Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И АНТИБИОТИЧЕСКИЕ B PSUDOMONAS CEPACIA

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "АНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И АНТИБИОТИЧЕСКИЕ B PSUDOMONAS CEPACIA"

о/-<2 9 ¥¿>9

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУ1Ш НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГМИ И ШРУСОЛОШИ им* Д.К.ЗАБСШОТНОГО

На правах рукописи

Д О Д А Т К О Татьяна Александровна

УДК 579.841 .II.264+615.Г J.84І

АНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И АНТИБИОТИЧЕСКИЕ Ь : РЗЕиООМОИАЗ СВРАСГА.

03.00.07 - микроОиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1990

-у, -'

Работа выполнена в Институте микробиологи» и вирусологии им.Д.К.Заболотного АН УССР

і

Научные руководители: академик АН УССР,профвосор В.В.Смирнов

доктор биологически* наук Е.А.Киприанова

Официальное оппоненты; доктор медицински* наук З.П.Эеоеренко

кандидат биологических наук А.Н.Эайченко

Ведудая органи аация: Одесский государственный университет ин.И.И.Мечникоаа

л ^ о

Зените состоится Чц^ І990 чао

на заведении специали »ровЗнногоСоветв І 016.01 при Институте микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН УССР по адреоу: 252627, Киев - Ш,ул.Звйо-лотиогоДЯ

С диссертацией можно ознакомиться і библиотеке Ииоти-тута микробиологии и вирусологии имД.Н.ЭойелотНоге

АН УССР

Автореферат ровоолаи * и'1990 г.

Ученый оекретерь

специализированного совет« р/ :__

кандидат биологических наук ; Э.А.Новаленке

ОЩАЯ ИРАК1ЕШСТИКА РАБОШ

Актуальность проблемы. Антибиотические вещества, открытые в первой половине 20 века, прочно утвердились в арсенале современной медицины, ветеринарии, растениеводства, однако, возникновение у микроорганизмов устойчивости к различным антибиотикам, побочное действие последних на макроорганизм, отсутствие эффективных средств лечения вирусных инфекций и злокачественных заболеваний диктуют необходимость широкого изыскания новых антибиотических средств.

Наряду с поиском новых классов низкомодекулярных антибиотиков, значительное внимание исследователей привлекают в последние роды бактериоциш - высокомолекулярные антибиотические вещества узкого спектра действия. Данные, полученные при их исследовании, имеют не только общебиологическое значение, позволяя глубже понять взаимоотношения отдельных штаммов внутри вида или популяции, но представляют и практический интерес, Вактериоцины применяются для тшшрования микроорганизмов, диагностики ряда инфекций, биологического контроля заболеваний сельскохозяйственных растений. Все это свидетельствует об актуальности поиска и широкого изучения этого класса антибиотических веществ.

В настоящее время параллельно с грибами и актиномицетами, исследованными достаточно подробно в качестве потенциальных продуцентов антибиотиков, объектами исследования все чаще становятся различные группы бактерий. Перспективными в этом плане являются представители рода Paeudomonaa , у которых в последние годы обнаружены новые классы антибиотиков - аминогликозидов, мо-нобактаыов, многоядернкх хинонов. К числу наиболее изученных представителей рода принадлежат P-aerugi.no в а. и P-fluoreaoena ( однако, предметом изучения становятся и другие вида, в том числе P.cepacia , штаммы которого были впервые выделены при заболеваниях лука в 1950 году. Биология P.cepacia изучена далеко не полно» а поиск образуемых ими новых антибиотических веществ представляется весьма перспективным. К настоящему времени известно не менее 5 классов антибиотических веществ, синтезируемых р,cepacia , в том числе фенилпирролы, трополоны, ацетиленовые антибиотики. Из штаммов данного вида вццелен и ряд феназиновых пигментов, однако их антибиотическая активность не_быда охарактери-эована. Подобно всем аэробным ри кроорпаЯФЭМ&м^НАЭмш P.Cepacia

МДУЧНАЯ г.ИЗЛИСнТ.КЛ \ («'сек, '1

Hi.; I'. A.

обледаюг специальными системами транспорта железа - сидерофора-ми, однако связь между синтезом сидерофоров и антибиотическими свойствами вида до настоящего времени не была исследована. -

В Кв5 году у клинических штаммов p.cepacia. впервые описаны высокомолекулярные антибиотические вещества - сепацлщины - й^ предложены схемы бактериоцинотипирования. Оцнако, эти схема были далеко но полными и продолжали в дальнейшем пополняться, а экологический аспект проблемы синтеза бактериоцинов вообще не был изучен. ,

Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы была всесторонняя характеристика антибиотической активности P.cepacia , выяснение химических свойств и биологической активности веществ, синтезируемых штаммами этого вида, оценка их экологической и физиологической роли.

Задачи исследования состояли в следующем!

1. Изучить антагонистическую активность штаммов p.cepacia в отношении микроорганизмов различных таксономических групп и отобрать наиболее активные штаммы-антагонисты.

2. Выделить низкомолекулярные антибиотические вещества, ответственные за антагонистическую активность некоторых штаммов'

p.cepacia , изучить спектр их антибиотического действия и физико-химические свойства.

