Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Синтез 3'-меркаптонуклеозидов и -нуклеотидов и изучение их ингибиторных свойств по отношению к ДНК-полимеразам

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Синтез 3'-меркаптонуклеозидов и -нуклеотидов и изучение их ингибиторных свойств по отношению к ДНК-полимеразам"

Гг»Ч ! 9 ?

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИООГИИ им. В.А. Энгельгардга

На правах рукописи УДК 577.152

ЮЖАКОВ Александр Арнольдович

СИНТЕЗ З'-МЕРКАПТОНУКЛЕОЗИДОВ И -НУКЛЕОТИДОВ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ИНГИВИТОРННХ СВОЙСТВ ПО ОТНОШЕНИЮ К ДНК—ПОЛИМЕРАЗАМ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандитата химических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии Института экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра

Научный руководитель:

кандидат физико-математических наук Р.Ш. Бибилашвили

Официальные оппоненты: .

доктор химических наук A.M. Юркевич доктор химических наук С.Н. Кочетков

Ведущая организация - Институт биоорганической химии РАН

на заседании специализированного совета Д.002.79.01 Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга РАН по адресу: 117984 Москва, улица Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

РАМН

Защита состоится

года в

Автореферат разослан

кандидат химических наук

Ученый секретарь

специализированного совета

A.M. Крицын

■/■'.- < ■ I. ' I

. -.,, t '" ''••"' ■■

Актуальность работы. Биосинтез ДНК является одним из ключевых элементов в воспроизведении и обмене генетической информации в клетке. Ферменты, принимающие участие в этом процессе такие как ДНК-полимеразы, привлекают к себе внимание большого круга ученых - молекулярных биологов. В качестве одного из самых распространенных инструментов в изучении механизмов работы ДНК-полиыераз многие исследователи с успехом пользуются аналогами нуклеотидов. Поэтому поиск новых, ранее неизвестных аналогов расширяет возможности в иследовании ДНК-полимеразных ферментативных систем.

Цельр паботы являлось осуществление синтеза З'-меркапто-2',3'-дидезоксинуклеозидов и их 5'-трифосфатов с последующим изучением их субстратных свойств по отношении к различным ДНК-синтезирующим ферментам.

Научная новизна. В настоящей работе впервые осуществлен синтез 3'-меркапто-2',3'-дидезоксинуклеозидов и их 5"-трифосфатов со всеми четырьмя природными основаниями. Изучены свойства синтезированных трифосфатов по отношению к ДНК-полимеразе I (фрагмент Кленова) из Е. coli, ДНК-полимеразе альфа и концевой дезоксирибонуклеотидилтрансферазе из тимуса теленка, обратных транскриптаз из AMV, MVLV и HIV вирусов. Была обнаружена эффективная терминация элонгации синтеза ДНК, катализируемого концевой дезоксирибонуклеотидилгрансферазой из тимуса теленка и обратными транскриптазами из HIV и AMV и слабая терминация при синтезе с обратной транскриптазой из MLV, а также отсутствие

субстратных свойств у синтезированных аналогов к ДНК-полимеразам I (фрагмент Кленова) из Е. coli и альфа из тимуса теленка.

Практическая ценность работы. В ходе работы была обнаружена высокая привовирусная активность 3'-меркапто-3'-дезокситимидина по отношению к вирусу HIV-1 (вирус иммунодефицита человека) и показана его низкая цитотоксичность на лимфоцитах крови человека. Было доказано, в 3*-положении терминированного продукта ДНК наличие активной SH-группы, удобной для возможного введения различных функциональных заместителей.

Апробация работы. Результаты работы докладывались 2-ом рабочем совещании по изучению ДНК-полимераз (Тбилиси, 1988) и на международном симпозиуме: "Synthetic oligonucleotides: problems and frontiers of practical application" (Москва, 1991).

_Публикации. По материаллам диссертации написано 3 статьи и 1

тезисное сообщение.

_Объем работы. Диссертационная работа изложена на 108

страницах машинописного текста и содержит 2 схемы, 2 таблицы, 10 рисунков и 6 хроматограмм. Она состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (138 ссылок на литературные источники).

ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ АНАЛОГОВ НУКЛЕ03ИЯ0В И ИХ 5'-ТРИФОГФАТОВ.

Программа синтеза 3'-меркапто-2',3'-дидезоксинуклеозидов и их 5'-трифосфатов была осуществлена в трех основных направлениях.

Первое направление. Синтез З'-тиоацетил-З'-дезокситимидина (T(3'SAc)) из 2,3'-ангидрогимидина, а также синтез З'-меркапто-З'-дезокситимидина (T(3'SH)) и его 5'-трифосфата (TTP(3'SH)).

Осуществление первого направления позволило провести первичный скрининг синтезированных соединений как на ДНК-полимеразных ферментативных системах, так и на клеточных культурах, инфицированных вирусом HIV, опредилить цитотоксичность T(3'SH).

Второе направление. Синтез З'-тиобензоил-З'-дезокситимидина (T(3'SBz)) методом "двойного обращения".

Осуществление этого направления позволило подтвердить ранее синтезированные структуры, значительно поднять выход T(3'SBz), что в свою очередь позволило наработать достаточно большое количество T(3'SBz), явившимся исходным соединением в последующих реакциях трансгликозилироания.

Третье направление. Синтез 3'-тиобензоил-2',З'-дидезокси-нуклеозидов (dN(3'SBz)): dA(3'SBz), dC(3'SBz), dG(3'SBz), синтез 3'-меркапто-2*,3'-дидезоксинуклеозидов (dN(3'SH)): dA(3'SH), dC(3'SH), dG(3'SH) и их 5'-трифосфатов: TTP(3'SH), dATP(3'SH), dCTP(3'SH) и dGTP(3'SH).

Осуществление третьего направления позволило получить полный набор dNTP(3'SH) для проведения полного скрининга полученных аналогов на ДНК-полимеразных ферментативных системах таких как ДНК-полимераза I (фрагмент Кленова) из E.coli, ДНК-полимераза альфа из тимуса теленка, концевая дезоксирибонуклеотидил

трансфераза из тимуса теленка и обратные транскриптазы из AMV, MLV и HIV вирусов.

Синтез_3 '-тиоаиетил-3 '-гтезокситимипина <Т(3 'БАп ) ^._З'-меркапто-

З'-дезокситимидина (ТО'гнП и его б'-триЗюсйата ТТР(З'Н).

5'-0-тритил-2,3'-ангидротимидин явился исходным соединением для введения в 3'-положение сахара тио-группы (см. схему 1).

Схема 1.

О

СИ

В качестве агента, атакующего ангидро-цикл, была выбрана калиевая соль тиоуксусной кислоты (К+ТУК). Реакции раскрытия ангидро-цикла вели в ОМГ с 10-кратным избытком К^ТУК при температуре 110120°. Такой высокий избыток реагента обусловлен в первую очередь очень высокой степенью деградации соли в при нагревании.

Выход на этой стадии не превышает 42% и после детритилирования и колоночной хроматографии на силикагеле получить Т(З'ЗАс) в чистом виде можно было только после препаративной ВЭЖХ на обращенной фазе. После обработки Т (3'ЭАс) метанольным аммиаком был получен

З'-меркапто-З'-дезокситимидин Т(3'БН), который был изучен в клеточных системах.

ТО'БАс) явился исходным соединением в синтезе 5'-трифосфата и после удаления ацетильной защиты мы имели ТТРСЗ'БН), небольшое количество которого после обработки щелочной фосфатазой по хроматографическим и физико-химическим свойствам совпал с Т(3'БН). После ионообменного хроматографического выделения ТТРО'ЭН) методом Васьковского было доказано наличие трифосфата, а модифицированным методом Эллмана контролировалось наличие свободной БН-группы.

По данным 'н-ЯМР спектроскопии (см. таблицу 1) хорошо виден тиоацетильный синглет у ТЧЗ'БАс) при 2,39 мд. и отсутствие его в спектре ТЧЗ'БН).

Синтез 3'-тиобенвоил-3'-дезокситимидиня (Т(З'ЗВг).

