Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение активности 5-регуляторной области гена 6b из ДНК Agrobacterium Tumefaciens

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение активности 5-регуляторной области гена 6b из ДНК Agrobacterium Tumefaciens"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ии . В - Д.. ЗНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи УДК 577.218

Багян Ирина Левоновна

ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ о' -РЕГУЛЯТОРНОИ ОБЛАСТИ ГЕНА 6Ь ИЗ Т-ДНК ЖЗЙШСТЕНГиМ 7Ч/АЕГЛС1ЕЖ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени хгндздата химических шух

Кокова 1594 г.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологах растений Центра "Вионняенерия" РАН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук, профессор,

члеа-корр. РАСХН К.Г.Скрябин

кандидат биологических наук Е.В.Ревенкова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук А. А. Аграновский

доктор биологических наук Г.А.Романов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной генетика РАН

Зашита состоится »4 г. в /¿и асов ва

заседании диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва» ул.Вавилова, д.32

С диссертацией мсжно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан "

А

894 Г.

Ученый секретарь диссертационного совета. /~72 * кандидат химических наук

А.М.Кршщн

ОБЩАЯ ЫРМСШИСТЖА РАБОТЫ Актуальность , работы. Agrobacterlun tuosfaciens почвенный фиопатоген. вкзнваыщй у растения образование опухоли (корончатого галла) в месте заражения. Механизм образования ОПУХОЛИ Известен В ОбИИХ Чертах (Hooykaas and Schiiperoort, 1992), однако, многое в этом процессе остается пока не вмененным. Фрагмент тл-цлазмяды агробактерии -Т-ДНК - перекосится при явфекцви в клетки растения и интегрируется в ядерный геном. Гены, входящие в состав Т-ДНК, экспре с окружен в растительных клетках. Часть генов Т-ДНК кодирует биосинтез фитогормонов - ауксина и цитокинина, экспрессия зтих генов приводит к образованию опухоли в месте заражения. Кроме того, Т-ДНК должна содержать гены,, продукты которая регулировали бы развитие опухоли. Один из таких генов Снл идентифицирован - ген 5, который регулирует активность ауксина в клетках опухоли скогЪег et ai, 1951). в последние годы стала интенсивно изучаться регуляция активности промоторов генов, входящк в состав Т-ДНК. Было показано, что промотора генов Т-ДНК способны обеспечивать дифференциальную экспрессию репортершго гена в трансгенинх растениях органоспецафгшув и зависимую от стадии развития растения,-для некоторых из этих промоторов било показано, что они способны реагировать на поранение растения и фитогормонн (An et al, 19В8, 1990; Larjgrldge et al, 1969; Koncz and Schell, 1986; Korber et al, 1991; Kononovicz et al, 1992; Matt3Son et al, 3992; Strabala et al, 1993). ВНЯВЛЭНЫ фУВКЦИОНаЛЬНО важные элемента этих промоторов, определяйте их дифференциальную экспрессию (Kononowicz et al, 1992; Neuteboom et al, 1993a; Leung et al, 1991; Guevara-Care la et al, 1993; Ha at al, 1969; Mitra et al, 1990; Kin et al, 3994). Определена Селковне факторы, взашодействунаае с ЭТИМИ цис-элементами (Neuteboom et al, 1993b; lam et al, 1969; Singh et al, 3969, 1990; Fromm et al, 1989; Tokuhisa

et ai, 1990). Такие исследования, во-первых, способствуют пониманию механизмов развития и функционирования опухоли. Во-вторнх, генй^-ДНХ является удобной моделью для изучения

механизмов регуляции генов в растениях, поскольку имеют регуляторные области небольшой протяженности.

Ген бъ является одним из немногих генов Т-ДНК, функция которых пока неизвестна. Выяснено только, что экспрессия гена бъ,особым образом модулирует клеточный рост, и функции . этого гена связаны с рефляцией активности фитогормонов в клетках опухоли (Spanlfer et al, 1969; Tinland.et al, 19B9, 1990, 1992). 5'-регуляторная область гена бъ никогда ранее не изучалась. Мы поставили своей целью изучить регуляторную активность Б'-фяанкируззщей области гена бъ из п-плазмада

Во542 (Hood et al, 1984 ) в ТрЭНСГвННЫХ растениях. Результат

исследования регуляции активности гена бь могут быть полезны при изученж роли этого гена в процессе развития корончатого галла.

Цель работы. 1. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности 5' -фданкирудаей области гена бъ из tl-ДйК рТ1Во542. 2. Изучение активности данной регуляторной области в различиях органах трансгенных растений и сравнение ее с активностью промотора 35S-e. з. Выяснение влияния поранения растения на активность регуляторной области гена бь. 4. Изучение влияния фитогормонов на активность регуляторной области гена бъ.

Научная нозизка и практическая ценность работы-Впервые хслонирована и сехвенирована 5' -регуляторная область гена бь из pTiF^542, являющегося одним из немногих генов функция которого пока неизвестна и регуляция

экспрессии которого никогда ранее не анализировалась. Впервне проведен функциональный анализ 5' -регуляторной

области гена бь. Показано, что она способна обеспечивать

' *

диЗфзранцгальют) экспрессию как в вегетативных, так .и в репродуктивных органах транегеншх растений. Проведено сравнение уровней* экспрессии, обеспечкваакк изучаемой область® и промотором 35s-e в различных органах транегеншх растений. Изучено влияние фнтогормонов на активность 5'-регуляторной области гена &ъ, впервые показано, что эта активность стимулируется ауксиаакл, а такие в ответ на поранение растения. Полученные данные могут быть полезны при

изучения роли гена бь в развитии корончатого галла. Кроме того, 5'-регуляторная область гена Бъ, активность которой нгш охарактеризована, монет быть исшхльзована экспрессии генов в трэнсгенных растениях.