3. Исследовать влияние трехвалентного железа на биосинтез и антибиотические свойства биологически активных метаболитов, образуемых штаммами P.cepacia.

4. Исследовать явление бактериоциногении у штаммов P.cepacia , провести их бактериоцинотипирование, отобрать активные продуценты бактеркоциноподобных веществ.

5. Изучить закономерности.биосинтеза, биологическую активность и физико-химические свойства некоторых бактериоцинов Р. cepacia .

6. Проанализировать некоторые стороны антибиотической активности P.cepacia в связи С экологией этого вида.

Научная новизна и практические результаты. Впервые исследована антагонистическая активность штаммов р^ cepacia • выделенных из различных экологических источников,и установлено, что подавляющее большинство штаммов характеризуется высоким уровнем И широким спектром антагонистического действия. У многих штаммов эти сроГ.ства связаны с синтезом антибиотически активных пигментов, а

также неокрашенных метаболитов, извлекаемых из культуральной жидкости хлороформом. Установлено снижение антимикробной активности и угнетение процессов биосинтеза некоторых из исследованных веществ ионами трехвалентного железа, что позволяет предположить их принадлежность к железотранспортирующим агентам - сидерофорам.

Изучены компонентный состав и биологическая активность антибиотика-сырца из штамма p. cepacia 5798, получены метильные производные входящих в его состав веществ. Установлено, что два компонента принадлежат к ароматическим соединениям с атомами азота в боковой цепи заместителей. Подобные антибиотические вещества у бактерий рода Pseudomonaa выявлены нами впервые. Предполагается участие этих соединений в транспорте железа у p.cepacia • Возможная роль антибиотиков p. cepacia в процессах переноса железа установлена нами впервые.

Выявлена высокая внутривидовая антагонистическая активность штаммов p.cepacia , более 70$ которых оказались способными к образованию бактериоциноподобных веществ. Проведено бактериоциноти-пирование штаммов P.cepacia > обнаружены новые, ранее не встречавшиеся бактериоцинотипы, дополнены схемы тонирования.

Из штамма P.cepacia 5779 адцелен, очищен и изучен новый бактериоцин /сепациацин/, являющийся высокомолекулярным комплексом с массой 1,В.1(£ дальтон, включающий белки и углевода в соотношении 3:L, Одновременное проявление термолаб ил ьност и и чувствительности к протеазам выделяет его из ряда известных бактериоци-ноподобных веществ и позволяет отнести к новому типу бактериоци-нов. Активность сепациацина терялась при совместной инкубации с липополисахаридами, выделенными из индикаторного штамма, подобный эффект обнаружен для P.cepacia впервые,.

Полученные результаты исследования антагонистических свойств и антибиотических веществ P.cepacia представляют интерес с позиции познания взаимосвязи между образованием различных антибиотических веществ и экологией бактерий-продуцентов. Дополненные схемы бактериоцинотширования могут быть использованы в клиниках для выявления путей распространения госпитальной инфекции, вызванной штаммами Р.cepacia , Перспективными представляются дальнейшие исследования возможности применения активных штаммов-антагонистов P.cepacia ДЛЯ борьбы с возбудителями заболеваний сельскохозяйственных культур.

Работа выполнена на базе Института микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН УССР, выделение, очистка и определение структуры веществ, входящих в состав анткби о тика-сирца из штамма р.espacia 5793, проводились на базе Всесоюзного НИН антибиотиков под руководством к.х.н, Л.А.Сабуровой и к.х.н. Н.А.Клюева.

Апробация работы. Основные результаты и положения работы докладывались на Всесоюзном семинар? "Методы направленного скрининга антибиотиков и других биологически активных веществ" /Москва, 1967 г./, на Всесоюзной конференции "Вюсинтеэ вторичных метаболитов" /Путцино, 198? г./, конференции молодых ученых-микробиологов ШВ АН УССР /1968 г./. Диссертационная работа докладывалась на заседаниях отдела антибиотиков, а также научно-тематической микробиологической секции ИМВ АН УССР.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем,и структура. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы /2 главы/, экспериментальноВ части /6 глав/, заключения, выводов и списка литературы, включающего 41 источник отечественной к 155 иностранной литературы. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 30 рисунками.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили 44 штамма p.^paci» иэ коллекции культур отдела антибиотиков ИМВ АН УССР, в том числе 16 ютам-мов, выделенных из почв Батумского ботанического сада, 27 штаммов клинического происхождения, полученных из коллекции Института им.Пастера /Франция/, коллекции Эдинбургского Университета /Шотландия/, Медицинского колледжа в Фукушима /Япония/, а также типовой штамм P.cepaei* ÀTCC 25416. В качестве тест-объектов использовали типовые штаммы 20 видов бактерий рода peeudomones и 47 штаммов микроорганизмов, относящихся * другим видам и родам.

Антагонистическую активность р.серяс1а ' исследовали методом отсроченного антагонизма /Егоров, 1££6/ в отношении широкого спектра ыикроорганизмов и штаммов собственного вида на иясо-пеп-тонноч агаре /МПА/, средах Паузе 72 и Кинг В. В некоторых вари-

антах опытов в среду добавляли ресі3 из расчета 100 мкг/мл. Для определения способности антибиотических веществ к ди^узии через целлофан использовали стерильные целлофановое диски.