На первой стадии (см. схему 2) 5'-0-монометокситритилтимидин (ММТгТ) обрабатывалтся метансульфохлоридом и полученный З'-О-метансульфонил-5'-монометоксятритилтимидин (ММТгТСЗ'Мб)) после кипячения с избытком щелочи в водном спирте переходил в 5'-0-монометокситритилксилотимидин (ММТгТ(3'ху1о ОН)). Реакция

("первое обращение") протекает легко без побочных продуктов с высоким выходом (90%). После экстракции хлороформом и отмывки от щелочи выделенный продукт повторно метансульфонилировался по 3'-ОН группе ксилотимидина. Полученный 5'-О-монометокситритил-3'-метансульфонилксилотимидин (ММТгКЗ 'ху1о Мз)) выдерживался в ВМР с 10-кратным избытком натриевой соли тиобензойной кислоты в течение 72 часов при 60°С, осуществляли контроль за прохождением

ОН OUs

líUTfT MUTrT(j'Ua) MUTrTts'xylo OH)

SH

TTPts'SH)

н.р50.

х>Г

<UTP(,'SH) dG(a'SBz) dC(,'S8j)

ТАБЛИЦА 1

Химические сдвиги (б, м.д.) и константы спин-спинового взаимодействия (Л, ГЦ) протонов в 1Н-ЯМР-спектрах синтезированных нуклеозидов.

1 |Соединение Н-б Н-5 Н-1' Н -2' 1 Н-3' | Н-4 1 ' 1 Н- 5 'а, б Прочие 1 1

1 "г "4-.5 а, 1

1 и ЛИ 2.в> 1 1 1

1 1 Н-8 Н-2 1 1 1

¡Т(З'ЗАс) 7,85к 6.13ДД 2,46 м 4,04 - 3,67 М 2,39с(СН3С03-), 1,93д(Л,0, |

1 (1.0) (6,5;6,5) 5-СН3) 1

|Т(3'ЭН) 7,90д 6.16ДД 2,55- -2,50М з,б7м | 4,01м ,94-3,82 1,88д(5-СН3,Л 1, 0) |

1 (1.0) (4,6;6,7) 1 1 м 1

исез-БЮ 7,78д 5,73д 6,18дд 2,40- -2,32м 3,48м | 3,92ДД | 3 ,80м 5,14т(-ОН,Л5.а0 4,8;4,8) |

1 (7,8) (5,2;б,4) |(4,0 ¡4,5)| 7,18д(ЯНг) 1

| сС-аномер 7,60д 5,75д 6,40дд 2,66- -2,64м 4,02 - 3,51 м 5,10т(-ОН,Л5.а>о 4,85;4,86)|

1 (7,6) (3,8;2,5) 7,20д(ЫНг) 1

|с1А(3'БН) 8,2с 8,0с 6,24дц 3,02- -2,92м 3,78 - 3,59 м 5,0т(-ОН,■а0 5,5) |

1 ( 4,8; 6,8 ) 7,32ус(1Ш2) 1

| сС-аномер 8,08с 8,1с 6,54дд 3,11- -3,05м 4,00 - 3,79 м 5,05т(-ОН,Л5.аО 5.5) |

1 (3,8;2,0) 7,32ус(МНг) 1

ИС(З'БН) 7,94с - 6,18дц 2,80- -2,61м 4,04 - 3,60 м 5.И5т(-ОН.Л6.в1в 5,5) |

1 (4,9;6,7) 6,5ус(Шг) 1

| сС-аномер 7,70с - 6,38дц 3,02- ■2,94м 4,15 - 3,80 м 5,10т(-ОН,Л5.аб 5,5) |

1 (3,9;3,0) 6,4Вус(Ш2) 1

реакции по ТСХ. При этих условиях реакция ("второе обращение") протекает полностью и после удаления монометокситритильной защиты и колоночной хроматографии на силикагеле приводит к 3'-тиобензоил-3'-дезокситимидину (ТО'ЗВг)) с выходом более 90%. После удаления бензоила с 3'-меркапто группы полученный Т(3' £Н) по хроматографическим данным и данным 'н-ЯМР спектроскопии был идентичен Т(З'БН) полученному из Т(3'БАс).