Апробация оасоти. Материалы диссертации бшш представлены на I Всесоюзном симпозиуме "Новпе метода биотехнология растений", Пушно. 1991; на и Российском симпозиуме "Новые методы биотехнология растений", Пущяно, 1893; на 2 Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология". Алма-Ата, 1993; на Конференции "Генетическая ингенерзя и биотехнология", Минск, 1994; на заседании коллоквиума Центра "Еиошгявявряя'' РАБ.

Структура и объем диссертации - Диссертация состоит из .введения; грех глав, выводов а списка литература. Она изложена на / страницах, сод ерзай /рисунков и библногоафяческиЯ список из ^■■¿»ЪшзваштЬ.

ОСНОВНОЕ СОДЕЕЕШН РАБОТЫ

1. Клонирование и секвенирование 5' -Фванкирурдея области гена бь из ГГ-ДЩС рПВо542.

Ко времени начала данной работн в нажй лаборатории бал клонирован в рТ219Р. ВатН! фрагмент 10 п-ДНК рГ1&>542 (7,5 т.н.п.), содержаний праву» часть ть-ДНК (обозначение фрагмента из работн Кошап а1, 1966), и методой блот-гибридизациа по Саузерну было определено положение 5'-конца гена бь относительно УЬа1 сайта (рис. 1а). Была получена серая делеций ХЬа!-ЕашН1 фрагмента с номошьв нукиаазы Ва131, полученные фрагменты (делецишшыэ варианты) были -клонированы в рТ219В и проанализированы с. помощь® блот-гибридизации (Реванкова с соавт, 1993). Меченый зонд был синтезирован на фрагменте рТ1АсЬ5, вклпчашгем 5"-конец гена бь и прздяествуящй ему нетранскрзбируеша участок. Дадеционннй Еариант N5 (рис. 1а,б) фрагмента П-ДНК РГ1Во542, который слабо гибрилизовался с указавши зондом, бнл выбран для дальнейшей работн но поиску 5' -конца гена бь Т1-ДНК рТ1В=542.

Мы перенесла Ecoñi-Hindin фрагмент (рис.10) этого клона длшй около 1.6 т.н.п. в вектор шзюрЮ и определили нукпеотиднуэ последовательность ЕсоИ-конца

фрагмента. Полученную последовательность сравнили с опубликованной последовательностью, промоторной области гена

6Ъ из П.-ДВК PTlAch5 (Glelen et al, 1984). ВЫЯСНИЛОСЬ, ЧТО

последовательность Ecosi-конца клонированного фрагмента tl-днк рт1во542 начинается с tata, блока промотора гена бь. Для того, чтобы клонировать 5"-фланкирующую область гена бъ, прилегаявдэ к atg кодону, был взят более длинный фрагмент tl-днк рИБо542 длиной. около 1,8 т.н.п. - делеционный вариант 4 (рис. 1а), клонированный в ptzi9R (предоставлен Е.В.Ревенишай). Ecofíl-Hindlll фрагмент этого клона . аналогично бал перенесен в вектор шзпрю и секвенирован с Есо81-конца. Полученную последовательность сравнили с соответствует участком опубликованной последовательности tl-ДНК pTiAchS (Gielen et al, 1984). БШЮ обнаружено, ЧТО клонированшгй фрагмент содержит начало кодирующей части гена бь (129 н.п.) и 5' -фланкирующую область (общая длина фрагмента - около 1,8 т.н.п.). На протяжении 220 н.п. перед atg кодоногл последовательности 5'-фланкирующей области гена 6ъ из рт1ш5«" и ptiachs' в' вйсбкой 'степени гомологичны (гомология }, далее область высокой гомологии обрывается. Были найдеш вероятные tata и ссаат блоки промотора гена бь из рПБо542 (по аналогии с pTiAchS). Оказалось, что последовательности ТАТА-блока и ССААТ-блоков pTiAchS совпадают, за исключением одного нуклеотида в tata -блоке

(TATAAGA В рТ1Во542 И ТАТАААА В pTiAch5 ).

2- Пергкесение 5" -фланкирующеи области гена бь рТ1Во542 в вектор для тестирования регуляторнои активности в-растениях.

На основании полученной пата нуклеотидной последовательности Б*-фланкирувщей области гена бь рПВо542 был «тезирован олпгонухлеотид. комплементарный последовательности, прилегающей к atg кодону гена бь (далее 3' -праймер):

5' -CCCATGC-CAATTTTCGTATTTACTACAAAT-3'

а)

BamHl

Xbal

— » ннн

„BamHl

6) Ecolll

HiadlD Hindi!!

J у шц'л'.ют.'.'гта

Pac.l.

а) Схема BamHl фрагмента 10 (7,5 т.п.н.) TL-ДНЕ рГ1Во542 (ноздоставлека "Е.В.Ревенковой). Звездочкой показано положение гонга, содержащего 5'-конец гена бь из рПАсЬЭ и псздиествукзай ему • нетраяскрибгруемнй участок. Стрелкой обозначено кглмвлешге трзнташшшиа гена бь. внизу показано иолояение делеционншс вариантов Xbai-BaEHi фоагмента (7, 4, 5, 3, 17). Делеционнне вахианты n 4 и 5 баяй отелоставлены Е.В.РевевковоЗ для дальнейшего клонирования 5' -фкаккирувдей области гена бь рПБо542. н - сайт узнавания рзстриктазы Hindin.

б) Схека клона N 5, содетаашего делеционшй ватаант 5 Xbai-5aisHi фрагмента tl-днк рТ1Во542 , клонигованнвй в pTZi9E (делеционные вашанты различались по концу^ фланкированное сайтом ЕсоИ).

На 5" -конце этого праймера был предусмотрен. сайт узнавания рестриктазн Ncoi (ссагсс) - для того, чтобы в результате ПЦР создать сайт Ncoi на конце фрагмента регуляторной области гена бъ, прилагающем к atg кодону, это необходимо для встраивания изучаемой регуляторной области перед atg кодоном репортерного гена.