Продуценты низкомолекулярных антибиотиков выращивали на МПБ и среде Гауэе в условиях аэрации /качалка/ при 28°С в течение 72 часов. Культуральные жидкости экстрагировали хлороформом при подкислении до pH 3-Ü, Активность экстрьктов-"сырцов", освобожденных от поли-А-оксныасляноЙ кислоты, испытывали методом серийных разведений на мясо-пептонноы бульоне ■ /МШУ и сусле в присутствии 100 мкг/мл УфСЦ и без него. Разделение и очистку антибиотика-сырца из штамма 579S проводили после метилирования его мета-кольного раствора диазометаном методами колоночной и тонкослойной хроматографии на силикагеле l 40/70, Merk /ФРГ/ и окиси алюминия /СССР/ 70-105 и менее 70 меш. Элюцию осуществляли системами растворителей: хя ороформ:этилацетат:метанол /10:20:1, 10:20:4/, бензол:етилацетат:хлороформ /4:1:1, 4;1:2/ и бензол:этилацетат /1:1/. УФ-спектри фракций исследовали на спектрофотометре Fyc-Cp Unlearn /Великобритания/ и Beckman Ш-8В /Австрия/; ПК-спектры ДБг t таблетка/ на приборе ик-ю /ГДР/; масс-спектрометрии проводили на приборе MATT 3IIA /Швейцария-США-ФРГ/. Масс-спектры химической ионизации получены на квадруподъном масс-спектрометре Финниган 4021, газ реактант - изобутан; ПМР-спектрц снимали в растворе SDClj на приборе Bruclter Ш 90 /ФРГ/ с ТМС в качестве стандарта.

Боктериоцинотипирование штаммов P.cepacia проводили по методу Qovan /1985/, используя стандартные набори продуцентов сепа-даашнов/CPj-CP^/ и индикаторных к эти« веществам культур Л^-CSq /, любезно предоставленных нам автором.

Дяя построения ростовых кривых и исследования динамики синтеза бактериоцинов бактерии выращивали в условиях аэрации при 28°С на МПБ и синтетической среде М9 /Лысак, 1063/. Оптическую плотность культуралъных жидкостей измеряли на спектрофотометре СФ-24 при длине волны 750 ны. Индукцию синтеза бактериоцинов проводили УФ-облучением или добавлением 0,5-1,5 мкг/мл митомицина С Äerwa , ФРГ/, Для получения бактериоцинов использовали те же среда и МПА.

Щделение и очистку сепациацннов проведали с использованием ультрацентрифугировэния на центрифуге Vac-601 /ГДР/ при 40 ООО об/мин в течение 4 часов с последующей гель-фильтрацией на cef.a-

розе б-В. Колонка 10 х 1000 мм, скорость алюции 12 мл/час, v 17 мл, элюция 0,01 М ТРЙС-Hci буфером, рН - 7,4. Молекулярную массу бактериоцина определяли гель-фильтрацией /Detarmarw , 1970/; электрофорез в полиакрилаыидном геле проводили согласно Laemrali /1970/, Аминокислотный состав определяли на аминокислотном анализаторе ВС-200 Hitachi /Япония/. Количество белка определяли согласно Bradford /1976/, углейодов - фенол-серным методом /Захарова, Косенко, 1962/. Устойчивость сепащвщнов к различным значениям температуры и jit исследовали, используя набор буферов с рН от 4,5 до 9,0, а также прогревая их при температуре 40, 60, 60, 100°С на водяной бане. Очищенные липогголнсахариды из штамма P.cepacia 3181 любезно предоставлены М.А.Содцаткиной /отдел биохимии №8 АН УССР/.

АНТАГСШСТИЧЕСШ! ШМШОСТЬ ШТАШОБ PS'MDOMOIJAS

CEPACIA В 0ТНШШ1Н МИКРООРГАНИЗМОВ PA3JB14HUX ТАКСШОМИЧЕСКЖ ГРУПП

Установлено, что большинству штаммов P.oepacla присуща высокая антагонистическая активность в отношении различных групп микроорганизмов /рис. I/. Среди исследованных нами культур не было ни одного полностью антагонистически не активного штамма, хотя степень и спектр этой активности варьировали. Более 50% штаммов p.cepacia подавляли рост стафилококка и спороносных бактерий, 42?й ингибировали рост микобактерий. Антагонисты в отношении синегнойноЛ и кишечной палочек встречались реже - в 22,2 я 29,GJi случаев, соответственно. Высоко чувствительными к действию P.cepacia оказались фитопатогенные микроорганизмы Agrobncteri-«и tumefaciens, Cory ne bacterium mlchlganenae, Xanthoaonae malva-cearum, 50Si ШТаМУОВ ингибировали рост эрвиний. Подпвлящее большинство культур p.cepacia обнаруживали антагонистическую активность и в отношении фятопатогенных грибов. Многие из них угнетали рост такого устойчивого к антифунгальным соединениям возбудителя корневой гнили, как Puewlum охуэрогит Оде более чувствительными К антибиотическим веществам P-oapaeifc были Грибы родов Helminthoeporium, VerticlllluSiPeniciIlium /табл. I/. Высокую активность в отношении грибов обнаруживали штаммы, синтезирующие желтый, ди^йгндирущий в среду пигмент; акти£унгальными

свойствами обладали и штаммы, образующие другие пигиенты, а также некоторые неокрашенные культуры.

