12,76 10,50

Аскорбиновая кислота, мг/% 100,32 88,00 123,20 84,48

Фогопигменты, мг/г (сырого вещества) Хлорофилл «а» 0,64 0,97 0,74 0,88

Хлорофилл «в» 0,43 0,51 0,42 0,50

Каротин 0,26 0,32 0,25 0,11

Моносахара, % 1,70 1,65 1,55 1,09

Содержание ионов калия (К*), мг/% 236,90 242,10 235,40 202,60

Суммарное содержание антиоксидантов, мг/г: - в единицах аскорбиновой кислоты

71,76 76,97 80,01 69,86

-в единицах галловой кислоты

8,75 939 9,76 8,38

Содержание белка (на сырое вещество), % 1,95 2,35 2,15 2,05

выводы

1. На этапе введения эксплантов в культуру in vitro использование питательной среды MS, обогащенной ТДА в концентрации 1,0 мг/л, ИУК - 0,5 мг/л и сахарозой - 30 г/л позволяет получать 93 - 97% растущих завязей и 1,31,8% жизнеспособных семяпочек.

2. Использование бутонов, длиной 8,1-9,0 мм для выделения экспланта, который состоит из завязи, не травмированного пестика и фрагментов цветоложа повышает число жизнеспособных завязей до 96%, а семяпочек до 1,8%.

3. Культивирование разросшихся завязей в течение 28 суток обеспечивает рост 65-69% семяпочек, при этом 18-19% семяпочек способны образовывать почки.

4. Культивирование изолированных семяпочек на агаризованной среде MS в присутствии: ТДА в концентрации 1,0 мг/л и ИУК - 0,5 мг/л; а также сахарозы - 30 г/л обеспечивает получение 44-58% жизнеспособных семяпочек.

5. Сочетание ТДА - 0,5 мг/л, ИУК - 0,1мг/л в питательной среде эффективно для размножения побегов in vitro. Использование 1,0 мг/л БА, 0,1 мг/л НУК - преимущественно стимулирует корнеобразование и в меньшей степени образование почек и побегов.

6. Укоренение побегов на среде MS, содержащей 0,1мг/л ИУК, обеспечивает образование 97-99% растений-регенерантов, при минимальном сроке, необходимом для образования корней (10 сут.).

7. Использование торфяных таблеток фирмы «Jiffy» повышает долю адаптированных растений-регенерантов на 6-8% в почвенном субстрате и на 79% - в открытом грунте, по сравнению со специально приготовленным, простерилизованным торфяным субстратом.

8. Семьи растений-регенерантов №8, №5 и №1 поколения Ri существенно превышают исходный сорт Тонус по продуктивности, массе центральной головки, количеству боковых головок, их массе, скороспелости, «ремонтантности», массе 1000 семян, а также по содержанию сухого вещества, аскорбиновой кислоты, хлорофилла «а» и «в», каротина, моносахаров и антиоксидантов и, в дальнейшем, могут быть использованы в селекционной практике.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОЙ

ПРАКТИКЕ

На основании полученных результатов исследований предложен ряд новых элементов технологии получения растений-регенерантов в культуре завязей и семяпочек капусты брокколи.

1. Выделять экспланты необходимо из бутонов длиной от 8,1 до 9,0 мм.

2. Для введения в культуру следует использовать наименее травмированный тип экспланта, состоящий из завязи, пестика и цветоложа.

3. Для индукции морфогенеза изолированных завязей и роста в них морфогенных семяпочек рекомендуется использовать жидкую среду MS, обогащенную ТДА в концентрации 1,0 мг/л, ИУК - 0,5 мг/л с концентрацией сахарозы 30 г/л.

4. Культивировать разросшиеся завязи для эффективного выделения семяпочек следует в течение 28 суток.

5. Растущие изолированные семяпочки пересаживать на агаризованную среду MS, содержащую регуляторы роста: ТДА, в концентрации 1,0 мг/л и ИУК - 0,5 мг/л и сахарозу - 30 г/л.