К этому времени в результате совместной работы лаб. молекулярной биологии растений Центра ЧйюиЕкенерия" и группы сбквенировааия и картирования генома человека Института молекулярной биологии методом shotgun онл создан банк фрагментов тх-днк рТ1Во342, клонированных в фаге шзпрю по сайту Saal и секвенированных (Краев. Банников, неопубликованные данные). Определенную нами нукгеогашув

последовательность б'-флашшрувдей области гена бь сравнили с последовательностями этого банка. Таим способом в этом банке был найден клон М13, несущий 826 н.п. 5' -фланкирушей области и часть кодирующей области гена бь (рис.2). Этот клон был ваят для дальнейшей работы. Следует отметить, что протяженность регуляторной области гена бъ неизвестна, а протяженность межгенной области соответствующего участка tl-ДНК рпасьэ (мевду термянирушим кодоном гена oes и atg КОДОНОМ гена 6Ь> составляет 877 Н.П. (Gielen et al, 1984!.

ДНК этого клона использовала в качестве матрицы в ПЦР для амшшфжации фрагмента 5' -флаякируляей области гена бь, праймераш служили описанный выше З'-праймер и обратный праймер на и 13. Электрофоретическа гомогенный продукт ППР обработали рестриктазами ífcoi и Есизбп (изошизомер Sstx, дающий tyvsS конец). Полученный фрагмент ДНК содерешт

JVcoJ

3'—РГ.| coding region —826 < '

V Sin a. J

.1___

jpolylinker M13mpl0 Ec¡ !36 11

Рис.2. Структура клона и 13 из банка последовательностей tl-ДНК рт1ео542. Показано положение з'-праймера (з'-pr.) и обратного праймера (HP), использовавшихся для амшшфакадии посредством ПЦР фрагмента 5'-фланкирующей области гена бъ длиной 826 н.п. (Клон предоставлен А.С.Краевым).

5'-фяашшрувзую область гена бь длиной 82S н.п., нуклеотидная последовательность которой.приведена на рис.3.

На 5'-конце фрагмента имеется сеж нукпеотицов из шлиланхера шзшрю (crcGCCCi. в природной последовательности гена бь из pTiBo542 в положении -1 относительно atg кодона находится нуклеотвд G, который был

заменен на с при создании сайта узнавания Nco I. Никаких других . замен .или дополнительных, последовательностей в изучаемую область при клонировании перед репортерам геном не вводится. Этот фрагмент ДНК был встроен (путем транскрипционного слияния) в соответствующей ориентации в специализированный вектор р«оп755 перед репортерным геном gtiS (Jefferson et al, 1986), ВМвСТО ПрОМОТОра 35S-e (рис.4).

-826

CTCCCCCTCACGATCTCACCGCCAAGCTCTCCACCTCCAAACACCAA

GATCTCAATTTTATCTTTGCCCTTTACGAACAAATCGATACAGCCCCGCC

CAAACCACGCTGTACGGCCGAACGATATAGCTTTTCCCTCTAGCCCACAG

TACTCGTTCCCCAGTCGATTTACGTCGGAGTAAGAATATCGATGTGCCTT

ACACCAACATTGTTCCGTTCATTACAGCGAGACAACTGCATArrCTTGAC

ACCAGAATAGTCTTTCAACCACCCAATCACAACCCCTTCTCCCCATCCGT

TGG'GAATTGAATCAAACTGAACATACTTCTTAACCTCrrCTCTTCTCCAAC

TGCGCTGTCCCAGTAGTCTTGAAGAGAGTCTTGGACGAGACCCGGCCTAA

TACCGACCCCGAGTTCCTGCAATTTTTCCTCACACCAGTGGCGCTCACTG

ATTTCCGTCGTCATTTCTTATTATCACCCCTCTTACCCCCATCCGCCTTA

TATACGGGGCGTAGCGTATACTCACTCCGACAATAACACTGAAATCGTCT •

TTGAAAACGCACCATTTCCCCTCATTGAATCATTTCAACCAGTACCTTTT

GAATTTTAAAAATCAAGTGACCACAAATTGTTAGATCGGCCTAGGCCGAC

TTTTGCGACACATCTGCCCCCCAGCAGCCGAAAATTCAAATCCGCTATTC

-131 -94

MTCCTATCAATCTGTCGTGTTTTTACACGGCATCACACGGTCACCAATG -62

ACGTCAATGCGCATCCTTAGTCAATATAAGAACCAATAGCTCAGACTTAC

■ -1

CACCGGC AGGTATTTGTAGTAAATACGAAAATTGCCat g

Рис.3. Нуклеотидная последовательность Б'-фяанкирупцей области гена бь длиной 825 н.п. Курсивом выделена последовательность от шлилинжеиа шзтрю (стс - от сайта ЕсПЗбП. ССС - от сайта Sml). Еодчешнуты последовательности вероятная ССААТ блоков (-131 я -94) и тт-блока (-62).

- а -

/Votl

Рис.4. Шазмши pi¡on755, несуиая репортерный ген gvs. Исследуемую 5" -фланкирующую область гена бъ (Р-бь ) встраивали в pWon755 вместо Промотора 35s-e < P-35S-e ). gtis - кодирующая область гена ß-глюхуронидазы Е.соИ; nos з • - з'-рогуляторная область " гена нопалинсинтазы A. tu¡aefaclens.

Таким образом, ■ уровень активности gus в тканях тркнсгвнныг растений должен отраяать активность изучаемой регу.чяториой области, под контролем которой находится репортернна ген gvs.

Кассету экспрессии Рбъ-gus-nos 3' вырезала из pfcn755 по сайтам ffoti и встраивали в бинарный вектор ptfonsos в сайт Noil таким образом, чтобы направления транскрипции гена gus и гена apt п были противоположны. Полученная плазмида была обозначена как Рбъ-gus (рис.5). Мы предполагали сравнить регуляторную активность изучаемой 5' -фланкирушей области гена S'D С активностью промотора 35S-e (Monsanto Co., ЕР о 339009 a2 i , который представляет собой усиленный посредством дупликации знхансернсй области вариант иироко используемого для экспрессии вводимых генов в растениях промотора 35S РНК.