8

t* и

8

100

90

80

70

60 50

40

30

20

10

ш

г

I

пДгШ

tit*

Staphylococcus auraua

Escherichia Candida al- Xarithomonaa о oil bicans malvacearura

Pvtc. I. Антагонистическая активность штаммов PaeudoMon&a cepacia В отношении некоторых микроорганизмов

Антагонистическая активность: |- высокая,

U—J

- умеренная,

- слабая

При научении противовирусных свойств p.cepacia нами било установлено, что нудь туральные жидкости штаммов 4200, 4225, 5769 5779 значительно /на 50* и более/ снижали число некрозов, вызыва еыьос репродукцией вируса табачной мозаики в листьях табака в опытах in vitro.

Т!шм образом^ исследованные нами штаммы P.cepacia обладали высокий уровнен и широким спектром антагонистической активности в- отношении микроорганизмов и некоторых вирусов. В дальнейшем объектом наших исследований служили наиболее активные

пигментообр&зущие штаммы р.cepacia • культуральных жидкостей трех продуцентов нами были веде лены хлороформные экстракты /"пигменты-сырцы"/ и изучена их антибиотическая активность. Результаты изучения активности желтого иэ штамма p.cepacia 5790, красного из штамма 5779 и фиолетового из штамма 4203 "пигментов-сырцов" показали, что все они обладали сходным спектром действия, подавляя рост грамположитеяькых микроорганизмов в концентрации 2-100 мкг/мл и несколько слабее угнетая грамотрицательные микроорганизмы /при концентрациях 100-400 мкг/мл/. Чувствительными к действию "пигментов*сырцов" оказались также и фитопатогенные бактерии /50-100 мкг/мл/ и грибы /50-400 «кг/мл/. Наибольшей активностью обладал хлороформный экстракт иэ культуральной жидкости штамма P.cepacia 5798, изученный нами наиболее подробно.

ВЦДЕЛШИЕ, ОЧИСТКА И ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ФИЗИКО-

ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АН ШШ7ИКА-СЫРЦА ИЗ ШИША PSEUDOMONAS CEPACIA 579В

Вещества, входящие в состав хлороформного экстракта культу~ ральной жидкости штамма 57Ш, изменяли свои химические свойства tt теряли антибиотическую активность в течение 1-2 месяцев хранения при 4°С, что побудило нас перевести их в химически стабильную форцу, осуществив метилирование суммарного продукте диазоме-таном. Дальнейшее разделение метильных производных проводили, используя методы колоночной и тонкослойной хроматографии, что позволило выделить 4 хроматогра^ическн чистых вещества /в том числе два минорных/, все они обладали антибиотической активность». Объектом дальнейших исследований служили вещества F3 к IP4, выделенные в количестве 57 и 36 мг; Изучены их некоторые физико-химические свойства. УФ-спектр вещества IP3 имел полосы поглощения при 202, 245, 325 и 372 нм, В ИК-спектре обнаружены полосы валент-. .;. них колебаний, подтверждающие наличие ян -группы /3300-3400 см" /, группы -CHg и -CHg при ароматическом ядре /2980-2820 см" /, самого ароматического ядра /1560 см"1/. В ПМР-спектре обнаружены сигналы протонов, соответствующие группам -СОШ /4,0 м.д./, -ОСН3 /4,2 м.д./, -СН3 при ароматическом ядре /2,8 м.д./, -СНд /2,77 м.д/. Сигналы протонов ароматического ядра находились в области 6,7-7,2 м.д. В масс-спектре зарегистрирован пик fjtij+ с и/г 194, В масс-

спектре химической ионизации - протонировглный пик {м*н]с На основании масс-спектра высокого разрешения брутто-формула вещества 1РЗ определена как С10НиН,Ог /найдено 154, 1044, рассчитано - 194, 1055/; На основании приведенных данных предложена структурная формула вещества №3, приведенная на рис. 2 /А/.

Рис. 2. Предполагаемые структурные формулы веществ №3 /А/ и IP4 /В/

В УФ-спектре вещества №4 наблюдались полосы поглощения при 203, 242, 325 нм. В ПМР-спеятре выявлены сигналы протонов, сходные с таковыми вещества IP3; близки были и ИК-спектри обоих соединений. Данные масс-спектрометрии показали наличие пика {Vj+o m/e 276, что было дополнительно подтверждено масс-спектрами химической ионизации /протонированвый ион с ю/в 279/. На основании полученных данных определен брутто-состав вещества IP4 -С15Нг2Кг03 /найдено 278, 1523, рассчитано 278, 1630/. Исходя из совокупности данных, предложена структурная формула вещества №4, приведенная на рисунке Z /В/.

