Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональное изучение генов биосинтеза феназиновых антибиотиков у ризосферных псевдомонад

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональное изучение генов биосинтеза феназиновых антибиотиков у ризосферных псевдомонад"

на правах рукописи

БИОСИНТЕЗА ФЕНАЗИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ У РИЗОСФЕРНЫХ ПСЕВДОМОНАД

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации ка соискание ученой степени кандидата биологических, наук

Москва - 1996

Работа выполнена в лаборатории биологии плазмид Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Научные руководители: член-корреспондент РАН

A.M. Воронин;

кандидат биологических наук

B.Н. Ксензенко

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук, профессор Я.И. Бурьянов; доктор химических наук, профессор С.Н. Кочетков

Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится " "_г. в_час. на заседании

Специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, по адресу: 117984, Москва, ГСП-1, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Автореферат разослан " "_ 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

A.M. Крицын

Актуальность темы. Отличительной особенностью бактерий рода Pseudomonas является способность продуцировать широкий спектр веществ, называемых "вторичными метаболитами", среди которых присутствуют антибиотически активные соединения (Budzikiewicz, 1993). К числу последних относятся феназиновые пигменты азотсодержащие гетероциклические соединения с широким спектром антибиотического действия по отношению к бактериям и грибам. Способность некоторых бактерий синтезировать феназиновые пигменты известна микробиологам давно и использовалась в традиционной систематике микроорганизмов как важный таксономический признак (Balow et al., 1992). В ранних работах было показано, что феназины представляют собой побочные продукты биосинтеза шикимовой кислоты, однако детали отдельных реакций, а также генетический контроль процесса их биосинтеза до недавнего времени оставались неисследованными (Leisinget, Margraff, 1979). Существует несколько моделей для обьяснения антибиотического действия феназинов, включая ингибирование репликации ДНК, нарушение функционирования электронтраиспортной цепи и мембранного транспорта (Бриттон, 1986).

Целый ряд данных свидетельствует о том, что соединения феназинового ряда оказывают существенное влияние прежде всего на конкурентноспособность бактерий-продуцент&в в окружающей среде (Mazzola et al., 1992). Показано, что комплекс феназиновых пигментов, продуцируемых ризосферными псевдомонадами, ингибирует развитие фнтопатогенных грибов. Поэтому в последнее время предпринимается все больше попыток использовать такие штаммы в биоконтроле заболеваний сельскохозяйственных культур (Cook et al., 1995).

Таким образом, изучение пути биосинтеза феназинов и генетического контроля этого процесса представляет несомненный интерес с точки зрения выяснения молекулярных механизмов регуляции и эволюционирования подобных генетических систем у микроорганизмов. С практической точки зрения эти исследования обеспечивают возможность селекции природных штаммов и создания трансгенных ризосферных бактерий для осуществления биологического контроля и борьбы с цельм рядом заболеваний растений.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось проведение подробного структурно-функционального анализа генетического локуса, контролирующего биосинтез феназин-1 -карбоновой кислоты у Pseudomonas fluorescens 2-79.

Исходя из этого, в работе последовательно ставились следующие конкретные задачи:

1) Картировать область генома штамма Р. fluorescens 2-79, содержащую генетический

локус биосинтеза феназин-2-карболовой кислоты.

2) Определить нуклеотидную последовательность генов биосинтеза феназин-1-карбоновой кислоты.

3) Изучить роль отдельных структурных генов в продукции феназин-1-карбоновой кислоты и ее интермедиатов.

4) Подобрать высокоспецифичные зонды для обнаружения природных и трансгенных бактерий-продуцентов феназинов.

Новизна результатов. Полученные в ходе данной работы результаты носят приоритетный характер. Впервые определена нуклеотидная последовательность генов phz, контролирующих биосинтез феназин-1-карбоновой кислоты у Р. fluorescens. Анализ секвенированного фрагмента ДНК выявил ряд интересных особенностей организации оперона структурных генов, в частности высокую гомологию генов phzA и phzB. На основании анализа продукции феназин-1-карбоновой кислоты в клетках Е. coli, содержащих клонированные гены phz, а также в мутантных штаммах Р. fluorescens, предложена схема пути биосинтеза антибиотика. Показано, что гены, контролйрующие биосинтез феназинов у различных видов псевдомонад, гомологичны друг другу.