вируса мозаика цветной капусты. Мн переклонировали кассету ЭКСПреССШ , РгбЭ-е-йиз-тг 3' КЗ ИСХОДНОЙ ПЛаЗМИЯН рИоп755 в рМоп505 по сайту НоII, . полученная плазмаиа рМоп505: .-РЗЗБ-в-^из-ЙОЗ 3' бЫЛЭ обозначена как .

От Рбь-еиг она отличается только регуляторной областью, стоящей перед геном да .

BKZ - фрагмент плазмвди с широким 1фугом хозяев вкг, содеркащяй сайты инициации репликации и переноса; ог!322 -фрагмент, содержали!? сайг инициации репликации рШ322; яв -правая пограничная последовательность Т-ДНК ртзтз7; nos pîiT37 - ген нопаяшсинтазы ИЗ рПТ37; Tn? Spc/StrK -фрагмент из Тп7, ■ содернашй ген устойчивости к спектиномицину/стрептомицину; apt II - химерный ген неомвдизфосфотрансфетазы и с промотором и терминатором гена нопалинсинтазы из Т-дНК.; Р-бъ б'-фланкарухшя область гена 6Ь; gus- кодирушая часть репортерного гена р-гликуронцдазн Е. coll; nos 3' — 3' -регуляторная область гена нопалинсинтазы Т-ДНК. Стрелками укатано направление транскрипции.

3. Получение трансгенных растения Klcotlana tabacua. несущих репортернця геи- gus под. контролем ■ 5*-регуляторной области г?на бъ, и растений, несущих ген риз под контролем промотора 35S-e.

Рбь-gus перенесли в штамм-помощник A.tuaefaciens B6S3SE

Notl

RK2

яг nos pTiT37

методом трансформации. Присутствие Рбь-gtis в полученных клонах Л.tuaefaciens было подтверкдено методом блот-габршшзаши по Саузерну. Один из зтих xaoscs использовали для трансформации листовых дисков N.tabacua sal. В результате были получены трансгенные растения N. t&bacim, несуше репортерный ген gas под контролем изучаемой б'-фнанкируидей области гена бъ. Аналогичным образом были получены трансгенные растения N.taba сига, несущие ген gas под контролем промотора 35s-e. Присутствие гена gus в геношой ДНК полученных растений подтверждали с помощь® ПЦР. Было отобрано 8 независимых трансфорлантов, несупщ P&b-gus, и 6 независимых трансфоркантов, несущюс 35s-e-gus. Отсутствие агробактериального загрязнения полученных растений подтверждали путем растирания листьев в богатой среде и инкубации при £8° в точеше 2 суток.

4. Определение активности 51-регуляторноя области гена бь в клетках A.tmsafacisns.

Ms ■ определили активность gus в исходном итамке A.twsefaclens E6S3SE ж в штаммах, несущих Рбъ-gus и P35s-e-gus. В клетках исходного штамма активность GUS не была обнаружена; в то же время, и Рбь-gus, и P35s-e-gus обеспечшза.т- высокий -уровень экспрессии гена gus в-A.tuaefacleas - 24 нмольми/ (мин* иг белка) и 2400 вмолЫШ/(кин*кг белка), соответственно. Гены .Т-ДНК, в том числе и ген бъ, имею типичные зукариотические сигналы транскрипции (Gialen et al, 19S4; Depicker et al, 1982; De Grave et al, 1982), 0ДНЗК0 ДЛЯ ПрЭКОТОроВ НвКОТОрЫХ Г6Н0В ИЗ

Т-ДНК (например, генов маннопинсзнтазн, ¡¡¡as (Galvin et al, 1981; Gelvin et al, 19B5; DlRlta and Gelvin, 1967; Henssens et al, 1992 ) было показано, что они работает в A.tussefaciens. Tame было показано (Janssens et al, 1984), что некоторые районы Т-ДНК из рТ1С5в транскрибируется в агробактерзи. Авторы этой работы предположили. что некоторые продукта- генов Т-ДНК, например те, которые вовлечена в биосинтез фнхогормонов, могут участвовать в физиологических процессах, происходящих на ранних стадиях агробактериальной инфекции, до переноса Т-ДНК в растительные клетки. Однако,

п -

вполне возможно, что транскрипция с промотора гена бь в агробактеряи имеет .иное биологическое значение. "Для промотора 35S тоае было показано, что он активен в клетках A.tumsfaclsns (Henssens et al, 1992).

5- Определение активности 5'-регуляторной области гена бь в тнансгеннах растениях N. tabacum (_в первичных трансформантах! и ее сравнение с актизностыз промотора 35S-P..

Мы определили активность cus в молодых (явенальнцх) .шстьях и корнях полученных растений. Было проанализировано 8 независимых траксформэнтов Вь-gvs, и 5 независимых тразсформантов 35S-e-gus. Анализ проводили in vitro, в грубых экстрактах растительных тканей, с использованием флуорогеввого субстрата - 4-mug. Интенсивность флуоресценции 4-Уи измеряли на манифлуоршзтре. Это дало возможность колкчественно оценить уровень гг.спрессиз репортерасго гена. Было обнаружено, что растения бь-^js имеет в среднем в 100 рзз меньший уровень активности: cus в молодых листьях, чем Р'дстенгш 35S-e-gus (0,1-0,5 НМОЛЬ ми/(МИЕРМГ белка) И 9-63 нмодыш/(мин«мг белка), соответственно). В корнях растений Sb-gus активность gus сила в среднем в 30 раз меньае, чем в корнях растений 35S-e-gus (8-18 нмольш/(кин*мг белка) и • Í-2C3-5G0 шюльми/(шщ * мг- белка), соответственно). Ори. зтом. активность gus в корнях растений бь-gus была в 20-80 pao больше, чем в листьях этих растений. Црсмотор 255-е токе обеспечивал более высокую активность сиз в корнях, чем в молодых лгстьях, в сродном в 25 раз. Ветрансформарованше растения N.tabacua SRi не содержали активности gus.