Синтез 3 '—гиобензоил-2 '. 3 '-дилезоксииитидина_(¿СГЗ'БВг))- 3'-

тиобензоил-2' .3'-пидезоксиаденозина_(ЗАО'5Вг) ) ■ . 3 '-ТИоОенЗРИД-

2'.З'-лидезоксигуанозина 'ЯВг)).

Синтез 3'-гиобензоил-2',3'-дидезоксинуклеозидов проводили методом трансгликозилирования с использованием Т(БВг) в качестве донора углеводного остатка. В качестве акцептора выступали перепланированные производные 6-М-бензоилцитозинин, 6-М-бензоиладенин и г-И-пальмитоилгуания, которые получали кипячением Ы-защищенных оснований в смеси гексаметилдисилазана и триметилхлорсилана. Реакция трансгликозилирования велась при кипячении в сухом ацетонитриле. Ход реакции контролировался по убыванию исходного ТСЗ'ЙВг) в реакционной среде по ТСХ. Персилилированные производные 6-М-бензоиладенина и 2-11-пальмитоилгуанина брались в 2-крагном, а 6->1-бензоилцигозин в 5-кратном избытке по отношению к нуклеозиду ТСЗ'БВг). Реакции велись без введения защиты по 5'-положению сахара. В качестве катализатора в реакциях трансгликозилирования использовался триметилсшшлтрифторметанеульфонат (ТИБ-Т:? 1), который получали кипячением триметилхлорсилана с трифторметансульфоновой

кислотой, с последующей отгонкой ТМЭ-Т:^ из реакционной среды.

После окончания реакций продукты выделялись колоночной хроматографией на силикагеле, а затем йСО'БВг), с1А(3'БВг) и их альфа аномеры препаративной ВЗНОС на обращенной фазе в системе вода - ацетонитрил. ¿0(3'Вг) и его альфа аномер выделяли на препаративных пластинках ТСХ. После деблокирования 8% аммиаком в метаноле и выделения образцов на аналитической колонке ВЭЖХ (обращенная фаза) методом 1Н-ЯМР спектроскопии была определена структура синтезированных соединений и по отнесению сигналов были определены альфа и бета аномеры синтезированных нуклеозидов (см. таблицу 1).

Выход реакций составил для сККЗ'БВг)- 17%, а для его альфа аномера 10%; для сЩЗ'ЗВг)- 12%, а для альфа аномера- 10%; для йвО'БВг)- 12%, а для его альфа аномера- 9%. Структура полученных нуклеозидов была подтверждена элементным анализом.

Синтез 3'-меркапто-2'.З'-дидезоксинуклезид-б'-триФосФатов (анТРГЗ'ЯН)).

Синтезированные нуклеозиды ТО'БВг), (¡СО'ЯВг), сШЗ'БВг) и сК1(ЗВг) были использованы для синтеза 5'—трифосфатов методом. На первой стадии нуклеозиды обрабатывались бис-триазолидом хлорокиси фосфора в ацетонитриле. После протекания реакции фосфорилирования (контроль ТСХ) к смеси добавлялась Ы-трибутиламмонийная соль пирофосфата в ШР. По окончании реакции нуклеотиды деблокировались и выделялись ионообменной хроматографией. Выход ТТР(З'БН)-60%, ЙСТР(3'БН) - 45%, (ШТО'БН) - 48%, йвТРО'БН)- 40%. Наличее

трифосфата определялось методом Васьковского, а наличие свободной SH-группы модифицированным методом Эллмана.

После обработки щелочной фосфатазой небольших количеств синтезированных трифосфатов dNTP(3'SH) полученные нуклеозиды по хроматографическим и физико-химическим свойствам были идентичны исходным dN(3'SH).