Практическое значение работы. Несмотря на то, что настоящая работа относится к числу фундаментальных исследований, данные, полученные в ходе этой работы, могуг найти применение как при селекции более эффективных природных штаммов-продуцентов для последующего их использования в биоконтроле, так и при создании трансгенных бактерий с заданными свойствами. Необходимо подчеркнуть, что широкомасштабное применение трансгенных штаммов бактерий связано прежде всего с проблемой точного прогнозирования и осуществления наблюдения за поведением генетически модифицированных микроорганизмов в окружающей среде. В ходе работы подобраны высокоспецифичные олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонды, позволяющие детектировать гены биосинтеза феназинов у природных бактериальных изолятов из ризосферы растений, а также у других видов псевдомонад. Это дает возможность быстро и эффективно идентифицировать штаммы-продуценты феназинов с помощью таких чувствительных методов как ПЦР и ДНК-ДНК-гибридизация в ходе

изучения продукции феназиновых антибиотиков в почве и гюпуляииошюй динамики соответствующих микроорганизмов в ризосфере растений.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на международных конференциях "Pseudomonas 1995" (Tsukuba, Japan, 1995 г.) и "Molecular Genetics of Bacteria and Phages" (Cold Spring Harbor, USA, 1996 г.), а также ежегодной сессии Ученого Совета ИБФМ РАН, посвященному подведению итогов конкурса научных работ (Пущино, 1994 г.).

Публикации. Основное содержание работы изложено в трех статьях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 4 таблицы. Список цитируемой литературы включает 138 источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Картирование генов, контролирующих биосинтез феназин-1-карбоновой

кислоты.

Ранее на основе космидного вектора pLAFR3 была сконструирована клонотека генов штамма 2-79 P. fluorescein - продуцента феназин-1-карбоновой кислоты. Для дальнейшей работы была отобрана рекомбинантная космида pPHZ108A, содержащая Н/л<ЛП-5яотШ-фрагмент ДНК размером 12 т.п.н., введение которой в клетки P. fluorescens, дефектных по синтезу феназинкарбоксилата, приводило к восстановлению способности продуцировать данный антибиотик (Thomashow, Weller, 1988). Рестриктазное картирование проводили параллельно с мутагенезом данного фрагмента ДНК с помощью транспозона Tn3-lacZYA, который несет в своем составе репортерный ген ¡acZ и представляет собой удобный инструмент для изучения транскрипционной активности исследуемого генетического локуса. Результаты анализа, представленные на рис.1., показывают, что инсерции транспозона, нарушающие биосинтез феназинкарбоксилата, расположены в пределах двух единиц транскрипции размером соответственно 6,0 т.п.н. и 0,75 т.п.н.

Вг/II Есо\1\ Bgnl ЕсоШ ЕсоШ

АЛ

в?т аг1 лм

®Ш1

рйг/ рАгй

О 1

р/цЛ р!цВ ркгС ркгО

рНгЕ

ркгР />йгС

7 8 _|_1_

9 т.п.н.

I

Рис. 1. Схема организации генов, контролирующих синтез феназин-1-карбоновой кислоты у штамма Р.Аиогезсегя 2-79. В верхней части рисунка приведена рестрикционная карта, в нижней - шкала измерений (в т.п.н.). Стрелками отмечено положение генов и направление их транскрипции. Символами обозначены положения инсерций транспозона Тп3-!ас2УЛ, при которых наблюдается или не наблюдается (? ) экспрессия репортерного гена. Расположение предполагаемого терминатора транскрипции (Ц) показано между генами рИх! и рИгК.

О

2, Определение и анализ нуклеотидной последовательности ДНК.