5. Определение влияния поранения растения на активность регуляторной области гена бь.

ранее для промоторов генов nos а аяз была показана стимуляция экспрессии поранением растительной ткаш (An et

al, 1950; Lasgridge st al, 1989; Teari et al, 1969; Gelvln et al, 1994), что 23 -является жожидашгостьэ, поскольку агробактерия способна заражать растение только в месте поранения. Для того, чтобы проверить, имеет ля мосто этот эффект в случае промотора гена бъ, ма провели следуншй

опыт. Листья травсгенных растений (первичных трансформантов, перенесенных в искусственный- грунт и выращенных до стадии 12 листьев) били разрезаны на фрагменты размером около 0,5 см2, которые загем инкубировали в стерильной воде в течение 22 часов. Такая обработка существенно увеличила активность cus по сравнению с исходной в листьях растений. оь-gus - в 3-8 раз (рис.6а). активность gus в листьях растений 35s-e-gus не изменилась в результате подобной обработки.

£20 uaw езо saw

Рис.6. Возрастание активности 5'-регуляторной области гена бъ в ответ "на поранение растения.

а) Возрастание активности gus в листовых эксплантах растений бь-gvs' (вташенннх в искусственном грунте) в результате инкубации их в течение 22 часов в стерильной воде (Vf) по ставнения с исходной активностью gus в листьях (11, 20, 21, 38. 51. 60 - номера независимых трансформаятов).

б) Возрастание активности gus "(за 22 часа) в листьях иастения бь-gus (выращенных m vitro) в результате поранения (w) по сравнения с исходной активностью gus в этих листьях (О). 20 , 38, 45, 60 - номера независимых трансформантов.

По оси ординат - активность gus, нмольми/(шн х мг белка).

В дальнейшем ' мы проверяли, будет . ли наблвдаться подобный эффект, если пораненный лист оставить на растении. В этом экгаерикзнте использовали трансгеннне растения

первого поколения, выращенные in vitro из семян самоопыленных первичных грансфоркаятов. В зрелых листьях этих растения делали по 2 отверстия (вырезали 2 диска), определяли активность cus в этих дисках, а пораненные листья оставляли на растении.. Через 22 часа определяли активность cus в этих листьях. Оказалось, что активность cus в листьях растений бъ-gvs возрастала в ответ на поранение в 1.5-0 раза (рис.60). АКТИВНОСТЬ GUS В ЛИСТЬЯХ растений 35S-e-gUS после такой обработки не изменилась. Таким образом, данные этих двух экспериментов свидетельствуют о стимуляции активности 5' -регуляторной области гена бь в ответ на поранение растения.

7. Изучение влияния фитогормонов на активность регулятошоя области гена бъ.

Как полагает, ген бъ вовлечен в регуляции активности фитогормонов В клетках опухоли (Spanier et al, 1989; Tinland et al, 1989, 1990, 19921. На этом основании МОЖНО предположить, что активность регуляторной области гена бь должна реагировать на изменение концентраций шш соотношения концентраций фитогормонов. Для того, чтобы проверить это предположение, мы поместили фрагменты зрелых листьев трансгенных растений на среду "для 'калл'усообразования' (с высоким соотноиеняем ауксшпцитокиаин - 0,5 мг/л ЮТ, 0,2 мг/л ВАШ. За 6 суток инкубации активность gus в эксшгантах листьев растений бъ-Gus возросла в среднем в 51 раз, а- для 35S-e-GU? - только в 3 раза. Такой анализ был проведен для 8 независимых трансформантов бъ-GUs и 5 независимых трансформантов 35S-e-cus.

Мы поставили своей целью выяснить, обусловлен ли подобный стимулируший эффект каким-то одним из этих фитогормонов (и каким именно), или se определяющее значение имеет их соотношение (соотношение ауксин; цитокинин), а такяе выяснить, будут ли оказывать влияние другие ауксины и цитокининн. Для этого мы провели серив экспериментов, заключавшихся в следущем; фрагменты листьев ■ трансгенных растений (первичных трансформантов), выращенных в искусственном грунте, помешали в водные растворы, содержащие

ауксины и/ияк цитокинины в различат: концентрациях. Все использовавшиеся концентрации входят в диапазон рабочих концентраций различных фитогормошз (каталог "Siffma. Plant cell culture.". 1990) - концентраций, ИСШЛЬЗуЮИХСЯ При культивировании клеток и тканей растений. Контрольные диска инкубировали просто в стерильной воде, чтобы учесть вклад поранения листьев в усиление экспрессии. Определяли активность cus в листовых эксплангах до и яосле инкубации. Таким способом было проанализировано 3 независимых трансформанта бъ-g-us и 3 независимых трансформанта 25S-e-gus. Было обнаружено, что активность регуляторной области гена бь существенно стимулируется ауксинами - КУК, ЕУК к 2.4-Д, причем эффект зависит от т^па ауксина. Природный аукснн ИУК вызывает наименьший среди опробованных ауксинов эффект - обработка ICteKM раствором КУК вызывает увеличение акгкввости gus в средаэм в 1.8 раза, {¿ашзм&кьшй эффзкт вызывает 2,4-Д - обработка 10мкМ раствором 2,4-Д вызывает увеличение активности в средам в 7 раз, ШК в той не концентрации вызывает промежуточный эффект. Цетокиниш в использовавшихся наш концентрациях (1, 2 и 10мкМ БАЛ; 1 е IOkkM кинетин) не оказывали такого заметного влияния на активность регуляторной области гена 5ъ. Растворы, содериакие и дагокининн, и. ауксины одновременно, вызывали эффект, который определялся количественно содержанием ауксина. Активность gus в листьях растений 35s-e-gus не изменилась в результате такой обработки.