6. При культивировании жизнеспособных тканей разросшихся семяпочек, а также для стимулирования образования высокого числа почек и побегов следует использовать агаризованную питательную среду MS, содержащую ТДА, в концентрации 0,5 мг/л, ИУК-0,1 мг/л, сахарозу 30 г/л.

7. Укоренение побегов производить на среде MS содержащей ИУК в концентрации 0,1 мг/л, сахарозу - 30 г/л.

8. Адаптирование растений-регенерантов к условиям in vivo проводить с использованием торфяных таблеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Старцев C.B. Совершенствование технологии получения удвоенных гаплоидов брокколи // C.B. Старцев, A.B. Поляков, В.В. Введенский.// Картофель и овощи. М. — 2012. — №5. — С. 24.

2. Старцев C.B. Влияние концентрации регуляторов роста в культуре цветоложа капусты брокколи (Brassica oleraceae var. Italica) // C.B. Старцев, A.B. Поляков.//Вестник Российского университета дружбы народов. М. — 2013 — №2—С.20-26

3. Старцев C.B. Особенности технологии получения двойных гаплоидов, для их дальнейшего применения в совершенствовании селекционного процесса капустных культур // C.B. Старцев, В.В. Введенский.// Инновационные процессы в АПК. Сборник статей IV Международной научно-практической конференции преподавателей, молодых ученых, аспирантов и студентов. - М.: РУДН, 2012.-С.88-89.

4. Старцев C.B. Влияние регуляторов роста и их концентрации на морфогенез микроспор капусты брокколи // С.В.Старцев. //Овощеводство будущего, новые знания и идеи. Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 125-летию со дня рождения Н.И. Вавилова. -М.: ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии - 2012. - С.314-315.

5. Старцев C.B. Усовершенствование элементов технологии получения удвоенных гаплоидов капусты брокколи в культуре завязей и семяпочек// C.B. Старцев, A.B. Поляков // Селекция на адаптивность и создание нового генофонда в современном овощеводстве (VI Квасниковские чтения). Международная научно-практическая конференция (8 августа 2013 г.). Материалы докладов, сообщений./ВНИИО - М.: Изд-во ООО «Полиграф-Бизнес», 2013,- С.297-301.

6. Старцев C.B. Основные этапы технологии получения растений-регенерантов капусты брокколи (Brassica oleracea L. convar. Botrytis (L.) Alef. var. cymosa Duch.) в культуре неоплодотворенных семяпочек / C.B. Старцев // Овощи России. Научно-практический журнал./ - М.: ВНИИССОК - №3 (20) - 2013. -С. 28-29.

Верстка, печать ООО «Полиграф Плюс», ИНН 5032201492 143000, Московская область. Одинцовский район, г. Одиниово, ул. Транспортная, д. 2 Тел.: (498) 595-51-51. тел./факс: (498) 595-54-54. e-mail: poligralok@yandex.ru Подписано в печать 23.10.2013 г. Тираж 100 экз. Гарнитура Times New Roman. Усл. печ. л. 1.0

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Старцев, Сергей Викторович, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОВОЩЕВОДСТВА (ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии)

На правах рукописи

04201364832

СТАРЦЕВ СЕРГЕЙ ВИКТОРОВИЧ

РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ КАПУСТЫ БРОККОЛИ {Brassica oleracea L. convar. Botrytis (L.) Alef. var. cymosa Duch.) В КУЛЬТУРЕ СЕМЯПОЧЕК

06.01.05 - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор A.B. Поляков

Москва-2013

Оглавление

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ..................................4

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................12

1.1. Понятие «гаплоид» и его использование в научных исследованиях и селекционном процессе.........................................................................................12

1.2. Биологическое описание и ботаническая характеристика растений капусты...................................................................................................................14

1.2.1. Характеристика семейства Капустные -Brassicaceae Burnett........14

1.2.2. Характеристика капусты брокколи...................................................16