В ходе работы была определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК штамма 2-79 общей длиной 8505 п.н., содержащего полный генетический локус, контролирующий синтез феназин-1-карбоновой кислоты (номер в базе данных GenBank -L48616). Компьютерный анализ выявил наличие в составе данного фрагмента девяти открытых рамок считывания (ОРС), обозначенных как phzABCDEFG, phzl и phzR, образующих соответственно три транскрипционные единицы (рис.1). На каноническом расстоянии перед каждой ОРС имеются последовательности Шайна-Дальгарно. Пары генов phzD-E иphzF-G перекрываются в области терминирующего кодона первого гена и инициирующего кодона второго, что может служить указанием на то, что эти гены кодируют субьединицы одного фермента. Между генами phzl и phzR обнаружена последовательность ДНК, имеющая характерные признаки терминатора транскрипции. С помощью системы "промотор/РНК-полимераза фага Т7" показана экпрессия всех генов из локуса phz в клетках Е. coli. Молекулярные массы всех синтезируемых белков оказались близкими к расчетным (Рис.2,3).

к'Да 1 2 3 4 5 6 7

94,0 -> . , ,

67,0-> ff Щ

43,0 -> i i

30.0 ->

20.1

14,4->

Рис. 2. Экспрессия генов phzABCDEFG в системе в системе '"'РНК-полимер аза/промотор фага Т7". Белки, кодируемые генамиphzABCD (дорожка 2), phzAB (дорожка 3), phzCDE (дорожка 4), phzCDEFG (дорожка 5), phzCD (дорожка 6) и phzG (дорожка 7), метили [3!S] в условиях индукции синтеза РНК-полимеразы фага Т7 и анализировали в 10%-ном полиакриламвдном геле, содержащем 0,1% додёцилсульфата натрия с последующей радиоавтографией геля. Дорожка 1 - анализ белков, синтезируемых в тех же условиях в клетках К coli, содержащих векторную плазмиду рТ7-6.

А)

кДа

1 2

Е)

кДа

94,0 -> 67,0 43,0 ->

30,0 ->

20,1 ->

94,0 —> 67,0-» 43,0-»

30,0 -»

PhzK

20,1

^■Phzl

1

2

14,4 —> 14,4

Рис. 3. Экспрессия генов phzK (А) uphzl (Б) в сопряженной системе транскрипции-трансляции Е. coli. Меченные [33S] белки, синтезированные в экстрактах S30 в присутствие фрагментоз ДНК, содержащих ген phzK (дорожка 2а), и ген phzl (дорожка 26), разделяли электрофорезом в 10%-ном полиакриламидном геле с 0,1% додецилсульфата натрия с последующей радиоавтографией геля (см. раздел "Материалы и методы"). Дорожки 1А и 1Б - контроль экспрессии в условиях использования в качестве матрицы соответственно суперспиральной ДНК плазмиды pALTER.-£xl и ее большего ScaI-£coRV-($pameHra.

Компьютерный поиск белков, обладающих гомологией с продуктами генов из локуса р!с проводили, используя базы данных бу^РпЛ, РЖ и СепРер1. Результаты анализа сведены в таблице. Обнаруженная гомология аминокислотных последовательностей РЬгС,1),Е,Р,0 с известными ферментами центрального метаболизма позволяет предположить, что соответствующие гены р1п составляют оперон структурных генов, кодирующих ферменты биосинтеза феназин-1- карбоновой кислоты. В этот оперон входят также гены рЫА и рЫВ, хотя продукты этих генов не показывают достоверной гомологии с белками, содержащимися в указанных выше базах данных. Интересно отметить, что нуклеотвдные последовательности этих генов гомологичны между собой (70% идентичности). Вполне вероятно, что данные гены являются результатом дупликации некоего "предкового" гена.