Характер той регуляции активности фитогормзвов в клетках опухоли, в которой участвует ген бъ, в настоящее время неизвестен. Изучение зависимости активности регуляторной области гена 6ъ от концентрации фитогормонов может помочь ответить аа зтот вопрос. Ддя того, чтобы более подробно изучить зависимость активности регуляторной области гена бъ - от концентрации ауксинов, выяснить, оказываю? ли . влияние цитокинезы , взятые в других концентрациях, чем в предыдущем анализе, и определить, влияю: ли цитокинины на эффект ауксинов, мы провели анализ, аналогичный описанному выше, но с использованием растворов

фитогормонов. указавши в подписях к рис.7 и 8. Результаты этого анализа показаны на рис.7 и 8. Исследование, проведенное для 3 независимых трансформантов бь-gus, выявило одинаковую картину: ауксины существенно увеличивают активность регуляторной области гена бъ, причем повышение концентрации ауксина увеличивает эффект. Наибольший эффект вызывает (как было показано и в предыдущем анализе) 2,4-Д. Шетокинжш, взятые в отдельности, не оказывают влияния на активность регуляторной области гена бь, однако цитокинин ВАЛ немного (до полутора раз) усиливает эффект ауксина НУК (рис.8).

Поскольку для ауксинов ствмулируший эффект зависел от типа ауксина, мы решили проверить, не оказывают ли влияние другие цитокянины (природные цизокининн транс-зеатин и изопентениладенин), в отличие от исследованных ранее, на активность регуляторной области гена бъ. этот анализ провели для трех молодых растений бь-gus первого поколения, вырашенных in vitro■ из сеиян самоопыленных первичных трансформантов. Мы использовали в анализа минимальные, промежуточные и максимальные концентрации фятогормонов из 'диапазона рабочих концентраций этих фятогормонов. существенных изменений в активности регуляторной области гена бъ под действием цитокинезов нами не было обнаружено.

Ранее другими исследователями была показана зависимость от фнтогормонов активности промоторов других генов из Т-ДНК

- nos (An et al, 1990!, nas (Langridge et al, 1969; Leung et al, 19911, и гена 5 (Koncz and Schell, 1986; Korber et al, 1995 ). Как и в напем исследовании активности 5' -регуляторной области гена бь, при исследования промотора гена поз было показано (An et ai, 1990), что его активность возрастает под действием ауксинов, эффект зависит от типа и концентрации, ауксина; цптокининн не оказывает существенного влияния на активность этого проютора. В результате исследования влияния фатогордоноз на активность промотора гена ms lLangridge et al, 19691 ВЫЯСНИЛОСЬ, ЧТО ОНЭ СТИМуЛИруеТСЯ воздействием как ауксина (КУК), так и цнтокинина (БАЛ), однако эффект ауксина ваше. Увеличение концентрации ауксина

nmolMU/(min i mg pr.)

21

nmoUTO/fmin s mg pr.)

45

ninolMU/(miii x mg pr.)

Рис.7. Определение

концентрационной зависимости влияния фитогормонов на активность 5'-регуляторной области гена бь. На отдельных диаграммах показаны данные, полученные при анализе трех ■независимых трансформантов бъ-ffus - с номерами 38 , 45 , 21. о - активность cus в эксплантах листьеЕ до инкубации, w -активность gus в эксплантах после инкубации в стерильной воде. кз, к2, вз, £2, N1-N3, D1-D4 - активность gus в эксплантах после инкубации в водных растворах фитогошонов: К1 - 0,1 мг/л кинетин; £2 - 5,0 мг/л кинетин; bi - 0,1 мг/л БАЛ; В2 - 5,0 мг/л БАЛ; N1 -0,1 мг/л ЕУК; N2 - 2,0 мг/л НУК; мз - 5,0 мг/л КУК; Di -0,1 мг/л 2,4-Д; D2 - 0,5 мг/л 2,4-Д; D3 - 1.0 мг/л 2,4-Д; D4 - 5.0 мг/л 2,4-Д. По оси ординат - активность gus, нмольмиДмин х мг белка).

21

45

nmolMTJ/(mm x mg pr.)

38

!ii«ol)ÍU/(min x mg pr.)

Рис.8. Зависимость активности 5'-тегуляторноЗ области гена бъ от ' фйтогормонов, взятых в различных гсонцентрациях: nbi -Ffi + Bl (0,1 мг/л НУК; 0,1 мг/л БАЛ); nb2 - n2 + 21 (2,0 мг/л КУК; 0,1 мг/л БАШ; NB3 - N3 + В1 (5,0 мг/л НУК: 0,1 мг/л БАЛ). Остальные обозначения те se, что на рис.7. По оси абсцисс - концентрация фитогорюнов, мг/л. По оси ординат - активность gus, шолъмиДмш х мг бежа).

- IB -

ведет к увеличению активности промотора гена aas. Для промотора гена 5 бнло показано .что его активность зависит от соотношения ауксиягцитокишш, увеличение' этого соотношения увеличивает активность промотора, а уменьшение - снижает (Koncz and Schell, 1986), эффект зависит как от типа, так и ОТ концентрации ауксша (Korber et al, 1991 ). Выяснение того факта, что активность промотора гена 5хобратимо индуцируется увеличением соотношения ауксингцигокишн в среде, помогло понять роль гена 5 в развитии корончатого галла - было установлено, что функция этого гена заключается в модулировании ответа клеток опухоли на ауксин путем авторегулируемого синтеза антагониста ауксша в ответ на повышение концентрации ауксина в клетке. Таким образом осуществляется регуляция активности ауксина в клетках корончатого галла (Korber et ai, 1993 ). Авторы этой работы высказали предположение, что ген бъ выполняет сходнув функции в отношении цшгокишнов. Наши данные не подтверждаю этого предположения, поскольку в нашем анализе активность регуляторной области гена бь не изменялась в ответ на на изменение концентрации цитоканинов. Однако, опровергнуть это предположение на основании наших результатов мы не можем, поскольку не исследовано влияние продукта самого гена бъ на активность регуляторной .области этого гена и его взаимодействие с активность» ауксина и цитокинина. В то ив время, наш данные согласуются с высказанным другими исследователями (Tinland et al, 1990) предположением о том,, что роль гена бъ в клетках корончатого галла заключается в уменьшении ингибирущего эффекта высоких концентраций ауксина, продуцируемого в клетках опухоли, на рост этих клеток.