1.2.3. Географическое распространение видов рода Brassica L...............16

1.2.4. История изучения рода Brassica L....................................................17

1.3. Культура семяпочек и ее использование в селекции сельскохозяйственных растений........................................................18

1.4. Этапы культуры семяпочек и их особенности........................................22

1.4.1. Подбор условий содержания донорных растений и их генетические особенности....................................................................................23

1.4.2. Определение стадии развития экспланта..........................................24

1.4.3. Индукция гаплоидных регенерантов.................................................25

1.4.4. Перевод гаплоидных растений на диплоидный уровень................31

1.4.5. Микроклональное размножение........................................................32

1.4.6. Укоренение растений-регенерантов..................................................34

1.4.7. Адаптация растений-регенерантов....................................................35

2. МЕТОДИКА, ЦЕЛИ, ЗАДАЧИ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ................................................................................................37

2.1. Цель и задачи исследований......................................................................37

2.2. Схема исследований...................................................................................37

2.3. Условия проведения исследований..........................................................42

2.3.1. Почвенные и агрохимические условия проведения исследований42 2.3.2 Погодные условия вегетационных периодов....................................43

2

2.4. Материал и методика проведения исследований....................................46

2.4.1. Исходный материал.............................................................................46

2.4.2. Методика лабораторных опытов.......................................................46

2.4.2.1. Приготовление питательной среды............................................47

2.4.2.2. Приготовление концентратов регуляторов роста.....................48

2.4.2.3. Условия выращивания донорных растений..............................49

2.4.2.4. Подготовка исходных эксплантов (завязей)..............................49

2.4.2.5. Укоренение растений-регенерантов...........................................50

2.4.3. Проведение оценки исходного и полученного в ходе исследований материала.......................................................................................51

3. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ КАПУСТЫ БРОККОЛИ В КУЛЬТУРЕ ЗАВЯЗЕЙ И СЕМЯПОЧЕК..................................................................................54

3.1. Морфогенез изолированных завязей при культивировании in vitro.....54

3.2. Морфогенез изолированных семяпочек в культуре in vitro...................62

3.3. Микроклональное in vitro размножение морфогенных почек и побегов....................................................................................................................74

3.4. Получение растений-регенерантов, их укоренение и адаптация..........88

4. ОЦЕНКА РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ КАПУСТЫ БРОККОЛИ, ПОЛУЧЕННЫХ В КУЛЬТУРЕ ЗАВЯЗЕЙ И СЕМЯПОЧЕК...........................92

4.1. Характеристика растений-регенерантов R( по морфологическим признакам...............................................................................................................92

4.2. Биохимический анализ растений-регенерантов Rj.................................93

ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................................................95

ВЫВОДЫ...............................................................................................................96

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОЙ

ПРАКТИКЕ............................................................................................................97

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.............................................98

ПРИЛОЖЕНИЯ...................................................................................................110

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Сокращенное название Полное название

ГНУ ВНИИО Государственное научное учреждение Всероссийский научно — исследовательский институт овощеводства Россельхозакадемии

БА 6-бензиламинопурин (бензиладенин)

ТДА (Ы-фенил-М'-(1,2,3-тиадиазол-5-ил)мочевина)

ИМК индолилмасляная кислота

ИУК Р-индолил-3-уксусная кислота

НУК а-нафтил-уксусная кислота

2,4-Д 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота

2,4,5-Т 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота

ХФУ 4-хлорфеноксиуксусная кислота

ТХП (пиклорам) 4-амино-3,5,6-трихлорпиколиновая кислота

кинетин 6-фурфуриламинопурин

2ip 6-(-у, у, диметилаллиламино)-пурин

БДС (BDS) питательная среда (Dunstan D.T., Short К.С., 1977)

MS питательная среда Мурасиге - Скуга (Murashige Т., Skoog F., 1962)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Капуста брокколи {Brassica oleracea L. convar. Botrytis (L.) Alef. var. cymosa Duch.) была известна людям более 2 тысяч лет назад. Ее возделывали еще во времена Древнего Рима, а родиной брокколи является южная Италия. Само название этой культуры тоже происходит из итальянского языка (cavolo brocolis) и переводится как «короткие побеги» или стеблевая капуста (Пивоваров В.Ф., 2006).