Таким образом, нами установлено, что антибиотически актив-

о-сн

в

А

ÇK-CH0H-CHaCHiCH=CH2 мн»

'«Г*'

ныв метаболиты р.espacia 5728 содержат в своей молекуле ароматическое ядро с группами -CHgCOO, -CífoHn, а также 5-углеродную вл-кеновую цепь. По-видимому, данный штамм синтезирует целое семейство сходных по структуре веществ, обладающих антибиотической активностью. йше мы уже упоминали об антибиотиках - феназинах, фенил-пирролах, трополонах, образуемых отдельными штаммами p.cepacia ■ , описанными в литературе. Анализ loe свойств и сопоставление с характерно тиками изученных нами веществ позволяют прийти it выводу, что соединения подобного химического строения выделены нами из штаммов p.cepacia впербне.

АНТИШОТИЧЕСКАЯ АКТНШОСТЬ И СИДЕРОЮРЫ PSBUDOMCWAS CEPACIA

В последние годы установлено, что антибиотическая активность многих видов бактерий рода Pesudomoae« обусловлена синтезом железо транспортирующих агентов - сидерофоров, конкурирующих с аналогичными веществами других микроорганизмов, в том числе и фитопа-тогенных грибов, за необходимое для их роста железо. Поскольку антагонистическая активность многих штаммов P. cepacia связана с синтезом ими антибиотически активных пигментов, а в литературе имеются данные,о том, что синтез некоторых из них усиливается на железодефицитных средах, представлялось целесообразным изучить влияние железа на антагонистическую активность и пигментообраэо-ваниё P. cepacia И попытаться выяснить возможную роль этих вторичных метаболитов в транспорте железа.

Изучив антагонистическую активность P. cepacia в отношении фитопатогенных грибов в' условиях дефицита железа и в присутствии FeClj /100 мкг/мл/, мы установили, что добавление железа в среду существенно снижало антифунгальное действие исследуемых штаммов; от частичного уменьшения зон задержки роста тест-микроорганизмов до полного их исчезновения /Табл. I/. Эффект наблюдался у 60* штаммов, синтезирующих желтке пигмент», а тайге у некоторой части неокрашенных культур. ■ "

Внесение в среду 100 мкг/мл peoi-, снижала антибиотическую активность желтого "пигмента-сырца" из штамма P.cepacia 5798 В 2-10 раз. Аналогичное дейстеие соли железа оказывали и на активность фиолетового пигмента -1203, снижая ее в 4-10 раз. Активность красного пигмента из P.cepacia 5779 в этих условиях оставалась без изменения /Табл. 2/.

Таблица I

Влияние железа на активность штаммов Раеидошопая аврао!а в отношении фитопатогенных грибов

%ст-микроорганизм * | Процент активных штаммов

(-

! в отсутствии ' I в присутствии : железа ; 100 мкг/мл : I Р«С1,

1. HeliBlnthoeporium grenlnea 82 '50

г. Tuaarium оxyeporuu» 67 14

э- Tertlcllliu« dahlia« 78 43

4. Peal с 11 Hum notatun 69 54

5* Hucor plumb®um 67 34

Таблица 2

Влияние железа на антимикробную активность пигментов-сырцов из штаммов Р&ви1олюпаа сврас1а

Тест-минроорганизк! Минимальная ингибирущая рост концентрация, I мкг/мл

I ■■■■■ -.....——

¡желтый пигмент ¡фиолетовый лиг-¡красный пи г-I 5796 ¡мент 4203 :мент 5779

. :---:-,-

•в отсут!в при-1в от- :в при- :» от- (в при-¡ствиии :сутст-1сутст-1сутствии!сутст-:сутствии ¡рвсц ¡вии ¡вии ¡100 ¡вии ¡100

: цкг/шк 3 :Рв013 : ' _1 ¡N014 I : 3 1 \ *

I. Staphylo со с си в «treu* 4 40 20 200 4 4

2. HiСГОСОСCU« luteue 4 20 4 20 10 10

3. Baoillu* ей btIiiв 50 ' 200 . 20 200 200 200

4. Becherl'ohia coli 100 ' 400 100 . 400 400 400

5. Paeudomonaa 200 >400 . 100 > 400 400 400

aeruginosa '200

6. Candida albicans 50 400 400 > 400 200

7. Pueariua 100 400 100 >400 100 100

ojyaporum

Добавление в среду культа вироваиш 100 мкг/мд угнета-

ло биосинтез желтого "пигмента-сырца". Последний полностью терял при этом антибиотическую активность. Сравнение спектров поглощения хлороформных экстрактов, полученных в условиях дефицита и избытка железа, выявило отсутствие у последнего характерных максимумов поглощения /Рис. 3 А/,

Добавление солей железа вызывало незначительное снижение биосинтеза красного "пишента-сырца" Р.оерас1в 5779, при этом его антибиотическая активность оставалась на прежнем уровне, сохранялись и максимумы поглощения в ультрафиолете.

Существенно не снижался и суммарный выход фиолетового "шг-меята-снраа" из штамма 4303, но при этом исчезала его антибиотическая активность и изменялась спектральные характеристики /Рис. 3 В/. В частности, исчезали максимумы при 206 , 223, 243 т. По-видимому, фиолатовнй пншент является многокомпонентным, и добавление железа и [лидировало синтез некоторых его составляпцкх.