^ 8- Определение органоспецифичной активности 51 -регуляторной области гена бъ в проростках■

Мы проанализировали активность gus в 40-даевных проростках, выращенных на среде с канамицином из семян самоопыленных первичных трэнсформантов (в анализ брали по 30 проростков от 6 первичных трансформаятов бь-gus и 5 35s-e-gus). Активность gus определяли в корнях, гипокотилях

и семядолях проростков. Для проростков бь-gus максимальная активность наблюдалась в корнях - в среднем в 17 раз большая, чем в семядолях, л в 70 раз большая, чем в гипокотилях, где была минимальная активность. В проростках . 355-е-gus наблюдался иной характер экспрессии - максимальная активность была такяе в корнях, но, в среднем, только в полтора раза большая, чем в семядолях, и в 20 раз большая, чем в гипокотилях.

9. Определение активности 5' -рзгуляторной области гена 6Ъ в вегетативных органах трансгенных растений первого поколения и ее сравнение с активностью промотора 35S-e.

Мы проанализировали активность gus в различных органах трансгенных растений первого поколения, выращенных т vttro из семян самоодыдешшх первичных трансформантов до стадии 12 листьев. Было проанализировано 8 независимых трансформантов бь-gtis а 6 независимых трансформантов 35s-e-gv.s. Результаты приведены на рисунке 9. Было обнаружено, что 5'-регуляторная область "гена бъ обеспечивает наибольшую активность gus в корнях, наименьшую - в листьях (активность в корнях на два порядка больше, чем в верхних листьях; в среднем в 50 раз больше, чем в средних листьях, и на порядок больше,"чем в'стйрых листьях): 'Стебли-содераат промежуточное значение активности cus. мы обнаружили базипетальный градиент активности gus в растениях бь-gus - возрастание активности cus от верхушки к основанию растения. Такой градиент активности наблюдался и в листьях, и в стебле. Его нельзя объяснить просто накоплением активности gus в более старых частях растений, поскольку этого градиента не было обнаружено в растениях 35s-e-gus.

Промотор 35s-s обеспечивал иной характер экспрессии. Наибольшая активность наблюдается в корнях, однако, она в среднем только в 15 раз больше, чем в молодых листьях. Базппетапьного градиента активности не наблюдалось; напротив, в _ молодых листьях уровень активности промотора 35s-e выше, чем в зрелых и старых листьях и чем в стебле.

Сравнение активностей 5"-регуляторной области гена бь (Р6Ь) и промотора 355-е (P35s-ei показывает, что в молодых

120

100

80

nmolMU/(min x mg pr.)

35S-e-gus

a

40

20

0

I

й 1

s 1

!

ш 1

i Si i ll tí ■

1 I ti h | 11

L1L2L3

S1S2 S3

gus в различных

L1L2L3

SI S2 S3

Рис. 9. Средние значения активности органах растении бь-gus и 35s-e-gt¡s. Li - молодой лист (1-й сверху, 2,5-3,5 см миной), L2 -зрелый ласт (5-й или 6-й сверху, 4,5-6,5 см длиной), L3 -старый лист (12-й лист, 3-4 см длиной). si, S2, зз - секции стебля, взятые из мевдоузлий под листьями с соответствушами номерами, в - корни (корни орали для анализа целиком). По оси ординат - активность tus, имольии/(мин х мг белка).

листьях Рбь обеспечивает в среднем в 60 раз меньший уровень экспрессии, чем P35S-e, в средних листьях - только в 6 раз меньший, а в нижних листьях рьъ обеспечивает примерно тот же уровень экспрессии, что и P35s-e. в корнях активность РбЬ в среднем..в 7 раз меньше, чем активность P35s-e. в верхней части стебля Рбь и P35S-e обеспечивают примерно одинаковый уровень экспрессии, однако в средней и нижней частях стебля Рбь более активна, чем P35S-e, в среднем в. 4 и 3 раза, соответственно.

Значения активности eus в листьях, показанные на рис. 9. соответствуют активности eus в листовых пластинках. Для-зрелых листьев мы определили активность gus и в других частях листа - в срединной жилке и в черешке. Оказалось, что зрелые листья растений бъ-gus имеют наименьшую активность в листовых пластинках, в срединных килках - в среднем в 5 раз большую активность, и еще в 2 раза большую активность - в черешках. Таким образом, рагуляторная область гена еъ более активна в органах, богатых проводящими тканями. Поскольку мы не проводили гистологического определения активности gus, мы не можем утверждать, что именно в проводящих тканях эта активность максимальна. Другими авторами для аукеш-регулируемнх промоторов генов ms и гена '5 было показано, что они наиболее активны < в клетках флоэмы

(Guevara-Garcia, 1993; Korber et al, 1991). ВЫЛО ВЫСКаЗЭНО предположение, что, поскольку транспорт ауксинов в растении происходит ПО фшоэме (Davies P.S., 19671, ЭТО, ВОЗМОЖНО, И определяет высокую активность ауксин-регулируемых промоторов В ЭТОЙ ткани (Korber et al, 1991).