В странах Западной Европы постоянно увеличиваются площади, занимаемые этой разновидностью капусты, что обусловлено ее преимуществом перед другими разновидностями. Это отмечали еще в начале 20-го века русские ученые-овощеводы (рис. 1).

Головки брокколи содержат 4% метионина, 100-160 мг/% витамина С, а также они богаты сахарами и каротином, содержание которого выше, чем в фасоли, зеленом горошке, перце, яблоках и апельсинах. Кроме того, в головках содержится целый поливитаминный комплекс: витамины А, Вь В2, РР, С, К, соли калия, фосфора, кальция, магния. Брокколи по химическому составу занимает ведущее место не только среди разновидностей капусты, но и среди других овощных культур. Количество протеина в ней превышает его содержание в шпинате, сахарной кукурузе, батате. По наличию незаменимых аминокислот брокколи не уступает говяжьему мясу, а лизина, изолейцина и триптофана — белку куриного яйца. В ее составе находятся антисклеротические вещества, такие как метионин и холин, которые препятствуют накоплению холестерина в организме человека, и замедляют старение. Брокколи богата йодом и применяется при лечении и профилактике лучевой болезни. В ней содержатся флавоноиды (Williamson et al, 1996), селен (Finley et al, 2000), глюкозинолаты (Голубкина H.A. и др., 2010), поэтому ее используют в лечебно-профилактическом питании при лечении онкологических заболеваний, гипо- и авитаминоза, колита, болезни желудочно-кишечного тракта и сердца. Капуста брокколи способствует

выведению избытка желчи. Также она рекомендована при заболевании печени и диабете (Пивоваров В.Ф., 2006).

Рисунок 1 - Площади, занимаемые капустой брокколи и цветной капустой в мире, га: Китай - 446 524, Индия - 369 ООО, Эквадор - 97 547, Испания -

31 169, Мексика - 29 010, Франция - 19 700, Италия - 17 637, Великобритания 16 757, Бангладеш - 16 552, США - 15 150, Россия - 600

(FAOSTAT, 2011 г.)

Селекционная работа с капустой брокколи, в первую очередь, направлена на создание в максимально короткие сроки высокопродуктивных, скороспелых сортов и гибридов. Они должны быть устойчивы к фитопатогенам, пригодны к современным механизированным технологиям возделывания и отвечать природно-климатическим условиям регионов выращивания (Литвинов С.С., 2003; Борисов В.А., 2003).

В настоящее время Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию в РФ, за 2013 г. включает 26 наименований сортов и гибридов F) капусты брокколи. Однако среди них только 10 отечественных: 7 сортов и 3 гетерозисных гибрида. Все из представленных сортов являются отечественными, а большинство гибридов -результат иностранной селекции, причем многие из них принадлежит таким агрофирмам как Syngenta Seeds B.V., Bejo Zaden B.V., Monsanto Holland B.V. Эти данные свидетельствуют о том, что за последние годы возрастает

США

Индия'

интерес к капусте брокколи в целом и ее гетерозисным гибридам в частности (рис. 2,3), а это означает, что существует необходимость в усовершенствовании способов более быстрого получении исходного материала для создания отечественных линий, гибридов и сортов.

61°/<

□ Сорта отечественной селекции

01 Гибриды отечественной селекции

□ Гибриды иностранной селекции

Рисунок 2 - Доля отечественных и зарубежных сортов и гибридов капусты брокколи в соответствии с Государственным реестром селекционных достижений, допущенных к использованию в РФ, за 2013 г.

5 4 3 2

Количество, шт.