СУБСТРАТНЫЕ_СВОЙСТВА_3' -МЕРКАПТО-2' . 3 ■ —ДИДКЗОКСИКУКЛЕОЗИД—5' -

ТРИФОСФАТОВ

После осуществления полного синтеза всех четырех dNTP(3'SH) были изучены терминационные свойства аналогов нуклеотидов "на широком спектре ДНК-полимеризующих ферментов.

Субстратные сиойствя dATP(3'SH) по отношению К ДНК-полимеразе Г из E.coli (фрагмент Кленова), ДНК-полимеразе альфа из тимуса теленка, обратным транскриптазам из AMV-, HLV- и HIV-вирусов, исследованы в условиях, описанных в "Подписи к рисункам". На фотографии электрофореграммы (см. рис. 1) показаны субстратные свойства dATP(3'SH) в синтезе ДНК с ДНК-полимеразой I (фрагмент Кленова) (треки 2-5), ДНК-полимеразой альфа (треки 69), AMV-обратной транскриптазой (треки 10-13), MLV-обратной транскриптазой (треки 14-17), HIV-обратной транскриптазой (треки 18-21). На основании данной фотографии можно сказать: ни ДНК-полимераза альфа, ни ДНК-полимераза I не используют dATP(3'SH) в качестве субстрата, и трек 2 не отличается от трека 5 (для ДНН-полимеразы I фрагмента Кленова (см. "Подписи к рисункам"), а трек 5 не отличается от трека 8.

23А-22 Г-

17C-1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Рис. 1. Электрофореграмма ДНК, синтезированной в присутствии dATP(3'SH) с ДНК- полимеразой 1, фрагментом Кленова (треки 2-5), ДНК-полимеразой альфа (6-9), AMV обратной транскриптазой (10-13), MLV обратной транскриптазой (14-17), HIV обратной транскриптазой (18-21). Грек 1 - 5'-[32Р]-меченый 17-членный праймер. Треки 2, 6, 10, 14, 18- синтез с 250 мкМ каждого из четырех природных dNTP. Треки 3, 7, 11, 15, 19 - синтез с 10 мкМ каждого из dGTP и ТТР. Треки 4, 8, 12, 16, 20 - синтез с 10 мкМ каждого из dGTP, ТТР и 200 мкМ dATP(3'SH). Треки 5, 9, 13, 17, 21 - реакции "угона" с 250 мкМ каждого из четырех dNTP, добавленных после реакций, показанных на греках 4, 8, 12, 16, 20.

10 20 30

5•-GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCC (лраймер подчеркнут).

Очень хорошо видно терминирование роста цепи ДНК с АМУ-обратной транскриптазой. Линия 22Т (трек 11) переходит в линию 23А (трек 12) и остается после реакции "угона", когда после окончания реакции (трек 13) добавляется смесь четырех природных сШТР и ДНК-полимераза I (фрагмент Кленова), чтобы "угнать" незатерминированные цепи ДНК (трек 13).

МЬУ-обратная транскриптаза практически не использует с!АТР(3'БН) в качестве субстрата (очень слабая полоса 23А в треках 16 и 17). Наиболее высокую активность в качестве терминирующего субстрата <1АТР(3'ЗН) проявил для Н1У-обратной транскриптазы. Полоса 22Г (трек 19) практически полностью переходит в полосу 23А (трек 20), не оставляя материала для реакции "угона" (трек 21).

Надо сказать, что все случаи терминации были необратимы. Кроме того, мы не увидели каких-либо субстратных различий между сШТР(З'ЙН) в зависимости от основания.

При изучении субстратных свойств сШГР(3'БН) по отношению к концевой яезоксирибонуклеотидилтрансйеразя была показана высокая эффективность терминации синтеза ДНК (см. рис. 2). На треке 3 (синтез с с!6ТР(3'БН)) видна терминационная полоса на уровне 18-членного олигонуклеотида, которая остается после реакции "угона"-трек 4, когда после синтеза с аналогом в реакцию добавляется природный трифосфат. Те же результаты получены и для остальных аналогов: треки 6, 7- для ЙАТР(З'ЗН); греки 9, 10- для йСТР(З'БН); треки 12, 13- для йТТРСЗ'БН). Как видно из рисунка разницы в терминационных свойствах между сШТРО'БН) нет.