Рис. Э. УФ-спектры антибиотиков-сырцов иташов Рявийоаоп&в сврао1а 5798 /к'/ и 4203 /В/, выращенных »а среде: I - содержащей 100 мкг/мл Рв013 , 2 - без добавления железа

Снижение антибиотической активности и нарушение процессов биосинтеза желтого и фиолетового "пигментов-сырцов" в присутствии »Трехвалентного железа позволило нам предположить принадлежность. входящих в их состав соединений к группе переносчиков железа си-дерофоров. Известно, что некоторые сидерофоры и их комплексы с железом обладают ростостиыулирухщей активностью, В наших опытах комплекс желтого пигмента с железом усиливал рост некоторых штаммов ?.eepaoi& не синтетической среде в условиях аэрации. По-видимому, и антибиотическое действие желтого пигмента связано с конкуренцией эа железо. Успех данной конкуренции определяется величиной константы связывания железа у сидерофоров коннурирущюе микроорганизмов. Хотя константа связывания железа пигментами p.eeptiisia в прямых опытах нами не определялась, мы получили представление об этом кх свойстве на основании косвенных данных, изучая устойчивость p.cepaoia к синтетическим со единениям-коыплексонам. Штаммы P.cepacia хорошо росли на синтетической среде, содержащей 250-5000 мкг/мл о ксиэтилендифосфоновой /К*2Сг• или дизтиленди-аминпентауксусной /К^О27*®/ кислоты. Это позволяет предположить, что сидерофоры p.cepacia' обладают достаточно высоким средством ж железу, что дает им возможность конкурировать за этот элемент с синтетическими лигадцами, находящимися в среде.

В составе исследованных хлороформных экстрактов нам не удалось обнаружить пиохелин-серусодержащий сидерофор, найденный-рядом авторов у p.cepacia , В то же время анализ структуры и свойств рассмотренных выше метальных производных позволяет предположить, что именно эти вещества /вернее их исходные неметклированные предшественники/ являются антибиотически активными сидерофораш р.св_ расеа . Возможно, желтый пигмент является окрашенной хиноидной формой этих соединений. Эти предположения основаны на предварительных данных и требуют для окончательного доказательства более глубоких химических исследований.

ЯВЛЕНИЕ ЕАКТЕРШдаОГйШ У ШТАМПОВ РЗШТОКШАЗ ■ CEPACIA

Для изучения способности штаммов р, cepa.de к синтезу банте-риоцинов нами была применена система скрининга, включающая: I/ использование всех исследуемых штаммов в качестве продуцентов бак-териоцинов и индикаторных к ним культур; 2/ одновременное выявле-

нив продуцентов антибиотических веществ с высокой молекулярной массой /не способных к диффузии через целлофан/; 3/ изучение термостабильности и чувствительности к протеаваы исследуемых антибиотических веществ.

Установлено»что способностью подавлять рост штаммов собственного вида обладал 31 из 44 исследованных штаммов. Наиболее активные антагонисты подавляли развитие 15-23 штаммов P.cepacia . Среди штаммов, выделенных из ризосферы растений, способность к образовании бактериоциноподобных веществ выявлена у б (Ж культур, среди штаммов, подученных из клинических ИСТОЧНИКОВ, их количество превышало 90*. Можно предположить, что синтез бактериоцинов клиническими штаммами P.cepacia облегчает им сукцессию специфичео-. ких экологических ниш, где борьба с близкородственными микроорганизмами имеет для их выживания решающее значение.

При изучении чувствительности штаммов P.cepacia к бактерио-цинам, образуемым стандартными продуцентами, 24 штамма были отнесены нами к II различным 3-<гипам /Набл. 3/, Не укладывались в предложенную ранее схему 10 штаммов, в связи с чем они были отнесены нами к четырем новым типам, обозначенным как Н^-н^ . Большинство из них были вццелены от больных.

Изучение способности штаммов P.cepacia к синтезу сепациаци-нов, активных в отношении стандартного набора тест-микроорганизмов, позволило обнаружить это свойство у 23 штаммов. Три из них соответствовали Р-3, Р-Ю и P-I2 типам. Остальные 20 штаммов синтезировали бактериоцины новых, ранее не описанных типов. II штаммов вообще не были способны к подавлению стандартно го набора тест-культур, а S штаммов не укладывались в схемы тнпирования, принадлежа к новым как д-, так'и Р-типам.

Таким образом, в процессе бактериоцинотипирования большого набора ризосферных и клинических штаммов p.cepacia нами были дополнены схемы тнпирования и установлены новые, ранее не описанные бакгериоцинотипы.

ВЬЩШНЙЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ШТЕРИОЦИНА ИЗ ШТАММА раЁУШЮНАЗ CSPA.0IA 5779

Объектом наших дальнейших исследований служил штамм p.cepacia 5779, синтезирующий бактериоцинолодобное вещество нового типа Р /з НГ1Т/. Это высокомолекулярное антибиотическое вещест-

Таблица З

Характеристика штаммов Рввініотопші оврасіа 'ПО продукции и чувствительности к стандартному набору сепациапинов

шов іЧрствительность в Оактэтошнам йс-:Число :1Ю означенно и характерне-:Число :штнм- :тика б актери одано типа :пггам-; мрв ; , , „...... . , ;мов

3 сз4, сз5, сз6, сз7 10 оз6, сзэ 12 сад, сз6 новый сз3 сз

7

03,, сз

СЗ/

4*

сз2, 033, сзб сзв

сз,( С33,

СЗ., 08-, 08-.CS,

03І *

сз], С35

03 5

озэ, оз5, ет6

03у са7

са5, сз6, сз7

С33, СЭ4, С37

сз3, 034, сз6 сз,

I СР!, СР2, СР3

6 СРХ, СР2, СРЭ,

6 срх, ср2

16 СР]., СР2,

17 СР^ ср2. СР5

21 СР5 25 СРХ

СР|, СР| -3 4

27 СР2

28 СР]-, СР3, СР5 новый Н^ СР1, СР5

«2 -% -

Н4 СР^» СР^» СР^

4

3 і I

1

2

1

3

2

2 3

5 Ї

Условные обозначения: сз1-сзв - стандартные индикаторы на сепациаиинн[

, СРТ-СРЛ - стандартные продуценты сила-шаданов;

- отсутсмие действия на стандартный набор индикаторов либо чувствительности к стандартному набору продуцентов

во обладало узким спектром действия, подавляя лишь штаммы собственного вида и не оказывал влияния на другие виды псевдомонад к микроорганизмы иных таксономических групп.

Синтез бактериоцина происходил на агариэованных и несколько слабее - на жидких питательных средах, в последнем случае наблюдался выраженный латентный период. Начало образования бактерноци-на соответствовало началу логарифмической фазы роста, а максимальное накопление наблюдалось в конце Л) г-фазы, Синтез бактериоцина был интенсивнее на богатых средах и значительно повышался при УФ-облучении клеток продуцента или внесении в среду 0,5-1,5 мкг/мл митомицина С. Последнее увеличивало его активность с 64 до 200 условных единиц, а УФ-облучение клеток продуцента позволяло достигнуть величины 1000условных единиц. В дальнейшем, используя Уоблучение и комбинированное выращивание на агаризованных и жидких средах, мы повысили активность культуральной жидкости штамма 5779 ДО 10 ООО условных, единиц.

Ультрацентрифугирование культуральной жидкости позволяло сосредоточить активное вещество в осадке, избавляло от большого количества ниэкомолекулярных веществ и увеличивало активность сепациацина с 1*10^ до 1*10^ у.е., при этом его удельная активность повышалась с 2,56-Ю2 до 9,8-кР. Последующая гель-фильтрация на сефарозе 6-В увеличивала удельную активность сепациацина до 1,26-10^; таким образом, препарат был очищен в 6000 раз. Степень очистки сепациацина подтверждалась электрофорезом в полиакриламид-ном геле с ДОН, В исходном материале /культуральноИ жидкости/ обнаруживалось 36 полипептидов с массой 10-130 тыс, дальтон, среди них основными были,по крайней мере, 12 полипептидов. В очищенном препарате наблюдался один основной белок о массой 17 360 и два минорных с массой 34 670 и 72 440. Эти данные свидетельствуют о достаточно высокой степени очистки препарата и позволяют предположить, что в состав сепациацина входит несколько белковых субъединиц. Методом гель-фильтрации установлена молекулярная масса сепациацина, составляющая 1800000 дальтон. В его составе обнаруживались белки и углеводы в соотношении 3:1. Изучение аминокислотного состава белков, входящих в состав сепациацина 5779, показало наличие гийтидшга, аланина, серина и ,глу таниновой кислоты. Изо-лейцин, триптофан, орнитин содержались £ меньших количествах, В УФ-спектре поглощения очищенного сепациацина обнаруживался выраженный пик при 271 им. Попытки выделить белковую и углеводную

части сепациацина в индивидуальном виде Бели к потере биологической активности,

Сепациацин 5779 оказался термолабильным; после 5 минут про-, гревания при 40°С наблодалось снижение активности на 5СМ, а после прогревания в течение того же времени при 60°С - полная потеря активности. Стабильность бактериоцина сохранялась лишь в узком интервале рН от 6,0 до 7,4. Сепациацин был устойчив к действию нуклеаз, полностью инактивировался под действием ггронаэы и в 5-6 раз снижал свою активность под воздействием трипсина. Активность сепациацина исчезала также при инкубации его с очищенными липопо-лисахаридами, выделенными из индикаторного шта«ма p.oepdcii 3161, а также их 0-специфической полисахаридной цепью, что, по-видимому, было связано с необратимой адсорбцией бактериоцинов на ЛПС. Подобный Эффект обнаружен для р,cepacia впервые.

Таким образом, нами был выделен, очищен и исследован бакте-риоцин P.cepacia 5779 - сложный высокомолекулярный комплекс С массой 1,0* включащий белковую и углеводную части, Сепациацин по многим свойствам близок к сиршгяцинам из фитопатогениого вида P.syrlngae ♦ Однако, в отличие от последних, характеризуется термолабильностью и чувствительностью к протеазам, что не позволяет отнести его к какой-либо из двух известных до настоящего времени групп бактериоцинов. По-видимому, нами изучен новый, не описанный ранее тип бактериоциноподобных веществ.