о 11 XXI

1986 1 997 199 9 2002 2 003 200 5 2006 2007 2 008 2009 2010 2 011 2012 2013

В Сорта ■ Гибриды

Год включения в Гос. реестр

Рисунок 3 - Общее количество сортов и гибридов капусты брокколи допущенных к использованию, по состоянию на 31 января 2013 г.

Следуя мировым тенденциям российскими селекционерами уже получена в 2012 г. коллекция линий - удвоенных гаплоидов капусты пекинской и капусты белокочанной. На их основе созданы и с 2013 года включены в Госреестр следующие гибриды капусты пекинской: Г| Маркет, Р| Мохито и Бирюза (Баутин В.М., Монахос Г.Ф. и др., 2013).

Целью исследований являлась разработка технологии получения растений-регенерантов капусты брокколи в культуре семяпочек, на основе

оптимизации условий индукции морфогенеза на всех этапах биотехнологического процесса.

Объект исследований — технология получения растений-регенерантов капусты брокколи в культуре завязей и неоплодотворенных семяпочек.

Предмет исследований — бутоны, завязи, неоплодотворенные семяпочки, морфогенные ткани семяпочек, растения-регенеранты капусты брокколи.

Научная новизна работы. Впервые в России получены растения-регенеранты из изолированных семяпочек капусты брокколи. Разработаны элементы технологии культуры завязей и семяпочек капусты брокколи: установлено, что наилучший результат может быть достигнут при использовании для выделения экспланта бутона длиной 8-9 мм.; выявлен оптимальный тип экспланта для введения в культуру in vitro, состоящий из завязи и не травмированного пестика с фрагментами цветоложа, показано, что наилучший рост изолированных завязей происходит на питательной среде MS (Murashige Т., Skoog F., 1962), содержащей тидиазурон (ТДА) в концентрацией 1,0 мг/л и индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,5 мг/л, а так же сахарозу - 30 г/л.

Установлено, что выделение семяпочек из культивируемых in vitro завязей следует проводить на 28 сутки и культивировать их на среде MS, содержащей 1 мг/л ТДА, 0,5 мг/л ИУК, 30 г/л сахарозы.

Показано, что ТДА, используемый в концентрации 0,5 мг/л, ИУК -0,1 мг/л и сахароза — 30 г/л в питательной среде при культивировании морфогенных тканей растущих семяпочек стимулируют образование высокого числа почек и побегов.

Установлено, что наилучший результат при укоренении полученных побегов на среде MS (97-99 % растений-регенерантов), достигается при использовании ИУК в концентрации 0,1 мг/л, а так же торфяных таблеток для рассады в качестве субстрата для адаптации растений-регенерантов к условиям открытого грунта (88-94% адаптированных растений).

Проведенные исследования позволили впервые в России получить из изолированных семяпочек капусты брокколи растения-регенеранты с высоким содержанием питательных веществ, а так же превышающие по большинству хозяйственно-ценных признаков исходный контрольный сорт.

Практическая ценность. Оптимизированные условия культивирования позволяют получать 93-97% растущих завязей, 44-58% растущих семяпочек, 96-98% жизнеспособных конгломератов с почками и побегами, 97% растений-регенерантов. Использование торфяных таблеток на 6-8% повышает число адаптированных растений в почвенном субстрате и на 7-9% в открытом грунте.

Выделены три семьи (№1, №5, №8) существенно превышающие по комплексу хозяйственно-ценных признаков контроль, которые представляют интерес для использования в дальнейшей селекционной работе.

Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были доложены и представлены на IV Международной научно-практической конференции преподавателей, молодых ученых, аспирантов и студентов (ФГБОУ ВПО РУДН, Москва, 2012); Международной научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 125-летию со дня рождения Н.И. Вавилова (ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии, д. Верея, 2012).