Обнаруженное наш распределение активности 5' -регуляторной области гена бъ в различных органах трансгенных растений сходно с характером активности других аукспв-стимулируекых з индуцируемых поранением промоторов генов Т-ДНК - гена nos (An et al, 1988! И ElâS (Langridge et al, 1989, Guavar a-Garcla et al, 1993 1. ПрОМОТОрЫ ГенОВ DOS И

cas токе наиболее активны в корнях трансгенных растений. Для них, как и для гена бъ, в надземных органах - стебле и листьях - характерен базипетальный градиент активности

- z2 ~

(возрастание активности от верхушки растения к основании). Таким образом, активность этих промоторов минимальна в верхушке побега, хотя именно верхушка побега является местом синтеза ауксина в растении (Полевой и Салматова, 1991). Исследователи, занимавдиеся изучением промотора mas, показали <laogridge et al, з9В9), что в верхушке побега, синтезируется вещество, ингибирующее индукцию ауксинами активности isas-промотора. Это вещество транспортируется сверху вниз по стеблю, что, как полагают авторы работы, и определяет Оазипетальный градиент активности ms-промотора.

Агробактерия является почвенным фитопатогеном, заражающим растение в месте поранения, tomo предположить, что характер дифференциальной активности промоторов генов Т-ДНК - наибольшая активность е корнях и нижних частях растений - обусловлен тем, что эти части растения являются наиболее вероятным местом заранения агробактерией в природных условиях. В природе инфекция обычно локализуется на границе корня и стебля," у корневой шейки (коронки) растения (неслучайно название - "корончатый галл").

10. Определение активности 5'-регуляторноя области гена бъ в цветах -

Мы проанализировали активноегь cus в различных органах ' ' цветков трансгенных растений" - первичных трансформантов-, выращенных в искусственном грунте. Иы определили активность cus в венчике, тычинках, завязи, столбике ж рыльце, чашелистиках, а такие, для сравнения, в первом от соцветия листе, для 7 независимых трансформантов бь-gus и 6 независимых трансформантов 35s-e-gus. Для анализа брали но 3 цветка с каждого растения на 1-2 день после начала пиления. Выло обнаружено, что 5' -регуляторная область гена бь обеспечивает высокий уровень экспрессии репортерного гена в различных органах цветков; наибольшую - в венчике, в тычинках и в столбике/рыльце - в среднем в 2. раза ниже. Уровень активности gus в чашелистиках близок к активности в верхнем листе, и на порядок вше, чек в венчике. Активность Рбъ в завязи едва детектировалась. Промотор 35s-e в цветках менее активен, чем в верхних листьях. Другими

исследователями для промоторов генов nos и ms также было показано, что они обеспечивает высокий уровень экспрессии в цветках (An et al, 19В8; Langrldge et al, I9S9).

Таким образом, нами охарактеризована активность 5' -регуляторной области гена бъ, одного из немногих генов Т-ДНК, 5'-регуляторная область которого не изучалась ранее. Эти данные могут быть полезны при изучении роли гена бъ в индукция опухоли. Кроме того, 5'-регуляторная область гена бъ может быть использована для экспрессии генов в трансгенных растениях.

вывода

1. Клонирована и секвенарована 5' -фланкирующая область гена вЪ из TL-ДНК рПВо542 (826 Н.П. ).

2. Показано, что изучаемая регуляторная область гена бъ обеспечивает дифференциальную экспрессию репортерного гена sus как в вегетативных, тек и в репродуктивных органах трансгенных растений Nicotiana tabaсит. Максимальный уровень экспрессии обнаружен в корнях, показано возрастание

.активности регуляторной области гена Бь от верхуташ растения к основанию. .....

3. Проведено сравнение активности 5' -регуляторной области гена бъ и промотора 353-е в различных органах трансгенннх растений. Показано, что в верхних и средних листьях и в корнях регуляторная область гена 6v> обеспечивает существенно меньшей уровень экспрессии, чем промотор 35s-e, в низших листьях и в верхней части стебля эти уровни примерно одинаковы, а в средней и нижней частях стебля регуляторная область гена бъ обеспечивает более высокий уровень ЗКСПрСССИИ, чем ПрОМОТОр 353-е.

4. Показало усиление активности регуляторной области гена бъ в ответ на поранение растения.

5. Исследовало влияние различных ауксинов и цатокининов на уровень экспрессии, обеспечиваемый регуляторной областью гена бь. Показано усиление экспрессии в ответ на обработку ауксинами и зависимость этого эффекта от типа и концентрации ауксина.

Результаты диссертации изложены в следующих статьях и докладах:

1. Ревенкова Е.В., Дорохов Д.Б.. Багян И.Л., Краев A.C., Скрябин К.Г. -Исследование структуры TL-ДНК плазмиды pTiBo542.-Тезисы I Всесоюзного симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", Бупщно, 1991, с.36.

2. Ревенкова Е.В., Багян И.Л.. Краев A.C., Скрябин К.Г. -Исследование структуры Т-ДНК плазмиды рГ1Во542.-Молекулярная биология, 1993, т.27, вып. 1, с.58-63.

3. Багян Й.Л., Ревенкова Е.В., Краев A.C., Скрябин К.Г. -Клонирование и определение промоторной активности 5' -фланкирушцей области гена бъ из tl-днК рт1во542. -Тезисы и Российского сЕмпозаука "Новые методы биотехнологии растений", Бущино, 1993, с.10.

4. Багян Й.Л., Ревенкова Е.В-, Краев A.C., Скрябин К.Г. -Изучение работы 5'-фланкирующей области гена бь из Т-ДНК A.tiuaefaciens, участвующего в регуляции баланса фитогормонов^-Тезисы' 2 Меадународной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология", Алма-Ата, 1993, с.84.

5. Багян й.Л., Ревенкова Е.В., Краев A.C., Сюэябин К.Г. .-Определение . . вдиящя „фитогормонов . на активность 5' -регуляторшй области гена бъ из Т-ДНК А. tumstö.clens.-Тезисы конференции "Генетическая инженерия и биотехнология", Минск, 1S94, с.6.

6. Багян И.Л.. Ревенкова Е.В., Краев A.C., Скрябин К.Г. -Функциональный анализ 5' -фданкируицей области гена бъ из TL-ДНК рТ1Во542 в трансгенных растениях табака.-Молекулярная биология, 1994, т. 28, вып.4, с.744-751.