Таблица. Результаты поиска белков, гомологичных продуктам генов рЬ: в базах данных "СепРерГ, "8\М55РгоГ' и "РЖ"

Ген Гомологичный ген Гомоло- Продукт гена

phz гия*, %

А phzß СP.fluorescens 2-79) 69.1 Неизвестен

В phzA {P.fluorescens 2-79) 69.1 Неизвестен

С phzF (P.aureofaciens 30-84) aroF (Nicotiana tabacum) aroF (Solamim tuberosum) 88.5 39.0 36.5 Неизвестен ДАГФ-синтаза ДАГФ-синтаза

D pltzA (P.aureofaciens 30-84) entB (E.coli) 92.2 47.8 Неизвестен Изохоризматаза

Е phzB (P.aureofaciens 30-84) pabA (Salmonella typhimurium) trpG (Р.aeruginosa) 91.8 23.0 21.9 Неизвестен р-аминобензоатсинтаза (комп.И) Антранилатс интаза (комп.И)

F phzC (P.aureofaciens 30-84) thyA (Mycobacterium tuberculosis) 93.5 30.6 Неизвестен Тимидилатсинтаза

G phzD (P.aureofaciens 30-84) fprA (Myxococcus xanthus) pdxH (E.coli) 90.5 32.0 29.4 Неизвестен Пиридоксамин 5'-фосфатоксидаза

I phzl(P.aureofaciens 30-84) tral (Agrobacterium tumefaciens) luxl (Vibrio fischeri) lasl (P.aeruginosa) 85.7 26.5 26.4 21.4 Синтетаза автоиндуктора Синтетаза автоиндуктора Синтетаза автоиндуктора Синтетаза автоиндуктора

R phzR (P.aureofaciens 30-84) lasR (P.aeruginosa) rhiR (Rhizobium leguminosarum) luxR (Vibrio fischeri) 86.3 29.3 24.6 20.9 Фактор транскрипции Фактор транскрипции Фактор транскрипции Фактор транскрипции

*, уровень гомологии в процентах идентичных аминокислот в последовательностях белков при их оптимальном выравнивании с помощью программы "BLAST" из программного пакета "PC/Gene".

Гены phzl и phzR представляют собой два конвергентно транскрибруемых оперона и, по-видимому, являются регуляторными, поскольку их продукты проявляют гомологию соответственно с синтетазами автоиндуктора и. белками-регуляторами транскрипции, относящихся к семейству LuxR/LuxI. Генетическая регуляция в подобных локусах основана на взаимодействии низкомолекулярного соединения (автоиндуктора), синтезируемого синтетазой, с фактором транскрипции, в результате которого последний переходит в активную форму и, связываясь с операторной последовательностью, активирует экспрессию генов того или иного оперона. Считается, что внутриклеточная концентрация автоиндуктора, способного свободно диффундировать как внутрь клетки, так и за ее пределы, зависит от концентрации бактерий в популяции. Иными словами, для активации системы необходимо, чтобы в среде в данный момент присутствовало достаточное количество клеток. Вследствие этого экспрессия подобных генетических систем достигает максимума в стационарной фазе роста культуры. Результаты проведенного нами анализа накопления транскриптов показывают, что система биосинтеза феназинкарбоксилата ведет себя подобным образом.

3. Исследование роли индивидуальных структурных генов phz в биосинтезе феназин-1-карбоновой кислоты.

Для установления роли отдельных генов локуса phz проводился анализ биосинтеза соединений феназинового ряда с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии. Продукцию феназинкарбоксилата и интермедиатов его биосинтеза исследовали как в гетерологичной системе (в клетках Е. coli), так и в исходном штамме Р. fluorescens 2-79, используя специально полученные для этой цели мутанты по отдельным структурным генам. Результаты этих опытов представлены на рисунке 4.