Автор выражает глубокую благодарность и признательность научному руководителю - д. б. н., профессору Полякову А. В., заведующему кафедрой генетики, растениеводства и защиты растений аграрного факультета ФГБОУ ВПО РУДН Минобрнауки России к.с.-х.н. Введенскому В.В. за помощь и поддержку в проведении научных исследований.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

• культивирование эксплантов, выделенных из бутонов длиной 8,1-9,0 мм на жидкой питательной среде MS, обогащенной ТДА в концентрации 1 мг/л и ИУК - 0,5 мг/л, сахарозой в концентрации 30 г/л, позволяет получать 97,2% растущих завязей и 1,3% семяпочек;

• завязь, включающая пестик и цветоложе, обладает наиболее высокой морфогенетической активностью (95,1±1,2% растущих завязей и 1,8±0,3% семяпочек);

• применение ТДА в концентрации 1,0 мг/л и ИУК - 0,5 мг/л, для пересадки растущих изолированных семяпочек на агаризованную среду MS обеспечивает наибольшую частоту образования жизнеспособных семяпочек (58,2±2,1 %);

• культивирование морфогенной ткани, почек и побегов, полученных из растущих семяпочек на агаризованной среде MS, содержащей ТДА, в концентрации 0,5 мг/л и ИУК - 0,1 мг/л, сопровождается образованием 9698% жизнеспособных конгломератов с почками и побегами;

• полученные на основе семяпочек капусты брокколи семьи растений-реге-нерантов отличаются высокими товарными качествами: пищевой ценностью, массой центральной головки до 193 г и продуктивностью с куста до 327 г.

Публикации результатов исследований

1. Старцев C.B. Совершенствование технологии получения удвоенных гаплоидов брокколи // C.B. Старцев, A.B. Поляков, В.В. Введенский. // Картофель и овощи. М. — 2012. — №5. — С. 24.

2. Старцев C.B. Влияние концентрации регуляторов роста в культуре цветоложа капусты брокколи {Brassica oleraceae var. Italica) // C.B. Старцев, A.B. Поляков. // Вестник Российского университета дружбы народов. М. — 2013 —№2—С.20-26

3. Старцев C.B. Особенности технологии получения двойных гаплоидов, для их дальнейшего применения в совершенствовании селекционного процесса капустных культур // C.B. Старцев, В.В. Введенский

10

// Инновационные процессы в АПК. Сборник статей IV Международной научно-практической конференции преподавателей, молодых ученых, аспирантов и студентов. - М.: РУДН, 2012.-С.88-89.

4. Старцев C.B. Влияние регуляторов роста и их концентрации на морфогенез микроспор капусты брокколи // C.B. Старцев. //Овощеводство будущего, новые знания и идеи. Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 125-летию со дня рождения Н.И. Вавилова. - М.: ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии - 2012. - С.314-315.

5. Старцев C.B. Усовершенствование элементов технологии получения удвоенных гаплоидов капусты брокколи в культуре завязей и семяпочек// C.B. Старцев, A.B. Поляков // Селекция на адаптивность и создание нового генофонда в современном овощеводстве (VI Квасниковские чтения). Международная научно-практическая конференция (8 августа 2013 г.). Материалы докладов, сообщений /ВНИИО - М.: Изд-во ООО «Полиграф-Бизнес», 2013.- С.297-301.

6. Старцев C.B. Основные этапы технологии получения растений-регенерантов капусты брокколи {Brassica oleracea L. convar. Botrytis (L.) Alef. var. cymosa Duch.) в культуре неоплодотворенных семяпочек / C.B. Старцев // Овощи России. Научно-практический журнал./ - М.: ВНИИССОК - №3 (20) -2013.-С. 28-29.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, условий и методов проведения исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, предложения для использования в селекционной практике, списка использованной литературы (115 наименований, в том числе 69 работ иностранных авторов). Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы, 19 рисунков, 1 приложение.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Понятие «гаплоид» и его использование в научных исследованиях и

селекционном процессе

О гаплоидах и возможностях их использования в с