t

17C-

10 11 12 13

Рис. 2 Электрофореграмма ДНК

синтезированной концевой в присутствии 200 мкМ dATP(3'SH)~ Сб200 мкМ

дезоксирибонуклеотидилтрансферазой dGTP(3'SH) (треки 3,4), 200 мкМ

dCTP(3'SH)- (9,10), TTP(3'SH)- (12,13). Трек 1 - 5'-[заР]-меченый 17 mer праймер. Синтез ДНК в присутствие природных dNTP: dGTP-трек 2; dATP- трек 5; dCTP- трек 8; ТТР- трек 11. Треки 4, 7, 10, 13- реакция "угона", когда после реакций, показанных на треках 3, б, 9, 12 было добавленно по 200 мкМ природного dNTP, соответствующей "буквы".

9

*

т

• 1щ

• 1

19Т-18G-17С-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рис. 3. Сравнение терминационных возможностей TTP(3'SH) и TTP(3'N3) в зависимости от концентраций аналогов с HIV обратной транскриптазой.

Трек 1 - синтез с 250 мкМ каждого из природных dNTP; трек 2-синтез с 250 мкМ dGTP; трек 3 - синтез с 10 мкМ dGTP И 200 мкМ ТТР(З'БН); треки 4-8 - реакции "угона" с 250 мкМ каждого из NTP, добавленных после реакции с ТТР(З'БН). Концентрации ТТР(З'БН) на первой стадии были 200 мкМ (трек 4), 100 мкМ (трек 5), 10 мкМ (трек 6), 1 мкМ (трек 7), 0,1 мкМ (трек 8). Трек 9 - синтез с 10 мкМ dGTP и 200 мкМ TTP(3*Ng); трек 10-14 - реакции "угона" в тех же условиях. Концентрации TTP(3'N3) были 200 мкМ (трек 10), 100 мкМ (трек 11), 10 мкМ (трек 12), 1 мкМ (трек 13), 0,1 мкМ (трек 14).

Время основной и реакции "угона" составило по 15 мин.

*

Было проведено исследование зависимости терминации элонгации ДНК-цепи HIV-обратной транскриптазой от концентрации dTTP(3'SH) и dTTP(3'N3). На рисунке 3 показана электрофор'еграмма синтеза ДНК с последующим "угоном" в присутствии dTTPO'SH) при концентрациях 200 мкМ- трек 5, 20 мкМ- трек 6, 10 мкЫ- трек 7, 1 мкМ- трек 8. То же самое и для dTTP(3'N3): 200 мкМ- трек 9, 20 мкМ- трек 10, 10 мкМ- трек 11, 1 мкМ- трек 12. Все реакции ведутся в присутствии 1 мкМ природного ТТР.

Как видно из данного опыта, dTTP(3'SH) по своим терминационным свойствам при синтезе ДНК обратной транскриптазой HIV обладает несколько более высокой эффективностью по сравнении с dTTP(3'N3), в то время, как было показано в других опытах и на основании литературных данных, по отношению к AMV и MLV обратных транскриптазам dTTP(3'N3) обладает значительно более высокой эффективностью, чем dTTP(3'SH).

ИЗУЧЕНИЕ З1-ТЕРМИНИРОВАННОГО ПРОДУКТА СИНТЕЗА ЛНК.

Меченый 5'-[32Р] продукт реакции концевой трансферазы с dTTP(3'SH) был выделен на аналитической колонке Nucleosil-C18 ВЭЖХ, упарен и после обработки реактивом Эллмана был повторно нанесен на ту же колонку (хром. 3). Время удержания терминированного продукта при этом составило 19,5 минут против 16 минут до обработки. В качестве контроля использовался исходный олиго-нуклеотид (хром. 1), а также продукт реакции, полученный в тех же условиях с 2',3'—дидеэокситимидином-5'—трифосфатом (хром. 2). Обработка реактивом Эллмана не привела к изменению времени удержания (16 мин) у контрольных образцов. То же самое было

Chromatography i*

Jíe> 2

• Baf ora Aft. г

(X 10вв> г

о

е.в

в Б 1« 1В Ев £5 3Í Tita« <ain>

Chraamtaarmphu S*

• ВаГога Atter

Chroinatographu 3*

(X lee i 18

I-

" Befara ' «ft»r

. / I

t t i> t |i i' ii

l> il i' i> i>

ill.Ill

Б 18 IS гв Tim* (nin>

б ii ib га г«

Tim <i»in>

i t

Chromatography 4.