В ранних работах было установлено, что биосинтез феназинов представляет собой одну из ветвей шикиматного пути биосинтеза ароматических соединений. Проведенный нами компьютерный анализ аминокислотных последовательностей продуктов структурных генов локуса phz показал, что по-крайней мере три фермента - PhzC,D,E -обладают гомологией с ферментами шикиматного пути (см. табл.). Результаты анализа биосинтеза феназинкарбоксилата и его производных в Е. coli и мутантных штаммах 2-79 Р. fluorescens говорят о том, что данные ферменты, в комплексе с PhzF, составляют основу системы и непосредственно осуществляют синтез гетероциклического феназинового ядра. Гипотетическая схема биосинтеза феназинов приведена на рис. 5.

рЬгА р/ггВ р!чС !>1и1)

рЬгО

Sg!ll ХЪо1 ЕсоК1 ЕсоЮ. ЕсоКV

I-Ы_I_I_

рТ7-6АВСОЕЕС

рТ7-6АВСО

рТ7-6АВ

рТ7-6В

рТ-5СО

рТ7-5СБЕ

РТ7-6СБЕРС

рТ7-5в

2-79 МХС

2-79 МХО

2-79 МХЕ

2-79 МХС

КрпХ

_I

Л Л

Вя Л1 _1_

Ри 1 11

хъл

Продукция феназин-карбоксилата

Рис. 4. Анализ продукции феназин-1-карбоновой кислоты в клетках Е.соИ, содержащих клонированные гены под контролем промотора ф10 фага Т7, и в мутантах штамма Р.Аиогезсет 2-79. В верхней части рисунка показано расположение структурных генов ркгАВСВЕРй и приведена рестрикционная карта соответствующего им участка ДНК. В случае каждой из плазмид ( из обозначения приведены слева) указан клонированный участок ДНК и стрелкой показано направление транскрипции. Положение инсер-ций Кап'-кассеты в хромосоме мутантов 2-79 (обозначение штаммов приведено слева) отмечено затемненными треугольниками. Знаками "+" или "-" указана способность синтезировать феназин-1-карбоксилат.

соон

но

с оон

Эритрозо-4-фосфат +

Фосфоенолпируваг

/

чон

он Шикимовая кислота

соон

соон

Феназинкарбоксилат

Автоиндуктор

(рмГ)

Активатор транскрипции

Синтетаза ---ч.

автоиндуктора Гр^К)

Р, ""Г РП»7

РЛгС

РЬгА

Ои Пируват

р/ггГ рйгЯ ркгК ркгВ р/ггС /?/ггО р/ггЕ

р/гй7 рк~0

Рис. 5. Гипотетическая схема биосинтеза феназин-1-карбоновой кислоты

N

Учитывая высокую степень гомологии PhzC с растительными З-дезоксн-D-арабиногептулозонат-7-фосфат (ДАГФ)-синтазами, которые являются первыми ферментами в пути биосинтеза шикимовой кислоты, можно предположить, что данный фермент обладает сходной активностью. Вероятно, основная роль PhzC состоит в увеличении пула хоризмовой кислоты в клетке путем снятия регуляторного блока на первом этапе метаболической цепочки, ведущей (через шикиматный путь) к синтезу хоризмовой кислоты (Dyer et al., 1990). В опытах с мечеными субстратами было установлено, что хоризмовая кислота является последним интермедиатом пути биосинтеза шикимовой кислоты, включающимся в состав феназиновых соединений (Leisinger, Margraff, 1979).

Самый большой полипептид оперона - PhzE - проявляет гомологию с бактериальными антранилатсинтазами, относящимися к ферментам пути биосинтеза триптофана и катализирующих превращение хоризмовой кислоты в антранилат. Белок PhzE в комплексе с PhzD, вероятно, осуществляют две реакции: перенос аминогруппы с донора глутамина на хоризмат за счет активности глутаминамидотрансферазы PhzE, а также одновременную перестройку молекулы. Наличие подобного интермедиата было постулировано ранее (Budzikiewicz, 1993).