ВЫВОДЫ

1. Установлена высокая антагонистическая активность штаммов P.cepacia , выделенных от больных и из ризосферы растений, в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжей и микроскопических грибов. Продуценты ниэкомолекулярных антибиотиков широкого спектра действия чаще обнаруживались среди штаммов ризосферного происхождения.

2. Антагонистические свойства штаммов р.с?рпс14 связаны с синтезом ими желтого, 'красного и фиолетового пигментов,,а также неокрашенных метаболитов, извлекаемых хлороформом из культурель-ной жидкости и обладающих широким спектром антимикробного действия. Антибиотическая активность и биосинтез некоторых метаболитов ингибировались ионами трехвалентного железа, что позволяет предположить их принадлежность к группе железотранспортирующих веществ - сидерофоров.

3, Исследованы физико-химические свойства низкомолекулярньгх антибиотиков, образуемых штаммом p.cepacia 57£8. Методами ЯМР-, Ш{- и маес-спектроскопии установлено наличие в их молекуле ароматического ядра,групп -снйя2 I CHjiiHGO-и пятиуглеродной алкеновой цели. Предполагается участие этих соединений в транспорте железа У P.cepacia.

4, Более 70% штаммов данного вида били способны к образованию высокомолекулярных бактериоцинолодобш^ веществ. С использованием стандартного набора тест-культур проведено бактериоциноти-пирование штаммов p.cepacia , Дополнены схемы типирования, установлены новые, ранее не описанные бактериоцинотипы. Продуценты высокомолекулярных бактериоциноподобных веществ чаще встречались у штаммов, выделенных из больных,

5, Шделен, очищен и изучен новый высокомолекулярный бакте-риоцик-сепациацин с массой£$«1(£ дальтон, состоящий из белков и углеводов в соотношении 3:1, Сепгшиацин 5779 принадлежит к новому бактериоцинотипу, термолабилен, чувствителен к действию проте-аа, теряет сво» активность в присутствии липополисахаридов, выделенных из индикаторного штамма P.cepacia 3181 и, по-видимому, относится к новому, ранее не описанному типу бактериоциноподобных веществ.

По теме диссертации опубликованы следумцие работы!

1. Смирнов B.D., Киприанова Е,А., Гарагуля А.Д., Додатко ТД. Антибиотики-бактериоцины бактерий рода Teeudoгаопае // УТ съезд УМО; Tea. докл. - Киев: Наук, думка, 1984. - ч. 2, - С. 153.

2. Смирнов В.В., Киприанова А,Д., Гарагуля А.Д., рубан В.И., Додатко Т.А. Бактериоцины некоторых видов бактерий рода Feeudomo-nae // Антибиотики. - 1984. - I29t 1PI0. - С. 730-735.

3. Додатко Т.А,, Киприанова Е.А., Гарагуля А.Д., Бойко О.И., Колесова.d.h., Смирнов В.В. Низко- и высокомолекулярные вещества иа Pdeudomojiae cepacia 11 Веесоюзн. конф. "Биосинтез вторичных метаболитов" /Пущина, 1987 г./: Тез, докл. - Пущино, Î987. - С.69

4. Смирнов В.В., Киприанова Е.А., Бойко О.И., Гарагуля А,Д., Колесова O.A., Додатко Т.А. Экология и физиология штаммов Pseudomonas oepaoia ' // Микробиол. журк. - 1988. - 50, №1. - С. 49-52.

5. Додатко Т.А,, Киприанова Е.А., Гарагуля А.Д., Смирнов В.В. Некоторые подходы к изусканию продуцентов бактериоциноподобных веществ среди бактерий рода Pseudomonas // Антибиотики И химиотерапия, - 1968. - 33, П2. - С. 901-902,

6. Додатно Т.А,, Киприанова Е.А., Смирнов B.B. Вактериоци-нотипирование штаммов Pseudomonas cepacia ( выделенных от больных и из ризосферы растений // I. микробиол., эпидемиол. и иммуно бактериол. - 1989. - IPX. - С. 21-26.

7. Додатко Т.А., Киприанова Е.А., Смирнов В.В. дологическая активность и физико-химические -свойства нового бактериоцина из штамма Pseudomonas cepacia S779 // Микробиол. журн. - 1989. -51, Ш. - С. 68-74.

8. Додатко Т.А. Бактериоциноподобные вещества peeüdoocmee cepacia И УП Съезд УМО: Itea. докл. - Киев ! Наук, думка, 1984. -ч. 2. - С. 46.

9. Смирнов В.В., Киприанова Е.А., Ларагуля А.Д., Додатно Т.А Пиляшенко И.И. Антибиотическая активность и сидерофорн р»»udomo-пае серавіа // Прикл, биохимия и микробиол. - 1990. - 26, №1. -С. 75-60.

Пом. к веч. //. 0!. $0 БФ ¡Í S SX Форш« tura

Печ. офс. Усл. печ, л. Уч.-изд. л. q t% Тира» /оО.

3»«. Q'&QtSf Бесллатий, , ,

Киевская книжка а типография научной кнігн. Кнеа, Репина, 1.