ChronmtoarMphu 5.

Chromatacraphu в»

is 1Б 15

12 12 i i H •t

12 — ВаГога — Bafarm - Btfor«

- Aftar 9 - After S • - After ;

S- l О e 1 e ii 1 t ii

4 < : » i : n i¡ 3 i ■ i ! > i i i i !\

в 1 'i чЛд nll.llilUlJ e Ij, и Ь .i il и il 1.1 и i .i 1111 и • i, ...i., ..i—i iiUlâlÉ

в б is is гв гв 30

Timm (min)

б ib is гв 26 ав

Tim« (min)

Б 10 le 29 Time <nin)

сделано и для продукта, полученного Н1\Г-обратной транскриптазой с с1АТР(3'5Н). При этом время удержания изменилось с 16,5 минуты на 18,5 мин. (хрои. 6), тогда как время удержания контрольного продукта, полученного с 2*,3'-дидезоксиаденозином-5'-трифосфат (хром. 5) и исходным олигонуклеотидом (хром. 4), после обработки реактивом Эллманом осталось прежним (16,5 мин.). Детектирование осуществлялось по счету радиоактивности (см. хроматограммы 1-6).

СРАВНЕНИЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ_АКТИВНОСТИ 3'-МЕРКАПТО-31-

ДЕЗОКСИТИМИДИНА Т(3'5Н) И З'-АЗИДО-З1-ДЕЗОКСИТИМИДИНА Т(3'Н3).

Противовирусные свойства 3'-меркапто-,3'-дезокситимидина (Т(З'БН)) и 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидина (Т(3"Я3) изучали, используя перевиваемую лимфобластоиднуга Т-клеточную линию МТ-4 (получена от проф. С.С.Маренниковой, Институт вирусных препаратов АМН СССР), чувствительную к инфицированию Н1У-1 (Нагайа Б. еЪ а1. 1985). В таблицу 1 сведены данные по жизнеспособности клеток, инфицированных вирусом при различных концентрациях препаратов (Т(З'БН) и Т(3'Ы3)).

Как следует из таблицы 2, 3'-меркапто-3'-дезокситимидин увеличивает жизнеспособность МТ-4 клеток при концентрации 13,5 мкМ до 72% вместо контрольных 32%. Кроме того, из таблицы 1 видна низкая цитотоксичность 3'-меркапто-3'-дезокситимидина (80% в его присутствии против 88% в контроле за 5 дней, 74% в его присутствии и 74% в контроле за 7 дней). Из таблицы также видно, что действие Т(З'ЗН) на клетках не уступает действию Т(3'Н3) (разница в значениях лежит в пределах ошибки опыта).

Таблидя Я. Жизнеспособность МТ-4 клеток, инфицированных HIV при различных концентрациях T(3'SH) и Т(3'Н3).

Количество вещества (1(3'БН) или Т(З'Кд), которое внесли в лунку и его концентрация в инкубационном растворе

Жизнеспособность клеток (в %) 7 дней

5 дней T(3'SH)| T(3'N3)

T(3'SH)| T(3'N4)

Клетки с вирусом

100 мкл (13,5 мкМ) 72 82 59 79

20 мкл (2,7 мкИ) 53 66 36 74

5 мкл (0., 7 мкМ) 30 57 23 62

Клетки без вируса и без Т(З'БН) и Т(3*Н3) 88 74

Клетки с вирусом без Т(З'ЗН) и Т(3'Ка) 32 20

Клетки с ТО'ЭН) 100 мкл (13,5 мкМ) без вируса 80 74

ИЗУЧЕНИЕ ИИТОТОКСИЧНОСТИ З'-ИЕРКАПТО-З'-ДКЗОКСИТИМДИНА,

3'-Меркапто-З'-дезокситимидин был исследован на токсичность на культуре клеток лимфоцитов .