В настоящее время затруднительно строить предположения относительно роли продукта гена phzF, основываясь только на информации о наличии довольно слабой гомологии этого белка с бактериальными тимидилатсинтетазами - ферментами, вовлеченными в синтез дезокситимидилата. Между тем, PhzF абсолютно необходим для процесса биосинтеза феназинкарбоксилата. Роль белка PhzG представляется более очевидной. Инсерция кассеты в этот ген не приводит к полному нарушению процесса биосинтеза, а лишь очень сильно снижает продукцию феназин-1-карбоновой кислоты. Очевидно, что данный фермент, как и гомологичные ему пиридоксаминфосфатоксидазы, активирует работу системы, взаимодействуя с соответствующими кофакторами (Lain, Winkler, 1992).

Возвращаясь к структурным особенностям локуса phz надо отметить, что перекрывание генов нередко наблюдается в бактериальных оперонах (например, в триптофановом опероне) и может служить указанием на то, что пары генов кодируют субьединицы одного фермента (Yanofsky, Crawford, 1987). Можно предполагать, что отдельные полипептиды (no-крайней мере, продукты перекрывающихся генов phzDE и phzFG) образуют в клетке макромолекулярный комплекс. Дополнительньм доказательством существования такого комплекса могут служить данные о характере

Рис. 6. Идентификация генов биосинтеза феназиновых антибиотиков у природных штаммов псевдомонад, выделенных из ризосферы растений, с помощью ПЦР (А) и ДНК-ДНК-гибридизации (Б). ПЦР-анализ проводили с использованием пары праймеров рс2а (5'-TTGCCAAGCCTCGCTCCAAC-3') - рсЗЬ (5'-TTGCCAAGCCTCGCTCCAAC-3'). Гибридизацию проводили с £со111-.Крл1-фрагментом ДНК как описано в разделе "Материалы и методы". Для анализа использовали ДНК штаммов: Р. Jluorescens 2-79 (дорожка 2), Р. sp. 38а (дорожка 3), Р. sp. 70а (дорожка 4), Р. sp. 7Н (дорожка 5), Р. aureofaciens BS1393 (дорожка б), Р. fluorescens (дорожка 7), Р. aureofaciens BS1391 (дорожка 8) Р. pulida BS1380 (дорожка 9). Дорожка 10 - реакция без ДНК. Дорожки 1 и 11 - маркеры (ДНК фага X, гидролизованная рестриктазой HindWX).

экспрессии этих генов.

Белков, гомологичных продуктам генов phzA и phzB, в базах данных обнаружено не было. Кроме того, размер этих полипептидов слишком мал (примерно по 18 кДа каждый) для большинства катаболических ферментов. Функция PhzA и PhzB может состоять в стабилизации предполагаемого макромолекулярного комплекса, поскольку клоны Е. coli, не имеющие этих генов, синтезировали помимо практически бесцветного феназинкарбокеилата, большое количество другого соединения феназинового ряда. По-видимому комплекс ферментов, синтезирующих феназиновое ядро, способен функционировать и в отсутствие белков PhzA и PhzB, однако его стабильность нарушается, о чем может свидетельствовать накопление побочного окрашенного интермедиата.

4. Идентификация генов биосинтеза феназннов у других видов псевдомонад.

Идентификацию генов биосинтеза феназинов у других видов псевдомонад проводили методами ПЦР и ДНК-ДНК-гибридизации. В качестве зонда использовался фрагмент ДНК локуса phz штамма P. fluorcscens 2-79, содержащий гены phzC и phzD. Результаты проведенного анализа показали, что соответствующие последовательности ДНК имеются не только у P. fluoresceins и P. aureofneiens, но также присутствуют в геномах P. chlororaphis и P. aeruginosa (см. рис. 6). Таким образом, гены биосинтеза феназинов у разных видов псевдомонад гомологичны между собой и эволюционно консервативны, что лишний раз говорит о большом значении феназиновых антибиотиков для продуцирующих их бактерий.

Нами был клонирован ЛЛ-ЯсоШ-фрагмент геномной ДНК P. aeruginosa РА01, гомологичный генам генам phzC и phzD штамма P. fluoresceins 2-79 (Мавроди и др., неопубликованные данные). Построена физическая карта указанного фрагмента ДНК размером около 2,7 т.п.н., а также частично определена его нуклеотидная последовательность. Интересно отметить, что при анализе нуклеотидной последовательности в составе клонированного фрагмента обнаружены три открытые рамки считывания, обозначенные соответственно phnC, phnD и phnE, которые кодируют полипептиды, гомологичные белкам PhzC, PhzD и PhzE штамма P. fluorescens 2-79. Таким образом, можно утверждать, что генетические системы, контролирующие биосинтез феназинов у разных видов псевдомонад, гомологичны друг другу и организованы по единому принципу.

выводы

1. Изучена структурно-функциональная организация генов, контролирующих биосинтез антибиотика феназин-1-карбоновой кислоты у штамма Pseudomonas fluorescens 2-79.

2. Определена нуклеотидная последовательность фрагмента геномной ДНК штамма Р. fluorescens 2-79 размером 8505 п.н из области генов биосинтеза феназин-1-карбонозой кислоты. В секвенированном участке локализованы девять открытых рамок считывания, организованных в виде трех оперонов - phzABCDEFG, phzl и phzR. Показана экспрессия всех генов phz в клетках Е. coli.

3. Обнаружена гомология продуктов трех структурных генов (phzC, pkzD и phzE) с ферментами, участвующими в синтезе ароматических аминокислот, а также гомология продуктов генов phzl и phzR с соответствующими компонентам регуляторных систем семейства LuxR/LuxI. Выдвинуто предположение о том, что уровень синтеза феназиновых антибиотиков у Р. fluorescens 2-79 регулируется в зависимости от титра бактериальных клеток.

4. Изучена роль отдельных структурных генов в биосинтезе феназин-1-карбоновой кислоты в клетках Е. coli, содержащих клонированные гены phz, а также в соответствующих мутантах Р. fluorescens. На основании результатов этого анализа предложена принципиальная схема пути биосинтеза антибиотика.

5. С помощью ПЦР и ДНК-ДНК-гибридизации идентифицированы гены биосинтеза феназинов у различных штаммов Р. fluorescens, Р. chlororaphis и Р. aeruginosa. Выдвинуто предположение о том, что генетические системы, контролирующие биосинтез феназинов у разных видов псевдомонад гомологичны друг другу и организованы по единому принципу.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Мавроди Д.В., Ксензенко В.Н., Чатуев Б.М., Томашов J1.C., Воронин A.M. Структурно-функциональная организация генов Pseudomonas fluoresceins, кодирующих ферменты биосинтеза феназин-1-карбоновой кислоты//Молекулярная биология. 1997. Т. 31.

С 2 г

2. Мавроди Д.В., Чатуев Б.М., Ксензенко В.Н., Томашов Л.С., Воронин А.М.

Генетический локус, котролирующий биосинтез феназинового антибиотика у штамма

Pseudomonas Jluorescens 2-79 // ДокладыРАН. 1997 Т. 352. С. {<& - 4 Ье>

f

3. Mavrodi D.V., Ksenzenko V.N., Boronin A.M., Cook R.J., Thomashow L.S. Organization and characterization of the phenazine-l-carboxylic acid biosynthetic locus from Pseudomonas Jluorescens 2-79 // Applied and Environmental Microbiology. 1997. V. 63.

4. Boronin A.M., Mavrodi D.V., Ksenzenko V.N., Cook R.J., Thomashow L.S. Characterization of genes involved in phenazine biosynthesis in plant growth-promoting Pseudomonas Jluorescens 2-79 II Abstracts of the "Pseudomonas 1995. Fißh International Symposium on Pseudomonas: Biotechnology and Molecular Biology". Tsukuba. Japan. 1995. P. 183.

5. Mavrodi D.V., Ksenzenko V.N., Thomashow L.S., Boronin A.M. Genetic locus involved in phenazine biosynthesis in Pseudomonas fluorescerts 2-79 // Abstracts of the "Molecular genetics of bacteria and phages" meeting. Cold Spring Harbor. USA. 1996. P. 94.