Лимфоциты были выделены из крови здоровых доноров. Цитотоксическая активность определялась по ингибированию включения 3Н- тимидина в ДНК лимфоцитов. В качестве одного из стандарта сравнения был выбран 3'- азидо-3'-дезокситимидин.

После инкубации нуклеозидов (в различных концентрационных разбавлениях) со стандартным количеством лимфоцитов в присутствии 10% эмбриональной телячьей сыворотки в течение 16-18 часов, к

образцам добавляли 3Н - меченый тимвдин, и смеси инкубировались еще 12 часов. После отмывки клеток на фильтрах производился подсчет количества включенного 3Н- тимидина. На основании полученных данных для Т(З'БН) и Т(3'Н3) построен график (см. рисунок 4).

При анализе данного графика можно сказать, что ингибирование включения 3Н- меченого тимидина в ДНК лимфоцитов в присутствии

Т(3'ЗН) значительно ниже, чем у Т(3'Ы3). %

С (тд/ш!)

19

выводи

1. Впервые осуществлен химический синтез 3'-меркапто-2',3'-дидезоксинуклеозидов со всеми четырьмя природными основаниями и их 5'-трифо сфатов.

2. Показано, что ни ДНК-полимераза I (фрагмент Кленова) из Е. coli, ни ДНК-полимераза альфа из тимуса теленка не используют 3*-меркалто-2',3'-дидезоксинуклеозид 5'-трифосфаты в качестве субстратов в синтезе ДНК. В то же время установлено, что 3*— меркапто-2',3'-дидезоксинуклезид 5'-трифосфаты эффективно и необратимо терминируют элонгацию цепи ДНК в синтезе ДНК с концеаой дезоксирибонуклеогидилгрансферазой из тимуса теленка, обратной транскриптазой из AMV, обратной транскриптазой из HIV и слабо терминируют рост цепи ДНК в синтезе с обратной транскриптазой из WLV. При исследовании терминированных продуктов биосинтеза ДНК было доказано наличие активной SH-группы в 3'— положении 3'-концевого нуклеотида, удобной для возможного введения различных функциональных заместителей.

3. При сравнительном анализе на перевиваемой лимфобластоидной культуре клеток человека (МТ-4) инфицированной вирусом иммунодефицита человека (HIV-1), было показано, что З'-меркапто-2',3'-дидезокситимидин также эффективно подавляет цитотоксичность вируса по отношению к клеткам этой линии и в той же степени, что и 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин.

Основное содержание диссертации изложено в следующих

1. Южаков А.А., Чиджавадзе З.Г., Бибилашвили Р.Ш., Краевский А.А., Галегов Г.А., Корнеева М.Н., Носик Д.Н., Килессо Т.Ю. 3'-Меркапто-3'-дезокситимидин-5'-трифосфат как терминатор синтеза ДНК, катализируемого РНК-зависимыми ДНК-полимеразами. // Биоорган, химия - 1991 - т.17,N4 - с.504-509.

2. A.Yuzhakov, Z.Chidgeavadze, R.Beabealashvilli "A new method of synthesis of 3'-mercapto-3'-deoxythymidine" // Nucleic Acids Res. (Symphosium Series) - 1991 - N 24, p.266.

3. A.Yuzhakov, Z.Chidgeavadze, R.Beabealashvilli "3'-Mercapto-

2',3'—dideoxynucleotides are high effective terminators of DNA synthesis catalyzed by HIV Reverse Transcriptase". // FEBS letters - 1992 - V.306,N2-3 - P.184-188.

4. Южаков А.А., Чиджавадзе З.Г., Бибилашвили Р.Ш. Синтез З'-мер-капго-2',3'-дидезоксинуклеотидов и их свойства в синтезе ДНК-с РНК-зависимыми ДНК-полимеразами. // Биоорган, химия - 1992 (в печати).

работах :

МЦНГИ Эак. 2182